FI88175B - Rekombinant-dna-molekyler och foerfaranden foer framstaellning av polypeptider liknande humant -interferon - Google Patents

Description

1 38175

Yhdistelmä-DNA-molekyylejä ja menetelmiä ihmisen β-inter-feronin kaltaisten polypeptidien valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on rekombinantti-DNA-molekyyle-5 jä ja menetelmä ihmisen fibroblasti-interferonin kaltaisten polypeptidien valmistamiseksi. Erityisesti keksinnön kohteena on DNA-sekvenssejä, jotka on ekspressoitu sopivassa isäntä-organismissa. Tässä esitetyille rekombinant-ti-DNA-molekyyleille ovat ominaisia DNA-sekvenssit, jotka 10 koodaavat polypeptidejä, joiden aminohappo-sekvenssi ja koostumus ovat pääasiallisesti yhtäpitäviä ihmisen fibro-blasti-interferonin kanssa ja joilla on ihmisen fibroblas-ti-interferonin immunologinen tai biologinen vaikutus. Kuten seuraavasta esityksestä käy ilmi, käytetään tämän kek-15 sinnön DNA-sekvenssejä, rekombinantti-DNA-molekyylejä ja menetelmiä valmistettaessa polypeptidejä, jotka ovat käyttökelpoisia virusvastaisissa ja kasvainvastaisissa tai syövänvastaisissa aineissa ja menetelmissä sekä immunomo-duloinnissa.

20 Tässä patenttihakemuksessa käytetään interferoni- nimistöä, joka on esitetty julkaisussa Nature, 286, s. 2421 (heinäkuu 10, 1980). Tämä nimistö korvaa hakijan aikaisemmissa hakemuksissa käytetyn, joista tämä hakemus vaatii prioriteetin. Esim. IF merkitään nyt IFN:ksi ja 25 fibroblasti-interferoni merkitään nyt IFN-B:ksi.

• : -j Tiedetään olevan olemassa kaksi interferonien ____ ("IFN") luokkaa. Luokan I interferonit ovat pieniä, hapon . ·. kestäviä (glyko)-proteiineja, jotka tekevät solut resis tentiksi virus-infektiolle (A. Isaacs ja J. Lindeman, 30 "Virus Interference I. the Interferon", Proc. Royal Soc. Ser. B., 147, sivut 258-67 (1957) ja W. E. Stewart, II, The Interferon System, Springer-Verlag (1979) (tämän jälkeen "The Interferon System")). Luokan II IFN't ovat hapon suhteen labiileja. Tähän asti niitä on niukasti luonneh-35 dittu. Vaikka iFN't ovat jossakin määrässä soluspesifisiä 2 8817;:: (The Interferon System, sivut 135-45), ne eivät ole virus-spesifisiä. Sensijaan IFN't suojaavat soluja laajaa joukkoa vastaan erilaisia viruksia.

Ihmisen interferoni ("HuIFN") on luokiteltu kol-5 meen ryhmään α, β ja Ύ HuIFN-B:aa eli fibroblastiinter-feronia syntyy sopivan induktion jälkeen diploidifibro-blasti-soluissa. Sitä syntyy myös pienemmissä määrissä yhdessä suuremman määrän kanssa HulFN-a:aa lymfoblastoi-di-soluissa. Näistä soluista tehtyjä IFN-S:aa on laajalti 10 puhdistettu ja luonnehdittu (E. Knight, Jr., "Interferon: Purification and Initial Characterization from Human Diploid Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, sivut 520-23 (1976)). Se on glykoproteiini, jonka molekyylipaino on n. 20.000 (M. Wiranowska-Stewart, et al., "Contribu-15 tions of Carbohydrate Moieties to the Physical and Biological Properties of Human Leukocyte, Lymphoblastoid and Fibroblast Interferons", Atst. Ann. Meeting Amer. Soc. Microbiol., sivu 246 (1978)). Se on myös heterogeeninen mitä kokoon tulee, mkä todennäköisesti johtuu hiilihyd- 20 raatti-osista.

Myös ihmisen autenttisen fibroblasti-interferonin aminohappo-koostumus on esitetty (E. Knight, Jr. et ai., "Human Fibroblast Interferon: Amino Acid Analysis and

Amino-Terminal Amino Acid Sequence", Science, 207, sivut 25 525-26 (1980)). Lisäksi ihmisen autenttisen fibroblasti- interferonin aminohappo-sekvenssin eluutio on hyvällä alulla. Tähän mennessä autenttisen kypsän proteiinin NH2-pään aminohappo-sekvenssi on esitetty ensimmäisen 13 aminohappo-tähteen osalta: Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe- . 30 Leu-Gln-Arg-Ser-Ser... (E. Knight, Jr. et ai., supra).

Kahden eri geenin, joista toinen sijaitsee kromosomilla 2 ja toinen kromosomilla 5, on esitetty koodaavan IFN-8:aa (D. L. Slate ja F. H. Ruddle, "Fibroblast Interferon in Man is Coded by Two Loci on Separate Chromo-35 somes". Cell, 16, sivut 171-80 (1979)). Muut tutkimukset 3 38175 osoittavat kuitenkin, että geeni IFN-B:aa varten sijaitsee kromosomilla 9 (A. Medger, et ai., "Involvement of a Gene on Chromosome 9 in Human Fibroblast Interferon Production", Nature, 280, sivut 493-95 (1979)).

5 Vaikka autenttinen HuIFN-β on glykosyloitu, hiili hydraatti-osan poistaminen (P. J. Bridgen, et ai., "Human Lymphoblastoid Interferon", J. Biol. Chem., 252, sivut 6585-87 (1977)) tai IFN-B:n synteesi estoaineiden, jotka pyrkivät estämään glykosyloinnin, läsnäollessa (W. E. 10 Stewart, II, et ai., "Effect of Glycosylation Inhibitors on the Production and Properties of Human Leukocyte Interferon", Virology, 97, sivut 473-76 (1979); J. Fujisawa, et al., Nonglycosylated Mouse L Cell Interferon Produced by the Action of Tunicamycin", J. Biol. Chem., 253, sivut 15 8677-79 (1978); E. A. Havell, et al., "Altered Molecular

Species of Human Interferon Produced in the Presence of Inhibitors of Glycosylation", J. Biol. Chem., 252, sivut 4425-27 (1977); The Interferon System, s. 181) antaa IFN-B:n pienemmän muodon, joka silti säilyttää suurimman osan 20 sen iFN-aktiivisuudesta.

HuIFN-B, samoin kuin monet ihmis-proteiinit, voi myös olla polymorfinen. Siten erityisten yksilöiden solut voivat tuottaa IFN-B-lajeja yleisemmästä IFN-B-Iuokasta, jotka ovat fysiologisesti samanlaisia mutta rakenteelli-25 sesti lievästi erilaisia kuin luokan, jonka osa ne ovat, prototyyppi. Siten, vaikka IFN-B:n proteiini-rakenne on yleisesti hyvin määritelty, erikoisyksilöt voivat tuottaa IFN-B:ja, jotka ovat näistä lievästi muunneltuja.

IFN-B:aa ei tavallisesti ole havaittavissa normaa-30 leissa tai terveissä soluissa (The Interferon System, sivut 55-57). Sensijaan tätä proteiinia syntyy tuloksena solun altistamisesta jollekin IFN-indusoijalle.

IFN-indusoijat ovat tavallisesti viruksia, mutta voivat myös olla luonteeltaan ei-virusmaisia, kuten luon-35 non tai synteettistä kaksisäikeistä RNA;ta, solunsisäisiä 4 fJ' 8 ί 7 mikrobeja, mikrobisia tuotteita tai erilaisia kemiallisia aineita. Lukuisia yrityksiä on tehty näiden ei-virusmais-ten indusoijien käyttämiseksi hyväksi ihmissolujen tekemiseksi resistenteiksi virus-infektiolle (S. Baron ja F.

5 Dianzani (toim.), Texas Reports on Biology and Medicine, 35 ("Texas Reports"), sivut 528-40 (1977)). Nämä yritykset eivät ole olleet kovin menestyksellisiä. Sensijaan eksogeenisen HuIFN-B:n itsensä käyttöä pidetään nyt parempana .

10 Interferoni-hoitoa viruksia ja kasvaimia tai syöpiä vastaan on toteutettu erilaisilla annosalueilla ja useilla erilaisilla antotavoilla (The Interferon System, sivut 305-321). Interferonia on esimerkiksi annettu tehokkaasti suun kautta, rokottamalla - laskimonsisäisesti, lihaksen-15 sisäisesti, nenänsisäisesti, ihonsisäisesti ja ihonalaisesti - sekä silmätippojen, voiteiden ja suihkeiden muodossa. Sitä annetaan tavallisesti yhdestä kolmeen kertaan päivässä annoksina 10^:stä 107:ään yksikköä. Hoidon laajuus riippuu potilaasta ja hoidettavasta tilasta. Esimer-20 kiksi virusinfektioita hoidetaan tavallisesti yhdellä tai kahdella päivittäisellä annoksella muutamasta päivästä kahteen viikkoon ja kasvaimia tai syöpiä hoidetaan tavallisesti yhdellä tai moninkertaisilla päivittäisillä annoksilla monien kuukausien tai vuosien ajan. Tehokkaimman 25 hoidon jollekin määrätylle potilaalle määrää tietenkin hoitava lääkäri, joka ottaa huomioon tällaiset hyvin tunnetut tekijät kuin taudin suunta, aikaisempi hoito ja potilaan reagointi interferonille, valitessaan antotavan ja annoskoon.

30 Virusvastaisena aineena HuIFNta on käytetty hoidettaessa seuraavia: hengityselinten infektiot (Texas Re ports, sivut 486-96); herpes simplex keratitis (Texas Reports, sivut 497-500); R. Sundmacher, "Exogenous Interferon in Eye Diseases", International Virology IV, The 35 Hague, Abstract nr. W2/11, sivu 99 (1978)); akuutti side- 5 3817b kalvon verenvuoto-tulehdus (Texas Reports, sivut 501-10); adenovirus keratoconjunctivitis (A. Romano, et al., ISM Memo I-A8131 (lokakuu, 1979)); varicella zoster (Texas Reports, sivut 511-15); cytomegalovirus-infektio (Texas 5 Reports, sivut 523-27); ja hepatitis B (Texas Reports, sivut 516-22). Ks. myös The Interferon System, sivut 307- 19. Suurempimittakaavainen IFN: n käyttö virusvastaisena aineena vaatii kuitenkin suurempia määriä IFN:ä kuin tähän asti on ollut käytettävissä.

10 IFN:llä on muita vaikutuksia virusvastaisen vaiku tuksensa lisäksi. Se vastustaa esimerkiksi pesäkettä stimuloivan tekijän vaikutusta, estää punasoluja muodostavien pesäkkeitä muodostavien solujen kasvun ja häiritsee granu-losyytti- ja makrofagi-prekursorien normaalia erilaistu-15 mistä (Texas Reports, sivut 343-49). Se estää myös erytro-idi-erilaistumisen DMSOrlla käsitellyissä Friend-leukemia-soluissa (Texas Reports, sivut 420-28). On merkityksellistä, että jotkut solulinjat ovat huomattavasti herkempiä HuIFN-8:lle kuin HuIFN-a:lle näissä suhteissa (S. Einhorn 20 ja H. Strander, "Is Interferon Tissue-Specific? - Effect of Human Leukocyte and Fibroblast Interferons on the . . Growth of Lymphoblastoid and Osteosarcoma Cell Lines", J.

Gen. Virol., 35, sivut 573-77 (1977); T. Kuwata, et al., "Comparison of the Suppression of Cell and Virus Growth in 25 Transformed Human Cells by Leukocyte and Fibroblast Interferon", J. Gen Virol., 43, sivut 435-39 (1979)).

IFN:11a on osansa myös immuunivasteen säätelyssä.

: Esimerkiksi, riippuen annoksesta ja antoajasta antigeenin suhteen, IFN voi olla sekä immunopotentioiva että immuno-; 30 supressiivinen in vivo ja in vitro (Texas Reports, sivut 357-69). Lisäksi erikoisesti herkistettyjen imusolujen on havaittu tuottavan IFN:ia kosketuksen jälkeen antigeenin kanssa. Tällainen antigeeni-indusoitu IFN voisi siten olla immuunivasteen säätelijä vaikuttaen siten sekä kiertävien 35 antigeenien määriin että soluimmuuniuden ekspressioon 6 88175 (Texas Reports, sivut 370-74). IFN:n tiedetään myös lisäävän tappajaimusolujen aktiivisuutta ja vasta-aineesta riippuvaa soluvälitteistä solumyrkyllisyyttä (R. R. Herberman, et ai., "Augmentation by Interferon of Human 5 Natural and Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity", Nature, 277, sivut 221-23 (1979); P. Beverley ja D. Knight, "Killing Comes Naturally", Nature, 278, sivut 119-20 (1979); Texas Reports, sivut 375-80; J. R. Huddlestone, et al.. Induction and Kinetics of Natural Killer Cells in 10 Humans Following Interferon Therapy", Nature, 282, sivut 417-19 (1979); S. Einhorn, et al., "Interferon and Spontaneous Cytotoxicity in Man. II. Studies in Patients Receiving Exogenous Leukocyte Interferon", Acta Med. Scand., 204, sivut 477-83 (1978)). Kumpikin voi suoraan 15 tai epäsuorasti liittyä immunologiseen hyökkäykseen kas-vainsoluilla.

Käyttönsä lisäksi virusvastaisena aineena HuIFNilla on siten tärkeä käyttöalue kasvaimenvastaisessa ja syövän-vastaisessa terapiassa. (The Interferon System, sivut 319-20 21 ja 394-99). Nyt tiedetään, että INF't vaikuttavat mo nien kasvainlajien kasvuun monissa eläimissä (The Interferon System, sivut 292-304). Ne, samoin kuin muut kasvai-menvastaiset aineet, näyttävät tehokkaimmilta, kun ne kohdistetaan pieniä kasvaimia vastaan. Eläin-IFN:n kasvaimen-25 vastaiset vaikutukset riippuvat annoksesta ja ajasta, mutta niitä on esitelty pitoisuuksissa, jotka ovat alle myrkyllisten määrien. Siten HuIFN:jen kasvaimenvastaisista ja syövänvastaisista ominaisuuksista on tehty lukuisia tutkimuksia ja kliinisiä kokeita ja tehdään jatkuvasti. Nämä 30 käsittävät useiden pahanlaatuisten sairauksien, kuten os-teosarkooman, akuutin myeloidileukemian, multippelimyelo-man ja Hodgkins'in taudin hoidon (Texas Reports, sivut 429-35). Lisäksi HuIFN-B:n on äskettäin osoitettu aiheuttavan paikallista kasvaimen peräytymistä, kun sitä ruisku-35 tetaan ihonalaisiin kasvainkyhmyihin melanoomassa ja rin- 7 88175 tasyövästä kärsiville potilaille (T. Nemoto, et ai., "Human Interferons and Intralesional Therapy of Melanoma and Breast Carcinoma", Amer. Assoc, for Cancer Research, Abs nr. 993, sivu 246 (1979)). Vaikka tulokset näistä 5 kliinisistä testeistä ovat rohkaisevia, ovat IFN-S:n kas-vainvastaiset ja syövänvastaiset sovellutukset pahoin estyneet puhdistetun IFN-B:n riittämättömän tarjonnan vuoksi .

Jotkut solulinjat, jotka kestävät IFN-a:n solun-10 vastaiset vaikutukset, jäävät merkityksillisesti herkiksi IFN-B:lle. Tämä erilainen vaikutus tuo mieleen, että IFN-B:aa voidaan hyödyllisesti käyttää resistenttien kasvain-solujen tiettyjä lajeja vastaan, joita ilmenee selektiivisen paineen alaisena potilailla, joita hoidetaan suurilla 15 annoksilla IFN-a:aa (T. Kuwata, et ai., supra; A. A. Creasy, et ai., "The Role of Gq-G^ Arrest in the Inhibition of Tumor Cell Growth by Interferon", Abstracts, Conference on Regulatory Functions of Interferons, N. Y. Acad. Sci., no. 17 (lokakuu 23-26, 1979)).

20 Biokemiallisella tasolla IFN't aiheuttavat ainakin kolmen proteiinin muodostumisen, nimittäin proteiini ki-naasin (B. Lebleu; et ai., "Interferon, Double-Stranded RNA and Protein Phosphorylation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, sivut 3107-11 (1976); A. G. Hovanessian ja I. 25 M. Kerr, "The (2'-5') Oligoadenylate (ppp A2f-5A2'-5'A) Synthetase and Protein Kinase(s) from Interferon-Treated Cells", Eur. J. Biochem., 93, sivut 515-26 (1979)), (2'- 5') oligo(A)-polymeraasin A. G. Hovanessian, et ai., "Synthesis of Low-Molecular Weight Inhibitor of Protein ; 30 Synthesis with Enzyme from Interferon-Treated Cells",

Nature, 268, sivut 537-39 (1977); A. G. Hovanessian ja I. M. Kerr, Eur. J. Biochem. supra) ja fosfodiesteraasin (A. Schmidt, et al., "An Interferon-Induced Phosphodiesterase Degrading (2'-5') oligoisoadenylate and the C-C-A Terminus 35 of tRNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, sivut 4788-92 .Λ (1979)).

e 8 817 ö

Sekä IFN-β että lFN-α näyttävät nopeasti avaavan samanlaiset entsymaattiset kulkutiet (C. Baglioni, "Interferon- Induced Enzymatic Activities and their Role in the Antiviral State", Cell, 17, sivut 255-64 (1979)) ja molem-5 mat jakavat yhteisen aktiivisen ytimen, koska ne molemmat tunnistavat kromosomi-21-koodatun solu-reseptorin (M. Wiranowska-Stewart, "The Role of Human Chromosome 21 in Sensitivity to Interferons", J. Gen. Virol., 37, sivut 629-34 (1977)). Yhden tai useamman näistä entsyymeistä il-10 maantuminen soluihin, joita on käsitelty IFNrlla, tekisi mahdolliseksi proteiinien, joilla on IFN:n kaltainen vaikutus, lisäluonnehtimisen.

Nykyään HuIFN-B:aa tuotetaan ihmisen solulinjoil-la, joita viljellään kudosviljelyssä. Se on alhaisen saa-15 liin antava, kallis menetelmä. Joku suuri valmistaja tekee

Q

ainoastaan 40-50 x 10 yksikköä raakaa IFN-B:aa vuodessa (V. G. Edy, et ai., "Human Interferon: Large Scale Production in Imbryo Fibroblast Cultures", julkaisussa Human Interferon (W. R. Stinebring ja P. J. Chappie, toimitta-20 jia), Plenum Publishing Corp., sivut 55-60 (1978)). Puhdistettaessa adsorboimalla kontrolloituihin huokoisiin lasihelmiin saadaan IFN-B:aa, jonka spesifinen aktiivisuus on n. 10^ yksikköä/mg, talteen 50 %:n saaliilla raaoista solu-uutteista (A. Billiau, et ai., "Human Fibro-25 blast Interferon for Clinical Trials: Production, Partial Purification and Characterization", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, sivut 49-55 (1979)). Lisäpuhdistaminen g spesifiseen aktiivisuuteen n. 10 yksikköä/mg suoritetaan sinkkikelaatti-affiinisuuskromatografiällä n. 100 %:n saa-30 Hilla (A. Billiau, et ai., "Production, Purification and Properties of Human Fibroblast Interferon", Abstracts, Conference on Regulatory Functions of Interferons, N. Y. Acad. Ski., no. 29 (lokakuu 23-26, 1979)). Koska HuIFN- β:η spesifinen aktiivisuus on niin suuri, on IFN-B:n mää-35 rä, joka tarvitaan kaupalliseen käyttöön, pieni. Esimer-

9 8 81 7 S

kiksi 100 g puhdasta IFN-β antaisi 3:sta 30 miljoonaan annosta.

Viimeaikaiset edistysaskeleet molekyylibiologiassa ovat tehneet mahdolliseksi tuoda DNA, joka koodaa spesifi-5 siä ei-bakteeri-eukaryoottisia proteiineja, bakteerisolui-hin. Yleensä DNA:11a, muulla kuin kemiallisella synteesillä valmistetulla, tällaisten rekombinantti-DNA-molekyylien rakentelu käsittää vaiheet, joissa valmistetaan puhdistetun lähetti-RNA (mRNA)-mallin haluttua proteiinia varten 10 yksisäikeinen DNA-kopio (cDNA); cDNA muutetaan kaksisäi-keiseksi DNA:ksi; kytketään DNA sopivaan kohtaan sopivassa kloonaussiirtäjässä muodostamaan rekombinantti-DNA-mole-kyyli ja transformoidaan sopiva isäntä tällä rekombinant-ti-DNA-molekyylillä. Tällainen transformaatio tekee isän-15 nälle mahdolliseksi tuottaa haluttua proteiinia. Useita ei-bakteeri-geenejä ja proteiineja on saatu E. coli:ssa käyttäen rekombinantti-DNA-teknologiaa. Tällaisia ovat esimerkiksi IFN (S. Nagaga, et ai., "Synthesis in E. coli of a Polypeptide with Human Leukocyte Interferon Activ-20 ity", Nature, 284, sivut 316-20 (1980)). Lisäksi rekombinantti-DNA-teknologiaa on käytetty tuottamaan plasmid!, jonka sanotaan sisältävän geenisekvenssin, joka koodaan IFN-B:aa (T. Taniguchi, et ai., "Construction and Identification of a Bacterial Plasmid Containing the Human 25 Fibroblast Interferon Gene Sequence", Proc. Japan Acad. Ser. B, 55, sivut 464-69 (1979)).

Kummassakin edellä esitetyssä viitteessä ei IFN-B:n todellista geenisekvenssiä ole kuitenkaan selostettu eikä kummassakaan tätä sekvenssiä ole verrattu aminohappo-30 alkusekvenssiin tai autenttisen IFN-B:n aminohappokokoon-panoon. Aikaisempi työ on kohdistunut pelkästään IFN-a:aan, erilaiseen kemialliseen, biologiseen ja immunologiseen luokan I interferoniin kuin IFN-β (vrt. supra). Jälkimmäinen esitys perustuu pelkästään hybridisointi-arvoi-35 hin. Nämä tiedot yksinään eivät tee mahdolliseksi määrit- ίο 88175 tää sisältääkö valittu klooni täydellisen tai todellisen geenisekvenssin, joka koodaa IFN-B:aa, tai pystyykö kloonattu geenisekvenssi ekspressoimaan IFN-B:aa bakteereissa. Hybridisointi vain vahvistaa sen, että nimenomainen DNA-5 insertio on jossain määrässä homologinen poly(A)-RNA:n mRNA-komponentin kanssa, joka indusoi interferoni-aktiivisuuden varhaismunasoluun ruiskutettuna, ja sitä täydentävä. Lisäksi kaiken homologisuuden määrä riippuu seulonta-prosessia varten valituista hybridisoimisolosuhteista. 10 Siten hybridisointi poly(A)-RNA:n mRNA-komponentiksi pelkästään ei riitä osoittamaan, että valittu DNA-sekvenssi on sekvenssi, joka koodaa HuIFN-B:aa tai polypeptidiä, jolla on HuIFN-B:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus, tai että tällainen sekvenssi on käyttökelpoinen val-15 mistettaessa tällaisia polypeptidejä sopivissa isännännis-sä.

Eräässä seminaarissa Zurich'issä 25.2.1980 Taniguchi totesi, että hän oli määrittänyt nukleotidisek-venssin yhdelle hybridisoivista klooneistaan. Hän totesi 20 myös, että ensimmäiset 13 aminohappoa, joita tämä sekvenssi koodaa, olivat identtisiä Knight'in et ai., supra, määrittämien kanssa autenttisella HuIFN-B:lle. Taniguchi ei esittänyt koko nukleotidisekvenssiä kloonilleen tai verrannut sen aminohappokoostumusta siihen, joka on määri-25 tetty autenttiselle HuIFN-B:lle. Taniguichi on sen jälkeen esittänyt koko nukleotidisekvenssin hydridisoivalle kloonilleen (T. Taniguichi et ai.. Gene, 10, sivut 11-15 (1980)). Sekvenssi poikkeaa yhdellä nukleotidilla siitä, joka on selostettu ja vaadittu brittiläisessä patenttiha-30 kemuksessa 8011306, jätetty 3.4.1980, hakemus, josta tälle patenttihakemukselle on pyydetty prioriteettia. Taniguich' in esittämä aminohapposekvenssi on sama kuin edellisessä patenttihakemuksessa kuvattu ja vaadittu. Taniguichi ei myöskään ollut esittänyt polypeptidien, joilla on HulFN-35 B:n immunologienen tai biologienen aktiivisuus, ekspres- il 88175 siota sopivassa isännässä brittiläisen patenttihakemuksen 8018701, jätetty 6.6.1980, jättämisen ajankohtana, patenttihakemus, josta tälle pantenttihakemukselle on pyydetty prioriteettia. Juuri tämä polypeptidin (polypeptidien), 5 jolla (joilla) on HuIFN-8:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus, ekspressio isännässä sekä menetelmät, poly-peptidit, geenit ja niiden rekombinantti-DNA-molekyylit luonnehtivat tätä keksintöä.

Tämä keksintö ei liioin kohdistu, kuten Research 10 Disclosure'n (tutkimusselityksen) no. 18309, sivut 361-62 (1979) ilmeinen tarkoitus on, puhtaan tai pääasiallisesti puhtaan IFN-a:n mRNA:n valmistukseen ennen yritystä kloonata IFN-geeni tai tuottaa fibroblasti-interferonin kaltaisia polypeptidejä bakteeri-isännissä.

15 Lopuksi olisi todettava, että DNA-sekvenssivalinta tai rekombinantti-DNA-molekyylin, joka hydrisoituu mRNA:n kanssa polyA-RNA:sta, joka mRNA antaa HuIFN-aktiivisuuden varhaismunasoluissa, rakentaminen ei ole riittävä osoittamaan, että DNA-sekvenssi tai rekombinantti-DNA-molekyylin 20 hybridi-insertio vastaa HuIFN:ia. Sensijaan aminohappo-sekvenssin, jota koodaa joku nimenomainen DNA-sekvenssi, ·. ja autenttisen proteiinin aminohapposekvenssin vertailun puuttuessa, ainoastaan polypeptidin, joka antaa HuIFNrn immunologisen tai biologisen aktiivisuuden, valmistaminen 25 voi todella osoittaa, että valittu DNA-sekvenssi tai rakennettu rekombinantti-DNA-molekyyli vastaa HuIFN:ia. Mikä tärkeintä, vasta tällaisen HuIFN-aktiivisuuden osoittamisen jälkeen DNA-sekvenssiä, rekombinanttiDNA-molekyyliä tai niiden sukuisia sekvenssejä voidaan hyödyllisesti 30 käyttää muiden sekvenssien valintaan, jotka vastaavat HuIFN:ia, tämän keksinnön mukaisesti tai tuottamaan rekom-binantti-DNA-molekyylejä, jotka ekspressoivat tuotteita, joilla on HuIFN-8:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus .

35 Siten on edellä esitetyn perusteella selvää, että i2 881 75

HuIFN-B:n tuottamisen ongelma käyttäen rekombinantti-DNA-teknologiaa on suuresti erilainen kuin mikään edellä kuvatuista menetelmistä. Tässä nimenomainen, rakenteeltaan tuntematon DNA-sekvenssi - joka koodaa HuIFN-B:n ekspres-5 siota sopivassa isännässä - täytyy löytää DNA-sekvenssien erittäin monimutkaisesta seoksesta ja erottaa siitä, jotta sitä voitaisiin käyttää HuIFN-B:n valmistuksessa. Lisäksi tätä paikallistamis- ja erotusongelmaa pahentaa halutun DNA-sekvenssin ennustettu erinomaisen alhainen pitoisuus 10 monimutkaisessa seoksessa ja tehokkaiden keinojen puute analysoida nopeasti seoksen monet DNA-sekvenssit halutun sekvenssin valitsemiseksi ja erottamiseksi.

Tämä keksintö ratkaisee mainitut ongelmat paikallistamalla ja erottamalla DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat 15 HuIFN-β:n ekspressiota sopivassa isännässä tuottaen siten DNA-sekvenssejä, rekombinantti-DNA-molekyylin ja menetelmiä, joiden avulla isäntä siirretään tuottamaan polypepti-diä, jolla on ihmisen fibroblasti-interferonin immunologinen tai biologinen aktiivisuus.

20 Keksinnön mukaisille yhdistelmä-DNA-molekyyleille, menetelmälle yksisoluisen isännän transformoimiseksi ja 6-interferonin aktiivisuutta omaavan polypeptidin tuottamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.

25 Tämän keksinnön ansiosta on mahdollista saada poly- peptidejä, joilla on HuIFN-B:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus, käytettäviksi virusvastaisissa, kasvaimen vastaisissa tai syövän vastaisissa aineissa ja menetelmissä. Tämä keksintö tekee mahdolliseksi tuottaa näitä poly-30 peptidejä määrissä ja menetelmien, joita ei aikaisemmin ole ollut käytettävissä.

Kuten seuraavasta esityksestä käy ilmi, pystyvät esitetyt DNA-sekvenssit ja rekombinantti-DNA-molekyylit ohjaamaan polypeptidien, joilla on HuIFN-B:n immunologinen 35 tai biologinen vaikutus, valmistusta sopivassa isännässä.

i3 3 8 1 7 1 Näiden DNA-sekvenssien ja rekombinantti-DNA-molekyylien monistaminen sopivassa isännässä tekee myös mahdolliseksi tuottaa suuria määriä geenejä, jotka koodaavat näitä poly-peptidejä. Näiden polypeptidien ja geenien molekyyliraken-5 ne ja ominaisuudet voidaan helposti määrittää. Polypepti-dit ja geenit ovat käyttökelpoisia, joko sellaisina kuin ne isännässä valmistuvat tai sopivan johdannaisten muodos-telun tai muuntelun jälkeen, yhdistelmissä ja menetelmissä itse näiden tuotteiden löytämiseksi ja valmistuksen paran-10 tamiseksi ja käytettäviksi virusvastaisissa ja kasvaimen-vastaisissa tai syövänvastaisissa aineissa ja menetelmissä ja immunomoduloinnissa.

Tämä menetelmä on siten erotettavissa muista, edellä mainituista, alan aikaisemmista menetelmistä sikäli, 15 että tämä menetelmä, vastakohtana mainituille aikaisemmille menetelmille, käsittää DNA-sekvenssien ja rekombinant-ti-DNA-molekyylien, jotka sisältävät sopivia DNA-sekvens-sejä, jotka koodaavat ainakin yhtä polypeptidiä, jolla on HuIFN-B:n immunologienen tai biologinen aktiivisuus, val-20 mistuksen ja valikoinnin.

Edellä esitetyn perusteella on selvää, että tämän keksinnön peruskohtana on DNA-sekvenssin aikaansaaminen, jolle on ominaista, että se koodaa polypeptidiä, jolla on HuIFN-β:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus ja joka ;;; 25 on valittu ryhmästä, joka käsittää G-pHFIF-1:n, G-pHFIF-3:n, G-pHFIF-6:n, G-pHFIF-7:n, G-pPla-HFIF-67-12:n, G-pPla-HFIF-67-12Al9:n, G-pPla-HFIF-67-8:n, G-pPla-HFIF-67-12A279T:n, G-pPla-HFIF-67-12A218Ml:n, G-pPla-HFIF-67-12AMl:n, 30 G-pPla-HFIF-67-12Al9BX-2:n DNA-insertiot, DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat mihin tahansa edellä mainituista DNA-insertioista, DNA-sekvenssejä, jotka on saatu mistä tahansa lähteestä, kuten luonnollisista, synteettisistä tai puolisynteettisistä lähteistä, jotka on saatu mutaati-35 olla, kuten yksinkertaisilla tai moninkertaisilla emäs- 14 3 8 1 7 ο substituoinneilla, deleetioilla, insertioilla ja inversioilla johonkin edellä mainituista DNA-sekvensseistä tai insertio-osista, ja DNA-sekvenssejä, jotka sisältävät ko-donien sekvenssejä, jotka ekspressiossa koodaavat polypep-5 tidiä, jolla on samanlainen immunologinen tai biologinen aktiivisuus kuin polypeptidillä, jota koodataan jonkun edellä mainitun DNA-sekvenssin kodonien ekspressiossa. Tämän keksinnön sekvensseille on lisäksi ominaista, että ne sallivat HuIFN-B:n ja HuIFN-B:n kaltaisten polypepti-10 dien valmistamisen isännissä.

Kuvissa on kuva 1 kaavamainen luonnos tämän keksinnön erään menetelmän yhdestä suoritusmuodosta rekombinant-ti-DNA-molekyylien seoksen valmistamiseksi, joista molekyyleistä joillekin on ominaista, että niihin on kytketty 15 DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat tämän keksinnön polypep-tidejä.

Kuva 2 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön kloonin alkuseulontaprosessista.

Kuva 3 on kaavamainen luonnos kloonin seulontapro-20 sessin yhdestä suoritusmuodosta, jossa käytetään tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja DNAsekvenssejä.

Kuva 4 esittää HuIFN-B-DNA:n koodaavan säikeen yh-distelmä-nukleotidisekvenssiä. Sekvenssi on numeroitu in-sertio-kohdan alusta insertio-osan translatoimattomalle 25 alueelle. Nukleotidit 65-127 edustavat merkki-sekvenssiä ja nukleotidit 128-625 edustavat "kypsää" fibroblasti-interferonia. Merkki-polypeptidin aminohappo-sekvenssit on kuvattu vastaavien nukleotidi-sekvenssiensä yläpuolelle; merkki-polypeptidin aminohapot on numeroitu -21:stä -l:een 30 ja kypsän interferonin aminohapot on numeroitu yhdestä 166:een. HuIFN-B-DNA:n, joka on läsnä viljelyissä, jotka on talletettu GB-patenttihakemuksen 8011306, jätetty 3.4. 1980, yhteydessä, restriktioja fragmenttianalyysi-arvojen tarkastelusta on ollut seurauksena kahden nukleotidin 35 vaihtuminen kuvassa 4 verrattuna mainitun brittiläisen is 88175 patenttihakemuksen kuvaan 4. Nämä muutokset ovat transla-toimattomassa sekvenssissä, joka edeltää ehdotettua HuIFN-B-DNA:n merkki-sekvenssiä. Nämä muutokset eivät vaikuta HuIFN-B-DNA:n sekvenssiin tai sen translaatio-tuotteiden 5 aminohappo-sekvenssiin eivätkä muuta sekvenssien käyttöä hydridisoimis-koettimena kloonien HuIFN-B:n sukuisille DNA-insertio-osille seulomiseksi.

Kuva 5 esittää suuntaus- ja pilkkomiskarttoja useille plasmideille tämän keksinnön mukaisesti.

10 Kuva 6 ihmisen fibroblasti-interferonin aminohappo- koostumuksen, määritettynä tämän keksinnön mukaisesti, vertailu autenttisesta fibroblasti-interferonista määritettyyn .

Kuva 7 esittää tämän keksinnön HuIFN-B-geenin piol-15 kontakarttaa ja sekvenssointistrategiaa, jota on käytetty sekvenssoitaessa pHFIF3, pHFIFö ja pHFIF7.

Kuva 8 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön re-kombinantti-DNA-molekyylin pPLa-HFIF-67-1 rakentamisesta.

Kuva 9 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön re-20 kombinantti-DNA-molekyylin pPLa-HFIF-67-12 ja pPLa-HFIF- 67-12Δ19 rakentelusta.

Kuva 10 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön re-kombinantti-DNA-molekyylin pPLc-HFIF-67-8 rakentelusta.

Kuva 11 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön 25 pPLa-HFIF-67-12:n suuntaus- ja osittaispilkontakartasta.

Kuva 12 on kaavamainen luonnos tämän keksinnön pPLa-HFIF-67-12 19:n suuntaus- ja osittainpilkontakartas-ta.

Kuva 13 on kaavaminen luonnos tämän keksinnön 30 pPLc-HFIF-67-8:n suuntaus- ja osittaispilkontakartasta.

Tässä kuvatun keksinnön täydellisemmin ymmärtämiseksi esitetään seuraava yksityiskohtainen selostus.

Selostuksessa käytetään seuraavia termejä:

Nukleotidi - DNA:n tai RNA:n monomeeri-yksikkö, 35 joka koostuu sokeriosasta (pentoosi), fosfaatista ja typ- Α Π Λ r 7 ·- 16 Ö 8 I / o pipitoisesta heterosyklisestä emäksestä. Emäs on liittynyt sokeriosaan glykosidi-hiilen kautta (pentoosin 1'-hiili ) ja tätä emäksen ja sokerin yhdistelmää nimitetään nuk-leosidiksi. Emäs luonnehtii nukleotidia. Neljä DNA-emästä 5 ovat adeniini ("A"), guaniini ("G"), sytosiini ("C") ja tyrniini ("T"). Neljä RNA-emästä ovat A, G, C ja urasiili ( ”U" ).

DNA-sekvenssi - Suora jono nukleotidejä, jotka ovat liittyneet toisiinsa fosfodiesteri-sidoksin viereisten 10 pentoosien 3'- ja 5'-hiilien välissä.

Kodoni - Kolmen nukleotidin (kolmikon) DNA-sekvenssi, joka koodaa mRNA:n kautta aminohapon, translaation aloitusmerkin tai translaation lopetusmerkin. Esimerkiksi nukleotidi-kolmikot TTA, TTG, CTT, CTC, CTA ja CTG koodaa-15 vat aminohappoa leusiini ("Leu"), TAG, TAA ja TGA ovat translaation lopetusmerkkejä ja ATG on translaation aloi-tusmerkki.

Koodikaava - kodonien ryhmittymä mRNA:n traslaa-tion aikana aminohappo-sekvensseiksi. Translaation aikana 20 oikea koodikaava täytyy ylläpitää. Esimerkiksi DNA-sekvenssi GCTGGTTGTAAG voidaan ilmaista kolmena koodikaavana tai vaiheensa, josta jokainen antaa erilaisen aminohappo-sekvenssin : GCT GGT TGT AAG - Ala-Gly-Cys-Lys 25 G CTG GTT GTA AG - Leu-Val-Val GC TGG TGG TAA - Trp-Leu-(STOP)

Polypeptidi - Suora jono aminohappoja, jotka ovat liittyneet toisiinsa peptidi-sidoksen vieresten aminohappojen α-amino- ja karboksi-ryhmien välissä.

30 Genomi - Solun tai viruksen ehyt DNA. Se sisältää muunmuassa rakennegeenit, jotka koodaavat aineen polypep-tidejä. Sekä myös operaattorin, promoottorin ja ribosomin sitomis- ja vuorovaikutus-sekvenssit, sellaiset sekvenssit kuin Shine-Dalgarno-sekvenssit mukaanluettuina.

17 3817·-;

Rakennegeeni - DNA-sekvenssi, joka mallinsa tai lähetti-RNA:nsa ("mRNA") kautta koodaa aminohappojen sekvenssin, joka on luonteenomainen spesifiselle polypepti-dille.

5 Transkriptio - Prosessi mRNA:n tuottamiseksi raken- negeenistä.

Translaatio - Prosessi polypeptidin tuottamiseksi mRNA:sta.

Ekspressio - Prosessi, jonka rakennegeeni on läpi-10 käynyt polypeptidin tuottamiseksi. Se on transkription ja translaation yhdistelmä.

Plasmidi - Ei-kromosomaalinen, kaksisäikeinen DNA-sekvenssi, joka käsittää koskemattoman "replikonin", niin että plasmidi monistuu isäntäsolussa. Kun plasmidi sijoi-15 tetaan yksisoluiseen organismiin, muuttuvat tämän organismin ominaisuudet tai transformoituvat seurauksena plasmi-din DNA:sta. Esimerkiksi plasmidi, joka sisältää geenin p tetrasykliini-resistenssiä varten (Tet ), muuttaa solun, joka on sitä ennen ollut herkkä tetrasykliinille, soluksi, 20 joka on resistentti sille. Solua, joka on transformoitu plasmidilla, nimitetään "transformantiksi".

Faagi tai bakteriofaagi - Bakteeri-viruksia, joista monet koostuvat DNA-sekvensseistä kapseloituina proteiini-kuoreen tai päällysteeseen ("kapsidi").

25 Kloonaus-siirtäjä - Plasmidi, faagi-DNA tai muu DNA-sekvenssi, joka pystyy kopioitumaan isäntäsolussa ja jolle on ominaista yksi tai pieni lukumäärä endonukleaasi-tunnistuskohtia, joissa tällaiset DNA-sekvenssit voidaan leikata määrätyllä tavalla, ilman että siihen liittyy 30 DNA:n jonkun oleellisen biologisen funktion häviötä, esim. replikaation, päällyste-proteiinien tuotannon tai promoottorin tai sitomiskohtien häviötä, ja jotka sisältävät merkitsijän, joka on sopiva käytettäväksi transformoitujen solujen identifioinnissa, esim. tetrasykliiniresistenssin 35 tai ampisilliini-resistenssin. Kloonaussiirtäjää nimitetään usein vektoriksi.

ie 88175

Kloonaus - Prosessi organismien populaation tai yhdestä tällaisesta organismista johdettujen DNA-sekvens-sien tai sekvenssin saamiseksi suvuttomalla lisääntymisellä.

5 Rekombinantti-DNA-molekyyli eli hybridi-DNA-mole- kyyli, joka koostuu DNA-segmenteistä eri genomeista, jotka on liitetty päittäin elävien solujen ulkopuolella ja joilla on kyky infektoida joku isäntäsolu ja säilyä siinä.

Ekspression säätely-sekvenssi - Nukleotidien sek-10 venssi, joka kontrolloi ja säätelee rakennegeenien eks-pressioita kun ne operatiivisesti liitetään näihin geeneihin. Ne sisältävät faagin λ lac-systeemin, pääoperaattori-ja promoottorialueet, fd-päällysteproteiinin kontrolli-alueen ja muita sekvenssejä, joiden tiedetään säätelevän 15 prokaryoottisten tai eukaryoottisten solujen geenien ja niiden virusten ekspressiota.

Viitaten nyt kuvaan 1 siinä on esitetty kaavamainen luonnos erään menetelmän yhdestä suoritusmuodosta rekombi-nantti-DNA-molekyylien, joista jotkut sisältävät kytketty-20 jä DNA-sekvenssejä, jotka luonnehtivat tätä keksintöä, seoksen valmistamiseksi.

Poly(A)RNA:n, joka sisältää ihmisen fibroblasti-inter-feroni-mRNA (IFN-B-mRNA):ta, valmistus Tässä keksinnössä käytetty RNA uutettiin ihmisen 25 VGS-soluista, diploidi-fibroblasti-solulinjasta, joka voi daan saattaa lisääntymään yksikerroksisissa viljelyissä 37 °C:ssa. IFN-B:aa syntyy näissä soluissa indusoitaessa poly(I,C):11a sykloheksimidin läsnäollessa.

Tyypillistä RNA-eristystä varten jokaista 20 sent-30 rifuugipullosta, jossa oli diploidi-VGS-soluja yhtyvässä yksinkertaisessa kerroksessa, pohjustettiin ("primed") yli yön 100 yksiköllä/ml IFN-B ja viljelyjä indusoitiin 1 h 100 pg/ml:lla poly(I,C) ja 50 pg/ml:lla sykloheksimidiä, inkuboitiin sykloheksimidin kanssa (50 pg/ml) r tuntia 35 korjattiin kaapimalla fosfaattina puskuroituun suola- 19 881 75 liuokseen ja lingottiin. Soluja liuotettiin 15 minuuttia 0 °C:ssa koskemattomien tumien poistamiseksi, jotka sisälsivät DNA:n, ja sytoplasma-RNA: n eristämiseksi suspendoi-malla ne hypotooniseen puskuriin (10 mM tris-HCl (pH 7,4), 5 10 mM NaCl ja 1,5 mM MgC^) ja lisäämällä NP40 1 %:ksi.

Tumat poistettiin pelletoimalla Sorvali SS-34-sentrifugis-sa 5 minuutin ajan kierrosluvulla 3.000 r/min. Päällä olevaan nesteeseen lisättiin natriumdodekyylisulfaattia ("SDS") ja EDTA 1 %:ksi ja vastaavasti 10 mM:ksi, ja seos-10 ta uutettiin 5 kertaa kaksinkertaisella tilavuudella 1:1 uudelleentislattua fenolia ja kloroformi-isoamyylialko-holia (25:1), jolloin RNA:n sisältävät vesipitoiset faasit oli erotettu linkoamalla Sorvali SS-34-lingossa kier-rosnopeudella 8.000 r/min. 10 minuutin ajan jokaisen uuton 15 jälkeen. RNA saostettiin vesipitoisesta faasista lisäämällä 1/10 tilavuusosaa 2 M natriumasetaattia (pH 5,1) ja 2,5 tilavuusosaa etanolia. Tavallisesti saatiin 60 - 90 yg täysin sytoplasmista RNA:ta sentrifugipulloa kohti.

Muita menettelytapoja solulima-RNA:n uuttamiseksi 20 on myös käytetty. Esimerkiksi, solut liuotettiin täysin homogenoinnin jälkeen 0,2 M tris-HCl:ään (pH 9,0), 50 mM NaCl:ään, 20 mM EDTA:aan ja 0,5-%:iseen SDS:ään ja uutettiin fenoli-kloroformilla kuten edellä (F. H. Reynolds, et. ai., "Interferon Activity Produced by Translation of 25 Human Interferon Messenger RNA in Cell-Free Ribosomal Systems and in Xenopus Oocytes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, sivut 4881-87 (1975)), tai pestyt solut suspen-doitiin 400 yl:ään 0,1 M NaCl, 0,01 M tris-HCl (pH 7,5) ja 0,001 M EDTA ("NTE-puskuri" )) ja lisättiin 2,5 ml 4 M gua-30 nidiniumisotiosyanaattia ja 1 M B-merkaptoetanolia 2 mM natriumasetaatissa (pH 5,0) ja solut homogenoitiin. Ly-saatti kerrostettiin 1,3 ml:n 5,7 M CsCl-patjalle Beckman SW-60 Ti-nitroselluloosaputkessa, lingottiin 17 tuntia nopeudella 39.000 r/min. RNA:n pelletoimiseksi ja sen 35 erottamiseksi DNA:sta, proteiineista ja lipoideista, ja 0 0 17

20 o V \ / .J

RNA uutettiin kerran fenoli-kloroformilla (J. Morser, et ai., "Characterization of Interferon Messenger RNA from Human Lymphoblastoid Cells", J. Gen. Virol., 44, sivut 231-34 (1979)).

5 Kokonais-RNA analysoitiin IFN-B-mRNA:n läsnäolon suhteen ruiskuttamalla Xenopus laevis-varhaismunasolujen solulimaan ja määrittämällä siinä indusoitunut IFN-B-ak-tiivisuus (Reynold, et ai., supra). Määritys suoritettiin liuottamalla RNA veteen ja ruiskuttamalla n. 50 μΐ jokai-10 seen varhaismunasoluun. Varhaismunasoluja inkuboitiin yli yön huoneen lämpötilassa Barth'in väliaineessa (J. Gurdon, J. Embryol. Exper. Morphol., 20, sivut 401-14 (1968)), homogenoitiin osassa väliaineesta, orgaanisten aineiden jätteet poistettiin linkoamalla ja päällä olevan nesteen 15 IFN-B-aktiivisuus määritettiin. IFN-B-aktiivisuuden il maiseminen tapahtui vähentämällä viruksen aiheuttamaa sy-topaattista vaikutusta (W. E. Stewart ja S. E. Suikin, "Interferon Production in Hampsters Experimentally Infected with Rabies Virus", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 20 123, sivut 650-53 (1966)). Hyökkääjävirus oli rakkula-sto- matitisvirus (Indiana-kanta) ja solut olivat ihmisen dip-loidi-fibroblasteja, jotka olivat trisomisia kromosomin 21 suhteen suuremman IFN-B-herkkyyden antamiseksi. IFN-B-aktiivisuus ilmaistaan suhteessa iFN-vertailustandardiin 25 69/19.

Poly(A) RNA, joka sisälsi IFN-B-mRNA, eristettiin solulima-RNA:sta adsorboimalla oligo(dT)selluloosaan (tyyppi 7; P-L Biochemicals) 0,4 M NaCl:ssa, 10 mM tris-HCl:ssa (pH 7,8), 10 mM EDTArssa ja 0,2-%:isessa SDS:ssa 30 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. RNA:n kasautumista vähennettiin kuumentamalla RNA:ta 2 minuuttia 70 °C:ssa ennen adsorptiota. Selluloosan pesemisen jälkeen edellä mainitulla puskurilla poly(A) RNA-jae eluoitiin 10 mM tris-HCl:11a (pH 7,8), 1 mM EDTA:11a ja 0,2-%:isella SDS-35 :11a. Sitä oli yleensä 4 - 5 % kokonais-RNA: sta, mitattuna optisella tiheydellä 260 nm:ssä.

21 8817 ;·;

Lisäpuhdistaminen poly(A)RNA:n rikastamiseksi IFN-B-mRNA:n suhteen suoritettiin formamidi-sakkaroosigradien-teilla (T. Pawson, et ai., "The Size of Rous Sarcoma Virus mRNAs Active in Cell-Free Translation", Nature, 268, sivut 5 416-20 (1977)). Näillä gradienteilla on paljon suurempi erottelykyky kuin ei-denaturoivilla sakkaroosi-gradienteilla. Tavallisesti n. 80 pg poly(A)-RNA:ta liuotettiin 50-%:iseen formamidiin, 100 mM LiCl:ään, 5 mM EDTA:han, 0,2-%:iseen SDS:ään ja 10 mM tris-HCl:ään (pH 7,4), kuulo mennettiin 37 eC:ssa 2 minuuttia kasautumisen ehkäisemiseksi ja kuormitettiin 5 - 20 %:n sakkaroosigradientille Beckman'in SW-60-Tipolyallomeeri-putkessa. 4,5 tunnin lin- koamisen jälkeen 20 °C:ssa nopeudella 60.000 r/min Beckman 14 SW-60-Tisentrifuugissa kokonaan C-merkitvn eukaryootti-15 sen RNA:n toimiessa koon merkitsijöinä, gradientti fraktioitiin ja fraktioiden optinen tiheys määritettiin. Kaikki RNA-jakeet seostettiin kahdesti 0,5 M NaCl:lla ja 2,5 tilavuusosalla etanolia ja analysoitiin interferoni-mRNA-aktiivisuuden suhteen kuten edellä kuvattiin. Nämä puhdis-20 tusprosessit antavat n. 40-kertaisen rikastumisen poly(a)-RNA:n IFN-B-mRNA-pitoisuudessa.

Vaikkakin VGS-soluista peräisin oleva RNA näytti sisältävän ainoastaan yhden IFN-B:aa koodaavan mRNA-fraktion, muista solulinjoista peräisin oleva RNA näyttää si-25 sältävän lisäksi ainakin yhden tai mahdollisesti useampia IFN-B:aa koodaavia mRNA-fraktioita. Tämä jälkimmäinen mRNA ei hydridisoidu edellisen mRNA:n kanssa, vaan koodaan proteiinia, jolla on IFN-B-aktiivisuus, ja inaktivoituu autenttiselle IFN-B:lle spesifisten antiseerumien vaikutuk-30 sesta. Tällaisen mRNA:n ja muiden sen kanssa hybridisoitu-vien mRNA-fragmenttien kloonaus ja ekspressio kuuluvat myös esillä olevan keksinnön suojapiiriin, koska myöhemmin kuvattavia menetelmiä voidaan siihen soveltaa.

Vaihtoehtoisesti oligo(dT)adsorboitu mRNA (60 pg) 35 fraktioitiin elektroforeesilla 4-%:isessa polyakryyliami- 22 88175 digeelissä 7 M ureassa, 0,l-%:isessa SDS:ssa, 50 mM tris-boraatissa (pH 8,3) ja 1 mM EDTA:ssa, jolloin mRNA liuotettiin tähän puskuriin ja kuumennettiin 1 min. 55 °C:ssa ennen geeliin lisäämistä. Elektroforeesin jälkeen geelistä 5 leikattiin 2 mm:n levyisiä viipaleita ja RNA eluotiin jokaisesta homogenoidusta geeliviipaleesta, vapautettiin vielä epäpuhtauksista adsorboimalla oligo(dT)selluloosaan ja analysoitiin IFN-B-mRNA:n suhteen kuten edellä.

Tässä vaiheessa olisi huomattava, että poly(A)RNA-10 tuote, joka on saatu formamidi-sakkaroosi-gradienteista, sekä myös polyakryyliamidigeelifraktionointi sisältävät hyvin suuren lukumäärän erilaisia mRNA'itä. Lukuunottamatta mRNA:ta, joka on spesifinen IFN-B:lle, muut mRNA't ovat ei-toivottuja epäpuhtauksia (kuva 1). Valitettavasti nämä 15 saaste-RNA't käyttäytyvät samalla tavalla kuin HulFN-B-mRNA läpi koko tämän keksinnön jäijelläolevan kloonauspro-sessin. Siten niiden läsnäolosta poly(A)-RNA:ssa on seurauksena suuren joukon ei-toivottuja bakteeri-klooneja kriitillinen valmistuminen, jotka kloonit sisältävät gee-20 nejä, jotka voivat koodata muita polypeptidejä kuin IFN-B:aa. Tämä saastuminen muodostaa monimutkaisia seulonta-ongelmia eristettäessä halutttuja IFN-B-hydridiklooneja. IFN-B:n tapauksessa seulontaongelma pahenee vielä sentäh-den, että puuttuu HuIFN-B-mRNA:n tai DNA:n tai niiden osan 25 riittävästi puhdistettu näyte, joka voisi toimia seulonta-koettimena haluttujen kloonien identtifroimista varten. Siten seulontaprosessi IFN-B-klooneille on hyvin aikaan-vievä ja vaikea. Lisäksi, koska ainoastaan hyvin pienen prosentin IFN-B-klooneista itsensä odotetaan ekspressoivan 30 IFN-B:aa biologisesti tai immunologisesti aktiivisessa muodossa, on aktiivisen kloonin eristäminen "neulan etsimistä heinäsuovasta".

Edullisesti voidaan käyttää rekombinantti-DNA-teknologiaa HuIFN-B-mRNA:n tai cDNA:n tai niiden osan puhdis-35 tetun näytteen aikaansaamiseksi. Tätä puhdistettua mRNA:ta 23 8817b tai cDNA: ta voidaan sitten käyttää hyvin suuren määrän bakteeri-klooneja nopeasti seulomiseksi ja siten merkittävästi lisätä todennäköisyyttä kloonin eristämiseksi, joka ekspressoi IFN-S:n aktiivisessa muodossa.

5 Kaksisäikeisen cDNA;n, joka sisältää IFN-6-cDNA:n, synteesi IFN-B-mRNA:n suhteen rikastettua poly(A)-RNA:ta käytettiin mallina komplementaarisen DNA:n ("cDNA") valmistamiseksi, pääasiallisesti kuten R. Devos, et ai., on kuvannut "Construction and Characterization of a Plasmid 10 Containing a nearly Full-Size DNA Copy of Bacteriophage MS2 RNA", J. Mol. Biol., 128, sivut 595619 (1979) plas-midin rakentamiseksi, joka sisältää bakteriofaagin MS2-RNA DNA-kopion.

Yksisäikeinen cDNA valmistettiin poly(A)-RNA:sta 15 RNArsta riippuvalla DNA-polymeraasilla (25 yksikköä) linnun myeloblastosis-viruksen ("AMV") käänteistranskriptaa-sista (Dr. J. Beard'in lahjoitus, Life Sciences, Gulfort, Florida), aloitettiin (dTJ^Q-alukkeella (6 pg, Miles), hybridisoitiin RNA:n poly(A)-häntään 50 pl:ssä 50 mM tris-20 HC1 (pH 8,3), 10 mM MgC^, 30 mM β-merkaptoetanolia, 4 mM Na^P20^, 2,5 pg/pl inaktivoitua naudan seerumialbumiinia, dTTP, dATP, dCTP ja dGTP, jokainen 0,5 mM, ja a-32P-dATP (20 pCi, Amersham). 30 minuutin kuluttua 41 eC:ssa reaktio päätettiin lisäämällä EDTA 10 mM:ksi, reaktioseos uutet-25 tiin yhtä suurella tilavuusmäärällä fenoli/kloroformi/iso-amyylialkoholia (25:24:1) ja vesipitoinen faasi kerrostettiin Sephadex G50-kolonniin ja eluotiin TE-puskurilla (10 mM tris-HCl (pH 7,5) 1 mM EDTA). Vapaat jakeet, jotka osoittivat radioaktiivisuutta, seostettiin lisäämällä 10 30 pg E. coli-siirtäjä-RNA:ta, kaliumasetaattia (pH 5,1) 0,2 ; Miksi ja 2,5 tilavuusosaa etanolia.

Edellä syntentisoitu cDNA-populaatio on itseasiassa cDNA'iden, jotka ovat peräisin eri mRNA'ista, joita oli läsnä rikastetussa poly(A)-mRNA:ssa, monimutkainen seos 35 (kuva 1). Lisäksi, johtuen ennenaikaisesta lopettamisesta 24 3 8 1 7:; AMV-käänteistranskriptaasilla, monet cDNA't ovat epätäydellisiä kopioita eri mRNA'ista poly(A)-RNA:ssa (ei esitetty kuvassa 1).

Ennen cDNA:n tekemistä kaksisäikeiseksi se poiste-5 taan yhteydestään komplementaariseen malli-RNA:hän saosta-malla etanolilla ja inkuboimalla TE-puskurissa (10 mM tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA) ribonukleaasi T^:n kanssa (10 yksikköä, Sankyo Vo., Ltd) ja haima-ribonukleaasi A:n kanssa (10 pg, Sigma) 10 pl:ksi 30 minuutin aikana 37 °C-10 :ssa (jolloin ribonukleaasit ovat vapaita yksisäikeisistä spesifisistä endo- ja ekso-deoksiribonukleaaseista). Mal-lisäikeen poistamisella ribonukleaasilla alkalin sijasta vältetään mahdollinen cDNA-mutaatio alkalin katalysoiman deaminoinnin vaikutuksesta.

15 cDNA-säie voidaan tehdä kaksisäikeiseksi DNA-poly- meraasi I:llä (A. Efstratiadis, et ai., "Enzymatic in Vitro Synthesis of Globin Genes", Cell, 7, sivut 279-88 (1976)). 10 μΐ ribonukleaasi/cDNA-seosta edeltä laimen nettiin 20 plzksi, niin että MgCl2 tuli 10 mM:ksi, DTT 10 20 mM:ksi, kaliumfosfaatti (pH 6,9) 100 mM:ksi, dATP, dCTP, 32 dTTP ja dGTP kukin 0,3 mM:ksi, o- P-dATP:lla (20 pCi, Amershmam) ja DNA-polymeraasi I:llä (40 yksikköä, Bio-labs). 6 tunnin kuluttua 15 °C:ssa lisättiin EDTA 10 mM-:ksi ja SDS 0,1 %:ksi ja kaksisäikeinen cDNA eristettiin 25 uuttamalla ( fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholi), kroma- tografoimalla (Sephadex G50) ja seostamalla tyhjät jakeet kuten edellä.

Yksisäikeisen hiusneulasilmukan, joka jää kaksisäi-keiselle cDNA-rakenteelle, avaamiseksi saostettu cDNA 30 liuotettiin 100 plrään 0,2 M NaCl, 50 mM natriumasetaat-tia (pH 4,5), 10 mM sinkkiasetaattia ja 2 pg:aan kuumana denaturoitua vasikan kateenkorva-DNA:ta ja saatettiin reagoimaan Sl-nukleaasin (5 yksikköä, Sigma) kanssa 30 minuutiksi 37 °C:ssa. EDTA:n lisääminen 10 mM:ksi, uutto feno-35 li/kloroformi/isoamyylialkoholilla ja vesipitoisen faasin 25 88175 seostaminen lisäämällä 10 pg E. coli-siirtäjä-RNA:ta kan-timeksi, 0,2 M natriumasetaattia (pH 5,1) ja 2,5 tilavuus-osaa etanolia, antoi tylppäpäisen kaksisäikeisen cDNA-seoksen. Tämä seos on heterogeeninen seurauksena sekä po-5 ly(A)-RNA:n, jota käytettiin mallina sen valmistamiseksi (kuva 1), heterogeenisyydestä että cDNA-transkriptien ennenaikaisesta päättämisestä AMV-käänteistranskriptaasilla (ei näy kuvassa 1).

Jälkimmäisen heterogeenisyyden vaikutuksen vähen- 10 tämiseksi kaksisäikeinen cDNA jaettiin eri kokoihinsa elektroforeesilla 4-%:isella polyakryyliamidigeelillä 50 mM tris-boraattipuskurissa (pH 8,3) ja 1 mM EDTAissa, jol-32 loin 5'- P-merkitvt pilkontaosaset (0x174 (RF)-DNA) toimivat koon merkitsijöinä. Valittiin sopivankokoisia DNA-15 nauhoja (esim. kokoluokkia 800-900 emäsparia (ep), 700- 800 ep, 650-750 ep ja 550-650 ep). Koska polyakryyliamidi-geelielektroforeesi-käsittelystä poly(A)-RNA:sta valmistettu kaksisäikeinen cDNA antoi erinomaisen n. 850 emäspa-rin nauhan, tämän nauhan katsottiin edustavan täyspituista 20 DNArta. Nauhat eluoitiin murtaamalla geeli 0,5 M ammonium-asetaattiin ja 0,l-%:iseen SDS ja sekoittamalla yli yön. Senjälkeen kun orgaanisten aineiden jätteet oli poistettu linkoamalla, DNA adsorboitiin hydroksyyliapatiitti-jauheeseen, pantiin Sephadex G50-pylvääseen 5 mM natriumfosfaa-25 tissa (pH 7,5), pestiin perusteellisesti puskurilla, eluoitiin 0,45 M natriumfosfaatilla (pH 7,5), ja siitä poistettiin suolat välittömästi Sephadex G-50-matriisin suodatusvaikutuksen avulla. Jakeet, jotka sisälsivät elu- - 32 oidun DNA:n, kuten p-radioaktiivisuudella osoitettiin, 30 saostettiin lisäämällä 10 pg E. coli-siirtäjä-RNA:ta, natriumasetaattia 0,2 M:ksi ja 2,5 tilavuusosaa etanolia.

Edellä kuvatun cDNA:n valmistuksen tehokkuudesta esitetään esimerkkinä tyypillinen koe, jossa n. 2 pg poly-(A)-RNA:ta. formamidi-sakkaroosi-gradientin jälkeen antoi 35 n. 16 ng kaksisäikeista cDNA, jonka koko oli väliltä 800-900 emäsparia.

26 8 81 7 ϊ Jälleen on todettava, että tämä kaksisäikeinen cDNA on suuren joukon cDNA'ita, joista vain harvat ovat IFN-β-cDNArta, seos (kuva 1).

Kaksisäikeisen DNA:n kloonaus 5 Suurta joukkoa erilaisia isäntä/kloonaussiirtäjä- yhdistelmiä voidaan käyttää kloonattaessa keksinnön mukaisesti valmistettua kaksisäikeistä cDNA:ta. Käyttökelpoisia kloonaus-siirtäjiä voivat olla esimerkiksi kromosomaalis-ten, ei-kromosomaalisten ja synteettisten DNA-sekvenssien 10 segmentit, kuten SV40:n erilaiset tunnetut johdannaiset sekä tunnetut bakteeri-plasmidit, esim. plasmidit E. coli-:sta, kuten col El, pCRl, pBR322, pMB9 ja niiden johdannaiset, plasmidit laajemmalta isäntäalueelta, esim. RP4, faagi-DNA't, esim. faagin λ lukuisat johdannaiset, esim. 15 NM 989, sekä muut DNA-faagit, esim. M13 ja lankamaiset yksisäikeiset DNA-faagit ja vektorit, jotka ovat peräisin plasmidien ja faagi-DNA'iden yhdistelmistä, kuten plasmidit, jotka on modifioitu käyttämään faagi-DNA:ta, tai muut ekspressiota säätelevät sekvenssit tai hiiva-plasmidit, 20 kuten 2 μ-plasmidi tai sen johdannaiset. Käyttökelpoisia isäntiä voivat olla bakteeri-isännät, kuten E. coli HB 101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli MRCI sekä jotkut Pseudomonas-, Bacillus subtilis-, Bacillus stearother-mophilus- kannat sekä muut basillit, hiivat ja muut sie-25 net, eläin- tai kasvi-isännät, kuten eläin- (ihminen mukaanluettuna) tai kasvisolut viljelyssä tai muut isännät. Tietenkään kaikki isäntä/vektoriyhdistelmät eivät voi olla yhtä tehokkaita. Isäntä/kloonaus-siirtäjä-yhdistelmän nimenomaisen valinnan voivat alaan perehtyneet tehdä punnit-30 tuaan esitettyjä periaatteita poikkeamatta tämän keksinnön piiristä.

Lisäksi voidaan jokaisessa spesifisessä kloonaus-siirtäjässä valita eri kohtia kaksisäikeisen DNA:n inser-tiota varten. Nämä kohdat ovat yleensä restriktioehdonuk-35 leaasin, joka leikkaa ne, merkitsemiä. Esimerkiksi pBR322- 27 88 1 7b :ssa Pstl-kohta sijaitsee geenissä β-laktamaasia varten, nukleotidi-kolmikkojen välissä, jotka koodaavat tämän proteiinin aminohappoja 181 ja 182. Tätä kohtaa käytti ensimmäisenä S. Nagata et ai., supra, syntetisoidessaan poly-5 peptidejä, joilla on IFN-a:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus. Yksi kahdesta HindiI-endonukleaasi-tunnistus-kohdista on kolmikkojen välissä, jotka koodaavat aminohappoja 101 ja 102 ja yksi useista Tag-kohdista kolmikossa, joka koodaa β-laktamaasin aminohappoa 45 pBR322:ssa. Salo maila tavalla EcoRI-kohta ja PvuII-kohta tässä plasmidissa sijaitsevat minkä tahansa koodausalueen ulkopuolella, jolloin EcoRI-kohta sijaitsee geenien välissä, jotka koodaavat resistenssiä tetrasykliinille ja vastaavasti ampisil-liinille. Tätä kohtaa käytti T. Taniguchi et ai., supra, 15 rekombinanttisynteesikaaviossaan. Nämä kohdat ovat alaan perehtyneiden hyvin tuntemia. On tietenkin selvää, että kloonaussiirtäjällä, joka on käyttökelpoinen tässä keksinnössä, ei tarvitse olla restriktio-endonukleaasi-kohtaa valitun DNA-osasen insertiota varten. Sensijaan siirtäjä 20 voitaisiin liittää osaseen vaihtoehtoisin menetelmin.

Vektori eli kloonaus-siirtäjä ja erityisesti kohta, joka siinä valitaan valitun DNA-pätkän liittämistä varten rekombinantti-DNA-molekyylin muodostamiseksi, määritetään ;·' joukolla eri tekijöitä, esim. jollekin nimenomaiselle res- 25 triktioentsyymille herkkien kohtien lukumäärällä, ekspres-soitavan proteiinin koolla, halutun proteiinin herkkyydellä proteolyyttiseen lyhenemiseen isäntäsolun entsyymien vaikutuksesta, ekspressoitavan proteiinin saastumisella tai sitoutumisella isäntäsolun proteiineihin, jotka ovat 30 vaikeasti poistettavissa puhdistamisen aikana, ekspression tunnusominaisuuksilla, kuten aloitus- ja lopetuskodonien sijainnilla vektorisekvenssien suhteen, sekä muilla tekijöillä, jotka ovat alaan perehtyneiden tiedossa. Vektorin ja insertiokohdan valinta jotakin nimenomaista geeniä var-35 ten määritetään näiden tekijöiden tasapainolla, jolloin 2e 3817', kaikki valinnat eivät ole yhtä tehokkaita jotakin annettua tapausta varten.

Vaikka tekniikan tasolla tunnetaan useita menetelmiä vieraan DNA:n kytkemiseksi kloonaussiirtäjään eli vek-5 toriin rekombinantti-DNA-molekyylin muodostamiseksi, on menetelmä, jota pidetään edullisena alkukloonausta varten, tämän keksinnön mukaisesti, plasmidin (erityisesti pBR322-:n) pilkkominen restriktioentsyymillä, joka on spesifinen insertiota varten valitulle kohdalle (erityisesti PstI) ja 10 dA-häntien lisääminen 3' -päihin terminaalitransferaasilla. Samalla tavalla kaksisäikeistä cDNArta pidennetään lisäämällä dT-häntiä 3'-päihin niiden liittymisen hännälliseen plasmidiin tekemiseksi mahdolliseksi. Hännällistä plasmi-dia ja cDNA:ta lämpökäsitellään sitten cDNA:n kytkemiseksi 15 plasmidin sopivaan kohtaan ja hybridi-DNA:n pyöristämisek-si, jolloin häntien komplementaarinen luonne tekee mahdolliseksi niiden koossapysymisen (kuva 1). Syntyneessä re-kombinantti-DNA-molekyylissä on nyt kytketty geeni valitussa Pstl-pilkontakohdassa (kuva 1). Tätä menetelmää dA-20 dT-häntien muodostamiseksi insertiota varten ko kuvannut D. A. Jackson, et ai., "Biochemical Methods for Inserting New Genetic Information into DNA of Simian Virus 40: Circular SV40 DNA Molecules Containing Lambda Phage Genes and the Galactose Operon of Escherichia coli", Proc. Natl. 25 Acad. Sci. USA, 69, siuvt 2904-909 (1972), sekä R.

Devos, et al., supra. Se antaa n. kolme kertaa niin monta rekombinantti-DNA-plasmidia kuin dG-dC-hännän muodostus.

Tietenkin muut tunnetut menetelmät DNA-sekvenssien kytkemiseksi kloonaus-siirtäjiin rekombinantti-DNA-mole-30 kyylien muodostamiseksi ovat yhtä käyttökelpoisia tässä keksinnössä. Näitä ovat esimerkiksi dG-dC-hännän muodostus, suora liitäntä, synteettiset liittäjät, eksonukleaa-si- ja polymeraasi-liitetyt korjausreaktiot, joita seuraa liitäntä, tai DNA-säikeen pidentäminen DNA-polymeraasilla 35 ja sopivalla yksisäikeisellä mallilla, mitä seuraa liitäntä.

29 P 8175

On tietenkin ymmärrettävä, että nukleotidisekvens-sit tai cDNA-pätkät, jotka on kytketty kloonaussiirtäjän valittuun kohtaan, voivat sisältää nukleotidejä, jotka eivät ole osana varsinaisessa rakennegeenissä haluttua 5 polypeptidiä varten, tai voivat sisältää ainoastaan osasen täydellisestä rakennegeenistä haluttua proteiinia varten. On ainoastaan tarpeen, että, olkoon mikä tahansa DNA-sek-venssi kytketty, transformoitu isäntä tuottaa polypepti-din, jolla on HuIFN-6:n biologinen tai immunologinen ak-10 tiivisuus, tai että DNA-sekvenssi itse on käyttökelpoinen hybridisoimiskoettimena kloonien valitsemiseksi, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia polypeptidien tuottamisessa, joilla on HuIFN-6:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus.

15 Kloonaussiirtäjää tai vektoria, joka sisältää vie raan geenin, käytetään transformoimaan isäntä, niin että isännälle tulee mahdolliseksi ekspressoida polypeptidejä, joilla on HuIFN-B:n immunologinen tai biologinen aktiivisuus, jota hybridi-geeni koodaa. Sopivan isännän valintaa 20 säätelee myös joukko tekniikan tasolla tunnettuja tekijöitä. Näitä ovat esimerkiksi yhteensopivuus valitun vektorin kanssa, proteiinien, joita hybridiplasmidi kodaa, myrkyllisyys, halutun proteiinin talteenoton helppous, ekspres-sointiominaisuudet, bioturvallisuus ja kustannukset. Tasa-25 paino näiden tekijöiden välillä täytyy löytyä ymmärtäen, että kaikki isännät eivät ole yhtä tehokkaita ekspressoi-maan jotakin tiettyä rekombinantti-DNA-molekyyliä.

Tässä systeemissä edullinen alku-kloonaussiirtäjä : : : on bakteeri-plasmidi pBR322 ja edullinen alkurestriktion- 30 endonukleaasi-kohta siinä on Pstl-kohta (kuva 1). Plasmidi . on pieni (molekyylipaino n. 2,6 megadaltöniä) plasmidi, jossa on antibiooteille ampisilliini (Amp) ja tetrasykliini (Tet) resistenttejä geenejä. Tämä plasmidi on täydellisesti luonnehdittu (F. Bolivar, et ai., "Construction and 35 Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multi-Pur- 30 381 75 pose Cloning System", Gene, sivut 95-993 (1977); J. G. Sutcliffe, "pBR322 Restriction Map Derived from the DNA Sequence; Accurate DNA Size Markers up to 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids Research, 5, sivut 2721-28 5 (1978); J. G. Sutcliffe, "Complete Nucleotide Sequence of the Excherichia coli Plasmid pBR322", Cold Spring Harbor Symposium, 43, I, sivut 77-19 (1978)). DNA-tuotteen inser-tio tässä kohdassa antaa suuren joukon bakteeriklooneja, joista jokainen sisältää yhden DNA-geeneistä tai niiden 10 osasista, joita on läsnä aikaisemmin valmistetussa cDNA-tuotteessa. Jälleen ainoastaan hyvin harva näistä klooneista sisältää geenin IFN-B:aa varten tai sen osasia (kuva 1) ja mikään niistä ei salli polypeptidien ekspressiota, joilla on IFN-B:n immunologinen tai biologinen aktiivi-15 suus. Edullinen lähtöisäntä tämän keksinnön mukaisesti on E. coli HB101.

1. Pstl-pilkotun, dA-pidennetyn pBR322:n valmistus

Plasmidi pBR322 pilkottiin täydellisesti 37 °C:ssa Pstl-endonukleaasin kanssa (New England Biolabs) 10 mM 20 tris-HCl:ssä (pH 7,6), 7 mM MgCl2:ssa 7 mM 2-merkaptoeta-nolissa. Seos uutettiin 1 tilavuusosalla fenolia ja 10 tilavuusosalla eetteriä ja saostettiin 2,5 tilavuusosalla etanoli/0,2 M natriumasetaattiliuosta.

Homopolymeeristen dA-häntien (kuva 1) lisääminen 25 terminaalisella deoksinukleotidyylitransferaasilla (TdT) (puhdistettu L. Chang'in ja F. J. Bollum'in mukaan, "Deoxynucleotide-Polymerizing Enzymes of Calf Thymus Gland", J. Biol. Chem., 246, sivut 909-16 (1971)) suoritettiin 50 μ1:η reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 0,14 M 30 kaliumkakodylaattia, 30 mM tris-HCl (pH 6,8), 1 mM CoSO^, 0,2 pg/μΐ kuumassa inaktivoitua nauhan seerumialbumiinia, 32 0,8 mM DTT, 0,2 mM dATP ja jonkinverran a- p-dATP. Inku-bointi tapahtui 37 °C:ssa 5 minuutin aikana ennen EDTA:n lisäämistä iO mM:ksi ja SDS:n 0,l%:ksi ja seos uutettiin 35 fenolilla ja kromatografoitiin Sephadex G50:lla TE-pusku- 3i 88175 rissa. Vapaita jakeita, jotka sisälsivät linearisoidun ja pidennetyn pBR322:n, puhdistettiin edelleen adsorptiolla 10 mM tris-HCl:ssä (pH 7,8, 1 mM EDTA:ssa ja 0,4 M NaCl-:ssa oligo(dT)selluloosan. Perusteellisen pesun jälkeen 5 halutut fraktiot eluoitiin 10 mM tris-HCl:llä (pH 7,8) ja 1 mM EDTA:11a.

2. dT-pidennetyn DNA:n valmistus

Kaksisäikeistä DNA:ta pidennettiin dTMP-tähteillä samalla tavalla kuin edellä kuvattiin pBR322:n dA-hännän 3 10 muodostukselle, paitsi että dTTP ja jonkinverran H-dTTP- 32 : tä korvasivat dATP:n ja a- p-ATP:n. Puhdistaminen oligo-(dT) selluloosalla jätettiin tietenkin pois. Kuten edellä, dT-pidennetty DNA on eri lajien seos, joista vain hyvin harvat ovat HuIFN-B-sukuisia (kuva 1).

15 3. Ca++-käsitellyn E. coli HB101:n valmistus

Ca++-käsiteltyä E. coli HB101:tä valmistettiin E. M. Lederberg'in ja S. N. Cohen'in menetelmällä, "Transformation of Salmonella Typhimurium by Plasmid Deoxyribonucleic Acid", J. Bacteriol., 119, sivut 1072-74 (1974) 20 ymppäämällä E. coli HB101:tä (H. Boyer'in lahjoitus) 5 ml:aan LB-väliainetta (10 osaa baktotryptonia, 5 osaa hii-vauutetta ja 5 osaa NaCl/1) ja kasvattamalla viljelyjä yli . . yön 37 °C:ssa. Tuoreet viljelyt laimennettiin 1/100:aan 20 ; ; g ; ml:aan LB-väliainetta ja viljeltiin n. 2 x 10 bakteerin/ 25 ml tiheyteen, jäähdytettiin äkkiä jäissä ja pelletoitiin kierrosluvulla 6000 r/min. 5 minuutissa Sorvali SS34-sen-trifugissa 4 °C:ssa. Solut, joita pidettiin 0-4 °C:ssa, pestiin 20 ml:11a 100 mM CaC^. 20 minuutin jälkeen jäissä solut pelletoitiin uudelleen ja suspendoitiin uudelleen 30 2 ml:aan 100 mM CaC^ ja pidettiin 0 °C:ssa 15 min. Tasa- osia (200 μΐ), täydennettynä glyserolilla 11 %:ksi, voitiin varastoida useita kuukausia -80 °C:ssa ilman aktiivi-suushäviötä (D. A. Morrison, "Transformation in Escherichia coli; Cryogenic Preservation of Competent Cells", 35 J. Bacteriol., 132, sivut 349-51, (1977)).

32 8 81 7 ι 4. dA-pidennetyn pBR322:n ja dT-pidennetyn DNA:n jäähdyttäminen hitaasti

Vektoreiden ja DNA-insertio-osien komplementaariset dA- ja dT-hännät tekevät mahdolliseksi emäspariutumisen 5 alunperin halutun hybridi-plasmidin tai rekombinantti-DNA-molekyylin muodostamisen. Tätä tarkoitusta varten dA-hän-nän muodostuksen läpikäynyt, PstI-pilkottu pBR322-vektori ja kokolajiteltujen dT-hännillä varustettujen cDNA'iden seos liuotettiin TSE-puskuriin (10 mM tris-HCl (pH 7,6), 1 10 mM EDTA, 100 mM NaCl) 1,5 pg/ml:aan plasmidia ja plasmidi/ DNA-insertio-osamoolisuhteeseen 1,5 - 2,0. Kuumentamisen jälkeen 65 °C:ssa 10 minuuttia seos jäähdytettiin hitaasti huoneen lämpötilaan 4 tunnin aikana.

Tuote on tietenkin eri rekombinantti-DNA-molekyy-15 lien ja joidenkin kloonaus-siirtäjien, joissa ei ole kytkettyjä DNA-sekvenssejä, laaja seos. Jokainen rekombinant-ti-DNA-molekyyli sisältää kuitenkin cDNA-segmentin Pstl-kohdassa. Jokainen tällainen cDNA-segmentti voi sisältää geenin tai sen osasen. Vain hyvin harvat cDNA-osasista 20 koodaavat HuIFN-fl:aa tai sen osaa (kuva 1). Ehdoton pääosa koodaa yhtä muista proteiineista tai niiden osista, joiden mRNA'5 olivat osa poly(A)-RNA:sta, jota käytettiin tämän keksinnön menetelmässä (kuva 1). Olisi myös ymmärrettävä, että mikään edellä valmistetun sarjan klooneista ei salli 25 polypeptidien, joilla on IFN-B:n immunologinen tai biolo-gienen aktiivisuus, ekspressiota.

5. E. coli HBlOlrn transfektio emäspariutetullla hyb-ridi-plasmideilla P3-suojarakennelaitteita käytettiin välttämättömi-30 nä transfektio-prosessia varten samoin kuin kaikkia myöhempiä vaiheita varten, joissa käsiteltiin saatuja transformoituja bakteereita. Edellisen seoksen tasaosia (90 μΐ tai pienempiä) jäähdytettiin 0 °C:seen ja lisättiin 1 M CaC^ 0,1 M:ksi. Tämän liuoksen tasaosia (100 μΐ tai pie-35 nempiä) lisättiin 200 pl:aan Ca++-käsiteltyyn E. coli 33 88175 HB101:een jäissä ja 3 minuutin seisomisen jälkeen 0 ®C:ssa soluja käsiteltiin lämpöshokilla 5 minuutin ajan 37 ®C:ssa ja jäähdytettiin jälleen 0 *C:seen 15 minuutiksi. Senjäl-keen kun oli lisätty 2 ml LB-väliainetta, soluja inkuboi-5 tiin 37 °C:ssa tärisevässä vesihauteessa 30 - 45 minuuttia ja bakteerisuspensio levitettiin 1,2 %:n agarmaljoille, jotka sisälsivät LB-väliainetta täydennettynä 10 pg/ ml:11a tetrasykliiniä.

Koska plasmidi pBR322 sisältää geenin tetrasyklii-10 ni-resistenssiä varten, E. coli-isännät, jotka on transformoitu plasmidilla, jossa on tämä geeni koskemattomana, kasvavat viljelyissä, jotka sisältävät tätä antibioottia, niiden bakteereiden poissulkemiseksi, jotka eivät ole näin transformoituja. Siten viljely tetrasykliiniä sisältävässä 15 viljelyssä tekee mahdolliseksi valita isännät, jotka on transformoitu rekombinantti-DNA-molekyylillä tai resykli-soidulla vektorilla.

24 tunnin jälkeen 37 ®C:ssa yksittäiset pesäkkeet poimittiin ja suspendoitiin 100 plrään LB-väliainetta 20 (täydennetty kuten edellä) mikrotiitterilevyjen (Dynatech) syvennyksiin.

Inkuboinnin jälkeen 37 ®C:ssa yli yön jokaiseen sy-. . vennykseen sekoitettiin 11 μΐ dimetyylisulfokosidia ja kennot suljettiin tarranauhalla. Levyjä varastoitiin -20® 25 C:ssa ja valmistettiin transformoidun E. coli HB101:n 17.000 yksittäisen kloonin kokoelma. Tämä kokoelma oli johdettu 270 fmoolista (128 ng) dT-hännillä varustettuja cDNA-insertio-osia, jotka puolestaan oli syntetisoitu 4,4 pg:n gradientista puhdistettua poly(A)-RNA:ta. N. 98 % 30 tämän kokoelman klooneista olivat herkkiä karbenisillii- nille (eräs pysyvämpi ampisilliini-johdannainen). Siten n. 98 % kokoelmasta sisälsi plasmidin, jossa on insertioosa pBR322:n 8-laktamaasigeenin PstI-kohdassa, ja ainoastaan n. 2 % sisälsi renkaaksi sulkeutuneen vektorin ilman in-35 sertio-osaa.

34 881 75 Nämä 17.000 kloonia sisältävät valikoiman erilaisia rekombinantti-DNA-molekyylejä, jotka edustavat täydellisiä tai osittaisia kopioita mRNA'iden seoksesta poly(A)-RNA:n valmistuksessa HuIFN-6:aa tuottavista soluista (kuva 2).

5 Pääosa näistä sisältää ainoastaan yhden ainoan rekombi-nantti-DNA-molekyylin. Vain hyvin harvat näistä rekombi-nantti-DNA-molekyyleistä ovat sukua HuIFN-B:lle. Niinmuodoin kloonit täytyy seuloa HuIFN-B-sukuisten kloonien erottamiseksi muista.

10 Seulonta kloonin löytämiseksi, joka sisältää HuIFN- β-cDNA;ta

On tehty lukuisia yrityksiä bakteerikloonien seulomiseksi, jotka sisältävät HuIFN-B-cDNA:ta. Näitä ovat esimerkiksi RNA:n valinta-hybridisointi (Alwine et ai., 15 infra), differentiaali-hybridisointi (T. P. St. John ja R.

W. Davis, "Isolation of Galactose-Inducible DNA Sequences from Saccharomyces Cerevisiae by Differential Plaque Filter Hybridization", Cell, 16, sivut 443-452 (1979)); hyb-ridisointi synteettisellä koettimella (B. Noyes, et al., 20 "Detection and Partial Sequence Analysis of Gastrin mRNA by Using an Oligodeoxynucleotide Probe", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, sivut 1770-74 (1979)) tai seulonta kloonien löytämiseksi, jotka tuottavat haluttua proteiinia immunologisin (L. Villa-Komaroff, et ai., "A Bacterial 25 Clone Synthesizing Proinsulin", Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 75, sivut 3727-31 (1978)) tai biologisin (A. C. Y. Chang, et al., "Phenotypic Expression in E. coli of a DNA Sequence Coding for Mouse Dihydrofolate Reductase", Nature, 275, sivut 617-24 (1978)) määrityksin. Tässä on 30 valittu RNArn selektiohybridisointi sopivimmaksi ja lupaavammaksi menetelmäksi alkuseulontaa varten.

35 8 8 1 75 A. RNA-selektio-hybridisointl-määritys 1. Alkumäärityksen arviointi

Viitaten nyt kuvaan 2, eristettiin rekombinantti-DNA-molekyylit n. 46 kloonin, jotka olivat herkkiä karbe-5 nisilliinille ja resistenttejä tetrasykliinille, yksittäisistä viljelyistä edellä mainittujen kloonien kokoelmasta (2 kloonin kaksi seosta on esitetty kuvassa 2) (vaihe A). Rekombinantti-DNA-molekyylit pilkottiin ja hybridisoitiin kokonais-RNA:hän, joka sisälsi HuIFN-B-mRNA:n, joka oli 10 valmistettu kuten edellä (vaihe B). Kaikki rekombinantti-DNA-molekyyli-kokonais-RNA-hybridit erotettiin ei-hybridi-soidusta kokonais-RNA:sta (vaihe C). Hydridisoitu kokonais-RNA otettiin talteen hybrideistä ja puhdistettiin (vaihe D). Talteenotettu RNA analysoitiin HuIFN-B-mRNA-15 aktiivisuuden suhteen kuten edellä (vaihe E). Jos ja ainoastaan jos, rekombinantti-DNA-molekyylien seos sisältää rekombinantti-DNA-molekyylin, jossa on kytkettynä nukleo-tidisekvenssi, joka pystyy hybridisoimaan HuIFN-B-mRNA:n kokonais-RNA:hän vaativissa hybridisoimisososuhteissa, 20 aiheuttaa tästä hybridistä vapautunut mRNA HuIFN-B:n muodostumisen varhaismunasoluissa, koska mRNA, joka vapautuu jostakin muusta rekombinantti-DNA-molekyylikokonais-RNA-hybridistä, ei ole IFN-B-sukuinen. Jos 46 kloonin ryhmä antoi positiivisen vasteen, ryhmiteltiin kloonit uudelleen 25 6 alaryhmäksi (neljäksi kahdeksan alaryhmäksi ja kahdeksi seitsemän alaryhmäksi) ja jokainen alaryhmä analysoitiin kuten edellä. Tätä prosessia jatkettiin kunnes yksi ainoa klooni, joka reagoi tälle määritykselle, identifioitiin.

Ei ole mitään varmuutta siitä, että rekombinantti-30 DNA-molekyylit ja bakteeri-viljelyt, jotka on niillä transformoitu, ja jotka on täten identifioitu, sisältävät täydellisen iFN-B-cDNA-sekvenssin tai että edes DNA-sek-venssi todella koodaan IFN-B:aa tai sallii kloonin eks-pressoida polypeptidejä, joilla on IFN-B:n immunologinen 35 tai biologinen aktiivisuus. Rekombinantti-DNA-molekyylit 36 88175 sisältävät kuitenkin varmasti laajoja nukleotidi-sekvenssejä, jotka ovat IFN-fl-mRNA-koodaussekvenssiä täydentäviä. Siten rekombinantti-DNA-molekyyliä voidaan käyttää ainakin koetinlähteenä muiden rekombinantti-DNA-molekyy-5 lien ja niillä transformoitujen kloonien nopeasti seulomiseksi lisäsarjojen kloonien identifioimiseksi, jotka voivat sisältää autenttisen tai täydellisen IFN-B-nukleotidia koodaavan sekvenssin. Nämä kloonit analysoidaan sitten polypeptidien, joilla on IFN-B:n biologinen tai immunolo-10 ginen aktiivisuus, mahdollisen ekspression suhteen. Lisäksi näiden hybridi-plasmidien kytkeyn DNA-osasen nukleoti-disekvenssi ja sen aminohappo-translaatiotuote voidaan määrittää ja saattaa vastaavuussuhteeseen, jos mahdollista, aminohappokoostumuksen ja alkusekvenssin kanssa, joka 15 on esitetty autenttiselle IFN-B:lle (supra).

2. Alkumäärityksen toteuttaminen

Vaihe A - Rekombinantti-DNA-molekyyliseoksen valmistus

Mikrotiitterilevyn kopiot, jotka sisältävät 96 20 kloonia edellä mainitusta kloonien kokoelmasta, tehtiin LB-agar-levyillä, joista yksi sisälsi 10 pg/ml tetrasykliiniä ja toinen oli täydennetty 100 pg/ml:lla karbeni-silliinia. Tällä tavalla kaksi n. 45 - 46 kloonin sarjaa, jotka olivat resistenttejä tetrasykliinille ja herkkiä 25 karbenisilliinille, poimittiin ja kasvatettiin erikseen yli yön 37 °C:ssa 100 ml:ssa LB-väliainetta, joka sisälsi 10 pg/ml tetrasykliiniä. Nämä viljelyt yhdistettiin, lingottiin Sorvali GS-3-sentrifugilla kierrosnopeudella 8.000 r/min. 10 minuuttia, pestiin kahdesti TES-puskurilla 30 (50 mM tris-HCl (pH 8), 5 mM EDTA, 5 mM NaCl) ja suspen- doitiin uudelleen 40 ml:aan TES’iä/1 alkuperäistä viljely-tilavuutta. Soluja liuotettiin lysotsyymi-Triton X-100:lla (M. Kahn, et ai., "Plasmid Cloning Vehicles Derived from Plasmids Col El, F, R6K And RK2" julkaisussa Methods in 35 Enzymology, 68: Recombinant DNA (R. Wu, toim. ) (1980) 37 8 8 1 7ο (painossa)). 40 ml TES:iin suspendoituja soluja yhdistettiin 20 ml:n kanssa 10-%:ista sakkaroosia 50 mM tris-HCl-:ssa (pH 8) ja lysotsyymissä 1,3 mg/ml:ksi ja annettiin seistä huoneen lämpötilassa 20 min. Tähän suspensioon li-5 sätiin 1 ml 0,5 M EDTA-NaOH (pH 8) ja liuotus saatettiin loppuun huoneen lämpötilassa 30 minuutissa. Orgaaninen solujäte ja suurin osa kromosomaalisesta DNA:sta poistettiin pelletoimalla Beckman SW27 sentrifugissa kierrosno-peudella 24.000 r/min 45 minuutin aikana. Päällä oleva 10 neste jäähdytettiin jäissä, yhdistettiin 1/3 tilavuusosan kanssa 40-%:ista polyetyleeniglykolia 6.000-2 M NaCl ja annettiin seistä yli yön 0 eC:ssa. Saatu sakka kerättiin Sorvali HB4-sentrifugissa kierrosnopeudella 5.000 r/min 10 minuutin aikana 4 °C:ssa ja liuotettiin TES-puskuriin. 15 Liuos lingottiin 0,2 tilavuusosan kanssa 10 mg/ml etidium-bromidia (Serva) ja CsCl:n 1 g/ml:ksi Beckman R60 Ti-lin-gossa kierrosnopeudella 40.000 r/min ainakin 48 tuntia, jolloin yksi polyallomeeriputki tavallisesti oli riittävä lysaattia varten 1-2 litrasta alkuperäistä viljelytila-20 vuutta. Kaksi DNA-nauhaa voitiin saattaa näkyviksi putkessa UV-valotuksella. Suurimman tiheyden omaava nauha vastaa plasmidi-muotoa I DNA, toinen nauha vastaa muodon II ja muodon III plasmidi-DNA'itä ja joitakin kromosomaalisia DNA'itä. Ensimmäinen nauha kerättiin putkesta, etidium-- 25 bromidi poistettiin kuudella isoamyylialkoholi-uutolla ja vesipitoinen faasi laimennettiin 3 tilavuusosalla vettä,

- täydennettynä 0,2 M:iin asti natriumasetaatilla (pH 5,1) ennen DNA-saostusta 2,5 tilavuusosalla etanolia. DNA liuotettiin uudelleen, uutettiin fenolilla ja saostettiin jäl-30 leen etanolilla. DNA:n laatua tarkkailtiin elektroforeesissa l-%:isella agaroosigeelillä 40 mM tris-HOAc:ssa (pH 7,8), 20 mM natriumasetaatissa, 2 mM EDTA:ssa, mitä seurasi värjääminen etidiumbromidilla. Jos DNA oli saastunut liian paljolla RNA:lla, sitä puhdistettiin edelleen neut-35 raalisakkaroosi-gradientti-sentrifugoinnilla: 300 pg DNA

38 88175 10 mM tris-HCl:ssa (pH 7,6) ja 1 mM EDTA:ssa kuormattiin 36 ml:n 5 - 20-%:iseen sakkaroosi-gradienttiin 10 mM tris-HCl:ssa (pH 7,6), 1 mM EDTA:ssa, 1 M NaCl:ssa, lingottiin polyallomeeri-putkissa 16 tuntia kierrosluvulla 24.000 5 r/min. Beckman SW27-sentrifugissa 18 °C:ssa ja DNA:ta sisältävät jakeet (O°260^ yhdistettiin ja saostettiin nat-riumasetaatti-etanolilla.

Vaihe B - DNA:n hybridisointi kokonais-RNA:11a N. 150 pg näin valmistettua DNA:ta yhdistettiin 32 10 pienen määrän kanssa tasaisesti merkittyä p-merkitsijä-DNA:ta ja 2 pg:n kanssa pSTNV-l-DNA (rekombinanttiplasmi-di, joka sisältää satelliitti-tupakka-nekroosiviruksen ("STNV")-RNA:n täysikokoisen cDNA-kopion; J. Van Emmelo, et ai., "Construction and Characterization of a Plasmid 15 Containing a nearly Full-Size DNA Copy of Satellite Tobacco Necrosis Virus RNA", J. Mol. Biol., (painossa) sisäisenä kontrollina, leikattiin äänikäsittelyllä MSE-sonikaat-torissa ja saostettiin natriumasetaatti-etanolilla.

Valmistettiin kiinteä diatsobentsyylioksimetyyli 20 (DBM)-selluloosamatriisi (vrt. J. C. Alwine, et ai., "Method for Detection of Specific RNAs in Agarose Gels by Transfer to Diazobenzyl Oxymethyl Paper and Hybridizing with DNA Probes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, sivut 5350-54 (1977)) J. C. Alwine'n, et ai., menetelmän mukai-25 sesti, "Detection of Specific RNAs or Specific Fragments of DNA Fractionation in Gels and Transfer to Diazobenzylo-xymenthyl Paper", Methods Enzymology, 68: Recombinant DNA (R. Wu, toim.) (1980). Paperimatriisia varten imeytettiin Whatman 540 paperin arkkia tasaisesti liuoksessa, joka 30 sisälsi 2 - 3 mg 1-(m-nitrobentsyylioksi)metyyli-pyridi- niumkloridia (NBPC/BDH) ja 0,7 ml natriumasetaattitrihyd- 2 raattia, 28,5 pl:ssa vettä/cm , inkuboitiin 60 °C:ssa kuivaksi ja vielä 10 minuuttia ja paahdettiin 130 - 135 °C-: ssa 30 - 40 minuuttia. Senjälkeen kun sitä oli pesty 35 useaan kertaan vedellä (n. 20 minuuttia), kolme kertaa 39 881 75 asetonilla (n. 20 minuuttia), ja kuivattu, se varastoitiin. Paperi inkuboitiin 60 eC:ssa 30 minuuttia 0,4 ml:ssa 2 20-%:ista natriumditioniitti-vettä/cm satunnaisesti ravistellen. Paperi pestiin jälleen neljä kertaa vedellä, 5 kerran 30-%:isella etikkahapolla 5 minuuttia ja nejä kertaa vedellä, siirrettiin 0,3 ml:aan/cm2 jääkylmää 1,2 M HC1, johon oli lisätty 10 mg/ml tuoretta NahK^ välittömästi ennen käyttöä, 30 minuutiksi 0 °C:ssa ja pestiin kahdesti nopeasti jääkylmällä vedellä ja kerran 80 %:lla di-10 metyylisulfoksidia (spektrofotometrinen laatu, Merck)-20 %:lla 25 mM natriumfosfaattia (pH 6,0). Jauhe-matriisia varten seurattiin pääasiallisesti samaan menettelyä käyttäen hienorakeista selluloosajauhetta (Whatman CC31), jolloin määrät on ilmaistu selluloosamatriisin vastaavaa pai-15 noa kohti.

Aluksi käytettiin jauhe-matriisia, koska sitomis-kyky oli suurempi, niin että siten voitiin käyttää suhteellisesti pienempiä määriä hybridisointia, pesuja ja eluointia varten. Senjälkeen käytettiin paperimatriisia 20 yksilölliistä klooniseulontaa varten. Paperin käyttö tekee mahdolliseksi tehokkaan eluoinnin vedellä, mikä osoittautui paremmaksi IFN-3-mRNA:n myöhempää määritystä varten.

Edellä valmistettu DNA liuotettiin 25 mM natrium-fosfaattiin (pH 6,0), kuumennettiin 1 minuutti, jäähdy-25 tettiin ja lisätiin 4 tilavuusosaa DMSO. Liittäminen matriisiin (50 mg (jauhetta) tai paperiarkkiin (läpimitta 10 mm)) tapahtui yleensä viikonlopun aikana 4 eC:ssa jatkuvasti sekoittaen. DNA:n tilavuus pidettiin melko pienenä läheisen kosketuksen sallimiseksi matriisin kanssa ja si-30 ten DNA:n tehokkaan kiinnittymisen parantamiseksi matriisiin. Liittämisen jälkeen matriisi pestiin neljä kertaa vedellä ja neljä kertaa 0,4 N NaOH:lla 37 °C:ssa kulloinkin 10 minuuttia, jälleen neljä kertaa vedellä huoneen lämpötilassa ja lopuksi kahdesti hybridisoimispuskurilla ' 35 (50-%:ista formamidia (deionoitua, Baker), 40 mM piperat- 40 88175 siini-N,Ν'-bis(2-etaanisulfonihappoa) (pH 6,4) ("PIPES",

Sigma) 1 mM EDTA, 0,6 M NaCl ja 0,1-T:sta SDS) 4 °C:ssa.

32

Liittymistehokkuudet mitattiin p-radioaktiivisuudella.

20 pg kokonais-RNA, joka oli valmistettu kuten 5 edellä, ja 50 ng STNV-RNA liuotettiin 250 pl:ään (50 μΐ paperimatriisia varten) hybridisoimispuskuria ja lisättiin DNA-liitettyyn matriisiin. Matriisia kuumennettiin 70 °C-: ssa 2 minuuttia ja pidettiin 37 °C:ssa yli yön miedosti sekoittaen.

10 Vaihe C - Hybridisoidun kokonais-RNA-DNA:n erotta minen ei-hybridisoidusta kokonais RNAista Jauhe-matriisin linkoamisen jälkeen hybridisoimat-tomat RNA't poistettiin ja matriisi pestiin 7 kertaa yhteensä 2 ml:11a 50-%:ista formamidia, 10 mM PIPES'lla (pH 15 6,4), 1 mM EDTA:lla, 0,3 M NaCl:lla ja 0,l-%:isella SDS- :11a, jolloin näiden pesunesteiden suolapitoisuus destabi-loi ei-spesifisen RNA-DNA-sidoksen. Jokaista pesua seurasi linkoaminen ja matriisin uudelleen suspendoiminen puskuriin. Myöhempää analyysiä varten ensimmäinen pesuneste 20 yhdistettiin hybridisoimattoman RNA:n kanssa ("jae 1") ja pesunesteet 2-4 ("jae 2") ja pesunesteet 5-7 ("jae 3") yhdistettiin. Hybridisoinneissa paperimatriisiin käytettiin samanlaista menettelytapaa, paitsi että pesunesteen kokonaistilavuus rajoitettiin 1 ml:ksi.

25 Vaihe D - Hybridisoidun kokonais-RNA:n puhdistus

Hybridisoitu kokonais-RNA-DNA eluoitiin jauhemat-riisista kolmella eluoinnilla käyttäen yhteensä 900 μΐ 99-%:ista formamidia, 0,2-%:ista SDS 70 °C:ssa 2 minuuttia ja jäähdytettiin jäissä. Kokonaishybridisointiprosessi ja 30 eluointi formamidilla tapahtuivat pääasiallisesti kuten A. G. Smith on selittänyt (henkilökohtainen kommunikaatio). Hybridisoitu kokonais-RNA-DNA eluoitiin paperimat-riisista pesemällä ensin 100 pl:llä jääkylmää vettä ja eluoiden senjälkeen kahdesti vedellä (yhteensä 300 μΐ) 35 80 °C:ssa 2 minuuttia. Myöhempää analyysiä varten nämä 4ΐ 3817Ϊ eluaatit ja 100 μΐ pesunestettä yhdistettiin ("jae 4").

Puoleen kustakin neljästä jakeesta lisättiin 0,1 pg vasikanmaksa-tRNA tai ribosomaalista RNA (jakeet IA, 2A, 3A ja 4A) ja toisiin puolikkaisiin 8 pg eukaryoottista 5 poly(A)-RNA:ta tai ribosomaalista RNA:ta (jakeet IB, 2B, 3B, 4B). Jakeet puhdistettiin seostamalla lisäämällä 0,5 M NaCl ja 2,5 tilavuusosaa etanolia jäljelläolevien pienien formamidi-määrien ja muiden epäpuhtauksien poistamiseksi.

Vaihe E - IFN-B-mRNA-aktiivisuuden määritys 10 Jakeet IA, 2A, 3A ja 4A translatoitiin 25 piissä nukleaasilla käsiteltyä kaniinin retikulosyyttilysaattia (valmistettu R. B. Pelham'in ja R. J. Jackson'in menetelmän mukaisesti "An Efficient mRNA-Dependent Translation System for Reticulocyte Lysates", Eur. J. Biochem., 7, 15 sivut 247-56 (1976)) B. LeBleu'n, et ai., menetelmällä, "Translation of Mouse Interferon mRNA in Xenopus Laevis Oocytes and in Rabbit Reticulocyte Lysates", Biochem. Bio-phys. Res. Coramun., 82, sivut 665-673 (1978) paitsi että lisättiin 250 mM spermidiini-HCl:ää ja 1 mM fruktoosi-1,6- 35 20 difosfaattia S-metioniinin (0,5 mCi/ml, Amersham) läsnäollessa. Inkuboinnin jälkeen 25 pl retikulosyytti-lysaat-tia edeltä yhdistettiin 1 pl:n kanssa 10-%:ista deoksiko-laatti-10-%:isen Triton X100 ja 2 pl antiseerumi-PBS (1:9) kanssa ja kuumennettiin 37 °C:ssa 1 h. Lisättiin 20 pl 25 Staphylococcus aureus Cowan I:tä (vastapestyä, S. W. Kessler, et ai., "Rapid Isolation of Antigens from Cells with a Staphylococcal Protein A-Antibody Adsorbent: Parameters of the Interaction of Antiboby-Antigen Complexes with Protein A", J. Immunology, 115, sivut 1617-1624 30 (1975)) 10 %:ssa 100 mM NaCl, 10 mM tris-HCl:ssä (pH 7,4), 1 mM EDTA:ssa ja 0,05 %:ssa NP40 ja seos pidettiin 20° C:ssa 30 minuuttia ja lingottiin Eppendorf 5412 sentri-fugissa 2 minuuttia. Pelletti pestiin ja lingottiin kahdesti PBS:n kanssa ja lopullinen pelletti liuotettiin näy-35 tepuskuriin ja käsiteltiin elektroforeesilla 13-%:isessa 42 38175 polyakryyliamidigeelissä kuten U. K. Leammli, et ai., on selostanut "Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4", Nature, 227, sivut 680-85 (1970) ja autoradiografoitiin. STNV-RNA- 5 translaatiotuotteiden vertailu jakeissa IA ja 4A antaa osoituksen hybridisoinnin tehokkuudesta ja RNA-lyhentämisestä prosessissa.

Jakeet IB, 2B, 3B ja 4B liuotettiin 2 pl:ään vettä ja analysoitiin varhaismunasoluissa IFN-fl-mRNA-sisällön 10 suhteen kuten edellä kuvattiin.

3. Myöhempi analyysi - hybridisointi nltroseluloosa- arkkeihin

Yksittäisten kloonien joitakin myöhempiä analyysejä tehtiin nitroselluloosa-arkeilla (M. Cochet, et ai., 15 "Cloning of an almost Full-Length Chicken Conalbumin Double-Stranded cDNA" Nucleic Acids Research, 6, sivut 2435-2452 (1979)). DNA liuotettiin 2 M NaCl:ään ja 0,2 M NaOHrhon, kuumennettiin 100 °C:ssa 1 minuutti, jäähdytettiin ja täplitettiin pesuaineesta vapaille Millipore-suo-20 dattimille (huokoskoko 0,45 pm; läpimitta 7 mm). Suodattimia kuumennettiin 2 tuntia 80 °C:ssa, pestiin 0,3 M NaCl:ssa, 2 mM EDTA:ssa, 0,l-%:isessa SDS:ssa, 10 mM tris-HCl:ssä (pH 7,5) ja kuivattiin huoneen lämpötilassa. RNA-:ta hybridisoitiin 3 tuntia 47 °C;ssa 30-%:isessa formami-25 dissa, 0,5 M NaCl:ssa, 0,4-%:isessa SDS:ssa, 2 mM EDTA:ssa ja 50 mM PIPES'issä (pH 7,5). Hybridisointi lopetettiin laimentamalla 10 tilavuusosalla 0,1 M NaCl ja suodattimia pestiin useita kertoja 15 ml:ssa 0,3 M NaCl, 0,l-%:ista SDS, 2 mM EDTA, 10 mM tris-HCl tris-HCl (pH 7,5) raviste-30 maila 45 °C:ssa ja useita kertoja samassa liuoksessa ilman SDS 4 °C:ssa. Hybridisoidun RNA-DNA:n eluointi suoritettiin 30 pl:ssä 5 mM kaliumkloridia 100 °C:ssa 1 minuutin aikana.

43 8 817 7 4. Tulokset RNA:n valinta-hybridisointl-määrityksestä 16 n. 46 kloonin ryhmää seulottiin (ryhmät A-P). Kuudessa näistä ryhmistä jae IB sisälsi ainoastaan IFN-B-mRNA-aktiivisuuden, 8:ssa ryhmässä IFN-B-mRNA:ta ei ha-5 vaittu ja kahdessa ryhmässä (ryhmät C ja O) IFN-B-mRNA havaittiin jakeessa 4B. Ryhmän C ja 0 analyysit esitetään seuraavassa muodossa IFN-B-yksiköiden (kalibroitu vertai-lustandardia 69/19 vastaan) logaritmi, jotka yksiköt on havaittu jakeen IB analyysissä (ei-hybridisoitu) ja jakeen 10 4B analyysissä (hybridisoitu) havaitsemisraja oli 0,1.

Ryhmä Jae IB Jae 4B

C 1,0 0 0,5 0,5 15 0 0,2 0 0 0 0,2 0,5

Ryhmä 0 jaettiin 6 alaryhmäksi (alaryhmät 0^-0^; neljä kahdeksasta kloonista ja kaksi seitsemästä kloonista) ja 20 hybridisoitiin ja analysoitiin kuten edellä, paitsi että käytettiin 400 ml viljelyä kloonia kohti. Alaryhmät antoivat seuraavat tulokset, esitettyinä samassa muodossa kuin edellä. Hybridisointi suoritettiin DMB-selluloosa-jauheella, paitsi jos toisin on ilmoitettu.

25

Alaryhmä Jae IB Jae 4B

0Ί 0 1,2 0 1,5 0 0,5 0 0,5 0,2 0,5 30 0 1,21

Qj 0,7 0 01 0,7 0 0,5 0 O 0 0

Oc 0,5 0 °6 0 0 35 DBM-selluloosapaperi-menetelmä 44 38m

Alaryhmä jaettiin edelleen yksittäisiksi klooneikseen (merkitty klooneiksi Ojy^-Ojyg) ja hybridisoitiin ja analysoitiin kuten edellä, paitsi että käytettiin 700 ml viljelyä kloonia kohti. Hybridisointi suoritettiin jälleen 5 DBM-selluloosa-jauheella, paitsi jos toisin on esitetty.

Klooni Jae IB Jae 4B

0W1 0,2 0 i/J- 0,7 0 0,7 01 10 1,0 02 O,1,2 0 0,2 01 0,7 02 0,,, 1,2 0 1/J 1,0 0,21 1.2 1,0(7)1 1.2 02 15 0 1,2 0 1/q 1,2 0 1,0 01 1,2 02 O1/5 0,7 0 1/0 0,7 SO,21 1,0 0 20 0 /6 0,7 0 i/D 1,0 SO,21 0,5 02 0W7 0,5 0 A/' 1,2 01 <0,2 0,52 O,0 1,71 i/ö <0,2 1,21 25 0 0,72 0 1,02 DBM-selluloosapaperi-menetelmä 2

Nitroselluloosa-arkkeja 30

Siten klooni O^g sisältää rekombinantti-DNA-molekyylin, joka pystyy hybridisoimaan IFN-B-mRNA:n kokonais-RNA:n sisältävästä IFN-B-mRNA:sta.

Ei-spesifinen RNA-DNA-sitoutuminen on erittäin epätodennäköistä, koska jakeiden IA ja 4A vertailu ei paljas-3 5 tanut pääasiallisesti ollenkaan STNV-DNA:n ei-spesifistä 45 88175 sitoutumista näissä kokeissa. Esimerkiksi, kuten translaa- 35 tiolla osoitettiin kaniinin retikulosyyttilysaatissa S-metioniinin läsnäollessa, mitä seurasi geelielektroforeesi kuten edellä kuvattiin. Klooni 0^/8 nimet'tiin E* coli 5 HB101(G-pBR322(Pst)/HFIFl (HG-HB101-pHFIFl"):ksi, senre-

kombinantti-DNA-molekyyli G-pBR322(Pst)HFIF1 ("pHFIFl")-:ksi ja sen hybridiinsertio-osa "pHFIFl-osaseksi". Tämä nimistö osoittaa, että klooni ja rekombinantti-DNA-mole-kyyli saivat alkunsa Gent ("G"):ssä ja käsittää plasmidin 10 pBR322, joka sisältää, Pstl-kohdassa HuIFN-B-cDNA

("HFIF"):n, jolloin tämä nimenomainen molekyyli on ensimmäinen, jonka sijainti on ("1").

Kloonien, jotka sisältävät rekombinantti-DNA-molekyylejä, jotka risti-hybrldlsoituvat pHFIFlteen, identifioiminen 15 Edellä eristettyä pHFIFlrä käytettiin edellä val mistetun klooni-kokoelman seulontaan bakteerikloonien löytämiseksi, jotka sisälsivät rekombinantti-DNA-molekyylejä, joilla on samansukuiset hybridi-DNA-insertio-osat, pesäke-hybridisoinnilla (M. Grustein ja D. S. Hogness, "A Method 20 for the Isolation of Cloned DNA's that Contain a Specific Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, sivut 3961-3965 (1974)). Tämä menetelmä tekee mahdolliseksi samansukuisten kloonien nopean identifioinnin hybridisoimalla radioaktii-vinen koetin, joka on tehty pHFIFl:sta, nitroselluloosa-25 suodattimiin kiinnitettyjen lysoitujen vakteerikolonioiden DNA:hän.

"· Mikrotiitteri-levyille varastoitujen kloonien koko- : i elma, kuten edellä kuvattiin, monistettiin samankokoisille nitroselluloosa-arkeille (huokosläpimitta 0,45 pm, 30 Schleicher & Schiill tai Millipore), jotka oli sitä ennen keitetty pesuaineen poistamiseksi, ja arkit sijoitettiin LB-agar-levyille, jotka sisälsivät tetrasykliiniä (10 pg/ ml). Bakteeripesäkkeitä kasvatettiin yli yön 37 °C:ssa. Bakteereiden liuottaminen ja kiinnittäminen nitroselluloo-35 sa-arkeille tapahtui pesemällä peräkkäin 0,5 N NaOH:ssa 46 3 81 7 - (kahdesti 7 minuutin ajan), IM tris-HCl:ssa (pH 7,5) (7 minuutin ajan), 0,5 M tris-HCl:ssa (pH 7,5) ja 1,5 M NaCl-:ssa (7 minuuttia), 2 x SSC:ssa (0,15 M NaCl, 0,015 M nat-riumsitraattia (pH 7,2) (7 minuuttia)). Perusteellisen 5 etanolilla huuhtelun ja ilmakuivauksen jälkeen arkkeja kuumennettiin 80 eC:ssa 2 h tyhjössä ja varastoitiin huoneen lämpötilassa.

Hinf I-restriktiofragmentti, joka oli spesifinen pHFIFl-fragmentille (infra), toimi koettimena koloniahyb-10 ridisointia varten, kuvattu jäljempänä. Tämä osanen (n.

170 emäsparia) puhdistettiin pHFIFlrn Hinf-pilkkomistuot-teiden elektroforeesilla 6-%:isessa polyakryyliamidigee-lissä. DNA-nauhojen värjäämisen jälkeen etidiumbromidilla spesifinen osanen eluoitiin, elektroforesoitiin uudelleen 32 15 ja p-merkittiin "rako-translaatiolla" (nick translation) (P. W. J. Rigby et ai., "Labeling Deoxyribonucleic Acid to High Specific Activity in Vitro by Nick Translation with DNA Polymerase I", J. Mol. Biol., 113, sivut 237-251 (1977)) inkuboimalla 50 plrssa 50 mM tris-HCl (pH 7,4), 10 20 mM MgCl2, 20 mM β-merkaptoetanoli, joka sisälsi 2,5 μΐ jokaista seuraavaa: dCTP, dTTP ja dGTP 400 pm:ssä, 100 pmoolia a-ATP (Amersham, 2.000 Ci/mmoolia) ja 2,5 yksikköä DNA-polymeraasi I:tä (Boehringer) 14 °C:ssa 45 minuutin ajan. Reagoimattomat deoksinukleosidi-trifosfaatit pois- 25 tettiin geelisuodatuksella Sephadex G-50:llä TE-puskuris- 32 sa. Voimakkaasti p-merkitty DNA seostettiin 0,1 tila-vuusosalla 2 M natriumasetaattia (pH 5,1) ja 2,5 tilavuus-osalla etanolia 20 °C:ssa.

Edellisen koettimen hybridisointi suodattimeen 30 imeytettyyn DNArhan suoritettiin pääasiallisesti kuten D. Hanahan ja M. Meselson (henkilökohtainen yhteydenotto) ovat esittäneet: edellä valmistettuja suodattimia esi- inkuboitiin 2 h 68 °C:ssa, 0,l-%:isessa Ficoll'issa, 0,1-%:isessa polyvinyylipyrrolidonissa, 0,l-%:isessa naudan 35 seerumialbumiinissa, 0,15 M NaCl:ssa, 0,03 M tris-HCl:ssä 47 3 81 7 ί (pH 8), 1 mM EDTA:ssa ja huuhdeltiin O,02-%:isella

Ficoll'illa, 0,02-%:isella polyvinyylipyrrolidonilla, 0,02-%:isella nauhdan seerumialubumiinilla, 0,75 M NaCl- :11a, 0,15 M tris-HCl:llä (pH 8), 5 mM EDTA: 11a ja 0,5- 5 %:isella SDS:lla. Hybridisointi jatkui yli yön 68 °C:ssa liuoksessa, joka oli samanlainen kuin huuhteluliuos edellä 32 käyttäen p-merkittyä koetinta, jota oli denaturoitu 100° C:ssa 5 minuuttia ennen käyttöä. Hybridisoidut suodattimet pestiin kahdesti 0,3 M NaCl:lla, 0,06 M tris-HCl:llä (pH 10 8), 2 mM EDTA: 11a, 2 h 68 °C:ssa ennen ilmakuivausta ja autoradiografiaa.

N. 1350 kloonia, jotka olivat peräisin 800-900 DNA-kokoluokasta, seulottiin. 13 koloniaa, jotka sisälsivät pHFIFl:n antoi positiivisen tuloksen. Nämä kloonit merkit-15 tiin G-HB101-pHFIFl:sta 13:een ja niiden rekombinantti-DNA-molekyylit pHFIFl:stä 13reen. Yksi näistä klooneista, pHFIF2, hybridisoltiin poly(A)mRNA:11a, joka sisälsi IFN-B-mRNA:n ja analysoitiin käyttäen DBM-selluloosapaperia (supra). Koska kokonais-IFN-RNA-aktiivisuus havaittiin 20 hybridisoidussa jakeessa ja hybridisoimaton RNA ei sisältänyt havaittavaa aktiivisuutta, on selvää, että kloonit, jotka pesäkehybridisoinnilla tunnistettiin osaksi pHFIFl-. - osasta, myös hybridisoituivat IFN-B-mRNA:hän.

On tietenkin selvää, että tämä kloonien seulonta-25 menetelmä käyttäen pHFIFl:n HuIFN-8-DNA-insertio-osaa tai kloonin, joka on identifioitu käyttäen pHFIFl:n DNA-inser-tio-osaa, kuten edellä kuvattiin, muuta DNA-insertio-osaa voidaan käyttää yhtä hyvin muilla klooneilla, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, joita syntyy rekombinantti-DNA-30 teknologiasta, synteeseistä, luonnon lähteistä tai niiden yhdistelmistä tai klooneista, jotka sisältävät DNA-sek-venssejä, jotka ovat sukua edellisille DNA-sekvensseille, mutaatiolla, kuten yksinkertaisilla tai moninkertaisilla emäs-substituoinneilla, insertioilla, inversioilla tai 35 deleetioilla. Siten tällaiset DNA-sekvenssit sekä niiden 4θ 8817; identifioiminen kuuluvat myös tämän keksinnön piiriin. On myös ymmärrettävä, että DNA-sekvenssit, jotka eivät seu-loonnu edellisillä DNA-sekvensseillä, vaan jotka seurauksena nukleotidiensa järjestelystä koodaavat niitä polypep-5 tidejä, joita edellä mainitut DNA-sekvenssit koodaavat, myös kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

IFN-3-sukuisten rekombinanttiplasmidien luonnehtiminen

Niitä kolmeatoista kloonia (pHFlFl-13), jotka havaittiin pesäkehybridisoinnilla, luonnehdittiin edelleen. 10 Laadittiin näiden kloonien insertio-osien fysikaalinen kartta ja insertio-osien suuntautuminen eri klooneissa määriteltiin.

Plasmidien fysikaaliset kartat laadittiin pilkkomalla eri restriktioentsyymien kanssa (New England Bio-15 labs) 10 mM tris-HCl:ssä (pH 7,6), 7 mM MgC^sssa ja 7 mM B-merkaptoetanolissa 37 °C:ssa hyvin tunnetuin menetelmin. Pilkontatuotteita käsiteltiin elektroforeesilla 2,2-%:isessa agaroosissa tai 6-%lisissä polyakryyliamidigee-leissä 40 mM tris-HOAc:ssa (pH 7,8), 20 mM EDTA:ssa. Ne 20 analysoitiin näkyviksi tekemisen jälkeen etidiumbromidilla värjäämällä ja verrattiin pBR322:n yksityiskohtaiseen fysikaaliseen karttaan (J. G. Sutcliffe, supra). Eri plasmidien pilkkomiskartat laadittiin näiden pilkontamallien perusteella. Nämä puhdistettiin sekvenssoimalla DNA-inser-25 tio-osat eri plasmideissa, pääasiallisesti A. M. Maxam'in ja W. Gilbert'in menetelmällä, "A New Method for Sequencing DNA", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, sivut 560-564 (1977).

Plasmidi-DNA valmistettiin eri pHFIFl-13:sta tämän 30 keksinnön mukaisesti Kahn'in et ai. menetelmällä (supra), jota tässä aikaisemmin käytettiin DNA:n eristämiseen kloo-nisarjoista seulontaa varten. Eristetty DNA-muoto I puh-distettiinneutraali-sakkaroosigradientti-sentrifugoinnil-la kuten edellä ja pilkottiin eri restriktioentsyymeillä, 35 pääasiallisesti kuten toimittaja (New England Biolabs) on suositellut.

49 8 81 7 5

Pilkottua DNA:ta defosforyloitiin 30 minuuttia 65° C:ssa 4 yksikön alkalista bakteeri-fosfataasia ja 0,1 %:n SDS läsnäollessa. Kahden fenoliuuton ja etanoli-saostuksen 32 jälkeen DNA:n 5'-päät merkittiin γ- P-ATP:lla (n. 3.000 5 Ci/mmoolia) ja polynukleotidikinaasilla (P-L Biochemicals, Inc.).

Sekvenssointia varten merkittyjä osasia käsiteltiin kahdella tavalla. Toiset puhdistettiin polyakryyli-amidigeelillä ennen pilkkomista toisella restriktioentsyy-10 millä. Toiset pilkottiin välittömästi toisella restriktio-entsyymillä. Kummassakin tapauksessa halutut osaset erotettiin polyakryyliamidigeelillä trisboraatti-EDTA-pusku-rissa. Kuvat 7 esittää eri pilkontaosasia (ympyrät esittävät merkkiä ja nuoli sekvenssoinnin suuntaa) ja käytettyjä 15 sekvenssointistragegiaa käyttäen pHFIFl:tä, pHFIF3:ea, pHFIF6:ta ja pHFIF7:ää.

Osasia lyhennettiin A. M. Maxam'in ja W. Gilbert’in menetelmän mukaan (supra). Tuotteita fraktionoitiin poly-akryyliamidigeeleillä eri pitoisuuksissa ja pituuksissa 50 20 mM tris-boraatissa, 1 mM EDTA:ssa (pH 8,3) 900 V-2000 Villa.

cDNA-insertion jokainen väli sekvensoitiin kummastakin säikeestä ja jokainen pilkkomiskohta, joka toimi merkittynä päätekohtana, sekvenssoitiin käyttäen osasta, 25 joka ulottui siihen. Yhdistelmä-nukleotidisekvenssi, joka näin saatiin IFN-B-DNA:n tai geenin koodaavaa säiettä varten ja sen vastaava aminohapposekvenssi on esitetty kuvassa 4. Koska mikään plasmideista pHFIFl-13 ei sisältänyt täydellistä geeniä HuIFN-fl:aa varten, on kuva 4 tulos tie-30 tojen yhdistämisestä vähintään kahdesta tällaisesta plas-: midista. Tässä suhteessa kuva 5 esittää insertio-osien pHFIFl, PHFIF3, pHFIF6 ja pHFIF7 suhdetta, ja kiinteät nuolet tai nuolikkaat osoittavat insertio-osien eri osien suuntauksen.

35 Viitaten nyt kuvaan 4 on siinä insertio-osan hete-

so 8 817 S

ropolymeerinen osa lopetettu toisessa päässä segmentillä, jossa on runsaasti T'eitä, ja A'iden säikeellä (joka todennäköisesti heijastaa mRNA:n polyA-päätä), Osoittamista varten insertio-osa on numeroitu yhdistelmä-insertio-osan 5 ensimmäisestä nukleotidistä nukleotidiin, joka on runsaasti insertioosan translatoimattomalla osalla. ATG-alotus-kolmikko asemassa 65-67 ja TGA-lopetuskolmikko asemassa 626-628 rajaavat merkityksettömien kodonien keskeyttämät-tömän koodikaavan. Joku muu translatoitava sekvenssi, 10 esim. eri koodikaavoissa, joita rajaavat ATG tai GTG ja lopetusmerkki, on liian lyhyt koodaamaan polypeptidiä, jolla on IFN-B:n odotettu koko. Siten alue nukleotidien 65 ja 625 välissä käsittää todennäköisimmin nukleotidisek-venssin yhdistelmä-DNA-sekvenssiä varten, joka koodaan 15 IFN-B:aa tämän keksinnön mukaisesti.

Tämä sekvenssi ei sulje pois mahdollisuutta, että modifikaatioita geenin, kuten mutaatioita, joita ovat yksinkertaiset tai moninkertaiset emäs-subtituoinnit, delee-tiot, insertiot tai inversiot, ei jo ole tapahtunut gee-20 nissä tai että niitä ei voitaisi myöhemmin käyttää modifioimaan sen ominaisuuksia tai siitä translatoitujen poly-peptidien ominaisuuksia. Se ei liioin sulje pois jotakin polymorfismia, jota saattaa esiintyä fysiologisesti samanlaisissa mutta rakenteellisesti hieman erilaisissa gee-25 neissä tai polypeptideissä kuin kuvassa 4 esitetty (supra, sivu 3). Esimerkiksi toisella kloonilla, joka on identifioitu tämän keksinn#n mukaisesti, on "T" "C":n asemesta nukleotidisekvenssin, joka koodaa IFN-B:aa, nukleotidilla 90. Tämä muutos kodonin kolmannessa nukleotidissa ei muuta 30 siitä koodattua aminohappoa. Aminohapposekvenssi, jota koodaa kuvan 4 DNA-sekvenssi, on sama kuin Taniguichi'n et ai., supra, esittämä aminohappo-sekvenssi.

On tietenkin ymmärrettävä, että kloonatusta cDNA-:sta, polyA-RNA:sta, tavallisin menetelmin 35 (A. Efstratiadis et ai., supra) saattavat puuttua 5'-pää- si 3 817 Ξ te-nukleotidlt ja ne voivat sisältää jopa keinotekoisia sekvenssejä (R. I. Richards et ai., "Molecular Cloning and Sequence Analysis of Adult Chicken β-Glodin cDNA", Nucleic Acids Research, 7, sivut 1137-46 (1979)). Siten ei ole 5 varmaa, että ATG, joka sijaitsee nukleotideillä 65-67, todella on autenttisen IFN-S-koodaussekvenssin ensimmäinen ATG. Seuraavan selostuksen tarkoituksiin oletetaan kumminkin, että ATG nukleotideilla 65-67 on autenttisen IFN-B-mRNA:n ensimmäinen ATG.

10 Vertaamalla polypeptidiä, jota insertio-osan tämä alue koodaa, autenttisen ihmis-fibroblasti-interferonin 13 amino-pääte-aminohapon sekvenssiin - MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSer -, jonka on määrittänyt Knight et ai. (supra), näyttää siltä, että valit-15 tu koodikaava on oikea ja että nukleotidit 65-127 koodaa-vat merkkipeptidiä, joka edeltää nukleotidisekvenssiä, joka koodaa "kypsää" polypeptidiä.

Lisäksi, eukaryoottisissa mRNA'issa ensimmäinen AUG-kolmikko 5'-pääteasemasta on tavallisesti aloituskohta 20 proteiinisynteesille (M. Kozak, "How Do Eukaryotic Ribosomes Select Initiation Regions in Messenger RNA?", Cell, 15 sivut 1109-25 (1978)). Tässä kodoni yhdistelmäosasessa, . . joka vastaa fibroblasti-interferonin ensimmäistä aminohap poa, on 22 kodonin päässä ensimmäisestä ATG:sta. Tämä taas 25 tuo mieleen, että DNA-sekvenssiä, joka koodaa fibroblasti- interferonia, saattaa edeltää sekvenssi, joka rajoittaa 21 aminohapon merkki-polypeptidin. Oletettu merkkisekvenssi sisältää sarjan hydrofobisia aminohappoja. Tällainen hydrofobisten tähteiden kasautuminen on tietenkin merkkisek-30 vensseille luonteenomaista (vrt. B. D. Davis ja P. C. Tai, "The Mechanism of Protein Secretion Across Membranes", Nature, 283, sivut 433-38 (1980)).

Nukleotidisekvenssi, joka ilmeisesti vastaa "kypsää" HuIFN-B:aa, käsittää 498 nukleotidia, jotka koodaa-35 vat 166 aminohappoa. Olettaen, että ei tapahdu mitään kar- 52 88175 boksi-päätekäsittelyä, on interferoni-polypeptidin mole-kyylipaino 20085. Koodaavan sekvenssin emäskoostumus on 45 % G+C. Kodonin käyttö interferonin koodaussekvensseissä on järkevässä sopusoinnussa sen kanssa, mitä noudatetaan ni-5 säkkäiden mRNA'ille yleensä (R. Grantham et ai., "Coding Catalog Usage and the Genome Hypothesis", Nucleic Acids Research, 8, sivut 49-62 (1980)). Jotkut havaitut poikkeamat voidaan katsoa aiheutuneen käytetyistä pienistä luvuista.

10 Kuvassa 4 esitetyn polypeptidin rakenne yhdistelmä- osasta varten ei tietenkään ota huomioon mitään modifikaatioita polypeptidille, jotka aiheutuisivat sen vuorovaikutuksesta in vivo-entsyymien kanssa, esim. glykosylointia. Siten on ymmärrettävä, että kuvassa 4 esitetty aminohappo-15 sekvenssi ei ole identtien HuIFN-B:n kanssa, joka on tuotettu in vivo.

Autenttisen fibroblasti-interferonin 13 ensimmäisen aminohapon (Knight et ai., supra) ja sekvenssin, joka on vähennetty kuvan 4 yhdistelmä-geenistä, vertailu ei 20 osoita mitään eroja. Aminohappo-koostumukset, jotka on määritetty suoraan autenttiselle fibroblasti-interferonille toisaalta ja toisaalta se, joka on vähennetty tämän keksinnön yhdistelmä-geenin sekvenssistä, osoittavat myös olennaista samankaltaisuutta. Kuva 6 esittää näiden koos-25 tumusten vertailua.

Vaikka mikään tämän keksinnön mukaisesti aluksi valmistetuista rekombinantti-DNA-molekyyleistä ei sisällä täydellistä DNA-sekvenssiä fibroblasti-interferonille, ne muodostavat käyttökelpoisen koettimen DNA-sekvenssien ko-30 koelmien seulomiseksi niiden sekvenssien lööytämiseksi, jotka ovat sukua HulFN-B:lle. Lisäksi näiden rekombinant-ti-DNA-molekyylien insertioiden osien yhdistelmä täydellisen lFN-βιη koodaussekvenssin saamiseksi on, kuten jäljempänä osoitetaan, tekniikan tasolla tunnettua. Esimerkiksi, 35 viitaten kuvaan 5 ja kuvaan 8, voidaan helposti nähdä, 53 8 8 1 75 että pHFIF6:n Pstl-Bglll-osanen voidaan liittää pHFiF7:n Pstl-Haell-osaseen tai pHFIF6:n EcoRI-Pstl-osanen voidaan liittää pHFIF7:n Pstl-Haell-osaseen tai pHFIF6:n Bglll-Pstl-osanen voidaan liittää kloonin 7 Pstl-BglII-osaseen 5 muodostamaan yhdistelmä-HuIFN-B-koodaussekvenssi. Näiden osasten liittäminen voidaan tietenkin tehdä ennen tai jälkeen kloonatun osasen insertiota haluttuun plasmidin. Plasmidlen, jotka sisältävät täydellisen DNA-sekvenssin, joka koodaa HuIFN-B:aa, valmistus tarkoitusta varten eks-10 pressoida polypeptIdejä, joilla on HuIFN-B-aktiivisuus

Bakteriofaagi λ sisältää kaksi vahvaa promoottoria, PL:n ja PR:n, joiden aktiivisuus on repressoriproteiinin, faagi-geenin cl tuotteen säätelyn alainen. Repressorin läsnäollessa transkriptio näistä promoottoreista on täy-15 sin sammunut. Repressorin poistaminen kytkee päälle voimakkaan transkription P : sta ja P_:sta (yleissilmäystä varten, ks. H. Szybalski ja W. Szybalki "A Comprehensive Molecular Map of Bacteriophage λ ", Gene, 7, 217-270 (1979)).

20 Monikkoplasmidin pBR322 johdannaisia (F. Bolivar et al. "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles. II. A. Multiple Cloning System", Gene, 2, 95-113 (1977)) rakennettiin PT-promoottorin yhdistämiseksi.

' f Li Näitä plasmideja on selostettu brittiläisessä patenttiha- ...· 25 kemuksessa 8028983, jätetty 8.9.1980 ja se on yhdistetty tähän viittein.

A. Plasmidien, jotka sisältävät PL-promoottorln rakenne, plasmidi pPLa2311

Plasmidi pPLa2311 (esitetty kuvassa 8) sisältää 30 kolme Haell-osasta. Suurin osanen, n. 1940 emäsparia, si-: sältää PL0L-alueen bakteriofaagista λ ja B-laktamaasigee- ni-alueen pBR322:sta (J. Sutcliffe, "Complete Nucleotide Sequence of the Escherichia coli Plasmid pBR322", Cold Spring Harbor Symposium, 49, 77-90, (1978)). Tämän osasen '·.·: 35 vieressä on 370 emäsparin Haell-osanen, joka on peräisin 54 38175 plasmidista Col E^. Kopioinnin alkukohta ulottuu liitokseen näiden kahden osasen välissä (A. Oka et ai. "Nucleotide Sequence of Small Col Derivatives. Structure of the Regions Essential for Autonomous Replication and Coli-5 cin E^ Immunity", Mol. Gen, Genet., 172, 151-159 (1979)). Kolmas Haell-osainen, n. 1600 emäsparin pituinen, koodaa resistenssiä kanamysiinille. Tämä osanen saatiin alunperin plasmidista pCR^^ (C. Covey et ai. "A Method for the Detection of Restriction Sites in Bacterial Plasmid DNA", Mol. 10 Gen. Genet., 145, 155-158 (1976)). Transkription suunta P_-promoottorilta kulkee samaan suuntaan kuin λ-laktamaa-si-geenillä. Plasmidi pPLa2311 antaa resistenssin 100 pg/ ml:lie karbenisilliiniä ja 50 pg/ml:lle kanamysiiniä. Plasmidi G-pPLa8 15 Plasmidi G-pPLa8 (esitetty kuvassa 9) johdettiin pPLa2311:sta muuttamalla Pstl-kohta β-laktamaasigeenissä BamHI-kohdaksi. Tämä suoritettiin Psttllä avatun pPLa2311 S^-nukleaasi-käsittelyllä, mitä seurasi tylppäpäinen liitäntä BamHI-liittäjäosaseen (saatu Collaborative Research 20 Inc.:sta, Waltham, Mass.) ja sulkemalla molekyyli uudelleen renkaaksi BamHI-pilkonnan jälkeen. Plasmidi pPLa8 ei enää anna spesifistä resistenssiä karbenisilliinille mutta se antaa vielä resistenssin kanamysiinilla.

Plasmidi G-pPLc24 ‘25 Plasmidi G-pPLc24 (esitetty kuvassa 10) sisältää B- laktamaasigeenin ja kopioinnin alkukohdan pBR322:sta. 290 emäsparin Haell-ExoRI-osanen sisältää PT0T-alueen bakte- L· Li riofaagista λ .Transkription suunta PT-promoottorilta on kohti EcoRI-kohtaa. 431 emäsparin EcoRI-BamHI-osanen koo-30 daa ribosomin sitomiskohtaa ja bakteriofaagin MS2 repli-kaasigeenin, joka on saatu plasmidista mMS2-7, ensimmäiset 98 aminohappotähdettä (R. Devos et ai. "Construction and Characterization of a Plasmid Containing a nearly Fullsize DNA Copy of Bacteriophage MS2 RNA", J. Mol. Biol., 128, 35 595-619 (1979)). MS2-replikaasiproteiini-osasen translaa- 55 3817': tio kulkee kolineaarisesti transkription kanssa PL-pro-moottorista.

B. PL-promoottoriaktiivisuuden lämpötilasta riippuva päällekytkeminen 5 Transkriptio PT-promoottorista - jota on läsnä L» plasmideilla pPLa2311, pPLa8 ja pPLc24 - tukahdutetaan pitämällä plasmidit E. coli-kannassa, joka syntetisoi rep-ressoriproteiinia. Itsesäätelevästä synteesitavastaan johtuen (M. Ptashne et ai., "Autoregulation and Function of a 10 Repressor in Bacteriophage λ ", Science, 194, 156-161 (1976)), cl-geenin yksi kopio lysogeenisen kannan kromosomilla pystyy täysin sammuttamaan monikopioplasmidilla läsnäolevan PL~promoottorin.

Tässä keksinnössä käytetyt kannat olivat E. coli 15 Κ12ΔΗΙ (K12 M72 lac AtrpEA2 SmR (λ C1857 N 7 N 53ΔΗΙ am ^ am am bio); U. Bernard et ai. "Construction of Plasmid Cloning Vehicles that Promote Gene Expression from the Bacteriophage λ PT Promoter", Gene 5, 59-76 (1979)) ja E. coli

k R

M5219 (K12 M72 lac trp Sm ( λ cl857AHIbio252); H. Greer, am am 20 "The kil Gene of Bacteriophage λ". Virology, 66, 589-604 (1975)). Kumpikin kanta majoittaa viallisen, poisleikkau-tumattoman -profaagin, jossa on mutantti cl-geeni. Mu-. . tantti-geeni koodaa lämpötilaherkkää repressoria, sallien

siten transkription päällekytkemisen PT-promoottorilta 25 lämpötilaa muuttamalla - 28 eC:ssa repressori on aktiivinen ja tukahduttaa transkription PT-promoottorilta, mutta ____* L

42 eC:ssa repressori on inaktivoitunut ja transkriptio P_-promoottorilta kytkeytyy päälle.

r Profaagin ΔΗΙ-deleetio poistaa osan ero-geenistä ja 30 kaikki muut geenit eteenpäin oikealle eroista (M. Castellazzi et ai. "Isolation and Characterization of Deletions in Bacteriophage λ Reciding as Prophage I E. coli K12", Mol. Gen. Genet., 117, 211-218 (1972)). Cro- geenin deleetio on edullinen, koska ero-proteiinin kasau-35 tumisen tiedetään sammuttavan transkription PT-promootto-

L

56 8 8 1 7b rista (A. Johnson et al., "Mechanism of Action of the cro Protein of Bacteriophage λ ", Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 75, 1783-1787 (1978)). Kanta M5219 sisältää lisäksi bio-252-deleetion, joka poistaa kaikki geenit vasemmalle 5 clllista, kil mukaanluettuna.

Lämpötila-induktion jälkeen kanta M5219 ekspressoi funktionaalisen N-geenituotteen. Kannalta Κ12ΔΗΙ on toisaalta kaksi amber-mutaatiota N:ssa, mikä tekee sen funk-tionaalisesti N-negatiiviseksi. N-geenin tuotteen tiede-10 tään toimivan anti-terminaattorina bakteriofaagissa λ (J. W. Roberts, "Transcription Termination and Late Control in Phage λ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3300-3304 (1975)). Antiterminaatio-vaikutus havaittiin samoin terminaattorisekvensseillä, joita luonnostaan ei ole länsä 15 faagi λ DNA:11a (esim. luonnollinen lopetus trp-operonin päässä), edellyttäen, että RNA-transkriptio alkaa PT-pro-

L

moottorilla. Lisäksi polaarisuus-vaikutukset, jotka aiheutuvat merkityksettömän kodonin läsnäolosta PT-transkrip-tiossa, huojentuivat N-geeniproteiinin toiminnan alaisena 20 (yleissilmäystä varten ks. N. Franklin ja C. Yanofsky, "The N Protein of λ : Evidence Bearing on Transcription Termination, Polarity and the Alteration of E. coli RNA Polymerase" julkaisussa RNA Polymerase (Cold Spring Harbor Laboratory, 1976), sivut 693-706).

25 Siten edellä mainittujen plasmidien pitäminen ter- mo-indusoitavalla bakteeri-cl-taustalla tekee mahdolliseksi P^-promoottorin aktiivisuuden päälle tai päältä kytkemisen. Lisäksi Κ12ΔΗΙ:η tai M5219:n valinta tekee mahdolliseksi transkription jatkumisen N-geenituotteiden poissa-30 tai läsnäollessa. Jälkimmäinen saattaisi olla eduksi kuten edellä selostettiin, tapauksissa, joissa on transkriboitavia DNA-alueita, jotka sisältävät transkription terminaat-torin kaltaisia sekvenssejä tai hidastavia sekvenssejä RNA-polymeraasia varten.

57 8 8 1 7:: C. Kloonien, joissa on DNA-sekvenssi, joka koodaan

HuIFN~e;aa, kytkettynä plasmidiin, joka sisältää PL-promoottorin, rakentaminen

Seuraavassa selostuksessa plasmidi-DNA:n eristämi-5 nen, DNA:n restriktionalyysi ja DNA-osasten liitäntä suoritettiin kuten edellä kuvattiin kaksisäikeisen DNA:n kloonausta varten. Transformointi-vaihe oli myös edellä kuvatun kaltainen, paitsi että käytettäessä kantoja Κ12ΔΗΙ tai M5219 isäntänä, tehtiin lämpöshokki 34 °C:ssa 5 minuu-10 tin aikana ja transformoituja soluja inkuboitiin 28 eC-: ssa.

1. Plasmidin G-pPLa-HFIF-67-1 rakentelu

Perussyy tätä rakennetta varten oli havainto, että sopivien pilkontaosasten yhdistäminen klooneista G-pBR322-15 ( Pst)/HFIF-6 ja G-pBR322( Pst)/HFIF-7 tekee mahdolliseksi IFN-B:n täydellisen, jatkuvan koodaussekvenssin rekonstruoimisen. Johdettujen osasten kulku useiden rakennusvaiheiden läpi on kaavamaisesti esitetty kuvassa 8. Plasmidi G-pBR322(Pst)/HFIF-6 pilkottiin EcoRI:lla ja Pstl:llä ja 20 liitettiin plasmidiin G-pBR322(Pst)/HFIF-7, joka oli pilkottu Pstl:llä ja Pvul:llä. Liittämisen jälkeen seosta pilkottiin EcoRI:n ja HaeII:n kanssa. 4-kertainen mooli-kyylimäärä tätä seosta liitettiin sitten plasmidiin : G-pPLa2311, jota oli pilkottu HaeII:n ja EcoRI:n kanssa.

+ 25 Transformantit saatiin kannassa C600rKmR(X) (jota käytet-tiin suhteellisen suuren transformoimiskykynsä ansiosta ja ____: koska se sisältää villityypin cl-geenin) valikoimalla ka- . namysiini-resistenssin suhteen. 15 seulotusta transfor- . . mäntistä kaksi oli menettänyt resistenssin karbenisillii- 30 nille. Näiden transformanttien plasmidista eristetyn DNA:n restriktioanalyysi paljasti, että yhdellä oli haluttu rakenne G-pPLa-HFIF-67-1, joka on esitetty kuvassa 8. Tämä plasmidi sisälsi erikoisen EcoRI-kohdan ja erikois Pstl-kohdan. Yhdistetty EcoRI-Pstl-pilkonta antoi kaksi osasta ____ 35 - joista pienempi kulkeutui yhdessä osasen kanssa, joka 58 381 75 oli saatu G-pBR322(Pst)/HFIF-6:n EcoRI-Pstl-pilkonnan jälkeen. Bglll-pilkonta lohkaisi pienen n. 650 emäsparin osasen. Jälkimmäisen osasen koko on yhtäpitävä odotetun koon kanssa kloonin G-pBR322(Pst)/HFIF-6 välittömän Bglll-Pstl-5 osasen liittämisen jälkeen G-pBR322(Pst)/HFIF-7:n keskipisteestä erillään olevaan Pstl-Bglll-osaan. HincII-pil-konta antoi kolme osasta kuten odotettiin HincII-kohtien läsnäolosta P^-alueella, β-laktamaasigeenin aminopääte-osasta ja HuIFN-B:n DNA-sekvenssin translatoimattomasta 10 5'-päästä. Tämä plasmidi merkittiin G-pPLaHFIF-67-1:ksi.

Edellä mainitun luonnehdinnan perusteella restrik-tioentsyymianalyysillä, plasmidin G-pPLa-HFIF-67-1 tulisi sisältää täydellisen koodaussekvenssi HuIFN-B:lle. Halutun transkription suunta kulkee kolineaarisesti suunnan 15 kanssa PL-promoottorilta. PL:n ja HiiFN-B-koodaussekvens-sigeenin välissä plasmidi yhä säilyttää poly(A*T)-hännän ja käänteis-3'-pääteosasen kuten G-pBR322 (Pst)/HFIF-6:ssa.

2. Plasmidin G-pLa-HFIF-67-12 rakentelu

Seuraava vaihe rakenteluissa tapahtui poistamalla 20 G-pPLa-HFIF-67-1:stä poly(A*T)-häntä ja osa käänteis-3'- pääteosasesta (ks. kuva 9). G-pPLa-HFIF67-l:n DNA pilkottiin Bglll:lla ja HpaII:lla. Koska HuIFN-B-koodaussekvenssi ei sisällä Hpall-kohtaa, on tästä käsittelystä seurauksena Bglll-osanen, joka sisältää koko koodaussekvenssin : 25 IFN-B:lie ja inaktivoi samanaikaisesti vektorin loppuosan.

Saatu Bglll-osanen liitettiin plasmidiin G-pPLa8, joka oli pilkottu BamHIrn kanssa. Entsyymit Bglll ja BamHI tekevät samanlaiset porrastetut päät niin, että Bglll-päät voidaan liittää avattuun BamHI-kohtaan ja päinvastoin. Tällainen 30 rekonstruoitu kohta ei enää ole substraatti Bglll:lle tai BamHI:lie, vaan sen tunnistaa entsyymi Sau3Al (Mbol) V. Pirotta, "Two Restriction Endonucleases from Bacillus globigii", Nucleic Acids Res., 3, 1747-1760 (1976)). Liitännän jälkeen seos pilkottiin jälleen BamHI:11a niiden 35 G-pPLa8-molekyylien poistamiseksi, jotka olivat yksinker- 59 88 1 75 taisesti muodostuneet renkaiksi. Saatiin jälleen trans-formantit CöOOr^m*( λ):ssa valikoiden kanamysiini-resistenssin suhteen.

Transformantit seulottiin pilkkomattoman DNA:n koon 5 määrityksellä agaroosigeelillä, kuten edellä selostettiin IFN-B-sukuisten rekombinanttiplasmidien luonnehtimiseksi. Kloonit, jotka osoittautuivat hieman suuremmiksi kuin G-pPLa-8-emä, saatettiin edelleen restriktioanalyysiin joko Pstl:n tai Hindi :n kanssa. Löydettiin yksi klooni, 10 joka sisälsi yhden ainoan PstI-kohdan ja kolme Hindi-kohtaa. Tämän kloonin yksi osanen kulkeutui yhdessä HincII-osasen kanssa pPLa8:sta, joka oli johdettu PL:sta, fl-lak-tamaasialueelle. Kloonin toisen pienen osasen pituudeksi mitattiin n. 400 emäsparia - mikä oli yhtäpitävää Bglll-15 osasen insertion kanssa G-pPLa8:aan suuntautumissuunnassa PT-promoottorin suhteen. Tämä plasmidi merkittiin G-pPLa-HFIF-6712:ksi. Tämän plasmidin rakentelussa käytetyt vaiheet on esitetty kaavamaisesti kuvassa 9. Yksityiskohtaisempi kartta tästä plasmidista on esitetty kuvassa 11. 20 Plasmidin koko (n. 4450 emäsparia) arvioitiin sen perusosasten koon perusteella, mikä puolestaan oli arvioitu niiden suhteellisesta liikkuvuudesta elektroforeesin jälkeen agaroosigeeleissä.

E. coli Κ12ΔΗΙ ja M5219 transformoitiin sitten 25 luonnehditulla plasmidilla G-pPLa-HFIF-67-12.

Määritetyn nukleotidisekvenssin tutkiminen Bglll/ BamHl-liitoksen ympärillä G-pPLa-HFIF-67-12:ssa paljasti mielenkiintoisen seikan. Tämän plasmidin β-laktamaasi-koo-daussekvenssin AUGrssa alkava polypeptidi päättyy kaksois-30 amber-kodonilla, joka sijaitsee HuIFN-B-koodaussekvenssin translatoimattomassa 5'-päässä. Nämä lopetuskodonit sijaitsevat 23 nukleotidia ennen HuIFN-B-merkkipeptidin aloi-tus-AUG:tä, ts.

60 381 75

Liitäntä 181* BamHI/Bglll CCC.3GG.AUC.UUC.AGU.UUC.GGA.GGC.AAC.CUU.UCG.AAG.CCU.

Pro-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Gly-Gly-Asn-Leu-Ser-Lys-Pro-5 - UUG.CUC.UGG.CAC.AAC.AGG.UAG.UAG GCGACACUGUUCGUGUUGUCAAC Leu-Leu-Trp-His-Asn-Arg am am AUG-(HuIFN-B-merkkipeptidiä koodaava sekvenssi)-AUG-10 (kypsää HuIFN-B:aa koodaava sekvenssi)

Suorakaidekuvion luku tarkoittaa aminohappotähteen numeroa pBR322:n β-laktamaasiproteiinissa (J. Sutcliffe, supra). Tähti (*) osoittaa, että CCU-kodoni, joka on läsnä 15 tässä asemassa pBR322:ssa, oli vaihtunut CCCrksi seurauksena Pstl-kohdan muuttumisesta pPLa2311:ssa BamHI-kohdaksi pPLa8:ssa (katso edellä). Siten tämä rakentelu avaa mahdollisuuden uudelleenaloitukseen HuIFN-B-merkkipeptidin AUGrssa ja siten IFN-8:n mahdollisen ekspression sulautu-20 neena merkki-peptidiinsä, mutta ei sulautuneena osaksi 8-laktamaasia. Tällainen ennenaikaista terminaatiota seu-raava sisäinen uudelleenaloittaminen on havaittu E. coli-laktoosioperonin repressorigeenissä T. Platt et ai., "Translational Restarts: AUG Reinitiation of a lac Repres-25 sor Fragment", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 897-901 (1972)). Tämä rakenne saattaisi tehdä mahdolliseksi kypsän IFN-B:n erittymisen HuIFN-8-merkkisekvenssin oikealla bakteeri-tunnistuksella.

3. Plasmidin G-pPLa-HFIF-67-12Al9 rakentelu 30 pBR322:n tunnetusta sekvenssistä ja HuIFN-B-koo- daussekvenssistä voidaan päätellä, että pienen HincII-osa-sen poisjätöstä G-pPLa-HFIF-67-12:sta (β-laktamaasista n. 3 nukleotidiin asti HuIFN-B-merkkipeptidin aloittavan AUG-:n edessä) on seurauksena jatkuva translationaalinen koo-35 dikaava, joka alkaa β-laktamaasin AUGrssa ja loppuu HuIFN-β-koodaussekvenssin jälkeen. Tämän rakenteen ennustetaan siten koodaavan polypeptidiä, joka koostuu 82 aminohappo- ei 88175 tähteestä B-laktamaasi-koodaussekvenssistä, yhdestä aminohaposta, joka on koodattu yhdistetyssä Hindi-kohdassa, HuIFN-B-merkkipeptidistä ja kypsästä HuIFN-B:sta, ts.

82" 5 GUI.AAC.AUG-(HuIFN-B-merkkipeptidi-koodaussekvenssi)-AUG-

Val-Asn-Met (kypsän HuIFN-B:n koodaussekvenssi)

Suorakaiteessa oleva luku tarkoittaa aminohappo-10 tähteen numeroa pBR322:n B-laktamaasiproteiinissa (J. Sutcliffe, supra). Siten tämä rakenne tekee mahdolliseksi ekspressoida yhdistyneen polypeptidin, joka koostuu B-laktamaasi-osasta, joka on yhdistynyt yhden aminohapon kautta HuIFN-B-merkkipeptidiin, joka puolestaan on yhtynyt 15 kypsään HuIFN-B:aan. Tällaista fuusio-proteiinia voi erit tyä solusta.

G-pPLa-HFIF-67-12 pilkottiin osittain Hindi: n kanssa. Liitännän jälkeen DNA-pitoisuudessa n. 0,01 pg/ml DNA pilkottiin Xorll:lla, Pvul:n isoshitsomeerillä, joka 20 tuottaa esiintyöntyviä 3'-päitä (R. Wang et ai., Biochim. Biophys. Acta, painossa), ja liitettiin uudelleen alhaisessa DNA-pitoisuudessa. Emä-G-pPLa-HFIF-67-12 sisältää kaksi Xorll-kohtaa; toinen kohta inaktivoi kanamysiini-geenin ja toinen sijaitsee Hindi-osasessa, joka jätetään 25 pois plasmidista. Xorll-pilkontauudelleenliittämisvaiheen tarkoituksena on poistaa emä-DNA-molekyylit, jotka eivät ··· ole pilkkoutuneet Hindi-entsyymillä. Tällaisissa molekyy leissä on kaksi Corll-kohtaa ja olosuhteissa, joita liitäntää varten käytetään, kaksi osasta erittäin epätoden-30 näköisesti liittyvät uudelleen. Transformantteja saatiin C600r^mK( \):ssa, valikoiden kanamysiinin suhteen, ja seu-lottiin restriktionalyysillä yksinkertaisen Pvul-kohdan läsnäolon suhteen. Kloonien lisäanalysoiminen suoritettiin käyttäen HincII-pilkontaa. Yksi klooni, josta puuttui pie-35 nin HincII-osanen, mutta joka muuten oli samanlainen kuin 62 88 1 75 G-pPLa-HFIF—67-12, merkittiin G-pPLa-HFIF-67-12il9:ksi. Plasmidin rakentelussa käytetyt vaiheet on kaavamaisesti esitetty kuvassa 9. Yksityiskohtaisempi kartta tästä plas-5 midista on esitetty kuvassa 12. Plasmidin koko (n. 4050 emäsparia) arvioitiin laskemalla sen perusosasten koot yhteen, jotka puolestaan oli arvioitu niiden suhteellisella liikkuvuudella elektroforeesin jälkeen agaroosigee-leillä. E. coli Κ12ΔΗ1 ja M5219 transformoitiin sitten 10 luonnehditulla plasmidilla G-pPLa-HFIF-67-12A9.

4. Plasmidin G-pPLc-HFIF-67-8:n rakentelu

Plasmidi G-pPLc24 tarjoaa toisen mahdollisuuden HuIFN-B-sekvenssien insertiota varten sillä tavalla, että toinen yhdistynyt polypeptidi voidaan piilevästi synteti-15 soida. Bglll-osasen G-pPLa-HFIF-67-1:stä insertiosta G-pPLc24:n BamHl-kohtaan on seurauksena jatkuva lukukehys, joka koodaa 98 aminohappotähdettä (MS2-replikaasigeenistä (W. Fiers et ai. "Complete Nucleotide Sequence of Bacteriophage MS2 RNA: Primary and Secondary Structure of the 20 Replicase Gene", Nature, 260, 500-507 (1976)), 27 aminohappoa, joita koodaavat sekvenssit Bglll-kohdan ja HulFN-8:n merkkisekvenssin aloitus-AUG:n välissä, jota seuraa HuIFN-8:merkkipeptidi ja kypsä HuIFN-β, ts.

98

25 UGG.GAU.CUU.CAG.UUU.CGG.AGG.CAA.CCU.UUC.DAA.GCC.UUU.GCU

Trp-Asp-Leu-Gln-Phe-Arg-Arg-Gln-Pro-Phe-Glu-Ala-Phe-Ala- CUG. GCA.CAA.CAG.GUA.GUA.GGC.GAC.ACU.GUU.CGU.GUU.GUC.AAC. Leu-Ala-Gln-Gln-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Val-Arg-Val-Val-Asn 30 AUG-(HuIFN-B-merkkipeptidin koodaussekvenssi)-AUG--Met (kypsän HuIFN-B:n koodaussekvenssi 35 Suorakaiteessa oleva luku tarkoittaa aminohappo tähteen numeroa MS2 replikaasigeeniproteiinissa (R. Devos et ai., supra; W. Fiers et ai. supra). Siten tämä rakenne 63 881 7;.

tekee mahdolliseksi ekspressoida yhtynyt polypeptidi, joka koostuu MS2-replikaasin osasta, joka on yhdistynyt 27 aminohapon kautta HuIFN-B-merkkipeptidiin, joka otse on yhdistynyt kypsään HuIFN-B:aan.

5 G-pPLa-HFIF-67-l-DNA:ta pilkottiin BGlIIzn kanssa ja liitettiin BamHI-pilkottuun pPLc24-DNA:hän. Sidos leikattiin uudelleen BamHI:11a emä-pPLc24-molekyylien poistamiseksi ja transformoitiin C600rKmK(λ ):aan valikoiden karbenisilliini-resistenssin suhteen. Transformantit ana-10 lysoitiin pilkkomalla Hindi:11a. Pilkontakohtien tunnetuista asemsita pPLc24:llä voidaan ennustaa, että Bglll-iFN-B-osasen insertio merkitsevässä PT:n suhteen antaisi ylimääräisen n. 650 emäsparin, Hincll-osasen. Edustava klooni, jolla oli tämä konfiguraatio merkittiin pPLc-HFIF-15 67-8:ksi. Vaiheet, joita käytettiin tämän plasmidin raken telussa, on esitetty kaavamaisesti kuvassa 10. Yksityiskohtaisempi kartta tästä plasmidista on esitetty kuvassa 13. Plasmidin koko (n. 3850 emäsparia) arvioitiin laskemalla sen perusosasten koot yhteen, jotka puolestaan oli 20 arvioitu niiden suhteellisella liikkuvuudella elektroforeesin jälkeen agaroosigeeleissä. E. coli Κ12ΔΗΙ ja M5219 transformoitiin luonnehditulla plasmidilla G-pPLc-HFIF-67-8.

5. Plasmidin G-pPLa-HFIF-67-12A279T rakentelu ; 25 Plasmidia pKT279 (K. Talmadge'n lahjoitus; pKT279 on pBR322:n johdannainen, jossa on osa geenistä B-lakta-____ maasia varten jätetty pois ja jossa on Pstl-kohta rakennettuna B-laktamaasin aminohapolle 2) pilkottiin Pstl:n kanssa ja 3’-päätelisäke poistettiin ja osanen tehtiin 30 tylppäpäiseksi käsittelemällä E. coli DNA-polymeraasi I:-llä (Klenow-osasella) deoksi-nukleosiditrifosfaattien läsnäollessa. pKT279:n Pstl:llä linearisoitua ja 3'-tylppäpäiseksi tehtyä DNA-osasta pilkottiin sitten EcoRI:n kanssa — antamaan osanen, joka muunmuassa koodaa B-laktamaasin ____: 35 merkkisekvenssiä ja kypsän proteiinin neljää ensimmäistä aminohappoa.

64 8 8 1 7:3 Tätä pientä osasta käytettiin sitten korvaamaan pPLa-HFIF-67-12Al9:n Hpal-EcoRI-osanen (jolloin Hpal-kohta syntyy seurauksena edellä kuvatusta deleetiosta G-pPLa-HFIF-67-12:sta) sitomalla Hpal-EcoRI-pilkottu pPLa-HFIF-5 67-12Δ19 tämän osasen kanssa T4-DNA-ligaasin läsnäollessa.

Ennustettu sekvenssi PstI (tehty tylppäpäiseksi)-Hpal-liitoksessa on: (B-laktamaasi-merkkipeptidin koodaus- sekvenssi )-CAC.CGC.AAC.

His-Arg-Asn- 10 AUG-(HuIFN-B-merkkipeptidin koodaussekvenssi)-AUG-

Met (kypsän HuIFN-B:n koodaussekvenssi)

Seiten rakentelun tuloksena on IFN-β, jota edeltää 15 kaksi merkkisekvenssiä peräkkäin - bakteeri-merkkisekvens- si (β-laktamaasi) ja IFN-B-merkkisekvenssi - usean aminohapon yhdistäminä. Siten tämä rakenne voi tehdä mahdolliseksi ekspressoida kypsä HuIFN-β, joka on yhtynyt kahteen merkkipeptidiin, tai, jos bakteeri-merkkisekvenssin ja 20 HuIFN-B:n merkki-sekvenssin peräkkäin yhdistelmä on bak teerien tunnistama ja oikein pilkottu, tekee tämä rakenne mahdolliseksi ekspressoida kypsä HuIFN-β ja sen erittyminen solusta.

E. coli M5219 transformoitiin pPLa-HFIF-6712A279T- : 25 :11a.

6. Plasmldin G-pPLa-HFIF-67-12A218Ml:n rakentelu

Plasmidia pKT218 (K. Talmadge'n lahjoitus; pKT218 on pBR322:n johdannainen, jossa on osa geenistä B-lakta-maasia varten ja sen merkkisekvenssi on jätetty pois ja 30 siinä on Pstl-kohta, joka on rakennettu B-laktamaasin merkkisekvenssin aminohapolle 4) digeroitiin EcoRI:n ja Alul:n kanssa antamaan osanen, joka koodaa muunmuassa B-laktamaasi-merkkipeptidin alkuosaa. Tämä osanen sidottiin T4-DNA-ligaasin läsnäollessa osaseen, joka oli valmistettu 35 pPLa-HFIF-6712Al9:stä Alul-digeroinnilla aktinomysiini D:n (0,05 mM) läsnäollessa (plasmidin pilkkomiseksi Alul-koh- 65 8 8 1 75 (0,05 mM) läsnäollessa (plasmidin pilkkomiseksi Alul-koh-dassa IFN-B-merkkipeptidissä) ja pilkkomalla EcoRI:lla.

Syntynyt plasmidi, joka merkittiin pPLa-HFIF-67-12A218Ml;ksi, sisälsi geenin, joka koodaa B-laktamaasi-5 merkkipeptidiä, alkuosan, osan geenistä, joka koodaa HuIFN-B-merkkipeptidiä, ja geenin, joka koodaa kypsää HuIFN-β. Plasmidin sopivan alueen ennustettu sekvenssi on: ~4 CAA.GCU.CUU.UCC.AUG-(kypsän HuIFN-B:n koodaussekvenssi) 10 Gln-Ala-Leu-Ser-Met-

Suorakaiteessa oleva luku tarkoittaa aminohappotähteen numeroa pKT218:n β-laktamaasi-merkki-peptidissä. Siten tämä rakenne tekee mahdolliseksi ekspressoida kypsä 15 HuIFN-β joka on yhtynyt osaan bakteeri-merkkisekvenssiä ja osaan omaa merkkisekvenssiään. Jälleen, jos bakteeri-isäntä tunnistaa ja pilkkoo oikein hybridi-merkkisekvenssin, kypsä HuIFN-β voitaisiin ekspressoida tästä plasmidista ja saada erittymään solusta.

20 E. coli M5219 transformoitiin pPLa-HFIF-6712A218Ml- : llä.

7. Plasmidin G-pPLa-HFIF-67-12AMl:n rakentelu

Plasmidi pPLa-HFIF-67-12Al9 linearisoitiin kuten edellä Alulrllä aktinomysiini D:n läsnäollessa (0,5 mM) 25 leikkauksen kehittämiseksi Alul-kohtaan HulFN-B:n merkki- peptidissä. Pilkonnan jälkeen Hpal:llä DNA muodostettiin ·· uudelleen renkaaksi T4-DNA-ligaasin läsnäollessa. Synty neellä plasmidilla, joka merkittiin pPLa-HFIF-67-12AMl-:ksi, oli vain pieni osa IFN-B-merkkisekvenssiä, joka 30 edelsi DNA-sekvenssiä, joka koodasi kypsää IFN-B:aa. Liitoksen ennustettu sekvenssi on: I 82 GUI.CUC.UUU. CCA.UGA.

Val-Leu-Phe-Pro-STOP___ 35 A UG-(kypsän HuIFN-B:n koodaussekvenssi) 66 881 75

Pystysuorassa suorakaiteessa oleva luku tarkoittaa aminohappotähteen numeroa β-laktamaasissa. Vaakasuora suorakaiteen muotoinen kuvio tarkoittaa sekvenssiä toisessa koodikaavassa. Sentähden β-laktamaasia koodaavan sekvens-5 sin ja koodaussekvenssin IFN-B:n merkkipeptidiä varten loppuosan translaatio pysähtyy UGA-pysäytyskodonilla. Aloituskodoni (AUG) kypsää IFN-B:a varten on kuitenkin läsnä samassa paikassa, vaikka eri koodikaavassa. Siten translaation uudelleenaloittaminen voi tapahtua tässä pis-10 teessä kypsän HuIFN-fl:n tuottamiseksi.

E. coli M5219 transformoitiin pPLa-HFIF-6712AMl- : llä.

8. Plasmidin G-pPLa-HFIF-67-12A9-BX2;n rakentelu

Plasmidi pPLa-HFIF-67-12A9 linearisoitiin Hpal:llä 15 ja käsiteltiin eksonukleaasilla BAL-31 emäsparien poistamiseksi peräkkäin linearisoidun DNA-osasen päästä (H. Gray et ai., "Extracellular Nucleases of Pseudomonas Bal 31" I. Characterization of Single Strand-Specific Deoxyribendo-nuclease", Nucleic Acids Res., 2, sivut 1459-92 (1975)). 20 Vaihtelemalla aikaa ja eksonukleaasi-käsittelyn olosuhteita rakennettiin sarja DNA-osasia, joissa oli eri lukumääriä nukleotidejä koodaussekvenssistä HuIFN-B:nn merkkipeptidiä varten, jos ollenkaan, joka edeltää kypsän HuIFN-β:η AUG-aloituskodonia. Näitä osasia voidaan sitten mani-25 puloida ribosomaalisten sitomiskohtien rakentamiseksi eri etäisyyksille alotuskodonista ja halutun sekundaarisen rakenteen saamiseksi lähelle tätä kodonia kypsän HuIFN-β:η ekspression lisäämiseksi.

Eksonukleaasilla käsitellyt osaset tehtiin tylppä-30 päisiksi E. coli-DNA-polymeraasi I:llä (Klenowosasella) dATPrn ja dGTP:n läsnäollessa täytteeksi kaikkiin ulostyöntyviin 5'-päihin. Senjaikeen kaksisäikeinen Xhol-liit-täjä, jossa oli sekvenssi 5'-CCTCGAGG-3' (Collaborative Research), liitettiin tylppäpäisiksi tehtyihin DNA-osa-35 siin. Näitä osasia pidennettiin sitten kaksisäikeisellä 67 88 1 75

EcoRI-liittäjällä, jossa oli sekvenssi 5'-CCGAATTCGG-3' (Collaborative Research). EcoRI-piikoman jälkeen osaset, joilla oli "tarttuvat" EcoRI-päät, muodostettiin uudelleen renkaiksi E. coli-DNA-ligaasilla. Tämän ligaasin käytöllä, 5 T4-DNA-ligaasin asemesta, vältetään tylppäpäisten osasten uudelleen renkaaksi muodostaminen.

Yksi plasmidi valittiin ja merkittiin pPLa-HFIF-67-12A9-BX-2:ksi. Siinä on Xhol-kohta n. 25 emäsparia ennen kypsän HuIFN-B:n AUG-aloituskodonia. Xhol-kohtaa edel-10 tää myös EcoRI-kohta, joka on kehitetty liittämällä Hpal-osasen EcoRl-liittäjä EcoRl-kohtaan, joka on juuri PL~pro-moottorin edellä pPLa-HFIF-6712Al9:ssa. Siten B-laktamaa-si-koodaussekvenssi on jätetty pois. Lisäksi, koska ainakin osa HuIFN-B:n merkkisekvenssistä on poistettu, on ai-15 noestaan kypsän HuIFN-B:n ekspressointi mahdollista.

E. coli Κ12ΔΗΙ transformoitiin pPLa-HFIF-6712Al9-BX-2:11a.

Bakteereilla tehdyn HuIFN-B:n eristäminen ja luonnehtimi-men 20 A. Bakteeri-uutteiden valmistus 1. Induktio-menetelmä

Tasaosa kantaviljelyistä (jäädytetty -80 eC:ssa 50-%:isessa glyseroli-50-%:isessa LB-väliaineessa), jotka käsittivät kantojen Κ12ΔΗΙ ja M5219, jotka oli transformoitu 25 plasmideilla, jotka sisälsivät edellä kuvattuja IFN-B-osa-sia, kantaviljelyt, ympättiin tuoreeseen LB-väliaineeseen halutun antibiootin kanssa ja kasvatettiin kyllästykseen asti 28 °C:ssa. Kaksi 500 ml:n panosta LB-väliainetta il-. . man antibioottia ympättiin 1 ml :11a kumpiakin kyllästetty- 30 jä soluja ja kasvatettiin voimakkaasti ravistellen 28 °C-

O

:ssa solutiheyteen 2 x 10 /ml. Toinen panos siirrettiin 42 °C:seen ja ravistelua jatkettiin. Riippuen käytetystä plasmidista viljely koottiin talteen eri ajankohtina siirron jälkeen 42 °C:seen. Vertailuviljely, joka jäi 28 °C-35 tseen, koottiin samaan aikaan kuin 42 °C:n viljely. Solut 68 881 75 koottiin linkoamalla GSA-sentrifugissa (Sorvali) kierros-luvulla 8.000 r/min. 10 minuuttia. Pelletit pestiin 20 ml:ssa 50 mM tris-HCI (pH 7,4), 30 mM NaCl ja pelletoitiin uudelleen SS34-sentrifugissa (Sorvali) 10 minuuttia kier-5 rosluvulla 10.000 r/min. Pelletti jäähdytettiin nopeasti hiilihappojää/metanolissa ja varastoitiin -80 °C:ssa. Kun talteenkorjattuja soluja haluttiin altistua osmoottiselle shokille, pakastusvaihe jätettiin pois.

Bakteerien liuottamista ja uuttamista varten on 10 käytetty kahta eri menetelmää.

2. Uuttomenetelmät

Liuotus A

Soluja suspendoitiin uudelleen edellä kuvatun puskurin 4 ml:n lopulliseen tilavuuteen ja lysotsyymiä (Sig-15 ma) lisättiin 1 mg/ml:ksi. Inkubointi kesti 30 minuuttia 0 °C:ssa. Suspensio kävi läpi kaksi pakastussulatus-sykliä kastamalla peräkkäin etanoli-CX^-seokseen (-80 CC) ja 37° C vesihauteeseen. S-100-jae valmistettiin ultrasentrifu-goimalla liuotettuja bakteereita (4 ml) Beckman SW60 Ti-20 roottorissa 1 tunti kierrosluvulla 50.000 r/min ja 4 ®C-:ssa, minkä jälkeen päällä olevaa nestettä käytettiin edelleen.

Liuotus B

Liuotus B suoritettiin, kuten edellä kuvattiin 25 (liuotus A), paitsi että 50 mM tris-HCI (pH 8,0)-30 mM NaCl-liuos korvattiin liuoksella: 50 mM HEPES (Sigma)NaOH (pH 7,0), 30 mM NaCl, 3 mM β-merkaptoetanolia ja 3 % vastasyntyneen vasikan seerumia (Gibco).

Osmoottinen shokki 30 Välittömästi talteenoton ja pesun jälkeen solupel- letti suspendoitiin uudelleen 20-%:iseen sakkaroosiin, 100 mM EDTA:hän, 100 mM tris-HCI:ään (pH 7,4) maksimisoluti-heydellä 1 x 10^/ml. Suspensiota pidettiin jäissä 10 minuuttia ja lingottiin 10 minuuttia kierrosluvulla 10.000 35 r/min Sorvali SS34-sentrifugissa. Sakkaroosiliuos valutet- 69 8 8 1 7 tiin varovasti putkesta ja pelletti suspendoitiin uudelleen yhtä suureen tilavuusmäärään vettä (solutiheys 1 x 10*®/ml). Uudelleensuspendoituja soluja pidettiin jäissä 10 min ja lingottiin sitten jälleen 10 minuuttia kierros-5 luvulla 10.000 r/min SS34-sentrifugissa (Sorvali). Päällä oleva neste (supernatantti) tehtiin 3-%:iseksi vasikan si-kiöseerumin suhteen, 50 m HEPES-puskurin (pH 7 suhteen, 30 mM NaCl:n suhteen ja 3 mM β-merkaptoetanolin suhteen. Tätä supernatanttia nimitetään "osmoottiseksi shokki-superna-10 tantiksi". Sitä varastoitiin 0 °C:ssa.

3. Ammoniumsulfaatti-saostus 1 ml (NH^^SO^-liuosta, joka oli kyllästetty huoneen lämpötilassa, lisättiin 0,5 ml:aan vertailuliuosta tai S-100-uutteeseen. Tätä seosta pidettiin jäissä ainakin 15 30 minuuttia, minkä jälkeen saostuma pelletoitiin Eppen- dorf-sentrifugissa 10 minuutissa huoneen lämpötilassa. Pelletti liuotettiin uudelleen PBS:ään (fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen).

B. Interferoni-titrauksia 20 1. Suora anti-virus-määritys

HuIFN-β analysoitiin mikrotiitteri-kennoissa (Ste-rilin) CPE (sytopaattinen vaikutus)-estomenetelmällä ihmisen fibroblasteissa, jotka olivat trisomisia kromosomin 21 suhteen. Solut ympättiin päivää ennen käyttöä, inkuboitiin : 25 näytteen sarjalaimennoksilla (log^Q = 0,5) 24 h ja altis tettiin rakkula-stomatitisvirukselle (Indiana-kanta), ai- 6 9 ·;· neen, joka sisälsi 10 ' hiiri-C-929-plakkia muodostavia _3 yksiköitä/ml, 10 laimennoksilla. CPE merkittiin muistiin 24 tuntia VSV-hyökkäyksen jälkeen ja interferonin pääte-30 piste määriteltiin näytelaimennokseksi, joka aiheutti vi-rusCPE:n 50 %:n vähentymisen. Kaikki analyysit käsittivät Hu IFN-0:n sisäisen standardin, joka itse oli kalibroitu NIH-fibroblasti-referenssiä G023-902-527 vastaan.

Solulinja, joka oli trisominen kromosomin 21 suh-35 teen (jota tämän jälkeen nimitetään T2^:ksi) oli peräisin yo 0817 ; naispuolisen potilaan, jolla oli Down'in syndrooma, ihon koepalasta. Sen karyotyyppi on todettu ja osoittautui dip-loidiseksi kaikille kromoseomeille paitsi kromosomia 21 (trisominen). Tämän solulinjan herkkyys interferonille 5 näyttää olevan verrattavissa soluiinjojen, jotka ovat tri-somisia kromosomin 21 suhteen, herkkyyteen, kuten on selostanut E. De Clercq et ai., "Non-antiviral Activities Of Interferon are not Controlled by Chromosome 21", Nature, 256, sivut 132-134 (1975) ja E. De Clercq et ai., "Chromo-10 some 21 Does not Code for an Interferon Receptor", Nature, 264, 249-251 (1976).

Muissa määrityksissä on käytetty solulinjaa E^M (A. Billiau et al., "Human Fibroblast Interferon for Clinical Trials: Production, Partial Purification and Charac-15 terization", Anti-microbial Agents and Chemotherapy, 16, 49-55 (1979)). Tämä solulinja on diploidi-fibroblasti, joka on disominen kromosomin 21 suhteen ja peräisin 2 kuukauden ikäsestä ihmissikiöstä. Verrattuna T21~solulinjaan on E^SM vähemmän herkkä HuIFN-fi:lle kertoimella 10.

20 2. 2,5-A-syntetaasi-määritys

Eräs toinen menetelmä interferonin läsnäolon havaitsemiseksi on käyttää 2,5-A-syntetaasi-määritystä. On osoitettu, että interferoni indusoi tätä entsyymiä, joka muuttaa ATP:n 2,5-A:n trimeereiksi (ja vähemmässä määrässä 25 dimeereiksi, tetrameereiksi ja multimeereiksi) (A. Kimchi et ai., "Kinetics of the Induction of Three Translation-Regulatory Enzymes by Interferon", Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 76, 3208-3212 (1979)).

2

Yhdistyviä 25 cm :n alustoja, jotka sisälsivät 30 E-^SM-solujen viljelyjä (A. Billiau et al., supra), käsiteltiin 20 tuntia bakteeriuutteiden tai vertailuinterfero-nin 1:6 laimennoksella MEM-10-%:isessa vasikan sikiöseeru-missa. Viljelyt irrotettiin trypsiinillä (0,25 %), EDTA-:11a (0,17 %) ja pestiin tehokkaasti 140 mM NaCl:lla 35 mM 35 tris-puskurissa (pH 7,5). Kaikki myöhemmät työvaiheet suo- 7i 8 817 5 ritettiin 4 °C:ssa. Solut homogenoitiin 1,5 - 2,0 tila-vuusosassa 20 mM HEPES-puskuria (pH 7,4), joka sisälsi 10 mM KCl, 1,5 mM magnesiumasetaattia ja 0,5 mM ditiotreito-lia ("liuotuspuskuri I") Dounce-lasihomogenoijassa. Homo-5 genaattia lingottiin 20 minuuttia 10.000 x g:ssä ja päällä oleva neste (S10) varastoitiin nestemäisessä typessä, kun sitä ei käytetty välittömästi.

5

Yhtyviä 96 syvennyksen mikrotiitteri-levyjä (10 2 solua 0,2 ml:ssa/0,28 cm syvennys) käsiteltiin interfero-10 nilla tai vastaavilla bakteeriuutteilla kuten edellä. 20 tunnin käsittelyn jälkeen levyt jäähdytettiin jäissä ja pestiin kolme kertaa 140 mM NaClillä 35 mM tris-puskurissa (pH 7,5). Viljelyt liuotettiin sitten lisäämällä jokaiseen syvennykseen 5 μΐ liuosta, joka sisälsi 0,5 % Nonidet P40 15 ja 1 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridia (PMSF) liuotus-puskurissa I. Voimakkaan ravistelun jälkeen 20 minuuttia jäissä solu-lysaatit koottiin ja lingottiin 20 minuuttia 10.000 x g:ssä kuten edellä.

3,5 μΐ lysaattia, joka oli valmistettu kuten edel-20 lä esitettiin, (liuotus A tai liuotus B) inkuboitiin 2 tuntia 31 eC:ssa 6 μl:ssä inkubointi-seosta, joka sisälsi 100 mM kaliumasetattia, 25 mM magensiumasetaattia, 10 mM HEPES/KOH (pH 7,4), 5 mM ATP, 4 mM fruktoosi-1,6-bis-fos-faattia, 1 mM ditiotreitolia ja 20 pg/ml poly(I)*poly(C) 30 25 ja 2 pCi lyofilisoitua (a- p)-ATP (400 Ci/mmol, Radiochemical Centre'stä, Amersham, U.K.). Reaktion lopettami-·;·! sen jälkeen kuumentamalla 3 minuuttia 95 eC:ssa ja 2 mi

nuutin kirkastamisen jälkeen 9.000 x g:ssä näytteitä käsiteltiin 150 U/ml:lla alkalista fosfataasia vasikan suoles-30 ta (Boehringer, Mannheim, luettelo no. 405612) 1 h 37 °C-:ssa, kirkastettiin jälleen ja taputettiin (1 μΐ/näyte) polyetyleeni-imiini-selluloosa-ohutkerroslevyille (Polygram, cel 300 PEI 20 χ 20 cm firmasta Macherey-Nagel Co., Duren, Saksa). Levyt pestiin kahdesti 2 l:ssa tislattua 35 vettä ja kuivattiin tyhjössä ennen kromatografiaa 1 M

72 881 75 etikkahapossa 2-3 tunnin aikana. Kuivaamisen jälkeen niitä käsiteltiin autoradiografiällä 1-24 tuntia.

C. HulFN-B-aktlivisuuden havaitseminen bakteerluut- teissa 5 1. Vertailukokeita

Edellä kuvattuja määrityksiä toteutettaessa kohdattiin kaksi pääongelmaa. Molemmat ovat tärkeitä analyysi-arvojen tulkinnassa. Bakteeri-uutteet (vertailu-uutteet mukaanluettuina), jotka saatiin liuotuksesta edellä kuva-10 tuilla menetelmillä, näyttivät sisältävän ei-interferoni-sukuisen tekijän, joka antoi virusvastaisen aktiivisuuden määrityksessä. On epäselvää oliko tekijä itse virusvastai-nen aine vai indusoiko tämä tekijä jonkun virusvastaisen aineen, esim. interferonin, määrityksessä käytetyissä olo-15 suhteissa. Tämän tekijän läsnäolo todettiin jatkuvasti S100-uutteissa. Tekijän aktiivisuus oli, ehkä solutihey-destä johtuen, usein suurempi vertailu-uutteissa E. coli HB101:stä kuin Κ12ΔΗΙ- tai M5219-isäntäbakteerien samanlaisissa vertailu-uutteissa, jolloin tekijän aktiivisuus 20 aina oli piemenpi kuin n. 0,7 log^/ml. Jostakin syystä tämän tekijän virusvastainen aktiivisuus aleni tai joskus jopa poistui kokonaan seostamalla (NH^ :llä olosuh teissa, jotka seostivat myös interferonia vertailukokeissa .

25 Johtuen tästä saastuttavasta tekijästä aiheutuvasta virusvastaisesta aktiivisuudesta on vaikeata tehdä johtopäätöksiä pienten määrien interferonia läsnäolosta bakteeri-uutteissa. Oli kuitenkin mahdollista erottaa tekijän virusvastainen aktiivisuus autenttisen interferonin aktii-30 visuudesta käyttämällä diploidi-fibroblasteja E^SM. Nämä solut ovat vähemmän herkkiä HuIFN-B:lle kuin tavalliset solut, jotka ovat trisomlsia kromosomin 21 suhteen. Mutta solut ovat paljon herkempiä tälle tekijälle kuin ne ovat bona fide interferonille. Esimerkiksi käyttäen pMS2-7:ää 35 (R. Devos et. ai., "Construction and Characterization of a 73 881 75

Plasmid Containing a nearly Full-Size DNA Copy of Bacteriophage MS2 RNA", J. Mol. Biol., 128, 595-619 (1979)) E.

coli HB101:ssä (H. Boyer ja D. Rouland-Dussoiz, "A Complementation Analysis of Restriction and Modification of 5 DNA In Escherichia coli", J. Mol. Bio., 41, 459-472 (1969)) tai K12AHI-G-pPLa2311:ssa vertailu-lysaatteina, on lukuarvot, jotka osoittavat tämän suhteellisen vaikutuksen, esitetty seuraavassa taulukossa, jolloin virusvastai-nen aktiivisuus on mitattu log^-yksiköissä/ml.

10 T21 E^M

HBl01-pMS2-7 (liuotus A) 0,7 HB101-pMS2-7 (liuotus B, mutta ei B-merkaptoetanolia eikä vasikan seerumia) <0,2 1,2 HB101-pMS2-7 (liuotus B) ei tehty 0,7 15 HB101-pMS2-7 (liuotus B) 0,2 1,0 HB101-pMS2-7 (liuotus B) 0,7 2,5 K12AHI-G-pPLa23ll (liuotus B) 0,2 4,0 K12AHI-G-pPLa2311 (42 eC; osmoottinen shokaatti) 0,5 >1,7 20 Lisäksi autenttisen HuIFN-B:n läsnäolo heijastuu erilaisin suhdearvoin T2^:E^SM:een ja suureen T21:n arvoon, verrattuna siihen, joka aiheutuu tekijän läsnäolosta. Tämä osoitetaan seuraavilla lukuarvoilla:

hl E1SM

25 osmoottinen K12AHI-G-pPLa2311 (42 °C) 0,5 2,5 shokki- K12AHI-G-pPLa2311 (42 °C) 1,5 2,5 super- + HuIFN-B(autenttinen) natantti liuotus B HB101-pMS2-7 0,2 2,5 (NH4)2S04- HB101-pMS2-7 + HuIFN-B 2,7 2,5 saostamisen (autenttinen) 30 jälkeen (lisätty ennen liuotusta)

Siten aktiivisuuksien T21:E1SM vertailu ja absoluuttisen aktiivisuuden mittaaminen T21-soluille tekee mahdolliseksi käyttää edellä kuvattuja viirusvastaisia 35 määrityksiä HuIFN-β:n epäilemättömästi löytämiseksi bak-teeriuutteessa. Lisäksi olisi huomattava, että E. coli:n

74 381 7 G

(joko Κ12λΗΙ:π tai M5219:n joka on transformoitu jollakin tässä kuvatuista plasmideista, esim. G-pPLa-HFIF-y7-12-:11a, G-pPLa-HFIF-6712Al9:11a, G-pPLc-HFIF-67-8:11a, 5 G-pPLa-HFIF-6712A279T:llä, G-pPLa-HFIF-67-12A218MI:11a, G-pPLa-HFIF67-12AMI:lla tai G-pPLA-HFIF-67-12A9-BX-2:11a, viljelyjen uutteita varten tällainen häiriö tuntemattoman tekijän vaikutuksesta virusvastaisissa määrityksissä oli vähemmän vakava. Näissä määrityksissä ei-runsaasti väke-10 vöidyillä uutteilla (esimerkiksi, soluja 150 ml:n vilje-

Q

lyistä 6 x 10 solulla/ml liuotettiin ja uutettiin 4 ml-:ssa) oli alhainen tai havaitsemattoman alhainen tuntemattoman tekijän aiheuttama aktiivisuus.

Tämän saastuttavan tekijän läsnäolon on myös osoi-15 tettu olevan havaittavissa 2,5-A-syntetaasiaktiivisuus- määrityksessä. Tässä tämä tekijä kuitenkin voidaan eliminoida täydellisesti seostamalla (NH4)2S04:llä. Siten HuIFN-B:n todellinen läsnäolo bakteeri-uutteessa, erotettuna saastuttavan tekijän läsnäolosta, voidaan myös epäi-20 lemättömästi havaita tässä määrityksessä. Kuitenkin uutteet E. coli HB101/G-pBR322 (Pst)/HFIF-6:sta, jossa on epätäydellinen kolineaarinen koodaussekvenssi (ainoastaan muutamat viimeiset emäsparit puuttuvat) ja joka siten ei pysty ekspressoimaan kypsää polypeptidiä, ovat toistuvasti 25 antaneet positiivisen 2,5-A-syntetaasiaktiviisuuden, mutta tähän asti ei erottuvaa virusvastaista vaikutusta. Tämä osoittaa, että 2,5-A-määritystä ei voida pitää ainoana kriteerinä täydellisesti bakteerien tekemän interferonin läsnäolosta. Se osoittaa myös, että vähemmällä kuin täy-30 dellisesti kypsällä interferonilla voi olla hyödyllinen aktiivisuus.

32 2,5-A-syntetaasi-aktiivisuus mitataan p-yhdistä-misellä 2,5-A-trimeeriin kuten autoradiografiällä osoitetaan. Tulokset (toistettu kolme kertaa) on esitetty seu- 35 raavassa taulukossa kasvavin positiivisin arvoin, mikä 32 heijastaa lisääntynyttä p-yhdistymistä.

75 881 75 uute a/pHFIF-6-*+++; (NH.)2S0.-saostuksen jälkeen-*++ uute b/pMS2-7->++ + ; (NH4 jfsO^-saostuksen jälkeen-*- uute b/pMS2-7-*+++; (NH?)2S04-saostuksen jälkeen-»+ + plus HuIFN-β 4 Z 4 5

Toinen tärkeä ongelma näissä määrityksissä on ihmisen fibroblastien erittämän HuIFN-fl:n alhainen talteenotto eri koevaiheiden aikana ja jälkeen. Talteenotetun leuko-10 syytti-interferonin ja fibroblastiinterferonin määrän ver tailu lisättynä S-100-uutteeseen osoittaa, että HuIFN-β saadaan talteen ainoastaan 10 %:n tehokkuudella vastakohtana HuIFN-a'ojen 100-%:iseen talteenottoon (virusvastai-set arvot on annettu log^Q yksikköinä/ml; määritettynä 15 T21-soluilla).

IFN-α laimennettu HB101-pMS2-7:n S-100-uutteessa (liuotus A) 2,5 IFN-α laimennettu E-MEM:ssa plus 3 % vasikan seerumia 2,7 20 IFN-α laimennettu HB101-pMS2-7:n S-100-uutteessa (liuotus A) 0,7 IFN-α laimennettu E-MEM:ssa-plus 3 % vasikan seerumia 1,7

Muut kokeet, joissa IFN-B:aa lisättiin solupellet-25 tiin ennen liuotusta ja uuttoa (myös vasikan seerumi lisättynä 3 %:iin asti stabiloimisaineeksi) osoittivat, että ainoastaan 10 - 30 % IFN-β saatiin talteen.

logiO yksikköä/ml HEPES ^21 E^SM

30 HB101-pMS2-7 (liuotus B, mutta ei pH 8 0,7(10 %) 1,7 plus IFN-β β-merkaptoetanolia ei-pH 7 1,0(20 %) 1,7 kä vasikan seerumia) pH 6 0,7(10 %) 1,7 IFN-β (sama käsittely kuin pH 6 1,7(50 %) 1,5 (ei baktee- liuotuksessa B) reita) 35 Lisäkokeita suoritettiin IFN-fi-aktiivisuuden pysy vyyden ja palautumisen testaamiseksi. Seostaminen (NH^)2S04:llä, kuten edellä kuvattiin, bakteeri-uutteiden 76 8 8 1 75 joko läsnäollessa tai poissaollessa, aiheutti usein tiit-terin pienentymisen virusvastaisessa määrityksessä: logiO yksikköä/ml

Saostaminen (NH^^SO^:llä ennen jälkeen 5 IFN-β 1,0 0,5 IFN-B 2,7 2,5 HBl01-pMS2-7 + IFN-B(liuotus B) 1,5 1,2 K12AHI-G-pPLa2311 (28 eC) + IFN-β (liuotus B) 1,7 1,5 K12AHI-G-pPLa2311 (28 °C) + IFN-B(liuotus B) 2,2 3,0 10 IFN-B:n dialyysistä (yli yön 4 °C:ssa PBS:ää vastaan) baakteeri-uutteiden joko läsnäollessa tai poissaollessa, oli tavallisesti myös seurauksena IFN-B-aktiivi-suuden palautumisen vähentyminen: 15 ^°^10 yksikköä/ml

Dialyysi ennen jälkeen IFN-β PBS:ssä 1,0 0,5 IFN-β PBS:ssä 2,7 2,5 K12AHI-G-pPLa8 (28 eC) + IFN-β (liuotus B) 1,2 <0,2 70 K12AHI-G-pPLa8 + IFN-β (liuotus B) 3,0 1,7 K12AHI-G-pPLa8 + IFN-β (liuotus B) 2,5 1,0 K12AHI-G-pPLa8 + IFN-β (liuotus B) 1,5 0,5

Koska IFN-β on tyypin I interferoni, sen aktiivisuuden tulisi olla hapon kestävä. Tämä testaattin dialy-25 soimalla IFN-B-näytteitä bakteeri-uutteiden läsnäollessa tai poissaollessa yli yön 5 mM glyysiini-HCl:ssä (pH 2,2) 4“ C:ssa. Tämä käsittely aiheutti sakan muodostumisen, joka pelletoitiin Eppendorfsentrifugissa 12.000 x g:ssä 2 minuutin aikana. Päällä oleva neste testattiin sitten vi-30 rusvastaisen aktiivisuuden suhteen. Vaikka jonkinverran virusvastaista aktiivisuutta säilyi tämän käsittelyn jälkeen, talteenotetun interferonin määrässä oli melkoinen häviö.

77 8 8 1 75 log1Q yksikköä/ml

Dialyysi ennen jälkeen HB101-pMS2-7 (liuotus A) + IFN-β 0,7 0,5 K12AHI-G-pPLa2311 (28 °C) 5 osmoottinen shokaatti + IFN-fl 1,2 1,2 M5219-G-pPLa8 (42 °C) (liuotus B) + IFN-β 1,2 0,7 M5219-G-pPLa8 (28 eC) (liuotus B) + IFN-β 3,0 2,0 10 Alenemat HuIFN-B-aktiivisuudessa, jotka havaittiin näillä eri käsittelyillä verrattuna edellä kuvattuihin vertailu-uutteisiin, täytyy tulkita varovaisesti. Alemmat virusvastaiset tiitterit eivät välttämättä tarkoita, että interferoni on huonontunut. Alemmat tiitterit voivat joh-15 tua HuIFN-B:n ei-spesifisestä tarttumisesta dialyysimem-braaneihin tai komponentteihin bakteeriuutteissa, esim. membraanikomponentteihin. On esimerkiksi selvästi todettu, että IFN-β on hydrofobinen proteiini (sen hydrofobi-suutta todistaa myös sen aminohappo-sekvenssi), joka voi 20 tarttua ei-spesifisesti putken seinämiin tai muihin pintoihin. Lisäksi bakteeriIFN-β, jolta puuttuu glykosyloin-ti, voi olla jopa hydrofobisempaa. Siten johtopäätöksiä ihmissolujen erittämän glykosyloidun IFN-B:n talteenotosta ei välttämättä ole ekstrapoloitava bakteeri-peräiseen IFN-25 B:aan.

2. IFN-B-aktiivisuuden osoittaminen a. Virusvastainen aktiivisuus E. coli M5219:n tai Κ12ΔΗΙ:η, jotka sisälsivät plasmideja G-pPLa-HFIF-67-12, G-pPLa-HFIF-67-12Al9, 30 G-pPLc-HFIF-67-8, G-pPLa-HFIF-67-12A279T, G-pPLa-HFIF67- 12Δ218ΜΙ, G-pPLa-HFIF-67-12AMI tai G-pPLa-HFIF-6712Al9-BX-2, bakteeri-uutteita analysoitiin IFN-β:n virusvastai-sen aktiivisuuden suhteen. Menetelmät S-100-uutteiden ja — osmoottisten shokki-supernatanttien induktiota ja valmis- ____ 35 tusta varten olivat pääasiallisesti edellä kuvatun kaltai- 78 8 81 75 set. Koetta kohti käytettiin 150 ml bakteeri-viljelyä

Q

(3 - 6 x 10 solua/ml). Kaikki biologiset tiitterit on annettu log^Q yksikköinä/ml.

G-pPLa-HFIF-67-12 5 G-pPLa-HFIF-67-12:tä käytettiin transformoimaan E.

coli M5219 ja E. coli Κ12ΔΗΙ ja S-100-uutteet valmistettiin liuotuksella B. Kaikki näytteet saostettiin (NH4)2S04:llä ennen testausta virusvastaisen aktiivisuuden suhteen.

10 T21 Ej^SM

K12AHI-G-pPLa-HFIF-67-12 (28 °C) <0,2 <1,0 K12AHI-G-pPLa-HFIF-67-12 (42 eC, 90 min) 0,2/0,5 <1,0/<1,0 M5219-G-pPLa-HFIF-67-12 (28 °C) <0,2 <1,0 M5219-G-pPLa-HFIF-67-12 (42 °C, 90 min) 0,7/0,7 <1,0/<1,2 15

Toinen luku edellisessä taulukossa on tiitteri, joka on määritetty saman näytteen uudelleenmäärityksellä. Vertailukoe, jossa autenttista IFN-fl lisätiin E. coli HB101-pMS2-7:ään ennen solujen liuottamista, osoitti IFN-B:n 30 %:n talteenoton määrityksessä. Siten on selvää, että induktion jälkeen havaitaan IFN-B:n virusvastainen vaikutus bakteeri-lysaatissa. Tiitterit, samalla kun ne ovat E-^SM-solujen havaitsemistason alapuolella, osoittavat selvästi, että IFN-B-aktiivisuus ei johdu saastuttavasta bakteeri-2 5 aktiivisuudesta. Tällainen saastuttava bakteeriaktiivisuus antaisi arvoiksi vähintäin 2,0 E^SMtllä vastaamaan arvoja 0,5 tai 0,7 T21-soluilla (ks. vertailukokeet edellä). G-pPLa-HFIF-67-12Al9

Plasmidia G-pPLa-HFIF-67-12Al9 käytettiin transformoimaan E. coli M5219 ja S-100-uutteita valmistettiin liuotuksella B. Kaikki näytteet saostettiin (NH4)2S04:llä, kuten edellä kuvattiin, ja analysoitiin virusvastaisen aktiivisuuden suhteen. Jälleen HuIFN-B:n virusvastainen __ vaikutus uutteessa on selvä. Sulkumerkeissä oleva luku-35 arvo ilmaisee havaitsemistason, joka aiheutuu nimenomais- 79 8 8 1 7.·) ten näytteiden pienestä myrkyllisyydestä ihmissoluille kudosviljelyssä.

i) M5219-G-pPLa-HFIF-67-12Al9 (28 eC) ii) M5219-G-pPLa-HFIF-67-12Al9 (42 °C, 90 min, 8 lopullinen solutiheys = 3 x 10ö/ml) 5 T21:llä EjSMrllä i) <0,5 2,2 (<2,0) ii) 2,2 (<0,5) 2,2 (<2,0) 10 Vertailukoe, jossa autenttista IFN-β lisättiin HB101-pMS2-7:ään ennen solujen liuottamista, antoi 30 %:n talteenoton. Tässä suuret arvot T2^-soluilla ja aktiivisuuden suhde T21:llä verrattuna aktiivisuuteen E^Mrllä osoittaa, että merkittävää saastuttavaa bakteeriaktiivisuutta (jota 15 edellä käsiteltiin) ei ollut lämpötilalla indusoiduissa näytteissä.

G-pPLc-HFIF-67-8

Plasmidia G-pPLc-HFIF-67-8 käytettiin transformoimaan E. coli M5219 ja S-100-uutteita valmistettiin liuo-20 tuksella B. Kaikki näytteet saostettiin (NH^)2SO^:llä ja analysoitiin virusvastaisen aktiivisuuden suhteen.

i) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (28 °C) ii) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42 °C, 180 min, „ lopullinen solutiheys = 6 x 10 /ml) Τοη:llä Εί SM:llä 25 21 _1_ i) <0,5 2,2 (<2,0) ii) 2,2 (<0,5) 2,2 (<2,0)

Sulkeissa oleva lukuarvo osoittaa havaitsemistason, joka ^ johtuu myrkyllisyydestä. Vertailukoe, jossa autenttista IFN-β:aa lisätiin HB101-pMS2-7:ään ennen solujen liuottamista, antoi 30 %:n talteenoton. Jälleen on selvää, että bakteeri-uutteella oli HuIFN-β:n virusvastainen aktiivisuus.

so 8 817::

Eräässä toisessa kokeessa näiden solujen osmoottinen shokki-supernatantti analysoitiin IFN-B-virusvastaisen aktiivisuuden suhteen: i) vertailu: M5219-G-pPLa-HFIF-67-12Al9 (28 eC) ii) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (28 °C) 5 iii) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42 °C, 180 mir^ solutiheys = 6 x 10/ml).

Määritykset suoritettiin T21~soluilla sekä ennen että jälkeen (NH.)_SO.-saostamisen. Lukuarvo sulkeissa osoittaa 4 2 4 10 havaitsemisrajaa.

Ennen saostamista Saostamisen jälkeen i) <0,2 <0,2 ii) <0,2 <0,2 iii) 1,5 (<0,2) 0,7 (<0,2) 15 IFN-B:n talteenotto oli n. 10 % vertailukokeissa. Vertai-lu-lysaatit eivät osoittaneet havaittavaa aktiivisuutta E^SMrllä. Arvot, jotka saatiin osmoottisilla shokki-super-natanteilla tekevät selväksi, että lämpötila-indusoidulla M5219-G-pPLc-HFIF-67-8-uutteella on virusvastainen aktii-20 visuus, jota ei ole indusoimattomilla näytteillä. Saosta misen jälkeen (NH^)2S0^:llä näyte (iii), jonka tiitteri oli 0,7 lo910 yKsikköä/ml, dialysoitiin pH 2,2:een, kuten edellä kuvattiin, ja se ei osoittanut olennaista aktiivisuuden alentumista. Tämä haponkestävyys on tyypin I inter-. 25 feronien, esim. IFN-6:n, erikoisominaisuus.

G-pPLa-HFIF-67-12A279T

Plasmidia G-pPLa-HFIF-67-12A279T käytettiin transformoimaan E. coli M5219 ja S-100-uutteita valmistettiin liuotuksella B. Näytteet saostettiin (NH^)2S0^:llä ennen 30 määritystä CPE:lla T21-soluilla. 42 °C:ssa indusoitujen solujen uutteilla oli virusvastainen tiitteri 1,5 - 1,7 log^Q yksikköä/ml uutetta.

G-pPLa-HFIF-67-12A218MI

Plasmidia G-pPLa-HFIF-67-12A218MI käytettiin trans-35 formoimaan E. coli M5219 ja S-100-uutteita valmistettiin ei 88175 liuotuksella B. Näytteet saostettiin (NH4)2S04:llä ennen määritystä CPE:lla T21-soluilla. 42 °C:ssa indusoitujen solujen uutteiden virusvastainen tiitteri oli 1,5 log^g yksikköä/ml uutetta.

5 G-pPLa-HFIF-67-12AMI

Plasmidia G-pPLa-HFIF-67-12AMI käytettiin transformoimaan E. coli M5219 ja S-100-uutteita valmistettiin liuotuksella B. Näytteet saostettiin (NH4)2S04:llä ennen määritystä CPE:lla T21-soluilla. 42 °C:ssa indusoitujen 10 solujen uutteiden virusvastainen tiitteri oli 2,0 loglO yksikköä/ml uutetta.

G-pPLa-HFIF-67-12Al9BX-2

Plasmidia G-pPLa-HFIF-67-12Al9-BX-2 käytettiin transformoimaan E. coli K12 HI ja S-100-uutteita valmis-15 tettiin liuotuksella B. Näytteet saostettiin (NH4)2S04:llä ennen määritystä CPE:lla T2^- ja FS-4-soluilla. 42 °C:ssa indusoitujen solujen uutteiden virusvastainen tiitteri oli 1,7 - 2,9 log1Q yksikköä/ml uutetta.

b. HuIFN-fl:n vlrusvastaisen aktiivisuuden neutraloimi- 20 nen vasta-aineella

Lisätodisteita, jotka vahvistavat IFN-B:n bakteeri-ekspression, annetaan vasta-aine-neutralointikokeilla.

: : : Anti-interferoni-vastaseerumi tuotettiin vuohissa, jotka ' 7 : oli immunoitu 10 yksiköllä autenttista IFN-B:aa (ihmisen 25 fibroblasti-solujen erittämää), ja puhdistettiin kontrol- — loiduilla huokoisilla lasihelmillä (A. Billiau et ai., supra). Bakteeri-uutteiden analysoinnin jälkeen kuten edellä virusvastaisen aktiivisuuden suhteen, lisätiin vas-taseerumin sarjalaimennoksia samanlaisiin näytteisiin, 30 seoksia induboitiin 1 h 37 °C:ssa, levitettiin ihmisen diploidi-fibroblasteille T2^ ja analysoitiin virusvastaisen aktiivisuuden suhteen kuten edellä kuvattiin. Neutra--;··! loitumisaste IFN-Ö-vastaseerumilla on väliltä +++:sta (täydellinen neutralointi) -:een (ei neutraloitumista). 35 Sulkeissa oleva lukuarvo osoittaa vastaseerumin likimää-: ·’ räisen laimennoksen 50-%:ista neutralointia varten.

82 881 7 ; 1) M52l9-G-pPLc-HFIF-67-8 (42 °C, 180 min; joka antoi 2,2 IoQ^q virusvastaista yksikköä/ml T21~soluilla).

2) M5219-G-pPLa-8 (42 °C, 180 min), johon IFN-B:aa (ihmis- fibroblasteista) lisättiin ennen liuotusta (joka ^ antoi 1,7 log^Q virusvastaista yksikköä T2^-soluil- la) .

Vastaseerumin laimennus (1) (2) 10~? +++ +++ 10 (- + lp + + + 10“3 ± (10~*,D) +++ f.

10 io“5 - ± (io“°) 10“' -

Samanlaisia tuloksia saatiin uutteilla M5219-pPLa-HFIF67-12Al9:sta (42 °C). Erot neutralointi-tiitterissä tämän keksinnön bakteeri-IFN-B:n ja autenttisen IFN-B:n välillä saattavat johtua eroista antigeenisyydessä tai näiden bak-teeriproteiinien spesifisessä IFN-aktiivisuudessa suhteessa autenttiseen IFN-B:aan, minkä aiheuttaa glykosyloinnin puute bakteeriproteiineissa.

c. HuIFN-B:n virusvastaisen aktiivisuuden pysyvyys (1) Lämpökäsittely IFN-B;lla on, vastakohtana IFN-a:lle, se hyvin epätavallinen ominaisuus, että sen virusvastainen aktiivisuus palautuu keitettäessä sitä l-%:isessa SDS:ssa, l-%:isessa B-merkaptoetanolissa, 5 M ureassa (Stewart, W. E. II et 25 ai.. Distinct Molecular Species of Human Interferon, Requirements for Stabilization and Reactivation of Human Leucocyte and Fibroblast Interferon, J. Gen. Virol., 26, 327-331, (1975)), vaikka 100 %:n palautumista ei tavalli-sesti saavuteta. Tätä määritystä varten bakteeri-solut 150 ml:n viljelystä suspendoitiin uudelleen puskuriin liuotusta B varten ja lisätiin yhtä suuri tilavuusmäärä 2-%:ista SDS, 2-%;ista B-merkaptoetanolia ja 10 M ureaa, seosta keitettiin 2 minuuttia ja valmistettiin S-100-jakeet.

83 3 8 1 75 i) vertailu: M5219-G-pPLa-HFIF-67-12Al9 (28 eC) ii) vertailu: 3 log-0 yksikköä HuIFN-8:aa laimennettuna B pusRuriin iii) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42 °C, 180 min, solutiheys-5 6 x 108/ml).

Määritykset suoritettiin T21-soluilla. Sulkeissa oleva lukuarvo ilmaisee havaitsemisrajan, mikä johtuu luontaisesta myrkyllisyydestä.

10 Ennen keittämistä Keittämisen jälkeen i) <1,5 <1,5 ii) 2,2 (<1,5) 2,0 (<0,5) iii) 3,0 (<2,0) 2,2 (<1,5)

Vertailukoe osoitti n. 10 %:n IFN-B-aktiivisuuden palau-15 tumisen. E^SM:ssa ei saatu havaittavaa arvoa rinnakkaisissa vertailulysaateissa. Nämä lukuarvot tekevät selväksi, että vaikka ainoastaan n. 10 % lisätystä IFN-B:sta palautuu vertailukokeessa ja että IFN-B-virusvastainen aktiivisuus oli läsnä uutteessa lämpötilaindusoidusta 20 M5219-G-pPLc-HFIF-67-8-viljelystä vielä tämän kovan käsit telyn jälkeenkin. Itseasiassa löydettiin suurempi virus-vastainen aktiivisuus tämän käsittelyn jälkeen verrattuna .·.·. liuotuksen B menetelmään, mikä osoittaa IFN-6:n mahdolli- ··. sen tarttumisen solukomponentteihin jälkimmäisessä mene- 25 telmässä.

(2) Dialyysi

HuIFN-β:n virusvastainen aktiivisuus on myös ei-dialysoituva. Esimerkiksi dialyysin jälkeen PBS:ää vastaan 16 tuntia neutraalissa pH:ssa ja 4 °C:ssa bakteeri-uuttei-30 den virusvastainen aktiivisuus (log^ yksikköä/ml) säilyi, vaikkakin alentunein tiitterein: i) M5219-pPLc-HFIF-67-8 (42 eC) ii) M5219-pPLa-HFIF-67-12Al9 (42 eC) iii) IFN-β M5219-pPLa-i:ssa (42 °C) 84 38175

Ennen dialyysiä Dialyysin -jälkeen i) 2,3 2,3 i) 3 2,3 i) 1,5 1,3 ii) 2,3 1,3 5 ii) 2,3 2 ii) 2,3 1

Havaittu alentuminen aktiivisuudessa dialyysin jälkeen saattaa johtua IFN-B:n ei-spesifisestä tarttumisesta dial-yysimembraaneihin jne.

(3) Saostaminen (NH^):llä Tämän keksinnön bakteeri-uutteiden virusvastainen aktiivisuus (log1Q yksikköä/ml) säilyi saostamisen jälkeen 67-%:isella kyllästetyllä ammoniumsulfaatilla (2 tilavuus- osaa (NH^^SO^-liuosta 1 tilavuusosaan uutetta), väkevyys, jonka tiedetään saostavan HuIFN-B. 30 minuutin kuluttuva jäissä pellettiä lingottiin 12.000 x g:ssä 10 minuuttia ja liuotettiin uudelleen PBS:ään määritystä varten: i) M5219-pPLc-HFIF-67-8 (42 eC) ii) M5219-pPLa-HFIF-67-12Al9 (42 °C) 20 iii) IFN-B M5219-pPLa-8:ssa (42 °C)

Ennen saostamista Saostamisen -jälkeen i) 2 2 i) 2 2,3 ii) 2 2 iii) 1,3 1,3 25 iii) 1,5 1,3 (4) pH 2-käsittely Tämän keksinnön bakteeri-uutteiden virusvastainen aktiivisuus (log^g yksikköä/ml) oli kestävä myös happoa 30 vastaan. Uutteita joko dialysoitiin 15 h 30 ml:aa glysii-ni-HCI (pH 2,2) vastaan, mitä seurasi dialyysi PBS:ää vastaan 3 h, tai tehtiin happameksi HCI:llä, mitä seurasi neutralointi NaOH:lla. Sakan poistamisen jälkeen suoritettiin määritys.

85 38 1 7 ¾ i) M5219-pPLc-HFIF-67-8 (42 eC) ii) M5219-pPLa-HFIF-67-12Al9 (42 °C) iii) IFN-β 5219-pPLa-8:ssa (42 °C)

Ennen happoa Hapon jälkeen 5 i) 2 1,3 1) 0,7 0,7 ii) 2 1 iii) 3 2 d. 2,5-A-syntetaasi-aktiivlsuus !Q M5219-G-pPLc-HFIF-67-8:n osmoottiset shokaatit (kuvattu edellä) analysoitiin 2,5-A-syntetaasin läsnäolon suhteen, kuten edellä kuvattiin, mikrotiitteri-levyillä, paitsi että käytettiin Hela-soluja E^M-solujen asemesta.

Saatiin seuraavat tulokset: 15 i) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (28 eC) ks.(edellä) ii) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42 °C) ks.(edellä)

Arvot, jotka heijastavat 2,5-A-syntetaasi-aktiivisuutta, 32 osoittavat P-radioaktiivisuuden yhdistyneen 2,5-A:n tri-meeri-muotoon.

20 (endogeenisen (mitatut taustan vähentä- lukemat) misen jälkeen) 1) käsittelemättömät - solut 3342 cpm 0 cpm 2) bakteeri-uute (i): laimennus 1/6 1972 cpm -1370 cpm 25 bakteeri-uute : (ii): laimennus 1/6 6960 cpm 3618 cpm 4) bakteeri-uute (i): + IFN-8 ···· 1,5 log10 yksik- köön/nuasti 7037 cpm 3695 cpm .ii 5) ks. 3, mutta inkuboi- tu anti-IFN-8-anti- 30 seerumin kanssa 3950 cpm 608 cpm 6) ks. 4, mutta inkuboi-tu anti-IFN-B-anti- : seerumin kanssa 2960 cpm -382 cpm 7) vertailu-IFN-β 0,5 login ksikköä/ml 4463 cpm 1120 cpm 8) vertailu-IFN-B 1 1<>910 35 yksikköä/ml 7680 cpm 4338 cmpm 9) vertailu-IFN-β . 1-5 log10 yksikköä/ ml 13615 cpm 10273 cpm 10) vertailu-IFN-β 2 log10 yksikköä/ ml 25040 cpm 21698 cpm

86 8 8 1 7 S

Tulokset 2,5-A-syntetaasi-aktiivisuusanalyysistä osoittavat, että lämpötila-indusoidun M5219-GpPLc-HFIF-67-8:n osmoottinen shokaatti-supernatantti, jolla on virusvas-tainen aktiivisuus (ks. edellä), indusoi myös 2,5-A-synte-5 taasiaktiivisuuden, kun taas ei indusoitu bakteerikanta ei tee näin. Tämä vastaa virusvastaisen aktiivisuusmäärityk-sen tuloksia.

2,5-A-syntetaasin stimuloitumisaste on sama kuin IFN-8:n, lisättynä vertailu-lysaattiin, aktiivisuus vrt. 10 tapaukset (3) ja (4)). Tapauksista (7)-(10) kehitetyn vä-kevyyskäyrän käyttö osoittaa, että, ottaen huomioon laimennus, aktiivisuus log.^ 1,7 yksikköä/ml voidaan avioida kummassakin tapauksessa (3) ja (4), mikä on yhteensopivaa arvojen kanssa suorassa virusvastaisessa määrityksessä, 15 ts. 1,5 log1Q yksikköä kummallekin tapaukselle. Tämä koesarja osoittaa myös, että 2,5-A-syntetaasin induktio voidaan neutraloida anti-IFN-B-vastaseerumilla, kuten asia on virusvastaisessa määrityksessä.

e. Virusvastainen aktiivisuus muilla solulinjoilla 20 Uutteet (i) ja (ii) (M5219-G-pPLc-HFIF-67-8, edel lä) testattiin myös virusvastaisen aktiivisuuden suhteen eri solulinjoilla, jotka olivat peräisin kissasta, hiirestä, apinasta tai kaniinista. Ne eivät osoittaneet havaittavaa virusvastaista aktiivisuutta näihin soluihin tätä ei 25 liioin osoittanut autenttinen IFN-β, joka oli ihmissolujen tekemä. Aktiivisuutta ei myöskään havaittu kissan keuhko-solulinjaan, joka oli herkkä ihmisleukosyytti-interfero-nille. Nämä tulokset antavat lisätodisteita siitä, että bakteereilla tuotetulla IFN-B:lla on ominaisuuksia, jotka 30 ovat pääasiallisesti samoja kuin IFN-β:11a, jota erittävät indusoidut ihmis-fibroblasti-solut.

f. Herkkyys proteaasille Tämän keksinnön bakteeri-isännistä saadun IFN-B:n herkkyys testattiin käsittelemällä laimennettuja bakteeri-35 uutteita kasvavalla määrällä trypsiiniä 1 h 37 °C:ssa.

87 881 75 IFN-β:n virusvastainen aktiivisuus kumoutui trypsiinin vaikutuksesta samanlaisessa väkevyydessä kuin se, joka poisti autenttisen IFN-β:n lisättynä inaktiiviseen ver-tailulysaattiin, aktiivisuuden.

5 Trypsiini- loppupiste (ms/ml) M5219-pPLa-HFIF-67-12Al9 (42 °C) (1.000 μ/ml) 0,03 M5219-pPLc-HFIF-67-8 (42 eC) (1.000 μ/ml) 0,03 10 IFN-β in M5219-pPLa-8 (42 °C) (1.000 μ/ml) 0,03 M5219-pPLc-HFlF-67-8 (42 °C) ( 30 μ/ml) 0,03 IFN-β in M5219-pPLa-8 (42 °C) ( 30 μ/ml) 0,03 15 3. Aktiivisen IFN-B-tuotteen identifiointi

Erilaiset kokeet ovat osoittaneet, että esi-HuIFN-β ei ole aktiivinen ja että se ei bakteerisolujen vaikutuksesta tai määritysolosuhteissa muutu aktiiviseksi tuotteeksi. Siten eri bakteeri-uutteissa havaittu IFN-fl-aktii-20 visuus, selostettu edellä, johtuu todennäköisesti odotettujen yhdistyneiden proteiinien (esim. HuIFN-β, joka on yhdistynyt β-laktamaasiin, MS2:een tai bakteeri-merkkisek-vensseihin) muuttumisesta bakteerien vaikutuksesta tai määritysolosuhteiden alaisena aktiiviseksi tuotteeksi.

25 Ei ole varmaa, että aktiivinen tuote tällaisista uutteissa on kypsä HuIFN-β (kypsä HuIFN-B on tietenkin, G-pPLa-HFIF-67-12AMl:n ja G-pPLa-HFlF-67-12Al9-BX-2:n tuo-'·. te). Kuitenkin fraktioitaessa nämä bakteeri-uutteet, jotka ____: oli saatu esimerkiksi indusoidusta M5219-pPLa-HFIF-67-120- - 30 Al9:stä tai indusoidusta M5219-pPLc-HFIF-67-8:sta polyak- . . ryyliamidigeeli-elektroforeesilla denaturoivissa olosuh teissa havaittiin kahden aktiivisen tuotteen läsnäolo. Ensimmäisen näistä tuotteista likimääräinen koko oli 15.000 - 18.000 daltonia ja saattaisi vastata kypsää IFN-35 B:aa. Toinen tuote, jolla oli suurempi molekyylipaino, saattaa olla fuusiotuote tai epätäydellisesti käsitelty tuote, jolla on IFN-B-aktiivisuus, tai voi olla tuote, joka on muuttunut kypsäksi IFN-B:ksi määritysolosuhteissa.

88 8 8 1 7Γ;

Eri ekspressio-tuotteiden aminohappo.sekvenssointi, käyttäen hyvin tunnettuja menetelmiä, tekee mahdolliseksi määrittää millä proteiini-tuotteilla, jos millään, kypsän HuIFN-B:n lisäksi, on HuIFN-B:n aktiivisuus.

5 Polypeptidlen, joilla on HuIFN-B-aktiivisuus ja jotka on tuotettu tämän keksinnön mukaisesti, saannon ja aktiivisuuden parantaminen

Proteiinin valmistumisen määrää säätelee kolme päätekijää: sen geenin kopioiden lukumäärä solun sisällä, 10 tehokkuus, jolla nämä geenikopiot transkriboituvat ja tehokkuus, jolla ne translatortuvat. Transkription ja translaation (jotka yhdessä muodostavat ekspression) tehokkuus riippuu vuorostaan nukleotidisekvensseistä, jotka normaalisti sijaitsevat halutun koodaussekvenssin edessä. Nämä 15 nukleotidisekvenssit eli ekspression säätelysekvenssit määrittelevät, muun muassa, sijainnin, jossa RNA-polyme-raasi alkaa vaikuttaa aloittaakseen transkription (pro-moottorisekvenssi) ja jossa ribosomit sitoutuvat ja ovat vuorovaikutuksessa mRNA:n kanssa (transkription tuote) 20 translaation alullepanemiseksi. Kaikki tällaiset ekspression säätelysekvenssit eivät toimi samalla tehokkuudella. Siten on eduksi erottaa spesifiset koodaussekvenssit haluttua proteiinia varten niiden viereisistä nukleotidisekvensseistä ja yhdistää ne sensijaan muihin tunnettuihin 25 ekspression säätelysekvensseihin suurempien ekspressio- määrien siten edistämiseksi. Kun tähän on päästy, vasta-valmistettu DNA-osanen kytketään suuremman kopioluvun plasmidiin tai bakteriofaagijohdannaiseen geenikopioiden lukumäärän lisäämiseksi solun sisällä ja siten ekspres-. 30 soidun proteiinin saannon edelleen parantamiseksi.

Voidaan käyttää useita ekspressiokontrollisekvens-sejä, kuten edellä kuvattiin. Näitä ovat E. coli:n laktoo-sioperonin ("lac-systeemi”), operaattori, promottori ja ribosomin sitomis- ja vaikutussekvenssit (sellaiset sek-35 venssit kuin Shine-Dalgarnosekvenssit mukaanluettuina), E.

89 8 81 7 E

coli'n tryptofaanisyntetaasisysteemin ("trp-systeemi") vastaavat sekvenssit, faagin λ pääoperaattori- ja promoottorialueet (0TPT kuten edellä selostettiin ja 0_,0_), lan-kamaisten yksisäikeisten DNA-faagien säätelyalue tai muut 5 sekvenssit, jotka säätelevät prokaryoottisten tai eukary-oottisten solujen geenien ja niiden virusten ekspressiota. Siten jonkun nimenomaisen polypeptidin tuotannon parantamiseksi sopivassa isännässä voidaan geeni, joka koodaa tätä polypeptidiä, valmistaa kuten edellä ja siirtää re-10 kombinantti-DNA-molekyylistä lähemmäksi sen aikaisempaa ekspressiokontrollisekvenssiä tai jonkun edellä mainitun ekspressiokontrollisekvenssin säätelyn alaisena. Tällaiset menetelmät ovat tekniikan tasolla tunnettuja.

Muut menetelmät translaation tehokkuuden parantami-15 seksi käsittävät kemiallisesti tai entsymaattisesti valmistettujen oligunukleotidien insertion aloituskodonin eteen. Tällä menettelyllä voidaan saada lähetti-RNA:n op-timaalisempi primaarinen ja sekundaarinen rakenne.

Erityisesti sekvenssi voidaan laatia niin, että 20 aloittava AUG-kodoni on helposti luoksepäästävässä asemassa (ts. ei sekundaari-rakenteen peittämä) joko hiusneulan kärjessä tai muilla yksisäikeisillä alueilla. Edellä mainitun Shine-Dalgarno-segmentin asema ja sekvenssi voidaan samalla tavalla optimoida. Lähetti-RNA:n yleisen rakenteen ··* 25 (taittumisen) tärkeys on selostettu (D. Iserentant ja W. -...· Fiers "Secundary Structure of mRNA and Efficiency of

Translation Initiation"’ Gene, 9, 1-12 (1980).

Haluttujen tuotteiden solusaannon lisäkasvut riip-:Y: puvat lisäyksestä geenien, joita voidaan käyttää hyväksi 30 solussa, lukumäärästä. Tähän päästään kytkemällä HuIFN-β-geeni (transkriptio- ja translaatio-säätelyelementtiensä kanssa tai ilman) vieläkin suuremman kopioluvun plasmidiin tai lämpötilalla säädeltävän kopioluvunplasmidiin (ts. plasmidiin, jossa on sellainen mutaatio, että lämpötilan ' 35 korottamisen jälkeen plasmidin kopioluku lisääntyy B.

90 881 75

Uhlin et ai. "Plasmids with Temperature-dependent Copy Number for Amplification of Cloned Genes and their Products", Gene, 6, 91-106 (1979)). Vaihtoehtoisesti lisäykseen geeniannoksessa voidaan päästä esimerkiksi aikaisem-5 min kuvatulla tavalla tuotettujen rekombinantti-DNA-mole-kyylien insertiolla pidättyväiseen bakteriofaagiin λ , yksinkertaisimmin pilkkomalla plasmidia restriktioentsyymin kanssa antamaan ketjumolekyyli, joka sitten sekoitetaan pilkotun faagi λ :n kloonaus-siirtäjän kanssa (joka on 10 esim. tyyppiä, jota on kuvannut N. E. Murray et ai., "Lambdoid Phages that Simplify the Recovery of in Vitro Recombinants", Mol. Gen. Genet., 150, 53-61 (1977), ja N.

E. Murray et al., "Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4", J. Mol. Biol., 132, 493-606 15 (1979) ja rekombinantti-DNA-molekyylin kanssa, joka on valmistettu inkuboimalla DNA-ligaasin kanssa. Haluttu re-kombinantti-faagi valitaan sitten kuten edellä ja käytetään lysogenoimaan E. coli:n isäntäkanta.

Erityisen käyttökelpoiset λ-kloonaus-siirtäjät si-20 sältävät lämpötila-herkän mutaation repressio-geenissä cl ja tukautettavissa olevia mutaatioita geenissä S, jonka tuote on tarpeen isäntäsolun liuotusta varten, ja geenin E, jonka tuote on viruksen pää-kapsidiproteiini. Tällä systeemillä lysogeenisiä soluja kasvatetaan suhteellisen 25 matalassa lämpötilassa (esim. 28 - 32 °C) ja kuumennetaan sitten korkeampaan lämpötilaan (esim. 40 - 45 ®C) profaa-gin poisleikkautumisen aikaansaamiseksi. Pitkitetty kasvu korkeammassa lämpötilassa johtaa proteeiinin, joka jää soluihin, tuotannon suurempiin määriin, koska nämä eivät ly-30 soidu faagi-geenituotteiden vaikutuksesta normaalilla tavalla, ja koska kytketty faagigeeni ei ole kapseloitu. Se on käytettävissä lisä-transkriptiota varten. Solujen keinotekoinen liuottaminen vapauttaa sitten haluttua tuotetta suurella saannolla. Koska tässä hakemuksessa on myös käy-35 tetty λ-repressorisysteemiä ekspression säätelyyn, saattaa 9i 88175 olla tarpeen kontrolloida profaagin poisleikkautumista ja siten geenikopioiden lukumäärää heteroimmuunilla kontrollialueella, esim. joka on johdettu lambdoidi-faagista 21.

Olisi ymmärrettävä, että polypeptidejä, joilla on 5 IFN-B-aktiivisuus (valmistettu tämän keksinnön mukaisesti), voidaan valmistaa yhdistetyn proteiinin muodossa (esim. sidottuna prokaryoottiseen N-päätesegmenttiin, joka ohjaa erittymistä), tai prointerferonin muodossa (esim. aloittamalla interferoni-merkkisekvenssillä, joka voitai-10 siin lohkaista pois erittymisen jälkeen) tai kypsänä interferonina (jälkimmäinen on mahdollinen, koska kypsä fib-roblasti-interferoni alkaa metioniinilla, aminohapolla, jota käytetään tranlaation aloittamiseen). Polypeptidin näiden eri muotojen saantoa voidaan parantaa jollakin 15 edellä esitettyjen menetelmien yhdistelmällä. Myös jotkut tai kaikki kodoneista, joita on käytetty näissä DNA-sek-venseissä, voitaisiin korvata eri kodoneilla. Nämä korvaavat kodonit voivat koodata aminohappoja, jotka ovat identtisiä niiden kanssa, joita korvatut kodonit koodaavat, 20 mutta antavat polypeptidin suuremman saannon. Vaihtoehtoisesti yhden kodoneista tai niiden yhdistelmän korvaaminen, mikä johtaa aminohapon korvautumiseen tai pitempään tai . . lyhyempään HuIFN-6-sukuiseen polypeptidiin, saattaa muut- taa sen ominaisuuksia hyödyllisellä tavalla (esim. lisätä 25 pysyvyyttä, lisätä liukoisuutta, lisätä virusvastaista ··* aktiivisuutta, lisätä 2,5-A-syntetaasi-aktiivisuutta tai lisätä isännän spesifistä aluetta).

Eräs esimerkki tällaisista parannuksista saavutet- : tiin insertoimalla esillä olevan keksinnön mukainen DNA- 30 fragmentti, joka sisälsi IFN-6:n esiastetta koodaavan DNA- : sekvenssin, kloonausvektoriin, joka sisälsi SV40:n myöhäi sen promoottorin ja tämän promoottorin säätelyn alaisena olevan silmukointisekvenssin. Tällainen konstruktio api- —: 4 nan soluissa tuotti noin 10 yksikköä/ml synteettistä IFN-• '· 35 6:aa. Samanlaisia rakenteita muissa kloonausvektoreissa ja eukaryoottisoluissa on myös tarkasteltu.

92 8 817 5

Lopuksi tämän keksinnön rekombinantti-DNA-molekyy-leillä tuotettujen polypeptidien aktiivisuutta voidaan parantaa fragmentoimalla tai modifioimalla tämän keksinnön DNA-sekvenssejä tai polypeptidejä tai muodostamalla niiden 5 johdannaisia hyvin tunnetuin menetelmin.

Kromosomaalisen geenin, joka koodaa HuIFN-B:aa, identti-floiminen

Hybridi-faagin, joka on johdettu ihmissikiön kromosomaalisen DNA:n osasista, jotka on kehitetty osittain 10 pilkkomalla Haelllrlla ja Alul:llä ja liitetty EcoRI-liit-täjillä λ-Charon 4A-haaroihin. kokoelman on valmistanut R. M. Lawn' et ai., Cell, 15, sivut 1157-74 (1978). Tämä geenipankki seulottiin jollakin "in situ"-menetelmällä (W. D. Benton ja R. W. Davis, Science, 196, sivut 180-82 15 (1977); T. Maniatis et ai., Cell, 15, sivut 687-701 (1978)); käyttäen koettimena ^P-merkittvä IFN-8-cDNA-in-sertio-osaa, joka on leikattu TaqI-Bglll-pilkonnalla pHFIF-21:stä. 1 Yksi hybridisoimis-positiivinen faagi-klooni eristettiin 600.000 plakista plakkien toistuvalla 20 puhdistuksella (T. Maniatis et ai., supra). Tämä plakki merkittiin λ CH4A-gHFIF-l:ksi. Tämän plakin restriktioana-lyysi osoitti, että se sisältää n. 16,3 Kb ihmis-DNA:ta.

\CH4A-gHFIF-l:n EcoRI-pilkontai antoi, kahden Charon-4A-faagi-haaran lisäksi, kahdeksan insertio-osasta - 25 - pituudeltaan 4,6, 3,5, 2,4, 1,9, 1,3, 1,2, 0,8 ja 0,6

Kb. Southern-täplityksen jälkeen ainoastaan 1,8 Kb:n osanen hybridisoitui pHFlF-21:n Taq-Bglll-osaseen.

Plasmidi pHFIF-21 tunnistettiin tämän keksinnön 30 seulontamenetelmillä. Tämän plasmidin TaqI-Bglll-osanen sisältää IFN-B:n lähes koko 5'-translatoimattoman alueen ja kokonaiskoodausalueen.

93 88 1 75 1,9 Kb:n osanen kloonattiin uudelleen suoraan pBR325:n (pBR322:n johdannaisen, jossa on myös klooriamfe-nikoli-resistenssi-merkitsijä, joka sisältää yhden ainoan EcoRI-kohdan) EcoRI-kohtaan. 0,6 μ:n EcoRI-pilkottua 5 λ CH4A-gHFIF-l-DNA:ta liitännän jälkeen 100 ng:hen pBR325 ja transformoinnin jälkeen E. coli HB101:een, valittiin useita klooneja. Ainoastaan ne kloonit, jotka sisälsivät 1,9 Kb:n-osasen, hybridisoituivat IFN-6-cDNA-koettimeen. Tämä klooni merkittiin p(325)-gHFIF-4:ksi.

10 pHFIF-21:stä ja p(325)-gHFIF-4:stä johdetun pilkon- taosasen vertailu osoitti, että kromosomaalisessa kloonissa ei ole mitään väliintulevia sekvenssejä ja että tämän kloonin sisältämä DNA-informaatio on sama kuin pHFIF-21:n sisältämä.

15 Kromosomaalisen DNA:n, joka koodaa HuIFN-B:aa, identifiointi ja eristäminen tekee mahdolliseksi transformoida sopivia isäntiä tällä DNA:11a ja ekspressoida siitä HuIFN-B:aa. Tällainen ekspressio on edullinen, koska eri signaalit, jotka liittyvät kromosomaalisen DNA:n sekvens-20 seihin, ovat läsnä tällaisissa klooneissa. Nämä signaalit ovat sitten käytettävissä tuottamaan suurempia saantoja polypeptidin, jota koodaa kromosomaalisen DNA:n koodaus-. . alue, ekspressiossa ja mahdollisessa ekspression jälkei sessä prosessissa.

- 25 Tässä kuvatuilla menetelmillä valmistetuista mikro- organismeista ja rekombinantti-DNA-molekyyleistä ovat esimerkkejä viljelyt, jotka on talletettu viljelykokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganism in Gottingen, Länsi-Saksa, 2.4.1980 ja nimetty HFIF-A - C:ksi: 30 A: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF3) 8: E. COli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF6) C: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF7) Näille viljelyille annettiin tulonumeroiksi vastaavasti DSM 1791-1793. Niistä ovat esimerkkejä myös viljelyt, jot-35 ka on talletettu kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikro- 94 8 81 75 organism in Gottingen, Länsi-Saksa 5.6.1980 ja nimetty HFIF-D - G:ksi: D: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) E: L. coli Κ12ΔΗΙ (G-pPLa-HFIF-67-12) 5 F: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12Al9) G: L. COli M5218 (G-pPLc-HFIF-67-8) Näille viljelyille annettiin vastaavasti tulonumeroiksi DSM 1851-1854. Lisäksi ovat esimerkkejä viljelyt, jotka on talletettu kokoelmaan America Type Culture Collection, 10 Rockville, Maryland, 26.2.1981, ja nimetty HFIF H:ksi ja I:ksi: H: E. coli M5219 (pPLa-HFIF-67-12AMI) I: E. coli HB101 (p[325]-gHFIF-4) Näille viljelyille annettiin tulonumeroiksi ATCC 31824 ja 15 31825, vastaavasti.

Samalla kun tässä edellä on esitetty joukko tämän keksinnön suoritusmuotoja, on selvää, että tätä perusrakennetta voidaan muuttaa muiden suoritusmuotojen aikaansaamiseksi, jotka käyttävät tämän keksinnön menetelmiä ja 20 yhdistelmiä. Siten on selvää, että tämän keksinnön piiri on määriteltävä tähän oheistetuin patenttivaatimuksin, eikä spesifisin suoritusmuodoin, joita on tässä edellä esitetty esimerkinomaisesti.

Claims (6)

95 38 1 75

1. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka pystyy indusoimaan ihmisen β-interferonin immunologista tai biologista 5 aktiivisuutta omaavan polypeptidin ekspression yksisolui sessa isännässä, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat: (a) G-pPLa-HFIF-67-12:n [HincII-Sau3AI], G-pPLa-HFIF-67-12Al9:n [HincII-Sau3AI], ja G-pPLc-HFIF-67-8:n 10 [HincII-Sau3AI] DNA-insertiot, jotka sisältyvät mikro-or- ganismeihin, joilla on talletusnumerot DSM 1851-1854, vastaavasti , (b) G-pPLa-HFIF-67-12AMl:n [BamHI-Sau3AI] DNA-in-sertio, joka sisältyy mikro-organismiin, jolla on talle- 15 tusnumero ATCC 31824, (c) p[325]-gHFIF-4:n [EcoRI] DNA-insertio, joka sisältyy mikro-organismiin, jolla on talletusnumero ATCC 31825, (d) DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat minkä 20 tahansa edellä määritellyn DNA-insertion kanssa, ja (e) DNA-sekvenssit, jotka ovat degeneroituneet geneettisen koodin tuloksena kohdissa (a) (b) ja (c) määri- . . teltyjen DNA-sekvenssien ja -insertioiden suhteen ja jotka koodaavat polypeptidin ekspressiota, jolla on sama amino- 25 happosekvenssi ja joka DNA-sekvenssi on toiminnallisesti liitetty yhdistelmä-DNA-molekyylin ekspressiosäätelysekvenssiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että sillä on kaava:

30 ATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAATTGCTCTCCTGTTGTGCTTCTCCACTACAGCT CTTTCCATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCAGTGT CAGAAGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGCACAGGATG AACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACCCC GCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAAGATTCA ; 35 TCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTGGCTAATGTCTATCAT 96 8 8 1 7 ·., CAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGATTTCACC AGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCAT TACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAGAGTGGAAATC CTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGAAAC; 5 tai ATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTT TCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGCA CAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGA GGACGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACA AGATTCATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGT 10 CTATCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGA TTTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGAT TCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAGAGT GGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGAAAC.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen yhdistelmä-

15 DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että ekspressiosää- telysekvenssi on lac-järjestelmä, β-lac-järjestelmä, trp-järjestelmä, λ-faagin operaattori- ja promoottorialueiden pääosat, fd-vaippaproteiinin säätelyalue tai muu sekvenssi, joka säätelee prokaryoottisten tai eukaryoottisten 20 solujen ja näiden virusten geenien ekspression.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen yh-distelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on G-pPLa-HFIF-67-12, G-pPLa-HFIF-67-12Al9, G-pPLc-HFIF-67-8 tai G-pPLa-HFIF-67-12AMl, jotka yhdistelmä-DNA-mole- 25 kyylit sisältyvät mikro-organismeihin, joilla on talle- tusnumerot DSM 1851-1854 ja ATCC 31824.

5. Menetelmä yksisoluisen isännän transformoimisek-si, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheen, jossa isäntään viedään jonkin patenttivaatimuksista 1-4 30 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli.

6. Menetelmä ihmisen β-interferonin immunologista tai biologista aktiivisuutta omaavan polypeptidin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa viljellään yksisoluinen isäntä, joka on 35 transformoitu patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella yhdis- telmä-DNA-molekyylillä. 97 8 8 1 75