HU193507B - Process for producing interferen-like pelypeptides - Google Patents

Description

A találmány dezoxíribonukleinsav (DNS) szekvenciákra, rekombináns DNS molekulákra, valamint emberi fibroblaszt interferon-szerű polipeptidek előállítási eljárására vonatkozik. Közelebbről megjelölve, a találmány alkalmas gazda-szervezetben kialakított DNS szekvenciákra vonatkozik. Az itt leírt rekombináns DNS molekulákat olyan DNS-szekvenciák jellemzik, amelyek oly polipeptideket kódolnak, amelyeknek az aminosav-szekvenciája és aminosav-összetétele lényegileg megegyezik az emberi (humán) fibroblaszt interferonnal és amelyeknek az immunológiai vagy biológiai aktivitása egyezik a humán fibroblaszt interferonéval. Amint az alábbi leírásból kitűnik, a találmány szerinti DNS-szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és előállítási módszerek vírusellenes, tumorellenes, illetőleg karcinomaellenes szerekben és gyógyászati eljárásokban felhasználható polipeptidek előállítására alkalmazhatók.

E leírásban az interferonokra vonatkozólag a Natúré 286, 2421 (1980. július 10.) 110. oldalán ismertetett nomenklatúrát alkalmazzuk a korábbi hasonló tárgyú bejelentéseinkben alkalmazott nomenklatúra helyett. így például „interferon rövidítéseként a korábbi „IF” helyett az „IFN rövidítést, a fibroblaszt interferon megjelölésére pedig az „IFN-β” rövidítést használjuk.

Az interferonok (IFN) két osztályát ismerjük eddig: az I. osztályba tartozó interferonok kisméretű, savakkal szemben stabil (gliko-)proteinek, amelyek a sejteket ellenállókká teszik vírusos fertőzésekkel szemben [A. Isaacs és J. Lindenmann, „Vírus Interíerence I. The Interferon, Proc. Royal Soc. Ser. B„ 147, 258—267 (1957); W. E. Stewart, II, The Interferon System, Springer-Verlag (1979) (az alábbiakban „The Interferon System)]. A II. osztályba tartozó interferonok savakkal szemben labilisak; közelebbi jellemzésükre ezidő szerint még kevés adat ismeretes. Bár az interferonok bizonyos fokig sejtspecifikusak (The Interferon System, 135— 145. old.), vírusokkal szemben azonban nem specifikusak, hanem a vírusok széles spektrumával szemben védik a sejteket.

A humán interferonok („HuIFN) három csoportba sorolhatók, ezeket a, β illetőleg γ humán interferonoknak nevezik. A fibroblaszt interferonnak is nevezett humán β-interferon („HuINF-β) a diploid fibroblaszt-sejtekben termelődik, megfelelő indukció hatására. Termelődik továbbá kisebb mennyiségekben, a HulFN-α nagyobb mennyiségei mellett, a limfoblasztoid sejtekben is. Az ilyen sejtekből termelt β-interferont már több kutató tisztította és vizsgálta [E. Knight, Jr., „Interferon: Purification and Initial Characterization írom Humán Diploid Celles, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 520-523 (1976)]. Ez egy 20 000 körüli molekulasúlyú glikoprofein [M. Wiranowska-Stewart és munkatársai: „Contributions of Carbohydrate Moieties to the Phy9 sical and Biological Properties of Humán Leukocyte, Lymphobiastoid and Fibroblast Interferons”, Abst. Ann. Meeting Amer. Soc. Microbiol., 246. old. (1978)]. Ez a termék méret szempontjából heterogén, ami feltehetőleg a szénhidrát-molekularészeknek tulajdonítható.

Beszámoltak már az autentikus humán fibroblaszt interferon aminosav-összetételéről is [E. Knight, Jr., és munkatársai: „Humán Fibroblast Interferon: Amino Acid Analysis and Amino-Terminal Amino Acid Sequence”, Science, 207, 525—526 (1980) ]. Folyamatban van az autentikus humán fibroblaszt interferon aminosav-szekvenciájának a felderítése is. Ezidőszerint az autentikus érett protein NH₂ -terminusa első 13 aminosavának sorrendjét írták le: Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser... (E. Knight, Jr., fentebb idézett műve).

Egy közlés szerint a β-interferont két különálló gén kódolja, az egyik a 2. kromoszómán, a másik az 5. kromoszómán helyezkedik el [D. L. Slate és F. H. Ruddle, „Fibroblast Interferon in Mán is Coded by two Loci on Separate Chromosomes, Cell, 16, 171 — 180 (1979)]. Más vizsgálatok viszont arra mutatnak, hogy a β-interferont kódoló gén a 9. kromoszómán helyezkedik el [A. Medger és munkatársai: Involvement of a Gene on Chromosome 9 in Humán Fibroblast Interferon Production, Natúré, 280, 493—495 (1979)].

Bár az autentikus humán fibroblaszt interferon glikozilezve van, a szénhidrát-molekularész eltávolítása [P. J. Bridgen és munkatársai, „Humán Lymphobiastoid Interferon”, J. Bioi. Chem., 252, 6585—6587 (1977)], illetőleg a humán fibroblaszt interferonnak a glikozilezést kizáró inhibitorok jelenlétében történő szintézise [W. E. Stewart, II és munkatársai: „Effect of Glycosylation Inhibitors on the Production and Properties of Humán Leukocyte Interferon, Virology, 97, 473—476 (1979); J. Fujisawa és munkatársai: „Nonglycosylated Mouse L Cell Interferon Produced by the Action of Tunicamycin, J. Bioi. Chem., 253, 8677—8679 (1978); E. A. Havell és munkatársai: „Altered Molecular Species of Humán Interferon Produced in the Presence of Inhibitors of Glycosylation, J. Bioi. Chem., 252, 4425—4427 (1977); The Interferon System, 181. old.] útján a humán fibroblaszt interferon olyan kisebb molekulájú alakjához jutotak, amely az interferon-aktivitást még teljes mértékben vagy legalábbis túlnyomó részben megtartja.

A humán fibroblaszt interferon, számos más humán fehérjéhez hasonlóan, polimorf is lehet. Ezért bizonyos emberek sejtjei oly fibroblaszt interferon-fajtákat termelhetnek (a humán fibroblaszt interferon általánosabb osztályán belül), amelyek fiziológiailag hasonlók, de szerkezetileg némileg különböznek ennek az interferon-osztálynak a prototípusától. Ezért, bár a humán fibroblaszt interferon fehérje-szerkezete általában jól de-2193507 finiált, bizonyos egyének a humán fibroblaszt interferon ettől némileg eltérő variánsait termelhetik.

A normális, egészséges sejtekben a β-interferon általában nem mutatható ki (The Interferon System, 55—57. old.). Ezt a fehérjét a sejt csak valamely IFN-induktornak való kitétele következtében termeli. IFN-induktorként legtöbbnyire vírusok szerepelnek, de léteznek nem vírus-jellegű IFN-induktorok is; ilyenek például a természetes vagy szintetikus kettősszálú RNS, egyes sejtközi mikrobák, mikrobiális termékek és különféle vegyi szerek is. Számos kísérlet történt már arra, hogy az ilyen nem vírus-jellegű induktorok segítségével az emberi sejteket rezisztensekké tegyék vírus-fertőzésekkel szemben [S. Báron és F. Dianzani; Texas Reports on Biology and Medicine, 35 („Texas Reports) 528—540. old. (1977) ]. Ezek a kísérletek azonban nem vezettek számottevő eredményekre. Ehelyett ma inkább az exogén humán fibroblaszt interferonnak az ilyen célú alkalmazását részesítik előnyben.

A vírusok, tumorok és rákos megbetegedések elleni interferon-terápiát különféle adagolási rendszerekkel és különféle beadási módszerekkel folytatták (The Interferon System, 305—321. old.). így például alkalmazták az interferont orális úton, beoltás útján, intravénásán, intramuszkulárisan, intranazálisan, intradermálisan és szubkután úton, továbbá szemcseppek, kenőcsök és spray alakjában; mindezen alkalmazások esetében eredményes hatásról számoltak be. Az interferont rendszerint napi 1—3 adagban alkalmazzák, 10⁴— 10⁷ egységnek megfelelő adagokban. A terápiás kezelés terjedelme függ a beteg állapotától és a beteg fajtájától. így például a vírusos fertőzéseket rendszerint napi egyszeri vagy kétszeri adaggal kezelik, néhány naptól két hétig terjedő ideig; a tumorok és rákos megbetegedések esetében a kezelést naponta egyszer vagy naponta többször adott adagokkal végzik néhány hónapon vagy esetleg éveken keresztül. Egy adott beteg esetében a leghatásosabb terápiás módot természetesen a kezelő orvosnak kell megállapítania, aki figyelembe vesz olyan jól ismert tényezőket is, mint a betegség lefolyása, az előzetes terápia, a beteg reagálása az interferonra és ezek alapján határozza meg a célszerű adagolási módot.

A humán interferont vírusellenes szerként a következő betegségekben alkalmazták az eddigi beszámolók szerint: a légzőutak fertőzései (Texas Reports, 486—496. old.); herpes simplex keratitis [Texas Reports, 497— 500. old.; R. Sundmacher, „Exogenous Interferon in Eye Diseases, International Virology IV, The Hague, Abstract nr. W2/11, 99. old. (1978)]; akut hemorrhagiás conjuctivitis (Texas Reports, 501—510. old.); adenovirus keratoconjunctivitis [A. Romano és munkatársai: ISM Memo I-A8131 (1979. október)]; varicella zoster (Texas Reports 511—515.

old.); cytomegalovirus fertőzések (Texas Reports, 523—527. old.); hepatitis B (Texas Reports, 516—522. old.). Lásd továbbá: The Interferon System, 307—319. old. Az interferon vírusellenes szerként történő széleskörű alkalmazása azonban nagyobb mennyiségű interferont tenne szükségessé, mint amennyi eddig rendelkezésre állott.

Az interferonnak vírusellenes hatásán kívül másirányú hatásai is vannak. így például antagonizálja a kolónia-stimuláló faktor hatását, gátolja a hemopoietikus kolónia-képző sejtek növekedését és zavarja a granulocita- és makrofág-prekurzorok normális differenciációját (Texas Reports, 343—349. old.). Gátolja továbbá az eritroid-differenciációt a dimetil-szulfoxiddal kezelt Friend-féle leukémia-sejtekben (Texas Reports,. 420—428. old.). Jelentőséggel bír az is, hogy egyes sejtvonalak lényegesen szenzitívebbek lehetnek a humán β-interferonnal szemben, mint a humán α-interferonnal szemben a fenti szempontokból [S. Einhorn és H. Strander: „Is Interferon Tissue-Specific — Effect of Humán Leukocyte and Fibroblast Interferons on the Growth of Lymphoblastoid and Osteosarcoma Cell Lines”, J. Gén. Virol., 35, 573— 577 (1977); T. Kutawa és munkatársai: „Comparison of the Suppression of Cell and Vírus Growth in Transformed Humán Cells by Leukocyte and Fibroblast Interferon”, J. Gén. Virol.., 43, 435—439 (1979)].

Az interferon szerepet játszhat az immun-reakció szabályozásában is. így például az interferon, az adagtól és az antigén beadásához viszonyított beadási időtől függően immun-szuppresszív is lehet in vivő és in vitro egyaránt (Texas Reports, 357—369. old.). Emellett megfigyelték, hogy specifikusan szenzitivizált limfociták interferont termelnek az antigénnel történő érintkezés után. Az ilyen, antigénnel indukált interferon ezért az immun-reakció szabályozója lehet, amely egyaránt befolyásolja az antigén-szintet és a sejt-immunitás kialakulását (Texas Reports, 370— 374. old.). Ismeretes továbbá, hogy az interferon fokozza az ölő limfociták aktivitását és az antitesttől függő, sejtek által közvetített citotoxicitást [R. R. Herberman és munkatársai: „Augmentation by Interferon of Humán Natural and Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity”, Natúré, 277, 221 — 223 (1979); P. Beverley és D. Knight, „Killing Comes Naturally”, Natúré, 278, 119— 120 (1979); Texas Reports, 375—380. old.; J. R. Huddlestone és munkatársai: „Induction and Kinetics of Natural Killer Cells in Humans Following Inteferon Therapy, Natúré, 282, 417—419 (1979); S. Einhorn és munkatársai: „Interferon and Spontaneous Cytotoxicity in Mán. II. Studies in Patients Receiving Exogenous Leukocyte Interferon, Acta Med. Scand., 204, 477—483 (1978)]. Mindkettő közvetlenül vagy közvetve kapcsolatban állhat a tumor-sejtekre történő immunológiai támadásai.

-3193507

Ezért a humán interferon, vírusellenes szerként történő alkalmazása mellett alkalmazható lehet a tumorellenes, illetőleg rákellenes terápiában is (The Interferon System, 319—321. és 394—399. old.). Ismeretes, hogy az interferonok különféle állatokban a tumorok sokféle fajtájának növekedését befolyásolják (The Interferon System, 292—304. old.) Ezek az interferonok, az egyéb tumorellenes szerekhez hasonlóan, leginkább a kis tumorok elleni alkalmazásban látszanak hatásosaknak. Az állati interferonok tumorellenes hatásai függnek az adagolás módjától és a beadás idejétől; kimutatták azonban, hogy ezek az interferonok a toxikus szint alatti koncentrációkban hatásosak. Ugyancsak nagyszámú vizsgálatról és klinikai kísérletről számoltak be a humán interferon tumorellenes és rákellenes tulajdonságaival kapcsolatban. E kísérletek sorában rosszindulatú megbetegedést kezeltek interferonokkal; ezek sorában az osteosarcoma, akut myeloid leukémia, multiplex myeloma és a Hodgkin-kór említendő (Texas Reports, 429—435. old.). Emellett újabban kimutatták, hogy a humán β-interferon lokális tumor-regressziókat okoz, ha melanomában, illetőleg mellrákban szenvedő betegeknek szubkután adják be a tumor-csomócskákba [T. Nemoto és munkatársai: „Humán Interferons and Intralesional Therapy of Melanoma and Breast Carcinoma, Amer. Assoc. Fór Cancer Research, Abs. nr. 993, 246 (1979)]. Bár az említett klinikai kísérletek eredményei biztatóak, a β-interferon tumorellenes, illetőleg rákellenes alkalmazását súlyosan gátolja a megfelelő mennyiségű tisztított β-interferon hiánya.

Egyes olyan sejtvonalak, amelyek rezisztensek az α-interferon anticelluláris hatásaival szemben, szenzitívek maradnak a β-interferonnal szemben. Ez a jelentős hatáskülönbség arra mutat, hogy a β-interferon eredményesen alkalmazható lehet bizonyos olyan rezisztens tumorsejtekkel szemben, amelyek szelektív nyomás alatt jelennek meg az a-interferon nagy adagjaival kezelt betegekben [T. Kuwata és munkatársai fent idézett munkája; A. A. Creasy és munkatársai: „The Role of G_o—G, Árrést in the Inhibition of Tumor Cell Growth by Interferon, Abstracts, Conference on Regulatory Functions of Interferons, N. Y. Acad. Sci., 17. sz. (1979. október 23—26.)].

Biokémiai szinten az interferonok legalább háromféle fehérje képződését indukálják; ezek a következők: egy fehérje-kináz [B. Lebleu és munkatársai: „Interferon, Double-Stranded RNA and Protein Phosphorylation, Proc. Natl. Acad. sci. USA, 73, 3107—3111 (1976); A. G. Hovanessian és I. M. Kerr, „The (2’—5’) Oligoadenylate (ppp A2’—5A2’—5Ά) Synthetase and protein Kinase(s) írom Interferon-Treated Cells”, Eur. J. Biochem., 93, 515— 526 (1979)], egy (2’—5’) oligo(A)polymerase [A. G. Hovanessian és munkatársai: „Synthesis of Low-Molecular Weight Inhibi6 tor of Protein Synthesis with Enzyme from Interferon-Treated Cells, Natúré, 268, 537— 539 (1977); A. G. Hovanessian és I. M. Kerr, Eur. J. Biochem, 1. fenn] és egy foszfodieszteráz [A. Schmidt és munkatársai; „An Interferon-Induced Phosphodiesterase Degrading (2’—5’)oligoisoadenylate and the C-C-A Terminus of tRNA”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4788—4792 (1979)].

Mind a β-, mind az α-interferonról úgy látszik, hogy hasonló enzimatikus utakat váltanak ki [C. Baglioni: „Interferon-Induced Enzymatic Anctivities and their Role in the Antiviral State, Cell, 17, 255—264 (1979)] és mindketten közös aktív maggal rendelkeznek, minthogy mindkettő felismer egy 21 kromoszómára kódolt sejt-receptort [M. Wiranowska-Stewart: „The Role of Humán Chromosome 21 in Sensitivity to Interferons, J. Gén. Virol., 37, 629—634 (1977)]. Az ilyen enzimek egyikének vagy többjének az interferonnal kezelt sejtekben való megjelenése lehetővé teheti az interferon-szerű aktivitást mutató fehérjék közelebbi jellemzését.

Ezidőszerint a humán β-interferont sejtkultúrákban tenyésztett humán sejtvonalak útján termelik. Ez egy kis hozamú, költséges eljárás. Egy nagyobb termelő évenként mindössze 40—50.IO⁸ egység nyers β-interferont termel [V. G. Edy és munkatársai: „Humán Interferon: Large Scale Production in Embryo Fibroblast Cultures, Humán Interferon (W. R. Stinebring and P. J. Chapple kiadása), Plenum Publishing Corp., 55—60. old. (1978) ]. Szabályozott pórusméretű üveggyöngyökön történő adszorpció útján való tisztítással a nyers sejtkivonatokból 50%-os hozammal tudtak nyerni egy körülbelül 10⁶ egység/mg specifikus aktivitású β-interferont [A. Biíliau és munkatársai: „Humán Fibroblast Interferon fór Clinical Trials: Produkction, Pátriái Purification and Characterization”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49— 55. old. (1979)]. Cink-kelátos affinitás-kromatográfiával további tisztítást tudtak végezni és így egy körülbelül 10⁹ egység/mg specifikus aktivitású terméket kaptak körülbelül 100%-os hozammal [A. Billiau és munkatársai: „Production, Purification and Properties of Humán Fibroblast Interferon”, Abstracts, Conference on Regulatory Functions of Interferons, N. Y. Acad. Sci., 29. sz. (1979. október 23—26.)]. A β-interferon ilyen magas specifikus aktivitása folytán a gyakorlati alkalmazás céljaira csak kis mennyiségekre van szükség. Így például 100 g tiszta β-interferonból 3 millió és 30 millió közötti adag lenne előállítható.

A molekuláris biológia újabb haladása lehetővé tette specifikus nem-bakteriális eukariotikus fehérjék DNS-kódolásának baktériumsejtekbe való bevezetését. Általában a nem kémiai szintézissel előállított DNS esetében az ilyen rekombináns DNS molekulák felépítése a következő lépéseket foglalja magába:

-4193507

A kívánt fehérje tisztított messenger(küldönc-) RNS (mRNS) templátja egyszálú DNS -kópiájának (cDNS) előállítása; a cDNS konvertálása kettősszálú DNS-sé; a DNS kapcsolása valamely alkalmas klónozás-hordozó megfelelő helyéhez, a rekombináns DNS molekula kialakítása céljából; valamely alkalmas gazda átalakítása ezzel a rekombináns DNS molekulával. Ez az átalakítás lehetővé teheti, hogy a gazda azután a kívánt fehérjét termelje. így már többféle nem-bakteriális gént és fehérjét állítottak elő. E. coli baktériumokban a rekombináns DNS-technika segítségével. Ezek sorában példaképpen megemlíthető az α-interferon [S. Nagata és munkatársai; „Synthesis in E. coli of a Polypeptide with Humán Leukocyte Interferon Activity, Natúré, 284, 316—320 (1980)].. Emellett a rekombináns DNS-technikát alkalmazták egy oly plazmid előállítására is, amely a közlések szerint egy a β-interferont kódoló gén-szekvenciát tartalmaz [T. Taniguchi és munkatársai: „Construction and Identification of a Bacterial Plasmid Containing the Humán Fibroblast Interferon Gene Sequence, Proc. Japan Acad. Ser. B, 55, 464— 469 (1979)].

Azonban a fenti munkák egyikében sem írták le a β-interferon tényleges gén-szekvenciáját és egyikben sem hasonlították össze ezt a szekvenciát egy autentikus β-interferon kezdeti aminosav-szekvenciájával vagy aminosav-összetételével. Az előbb idézett munka csak α-interferonra irányult, amely az interferonok I. osztályába (lásd fentebb) tartozó, kémiailag, biológiailag és immunológiailag a β-interferontól különböző termék. Az utóbb idézett munka kizárólag hibridizációs adatokon alapul. Ezek az adatok egymagukban nem teszik lehetővé annak megállapítását, hogy a kiválasztott klón tartalmazza-e a β-interferont kódoló teljes vagy tényleges gén-szekvenciát, vagy hogy a klónozott gén-szekvencia képes lesz-e β-interferont létrehozni baktériumokban. A hibridizáció csak azt állapítja meg, hogy valamely adott DNS-betét bizonyos fokig homológ és komplementer annak a poli(A)RNS-nek valamely mRNS-komponensével, amely oocitákba injektálva interferon-aktivitást vált ki. Emellett az esetleges homológja mértéke függ az adott szűrési (szkrin) eljárásban választott hibridizálási feltételektől. Ezért a poli (A) RNS mRNS-komponensének hibridizálása egymagában nem bizonyítja azt, hogy a választott DNS-szekvencia olyan, hogy kódolja a humán β-interferont vagy valamely a humán β-interferon immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató fehérjét, vagy pedig hogy egy ilyen szekvencia hasznos lehet ilyen polipeptidek megfelelő gazdákban történő előállításának céljaira.

Egy Zürichben 1980. február 25-én tartott szemináriumon Taniguchi kijelentette, hogy neki sikerült meghatározni az ő hibridizáló kiónjainak egyike esetében a nukleotid-szek8 venciát. Megállapította azt is, hogy az említett szekvencia által kódolt első 13 aminosav azonos volt azzal a szekvenciával, amelyet Knight és munkatársai fentebb idézett munkájukban az autentikus humán β-interferonra közöltek. Taniguchi nem közölte a kiónjának teljes nukleotid-szekvenciáját és nem is hasonlította össze annak aminosav-osszetételét az autentikus humán β-interferonra vonatkozólag meghatározott aminosav-összetétellel. Azóta Taniguichi közölte hibridizáló kiónjának teljes nukleotid-szekvenciáját [T. Taniguichi és munkatársai: Gene, 10, 11 — 15 (1980)]. Ez a szekvencia egyetlen nukleotidban különbözik az 1980. április 3-án benyújtott 8 011 306 sz. brit szabadalmi bejelentésben leírt és igényelt szekvenciától (ennek a brit szabadalmi bejelentésnek az elsőbbségét igényeljük jelen bejelentésünkhöz). A Taniguichi által közölt aminosav-szekvencia azonos az előző bejelentésben igényelt és leírt szekvenciával. Taniguichi nem írta le az 1980. június 6-án benyújtott 8 018 701 sz. brit szabadalmi bejelentés (ennek a bejelentésnek az elsőbbségét is igényeljük a jelen bejelentésünkhöz) idején a humán β-interferon immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptideknek valamely alkalmas hordozóban való expresszióját. A jelen találmányt éppen ez jellemzi, nevezetesen a humán β-interferon immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptid (ek) valamely gazdában való expressziója, valamint az erre vonatkozó módszerek és az ebben szereplő polipeptidek, gének és rekombináns DNS molekulák.

A jelen találmánynak nem célja, hogy tiszta vagy lényegileg tiszta «-interferon mRNSjét állítsa elő, mielőtt megkísérli az interferon-génnek a klónozását vagy fibroblaszt interferon-szerű polipeptideknek valamely gazda-baktériumban való előállítását, amint ezt a Research Disclosure No, 18309, 361—362 (1979) javasolja.

Végéül fel kell ismerni, hogy valamely a poli(A) RNS-bőI valamely, az oocitákban humán interferon-aktivitást termelő mRNS-t hibridizáló DNS-szekvenciának a kiválasztása vagy ilyen rekombináns DNS molekulának a felépítése még nem elegendő annak kimutatására, hogy az illető DNS-szekvencia vagy a rekombináns DNS molekula hibrid beillesztése megfelel a humán interferonnak. így, az adott DNS-szekvenciát kódoló aminosav-szekvenciának az autentikus fehérje aminosav-szekvenciájával való összehasonlítása nélkül csak egy a humán interferon immunológiai és biológiai aktivitását mutató polipeptidnek a termelése bizonyíthatja be ténylegesen azt, hogy a választott DNS-szekvencia, illetőleg a felépített rekombináns DNS molekula valóban megfelel a humán interferonnak. Még fontosabb utalni arra, hogy csak a választott DNS-szekvenciának, illetőleg felépített rekombináns DNS molekulának vagy ezzel rokon szekvenciáknak

-5193507 a humán interferonéval azonos aktivitása adhat alapot annak feltételezésére, hogy ezeket a szekvenciákat, illetőleg molekulákat eredményesen lehet felhasználni arra, hogy a jelen találmány szerinti módon további, a humán interferonnak megfelelő szekvenciákat választhassunk ki, vagy olyan rekombináns DNS molekulákat állíthassunk elő, amelyek a humán β-interferon immunológiai vagy biológiai aktivitásával rendelkező termékek expresszióját teszik lehetővé.

A fentiek alapján tehát megállapítható hogy humán β-interferonnak a rekombináns DNS-technikával történő előállítása egészen más problémát képez, mint amilyennel a fentebb leírt eljárások foglalkoztak. Itt ugyanis arról van szó, hogy egy olyan, ismeretlen szerkezetű DNS-szekvenciát keli találni, amely megfelelő gazdában a humán β-interferon expresszióját kódolja és ezt DNS szekvenciák igen bonyolult elegyéből kell kiválasztani abból a célból, hogy a kiválasztott szekvencia alkalmazható legyen humán β-interferon termelésére. Emellett az említett szekvencia megtalálásának és elkülönítésének a problémáját még súlyosbítja az a körülmény, hogy a kívánt DNS szekvencia csak rendkívül kis koncentrációban lehet jelen az említett bonyolult elegyben és nem áll rendelkezésre hatásos módszer az elegyben jelenlevő nagyszámú DNS-szekvencia gyors elemzésére abból a célból, hogy kiválaszthassuk és elkülöníthessük a kívánt szekvenciát.

A jelen találmány megoldja ezeket a fentebb említett problémákat a humán β-interferonnak valamely alkalmas gazdában történő expresszióját kódoló DNS-szekvencia megtalálása és elkülönítése tekintetében és ezáltal lehetővé teszi olyan DNS-szekvenciák, illetőleg olyan rekombináns DNS molekula előállítását, amelynek segítségével valamely gazdát arra lehet késztetni, hogy a humán fibroblaszt interferon immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptidet termeljen.

A jelen találmány segítségével tehát lehetővé válik a humán β-interferon immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptidek termelése és ezeknek vírusellenes, tumorellenes, illetőleg rákellenes szerekként való felhasználása. A találmány ezeknek a polipeptideknek eddig nem lehetséges menynyiségekben való előállítását teszi lehetővé és eddig nem ismert módszereket nyújt erre a célra.

Amint ez az alábbi leírásokból ki fog tűnni, a találmány szerinti DNS-szekvenciák és rekombináns DNS molekulák képesek a humán β-interferon immunológiai és biológiai aktivitását mutató polipeptidek valamely alkalmas gazdában történő termelésének az irányítására. Az ilyen DNS-szekvenciáknak és rekombináns DNS molekuláknak valamely alkalmas gazdában történő replikációja lehetővé teszi az ilyen polipeptideket kódoló gé6 nek nagy mennyiségekben történő előállítását is. Az ilyen polipeptidek és gének molekufaszerkezete és tulajdonságai könnyen meghatározhatók. Ezek a polipeptidek és gének vagy közvetlenül abban az állapotban, amint a gazda-szervezetben termelődtek, vagy pedig megfelelő származék-képzés vagy módosítás után felhasználhatók egyrészt maguknak e termékeknek a tökéletesített termelésre, valamint felhasználhatók vírusellenes, tumorellenes, illetőleg rákellenes szerekként vagy vírusellenes, tumorellenes és rákellenes gyógyászati módszereknek és az immun-modulációnak az eszközeiként.

A találmány szerinti eljárás abban különbözik a fentiekben ismertetett korábbi eljárásoktól, hogy a találmány szerinti eljárás a korábbi eljárásokkal ellentétben magában foglalja olyan DNS-szekvenciák és rekombináns DNS molekulák előállítását és kiválasztását, amelyek legalább egyfajta, a humán β-interferon immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptid termelését kódolják.

A fentiekből tehát kitűnik, hogy a találmány alapvető célkitűzése az, hogy olyan DNS-szekvencia előállítását tegye lehetővé, amelyet az jellemez, hogy a humán β-interferon immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptidek termelését kódolja; ez a szekvencia az alább felsorolt DNS-betétek valamelyike lehet:

G-pHFIF-1,

G-pHFIF-3,

G-pHFIF-6,

G-pHFIF-7,

G-pPla-HFIF-67-12,

G-pPla-HFIF-67-12A19,

G-pPla-HFIF-67-8,

G-pPla-HFIF-67-12A279T,

G-pPla-HFIF-67-12A218Ml,

G-pPla-HFIF-67-12AMl,

G-pPla-HFIF-67-12A19BX-2, valamint olyan DNS-szekvenciák, amelyek hibridizálnak a fenti DNS-betétek valamelyikére, valamint oly DNS-szekvenciák, amelyek oly kodon-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek valamely hasonló immunológiai vagy biológiai aktivitást mutató polipeptidet kódolnak expresszió útján. A találmány szerinti szekvenciákat az jellemzi, hogy lehetővé teszik humán β-interferonnak és humán β-interferonhoz hasonló polipeptideknek gazda-szervezetekben való termelését.

A találmány közelebbi szemléltetésére szolgálnak a csatolt rajzok is, amelyeket az alábbiakban ismertetünk:

Az 1. ábra vázlatosan szemlélteti a találmány szerinti eljárás egyik megvalósítási módját oly rekombináns DNS molekulák keverékének az előállítására, amelyek némelyikében a találmány szerinti polipeptideket kódoló DNS-szekvenciák foglalnak helyet.

A 2. ábra vázlatosan szemlélteti a jelen találmány szerinti szűrési eljárást a kezdeti klón kiválasztására.

-6193507

A 3. ábra a klón-szűrési eljárás egyik kiviteli módját szemlélteti, amelyben a találmány szerint előállított DNS szekvencia kerül alkalmazásra.

A 4. ábra a humán β-interferon DNS kódoló szálának összetett nukleotid-szekvenciáját szemlélteti. Ez a szekvencia a betét kezdetétől van számozva, a betét lefordítatlan szakasza felé. A 65—127 számozású nukleotidok egy szignál-szekvenciát képviselnek, a 128—625 számozású nukleotidok pedig az „érett” fibrobiaszt interferont képviselik. A' szignál-polipeptid amínosav-szekvenciáját a megfelelő nukleotid-szekvencia felett ábrázoltuk; a szignál-polipeptid aminosavait —21től -1-ig, az érett interferon aminosavait pedig 1-től 166-ig· számoztuk. Az 1980. április 3-án bejelentett 80.11306 sz. nagy-britanniai szabadalmi bejelentéssel kapcsolatban letétbe helyezett kultúrákban jelenlevő humán β-interferon DNS resztrikciós és fragment-analízis adatainak felülvizsgálata arra az eredményre vezetett, hogy az említett nagy-britanniai szabadalmi bejelentés 4. ábráján ábrázolt szekvenciához képest két nukleotidot a jelen bejelentés 4. ábráján feltüntetett módon megváltoztattunk. Ezek a változások a humán β-interferon DNS javasolt szignál-szekvenciáját megelőző lefordítatlan szekvenciában szerepelnek. Az említett változások nincsenek hatással a humán β-interferon DNS szekvenciájára, sem transzlációs termékének aminosav-szekvenciájára és nem változtatják meg e szekvenciának felhasználását hibridizációs szondaként a humán β-interferonnal rokon DNS-betétekhez alkalmazandó klónos szűrővizsgálatára.

Az 5. ábrán néhány e találmány szerinti plazmid orientációs és resztrikciós térképét mutatja.

A 6. ábr-án összehasonlítjuk a találmány szerinti humán fibrobiaszt interferonnak az aminosav-összetételét egy autentikus fibroblaszt interferonéval.

A 7. ábra a találmány szerinti humán β-interferon gén resztrikciós térképét, valamint a pHFIF3, pHFIF6 és pHFIF7 szekvenciák képzése során alkalmazott szekvencia-képzési stratégiát szemlélteti.

A 8. ábra a találmány szerinti pPLa -HFIF-67-1 rekombináns DNS-molekula szerkezetének vázlatos képe.

A 9. ábra a találmány szerinti pPLa-HFIF-67Ί2 és pPLa-HFIF-67-12A19 rekombináns DNS-molekula szerkezeti felépítésének vázlatos képe.

A 10. ábra a találmány szerinti pPLc-HFlF-67-8 rekombináns DNS-molekula szerkezeti felépítésének vázlatos képe.

A 1 í. ábra a találmány szerinti pPLa-HFIF -67-12 rekombináns DNS-molekula orientációjának és részleges resztrikciójának térképe.

A 12. ábra a találmány szerinti pPLa-HFlF-67-12Δ19 rekombináns DNS-molekula orientációs és részleges resztrikciós térképének vázlata.

A 13. ábra a találmány szerinti pPLc-HFIF-67-8 rekombináns DNS-molekula orientációs és részleges resztrikciós térképének vázlata.

A találmány kivitelezésének legjobb módja:

Annak érdekében, hogy az itt leírt találmány jobban megérthető legyen, azt az alábbi leírásban részletesen ismertetjük.

A leírásban alkalmazott fogalmak közelebbi magyarázata:

Nukleotid: A DNS vagy RNS monomer egysége, amely egy cukor- (pentóz-) részből, egy foszfát-részből és egy nitrogéntartalmú heterociklusos bázisból áll. A bázis a glikozid-szénatomon (a pentóz l’-szénatomján) keresztül kapcsolódik a cukor-részhez; a bázis és a cukor ilyen kombinációját nukleozidnak nevezik. A bázis jellemző a nukleotidra. A DNS-ben négyféle bázis szerepel: adenin („A”), guanin („G”), citozin („C”) és timin („T”). Az RNS négyféle bázisa: adenin („A), guanin („G”), citozin („C”) és uracil („U).

DNS-szekvencia: Nukleotidok lineáris elrendezésű csoportja, amelyben a nukleotidok a szomszédos pentózok 3’-, illetőleg 5’-szénatomjaí közötti foszfodiészter-kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz.

Kodon: Három nukleoíidból álló DNS-szekvencia (triplett), amely mRNS útján egy aminosavat, egy transzlációs indító szignált vagy egy transzlációs terminális szignált kódol. így például a TTA, TTG, CTT, CTC, CTA és CTG nukleotid-triplettek a leucin („Leu”) aminosavat kódolják; a TAG, TAA és TGA a transzlációs stop-szignálokat, az ATG pedig a transzlációs indító szignált.

Leolvasó-fázis: A kodonok csoportosítása az mRNS aminosav-szekvenciákba történő transzlációja során. így például a GCTGGTTGTAAG DNS-szekvencia három leolvasó-fázisban exprimálható, ezek mindegyike más-más aminosav-szekveneiát hoz létre:

GCT GGT TGT AAG — Ala-Glv-Cys-Lys

G CTG GTT GTA AG — Leu-Val-Val

GC TGG TTG TAA G — Trp-Leu-(STOP)

Polipeptid: Aminosavak lineáris elrendezésű csoportja, amelyben a szomszédos aminosavak az α-aminocsoport, illetőleg a karboxilcsoport közötti peptid-kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz.

Genom: Valamely sejt vagy vírus teljes DNS-je. Ez többek között a genom polipeptidjeít kódoló strukturális géneket, valamint operátort, promotort és riboszóma-kötő és kölcsönhatási (interaction) szekvenciákat, mint például Shine-Dalgarno-szekvenciákat foglal magába.

Strukturális (szerkezeti) gén: Egy DNS-szekvencia, amely a saját templátján vagy messenger (küldönc) RNS-jén keresztül egy valamely specifikus polipeptidre jellemző aminosav-szekvenciát kódol.

Transzkripció (átírás): mRNS képzése egy strukturális génből.

-7193507

Transzláció (lefordítás): Polipeptid képzése mRNS-ből.

Expresszió: Az a folyamat, amelyen egy strukturális gén keresztülmegy, míg polipeptiddé alakul; ez tehát a transzkripció és a transzláció kombinációja.

Plazmid: Egy nem-kromoszóma-jellegü kettősszálú DNS-szekvencia, amely egy ép (intakt) „replikon”-t foglal magába, úgy, hogy a plazmid egy gazdasejtben replikálódik. Ha a plazmidot egy egysejtű szervezetbe helyezik, e szervezet jellemzői megváltozhatnak vagy átalakulhatnak a plazmid DNSjének eredményeképpen. Így például egy a tetraciklin-rezisztencia génjét (Tet^R) hordozó plazmid az eredetileg tetraciklin-érzékeny sejtet tetraciklin-rezisztens sejtté alakítja át. A valamely plazmid által átalakított sejtet „transzformáns-nak nevezik.

Fág vagy bakteriofág: Bakteriális vírus; számos ilyen fág egy fehérje-burokba kapszulázott DNS-szekvenciából áll („kapszid”)

Klónozás-hordozó: Egy plazmid, fág-DNS vagy más DNS-szekvencia, amely egy gazdasejtben replikálódni képes és amelyet egy vagy néhány endonukleáz felismerési hely jellemez, amelynél az ilyen DNS-szekvenciák meghatározható módon felvághatok anélkül, hogy ezzel elveszítenék a DNS valamely lényeges biológiai funkcióját, például a replikációt, bevonat-fehérjék képzését, vagy pedig promotort vagy kötő-helyeket veszítenének, és amelyek egy a transzformált sejtek azonosítására alkalmas jelzőt (marker) tartalmaznak, mint amilyen a tetraciklin-rezisztencia vagy az ampicillin-rezisztencia. A klónozás-hordozót gyakran vektornak is nevezik.

Klónozás: Organizmus-populációk vagy DNS-szekvenciák nyerése egyetlen ilyen organizmusból vagy szekvenciából ivartalan (aszekszuális) szaporítás útján.

Rekombináns DNS-molekula vagy hibrid DNS: Különböző genomokból származó DNS-szegmensekből álló molekula, amelyben ezek a szegmensek élő sejteken kívül kapcsolódtak egymáshoz végeikkel és amely képes megfertőzni egy gazdasejtet és fennmaradni abban.

Expresszió-szabályozó szekvencia: Nukleotidok oly szekvenciája, amely ellenőrzi és szabályozza a strukturális gének expresszióját, ha operatív módon kapcsolódik ezekhez a génekhez. Az expresszió-szabályozó szekvenciák sorába a lac-rendszer. a λ-fág nagyobb operátor- és promotor-tartományai, az fd burok-fehérje szabályozó tartománya és más olyan szekvenciák tartoznak, amelyekről ismeretes, hogy szabályozzák a prokariotikus vagy eukariotikus sejtek és vírusaik génjeinek expresszióját.

Az 1. ábrára utalva megjegyezzük, hogy ezen az ábrán vázlatosan szemléltetjük a találmány szerinti eljárás egy kiviteli módját, olyan rekombináns DNS-molekulák etegyének az előállítására, amelyek némelyike a je3 len találmányt jellemző beiktatott DNS-szekvenciákat tartalmaz.

Humán fibroblaszt-interferon messenger

RNS-t (IFN-β mRNS) tartalmazó poli(A)RNS előállítása A találmány szerinti eljárásban alkalmazott RNS-t humán VGS-sejtekből vontuk ki; ez egy olyan diploid humán fibroblaszt sejtvonal, amely egyréteg-kultúrákban, 37°C hőmérsékleten szaporítható (A. Billian és munkatársai, J. Gén. Virol. 19, 1—8 /1973/). A humán β-interferon ezekben a sejtekben poli (I,C)-vel történő indukció hatására, cikloheximid jelenlétében termelhető.

Tipikus RNS-izolálás céljára 20 görgő-palackban konfluens egysejt-réteg alakjában elhelyezett diploid VGS-sejteket alkalmaztunk; a palackok mindegyikét éjszakán át 100 egység/ml β-interferon „primeltük és valamennyi kultúrát 1 órán át indukáltuk 100 pg/ml poli (I,C)-vei és 50 pg/ml cikloheximiddel, majd 4 óra hosszat inkubáltuk őket 50 pg/ml cikloheximiddel; a kapott kultúrát foszfát-pufferes sóoldatba kapartuk és lefontuk. A sejteket 0°C hőmérsékleten 15 percig lizáltuk a DNS-t tartalmazó intakt magok eltávolítása és a citoplazmás RNS izolálása végett; a lizálás oly módon történt, hogy a sejteket 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH=7,4), 10 mmól/1 nátrium-kloridot és 1,5 mmól/1 magnézium-kloridot tartalmazó hipotóniás pufferoldatban szuszpendáltuk és NP40-et (kereskedelemben hozzáférhető, a DNS- és RNS-technikában ismert oldószer [C. Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982]) adtunk hozzá 1% koncentrációig. A sejtmagokat egy Sorvall SS-34 rotorban 3000 percenkénti fordulattal 5 percig történő centrifugálással pelletizáltuk és ily módon távolítotfuk el őket. A szupernatánshoz nátrium-dodecil-szulfátot és etilén-diamin-tetraecetsavat adtunk 1 %, illetőleg 10 mmól/1 koncentrációig, majd az elegyet ötször extraháltuk frissen desztillált fenol és 25:1 arányú kloroform-izoaminalkohol-elegy 1:1 arányú elegyének kétszeres térfogatával; az RNSt tartalmazó vizes fázisokat mindegyik extrakció után egy Sorvall SS-34 rotorban percenként 8000 fordulattal történő centrifugálással különítettük el. Az RNS-t az elkülönített vizes fázisból 1/10 térfogat 2 mólos nátrium-acetát-oldat (pH=5,1) és 2,5 térfogat etanol hozzáadása útján választottuk le. Egy-egy görgő-palackból rendszerint összesen 60—90pg citoplazmás RNS-t kaptunk.

Alkalmaztunk más módszereket is a citoplazmás RNS extrahálására, fgy például a sejteket 0,2 molos trisz-HCl (pH—9,0), 50 mmol/1 nátrium-klorid, 20 mmol/1 etilén-diamin-tetraecetsav és 0,5 % nátrium-dodecil-szulfát elegyében történő homogenizálás után teljesen lizáltuk, majd fenol-kloroform eleggyel a fent leírt módon extraháltuk őket [F. H. Reynolds és munkatársai: „Interferon Activity Produced by Translation of Humán

-819350

Interferon Messenger RNA in Ceil-Free Ribosomal Systems and in Xenopus Oocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 4881—4887 (1975) ] vagy pedig a mosott sejteket 0,1 mol/l nátrium-kloridot, 0,01 mol/l trisz-HCl-t (pH= =7,5) és 0,001 mol/l etilidén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó elegy („NTE pufferoldat) 400 μΐ-jében szuszpendáltuk, 2,5 ml 4 molos guanidínium-izotiocianát-oldatot és 1 mol/l β-merkapto-etanol 20 mmolos nátriumacetát-oldattal készített oldatát adtuk hozzá és a sejteket homogenizáltuk. A lizátumot egy Beckman SW-60 Ti nitrocellulóz-csó'ben

I, 3 ml 5,7 molos cézium-oldat fölé rétegeztük és 17 óra hosszat centrifugáltuk percenként 39 000 fordulattal az RNS pelletezése és a DNS-től, a fehérjéktől és a lipoidoktól való elkülönítése céljából, majd fenol-kloroform eleggyel egyszer extraháltuk az RNS-t [vö.:

J. Morser és munkatársai: „Characterization of Interferon Messenger RNA írom Humán Lymphoblastoid Cells, J. Gén. Virol., 44, 231—234 (1979)].

A kapott teljes RNS-t vizsgáltuk IFN-pmRNS jelenlétére; a vizsgálat oly módon történt, hogy a vizsgálandó anyagot Xenopus laevis oociták citoplazmájába injektáltuk és meghatároztuk az abban indukált IFN-p-aktivitást (vö.: Reynold és munkatársai fentebb idézett munkája). Az RNS-t e vizsgálat során vízben oldottuk és mindegyik oocitába körülbelül 50 ni oldatot injektáltunk. Az oocitákat éjjelen át szobahőmérsékleten Barth-féle közegben [vö.: J. Gurdon: J. Embryol. Exper. Morphol., 20, 401—414 (1968)] inkubáltuk, a közeg egy részében homogenizáltuk őket, a sejt-törmeléket centrifugálással eltávolítottuk, majd a szupernatánsban meghatároztuk az IFN-p-aktivitást. Az IFN-β-aktivitás kimutatása a vírusok által indukált citopátiás hatás csökkentése alapján történt [W. E. Stewart és S. E. Sulkon: „Interferon Production in Hampsters Experimentally Infected with Rabies Vírus'', Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 123, 650—653 (1966)]. Kihívó vírusként vezikuláris sztomatitisz-virust (Indiana törzs) alkalmaztunk, a sejtek pedig 21-kromoszómára triszómás humán diploid fibroblaszt sejtek voltak, nagyobb IFN-6-érzékenység biztosítása céljából. Az IFN^-aktivitást a 69/19 IFN referencia-standardhoz viszonyítva adtuk meg.

Az ΙΕΝ-β-mRNS-t tartalmazó poli(A)RNSt a citoplazmás -RNS-ből különítettük el oligo (dT)-cellulózon (típus: 7, a P-L Biochemicals cég terméke) 0,4 mol/l nátrium-kloridot, 10 mmol/1 trisz-HCl-t (pH=7,8), 10 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat és 0,2% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó oldatban szobahőmérsékleten történő adszorpció útján. Rendszerint az összes RNS 4—5%át kaptuk ily módon, a 260 nm-nél mért optikai sűrűség alapján meghatározva.

A terméknek a további tisztítását, a poli(A)RNS-nek az IFN-p-mRNS-ben való dú16 sítása céljából formamid-szacharóz grádiensekkel végeztük [vö.: T. Pawson és munkatársai: „The Size of Rous Sarcoma Vírus mRNAs Active in Cell-Free Translation”, Natúré, 268, 416—420 (1977)]. Ilyen gradiensekkel sokkal nagyobb feloldást értünk el, mint a nem-denaturáló szacharóz-grádiensekkel. Rendszerint körülbelül 80 pg poli(A)RNS-t 50%-os formamid, 100 mmol/1 lítium-klorid, 5 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav, 0,2% nátrium-dodecil-szulfát és 10 mmol/1 trisz-HCl (pH=7,4) oldatában oldottunk, az oldatot 37°C hőmérsékletre melegítettük és 2 percig ezen a hőmérsékleten tartottuk, az aggregáció megelőzése céljából, majd egy Beckman SW-60 Ti poliallomer-csőben egy 5—20%-os szacharóz-gradiensre vittük. Ezután 20°C hőmérsékleten, 60 000 percenkénti fordulattal 4,5 óra hosszat centrifugáltuk a Beckman SW-60 Ti rotorban, teljes 3⁴C-vel jelzett eukariotikus RNS-t alkalmazva méret-jelzőként, majd a grádienst frakcionáltuk és meghatároztuk az egyes frakciók optikai sűrűségét. Az összes RNS-tartalmú frakciókból a terméket 0,5 mól nátrium-kloriddal és 2,5 tf. etanollal kétszer lecsaptuk és meghatóroztuk a fentebb leírt módon az interferon-mRNS aktivitást. Ezzel a tisztítási eljárással körülbelül 40-szeresre lehetett dúsítani a poli(A) RNS-ben az IFN-3-mRNS-tartalmat.

Bár úgy látszott, hogy a VGS-sejtekből kapott RNS csak egy, a β-interferonnal rokon mRNS-frakciót tartalmazott, más sejtvonalakból kapott RNS-ek legalább még egy vagy talán több a β-interferonnal rokon mRNS-frakciókat látszanak tartalmazni. Ez az utóbbi mRNS nem hibridizál az előbbi mRNS-re, de kódol egy olyan fehérjére, amely IFN-β-aktivitást mutat és amelyet az autentikus IFN-β antiszéruma inaktivál. Az ilyen mRNS és más ezzel rokon mRNS-ek hibridizáció útján történő klónozása és expressziója szintén a jelen találmány részét képezi, minthogy az alább leírt eljárások erre is alkalmazhatók.

Alternative, az oligo(dT)-hez adszobeált mRNS-t (60 pg) elektroforézis útján frakcionáltuk egy 4%-os poliakrilamid-gélben, amely 7 mol/l karbamidot, 0,1% nátrium-dodecilszulfátot, 50 mmol/1 trisz-borátot (pH=8,3) és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat is tartalmazott; úgy jártunk el, hogy az mRNS-t feloldottuk ebben a pufferoldatban, majd 1 percig melegítettük 55°C hőmérsékleten és ezután adtuk hozzá a gélhez. Az elektroforézis befejeztével 2 mm széles szeleteket vágtunk a gélből, az RNS-t mindegyik homogenizált gél-szeletből eluáltuk, majd oligo(dT)-cellulózon történő adszorpció útján tisztítottuk tovább a szennyezések eltávolítása céljából, végül a fentebb leírt módon meghatároztuk a kapott termékben az IFN-β mRNS-tartalmat.

Ezen a ponton meg kell jegyezni, hogy még a formamid-szacharóz-grádiensekből és a 9

-9193507 poliakrilamid-géles frakcionálásból kapott poli (A) RNS termék is igen nagy számban tartalmaz különböző mRNS-eket. Az IFN-β-re specifikus mRNS kivételével a többi jelenlevő mRNS-ek itt nem kívánatos szennyezésekként szerepelnek (1. ábra). Sajnos ezek a szennyező RNS-ek a találmány szerinti klónozás! eljárás egész további folyamán a HuIFN-β mRNS-hez hasonló módon viselkenek. Ezért ezeknek a poli (A) RNS-ben való jelenléte végülis arra vezet, hogy nagy számban kapunk nem kívánt bakteriális kiónokat, amelyek az IFN-β-ίδΙ különböző polipeptidekre kódoló géneket tartalmaznak. Ez a szenynyezés bonyolult szűrési problémákat képez a kívánt IFN-β hibrid kiónok izolálása szempontjából. Az IFN-β esetében ez a szűrési probléma még súlyosabbá válik azltal, hogy nem áll rendelkezésre olyan kielégítően tisztított minta a HuIFN-β mRNS-ből vagy DNS-ből vagy ezek legalább egy részéből, amelyet szűrési mintának lehetne alkalmazni a kívánt kiónok azonosítása során. Ezért az IFN-β kiónok kiszűrés! eljárása igen időrabló és nehéz művelet. Emellett, minthogy az IFN-klónok csupán igen kis százalékától várható el, hogy az IFN-β-ί biológiailag vagy immunológiailag aktív alakban exprimálják, az ilyen aktív klón izolálást művelete egy „tűt a szénakazalban kereső kiszűrési eljárásnak tekinthető.

Előnyösen a rekombináns DNS-technikát alkalmazhatjuk arra a célra, hogy a HuIFN-β mRNS vagy cDNS tisztított mintáját, vagy ezek valamely részének tisztított mintáját előállítsuk. Az így kapott tisztított mRNS vagy cDNS segítségével azután gyorsan szűrhetünk ki igen nagy számú bakteriális kiónt és ezzel jelentékenyen megnövelhetjük annak a valószínűségét, hogy olyan kiónt szűrünk ki, amely az IFN-β-ί aktív alakban exprimálja. IFN-β cDNS-t tartalmazó kettősszálú cDNS szintézise

IFN-β mRNS-ben feldúsított poli (A) RNSt használtunk templátként komplementer DNS („cDNS”) előállítására, lényegileg olyan módszerrel, amilyent R. Devos és munkatársai: „Construction and Characterization of a Plasmid Containing a Nearly Full-Size DNA Copy of Bacteriophage MS2 RNY, J. Mól. Bioi., 128, 595-619 (1979) közleményünkben egy MS2 RNS bakteriofág DNS-kópiát tartalmazó plazmid felépítésére leírtak.

Egyszálas cDNS-t poIi(A) RNS-ből állítottunk elő, RNS-függő DNS-polimeráz (25 egység) segítségével; (ez utóbbit madár-mieloblasztózis-vírus („AMV”) reverz transzkriptázból [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 213—214] nyertük) a reakciót az RNS poli (A)-végrészéhez hibridizált (dT)_I0 primerrel (6 pg, a Miles cég gyártmánya) iniciáltuk, 50 μΐ 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH= =8,3), 10 mmol magnézium-kloridot, mmol/1 β-merkapto-etanolt, 4 mmol/1 nátrium-pirofoszfátot (Na₂P₂O₇) és 2,5 pg/pl 10 inaktivált bovin szérum-albumint tartalmazó oldatban, 0,5—0,5 mmol/l dTTP, dATP, dCTP és dGTP, valamint a-^3zP-dATP (20 pCi, az Amersham cég terméke) hozzáadásával. Az elegyet 30 percig 41°C hőmérsékleten tartottuk, majd 10 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav hozzáadásával a reakciót megszakítottuk, a reakcióelegyet ugyanolyan térfogatú 25:24:1 arányú fenol-kloroform-izoamilalkohol eleggyel extraháltuk, a vizes fázist egy Sephadex G50 oszlopra vittük, majd TE-pufferoldattal (10 mmol/1 trisz-HCI — pH= =7,5 — és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav oldata) eluáltuk. A rádióaktivitást mutató üres frakciókat 10 pg E. coli transzfer RNS, 0,2 mol/l kálium-acetát (pH=5,l) és 2,5 tf. etanol hozzáadásával lecsaptuk.

A fenti módon szintetizált cDNS-populáció a valóságban különböző cDNS-ek komplex elegye; ezek a dúsított poli (A) mRNSben jelenlevő különböző mRNS-ekből származnak (vö.: 1. ábra). Emellett, az AMV reverz transzkriptáz általi idő előtti lezárás következtében számos így kapott cDNS a poli (A) RNS-ben jelenlevő különböző mRNS-ek inkomplett kópiája (ez az 1. ábrán nincs szemléltetve).

Mielőtt a kapott cDNS-t kettősszálúvá tesszük, el kell távolítani a komplementer templát-RNS-hez való asszociálódásból; ez oly módon történik, hogy a cDNS-t etanollal lecsapjuk, majd TE-pufferoldatban [10 mmol/1 trisz-HCL (pH=7,5), 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav] Ti-ribonukleázzal (10 egység, a Sankyo Co. Ltd. cég gyártmánya) és pankreász-A-ribonukleázzal (10 pg, a Sigma cég gyártmánya) 10 pl térfogatban 37°C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk; az alkalmazott ribonukleázok egyszálas specifikus endo- és exo-dezoxiribonukleázoktól mentes termékek. Azzal, hogy a templát-szálat alkáli helyett ribonukleázzal távolítjuk el, elkerülhető az alkáli által katalizált dezaminális folytán esetleg fellépő cDNS-mutáció.

A cDNS-szál DNS-polimeráz-I segítségével tehető kettősszálúvá [A. Efstratiadis és munkatársai: „Enzymatic in Vitra Synthesis of Globin Genes, Cell, 7, 279—288 (1976) ]. A fenti módon kapott 10 pl ribonukleáz/cDNS-elegyet 20 pl térfogatra hígítottuk 10 millimol/1 magnézium-kloridot, 10 mmol/1 DTT-t, 100 mmol/1 kálium-foszfátot (pH=6,9),0,3— 0,3 mmol/1 dATP-t, dCTP-t, dTTP-t és dGTP-t valamint 20 pCi ³²P-dATP-t és 40 egység DNS-polimerázt (a Biolabs cég gyártmánya) tartalmazó oldattal. Az elegyet 6 óra hosszat 15°C hőmérsékleten-tartottuk, majd 10 mmol/1 koncentrációig etiléndiamin-tetraecetsavat és 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot adtunk hozzá, majd a képződött kettősszálú cDNS-t fenol, kloroform és izoamilalkohol elegyével történő extrakció, Sephadex G50 oszlopon való kromatografálás és az üres frakciók lecsapása útján, a fentebb leírt módon elkülönítettük.

-10193507

Abból a célból, hogy a kettősszálú cDNS-struktúrán megmaradó egyszálú hajtű-hurkot felnyissuk, a lecsapott cDNS-t feloldottuk 100 pl 0,2 mol/1 nátrium-kloridot 50 mmol/1 nátrium-acetátot (pH=4,5), 10 mmol/1 cink-acetátot és 2 pg hővel denaturált borjú-thymus DNS-t tartalmazó oldatban, majd 5 egység SÍ-nukleázzal (a Sigma cég gyártmánya) 30 percig reagáltattuk 37°C hőmérsékleten. A reakcióelegyhez 10 mmol/1 koncentrációig etiléndiamint-tetraecetsavat adtunk, fenol, kloroform és izoamilalkohol elegyével extraháltuk, majd a vizes fázisból a terméket 10 pg E. coli transzfer RNS (hordozó), 0,2 mol/l nátrium-acetát (pH=5,l) és 2,5 tf. etanol hozzáadásával lecsaptuk; ily módon letompított végű kettősszálú cDNS-elegyet kaptunk. Ez az elegy heterogén, ami egyrészt az előállításához templátként alkalmazott poli (A) RNS heterogén voltának (vő.:

1. ábra), másrészt a cDNS transzkriptumoknak az AMV reverz transzkriptáz általi idő előtti lezárásának (ezt az 1. ábra nem mutatja) tulajdonítható.

Abból a célból, hogy ennek az utóbbi heterogeneitásnak a hatását csökkentsük, a kettősszálú cDNS-t elektroforézisnek vetettük alá 4%-os poliakrilamid-gélen, 0,5 mmol/1 trisz-borát puffért (pH=4,3) és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldatban; méret-jelzőként 5’-³²P-jelzett resztrikciós fragmenseket (0X174 (RF)-DNS) alkalmaztunk. A megfelelő méretű DNS-sávokat (például a 800—900 bp, 700—800 bp, 650—700 bp és 550—650 bp méret-osztályokat) szelektáltuk. Minthogy a poliakrilamid-gélen elektroforizált poli (A) RNS-ből előállított kettősszálú cDNS egy kitűnő sávot mutatott 850 bp körül, ezt a sávot tekintettük a teljes hosszúságú DNS képviselőjének. A sávokat oly módon eluáltuk, hogy a gélt 0,5 mólos ammónium-acetát oldatban 0,1 % nátrium-dodecil-szulfát hozzáadásával szétdörzsöltük és az elegyet éjjelen át kevertük. A törmelékeket centrifugálással eltávolítottuk, majd a DNS-t egy 5 mmol-os nátrium-szulfáttal (pH=7,5) készített Sephadex G50 oszlopra vitt hidroxil-apatit-porra adszorbeáltattuk, a pufferoldattal az oszlopot alaposan mossuk, majd 0,45 mólos nátrium foszfát-oldattal (pH=7,5) eluáltuk és közvetlenül sótlanítottuk a Sephadex G50 mátrix szűrő hatása révén. Az eluált DNS-t tartalmazó frakciókat (amelyeket a ³²P-rádióaktivitás alapján azonosítottunk) 10 pg E. coli transzfer RNS, nátrium-acetát (0,2 mol/l koncentrációig) és 2,5 tf. etanol hozzáadásával lecsaptuk.

A fent leírt cDNS-előállítási eljárás hatásosságát példaképpen egy olyan tipikus kísérlet mutatja, amelynek során körülbelül 2 pg poli(A) RNS-ből, formamid-szacharóz grádiens alkalmazása után, körülbelül 16 ng kettősszálú cDNS-t kaptunk; e termék mérettartománya 800 bp és 900 bp között volt.

Itt is meg kell jegyezni, hogy ez az így kapott kettősszálú cDNS nagyszámú cDNS ele20 gye, amelyek közül csak igen kevés az IFN-β cDNS (vö.: 1. ábra).

Kettősszálú DNS klónozása

A találmány szerinti eljárással előállított kettősszálú cDNS klónozására számos különféle gazdasejt/klónozás-hordozó kombináció alkalmazható.

Minden egyes specifikus klónozás-hordozón belül különféle helyek választhatók ki a kettősszáiú DNS beiktatására. Ezeket a helyeket rendszerint az a resztrikciós endonukleáz jelzi, amelyet a vágásra alkalmazunk, így például a pBR322-ben a PstI hely a β-laktamáz génjében található, e fehérje 181. és 182 aminosavát kódoló nukleotid triplettek között. Ezt a helyet eredetileg S. Nagata és munkatársai (lásd a fentebb idézett munkájukat) alkalmazták az IFN-β immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptidek szintézise során. A két Hindii endonukleáz rekogniciós hely egyike a 101. és 102. aminosavat kódoló triplettek között van, a néhány Tag hely egyike a pBR322-ben a β-laktamáz 45 aminosavát kódoló triplettnél található. Hasonló módon e plazmidban az EcoRI hely és a PyuII hely valamennyi kódolási tartományon kívül fekszik, az EcoRI hely a tetracikún-, illetőleg ampicillin-rezisztenciát kódoló gének között található. Ezt a helyet alkalmazták T. Taniguchi és munkatársai (lásd fentebb idézett munkájukat) rekombináns szintetikus rendszerükben. Ezek a helyek jól smeretesek a szakmabeliek számára. Meg_egyzendő természetesen, hogy a jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazható klónozás-hordozó nem feltétlen rendelkezik egy resztrikciós endonukleáz-hellyel a választott DNS-fragmens beiktatására. Ehelyett a hordozót alternatív módokon is kapcsolhatjuk a fragmenshez.

A rekombináns DNS-molekula képzésére választott DNS-fragmens kapcsolására választandó helyet és általában a választandó vektort (klónozás-hordozót) számos különböző tényező határozhatja meg, így például a valamely adott resztrikciós enzim iránt érzékeny helyek száma, az exprimálandó fehérje mérete, a kívánt fehérjének a gazdasejt enzimjei általi proteolitikus lebontással szembeni érzékenysége, az exprimálandó fehérjének a gazdasejt nehezen eltávolítható fehérjével való szennyezettsége vagy azokhoz való kötődése, az expresszió jellemzői, mint például az indító kodonnak és a stop-kodonnak a vektor-szekvenciákhoz viszonyított helyzete és más hasonló, a szakmabeliek által ismert tényező. A vektornak és a beiktatási helynek a megválasztását egy adott gén esetében a fent említett tényezők mérlegelése irányíthatja; egy adott esetben nem mindenfajta választással érhetünk el egyenlően jó eredményt.

Bár több különböző módszer ismeretes a szakmában az idegen DNS-nek egy klónozás-hordozóba vagy vektorba való beiktatá-11193507 sara rekombináns DNS-molekula képzése céljából, a kezdeti klónozásra a találmány értelmében előnyösen oly módszert alkalmazunk, amely szerint a plazmidot (különösen pBR322 plazmidot) a választott beiktatási helyre specifikus resztrikciós enzimmel emésztjük (különösen a PstI helyre specifikus enzimmel), majd dA farok-részeket adunk a 3’-terminusokhoz, terminális transzferáz segítségével. Hasonló módon, a kettősszálú cDNS meghosszabítására dT farok részeket adunk a 3’-terminusokhoz, hogy kapcsolódhassanak a meghosszabított plazmidhoz. A meghosszabított plazmidot és a cDNS-t ezután temperáljuk, hogy beiktassuk a cDNS-t a plazmid megfelelő helyére és hogy cirkularizáljuk a hibrid DNS-t; a farok-részek komplementer jellege megengedi azok kohézióját (vő.: 1. ábra). Az így kapott rekombináns DNS-molekula most már egy beiktatott gént tartalmaz a választott PstI resztrikciós helyen. A beiktatásnak ez a dA-dT farok-képzési módszerét D. A. Jackson és munkatársai: „Biochemical Methods fór Inserting New genetic Information intő DNA of Simian Vírus 40: Circular SV40 DNA Molecules Containing Lambda Phage Genes and the Galactose Operon of Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 2904—2909 (1972) és R. Devos és munkatársai fentebb idézett közleménye ismertetik. Ezzel a módszerrel körülbelül háromszor annyi rekombináns DNS-plazmidot kapunk, mint a dG-dC farok-képzési módszerrel.

Meg kell jegyezni, hogy a klónozás-hordozó választott helyére beiktatott cDNS-fragmensek vagy nukleotid-szekvenciák sorában lehetnek olyan nukleotidok is, amelyek nem részei a kívánt polipeptidhez való aktuális szerkezeti génnek, vagy pedig amelyek csupán egy fragmensét képezik a kívánt fehérjéhez való teljes szerkezeti génnek. Csupán arra van szükség, hogy bármilyen DNS-szekvencia beiktatása esetén a transzformált gazda olyan polipeptidet termeljen, amely a HuIFN-β biológiai vagy immunológiai aktivitásával rendelkezik, vagy pedig hogy maga a DNS-szekvencia használható legyen hibridizációs mintaként oly kiónok szelektálására, amelyek a HuIFN-β immunológiai vagy biológiai aktivitásával rendelkező polipeptidek termelésére felhasználható DNS-szekvenciákat tartalmaznak.

Az idegen gént tartalmazó klónozás-hordozót vagy vektort arra alkalmazzuk, hogy a megfelelő gazdát oly módon alakítsa át, hogy az képes legyen olyan, aHuIFN-β immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptideket exprimálni, amelyeket a hibrid géri kódol. Az e célra megfelelő gazda megválasztása is számos, a szakmában ismert tényezőtől függ. Ilyen tényező például a választott vektorral való kompatibilitás, a hibrid plazmid által kódolt fehérjék toxikussága, a kívánt fehérje kinyerésének egyszerűen vérehajtható volta, az expresszió-jellem12 zők, a biológiai biztonság és a költségek. Ezeket a tényezőket annak figyelembevételével kell egyensúlyba hozni, hogy nem minden szóbajövő gazda lehet egyformán hatásos valamely adott rekombináns DNS-molekula exprimálására.

A jelen találmány szerinti szintézisben kezdeti klónozás-hordozóként a pBR322 bakteriális plazmidot alkalmazzuk, előnyös kezdeti resztrikciós endonukleáz-helyként pedig a PstI hely jön tekintetbe (1. ábra). A plazmid egy kisméretű, körülbelül 2,6 megadalton molekulasúlyú plazmid, amely az ampicillin (Amp) és tetraciklin (Tét) antibiotikumokkal szembeni rezisztencia génjeit hordozza. Ezt a plazmidot már teljes mértékben jellemezték korábbi szerzők, mint F. Bolivár és munkatársat: „Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System”, Gene 95—113 (1977); J. G. Sutcliffe: „pBR322 Restriction Map Derived írom the DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers up to 4361 Nucleotide Pairs Long, Nucleic Acids Research 5, 27212728 (1978); J. G. Sutcliffe: „Complete Nucleotide Sewuence of the Escherichia coli Plasmid pBR322, Cold Spring Harbor Symposium, 43 I 77—90 (1978). A DNS-terméknek e helyre történő beiktatása útján nagyszámú bakteriális kiónt kapunk, amelyek mindegyike tartalmazza az előzetesen előállított cDNS termékben jelenlevő DNS-gének vagy -fragmensek egyikét. E kiónok közül is csak igen kevés fog tartalmazni az IFN-β vagy fragmensei létrehozására képes gént (1. ábra) és esetleg egyikük sem fogja lehetővé tenni az IFN-β immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptidek expresszióját. A jelen találmánnyal kapcsolatban előnyösen E. coli HB 101 alkalmazható kezdeti gazdaként.

1. Pstl-hasított, dA-megnyújtott pBR322 előállítása

A pBR322 plazmidot 37°C hőmérsékleten teljesen elemészettük Pstl-endonukleázzal (a New England Biolabs cég terméke) 10 mmol/1 tirsz-HCl (pH=7,6), 7 mmol/1 magnézium-klorid és 7 mmol/1 2-merkapto-etanol tartalmú pufferoldatban. A kapott elegyet 1 tf. fenollal és 10 tf. éterrel extraháltuk, majd a terméket 2,5 tf. etanol és 0,2 molos nátrium-acetát-oldat elegyével leválasztottuk.

Homopolimer dA-farok-részek hozzáadását (1. ábra) terminális dezoxinukleotidil-transzferáz (TdT) [L. Chang és F. J. Bollum, „Deoxynucleotide-Polymerizing Enzymes of Calí Thymus Gland, J. Bioi. Chem., 246, 909—916 (1971) módszere szerint tisztítva] segítségével végeztük, 50 μΐ reakció-térfo.gatban; a reakcióközeg 0,14 mol/1 kálium-kakodilátot, 30 mmol/1 trisz-HCl-t (pH= =6,8), 1 mmol/1 kobalt-szulfátot, 0,2 pg/μ! hőkezeléssel ináktivált bovin szérumalbumint, 0,8 mmol/1 DDT-t, 0,2 mmol/1 dATP-t és né-12193507 ²³ mi a-³²P-dATP-t tartalmazott. Az elegyet 37°C hőmérsékleten 5 percig inkubáltuk, majd 10 mmol/liter koncentrációig etiléndiamin-teraecetsavat és 0,1% koncentrációig nátrium-dodecil-szulfátot adtunk hozzá, az elegyet fenollal extraháltuk, majd TE-pufferoldatban, Sephadex G50 oszlopon kromatografáltuk. A linearizált és megnyújtott pBR322-t tartalmazó frakciókat 10 mmol/1 trisz-HCl (pH=7,8) pufferoldatban, 0,4 mol/1 nátrium-klorid és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav jelenlétében, oligo(dT)-cellulózon történő adszorbeáltatás útján tisztítottuk tovább. Alapos mosás után a kívánt frakciókat 10 mmol/trisz-HCl-t (pH=7,8) és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó pufferoldattal eluáltuk.

2. dT-megnyújtású DNS előállítása Kettősszálú DNS-nek dTTMP maradékokkal történő meghosszabítását hasonló módon végeztük, ahogyan azt fentebb a pBR322 dA-meghosszabítására leírtuk, csupán azzal az eltéréssel, hogy a fentiekben szereplő dATP és a-³²P-ATP helyett dTTP és némi ³H-dTTP került alkalmazásra. Ebben az esetben természetesen elhagytuk az oligo(dT)-cellulózon történő tisztítást. A fentiekhez hasonlóan a dT-meghosszabítású DNS-különböző fajták elegye, amelyek közül csak igen kevés mutat rokonságot a HuIFN-8-val (1. ábra).

3. Ca⁺⁺-ionokkal kezelt E. coli HB 101 előállítása

Ca⁺⁺-ionokkal kezelt E. coli HB 101 előállítása E. M. Lederberg és S. N. Cohen módszerével [„Transíormation of Salmonella Typhimurium by Plasmid Deoxyribonucleic Acid, J. Bacteriol. 119, 1072—1074 (1974)] történt; a E. coli HB101 kultúrát (H. Boyer ajándéka) 5 ml LB-közegbe (literenként 10 rész baktotripton, 5 rész élesztőkivonat és 5 rész nátrium-klorid) oldottuk, majd a kultúrát 37°C hőmérsékleten éjjelen át szaporítottuk. A friss kultúrákat 1:100 arányban hígítottuk 20 ml LB közegben, majd körülbelül 2.10^β baktérium/ml sűrűségig szaporítottuk, azután jéggel hirtelen lehűtjük és 4°C hőmérsékleten egy Sorvall SS34 rotorban percenként 6000 fordulattal 5 percig centrifugáltuk. Az így elkülönített sejteket 0°C és 4°C közötti hőmérsékleten tartottuk és 20 ml 100 mmol/1 koncentrációjú kalcium-klorid-oldattal mossuk. A sejteket azután 20 percig jégen tartottuk, majd újból centrifugáltuk, 2 ml 100 mmol/1 koncentrációjú kalcium-klorid-oldatban újból szuszpendáltuk és a szuszpenziót 15 percig 0°C hőmérsékleten tartottuk. 200 μΐ térfogatú alikvot-részekhez 11% koncentrációig glicerint adtunk; ezt a glicerines elegyet —80°C hőmérsékleten hónapokig lehetett tárolni, anélkül, hogy az aktivitásból veszített volna, [vö.: D. A. Morrison: „Transíormation in Escherichia coli: Cryogenic Preservation of Competent Cells”, J. Bacteriol. 132, 349— 351 (1977)].

4. A dA-megnyújtású pBR322 és dT-megnyújtású DNS hőkezelése

A vektor és DNS-betét komplementer dAés dT-farok-részeiből hőkezeléssel képezhető az eredetileg kívánt hibrid-plazmid vagy rekombináns DNS-molekula. Ebből a célból a dA-farok-részű Pstl-hasítású pBR322 vektort és a dT-farok-részű cDNS-ek elegyét TSE pufferoldatban — 10 mmol/1 tirsz-HCl (pH= =7,6), 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav, 100 mmol/1 nátrium-klorid — 1,5 pg/ml plazmid-koncentrációban oldottuk, oly módon, hogy a plazmidnak a DNS-betéthez viszonyított mólaránya 1,5 és 2,0 között legyen. Az elegyet 10 percig melegítettük 65°C hőmérsékleten, majd lassan, 4 óra alatt szobahőmérsékletre hűtöttük le.

Az így kapott termék természetesen nagyszámú különböző rekombináns DNS-molekula és néhány beiktatott DNS-szekvenciák nélküli klónozás-hordozó elegye. Valamenynyi rekombináns DNS-molekula tartalmaz azonban a PstI helyen egy cDNS szegmenst. Valamennyi ilyen cDNS-szegmens tartalmazhat egy gént vagy annak egy fragmensét. A cDNS íragmensek közül csak igen kevés kódol HulFN-p-ra vagy annak egy részére (1. ábra). Túlnyomó többségük más olyan fehérjékre vagy azok részeire kódol, amelyek mRNS-jei a találmány szerinti eljárásban alkalmazott poli(A)RNS részei voltak. Meg kell jegyezni azt is, hogy a fenti módon előállított klón-„könyvtár kiónjainak esetleg egyike sem engedi meg az IFN-β immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptidek expresszióját.

5. E. coli HB101 transzfekciója a hőkezelt hibrid plazmidokkal [A transzfekciós eljáráshoz és valamenynyi további oly lépéshez, amelyben a kapott transzformált baktériumokat kezeltük, az USA Nemzeti Egészségügyi Intézet „P3 előírását alkalmaztuk.] A fenti elegyből 90 μΐ vagy ennél kisebb térfogatú alikvot-részeket alkalmaztunk, ezeket 0°C hőmérsékletre hűtöttük és 1 molos kalcium-klorid oldatot adtunk hozzá 0,1 mol/l koncentrációig. Az így kapott oldatból 100 μΐ vagy ennél kisebb térfogatú alikvot-részeket 200 μΐ Ca⁺⁺-ionokkal kezelt E. coli HB101 jegelt kultúrához adtunk, majd 0°C hőmérsékleten 30 percig állni hagytuk, azután a sejteket hirtelen fölmelegítettük 35°C hőmérsékletre, 5 percig ezen a hőmérsékleten tartottuk, majd 15 perc időtartamra ismét 0°C hőmérsékletre hűtöttük. Ezután 2 ml LB közeget adtunk hozzá, a sejteket rázott vízfürdőben 37°C hőmérsékleten 30—45 percig inkubáltuk, majd a kapott baktérium-szuszpenziót 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó I.B közeggel készített 1,2%-os ágár-lemezekre szélesztettük.

Minthogy a pBR322 plazmid a tetracikHn-rezisztencia génjét tartalmazza, az ilyen gént intakt állapotban tartalmazó plazmid13

-13193507 dal transzformált F coli gazdák az ilyen antibiotikumot tar’.ahnazó kultúrában jól fejlődnek, az ily módón nem transzformált baktériumok kiz; ¹ Fisával. Ezért a tetraciklin-tartalmú kultúrában történő tenyésztés lehetővé teszi a rekombináns DNS-molekulával vagy reciklizált vektorral transzformáit gazdák szelekcióját.

37°C hőmérsékleten történő 24 órai inkubálás után az egyes kolóniákat kiemeltük és a fentiekhez hasonló, tetraciklin-tartalmú LB közeg 100 μΐ-jében szuszpendáltuk őket, Dynatech-féle mikroliter-lemezek üregében. A lemezeket éjjelen át 37°C hőmérsékleten inkubáltuk, majd mindegyik üreg tartalmához 11 μΙ dimetil-szulfoxidot kevertünk és a tálcákat ragasztószalaggal lezártuk. Az így elkészített lemezeket —20°C hőmérsékleten tároltuk; ily módon egy 17 000 transzformált E. coli HB101 egyedi kiónt tartalmazó „könyvtárat állítottuk elő. Ez a „könyvtár 270 fmo! (128 ng) dT-farok-részű cDNS-betétből származik; ez utóbbiakat viszont 4,4 gg gradienssel tisztított poli (A) RNS-ből szintetizáltuk. E „könyvtár kiónjainak körülbelül 98%-a érzékeny volt karbenicilinnel (ez az ampicillin egy stabilabb származéka) szemben. Ezért a „könyvtár körülbelül 98%-a oly plazmidot tartalmaz, amelynek a PstI helyen a pBR322 β-laktamáz-génjéből betétje van és csupán 2% tartalmaz ilyen betét nélküli reciklizált vektort.

Ez a 17 000 klón számos különböző rekombináns DNS-molekulát tartalmaz, amelyek a HuIFN+-termelő sejtekből származó poli (A) RNS-ben levő mRNS-ek elegyének teljes vagy részleges kópiáit képviselik. Ezek többsége csupán egyetlen rekombináns DNS-moiekulákat tartalmaz. E rekombináns DNS-molekulából csak néhány áll rokonságban a HuIFN-β val. így tehát ezeket a kiónokat még szűrésnek kell alávetni, hogy elkülönítsük a HuIFN+-rokon kiónokat a többiektől.

A HuIFN-β cDNS-t tartalmazó klón kiszűrése

Különböző módszerek vannak a HuIFN-β cDNS-t tartalmazó bakteriális kiónok kiszűrésére. Ilyen módszer például a DNS szelektáló hibridizációja (vö.: Alwine és munkatársai fentebb idézett munkája), a differenciális hibridizáció [T. P. St. John és R. W. Davis: „Isolation of Galactose-Inducible DNA Sequences írom Saccharomyces Cerevisiae by Differentíal Plaque Filter Hybridization, Cell 16, 443—452 (1979)], hibridizálás szintetikus mintával [B. Noyes és munkatársai: „Detection and Partial Sequence Analysis of Gastrin mRNA by Using an Oligodeoxynuclaotíde Probe”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1770—1774 (1979)] vagy az olyan kiónok kiszűrése immunológiai [L. Villa-Komaroff és munkatársai: „A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3727—3731 (1978)] vagy biológiai [A. C. Y. Chang és munkatársai: „Phenotypic 14

Expression in E. coli of a DNA Sequence Coding fór Mouse Dihydrofolate Reductase, Natúré, 275, 617—624 (1978)] módszerekkel, amelyek a kívánt fehérjét termelik. A RNS-szelekciós hibridizálást választottuk, minthogy ez a legkényelmesebb és a leginkább eredményt ígérő módszer a primer szűrővizsgálat céljaira.

A) RNS-szelekciós hibridizálási vizsgálat

1. A kezdeti vizsgálat áttekintése

Most a 2. ábrára utalva ismertetjük a rekombináns DNS-molekulák elkülönítését a fent említett klón-könyvtárból származó körülbelül 46 karbenicillinre érzékeny és tetraciklinnel szemben rezisztens klón egyedi kultúráiból („A lépés; a 2. ábrán két klón két elegyét mutatjuk be). A rekombináns DNS-molekulákat hasítottuk és olyan teljes RNS-sé hibridizáltuk őket, amely tartalmazza a fentebb leírt módon előállított HüIFN-β mRNS-t („B lépés). Valamennyi rekombináns DNS-molekula — teljes RNS hibridet elkülönítettük a nem hibridizált teljes RNS-től („C lépés). A hibridizált teljes RNS-t kinyertük a hibridekből és tisztítottuk őket („D” lépés). A kinyert RNS-t a fentebb leírt módon vizsgáltuk HuIFN-β mRNS aktivitásra („E lépés). Ha és csakis a rekombináns DNS-molekulák elegye tartalmaz egy olyan rekombináns DNS-molekulát, amelynek van olyan beiktatott nukleotid-szekvenciája, amely képes szigorú hibridizációs feltételek között a HuIFN-β mRNS-re hibridizálni a teljes RNSben, akkor az e hibridből felszabadított mRNS HuIFN-β képződését fogja oocitákban előidézni, minthogy a bármely más rekombináns DNS -molekula — teljes RNS hibridből felszabadított mRNS nem mutat IFN+-rokonságot. Ha egy 46 kiónból álló csoport pozitív reakciót adott, akkor e kiónokat 6 alapcsoportba osztottuk (4 alcsoport 8—8 kiónnal és 2 alcsoport 7—7 klónnal) és mindegyik alcsoportot újra vizsgáltuk a fenti módon. Ezt az eljárást addig folytattuk, míg egyetlen olyan kiónt tudtunk azonosítani, amely pozitív reakciót ad e vizsgálatban.

Nincsen biztosíték arra, hogy akár a rekombináns DNS-molekulák, akár az általuk transzformált baktérium-kultúrák, amelyeket a fenti módon azonosítottunk, valóban tartalmazzák a teljes IFN-β cDNS-szekvenciát, vagy akárcsak arra sem, hogy a DNS-szekvencia valóban kódol IFN+-ra vagy lehetővé teszi, hogy a klón az IFN-β immunológiai vagy bakteriológiai aktivitását mutató peptideket exprimáljon. A rekombináns DNS-molekulák azonban bizonyára tartalmazni fognak az IFN-β mRNS-t kódoló szekvenciával komplementer terjedelmes nukleotidokat. Ezért a rekombináns DNS-molekula legalább forrásként használható olyan mintához, amely más rekombináns DNS-molekulák és ezekkel transzformált kiónok gyors szűrővizsgálatára, hogy így azonosíthassuk további olyan klón-csoportokat, amelyek eset-1427 lég tartalmaznak egy autentikus vagy teljes IFN-β nukleotidot kódoló szekvenciát. Ezeket a kiónokat azután analízisnek vethetjük alá, hogy képesek-e exprimálni az IFN-β biológiai vagy immunológiai aktivitását mutató polipeptideket. Az ilyen hibrid plazmidok beiktatott DNS-fragmensének a nukleotid-szekvenciáját és aminosav-transzlációs termékét azután meghatározhatjuk és — amenynyíben lehetséges — korrelációba hozhatjuk az autentikus IFN-β aminosav-összetételével és kezdeti szekvenciájával (lásd fentebb).

2. A kezdeti vizsgálat kivitelezése „A lépés: A rekombináns DNS-molekula-elegy előállítása

A fenti klón-könyvtárból származó 96 kiónt tartalmazó mikrotiter-lemezről másolatokat készítettünk oly LB-ágár lemezeken, amelyek egyike 10 pg/ml tetraciklint, másika pedig 100 pg/ml karbenicillint tartalmazott. Ily módon két, elegyenként körülbelül 45—46 kiónt tartalmazó csoportot kaptunk, amelyek tetraciklinnel szemben rezisztensek, karbenicillinre pedig érzékenyek voltak; ezeket kiemeltük és külön-külön szaporítottuk őket 37°C hőmérsékleten, éjjelen át, 100 ml oly LB-közegben, amely 10 pg/ml tetraciklint tartalmazott. Ezeket a kultúrákat azután egyesítettük, egy Sorvall GS-3 rotorban percenként 8000 fordulattal 10 percig centrifugáltuk, majd TES pufferoldattal — 50 mmoj/l trisz-HC1 (pH=8), 5 mmol/l etiléndiamin-tetraecetsav, 5 mmol/l nátrium-klorid) kétszer mostuk, majd az eredeti kultúra-térfogat 1 literjére számítva 40 ml TES pufferoldatban újból szuszpendáltuk a kultúrát. Az így kapott sejteket lizozim Triton X-100 [vő.: M. Kahn és munkatársai: „Plasmid Cloning Vehicles Derived írom Plasmids Col El, F, R6K and RK2, Methods in Enzymology, 68: Recombinant DNA (R. Wu kiadása) 1980 (saj tó alatt)] enzim-készítménnyel lizáltuk. A TES pufferoldattal készített sejt-szuszpenzióból 40 ml-hez 20 ml 50 mmol/l-es trisz-HC1 (pH=8) oldattal készített 10%-os szacharóz-oldatot adtunk, majd 1,3 mg/ml koncentrációig lizozimet adtunk az elegyhez és szobahőmérsékleten 20 percig állni hagytuk. Ehhez a szuszpenzióhoz azután 1 ml 0,5 molos etiléndiamin-tetraecetsav-nátrium-hidroxid oldatot (pH=8), 8 ml 0,2% Triton Χ-100-at, 25 mmol/l etiléndiamin-tetraecetsavat és 50 mmol/l trisz-HCl-t tartalmazó oldatot (pH=8) adtunk és a lízist teljessététel céljából szobahőmérsékleten még 30 percig folytattuk. A sejt-törmelékeket és a kromoszómás DNS túlnyomó részét egy Beckman SW27 rotorban, percenként 24 000 fordulattal 45 percig folytatott centrifugálással eltávolítottuk. A szupernatáns folyadékot jégben hűtöttük, 1/3 térfogat 40%-os polietilén-glikol 6000 oldatot (2 molos nátrium-klorid oldatban) adtunk hozzá és az elegyet 0°C hőmérsékleten éjjelen át állni hagytuk. A kapott csapa28 dékot egy Sorvall HB4 rotorban percenként 5 000 fordulattal 10 percig centrifugáltuk 4°C hőmérsékleten, majd az így elkülönített csapadékot TES pufferoldatban oldottuk. A kapott oldathoz 0,2 tf. 10 mg/ml koncentrációjú etidium-bromid-oldatot (a Serva cég terméke) adtunk és 1 g/ml koncentrációig cézium-kloridot adtunk hozzá, majd az elegyet egy Beckmann R60 Ti-rotorban percenként 40 000 fordulattal legalább 48 óra hosszat centrifugáltuk; egy poliallomer cső rendszerint elegendő az 1—2 liter eredeti térfogatú kultúrából származó lizátum befogadására. A csőben ibolyántúli besugárzás alatt két DNS-sáv volt látható. A legnagyobb sűrűséget mutató sáv az I DNS-ből származó plazmidnak, a második sáv a II alakú és III alakú plazmid-DNS-eknek és némi kromoszómás DNSnek felel meg. Az első sávnak megfelelő részt elkülönítettük a csőből, az etidium-bromid eltávolítása céljából izoamilalkohollal hatszor extraháltuk, majd a vizes fázist 0,2 mol/l nátrium-acetátot tartalmazó víz (pH=5,l) háromszoros térfogatával hígítottuk és ezt követően 2,5 tf. etanol hozzáadásával leválasztottuk a DNS-t. Az így kapott DNS-t azután újból oldottuk, fenollal extraháltuk és etanollal újból lecsaptuk. A kapott DNS minőségét elektroforézissel ellenőriztük, 40 mmol/l trisz-ecetsav (pH=7,8), 20 mmol/l nátrium-acetát és 2 mmol/l etiléndiamin-tetraecetsav oldatával készített 1%-os ágár-géien, etidium-bromidos megfestéssel. Ha a kapott DNS túlságosan sok RNS-sel volt szennyezve, akkor további tisztításnak vetettük alá semleges szacharóz-gradiens centrifugálással: egy 10 mmol/l trisz-HCl-t (pH=7,6), mmol/l etiléndiamin-tetraecetsavat és 1 mol/l nátrium-kloridot tartalmazó oldatban (36 ml) 5—20%-os szacharóz-grádienst alkalmaztunk és ehhez 300 pg DNS 10 mmol/l trisz-HCl-t (pH=7,6) és 1 mmol etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó pufferoldattal készített oldatát adtuk, majd ezt az elegyet poliallomer csövekben 16 óra hosszat centrifugáltuk 18°C hőmérsékleten egy Beckmann SW27 rotorban, percenként 24 000 fordulattal. A DNS-tartalmú frakciókat (OD₂₆₀) egyesítettük és nátrium-acetát és etanol hozzáadásával leválasztottuk a DNS-t.

„B lépés: A DNS hibridizálása teljes

RNS-sel

Körülbelül 150 pg fenti módon előállított DNS-hez kevés ³²P-vel egyenletesen jelzett DNS-t és 2 pg pSTNV-1 DNS-t [ez egy rekombináns plazmid, amely a szatellita dohány-nekrózis vírus („STNV”)-RNS teljes méretű cDNS kópiáját tartalmazza, vő.: J. Van Emmelo és munkatársai: „Construction and Characterization of a Plasmid Containing a Nearly Full-Size DNA Copy of Satellite Tobacco Necrosis Vírus RNA, J. Mól. Bioi (sajtó alatt)] adtunk belső kontrollként, majd az elegyet szonikációnak vetettük alá egy MSE szonikátorban és a terméket nátrium-acetát és etanol hozzáadásával leválasztottuk.

-15193507

Ezután egy diazo-benzil-oximetil-cellulóz (DBM-cellulóz) szilárd mátrixot (vő.: J. C. Alwine és munkatársai: „Method fór Detection of Specific RNAs in Agarose Gels by Transfer to Diazobenzyl Oximethyl Paper and Hybridizing with DNA Probes”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5350—5354 (1977)] készítettünk J. C. Alwine és munkatársai [„Detection of Specific RNAs or Specific Fragments of DNA Fractionation in Gels and Transfer to Diazobenzyloxymethyl Paper, Methods-Enzymology, 68: Recombinant DNA (R. Wu kiadása) (1980)] módszere szerint. A papír-matrix készítése céljából egy Whatman 540 szűrőpapír-lapot egyenletesen átitattunk egy cm²-ként 2—3 mg 1-(m-nitro-benziloxi)-metil-piridínium-kloridot (NBPC/BDH) és 0,7 mól nátrium-acetát-trihidrátot 28,5 μΐ vízben tartalmazó oldattal, 60°C hőmérsékleten megszáradásig és még további 10 percig inkubáltuk, majd 30—40 percig 130—135°C hőmérsékleten tartottuk. Az így elkészített lapot vízzel többször mostuk (körülbelül 20 percig, majd acetonnal mostuk háromszor (ismét körülbelül 20 percig) és végül megszárítottuk és ilyen állapotban tároltuk. Ezt a papírt azután egy 20%-os vizes nátrium-ditionit-oldatta 1 (a papír egy cm²-jére 0,4 ml) 30 percig inkubáltuk 60°C hőmérsékleten, időnkénti felrázással. Ezután a papírt ismét mostuk, és pedig négyszer vízzel, egyszer 30% os ecetsavval 5 percig, majd ismét négyszer vízzel; az így mosott papírt oly jéghideg 1,2 molos sósavoldatba vittük át, amelyhez közvetlenül a felhasználás előtt 10 mg/ml friss nátrium-nitritet adtunk; a papír egy cinjére 0,3 ml oldatot alkalmaztunk és a papírt 0°C hőmérsékleten 30 percig hagytuk ebben az oldatban, majd jéghideg vízzel kétszer gyorsan mostuk és azután még egy mosást alkalmaztunk 80% dimetil-szulfoxid (spektrofotometriai minőség, a Merck cég készítménye) és 20% 25 mmolos nátrium-foszfát-oldat (pH=6,0) elegyével.

Por-matrix készítése céljából lényegileg ugyanezt a módszert követtük, de mikrogranuláris cellulóz-port (Whatman CC31) alkalmaztunk, a fent megadottt mennyiségeket a cellulóz-mátrix megfelelő súlyára számítva alkalmaztuk.

Kezdetben por-matrixot alkalmaztunk, minthogy megkötőképessége nagyobb volt, és így a hibridizáció, a mosás és az eluálás céljaira viszonylag kisebb folyadék-mennyiségek alkalmazása volt szükséges. Ezt követően azonban az egyedi kiónok szűrővizsgálatára papír-matrixot használtunk. Papír alkalmazása lehetővé teszi a vízzel történő hatásosabb eluálást; ez a módszer az IFN-β mRNS későbbi vizsgálatainak céljaira előnyösebbnek bizonyult.

A fenti módon előállított DNS-t 25 mmolos nátrium-foszfát-oldatban (pH—6,0) oldottuk, az oldatot 1 percig melegítettük, majd hirtelen lehűtöttük és négyszeres térfogatú 16 dimetil-szulfoxidot adtunk hozzá. A mátrixhoz való kapcsolás (50 mg por-matrix vagy egy 10 mm átmérőjű papír-korong alkalmazásával) rendszerint a hétvégi munkaszünet alatt ment végbe, 4°C hőmérsékleten, folytonos keverést alkalmazva. A DNS-oldat térfogatát viszonylag alacsonyan tartottuk, hogy lehetővé tegyük a mátrixszal való szoros érintkezést és ezáltal növeljük a DNS-nek a mátrixhoz való kapcsolódási hatásfokát. A kapcsolás befejezése után a mátrixot vízzel négyszer és 0,4 n nátrium-hidroxid-oldattal ugyancsak négyszer mostuk 37°C hőmérsékleten, minden egyes mosás 10—10 percig történt és végül ismét vízzel mostuk négyszer szobahőmérsékleten, kétszer pedig hibridizációs pufferoldattal [50% formamid (ionmentesített, a Baker cég terméke), 40 mmol/i piperazin-N,N’-bisz (2-etánszulfonsav) (pH=6,4, „PIPES, a Sigma cég terméke), 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav, 0,6 mol/1 nátrium-klorid és 0,1% nátrium-dodecil-szulfát] 4°C hőmérsékleten. A kapcsolás hatásosságát ³²P rádióaktivitással mértük.

pg fenti módon elkészített teljes RNS-t és 50 ng STNV-RNS-t 250 pg hibridizációs pufferoldatban (papír-matrix esetén 50 pihen) oldottunk és ezt az oldatot hozzáadtuk a DNS-sel kapcsolt mátrixhoz. A mátrixot ezután 2 percig melegítettük 70°C hőmérsékleten, majd éjjelen át 37°C-on tartottuk enyhe keverés közben.

„C lépés: A hibridizált teljes RNS-DNS elkülönítése a nem-hibridizált teljes RNStől

A por-matrix centrifugálása után a nem-hibridizált RNS-eket eltávolítottuk és a mátrixot hétszer mostuk összesen 2 ml 50% formamidot, 10 mmol/1 PIPES-t (pH=6,4), 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat, 0,3 mol/1 nátrium-kloridot és 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó oldattal; e mosófolyadékot kisebb sótartalma destabilizálja a nem-specifikus RNS-DNS kötést. Minden egyes mosás után a mátrixot centrifugáltuk, majd ismét szuszpendáltuk a pufferoldatban. Az ezután következő vizsgálat céljaira az első mosófolyadékot egyesítettük a nem-hibridizált RNS-sel („1. frakció), egyesítettük továbbá a 2—4. mosófolyadékot („2. frakció”) és az 5—7 mosófolyadékot („3. frakció). A papír-matrixon lefolytatott hibridizációk esetében hasonló módszert alkalmaztunk, azzal az eltéréssel, hogy a mosófolyadékok összes térfogatát 1 ml-re korlátoztuk.

„D” lépés: A hibridizált teljes RNS tisztítása

A hibridizált teljes RNS-DNS-t a por-matrixról 3 folyadék-adaggal eluáltuk, összesen 900 pl 99% formamidot, valamint 0,2% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó eluáló-folyadékkal; az eluálást 70°C hőmérsékleten végeztük, majd 2 perc múlva jégbe hűtöttük az eluátumot. A teljes hibridizációs műveletet és a formamiddal történő eluálást lényegileg A. G. Smith módszere szerint (szemé-16193507 lyes közlés alapján) végeztük. A hibridizált teljes RNS-DNS-t a papír-matrixról oly módon eluáltuk, hogy először 100 μΐ jéghideg vízzel mostuk a mátrixot, majd kétszer eluáltunk vízzel (összesen 300 μΐ térfogattal) 80°C hőmérsékleten 2 percig folytatva egy-egy eluálást. Az ezután következő vizsgálat céljaira a kapott két-két eluátumot és a 100 μ! mosófolyadékot egyesítettük egymással („4. frakció”).

A fenti módon kapott négy frakció mindegyikének a feléhez 0,1 pg borjúmáj-t RNS-t vagy riboszómás RNS-t adtunk („1A., 2A., 3A. és 4A. frakció”) a négy frakció mindegyikének másik feléhez pedig 8. pg eukariotás poli(A) RNS-t vagy riboszómás RNS-t adtunk („IB., 2B., 3B. és 4B. frakció”). Ezeket a frakciókat azután 0,5 molos nátrium-klorid-oldat és 2,5 tf etanol hozzáadásával történő lecsapás útján tisztítottuk, hogy eltávolítsuk a formamid nyomait és az egyéb szenynyezéseket.

„E lépés: Az IFN-β mRNS aktivitás meghatározása

Az 1 A., 2A., 3A. és 4A. frakciókat 25 pl nukleázzal kezelt nyúl-retikulocita lizátumban [előállítva R. B. Pelham és R. J. Jackson módszere szerint, vő.: „An Efficient mRNA-Dependent Translation System fór Reticulocyte Lysates, Eur. J. Biochem., 7, 247—256 (1976)] „fordítottuk” B. LeBleu és munkatársai [„Translation of Mouse Interferon mRNA in Xenopus laevis Oocytes and in Rabbit Reticulocyte Lysates, Biochem. Biophis. Rés. Commun., 82, 665—673 (1978)] módszere szerint, azzal az eltéréssel, hogy 250 mmol/1 spermidin-HCl-t és 1 mmol/l fruktóz- 1,6-difoszfátot adtunk hozzá, 0,5 mCi/ /ml³⁵S-metionin (az Amersham cég terméke) jelenlétében. Inkubálás után 25 pl fenti módon kapott retikulocita-lizátumhoz 1 pl 10%-os dezoxikolát—10%-os Triton X100 elegyet és 2 pl antiszérum-PBS (foszfáttal pufferezett sóoldat) 1:9 arányú elegyet adtunk és 1 óra hosszat melegítettük 37°C hőmérsékleten. 20 pl frissen mosott Staphylococcus aureus Cowan I kultúrát [S. W. Kessler és munkatársai: „Rapid Isolation of Antigens from Cells with a Staphylococcal Protein A-Antibody Adsorbent: Parameters of the Interaction of Antibody-Antigén Complexes with Protein A”, J. Immunology 115, 1617—1624 (1975)] 10% 100 mmolos nátrium-klorid-oldat, 10 mmolos trisz-HCI (pH= =7,4), 1 mmolos etiléndiamin-tetraecetsav-oldat és 0,5% NP40 elegyében adtunk és az elegyet 30 percig 20°C hőmérsékleten tartottuk, majd egy Eppendorf 5412 centrifugában 2 percig centrifugáltuk. A szilárd terméket foszfát-pufferes sóoldattal (PBS) mostuk és újra centrifugáltuk, ezt még egyszer megismételtük, majd az így kapott szilárd részt minta-pufferoldatban oldottuk és 13%-os poliakrilamid-gélben elektroforizáltuk U. K. Laemmli és munkatársai [„Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the

Head of Bacteriophage T4, Natúré, 227, 680— 685 (1970)] módszere szerint, majd autoradiográfiai vizsgálatnak vetettük alá. Az 1A és 4A frakciókban kapott STNV-RNS transzlációs termékeknek az összehasonlítása képet ad a hibridizációnak és az RNS-degenerációnak az eljárásban való hatásosságáról.

Az IB, 2B, 3B és 4B frakciókat 2—2 pl vízben oldottuk és a fent leírt módon oocitákban vizsgáltuk IFN-β mRNS-tartalmukra.

3. A következő vizsgálat — hibridizáció nitrocellulóz lapokon

Egyes egyedi kiónokat nitrocellulóz-lapokon [M. Cochet és munkatársai: „Cloning of an Almost Full-Length Chicken Conalbumin Double-Stranded cDNA, Nucleic Acids Research, 6, 2435—2452 (1979)] vizsgáltuk tovább. A DNS-t 2 mol/l nátrium-kloridot és 0,2 mol/l nátrium-hidroxidot tartalmazó oldatban oldottuk, 1 percre 100°C hőmérsékletre melegítettük, majd hirtelen lehűtöttük és felületaktív anyagtól mentes „Millipore szűrőkre (7 mm átmérővel, pórusméret: 0,45 pm) vittük. A szűrőket 2 óra hosszat 80°C hőmérsékleten tartottuk, majd 0,3 mol/l nátrium-kloridot, 2 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat, 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot és 10 mmol/1 trisz-HCl-t (pH=7,5) tartalmazó oldattal mostuk és szobahőmérsékleten megszárítottuk őket. Az RNS-t 3 óra hoszszat hibridizáltuk 47°C hőmérsékleten 30%os formamid-oldatban, amely 0,5 mol/l nátrium-kloridot, 0,4% nátrium-dodecil-szulfátot, 2 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat és 50 mmol/1 PIPES-t (pH=7,5) tartalmazott. A hibridizáció befejezése végett az elegyet tízszeres térfogatú 0,1 molos nátrium-klorid-oldattal hígítottuk, majd a szűrőket 0,3 mol/l nátrium-kloridot, 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot, 2 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat és 10 mmol/1 trisz-HCl-t tartalmazó oldat 15—15 ml-jével 45°C hőmérsékleten történő rázás útján többször mostuk és ezt a mosást 4°C hőmérsékleten ugyanilyen, de nátrium-dodecil-szulfátot nem tartalmazó oldattal többször megismételtük. A hibridizált RNS-DNS-t 30 pl 5 mmolos kálium-klorid-oldattal 100°C hőmérsékleten eluáltuk.

4. Az RNS-szelekciós hibridizációs vizsgálat eredményei

16, egyenként körülbelül 46 kiónt tartalmazó csoportot (A — P csoport) vetettünk alá szűrővizsgálatnak. 6 csoportban csak az IB frakció tartalmazott IFN-β mRNS aktivitást, 8 csoportban IFN-β mRNS nem volt felfedezhető és 2 csoportban (C és O csoportban) a 4B frakcióban találtunk IFN-mRNS-t. A C és O csoport vizsgálatáról az alábbiakban számolunk be; az IB frakcióban (nem hidrolizálva) és a 4B frakcióban (hidrolizált) talált IFN-β egységek logaritmusait adjuk meg (a 69/19 referencia-standardhoz viszo17

-1733

nyitottan	kalibrálva). A	detekció-limit 0,1
volt.
Csoport	1B frakció	4B frakció
C	1,0	0
	0,5	0,5
	0	0,2
O	0	0
	0,2	0,5

Klón	1B frakció	4B frakció
θΐ/7	0,5	0
	1,2	0*
	0,2	0,5**
θΐ/8	0	1,7*
0,2	1,2
	0	0,7**
	0	1.0**

Az O csoportot 6 alcsoportra osztottuk fel (Oj — O₆ alcsoportok; 4 alcsoportban 8— 8 klónnal és 2 alcsoportban 2—7 kiónnal) és ezeket a fentebb leírt módon hibridizáltuk és vizsgáltuk, csupán azzal az eltéréssel, hogy kiónonként 400 ml kultúrát alkalmaztunk.

Az alcsoportok az alább összefoglalt eredményeket mutatták (az eredményeket a fentivel

egyező módon mutatjuk be). A hibridizációt
DMB-cellulóz-poron végeztük, más megadva nincs:	amennyiben
Alcsoport	1 B frakció	4B frakció
o,	0	1,2
	0	1,5
	0	0,5
	0	0,5
	0,2	0,5
	0	1,2*
0,	0,7	0
O3	0,7	0
	0,5	0
o4	0	0
c>5	0,5	0
O6	0	0

* DMB cellulóz-papír módszerrel.

Az O, alcsoportot az egyes kiónjainak megfelelően osztottuk fel tovább (O_1Z, — O,_/8 jelzéssel) és ezeket is a fentebb leírt módon hibridizáltuk és vizsgáltuk, azzal az eltéréssel, hogy kiónonként 700 ml kultúrát alkalmazunk. A hibridizációt itt is DBM-cellulóz-poron végeztük, amennyiben mást nem adtunk meg az alábbi táblázatban.

Klón	1Β frakció	4Β frakció
θιζι	0,2	0
	0,7	0
	0,7	0*
	1,0	Q**
θ|Ζ2	1,2	0
	0,2	0*
	0,7	0**
	1,2	0
	1,0	0,2*
	1,2	1,0*
	1,2	Q**
Ο,«	1,2	0
	1,2	0
	1,0	0*
	1,2	θ**
θ|/5	0,7	0
	0,7	<0,2*
	1,0	0
θΙΖ6	0,7	0
	1,0	0,2*
	0,5	Q**

* DMB cellulóz-papír módszerrel ** nitrocellulóz-lapokon

Amint a fenti adatokból látható, az O_1/8 klón tartalmaz oly rekombináns DNS-molekulát, amely képes IFN-β mRNS-t hibridizálni teljes RNS-t tartalmazó IFN-β mRNS-bőI.

Nem specifikus RNS-DNS kötés jelenléte nagyon valószínűtlen, minthogy az 1A és 4A frakciók összehasonlítása nem mutatott az STNV DNS nem specifikus kötésének jelenlétére ugyanebben a kísérletben; a vizsgálatot nyúl-retikulocita-lizátumban, ³⁵S-metionin jelenlétében történő transzlációval és ezt követő gél-elektroforézzel ellenőriztük, amint ezt a fentiekben leírtuk. Az O,_/8 kiónt E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF1 („G-HB101 -pHFIFl) megjelöléssel, rekombináns DNS-molekuláját G-pBR322(Pst)HFIFl („pHFIFl) és hibrid betétjét „pHFIFl fragmens” megjelöléssel jelöltük. Ez a nomenklatúra azt mutatja, hogy ez a klón és a rekombináns DNS-molekula Gentből származik („G”) és oly pBR322 plazmidot tartalmaz, amelyben a PstI helyen HuIFN-β cDNS („HFIF”) van, mimellett az adott molekula volt az első, amelyet találtunk („1”).

A pHFIFl-re kereszt-hibridizáló rekombináns DNS-molekulákat tartalmazó kiónok azonosítása

A fenti módon izolált pHFIFl-et alkalmaztuk kolónia-hibridizálás útján előzetesen előállított klón-könyvtárunk szűrővizsgálatára abból a célból, hogy a rokon hibrid DNS-betétes rekombináns DNS-molekulákat tartalmazó bakteriális kiónokat találjunk [vö.: M. Grunstein és D. S. Hogness: „A Method fór the Isolation of Coned DNA’s that Contain a Specific Gene”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961—3965 (1975)]. Ez a módszer lehetővé teszi a rokon kiónok gyors azonosítását egy pHFIFl-ból készített rádióaktív mintának a nitrocellulóz-szűrőkön rögzített lizált baktérium-kolóniák DNS-ével.

A klón-könyvtárat, amelyet a fentebb leírt módon mikrotiter-lemezeken tároltunk, hasonló méretű nitrocellulóz-lapokon (pórus-átmérő: 0,45 pm; Schleicher and Schuel vagy Millipore gyártmány) replikáltuk; a nitrocellulóz-lapokat a felületaktív anyag eltávolítása céljából előzetesen forraltuk, majd a lapokat LB-ágár-lemezekre helyeztük; az e célra alkalmazott ágár-lemezek 10 pg/ml tetraciklint tartalmaztak. A baktérium-kolóniákat éjjelen át 37°C hőmérsékleten szaporítottuk. A baktériumok lízise és a nitrocellulóz-lapokon történő rögzítése oly módon történt,

-18193507 hogy a lapokat 0,5 n nátrium-hidroxid oldattal 7—7 percig kétszer, majd 1 mólos trisz-HCl-oldattal (pH=7,5) 7 percig, majd

0,5 molos trisz-HCl-oldattal (pH=7,5) ismét 7 percig, azután 1,5 molos nátrium-klorid-oldattal 7 percig, 2 x SSC oldattal (0,15 mol/1 nátrium-klorid, 0,015 mol/1 nátrium-citrát, pH=7,2) ismét 7 percig mostuk, a megadott sorrendben. Ezután az így mosott lapokat etanollal alaposan leöblítettük, levegőn megszárítottuk, majd vákuumban 2 óra hosszat 80°C hőmérsékleten tartottuk őket és az így kezelt lapokat szobahőmérsékleten tároltuk.

A kolónia-hibridizációhoz (lásd fentebb), mintaként a pHFIFl fragmensre (lásd fentebb) specifikus Hinf I resztrikciós frágmens szolgált. Ezt a körülbelül 170 bázis-párt tartalmazó fragmenst a pHFIFl Hinf emésztési termékeinek 6%-os poliakrilamid-gélben történő elektroforézisével tisztítottuk. Miután a DNS-sávokat etidium-bromiddal megfestettük, a specifikus fragmenst eluáltuk, újból elektroforézisnek vetettük alá, majd „nick-transzláció” útján ³²P vei jeleztük [vő.: P. W. Rigby és munkatársai: „Labeling Deoxyribonucleic Acid to High Specific Activity in Vitro by Nick Translation with DNA Polymerase I, J. Mól. Bioi. 113, 237—251 (1977)]; 50 μΐ 50 mmol trisz-HCI-t (pH=7,4) 10 mmol magnézium-kloridot, 20 mmol/1 β-merkapto-etanolt tartalmazó oldatban inkubáltunk, amely oldat 2,5—2,5 μΙ dCTP-t, dTTP-t és dGTP-t 400 mikromol koncentrációban, 100 pmol a-ATP-t (2000 Ci/mmol, az Amersham cég terméke) és 2,5 egység DNS-polimeráz I enzimet (Boehringer) tartalmazott. Az inkubálást 14°C hőmérsékleten 45 percig végeztük. A reagálatlan dezoxinukleozid-trifoszfátokat TE pufferoldatban Sephadex G-50 gélen történő gél-szürés útján távolítottuk el. A ³²P-vei-erősen jelzett DNS-t 0,1 tf. 2 molos nátrium-acetát-oldat (pH=5,l) és 2,5 tf etanol 20°C hőmérsékleten történő hozzáadása útján választottuk le.

A fenti hibridizációs mintának a DNS-sel impregnált szűrőre történő hibridizációját lényegileg a D. Hanaban és M. Meselson által kidolgozott módszerrel a következő módon végeztük: a fent leírt módon előkészített szűrőket 2 órai előinkubálásnak vetettük alá 68°C hőmérsékleten 0,1% Ficollt, 0,1% po1 ivinif-pirrolidont, 0,1% bovin szérumalbumint, 0,15 mol/1 nátrium-kloridot, 0,03 mol/1 trisz-HCl-t (pH=8) és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldatban, majd egy 0,02% Ficollt, 0,02% polivinil-pírrolidont, 0,02% bovin szérumalbumint, 0,75 mol/1 nátrium-kloridot, 0,15 mol/1 trisz-HCl-t (pH= =8) 5 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat és 0,5% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó oldattal öblítettük. A hibridizáció éjjelen át ment végbe 68°C hőmérsékleten, a fenti öblítő-oldattal azonos oldatban, a ³²P-jelzett minta alkalmazásával, amelyet előzetesen 100°C hőmérsékleten történő 5 perces melegítéssel denaturáltunk. A hibridizált szűrő36 két kétszer mostuk 2—2 óra hosszat 68°C hőmérsékleten egy 0,3 mol/1 nátrium-kloridot, 0,06 mol/1 trisz-HCl-t (pH=8) és 2 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldattal, azután levegőn megszárítottuk és autorádiográfiai vizsgálatnak vetettük alá őket.

Körülbelül 1350 kiónt (amelyek a 800—900 DNS-méretosztályból származtak) vetettünk alá szűrővizsgálatnak. Ezek közül 13 kolónia adott pozitív eredményt, ezek között volt a pHFIFl is. Ezeket a kiónokat G-HB101-pHFIF — G-HB101-pHFIF13 megjelöléssel, rekombináns DNS-molekuláikat pedig pHFIFl — pHFIF13 megjelöléssel jelöltük. E kiónok egyikét, a pHFIF2 kiónt IFN-β mRNS-t tartalmazó poli(A) mRNS-sel hibridizáltuk és DBM-cellulóz-papír alkalmazásával a fentebb leírt módon vizsgáltuk. Minthogy a teljes IFN-RNS aktivitást a hibridizált frakcióban találtuk és a nem-hibridizált RNS nem tartalmazott kimutatható aktivitást, nyilvánvaló, hogy a pHFIFl frágmens részévé történő kolónia-hibridizáció útján azonosított kiónok is IFN-β mRNS-sé hibridizáltak.

Nyilvánvaló természetesen az is, hogy a klón-szürővizsgálatnak ez a módszere, amelynek során valamely, a pHFIFl DNS-betétjének felhasználásával azonosított klón pHFIFljének HuIFN-β DNS-betétjét vagy valamely más DNS-betétjét alkalmaztuk a fent leírt módon, ugyanilyen jól felhasználható más olyan kiónok esetében, amelyek a rekombináns DNS-technológiából, szintézisből, természetes forrásokból, vagy ezek kombinációiból származó DNS-szekvenciákat tartalmaznak. Ezért mindezek az említett DNS-szekvenciák és azonosítási módszereik e találmány körébe esnek. Utalni kell továbbá arra is, hogy az olyan DNS-szekvenciák, amelyeket nem vetettünk alá szűrővizsgálatnak a fenti DNSszekvenciák felhasználásával, de amelyek nukleotid-el rendezés ük eredményeképpen olyan polipeptidekre kódolnak, amelyek a fenti DNS-szekvenciákat kódolják, szintén a jelen találmány körébe tartoznak.

Az IFN-p-rokon rekombináns plazmidok jellemzése

A fent leírt módon, kolónia-hibridizáció útján azonosított 13 (pHFIFl —pHFIF13) Hónt az alábbi ismertetett módon jellemeztük közelebbről. E kiónok betétjeinek fizikai térképét is megszerkesztettük és meghatároztak a különböző kiónok orientációját.

A plazmidok fizikai térképének megszerkesztését különböző resztrikciós enzimek (a New England Biolabs cég terméke) felhasználásával történő emésztéssel végeztük, 10 mmol/1 trisz-HCl-t (pH=7,6), 7 mmol/1 magnézium-kloridot és 7 mmol/1 β-merkapto-etanolt tartalmazó oldatban, 37°C hőmérsékleten, a szakmában jól ismert módszerekkel, az emésztési termékeket elektroforézisnek vetettük alá 2,2%-os agaróz vagy 6%os poliakrilamid-gélben, 40 mmol/1 trisz-ace19

-19193507 tatot (pH=7,8), továbbá 20 mmol/l etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldatban. A kapott terméket vizuális vizsgálat után etidium-bromiddal történő megfestés útján analizáltuk és összehasonlítottuk a pBR322 részletes fizikai térképével (vő.: J. G. Sutcliffe fent idézett munkája). A különböző plazmidok resztrikciós térképét ezeknek az emésztési képeknek az alapján szerkesztettük meg. A termékeket azután oly módon finomítottuk, hogy a DNS-betéteket különféle kapott plazmidokkal szekvencia-képzésnek vetettük alá, lényegileg az A. M. Maxam és W. Gilbert: „A New Method fór Sequencing DNA”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560—564 (1977) közleményében leírt módszerrel.

A különböző pHFIFI — pHFIF13 termékekből plazmid-DNS-t állítottunk elő a jelen találmány szerinti módon, Kahn és munkatársai (vö.: a fentebb idézett művet) módszerének alkalmazásával, tehát azzal a módszerrel, amelyet az előzőkben már alkalmaztunk a DNS-nek a klón-csoportok szűrővizsgálata során. Az elkülönített I alakú DNS-t semleges szacharóz-gradiens centrifugálással tisztítottuk, amint az előzőkben ezt már ismertettük, majd különböző resztrikciós enzimekkel resztringáltuk őket, lényegileg a szállító vállalat (New England Biolabs) által ajánlott módon.

A resztringált DNS-t defoszforizelés céljából 30 percig 65°C hőmérsékleten tartottuk 4 egység bakteriális alkalikus foszfatáz és 0,1% nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében. Ezután fenollal kétszer extraháltunk, a merméket etanollal lecsaptuk, majd az így kapott DNS-t az 5’-terminuson y-³²P-ATP-vel (~3000 Ci/mmol) jeleztük és polinukleotid-kinázzal kezeltük (a P-L Biochemicals, Inc. cég termékével).

A fenti módon jelzett fragmenseket szekvencia-képzés céljából kétféle módon kezeltük. Egyes fragmenseket egy második resztrikciós enzimmel történő hasítás előtt poliakrilamid-gélen tisztítottunk. Másokat közvetlenül hasítottunk a második resztrikciós enzimmel. Mindkét esetben a kívánt fragmenseket poliakrilamid-gélen különítettük el, trisz-borát — etiléndiamin-tetraecetsav pufferoldatban. A 7. ábra mutatja a különböző resztrikciós fragmenseket (a körök a jelzőt mutatják, a nyilak pedig a szekvenciaképzés irányát szemléltetik), mutatja továbbá a pHFIFI, pHFIF3, pHFIF6 és pHFIF7 alkalmazásával történő szekvencia-képzés stratégiáját.

A fragmenseket A. M. Maxam és W. Gilbert (fent idézett munkája) szerinti módszerrel bontottuk le. A termékeket különböző koncentrációjú és lánchosszúságú poliakrilamid-gélen frakcionáltuk, 50 mmol/l trisz borátot és 1 mmol/l etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldatban (pH=8,3), 900—2000 V-nál.

Mindegyik cDNS-betét szakaszon szekvenciát képeztünk mindkét szálból, továbbá szekvenciát képeztünk minden jelzett termi20 nusként szolgáló resztrikciós helyen, egy az azt átfogó fragmens alkalmazásával. Az IFN-β DNS kódoló-szál vagy gén részére így kapott összetett nukleotid-szekvenciát és megfelelő aminosav-szekvenciáját a 4. ábra mutatja. Minthogy a pHFIFI —pHFIF13 plazmidok egyike sem tartalmazta a HulFN-β teljes génjét, a 4. ábra legalább két ilyen plazmid kombinációjának adataiból származik. Ebben a vonatkozásban az 5. ábra mutatja a pHFIFI, pHFIF3, pHFIF6 és pHFIF7 betétek rokonságát; a vastagon kihúzott nyilak vagy a zegzúgos vonalak mutatják a betétek különböző részeinek orientációját.

Visszatérve a 4. ábrára, a betét heteropolimer részét az egyik végén egy T-kben gazdag szegmens és A-k füzére szegélyezi, ez utóbbi valószínűleg az mRNS poliA-terminusát tükrözi. A betétet hivatkozás céljaira az összetett betét első nukleotidjától kezdve számoztuk egy a betét le nem fordított szakaszában levő nukleotidig. Egy a 65—67 helyzetben levő ATG kezedti triplett és egy a 626—628 helyzetben levő TGA terminációs triplett határozzák meg az egy „nonszensz”-kodonok által meg nem szakított leolvasó-fázist. Valamenynyi többi lefordítható (transzlatálható) szekvencia, amely különböző, egy ATG vagy GTG és egy terminációs szignál által határolt leolvasó fázisokban van, túlságosan rövid ahhoz, hogy a várt IFN^-méretű polipeptidre kódoljon. Ezért a 65 és 625 helyzetű nukleotidok közötti szekvencia igen valószínűen magába foglalja azt az összetett DNS-szekvenciához való nukleotid-szekvenciát, amely a jelen találmány szerint az ΙΕΝ-β-re kódol.

Ez a szekvencia nem zárja ki annak lehetőségét, hogy gén-modifikációk, mint mutációk, például egyszerű vagy többszörös mutációk, bázis-szubsztitúciók, deléciók, beiktatások vagy inverziók előzőleg már nem történtek a génben vagy hogy ilyeneket nem alkalmazunk ezután a gén vagy az ebből transzlatált polipeptidek tulajdonságainak módosítására. Nem zár ki továbbá semmilyen polimorfizmust, amely fiziológiailag hasonló, de a 4. ábrában leírttól szerkezetileg némileg különböző géneket vagy polipeptideket eredményezhet. így például valamely más, a jelen találmány szerint azonosított kiónban egy „C helyett egy „T lehet jelen az IFN-β-re kódoló nukleotid-szekvencia 90 helyzetű nukleotidjánál. A kodon harmadik nukleotidjában fellépő ilyen változás nem változtatja meg az alábbi kódolt aminosavat. A 4. ábrában szemléltetett DNS-szekvencia által kódolt aminosav-szekvencia azonos azzal az aminosav-szekvenciával, amelyet Taniguichi és munkatársai fentebb idézett munkájukban ismertettek.

Megjegyzendő azonban, hogy a poliA RNS.ből a szokásos módszerekkel (vö.: A. Efstratiadis és munkatársai fentebb idézett munkáját) klónozott cDNS-nek hiányozhatnak az 5’-fermináiis nukleotidjai, sőt mesterséges szekvenciát is tartalmazhat [R. I. Richards

-20193507 és munkatársai: „Molecular Cloning and Sequence Analysis of Aduit Chiken β-Globin cDNA, Nucleic Acids Research, 7, 1137— 1146 (1979)]. Ezért nem biztos,, hogy a 65— 67 helyzetű nukleotidoknál levő ÁTG valóban az autentikus IFN-β-ί kódoló szekvencia első ATG-je. A jelen leírás céljaira azonban feltételezzük, hogy a 65—67 helyzetű nukleotidoknál levő ATG az autentikus IFN-β első ATG-je.

Ha a betét e tartománya által kódolt polipeptidet összehasonlítjuk az autentikus humán fibroblaszt interferon 13 amino-terminális aminosavjának szekvenciájával — MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSer — (amint ezt Knight és munkatársai fentebb idézett munkájukban meghatározták), akkor kitűnik, hogy a választott leolvasó-fázis helyes és hogy a 65—127 helyzetű nukleotidok kódolhatnak egy olyan szignál pepiidre, amely megelőzi az „érett” polipeptidre kódoló nukleotid-szekvenciát.

Emellett eukariotás mRNS-ekben az 5’-terminustól számított első AUG triplett rendszerint a fehérje-szintézis kezdő helye [M. Kozák: „How Do Eukaryotic Ribosomes Select Initiation on Regions in Messenger RNA?”, Cell, 15, 1109—1125 (1978)]. Itt a fibroblaszt interferon első aminosavának megfelelő kodon az összetett fragmensben 22 kodonra van az első ATG-től. Ez viszont azt mutatja, hogy a fibroblaszt interferonra kódoló DNS-szekvenciát megelőzheti egy 21 aminosavból álló szignál-polipeptidet meghatározó szekvencia. A feltételezett valószínű szignál-szekvencia hidrofob aminosavak sorozatát tartalmazza. A hidrofob aminosav-maradékok ilyen akkumulációja természetesen jellemző a szignál-szekvenciákra [vő.: B. D. Davis és P. C. Tai: „The Mechanism of Protein Secretion Across Membranes”, Natúré, 283, 433—438 (1980)].

Az „érett ΗυΙΕΝ-β-nak látszólag megfelelő nukleotid-szekvencia 498 nukleotidot tartalmaz, ezek 166 aminosavra kódolnak. Feltételezve, hogy ezekben nincs karboxil-terminális változás, az interferon-poiipeptid molekulasúlya 20 085. A kódoló szekvencia bázis-összetételében 45% G+C van. Az interferon-kódoló szekvencián belül a kodon-alkalmazás jól egyezik az emlős-mRNS-ekben általában feltételezettel [R. Grantham és munkatársai: „Coding Catalog Usage and the Genome Hypothesis”, Nucleic Acids Research, 8, 49—62 (1980)]. Az esetleg megfigyelhető eltérések a megfigyelt esetek kis számának tulajdoníthatók.

Az összetett fragmensre vonatkozólag a 4. ábrán ábrázolt polipeptid-szerkezet természetesen nem vesz figyelembe olyan módosításokat, amelyeket in vivő enzimhatások okoznak a polipeptidben, mint például a glikozileződést. Ezért figyelembe kell venni, hogy a 4. ábrán ábrázolt amnosav-szekvencia nem feltétlenül azonos az in vivő termelt HuIFN-β szekvenciájával.

Ha az autentikus fibroblaszt interferon első 13 aminosavát (vö.: Knight és munkatársai fent idézett munkáját) összehasonlítjuk a 4. ábra szerinti összetett gén szekvenciájával, akkor nem látunk különbséget. Az autentikus fibroblaszt interferonra vonatkozólag közvetlenül meghatározott aminosav-összetétel ugyancsak lényegbeli hasonlóságokat mutat a találmány szerinti összetett gén szekvenciájából levezethető aminosav-összetétel. A 6. ábra mutatja ennek az öszszehasonlításnak a részletes adatait.

Bár a jelen találmány szerint kezdetben előállított rekombanáns DNS-molekulák egyike sem tartalmazza a fibroblaszt interferon teljes DNS-szekvenciáját, ezek mégis használható szondát nyújtanak a DNS-szekvenciák gyűjteményeinek szűrővizsgálatára, a HuIFN+-val rokon szekvenciák kiválasztására. Emellett — amint ezt az alábbiakban kimutatjuk — a szakmabeliek számára nem képez nehézséget az ilyen rekombináns DNS-betétek részeinek kombinálása a teljes IFN-β-kódoló szekvencia képzése céljából. így például az 5. és 8. ábra alapján könnyen látható, hogy a pHFIF6 Pstl-Bgl II fragmense összeköthető a pPHFIF7 PiH-Hafill fragmensével, vagy a pHFIF6 EcoRI-Pstl fragmense összeköthető a pHFIF7 Pstl-Haell íragmensével, vagy pedig a pHFIF6 Bgl Il-PstI fragmense összeköthető a 7 klón Pstl-Bgl II fragmensével, egy összetett HuIFN+-kódoló szekvencia képzése céljából. Ezeknek a fragmenseknek az összekötése természetesen akár a klónozott fragmensnek a kívánt plazmidba való beiktatása előtt, akár azt követően történhet.

HuIFN-b-ra kódoló teljes DNS-szekvenciát tartalmazó plazmidok előállítása HuIFN^-aktivitást mutató polipeptidek exprimálásának céljaira

A λ bakteriofág két erős promotort — f^ éslj[ — tartalmaz, amelyek aktivitását egy represszor fehérje szabályozza; ez utóbbi a cl, fág-gén terméke. Represszor jelenlétében az e promotorokból történő transzkripció teljesen gátolva van. A represszor eltávolítása megindítja a ζ és IJ promotorokból történő erős transzkripciót [vö.: H. Szybalski és W. Szybalski: „A Comprehensive Molecular Map of Bacteriophage λ”, Gene, 7, 217— 270 (1979)].

A pBR322 sokmásolatú (multicopy) plazmid oly származékait [F. Bolivár és munkatársai: „Construction and Characterization of New Cloning Vehicles. II. A Multiple Cloning System”, Gene, 2, 95— 113 (1977) ] szerkesztettük meg, amelyek a ξ promotort tartalmazzák. Ezeket a plazmidokat az 1980. szeptember 8-án benyújtott 80.28983 sz. nagy-britanniai szabadalmi bejelentésünk leírásában ismertettük és itt erre a leírásra hivatkozunk.

A. A R promotort tartalmazó plazmidok szerkezete. A pPLa2311 plazmid származéka (C. Maniatis et al Molecular

-21193507

Cloning 5., 479—81. oldal, Cold Spring Harbor, 1982)

A pPLa2311 piazmid (amelyet a 8. ábra szemléltet) három Haell fragmensből áll nagy-britanniai szab. leírásban). A legnagyobb fragmens, amely körülbelül 1940 bázis-párból áll, tartalmazza a β O_u tartományt a λ bakteriofágból és a β-laktamáz gén-tartományt a pBR322 plazmidból ]J. Sutcliffe, „Complete Nucleotide Sequence of the Escherichia coli Plasmid pBR322, Cold Spring Harbor Symposium, 49, 77—90 (1978)]. E fragmenshez csatlakozik szomszédos helyzetben egy 370 bázis-párból álló Haell fragmens, amely a Col E, plazmidból származik. A replikáció kezdő helye átfogja az említett két fragmens közötti kapcsolódást [A. Oka és munkatársai: „Nucleotide Sequence of Small ColE, Derivatives. Structure of the Regions Essential fór Autonomous Replication and Colicin E, Immunity”, Mól. Gén. Génét., 172, 151 — 159 (1979) ]. A körülbelül 1600 bázis-pár hoszszúságú harmadik Haell fragmens a kanamicinnel szembeni rezisztenciára kódol. Ez a fragmens eredetileg a pCR, plazmidból származott [C. Covey és munkatársai: „A Method fór the Detection of Restriction Sites in Bacterial Plasmid DNA”, Mól. Gén. Génét., 145, 155—158 (1976)]. A R promotorból történő transzkripció iránya ugyanolyan értelemben halad, mint a β-laktamáz géné. A pPLa2311 piazmid rezisztenciát nyújt 100 pg/ml karbeinicillinnel és 50 pg/ml kanamicinnel szemben.

A G-pPLa8 piazmid

A G-pPLa8 plazmidot (amelyet a 9. ábrán mutatunk be) a pPLa2311 plazmidból nyerhetjük oly módon, hogy a β-laktamáz génben a PstI helyet egy BamHI hellyé alakítjuk át. Ez oly módon érhető el, hogy a Pstl-nél nyitott pPLa2311 plazmidot S, nukleázzal kezeljük, majd ezt követően a tompa véget egy BamHI összekötő fragmenshez (ezt a Collaborative Research Inc., Waltham, Mass. cégtől kaptuk) kapcsoljuk és a BamHI-hasítás után a molekulát recirkularizáljuk. A pPLa8 piazmid már nem ad rezisztenciát karbenicillinnel szemben, de kanamicinnel szembeni rezisztenciát még ad.

A G-pPLc24 . piazmid (konstrukcióját

1. 80.28983 sz. nagy-britanniai szab. leírásban)

A G-pPLc24 piazmid (amelyet a 10. ábra szemléltet) a β-laktamáz gént és a pBR322től való replikáció kezdőpontját tartalmazza. Egy 290 bázis-párból álló Haell-EcoRI fragmens a λ-bakteriofág R O_L tartományát tartalmazza. A transzkripció iránya a R promotortól az EcoRI hely felé tart. Egy 431 bázis-párt tartalmazó EcoRI-BamHI fragmens kódol a riboszóma kötési helyre és a pMS2-7 plazmidból kapott bakteriofág MS2 replikáz gén első 96 aminosav-maradékára [R. Devos és munkatársai: „Construction and Characterization of a Plasmid Containing a Nearly 22

Fullsize DNA Copy of Bacteriophage MS2 RNA, J. Mól. Bioi, 128, 595-619 (1979)]. Az MS2 replikáz fehérje fragmens transzlációja párhuzamosan halad a R promotortól kezdődő transzkripcióval.

B. A R promotor-aktivitás hőmérséklettől függő megindulása

A pPLa2311, pPLa8 és pPLc24 plazmidokon jelenlevő R promotortól induló transzkripciót elfojtja az, ha a plazmidokat egy a represszor fehérjét szintetizáló E. coli törzsben tartjuk. Autoregulatív szintézis-módja folytán [M. Ptashne és munkatársai: „Autoregulation and Function of a Repressor in Bacteriophage λ, Science, 194, 156—161 (1976)] egy lizogén törzs kromoszómáján levő cl gén egy kópiája képes teljesen elfojtani áz egy sok-kópiájú plazmidon jelenlevő Rpromotort.

A jelen találmányban alkalmazott törzsek a következők voltak:

E. coli Κ12ΔΗΙ [K12 M72 lac_am AtrpEA2 Sm^K (Xcl857 N_am7N_om53AHI bio); U. Bemard és munkatársai: „Construction of Plasmid Cloning Vehicles that Promote Gene Expression írom the Bacteriophage λ R Promoter, Gene, 5, 59—76 (1979)] és

E. coli M5219 [K12 M72 lac_amtrp_amSm^R (XcI857 ΔΗΙ bio252); H. Greer „The kü Gene of Bacteriophage λ, Virology, 66, 589— 604 (1975)].

Mindkét törzs magában hordoz egy mutáns .cl gént hordozó detektív, ki nem metszhető λ profágot. A mutáns gén egy hőmérséklet iránt érzékeny represszorra kódol és így megengedi a R promotortól kiinduló transzkripciónak hőmérséklet eltolása útján történő elindítását: 28°C-nál a represszor aktív és elfojtja a R promotortól kiinduló transzkripciót, de 42°C-nál a represszor inaktiválódik és a R promotortól kiinduló transzkripció megindul.

A profág ΔΗΙ deléciója eltávolítja a cro gén egy részét és valamennyi többi, a cro-tól tovább jobbra levő gént is [ M. Castellazzi és munkatársai: „ Isolation and Characterization of Deletions in Bacteriophage λ Residing as Prophage I E. coli KI2”, Mól. Gén. Génét., 117, 211—218 (1972)]. A cro gén deléciója előnyös, mert ismeretes, hogy a cro fehérje akkumulációja elfojtja a R promotortól induló transzkripciót. [A. Johnson és munkatársai: „ Mechanism of Action of the cro Protein of Bacteriophage λ, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 75, 1783—1787 (1978)]. Emellett az M5219 törzs tartalmazza a bio252 deléciót, amely eltávolítja a clll-tól balra levő összes gént, közöttük a kil gént is.

Az M5219 törzs hőmérséklet általi indukció hatására egy funkcionális hl-gén terméket exprimál. A Κ12ΔΗ1 törzsnek viszont kél borostyán mutációja van N-ben, amelyek funkcionálisan Nmegatívvá teszik. Ismeretes, hogy az N. gén terméke a λ bakteriofágban anti-terminátorként szerepel ]„J. W. Roberts, „Transcription Termination and Laté Cont-2219350?· rol in Pnage λ, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72, 3300—3304 (1975)]. Az anti-terminátor-hatást ugyanígy megfigyeltük oly terminátor-szekvenciák esetében is, amelyek természettől fogva nincsenek jelen a λ-fág DNSben (például a természetes „stop a trp operon végén), amennyiben az RNS-transzkripció a R promotornál indul meg. Emellett a „nonszensz” kodonnak a R transzkriptumban való jelenléte által kiváltott polaritás-hatásokat enyhítette az N-gén fehérje hatása „ áttekintés céljából vő.: N. Franklin és

C. Yanofsky, „The K Protein of λ: Evidence Bearing on Transcription Termination, Polarity and the Alteration of E, coli RNA Polymerase in RNA Polymerase (Cold Srping Harbor Laboratory, 1976) 693—706].

Ezért az említett plazmidoknak a hővel indukálható bakteriális d-háttérben való jelenléte lehetővé teszi a R promotor aktivitásának kísérleti megindítását vagy megszakítását. A Κ12ΔΗΙ vagy M5219 megválasztása pedig lehetővé teszi, hogy a transzkripció végbemenjen akár az N-gén termék távollétében, akár annak jelenlétében is. Ez utóbbi — amint fentebb már említettük — előnyös lehet olyan esetekben, amikor olyan DNS-tartományok transzkripcióját kívánjuk, amelyek terminátorszerű szekvenciákat vagy az RNS-polimerázra lassító hatású szekvenciákat tartalmaznak.

C. Oly kiónok felépítése, amelyek egy R promo.tort tartalmazó plazmidba beiktatott, HuIFN-b-ra kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak

Az alábbiakban a plazmid-DNS elkülönítését, a DNS resztrikciós analízisét és a DNS-fragmensek kapcsolását ismertetjük; e műveleteket azzal a módszerrel végeztük, amelyet a kettősszálú DNS klónozására vonatkozólag leírtunk. A transzformációs lépést is a fentebb leírt módon végeztük, azzal az eltéréssel, hogy amikor Κ12ΔΗΙ vagy M5219 törzset alkalmaztunk gazdaként, akkor 34°C-os hő-sokkolást végeztünk 5 percig, majd a transzformált sejteket 28°C hőmérsékleten inkubáltuk.

1. A G-pPLa-HFIF-67-1 plazmid felépítése

E felépítésnek az elvi alapját az a megfigyelés képezte, hogy a G-pBR322(Pst)/HFIF-6 és G-pBR322(Pst) /HFIF-7 kiónokból származó megfelelő resztrikciós fragmensek kombinálása lehetővé teszi az IFN-β egy teljes, folytonos kódoló szekvenciájának a rekonstrukcióját. Az ebből származó fragmenseknek a különböző felépítési lépéseken keresztüli útját a 8. ábra szemlélteti vázlatosan. A G-pBR322(Pst)/HFIF-6 plazmidot EcoRI és PstI alkalmazásával hasítottuk és az előzőleg Pstl-el és Haell-vel hasított G-pBR322(Pst)/HFIF-7 plazmidhoz ligáltuk. A kapcsolás után az elegyet EcoRI és Haell enzimekkel kezeltük. Ezután ennek az elegynek a négyszeres moláris feleslegét kapcsoltuk a G-pPLa2311 plazmidhoz, amelyet elő44 zőlep Haell és EcoRI enzimekkel kezeltünk. Transzformánsokat az E. coli C600r_krri^(X) törzsben kaptunk (ezt a törzset viszonylag nagy transzformáció-képessége miatt, továb5 bá azért alkalmaztuk,mert egy vad-típusú cl gént tartalmaz),kanamicinnel szembeni rezisztencia alapján történő szelekció útján. A szűrővizsgálatnak alávetett 15 transzformáns közül kettő elveszítette a karbenicillennel szembeni rezisztenciát. Az e transzformánsok plazmidjaiból elkülönített DNS resztrikciós analízise azt mutatta,hogy közülük egynek volt a kívánt G-pPLa-HFIF-67-1 szerkezete, amelyet a 8.ábra szemléltet. Ez a plazmid egyetlen EcoRI helyet és egyetlen PstI helyet tartalmazott. EcoRI-PstI kombinált enzimes kezelés útján két fragmenst kaptunk, amelyek közül a kisebb méretű együtt migrált egy oly fragmenssel, amelyet a G-pBR322(Pst)/HFIF20 -6 EcoRI-PstI alkalmazásával történő kezelés egy körülbelül 650 bázis-párt tartalmazó kis fragmens hasított ki. Ez utóbbi fragmensnek a mérete összhangban van azzal a mérettel, amely a G-pBR322(Pst)/HFIF-6 proximális BglII-Pstl fragmensének a G-pBR322(PsTj/HFIF-7 disztális Pstl-BglII részéhez való kapcsolása után várható volt. HincII-vel való kezelés három fragmenst eredményezett, amint ez a HincII helyeknek a R tartományban való jelenléte alapján várható volt, a β-laktamáz gén amino-terminális részét, valamint a HuIFN-β DNS-szekvenciájának lefordítatlan 5’-végét. Ezt a plazmidot G-pPLa-HFIF-67-1 plazmidnak nevez35 tűk el.

A fent ismertetett resztrikciós analízis alapján történt jellemzés értelmében a G-pPLa-HFIF-67-1 plazmidnak a HuIFN^-ra kódoló teljes szekvenciát kellene tartalmaznia.

A kívánt transzkripció iránya kolineárisan fut a R promotorból induló transzkripcióéval. A R és a HuIFN-β kódoló szekvencia közötti részen a plazmid még mindig tartalmazza a poli (A.T) farkat és egy intervált 3’-vég ₄c fragmenst, ugyanúgy, mint a G-pBR322(Pst)/HFIF-6-ban.

2. A G-pPLa-HFIF-67-12 plazmid felépítése

A felépítés következő lépésében a poli (A.T) farkat az invertált 3’-vég-fragmens egy részét kívántuk eltávolítani a G-pPLa-HFIF-67-1-ből (vö.: 9. ábra). A G-pPLa-HFIF-67-1 DNS-t BglII és Hpall enzimekkel hasítottuk. Minthogy a HuIFN-^-kódoló szek55 vencia nem tartalmaz Hpall helyet, ez a kezelés az ΙΕΝ-β-ra kódolo teljes szekvenciát tartalmazó BglII fragmenst eredményezi és ugyanakkor ínaktiválja a vektor többi részét. A kapott BglII fragmenst a BamHI enzimmel gQ kezelt G-pPLa8 plazmidhoz kötöttük. A BglII és BamHI enzimek azonos lépcsőzött végeket alakítanak ki, úgy, hogy a BglII végek hozzáköthetők egy felnyitott BamHI helyhez és viszont. Az ilyen rekonstruált hely már nem szerepel szubsztrátumként a BglII vagy ⁶⁵ BamHI számára, de a Sau3AI (Mbol) enzim 23

-23193507 fel tudja ismerni [V. Pirotta, „Two Restriction Endonucleases írom Bacillus globigii”, Nucleic Acids Rés., 3, 1747—1760 (1976)]. A ligáció megtörténte után az elegyet ismét hasítottuk BamHI enzimmel, az egyszerűen recirkularizált G-pPLa8 molekulák eltávolítása céljából. Transzformánsokat ismét C600r_Km,f (λ) törzsben kaptunk, kanamicin-rezisztencia alapján szelektálva.

A transzformált agaróz-gélen, a hasítatlan DNS méret-meghatározása alapján történő szűrővizsgálatnak vetettük alá, a fentebb, az IFN-p-rokon rekombináns plazmidok jellemzése esetében leírt módszerrel. Azokat a kiónokat, amelyek az eredeti G-pPLa8nál valamivel nagyobbaknak bizonyultak, további resztrikciós analízisnek vetettük alá, PstI vagy HincII alkalmazásával. Egy olyan kiónt találtunk, amely egyetlen PstI helyet és három HincII helyet tartalmazott. E klón egy fragmense együtt migrált a ζ-tői a β-laktamázig terjedő tartományból származó pPLa8 egyik HincII fragmensével. A klón egy másik kis fragmense körülbelül 400 bázis-párt tartalmazott, összhangban a BglII fragmensnek a G-pPLa8-ba a £ promotor irányában orientáltan történő beiktatásával. Ezt a plazmidot G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidnak neveztük el. Az e plazmid felépítése során alkalmazott lépéseket vázlatosan a 9. ábrán szemléltetjük. E plazmid részletesebb térképét a 11. ábra mutatja. A plazmid méretét (körülbelül 4450 bázis-pár) az alkotó fragmensek mérete alapján becsültük, ez utóbbiakat pedig az agaróz-gélen végzett elektroforézis során mutatott viszonylagos mozgékonyság alapján történő becsléssel állapítottuk meg.

Ezután E. coli Κ12ΔΗΙ és M5219 törzseket transzformáltuk a fentiekben jellemzett G-pPLa-HFIF-67-12 plazmiddal.

A G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidban a BglII/BamHI kötés körüli meghatározott nukleoiid-szekvencia vizsgálata egy érdekes vonást derített fel. Az e plazmid β-laktamáz-kódoló szekvenciájának AUG csoportjánál iniciált polipeptid egy oly kettős amber kodonnál végződik, amely a HuIFN^-ra kódoló szekvencia lefordítatlan 5’-végén belül helyezkedik el. Ezek a terminációs kodonok 23 nukleotiddal a HuIFN-β szignál-peptid iniciáló AUG csoportja előtt helyezkednek el, a következő módon („am jelentése: amber kodon) :

-71 BamH I/Bgl 11

181 kötés

CCC.CGG.AUC.UUC.AGU.UUC.GGA.GGC. Pro Arg . Ile - Phe - Ser - Phe - Gly - Gly AAC.CUU.UCG.AAG.CCU.UUG.CUC.UGG. Asn - Leu - Ser - Lys - Pro - Leu - Leu - Trp CAC.AAC.AGG.UAG.UAG GCGACACUGUHis - Asn - Arg am am

UCGUGUUGUCAAC

AUG-(HuIFN-p szignál-peptidre kódoló szekvencia)-AUG-(érett HuIFN-p-ra kódoló szekvencia) .

A bekeretezett szám a pBR322 β-laktamáz fehérjében levő aminosav-maradékok számára utal (J. Sutcliffe fentebb idézett munkája). A csillag (*) azt jelzi, hogy a pBR322ben az e helyzetben jelenlevő CCU kodon CCCre változott, annak következtében, hogy a pPLa2311-ben levő PstI hely a pPLa8-beli BamHI hellyé alakult át (lásd fentebb).

Ezért ez a felépítés megnyitja a HuIFN-β szignál-peptid AUG csoportjánál történő reiniciáció lehetőségét és ezért szignál-peptidjéhez kötött, de a β-laktamáz valamely részéhez nem kötött IFN-β expressziójának lehetőségét is. Ilyen, az idő előtti terminációt követő belső reiniciációt figyeltek meg az E. coli laktóz operon represszor génjében [ T. Platt és munkatársai: „Translational Restarts: AUG Reinitiation of a lac Repressor Fragment”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 897— 901 (1972) ]. Ez a felépítés lehetővé teheti érett HuIFN-β extrécióját a HuIFN-β szignál-szekvencia helyes bakteriális felismerése útján.

3. A G-pPLa-HFIF-67-12A19 plazmid felépítése

A pBR322 ismert szekvenciája és a HuIFN-β-kódoló szekvencia ismerete alapján levezethető, hogy a kis HincII fragmensnek a G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidból (a β-laktamáz belsejétől 3 nukleotiddal az AUG csoportot iniciáló hUIFN-szignál-peptid előttig) való deléciója egy folytonos transzlációs leolvasó-fázist eredményez, amely a β-laktamáz AUG csoportjánál kezdődik és a HuIFN-β-kódoló szekvencia után végződik. Erről a szerkezetről tehát megjósolható, hogy egy oly polipeptidre kódol, amely a β-laktamázkódoló szekvencia 82 aminosav-maradékából, egy az összekapcsolt HincII helyen kódolt aminosavból, aHuIFN-β szignál-peptidből és az érett HuIFN-p-kódoló szekvenciából áll, vagyis az alábbi felépítésű:

GUU.AAC.AUG-(HuIFN-p szignál-peptid kóVal - Asn - Met ‘doló szekvencia) AUG (érett HuIFN-β-kódoló szekvencia)

A bekeretezett szám a pBR322 β-laktamáz-fehérjében levő aminosav-maradékok számára utal (vö.: J. Sutcliffe fentebb idézett munkája). Ezért ez a szerkezet képes lehet egy olyan egyesített polipeptid exprimá’ására, amely a β-laktamáz egy részéből, az ehhez egy aminosavon keresztül kapcsolt HuIFN-β szignál-peptidből és az ehhez kapcsolódó érett HuIFN^-ból áll. Egy ilyen fúziós fehérje kiválasztódhat a sejtből.

A G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidot részlegesen lebontottuk HincII enzimmel való kezelés útján. A körülbelül 0,01 pg/ml DNSkoncentrációnál történő kapcsolás után a DNS-t XorlI alkalmazásával hasítottuk (ez a Pvul izoszkizomerje, amely kiálló 3’-vége-24193507 két alakít ki, vő.: R. Wang és munkatársai, Biochim. Biophis. Acta, sajtó alatt), majd alacsony DNS-koncentrációnál ismét kapcsoltuk. Az eredeti G-pPLa-HFIF-67-12 két XorlI helyet tartalmazott: az egyik hely inaktiválja a kanamicin-gént, a másik pedig a plazmidból eltávolítandó HincII fragmensben van. Az XorlI enzimmel történő kezelési és újrakapcsolási lépésnek az a célja, hogy kiküszöböljük a HincII enzim által nem hasított eredeti DNS-molekulákat. Az ilyen molekulákban két XorlI hely van és a kapcsolás során' alkalmazott körülmények között a két fragmens újbóli egyesülése igen valószínűtlen. Transzformánsokat CGOOnCm^IZj-ban kaptunk, ezeket kanamicinre szelektáltuk és resztrikciós analízis útján szűrővizsgálatnak vetettük alá őket egyetlen Pvul helyet tartalmazó transzformánsok kiszűrésére. A kiónok további analízisét HincII enzimmel való kezeléssel végezték. Egy olyan kiónt találtunk, amelyből hiányzott a legkisebb HincII fragmens, de egyébként azonos volt a G-pPLa-HFIF-67-12 plazmiddal, ezt G-pPLa-HFIF-67-12A19-nek neveztük el. Az e plazmid felépítése során alkalmazott lépéseket vázlatosan a 9. ábra szemlélteti. E plazmid részletesebb térképe a 12. ábrán látható. A plazmid méretét (körülbelül 4050 bázis-pár) az őt alkotó fragmensek méretének összegezése útján becsültük meg; a fragmensek méretét viszont az agaróz-gélen végzett elektroforézis során mutatottt viszonylagos motilitásuk alapján becsültük. Ezután az E. coli Κ12ΔΗΙ és M5219 törzseket transzformáltuk a fentiekben jellemzett G-pPLa-HFIF-67-12A19 plazmiddal.

4. A G-pPLc-HFIF-67-8 plazmid felépítése

A G-pPLc24 plazmid egy másik lehetőséget nyújt HuIFN-β szekvenciáknak oly módon történő’beiktatására, hogy ezzel egy másik fúziós polipeptid legyen szintetizálható. A G-pPLa-HFIF-67-1 plazmidból származó BglII fragmensnek a G-pPLc24 plazmid BamHI helyére történő beiktatása egy folytonos leolvasó-fázist eredményez, amely az MS2 replikáz-génből származó 98 aminosav-maradékra kódol [W. Fiers és munkatársai: „Complete Nucleotide Sequence of Bacteriophage MS2 RNA: Primary and Secondary Structure of the Replicase Gene, Natúré, 260, 500—507 (1976)] és amelyhez a BglII hely és a HuIFN-β szignál-szekvenciájának kezdő ALJG csoportja között helyet foglaló, 27 aminosav-máradékra kódoló szekvencia csatlakozik és ezt a HuIFN-β szignál-peptid és az érett HuIFN-β kódoló szekvenciája követi:

UUG GAU.CUU.CAG.UUU.CGG.AGG.CAA. Trp - Asp - Leu - Gin - Phe - Arg - Arg - Gin CCU.UUC.GAA.GCC.UUU.GCU.CUG.GCA. Pro - Phe - Glu - Alá - Phe - Alá - Leu - Alá 48

CAA.CAG.GUA.GUA.GGC.GÁC.ACU.GUU. Gln-Gln - Val - Val - Gly - Asp - Thr - Val CGU.GUU.GUC.AAC.AUG- (HuIFN-β szigArg - Val - Val - Asn - Met nál-peptidre kódoló szekvencia)-AUG-(érett kódoló szekvencia).

A bekeretezett szám az MS2 repJikáz •gén-fehérjében levő aminosav-maradékok számát mutatja (R. Devos és munkatársai fent idézett munkája: W. Fiers és munkatársai idézett munkája). Ezért ez a szerkezet képes lehet egy olyan kapcsolt polipeptid exprimálására, amely az MS2 replikáz egy részéből, a 27 aminosavon keresztül ezzel összekötött HuIFN-β szignál-peptidből és az utóbbival összekötött érett HuIFN^-ból áll.

A G-pPLa-HFIF-67-1 DNS-t BglII emésztő enzimmel, kezeltük,majd kapcsoltuk a BamHI enzimmel hasított G-pPLc24 DNS-sel. A kapcsolási elegyet újból hasítottuk BamHI-vel.hogy kiküszöböljük a reagálatlan pPLc24 molekulákat,majd CéoOr^mJ (λ)-ba transzformáltuk, karbenicilinnel szembeni rezisztencia alapján szelektálva. A transzformánsokat HincII-vel való resztrikció útján analazáltuk. A pPLc24 resztrikció-helyeinek ismert helyzete alapján várható, hogy a BglII-IFN-β fragmensnek a ζ irányában orientált értelmű beiktatása egy körülbelül 650 bázis-párból álló extra HincII fragmenst hozzon létre. Egy e konfigurációt mutató reprezentatív kiónt pPLc-HFIF-67-8 megjelöléssel láttuk el. Az e plazmid felépítése során alkalmazott lépéseket vázlatosan a 10 ábra mutatja. E plazmid részletesebb térképe a 13. ábrán látható. A plazmid méretét (körülbelül 3850 bázis-pár) az őt alkotó fragmensek méretének öszszegzése alapján becsültük, míg a fragmensek méretét agaróz-gélen végzett elektroforézis során mutatott mobilitásuk alapján állapítottuk meg. E. coli Κ12ΔΗΙ és M5219 törzseket transzformáltunk a fenti módon jellemzett G-pPLc-HFIF-67-8 plazmiddal.

5. A G-pPLa-HFlF-67-12A279T plazmid felépítése

A pKT279 plazmidot (K. Talmadge Eukaryotic Signal Sequence Transports Jusulin Antigén in E. coli, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77, 3369—73 helyen ismertetett módon pBR322ből előállítva; a pK.T279 plazmid a pBR322 plazmid oly származéka, amelyben a β-laktamáz génjének egy része deléció folytán hiányzik és egy PstI hely van benne a β-laktamáz 2. aminosavánál kialakítva) PstI emésztő-enzimmel kezeltük, majd a 3’-terminális extenziót eltávolítottuk és a fragmenst tompavégűvé alakítottuk E. coli DNS-polimeráz I enzimmel való kezelés útján (Klenov-fragmens) dezoxinukleozid-trifoszfátok jelenlétében. A pKT279 plazmid Pstl-linearizált és 3’-tompavégű DNS-fragmensét azután EcoRI emésztő-enzimmel kezeltük, hogy így egy oylan fragmenst állítsunk elő, amely többek között a β-laktamáz szignál szekvenciájára

-25193507 és az érett fehérje első négy aminosavára kódol.

Ezt a kis fragmenst ezután arra használtuk, hogy a pPLa-HFIF-67-12A19 plazmid Hpal-EcoRI fragmensébe (amelyben a Hpal hely a G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidból a fent leírt módon történt deléció következményeképpen jött létre) helyezzük, a Hpal-EcoRI-resztrignált pPLa-HFIF-67-12A19-nek e fragmenssel T4 DNS-ligáz jelenlétében történő kapcsolása útján.

A PstI (tompavégíisített)-Hpal kötésnél előre várhatóan kialakult szekvencia tehát a következő:

(β-laktamáz szignál-peptidet kódoló szekvencia)-CAC.CGC.AAC.AUG-(HuIFN-β szignálHis - Arg - Asn-Met

-peptidet kódoló szekvencia)-AUG-(érett HuIFN^-kódoló szekvencia).

így tehát a felépítés eredményeképpen a következő szerkezetet kapjuk: az IFN-β előtt két szignál-szekvencia áll tendemben, egy bakteriális szignál-szekvencia (β-laktamáz) és az IFN-β szignál-szekvencia, amelyeket néhány aminosav köt össze egymással. Ezért ez a szerkezet képes lehet a két szignál-peptiddel összekötött érett HuIFN-β exprimálására; vagy ha a bakteriális szignál-szekvencia és a HuIFN-β szignál-szekvencia tendem-kombinációját a baktériumok felismerik és helyesen hasítják, akkor ez a szerkezet képes lehet az érett HuIFN-β exprimálására és a sejtből való kiválasztására.

E. coli M5219 törzset transzformáltunk a pPLa-HFIF-67-12A279T-vel.

6. A G-pPLa-HFIF-67-12A218Ml plazmid felépítése

A pKT218 plazmidot (K- Talmadge id. h. ismertetett módon előállítva; a pKT218 plazmid a pBR322 oly származéka, amelyben a β-laktamáz génjének egy része és ennek szignál-szekvenciája deléció folytán hiányzik és amelynek a β-laktamáz szignál-szekvenciája 4. aminosavánál kialakított PstI helye van) EcoRI és Alul emésztő enzimmel kezeltük, hogy így egy olyan fragmenst képezzünk, amely többek között a β-laktamáz szignál-peptid kezdeti részére kódol. Ezt a fragmenst T4 DNS-ligáz jelenlétében kapcsoltuk a pPLa-HFIF-67- 12A19 Alul emésztő-enzimmel 0,05 mmol/1 aktinomicin D jelenlétében való kezelés és EcoRl-vel való resztrikció útján előállított fragmenssel (az aktinomicin D-t a fenti kezelés során abból a célból alkalmaztuk, hogy ezáltal resztringáljuk a plazmidot az IFN-β szignál-peptid Alul helyénél).

A kapott plazmid, amelyet pPLa-HFIF-67-12Δ218Μ1 plazmidnak neveztünk el a β-laktamáz szignál-peptidre kódoló gén kezdeti részét, aHuIFN^-ra kódoló szignál-peptidre kódoló gén egy részét és az érett HuIFN-β-ra kódoló gént tartalmazta. A plazmid_ vonatkozó tartományának előre megjósolt szekvenciája a következő:

ra—

CAA GCU.CUU.UCC.AUG-(érett HuIFN-βGln - Alá - Leu - Ser - Met -kódoló szekvencia)

A bekeretezett szám a pKT218 plazmid β-laktamáz szignál-peptidjében levő aminosav-maradékok számát jelzi. Ezért ez a szerkezet lehetővé teheti az egy bakteriális szignál-szekvencia egy részéhez és a saját szignál-szekvenciája egy részéhez kötött érett HuIFN-β expresszióját. Itt is, ha a gazda-baktérium felismeri és helyesen hasítja a hibrid szignál-szekvenciát, akkor érett HuIFN-β lesz exprimálható ebből a plazmidból és kiválasztható a sejtből.

E. coli M5219-et transzformáltunk a pPLa-HFIF-67-12A218Ml-gyel.

7. A G-pPLa-HFIF-67-12AMl plazmid felépítése.

A pPLa-HFIF-67-12A19 plazmidot a fentebb leírt módon linearizáltuk Alul enzimmel 0,05 mmol aktionimicin D jelenlétében, hogy egy metszést hozzunk létre az Alul helyen a HuIFN-β szignál-peptidjében. Hpal enzimmel való kezelés után a DNS-recirlíularizáltuk T4 DNS ligáz jelenlétében. A kapott plazmid, amelyet pPLa-HFIF-67-12AMl-nek neveztünk el, az érett ΙΕΝ-β-ra kódoló DNS-szekvenciát megelőző IFN-β szignál-szekvenciának csak egy kis részét tartalmazta.

A kapcsolat előre látott szekvenciája a következő:

GUU CUC.UUU.CCA.UGA.

Val -[Leu - Phe - Pro - STOP |A UG-(érett HuIFN^-kódoló szekvenciái

A függőlegesen bekeretezett szám a β-laktamázban jelenlevő aminosav-maradékok számára utal. A vízszintesen bekeretezett rész a második leolvasó-fázisban levő szekvenciát mutatja. Ezért a β-laktamáz-kódoló szekvencia és a HuIFN-β szignál-pep tidjére kódoló szekvencia fennmaradó részének a transzlációja meg van állítva az UGA-stop kodonnál. Az érett IFN-β start-kodonja (AUG) azonban jelen van ugyanazon a helyen, bár egy másik, különböző leolvasó fázisban. Ezért a transzláció újra kezdődhet ezen a ponton, hogy érett HuIFN^-t hozzon létre.

E. coli M5219 törzset transzformáltunk a pPLa-HFIF-67-12AMl plazmiddal.

8. A G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2 plazmid felépítése.

A pPLa-HFIF-67-12Á19 plazmidot Hpal enzimmel linearizáltuk és BAL 31 exonukleazzal kezeltük, hogy bázis-párokat távolítsunk el sorozatosan a linearizált DNS-frag.mens végéről [H. Gray és munkatársai: „Extracellular Nucleases of Pseudomonas Bal 31

1. Characterization of Single Strand-Specific Deoxyribendonuclease, Nucleic Acids Rés.,

2, 1459—1492 (1975)]. Az exonukleázzal va-26193507 ló kezelés időtartamának és körülményeinek a változtatása útján oly DNS-fragmensek egész sorát állítottuk elő, amelyek különböző számú nukleotidot tartalmaznak az érett HuIFN-β AUG start-kodonját megelőző és a HuIFN-β szignál-pepiidre kódoló szekvenciából (amennyiben egyáltalán tartalmaznak ilyen nukleotidokat). Ezeket a íragmenseket azután úgy manipulálhatjuk, hogy riboszómás kötési helyeket szerkesszünk meg különböző távolságokra a start-kodontól és ezzel létrehozzuk a kívánt szekunder struktúrát' e kodon közelében, hogy ezzel elősegítsük az érett HuIFN-β expresszióját.

Az endonukleázzal kezelt íragmenseket E. coli DNS-polimeráz I enzimmel (Klenow-fragmens dATP és dGTP jelenlétében történő kezelés útján tompavégüekké alakítottuk át, hogy kitöltsük az esetleg kiálló 5’-végeket. Ezután egy kétszálas Xhol összekötőtagot, amely az 5’-CCTCGAGG-3’ szekvenciát tartalmazta (Collaborative Research), kapcsoltunk a tompavégű DNS-íragmensekre. Ezeket a íragmenseket ezután egy kétszálas EcoRI kapcsolótaggal toldottuk meg, amely az 5’-CCGAATTCGG-3’ szekvenciát tartalmazta (Collaborative Research). EcoRI enzimmel való kezelés után a „ragadós EcoRI végeket tartalmazó íragmenseket recirkularizáltuk E. coli DNS-ligázzal. E ligáznak a T4 DNS-ligáz helyett való használata révén elkerüljük a tompavégű fragmensek recirkularizációját.

Egy plazmidot választottunk ki és ezt pPLa -HFIF-67-12A19 BX-2 plazmidnak neveztük el. Ennek egy Xhol helye van, körülbelül 25 bázis-párral az érett HuIFN-β AUG start-kodonja előtt. Az Xhol helyet megelőzi egy EcoRI hely is, amelyet a Hpaí fragmens EcoRI kapcsoló tagjának a pPLa-HFIF-67-12A19 plazmid £ promotorját éppen megelőző EcoRI helyhez történt kapcsolása hozott létre. Ezért a β-laktamáz-kódoló szekvencia kiiktatásra került. Továbbá, minthogy a HuIFN-β szignál-szekvenciának legalább egy részét eltávolítottuk, csakis érett HuIFN-β expressziója lehetséges.

E. coli K12AHI-t transzformáltunk a pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2 plazmiddal.

A baktériumok által termelt HuIFN-β elkülönítése és jellemzése

A) Baktérium-kivonatok készítése 1. Indukciós eljárás

50% glicerin és 50% LB közeg elegyében —80°C hőmérsékleten megfagyasztott törzs-kultúrákból, közöttük a fent leírt IFN-β fragmenseket tartalmazó plazmidokkal transzformált Κ12ΔΗΙ és M5219 törzsek kultúráiból vett alikvot részeket a kívánt antibiotikumot tartalmazó friss LB közegre oltottunk és 28°C hőmérsékleten telítődésig szaporítottuk a kultúrákat. Antibiotikumot nem tartalmazó LB közeg két 500—500 ml-nyi adagját a telített sejt-tenyészetek 1 — 1 ml-jével oltottuk be és élénk rázás közben 28°C hőmérsékleten tenyésztettük őket 2,10⁸/ml sejt-sűrűségig. Az egyik adagot 42°C hőmérsékletre emeltük és tovább ráztuk. Az alkalmazott plazmidtól függően a kultúrát a 42°C-ra való hőmérséklet-emelés után különböző időkben gyűjtöttük be. A mindvégig 28°C hőmérsékleten tartott kontroli-kultúrát ugyanakkor gyűjtöttük be, amikor a 42°C-on tartott kultúrát. A sejteket egy GSA rotorban (Sorvall) percenként 8000 fordulattal 10 percig történő centrifugálással gyűjtöttük össze. A szilárd üledéket 50 mmol/1 trisz-HCl-t (pH= =7,4) és 30 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmazó oldat 20 ml-jével mostuk, majd egy SS34 rotorban (Sorvall) újra centrifugáltuk, 10 pecig, percenként 10 000 fordulattal. A szilárd üledéket szárazjég-metanol keverékkel gyorsan megfagyasztottuk és —80°C hőmérsékleten tároltuk. Olyan esetekben, amikor az összegyűjtött sejteket ozmózisos sokknak kívántuk alávetni, ezt a fagyasztási műveletet mellőztük.

A baktériumok líziáére és extrahálására két különböző eljárást alkalmaztunk.

2. Extrakciós eljárások „A lízis

A sejteket a fent ismertetett pufferoldat összesen 4 ml térfogatában újból szuszpendáltuk és lizozim (Sigma) enzimet adtunk hozzá 1 mg/ml koncentrációig, majd 0°C hőmérsékleten 30 percig inkubáltuk. Ezután a szuszpenziót két megfagyasztási-felolvasztási ciklusnak vetettük alá oly módon, hogy felváltva —80°C hőmérsékletű etanol-szárazjég keverékbe és 37°C hőmérsékletű vízfürdőbe merítettük. Az S-100 frakciót a lizált baktériumok 4 ml ultracentrifugálásával állítottuk elő; ezt a műveletet egy Beckman SW60 Ti rotorban, pecenként 60 000 fordulattal, 4°C hőmérsékleten egy óra hosszat folytattuk, majd a szupernatáns folyadékot használtuk fel tovább.

„B” lízis

A „B lízist a fent leírt „A lízishez hasonlóan végeztük, azzal az eltéréssel, hogy az 50 mmol/1 trisz-HCI-t (pH=8,0) és 30 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldat helyett 50 mmol/1 HEPES (Sigma)-nátrium-kloridot (pH=7,0), 30 mmol/1 nátrium-kloridot, 3 mmol/1 β-merkapto-etanolt és 3% újszülött borjú szérumot (Gibco) tartalmazó oldatot alkalmaztunk.

Ozmózisos sokk.

A centrifugálás során kapott sejt-üledéket közvetlenül az elkülönítés és mosás után újból szuszpendáltuk egy 20% szacharózt, 100 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat és 100 mmol/1 trisz-HCl-t (pH=7,4), 1.10'°/ml maximális sejt-sürüséggel. A szuszpenziót 10 percig jégen tartottuk, majd 10 percig centrifugáltuk percenként 10 000 fordulattal egy Sorvall SS34 rotorban. A szacharózoldatot óvatosan leöntöttük a csőből és az üledéket

-27193507 ugyanolyan térfogatú vízben szuszpendáltuk, így a sejtsűrűség újból 1.10‘°/ml volt. Az újból szuszpendált sejteket 10 percig jégen tartottuk, majd ismét 10 percig centrifugáltuk a Sorvall SS34 rotorban percenként 10 000 fordulattal. A szupernatáns folyadékhoz 3% koncentrációig fetális borjú szérumot, 50 mmol/1 koncentrációig HEPÉS puffért (pH=7), 30 mmol/1 nátrium-kloridot és 3 mmol/1 β-merkapto-etanolt adtunk. Az így kapott szupernatáns folyadékot („ozmózisos sokk-szuszpernatáns) 0°C hőmérsékleten tároltuk.

3. Lecsapás ammonium-szulfáttal

0,5 ml kontroli-oldathoz vagy S-100 extrakthoz 1 ml szobahőmérsékleten telített ammonium-szulfát-oldatot adtunk. Az elegyet legalább 30 percig jégen tartottuk, majd a csapadékot egy Éppendorf-centrifugában, szobahőmérsékleten 10 percig folytatott centrifugálással tömörítettük. Az elkülönített üledéket újból feloldottuk foszfáttal pufferezett nátrium-klorid (PBS) oldatban.

B) Interferon-titrálások

1. Közvetlen vírus-ellenes vizsgálat

A HuIFN-β meghatározását Sterilin-féle mikrotiter-tálcákon végeztük, a CPE (citopátiás effektus) inhibiciós módszerrel kromoszóma 21-re triszómás humán fibroblasztban. A sejteket felhasználás előtt egy nappal oltottuk a közegre, a minta sorozatos hígításával (log_l0=0,5) 24 óra hosszat inkubáltuk, majd índiana-törzsű vezikuláris sztomatitisz-vírussal (VSV) kezeltük; egy olyan vírustörzs-tenyészet 10“hígításait alkalmaztuk, amely milliméterenként 10⁶’⁹ C-929 egér plaque-képző egységet tartalmazott. A citopátiás hatást a VSV-kezelés után 24 órával regisztráltuk és az interferon-végpontnak azt a minta-hígítást tekintettük, amely a vírusos citopátiás hatás 50%-os csökkenését eredményezte. Valamennyi meghatározás során egy belső HuIFN-β standardot is alkalmaztunk, amelyet viszont az USA Nemzeti Egészségügyi Intézet G023-902-527 jelű humán fibroblasztjára kalibráltunk.

A kromoszóma 21-re triszómás sejtvonalat (a továbbiakban ezt T₂₁ megjelöléssel említjük) egy Down-féle szindrómában szenvedő nőbetegtől bőr-biopszia útján szereztük. Meghatároztuk ennek a kariotípusát és azt találtuk, hogy diploiditást mutat valamen?nyi kromoszómára a (triszómás) kromoszóma 21 kivételével. Ennek a sejtvonalnak az interferonnal szembeni érzékenysége összehasonlíthatónak látszik a triszómás sejtvonalak E. Clercq és munkatársai [„Non-antiviral Activities of Interferon are nőt Controlled by Chromosome 21”, Natúré, 256, 132— 134 (1975) és „Chromosome 21 does nőt co-_f de fór an Interferon Receptor, Natúré, 264, 249—251 (1976)] által leírt kromoszóma 2.1 iránti érzékenységével.

Más ilyen meghatározásokban az E,SM sejtvonalat alkalmazták [A. Billiau és munkatársai: „Humán Fibroblast Interferqn fór Clinical Trials: Production, Partial Purification and Characterization, Anti-microbial Agents and Chemotherapy, 16, 49—55 (1979)]. Ez a sejtvonal egy diploid fibroblaszt, amely diszómás kromoszóma 21-re és amely egy kéthónapos emberi méhmagzatból származik. A T₂₁ sejtvonallal összehasonlítva, az E[SM sejtvonal egy nagyságrenddel, (egy 10-es faktorral) kevésbé érzékeny HuIFN-^-val szemben.

2. Vizsgálat 2,5-A szintetáz alkalmazásával

Egy másik módszer interferon jelenlétének a kimutatására a 2,5-A szintetáz enzim alkalmazásán alapul. Kimutatták, hogy az interferon indukálja ezt az enzimet, amely az adenozin-trifoszfátot (ATP) a 2,5-A trimerjeivé (és kisebb mértékben dimerjeivé, tetramerjeivé és multimerjeivé) alakítja át [A. Kimchi és munkatársai: „Kinetics of the Induction of Three Translation Regulatory Enzymes by Interferon, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,76, 3208—3212 (1979)].

Az E,SM sejtek (vő.: A. Billian és munkatársai, i.m.) kultúráit tartalmazó konfluens 25 ml-es palackok tartalmát 20 óra hoszszat baktérium-kivonatok vagy kontroli-interferon MÉM-10% fetális borjú-szérummal készített 1:6 hígításával kezeltük. A kultúrákat 0,25% tripszinnel és 0,17% etiléndiamin-tetraecetsavval választottuk le, majd 35 millimolos nátrium-klorid-oldattal alaposan mostuk őket. Valamennyi következő műveletet 4°C hőmérsékleten folytattuk le. A sejteket egy Dounce üveg-homogenizátorban, 10 mmol/1 kálium-kloridot, 1,5 mmol/1 magnézium-acetátot és 0,5 mmol/1 ditiotreitolt tartalmazó 20 mmolos HEPES (pH=7,4) pufferoldat (I. 1 ízis-puffér) 1,5—2,0 tf.-nyi menynyiségben homogenizáltuk. A homogenizátumot 20 percig centrifugáltuk 10 000 g-vel, majd a szupernatáns folyadékot (S10) — amennyiben nem azonnal dolgoztuk fel tovább — cseppfolyós nitrogénben tároltuk.

Konfluens 96-tartáIyos mikrotiter-lemezekben (0,28 cm²-es tartályonként 10⁵ sejt 0,2 ml folyadékban) a fentebb leírt módon interferonnal vagy megfelelő baktérium-kivonatokkal kezeltük a sejteket. 20 órai kezelés után a lemezeket jégen lehűtöttük, majd háromszor mostuk őket 140 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmazó 35 mmol/-os trisz-pufferoldattal (pH=7,5). A kultúrákat azután oly módon lizáltuk, hogy mindegyik tartályhoz 5 μΐ 0,5% Nonidet P40-et és 1 mmol/1 fenil-metánszulfonil-fluoridot (PMSF) tartalmazó I. lízis-pufferoldatot adtunk. Jégen 20 percig élénken ráztuk a lemezeket, majd a sejt-lizátumokat összegyűjtöttük és a fentebb leírt módon 20 percig centrifugáltuk 10 000 gvel.

A fent leírt módon („A” lízis vagy „B lízis) előállított 3,5 μΐ lizátumot 6 μΙ

-28193507

100 mmol/1 kálium-acetátot, 10 mmol/1 HEPES/KOH puffért (pH=7,4) 5 mmol/1 adenozin-trifoszfátot, 4 mmol/1 fruktóz-1,6-bisz-foszfátot, 1 mmol/1 ditiotreitolt, 20 pg/ml poli (I) .poli (C)-t és 2 pCi liofilizált (α-³Φ)-ΑΤΡ4 (400 Ci/mmol, a Radiochemical Centre, Amersham, Nagy-Britannia, készítménye) tartalmazó inkubációs elegyben óra hosszat inkubáltunk. A reakciót 95°C hőmérsékleten 3 percig tartó melegítéssel megszakítottuk, majd derítés céljából 2 percig 9000 g-vel centrifugáltuk a mintákat, amelyeket ezután 150 egység/ml (borjúbélből származó) alkalikus foszfatázzal (a Boehringer, Mannheim cég 405 612 katalógus-számú terméke) kezeltünk 37°C hőmérsékleten 1 óra hosszat, centrifugálással újra derítettünk, végül pedig mintaként 1 μΐ mennyiséget polietilénimin-cel lulóz vékonyrétegű lemezre („Polygram, cél 300 ΡΕΓ, 20x20 cm, a Macherey-Nagel Co., Duren, NSZK terméke) cseppentettünk. A lemezeket 2—2 liter desztillált vízzel kétszer mostuk, vákuumban megszárítottuk, majd 1 molos ecetsavoldatban 2— óra hosszat kromatografáltuk őket. Megszárítás után a lemezeket autoradiográfiának vetettük alá 1—24 óra hosszat.

C) A HuIFN-β aktivitás kimutatása baktérium-kivonatokban

1. Kontroli-kísérletek.

A fent leírt vizsgálatok kivitelezése során két fő problémával kerültünk szembe. Mindkét probléma fontos a vizsgálati adatok értelmezése szempontjából. A fentebb leírt módszerekkel végzett lízisből kapott baktérium-kivonatokról (beleértve a kontroli-kivonatokat is) úgy látszott, hogy azok egy az interferonnal nem rokon faktort is tartalmaztak, amely a vizsgálat során vírus-ellenes aktivitást mutatott. Nem világos, hogy ez a faktor maga volt-e vírus-ellenes hatású, vagy pedig a szóbanforgó faktor esetleg valamely vírus-ellenes anyagot, például interferont indukált-e a vizsgálat körülményei között. E faktor jelenlétét ismételten felisme’rtük az S100 kivonatokban. A faktor aktivitása — talán a sejt-sűrűség következtében — gyakran nagyobb volt az E. coli HB101 kontroli-kivonatokban, mint a Κ12ΔΗΙ vagy M5219 gazda-baktériumokból készített hasonló kontroll-kivonatokban, ahol a faktor aktivitása mindig körülbelül 0,7 log₁₀/ml alatt volt. E faktor vírus-ellenes aktivitását csökkentette, sőt olykor teljesen meg is szüntette az ammónium-szulfáttal való lecsapás, amelyet a kontroli-kísérletekben az interferon lecsapását is eredményező feltételek között végeztünk.

Az e szennyező faktornak tulajdonítható vírus-ellenes aktivitás következtében nehéz lenne következtetéseket levonni interferon nyomnyi mennyiségeinek a baktérium-kivonatokban való jelenlétére vonatkozóan. Lehetséges volt azonban különbséget tenni az említett faktor vírus-ellenes aktivitása és az autentikus interferon aktivitása között

E^M diploid fibroblasztok alkalmazása útján. Ezek a sejtek kevésbé érzékenyek HuIFN-β iránt, mint a kromoszóma 21-re triszómás közönséges sejtek. Sokkal érzékenyebbek azonban a faktorral szemben, mint a valódi interferonnal szemben. így például pMS2-7 [R. Devos és munkatársai: „Construction and Characterization of a Plasmid Containing a Nearly Full-size DNA Copy of Bacteriophage MS2 RNA, J. Mól. Biok, 128, 595-619 (1979)] E. coli Hl 101-ben [H. Boyer and D. Rouland-Dussoix, „A Complementation Analysis of Restriction and Modification of DNA in Escherichia coli, J. Mól. Bioi., 41, 459— 472 (1969)] vagy K12AHI-G-pPLa231 l-ban mint kontroll-lizátumban való alkalmazása esetén az alábbi táblázatban összefoglalt adatokat kapjuk; a log₁₀ egység/ml-ben mért vírus-ellenes jól mutatják ezt a viszonylagos hatás-különbséget.

T_2l E,SM

HB101-pMS2-7 („A lízis) 0J

HB101-pMS2-7 („B lízis, de β-merkapto-etanol és borjú-

-szérum nélkül) HB101-pMS2-7 („B	lízis)	<0,2	1,2 0,7
HB101-pMS2-7 („B	lízis)	0,2	1,0
HB101-pMS2-7 („B	lízis)	0,7	2,5
K12AHI-G-pPLa2311	(„B
lízis		0,2	4,0
K12AHI-G-pPLa2311	(42°C,
ozmózisos sokkal kezelve)	0,5	>1,7

Emellet autentikus HuIFN-β jelenlétére mutat a T_2I:E,SM érték-viszony különbsége és a nagy T₂₁ érték a faktor jelenléte esetén kapett értékekhez viszonyítva, amint ezt az alábbi táblázat adatai mutatják:

		T2.	E,SM
az ozmó-	K12AHI-G-pPLa2311
zisos sokk	(42°C)
szuperna- tánsa	K12AHI-G-pPLa2311	0,5	2,5
	(42°C) -pautentiküs HuIFN-β	1,5	2,5
„B lízis	HB101-pMS2-7	0,2	2,5
ÍNH4)2SO4	HB101-pMS2-7+
lecsapás	-pautentikus HuIFN-
után	-β (lízis előtt hozzáadva	2,7	2,5

Ezért a T₂,:E,SM aktivitás-viszony és a T_2I sejteken mutatott abszolút aktivitás mérése alapján lehetségessé válik a fentebb leírt vírus-ellenes vizsgálati módszer alkalmazása a HuIFN-β baktérium-kivonatokban való jelenlétének egyértelmű kimutatására. Megjegyzendő továbbá, hogy a jelen találmány szerinti plazmidok valamelyikével, például a G-pPLa-HFIF-67-12, G-pPLa-HFIF-67-12Δ19, G-pPLc-HFIF-67-8, G-pPLa-HFIF-67- 12Δ279Τ, G-pPLa-HFIF-67- 12Δ218MI, G-pPLa-HFIF-67-12AMI vagy G-pPLa-HFIF-67-12Δ19 BX-2 plazmiddal transzformált E. coli (akár Κ12ΔΗΙ, akár M5219) kultúrák kivonatai esetében az említett ismeretlen faktornak a vírus-ellenes vizs29

-29193507 gálati módszerre gyakorolt zavaró hatása kevésbé súlyos. Ezekben a vizsgálatokban a nem nagy koncentrációjú kivonatokban (például 6,10® sejt/ml koncentrációjú 150 ml-es kultúrák sejtjeit lizáltuk és 4 ml térfogatú kivonatokat készítettünk belőlük) az ismeretlen faktornak tulajdonátható vírus-ellenes aktivitás csekély vagy ki sem mutatható mértékű volt.

Ennek a szennyező faktornak a jelenléte kimutatható volt a 2,5-a szintetáz aktivitás mérésén alapuló vizsgálati módszer esetében is. Itt azonban az ammónium-szulfáttal való lecsapás útján ez a faktor teljesen kiküszöbölhető. Ezért e vizsgálati módszerrel is egyértelműen kimutatható a HuIFN-β tényleges jelenléte a baktérium-kivonatokban és megkülönböztethető az említett szennyező faktor jelenlététől.

Az E. coli HB10Í/G-pBR322(Pst)/HFIF-6 kolineáris kódoló szekvenciája nem teljes (csupán a néhány utolsó bázis-pár hiányzik) és ezért nem képes érett polipeptidet exprimálni; ennek kivonatai ismételten mutattak pozitív 2,5-A szintetáz-aktivitást, felismerhető vírus-ellenes aktivitást azonban ezekben eddig nem tapasztaltunk. Ez a körülmény arra mutat, hogy a 2,5-A szintetáz-próba nem tekinthető a teljes baktérium-termelte interferon jelenléte egyedüli kritériumának. Azt is mutatja továbbá, hogy a komplett érett interferonhoz képest hiányos terméknek is lehet hasznos aktivitása.

A 2,5-A szintetáz-aktivitás mérése ³²P rádióaktív foszfornak a 2,5-A trimerbe való beépítésén és autoradiográfián alapul. A háromszor megismételt kísérletek eredményeit az

HB1O1-pMS2-7 (B lízis, de + IFN-β β -merkapto-etanol vagy borjúszérum nélkül)

IFN-f^bak- (ugyanaz a kezetériumok lés, mint B nélkül) lízisben)

További kísérleteket végeztünk az IFN-β aktivitás stabilitásának és kinyerésének a vizsgálatára. Az ammónium-szulfáttal akár baktérium-kivonatok jelenlétében, akár enél(NHi,) 2 SO4-I ecsapás

IFN-β

IFN-β

HB101-pMS2-7 + IFN-^(B lízis) K12ŰH1-G-pPLa2311 (28^ŰC) + IFN-j? (B lízis)

Κ12ΔΗ1-G-pPLa2311 (28°C) + IFN-β (B lízis) alábbi táblázatban foglaltuk össze; a növekvő pozitív értékek a ^3ÍP növekvő mértékű beépítését mutatják.

„a extrakt/pHFIF-6 —> +·++; (NH₄)₂SO₄ lecsapás után —, + -R „b extrakt/pMS2-7 —>+ + + ; (NH₄)₂SO₄ lecsapás után —» — „b extrakt/pMS2-7 plusz HuIFN-β-»+ ++; (NH₄)₂SO₄ lecsapás után —> + +

E vizsgálatok másik fontos problémáját a humán fibroblasztok által a különböző kísérleti lépések alatt és után kiválasztott HuIFN-β alacsony kinyerési hozama képezi. Az S-100 kivonathoz adott leukocita interferon és fibroblaszt interferon kinyerési hozamának összehasonlítása azt mutatja, hogy a HuIFN-α 100%-os kinyerésével ellentétben a HuIFN-β kinyerési hatásfoka csupán 10%. Az alábbi táblázatban a T₂, sejteken meghatározott vírus-ellenes aktivitás-értékeket adjuk meg log₁₀ egység/ml-ben: HB101-pMS2-7 („A lízis) S-100 kivonatában hígított IFN-a 2,5

E-MEM+3% borjú-szérumban hígított

IFN-a 2,7

HB101-pMS2-7 („A” lízis) S-100 kivonatában hígított IFN-β 0,7

E-MEM+3% borjú-szérumban hígított

IFN-β 1,7

Más olyan kísérletek, amelyekben IFN-β-t adtunk a centrifugált sejt-üledékhez lízis és extrakció előtt (akár 3/ borjú-szérum stabilizátorként való hozzáadásával is), azt mutatták, hogy csupán 10—30% IFN-β volt kinyerhető.

logio egység/ml

HEPES	T21	EiSM
pH = 8	0,7 (10%)	1,7
pH = 7	1,0 (20%)	1,7
pH = 6	0,7 (10%)	1,7
pH = 6	1,7 (5,0%)	1,5

kül történő lecsapás, amint ezt fentebb leírtuk, gyakran a titer csökkenését eredményezte a vírus-ellenes aktivitás mérése során:

logio egység/ml

előtt	után
1,0	0,5
2,7	2,5
1,5	1,2
1,7	1,5
2,2	3,0

-30193507

Az IFN-β dialízise (éjjelen át 4°C-on, PBS ellen) akár baktérium-kivonatok jelenlétéDialízis

IFN-β PBS-ben

IFN-Β PBS-ben

KI2ΔΗ1-G-pPLa8 (28 C) + IFN(B lízis)

K12 Hl-G-pPLa8 + IFN-β (B lízis) K12 HI-G-pPLa8 + IFN-á (B lízis) K12 HI-G-pPLa8 + IFN-β (B lízis)

60 ben, akár enélkül történt, ugyancsak az IFN -β-aktivitás csökkenését eredményezte;
logio	egység/ml
előtt	után
1,0	0,5
2,7	2,5
1,2	0,2
3,0	1,7
2,5	1,0
1,5	0,5

Minthogy az IFN-β I-típusú interferon, aktivitásának savakkal szemben stabilnak kellene lennie. Ezt oly módon vizsgáltuk, hogy az IFN-β mintákat baktérium-kivonatok jelenlétében vagy enélkül, éjjelen át 4°C hőmérsékleten 5 mmolos glicin-HCl oldatban (pH= =2,2) dializáltuk. Ez a művelet egy csapadék képzésére vezetett; a csapadékot Eppendorf-centriíugában 12 000 g-vel 2 percig tömörítettük. A szupernatáns folyadékot vizsgáltuk vírus-ellenes aktivitásra. Bár némi vírus-ellenes aktivitás megmarad e művelet után is, a kinyert interferon mennyiségében számottevő veszteség mutatkozott. log₁₀ egység/ml

Dialízis

HB101-pMS2-7 (A lízis) + IFN-#

K12AHI-G-pPLa2311 (28^cC) ozmózisos sokkal kezelve + IFM-p

M5219-G-pPLa8 (42°C) (B lízis) + IFN-P

M5219-G-_PPLa8 (28°C) (B lízis) + IFN-β eló'tt után

0,7 0,5

1,2 1,2

1,2 0,7

3,0 2,0

Az ilyen különféle kezelések következtében a fent leírt kontroll-extraktorokhoz képest megfigyelhető HuIFN-β aktivitás-csökkenés értelmezésében óvatosan kell eljárni. A csökkent vírus-ellenes titerek nem szükségképpen jelentik azt, hogy az interferon részben elbomlott. Az alacsonyabb titrálási értékek származhatnak onnan is, hogy az IFN-β nem-specifikusan a dializáló-membránhoz vagy a baktérium-kivonatok komponenseihez, például a sejtfal-részekhez tapad, fgy például megállapítható volt, hogy az IFN-β hidrofob fehérje (hidrofob jellegét aminosav-szekvenciája-is megerősíti), amely nem-specifikusan tapadhat cső-falakhoz vagy más felületekhez is. Emellett a bakteriális eredetű IFN-β, glikozilezés hiányában még hidrofobabb lehet. Ezért az emberi sejtek által kiválasztott glikozilezett IFN-β nyeredékére alapított következtetések nem szükségképpen extrapolálhatók a bakteriális eredetű ΙΕΝ-β-ra is.

2. Az lFN-3-aktivitás kimutatása

a) Vírus-ellenes aktivitás A G-pPLa-HFIF-67-12, G-pPLa-HFIF-67-12Δ19, G-pPLc-HFIF-67-8, G-pPLa-HFIF-67-12Δ279Τ, G-pPLa-HFIF-67^218MI, G-pPLa-HFIF-67-12AMI vagy G-pPLa-HFIF-67-12Δ19 BX-2 plazmidokat tartalmazó É.

coli M5219 vagy Κ12ΔΗΙ baktérium-kivonatokat vizsgáltunk IFN-β vírus-ellenes aktivitásra. Az indukálási eljárás, valamint az S-100 kivonatok és az ozmózisos sokkal kezelt szupernatánsok elkészítési módja lényegileg egyező volt a fentebb leírttal. Kísérletenként 150 ml baktérium-kultúrát (3— 6.10⁸ sejt/ml) használtunk. Az összes biológiai titereket log_l0 egység/ml-ben adtuk meg.

G-pPLa-HFIF-67-12

E kísérletben G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidot alkalmaztunk E. coli M5219 és E. coli Κ12ΔΗΙ transzformálására; az S-100 kivonató kát „B” 1 ízissei állítottuk elő. Valamennyi mintát ammonium-szulfáttal csaptuk le a vírus-ellenes aktivitás meghatározása előtt.

T„ E,SM

K12AHI-G-pPLa-HFIF- —--67-12 (28°C) <0,2 <1,0

K12AHI-G-pPLa-HFIF-67-12 (42°C, 90 perc) 0,2/0,5< l,0/< 1,0 M5219-G-pPLa-HFIF67-12 (28°C) <0,2 <1,0

M5219-G-pPLa-HFIF67-12 (42°C, 90 perc) 0,7/0,7< 1,0/< 1,2

A fenti táblázatban második helyen álló értékek ugyanazon minta újbóli vizsgálata alkalmával kapott titert mutatják. Egy kont31

-31193507 roll-kísérletben, ahol az E. coli HB101-pMS2-7-hez a sejtek lízise előtt autentikus IFN-β-t adtunk, 30%-os IFN-β kinyerés mutatkozott. Ezért nyilvánvaló, hogy az indukció után IFN-β vírus-ellenes aktivitás mutatható ki a baktérium-lízátumban. Bár a kapott titerek az E[SM sejtek kimutatási szintje alatt vannak, mégis világosan mutatják, hogy az IFN-β aktivitás nem valamilyen szennyező bakteriális aktivitásból ered. Az ilyen szenynyező bakteriális aktivitás az E,SM diploid fibroblaszttal legalább 2,0 értéket adna, hogy megfeleljen a T₂₁ sejtekkel kapott 0,5 vagy 0,7 értéknek (lásd a fentebb leírt kontroll kísérleteket) .

G-pPLa-HFIF-67-12A19 E kísérletekben G-pPLa-HFIF-67-12A19 plazmidot használtunk E. coli M5219 transzformálására; az S-100 kivonatokat „B” lízissel készítettük. Valamennyi mintát ammonium-szulfáttal csaptuk le, a fentebb leírt módon, majd vizsgáltuk vírus-ellenes aktivitásukat. Itt is nyilvánvaló a HuIFN-β vírus-ellenes aktivitásának jelenléte a kivonatokban. Az alábbi táblázatban a zárójelbe tett számértékek a kimutathatósági szintet mutatják amely az egyes mintáknak a sejt-kultúrákban tenyésztett emberi sejtekkel szemben mutatkozó bizonyos mértékű toxikussága befolyásol.

1) M5219-G-pPLa-HFlF-67-12A19 (28°C)

2) M5219-G-pPLa-HFIF-67-12A19 (42°C, 90 perc, végső sejtsűrüség=3,10⁸/ml)

1) <ü?5 2,2 (< 2,0)

2) 2,2 (>0,5) 2,2 (>2,0)

Egy kontroli-kísérletben, ahol a HB101-pMS2-7-hez a sejtek lízise előtt autentikus IFN-β-ΐ adtunk, 30%-os kinyerést értünk el. Itt a T₂₁ sejteken kapott magas értékek, valamint a T_2I sejteken talált aktivitásnak az E,SM-en találthoz való viszonya azt mutatja, hogy a hőmérséklettel indukált minták esetében nem lépett fel szignifikáns mértékben a fentebb tárgyalt szennyező bakteriális aktivitás.

G-pPLc-HFIF-67-8

G-pPEc-HFIF-67-8 plazmidot alkalmaztunk E. coli M5219 transzformálására és az S-100 kivonatokat „B lízissel állítottuk elő. Valamennyi mintát amonium-szulfáttal csaptuk le és vizsgáltuk vírus-ellenes aktivitásukat.

1) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (28°C)

2) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42°C, 180 perc, végső sejt-sűrűség=6.10⁸/ml)

T₂₁ E,SM sejteken

1) ~<ΤΓ,5 2,2 (< 2,0)

2) 2,2 (<0,5) 2,2 (<2,0)

A zárójelben levő é. ;ék a toxikusság miatti kimutathatósági szintet mutatja. Egy kontroli-kísérletben, ahol autentikus IFN-β-ί adtunk a HB101-pMS2-7-hez a sejtek lízise előtt, 30%-os kinyerést értünk el. Itt is nyilvánva32 ló, hogy a bakteriális kivonat HuIFN-β vírus-ellenes aktivitást mutatott.

Egy másik kísérletben az e sejtekből az ozmózisos sokk szupernatánsát vizsgáltuk IFN-β vírus-ellenes aktivitásra:

1) kontroll: M5219-G-pPLa-HFIF-67-12A19 (28°C)

2) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (28°C)

3) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42°C, 180 perc, sejt-sűrűség=6.10⁸/ml)

A vizsgálatokat T₂, sejteken végeztük, mind az ammónium-szulfáttal történő lecsapás előtt mind ezt követően. Az alábbi táblázatban zárójelben levő érték a kimutathatósági szintet mutatja.

lecsapás előtt lecsapás után

1) <0,2 <0,2

2) <0,2 <0,2

3) 1,5 (<0,2) 0,7 (<0,2)

A kontroli-kísérletekben az IFN-β kinyerése 10% körül volt. A kontroll-lizátumok E,SMen nem mutattak kimutatható aktivitást. Az ozmózisos sokk szupernatánsával kapott értékekből nyilvánvaló, hogy a hőmérséklettel indukált M5219-G-pPLc-67-8 kivonatnak vírus-ellenes aktivitása van, ami a nem-indukált mintákban nincsen. Az ammonium-szulfáttal való lecsapás utáni 3) mintát, amelynek a titere 0,7 log₁₀ egység/ml volt, 2,2 pHra dializáltuk a fentebb leírt módon; az így kezelt minta aktivitása nem csökkent számottevő mértékben. Ez a savakkal szembeni stabilitás az I típusú interferonok, például az IFN-β jellegzetes tulajdonsága.

G-pPLa-HFIF-67-12A279T G-pPLa-HFIF-67-12Δ279Τ plazmidot alkalmaztunk E. coli M5219 transzformálására; az S-100 kivonatokat „B lízissel készítettük. A mintákat ammónium-szulfáttal csaptuk le a citopátiás hatásnak (cPE) T_2l sejteken történő vizsgálata előtt. A 42°C hőmérsékleten indukált sejtek kivonata a kivonat 1 ml-jére számítva 1,5—1,7 log₁₀ egység/ml vírus-ellenes titert mutatott.

G-pPLa-HFIF-67-12A218MI G-pPLa-HFIF-67-12Δ218ΜΙ plazmidot alkalmaztunk E. coli M5219 transzformálására; az S-100 kivonatokat „B lízissel készítettük. A mintákat ammónium-szulfáttal csaptuk le a citopátiás hatásnak (cPE) T₂₁ sejteken történő vizsgálata előtt. A 42°C hőmérsékleten indukált sejtek kivonata a kivonat 1 ml-jére számítva 1,5 log₁₀ egység/ml vírus-ellenes titert mutatott.

G-pPLa-HFIF-67-12AMI G-pPLa-HFIF-67-12AMI plazmidot alkalmaztunk E. coli M5219 transzformálására; az S-100 kivonatokat „B” lízissel készítettük. A mintákat ammónium-szulfáttal csaptuk le a citopátiás hatásnak (cPE) T₂₁ sejteken történő vizsgálata előtt. A 42°C hőmérsékleten indukált sejtek kivonata a kivonat 1 mijére számítva 2,0 log_l0 egység/ml vírus-ellenes titert mutatott.

-32193507

G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2

G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2 plazmidot alkalmaztunk E. coli Κ12ΔΗΙ transzformálására; az S-100 kivonatokat „B lízissel készítettük. A mintákat ammonium-szulfáttal csaptuk le a citopátiás hatásnak (cPE) T₂₁ és FS-4 sejteken történő vizsgálata előtt. A 42°C hőmérsékleten indukált sejtek kivonata a kivonat 1 ml-jére számítva 1,7— 2,0 logi₀ egység/ml vírus-ellenes titert mutatott.

b) A HuIFN-β vírus-ellenes aktivitásának' antitest-semlegesítése

Az IFN-β bakteriális expressziójának további bizonyítékát nyújtják az antitest-semlegesítési kísérletek. Az anti-interferon antiszérumot 10⁷ egység autentikus (emberi fibroblaszt-sejtek által kiválasztott) ΙΕΝ-β-vaI immunizált kecskékben állítottuk elő és szabályozott pórusú üveggyöngyökön (A. Billiau és munkatársai: i.m.) tisztítottuk. A baktérium-kivonatok vírus-ellenes aktivitását a fent leírt módon vizsgáltuk, majd az antiszérum sorozatos hígításait adtuk hasonló mintákhoz, az elegyeket 37°C hőmérsékleten 1 óra hosszat inkubáltuk és ezután T₂, emberi diploid fibroblaszt sejtekre alkalmaztuk a mintákat és a fentebb leírt módon vizsgáltuk a vírus-ellenes aktivitásukat. Az IFN-antiszérummal történő semlegesítés foka a teljes semlegesítéstől (+ ++) a semlegesítés teljes hiányáig (—) terjed. Az alábbi táblázatban a zárójelbe tett értékek az 50%-os semlegesítést adó antiszérum-koncentráció közelítő értékei.

1) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42°C, 180 perc;

2,2 log₁₀ vírus-ellenes egység/ml T₂₁ sejteken)

2) M5219-G-pPLa-8 (42°C, 180 perc), amelyhez emberi fibroblasztból származó IFN-β-ί adtunk a lízis előtt (1,7 log₁₀ vírus-ellenes egység/ml T₂₁ sejteken)

Antiszérum hígítása (1) (2)

ΙΟ’³ + + + + + + ⁴ + + + + ⁵ ± (10'⁴·⁵) + + +

10^tí — ± (10“⁶) 10“⁷ — —

Hasonló eredményeket kaptunk M5219-pPLa-HFIF-67-12A19 (42°C) kivonatokkal rs. A találmány szerint előállított bakteriális IFN-β és az autentikus IFN-β semlegesített litere között mutatkozó különbség az e bakteriális fehérjék antigenitásában vagy specifikus IFN-aktivitásában az autentikus IFN-β-Ιιοζ képest fennálló és a bakteriális fehérjék glikozilezettségének hiányából eredő különbségekkel magyarázhatók.

c) A HuIFN-β stabilitása Vírus-ellenes aktivitás

1) Hőkezelés

Az IFN-β az IFN-a-val ellentétben azt a nagyon szokatlan tulajdonságot mutatja, hogy vírus-ellenes aktivitása 1% nátrium-do64 decil-szulfátot, 1% β-merkaptoetanolt és 5 mol/1 karbamidot tartalmazó oldatban [Stewart, W. Ε. II és munkatársai: Distinct Molecular Species of Humán Interferon, Requirements fór Stabilization and Reactivation of Humán Leucocyte and Fibroblast Interferon, J. Gén. Virol., 26, 327—331, (1975)] történő forralás után kinyerhető, bár 100%_;os kinyerés rendszerint nem érhető el. E vizsgálat céljaira egy 150 ml-es kultúra baktérium-sejtjeit a „B lízis céljaira szolgáló pufferoldatban újból szuszpendáltuk és ugyanolyan térfogatú, 2% nátrium-dodecil-szulfátot, 2% β-merkapto-etanolt és 10 mol/1 karbamidot tartalmazó oldatot adtunk hozzá, majd az elegyet 2 percig forraltuk és S-100 frakciókat állítottunk elő.

1) kontroll: M5219-G-pPLa-HFIF-67-12A19 (28°C)

2) kontroll: 3 log_I0 egység HuIFN-β „B lízishez való pufferoldattal hígítva

3) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 Í42°C, 180 perc, sejt-sürűség=6.10⁸/ml)

A vizsgálatokat T_2I sejteken végeztük. A zárójelbe tett értékek a saját toxikusság miatti kimutathatósági határokat mutatják. Forralás előtt Forralás után

1) <1,5 <1,5

2) 2,2 (<1,5) 2,0 (<0,5)

3) 3,0 (<2,0) 2,2 (<1,5)

A kontroli-kísérlet az IFN^-aktivitás kb.

10%-os kinyerését mutatja. Nem volt kimutatható érték E,SM-ben a párhuzamos kontroll-lizátumokban. Ezek az adatok világosan mutatják, hogy bár a kontroli-kísérletben a hozzáadott IFN-β csupán körülbelül 10%-át nyertük ki, vírus-ellenes IFN-β aktivitás még ilyen szigorú kezelés után is jelen volt a hőmérséklettel indukált M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 kivonatában. Valójában e kezelés után nagyobb vírus-ellenes aktivitást találtunk mint a „B lízis termékében, ami azt mutatja, hogy az utóbbi eljárásban az IFN-β esetleg a sejt-komponensekhez tapad.

2) Dialízis

A HuIFN-β vírus-ellenes aktivitás nem dializálható. így például PBS-sel szemben semleges pH-értéknél, 4°C hőmérsékleten 16 órai dialízis után a baktérium-kivonatok vírus-ellenes aktivitása (Iog_l0 egység/ml) megmaradt, bár némileg csökkent titerrel:

I) M5219-pPLc-HFlF-67-8 II) M5219-pPLa-HFIF-67- 12Δ19 III) ΐΡΝ-β M5219-pPLa-8-ban	(42°C) (42°C) (42°C) Dialízis után
	Dialízis előtt
I)	2,3	2,3
I)	3	2,3
I)	1,5	1,3
II)	2,3	1,3
II)	2,3	2
II)	2,3	1
λ dialízis után megfigyelt aktivitás-csökke-

nés valószínűleg az ΙΡΝ-β-nak a dialízismembránokhoz való nem-specifikus tapadásával és hasonló tényezőkkel magyarázható.

-33193507

3) Lecsapás ammonium-szulfáttal

A találmány szerinti baktérium-kivonatok vírus-ellenes aktivitása (log₁₀ egység/ml) megmaradt 67%-os telített ammonium-szulfát-oldattal (2 ti. ammonium-szulfát-oldat 1 tf. kivonatra) történő lecsapás után is; az említett ammonium-szulfát-koncentrációról ismeretes, hogy lecsapja a HuIFN-p-t.

A lecsapott elegyet 30 percig jégen tartottuk, majd 10 percig centrifugáltuk 12000.gvel, majd elemzés céljából újból feloldottuk a centrifugálással elválasztott szilárd részt PBS-ben:

I) M5219-pPLc-HFIF-67-8	(42°C)
II) M5219-pPLa-HFIF-67-12A19 42°C)
ΙΠ)	IFN-β M5219-pPLa-8-ban	(42°C)
I) I)	Lecsapás előtt	Lecsapás után 9
2	2,3
II)	2	2
III)	1,3	1,3
III)	1,5	1,3

4) Kezelés 2 pH-nál

A találmány szerinti eljárással készített baktérium-kivonatok vírus-ellenes aktivitása (log_1Q egység/ml) stabil volt savakkal szemben is. A kivonatokat vagy 15 óra hosszat dializáltuk 50 ml glicin-hidrokloriddal (pH 2,2) szemben, majd 3 óra hosszat dializáltuk őket PBS-sel szemben, vagy pedig megsavanyítottuk a kivonatokat sósavval és ezt követően nátrium-hidrokloriddal semlegesítettük őket. A csapadék eltávolítása után végeztük az alábbi vizsgálatokat;

I) M5219-pPLc-HFIF-67-8 (42°C)

II) M5219-pPLa-HFIF-67-12A19 (42°C)

III) IFN-β M5219-pPLa-8-ban (42°C)

Savas kezelés előtt Savas kezelés után

I) 2 1,3

I) 0,7 0,7

II) 2 1

III) 3 2

d) 2,5-A szintetáz-aktivitás

Az M.5219-G-pPLc-HFIF-67-8 kivonat ozmózisos sokkal való kezelése útján (a fentebb leírt módon) kapott terméket 2,5-A szintetáz jelenlétére vizsgáltuk a fentebb leírt módon, mikrotiter-lemezekkel, de azzal az eltéréssel, hogy az E_tSM sejtek helyett Hela sejteket alkalmaztunk. Az alábbi eredményeket kaptuk;

I) M5219-G-pPLc-HFlF-67-8 (28°C) (lásd fent)

II) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42°C) lásd fent)

A 2,5-A szintetáz-aktivitást tükröző értékek a 2,5-A trimer alakjában jelenlevő ³²P-rádióaktivitást mutatják:

(mért számlálás) (az endogén háttér levonása után)

1) nem kezelt sejtek

2) 1) baktérium-kivonat:

1/6 hígítás

3) 11) baktérium-kivonat:

1/6 hígítás

4) 1) baktérium-kivonat + IFN-β 1,5 log₁₀ egység/ml-re

5) mint 3) , de anti-IFN-JJ antiszérummal inkubálva

6) mint 4), de anti-IFN-A antiszérummal inkubálva

7) kontroll IFN-β 0,5 logxoegység/ml

8) kontroll IFN-β logio egység/ml

9) kontroll IFN-β

1,5 log₁₀ egység/ml

10) kontroll IFN-β log₁₀ egység/ml

3342	cpm	0 cpm
1972	cpm	-1370	cpm
6960	cpm	3618	cpm
7037	cpm	3695	cpm
3950	cpm	608	cpm
2960	cpm	-382	cpm
4463	cpm	1120	cpm
7680cpm	4338	cpm
13615	cpm	10273	cpm
25040	cpm	21698	cpm

A 2,5-A szintetáz-aktivitás meghatározásának eredményei bizonyítják, hogy a hőmérséklettel indukált M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 ozmózisos sokk után kapott szupernatánsa, amely (amint ezt fent láttuk) vírus-ellenes aktivitással rendelkezik, indukálja a 2,5-A szintetáz-aktivitást is, míg a nem-indukált baktériumtörzs ezt nem teszi. Ez az eredmény megfelel a vírus-ellenes aktivitás mérése során kapott eredményeknek.

A 2,5-A szintetáz-aktivitás stimulálásának mértéke megegyezik a kontroll-lizátumhoz adott IFN-β aktivitásával (látható ez a (3) és (4) minták összehasonlításából). A (7) — (10) mintákból megszerkesztett koncentráció-görbe azt mutatja, hogy figyelembe véve a hígítást, log,₀ 1,7 egység/ml aktivitás tételezhető fel mind a (3), mind a (4) mintákban, ami összhangban áll a közvetlen vírus-ellenes vizsgálat során kapott értékek-34193507 kel (1,5 log_lu egység mindkét mintánál). Ez a kísérletsorozat azt is bizonyítja, hogy a 2,5-A szintetáz indukciója semlegesíthető anti-lFN-β antiszérummal, ugyanúgy, mint a vírus-ellenes vizsgálat esetében.

e) Vírus-ellenes aktivitás más sejtvonalakon

Az I) és II) kivonatokat (M5219-G-pPLc-HFIF-67-8, lásd fent) vizsgáltuk vírus-ellenes aktivitás szempontjából különböző más, macska-, egér-, majom- vagy nyúl-eredetíí sejtvonalakon is. Ezeken a sejteken e kivonatok nem mutattak kimutatható mértékű vírus-ellenes aktivitást; nem tapasztaltunk ilyen aktivitást emberi sejtek útján nyert autentikus IFN-β esetében sem. Nem tapasztaltunk aktivitást humán leukocita-interferonra érM5219-pPLa-HFI?-6 7-12^)19 (42 M5219_pPLc_HFIF-67_8 (42

IFN-β M5219-pPLa-8-beE (42 M5219-pPLc-HFIF-67_8 (42

IFN-β M5219-pPLa-&-ban (42

3) Az aktív IFN-β termék azonosítása

Különböző kísérletek során bebizonyosodott, hogy a pre-HuIFN-β nem aktív és a baktérium-sejtek nem alakítják aktív termékké; a vizsgálati körülmények között sem alakul át ilyenné. Ezért a különböző baktérium-kivonatokban a fent leírt módon kimutatott IFN-β-aktivitás valószínűleg onnan származik, hogy a várt kapcsolt fehérjéket (például a β-laktamázhoz, MS2-höz vagy bakteriális szignál-szekvenciákhoz kapcsolt HuIFN-β-ί) a baktériumok aktív termékké alakítják, vagy a termék a vizsgálati körülmények között alakul aktívvá.

Nem bizonyos, hogy az ilyen kivonatokban jelenlevő aktív termék érett HuIFN-β (az érett HuIFN-β természetesen a G-pPLa-HFIF-67-12ΔΜΙ és G-pPLa-HFIF-67-lA19 BX-2 terméke). Azonban a például indukált M5219-pPLa-HFIF-67-120A19-ből vagy indukált M5219-pPLc-HFIF-67-8-ból kapott baktérium-kivonatok poliakrilamid-gél-elektroforézissel denaturáló körülmények között végzett frakcionálása kétféle aktív termék jelenlétét mutatta. Az első ilyen aktív termék hozzávetőleges mérete 15000-18000 dalton, ez tehát megfelelhet az érett ΙΕΝ-β-nak. A másik termék, amelynek nagyobb volt a molekulasúlya, egy fúziós termék vagy egy nem teljesen átalakított, ΙΕΝ-β-aktivitást mutató termék lehetett, vagy az is lehetséges, hogy ez a termék az adott vizsgálati körülmények között alakult át érett IFN-β-νέ. A különböző expressziós termékek aminosav-szekvenciájának ismert módszerekkel történő felderítése alapján meghatározható lesz, hogy az érett HuIFN-β mellett milyen további fehér68 zékeny macska-tüdő sejtvonalon sem. Ezek az eredmények is megerősítik, hogy a baktériumok által termelt IFN-β lényegileg azonos tulajdonságokat mutat, mint az indukált humán fibroblaszt-sejtek által kiválasztott IFN-β.

f) Érzékenység proteázzal szemben A jelen találmány szerinti, baktérium-gazdákból nyert IFN-β érzékenységét vizsgáltuk a hígított baktériumkivonatok növekvő mennyiségű tripszinnel 37°C hőmérsékleten 1 óra hosszat folytatott kezelése útján is. A tripszin hasonló koncentrációban szüntette meg az ilyen IFN-β vírus-ellenes aktivitását, mint amilyen koncentrációban a tripszin megszünteti az inaktív kontroll-lizátumhoz adott autentikus IFN-aktivitását:

Tripszin-végpont (ms/nl) (1ΟΟΟ E/ml) 0,03 (1000 E/ml) 0,03 (1000 E/ml) 0,03 ( 30 E/ml) 0,03 ( 30 E/ml) 0,03 je-termékek (ha vannak egyáltalán ilyenek) mutatnak HuIFN^-aktivitást.

A találmány szerinti eljárással előállított, HuIFN^-aktivitást mutató polipeptidek hozamának és aktivitásának növeiése A fehérjék termelésének a szintjét három főbb tényező irányítja: A megfelelő gén kópiáinak száma a sejtben, az a hatásfok, amelylyel ezek a gén-kópiák transzkribálhatók és transzlációjuk hatásfoka. A transzkripció és transzláció (amelyek együtt képezik az expressziót) hatásfoka viszont ezoktói a nukieotid-szekvenciáktól függ, amelyek rendes körülmények között a kívánt kódoló szekvencia előtt foglalnak helyet. Ezek a nukleotid-szekvenciák vagy expressziós kontroli-szekvenciák határozzák meg többek között azt a helyet, amelynél az RNS-polimeráz iniciálja a transzkripciót (promotor szekvencia) és amelynél a riboszómák kötődnek és reagálnak az mRNS-sel (transzkripciós termék) a transzláció iniciálására. Nem valamennyi ilyen expressziós kontroli-szekvencia működik azonos hatásfokkal. Előnyös tehát a kívánt fehérje specifikus kódoló szekvenciáit elkülöníteni a szomszédos nukleotid szekvenciáktól és ehelyett más ismert expressziós kontroli-szekvenciákhoz kapcsolni őket, hogy ezzel elősegítsük az expresszió magasabb szintjeinek elérését. Ha ez sikerült, az így újonnan megszerkesztett DNS-fragmens beiktatható egy nagyobb kópia-számú plazmidba vagy egy bakteriofág-származékba, hogy így megnöveljük a sejtben a gén-kópiák számát és ezzel tovább növeljük az exprimált fehérje hozamát.

-35193507

Ilyen célra különböző expressziós kontroli-szekvenciák alkalmazhatók a fent leírt módon. Ezek sorába az E. coli laktóz-operonjának operátor, promotor, riboszóma-megkötő és interakciós szekvenciái (a „lac rendszer) tartoznak (beleértve az olyan szekvenciákat is, mint a Shine-Dalgarno szekvenciák), továbbá az E. coli triptofán-szintetáz-rendszerének (a „trp rendszer”) megfelelő szekvenciái, a λ-fág nagyobb operátor- és promotor-tartományai (O_LR. amint fentebb leírtuk és ), az egyszálas filament DNS-fág kontroli-tartománya, valamint más olyan szekvenciák, amelyek szabályozzák a prokariotikus és eukariotikus sejtek és vírusaik génjeinek expresszióját. Ezért annak érdekében, hogy valamely adott polipeptidnek egy megfelelő gazdában történő termelését fokozzuk, a fentebb leírt módon előállíthatjuk az e polipeptidre kódoló gént és ezt egy rekombináns DNS-molekulából eltávolítva közelebb vihetjük előző expressziós kontroli-szekvenciájához vagy a fentebb említett expressziós kontroli-szekvenciák valamelyikének szabályozása alá vihetjük. A szakmában ismeretesek az e célok elérésére alkalmas módszerek.

A transzláció hatásfokának javítására alkalmazható egyéb módszerek esetében kémiailag vagy enzimatikus úton előállított oligonukleotidokat iktatnak be az iniciáló kodon elé. Ezzel az eljárással a messenger RNS optimálisabb primer és szekunder szerkezete alakítható ki. Közelebbről megjelölve, a szekvencia oly módon szerkeszthető meg, hogy az iniciáló AUG kodon könnyen hozzáférhető helyzetben álljon (tehát szekunder szerkezet ne takarja el) akár egy „hajtű tetején, akár valamely más egyszálas tartományban. Hasonló módon optimalizálható a fentebb említett Shine-Dalgarno szegmens helyzete és szekvenciája is. A messenger RNS általános szerkezetének fontosságára már rámutattak [D. Iserentant és W. Fiers: „Secondary Structure of mRNA and Efficiency of Translation Initiation”, Gene 9, 1 — 12 (1980)].

A kívánt termékek sejt-hozamának további növelése ama gének számának növelésétől függ, amelyek hasznosíthatók a sejtben. Ezt oly módon érhetjük el, hogy HuIFN-β-gént (transzkripciós és transzlációs kontroll-elemeivel vagy anélkül) iktattunk be egy még nagyobb kópia-számú plazmidba vagy egy hőmérséklettel szabályozott kópia-számú plazmidba (vagyis egy olyan plazmidba, amely oly értelmű mutációt hordoz, hogy a plazmid kópia-száma megnövekszik a hőmérséklet emelése után) [vö.: B. Uhlin és munkatársai: „Plasmids with Temperature-dependent Copy Number tor Amplification of Cloned Genes and Their Products”, Gene 6, 91 —106 (1979)]. Elérhető a gén-adag megnövelése oly módon is, hogy például a fentebb leírt módon megszerkesztett rekombináns DNS-molekulákat bevisszük a temperált λ-bakteriofágba, ami legegyszerűbben úgy érhető el, hogy a plazmidot egy resztrikciós enzimmel 36 kezeljük, hogy így egy lineáris molekulát kapjunk, amelyet azután egy resztringált λ-fágot klónozó hordozóval keverünk össze [ilyen típusú hordozót például N. E. Murray és munkatársai írtak le: „Lambdoid Phages that Simplify the Recovery of in Vitro Recombinants”, Mól. Gén. Génét., 150, 53—61 (1977); N. E. Murray és munkatársai: „Molecular Cloning of the DNA Ligásé Gene from Bacteriophage T4, J. Mól. Bioi, 132, 493—505 (1979)] és a DNS-ligázzal történő inkubálás útján kapott rekombináns DNS-molekulával. A kívánt rekombináns fágot azután a fentebb léírt módon különítjük el és alkalmazzuk egy E. coli gazda-törzs lizogénezésére.

Az ilyen célra különösen alkalmas λ klónozó-hordozók hőmérsékletre érzékeny mutációt tartalmaznak a cl repressziós génben, továbbá szupprimálható mutációkat az Szénben; ezek terméke szükséges a gazdasejt líziséhez, tartalmazzák továbbá az E, gént, amelynek terméke a vírus nagyobb kapszid-fehérjéje. Ezzel a rendszerrel a lizogén sejteket viszonylag alacsony hőmérsékleten (például 28°C és 32°C között) szaporítjuk, majd magasabb hőmérsékletre (például 40-45°Cra) melegítjük őket, a profág exciziójának indukálása céljából. A magasabb hőmérsékleten történő huzamosabb tenyésztés a fehérje nagy mennyiségekben való termelésére indít, ez a fehérje a sejtek belsejében marad, mert a fág gén termékek nem lizálják a sejteket a normális úton, és minthogy a fág gén betét nem kerül burokba, hozzáférhető marad a további transzkripció céljaira. A sejtek mesterséges lízise azután nagy hozammal szabadítja fel a kívánt terméket.

Minthogy ebben az eljárásban a λ represzszor-rendszert az expresszió szabályozására is felhasználtuk, szükségessé válhat a profág exciziójának és ennélfogva a gén kópia-számának a szabályozása egy például a lambdoid 21 fágból származó heteroimmun szabályozó tartomány útján.

Megjegyzendő, hogy IFN^-aktivitást mutató polipeptidek (a jelen találmánnyal összhangban) előállíthatok összekapcsolt (például egy az exkréciót irányító prokariota N-terminális szegmenshez kapcsolt) fehérje alakjában, vagy prointerferon (például az interferon szignál-szekvenciájával — amely az exkréció során lehasítható — kezdődően), vagy pedig érett interferon (ez utóbbi lehetséges, mert az érett interferon metioninnal, tehát egy a transzláció megindítására alkalmas aminosavval kezdődik) alakjában is. A polipeptid e különböző alakjainak hozama növelhető a fentebb ismertetett eljárások bármelyike vagy azok valamilyen kombinációja útján. A jelen DNS-szekvenciákban alkalmazott kodonok közül néhány vagy valamenynyi is kicserélhető más kodonokra. Ezek a behelyettesített kodonok ugyanazokra az aminosavakra kódolnak, mint azok, amelyek helyébe léptek, de nagyobb hozammal adhatják a polipeptidet. Lehetséges azonban az is, hogy

-36193507 egyes kodonoknak vagy kodonok valamilyen kombinációjának a kicserélése más aminosavakat vagy hosszabb vagy rövidebb HuIFN-β-rokon polipeptidet ad; ezáltal hasznos irányban változtathatjuk meg a termék tulajdonságait (például növeljük annak stabilitását, növeljük oldhatóságát vagy vírus-ellenes aktivitását, fokozhatjuk a 2,5-A szintetáz-aktivitást vagy növelhetjük a gazda-specifitási tartományt).

Az így elérhető javítások egyik példája az, hogy egy e találmány szerinti DNS-fragmenst, amely pre-lFN-P-ra kódoló DNS-szekvenciát tartalmazott, beiktattunk egy olyan klónozó vektorba, amely a promotort és az e promotor által szabályozott SV40 összekötő-szekvenciát tartalmazta. Ez a konstrukció majom-sejtekben körülbelül 10⁴ egység/ml feldolgozott IFN-β termelését eredményezte. A jelen találmány kiterjed hasonló konstrukcióknak más klónozó vektorokban és eukarióta sejtekben való létrehozására is.

Végül a jelen találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák által termelt polipeptidek aktivitása javítható a találmány szerinti DNS-szekvenciák vagy polipeptidek ismert módszerekkel történő fragmentálása, módosítása vagy származékok képzése útján is, anélkül, hogy ezzel túllépnénk a találmány körét.

Egy HuIFN-p-ra kódoló kromoszóma-gén azonosítása

R. M. Lawn és munkatársai egy humán magzati kromoszóma-DNS fragmensekből származó hibrid fág-gyűjteményt állítottak elő, ezeket HaelII és Alul alkalmazásával végzett részleges hasítással képezték és EcoRI kapcsolókkal kapcsolták λ Charon 4A karokhoz a Cell, 15, 1157—1174 (1978) helyen ismertetett módon. Ezt a gén-bankot egy „in situ módszerrel [W. D. Benton és R. W. Davis, Sicence, 196, 180—182 (1977); T. Maniatis és munkatársai: Cell 15, 687—701 (1978)] vizsgálták, szondaként a pHFIF-21ból Taql-Bglll resztrikció útján kimenesztett, ³²P-vel jelzett IFN-β cDNS betétet használtuk. A .pHFIF-21 plazmidot az e találmány szerinti szkrinelési eljárással azonosítottuk (A 21. hibrid plazmid, amely humán fibroblaszt interferon cDNS inszertet tartalmaz). E plazmid Taql-Bglll fragmense tartalmazza az IFN csaknem teljes 5’-lefordítatlan tartományát és teljes kódolási tartományát is. Egy hibridizálásra pozitk fág-klónt 600 000 piákból különítettünk el, ismételt plak-tisztítás útján (T. Maniatis és munkatársai: i.m.). Ezt a piakot λ CH4A-gHFIF-l jelzéssel jelöltük. E plak resztrikciós analízise során kitűnt, hogy az körülbelül 16,3 Kb humán DNS-t tartalmaz.

A λ CN4A-gHFIF-l EcoRI-vel való kezelése a két Charon 4A fág-kar mellett 8 betét-fragmenset tartalmazott, 4,6, 3,5, 2,4, 1,9, 1,3, 1,2, 0,8 és 0,6 Kb hosszúságban. Southern megfestés után csak az 1,9 Kb fragmens hibridizált a pHFIF-2l Taql-Bglll fragmensére.

Az 1,9 Kb fragmenst közvetlenül visszaklónoztuk az EcoRI helyre a pBR325-ben (ez a pBR322 oly származéka, amely egy kloramfenikol-rezisztens jelzőt is hordoz, amely egyetlen EcoRI helyet tartalmaz [R. Rentki és munkatársai, The plasmid cloning vektor pBR325 contains a 482 basc-pair-long Ínverted duplication, Gene 14, 289 (1981)]). 0,6 u,g EcoRIvel kezelt λ CH4A-gHFIF-l DNS-nek 100 ng pBR325-höz való kötése és E. coli HBlOl-be való transzformáció után néhány kiónt szelektáltunk. Csak az 1,9 Kb fragmenst tartalmazó kiónok hibridizáltak az IFN-β cDNS szondára. Ezt a kiónt p(325)-gHFIF-4 jellel jelöltük.

A pHFIF-21-ből és a p(325)-gHFIF-4-ből származó resztrikciós fragmensek összehasonlítása azt mutatta, hogy a kromoszóma-klónban nincsenek közbelépő szekvenciák, továbbá hogy az e klón által hordozott DNS-információ azonos a pHFIF-21-ével.

A HuIFN+-ra kódoló kromoszóma-DNS azonosítása és elkülönítése lehetővé teszi a megfelelő gazdáknak az e DNS-sel való transzformációját és HuIFN-β belőle történő expreszszióját. Ez az expresszió előnyös, minthogy a kromoszóma-DNS szekvenciákhoz asszociált különféle szignálok jelen lesznek az ilyen kiónokban. Ezek a szignálok azután rendelkezésre fognak állni arra a célra, hogy nagyobb hozamokat kapjunk a kromoszóma-DNS kódoló tartománya által kódolt polipeptid expressziója és esetleg expresszió utáni kezelése során.

Az itt leírt eljárások során előállított rekombináns DNS-molekulák és létrehozott mikroorganizmusok példáiként az alább felsorolt kultúrákat helyeztük letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Göttingen, Német Szövetségi Köztársaság) kultúra-gyűjteményében 1980. április 2-án; ezeket a kultúrákat HFIF-A—HF1F-C kultúraként azonosítottuk:

A: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst) /HFIF3) Β: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF6) C: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF7) Ezeket a kultúrákat a gyűjteményben DSM 1791, DSM 1792, illetőleg DSM 1793 nyilvántartási számmal jelölték meg.

A találmány szerinti kultúrák további példáiként, ugyancsak a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Göttingen, Német Szövetségi Köztársaság) kultúra-gyűjteményében 1980. június 5-én letétbe helyeztük a következő további kultúrákat is, amelyeket HFIF -D—HFIF-G kultúrákként azonosítottunk: D: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) E: E. coli Κ12ΔΗΙ (G-pPLa-HFIF-67-12) F: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67- 12Δ19)

G: E. coli M5219 (G-pPLc-HFIF-67-8) Ezeket a kultúrákat a gyűjteményben DSM 1851 — DSM 1854 nyilvántartási számokkal jelölték meg.

Letétbe helyeztük továbbá az American Type Culture Collection, (Rockville, Mary37

-37193507 land, USA) gyűjteményében 1981. február 26-án az alábbi kultúrákat, amelyeket HFIF-H, illetőleg HFIF-I kultúrákként azonosítottunk:

Η: E. coli M5219 (pPLa-HFIF-67-12AMl) I: E. coli HB101 (p [235]-gHFIF-4)

Ezek a kultúrák az intézet gyűjteményében az ATCC 31824, illetőleg ATCC 31825 nyilvántartási számokat kapták.

Bár a fenti leírásban a találmány számos különféle kiviteli alakját ismertettük részletesen, a szakértő számára nyilvánvaló, hogy az eljárás különféle módokon változtatható a találmány keretében és így a találmány szerinti eljárás különböző változatai alkalmazhatók. Ezért a találmány köre nem korlátozódik a fenti leírás példaszerű ismertető részeire, hanem azt az alább következő igénv pontok határozzák meg.

Claims (13)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás IFN-p-típusú polipeptidet kódoló DNS szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy humán fibroblaszt sejtekből citoplazmás RNS-t izolálunk, ebből a poli(A) RNS-t elválasztjuk, ebben az IFN-β-mRNS-t — előnyösen gradiens centrifugálással vagy elektroforézissel — dúsítjuk, ebből RNS-függő DNS-polimeráz segítségével dTTP, dATP, dCTP és dGTP jelenlétében egyszálú cDNS keveréket alakítunk ki, tisztítás után dTTP, dATP, dCTP és dGTP jelenlétében DNS polimeráz segítségével kettősszálúvá alakítjuk, az így kapott terméket SÍ nukleázzal kezeljük, a heterogén cDNS keveréket elektroforézissel tisztítjuk, a kapott IFN-β-cDNS-t tartalmazó kettősszálú cDNS keveréket valamely hordozóba juttatjuk, az így kapott hibrid vektorral E. coli törzset transzformálunk, antibiotikum-érzékenység alapján transzformánsokat izolálunk, a kapott plazmid „könyvtár”-ból RNS-hibridizálási módszerrel IFN-β-ί kódoló géndarabokat is tartalmazó plazmidokat izolálunk, és ezekből a plazmidokból az IFN-β-ί kódoló géndarabokat kihasítjuk. (Elsőbbsége: 1980.04.03.)
2. 2. Eljárás ΙΕΝ-β-típusú polipeptidet kódoló DNS szakaszt tartalmazó rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely E. coli eredetű klónozó hordozóba valamely '1, igénypont szerinti DNS-szekvenciát, előnyösen (a) G-pBR322(Pst)/HFIF, illetve G-pBR322(Pst) /HFIF3, illetve G-pBR322 (Pst) HFIF6, illetve G-pBR322(Pst) /HFIF7 rekombináns DNS-ek DNS beiktatásait, amelyeket előnyösen a DSM 1971 —1973 letéti számon deponált törzsek hordoznak, (b) az (a) pontban leírt DNS beiktatásokhoz hibridizálni képes DNS-molekulákat, vagy (c) az (a) és (b) pontban leírt DNS beiktatásoktól, illetve DNS-molekuláktól a genetikai kód természetes degenerációja miatt eltérő DNS szekvenciákat, valamint valamely kifejeződést szabályozó 38 szekvenciát vezetünk be. (Elsőbbsége: 1980.04.03.)
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (b) pontban említett DNS szekvenciaként (d) G-pPLa-HFIF-67-12, illetve G-pPLa-HFIF-67-12A19, illetve G-pPLc-HFIF-67-8 rekombanáns DNS-ek DNS-beiktatásait, amelyeket előnyösen a DSM 1851 —1854 letéti számon deponált törzsek hordoznak, (e) a (d) pontban leírt DNS beiktatásokhoz hibridizálni képes DNS molekulákat, vagy (f) a (d) és (e) pontban leírt DNS beiktatásoktól, illetve DNS-molekuláktól a genetikai kód természetes degenerációja miatt eltérő DNS szekvenciákat vezettünk be. (Elsőbbsége: 1980.06.06.)
4. 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (b) vagy (e) pontban leírt DNS szekvenciaként.

   (g) G-pPLa-HFIF-67-12AMl, illetve G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2 rekombináns DNS-ek DNS-beiktatásait, amelyeket előnyösen az ATTC 31824, illetve DSM 1853 letéti számon deponált törzsek hordoznak, (h) a (g) pontban leírt DNS beiktatásokhoz hibridizálni képes vagy DNS-molekulákat, vagy (i) a (g) és (h) pontban leírt DNS beiktatásoktól, illetve DNS molekuláktól a genetikai kód természetes degenerációja miatt eltérő DNS szekvenciákat vezetünk be. (Elsőbbsége: 1980.06.06.)
5. 5) A 2—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (b), (e) vagy (h) pontban leírt, hibridizálni képes DNS molekulaként (j) p [325]-gHFIF-4 rekombináns DNS DNS-beiktatását, amelyet előnyösen az ATCC 31825 letéti számon deponált törzs hordoz, (k) a (j) pontban leírt DNS-beiktatáshoz hibridizálni képes DNS-molekulákat, vagy (l) a (j) és (k) pontban leírt DNS-beiktatásoktól, illetve DNS molekuláktól a genetikai kód természetes degenerációja miatt eltérő DNS szekvenciákat iktattunk be. (Elsőbbsége: 1980.06.06.)
6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS szekvenciaként a ATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAATTGCTCTCCTGTTGTGCTTCTCCACTACAGCTCTTTCCATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCGAAGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGCACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAATGAGATCATTGTTGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACT-38193507

   TACAGGTTACCTCCGAAAC VAGY ATGAG CTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAA GCAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTG TGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTG CCTCAAGCACAGGATGAACTTTGACATCC CTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTC CAGAAGGAGGACGCCGCATTGACCATCT ATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTT TCAGACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGG AATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGC TAATGTCTATCATCAGATAAACCATCTGAA GACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAÁ GAAGATTTCACCAGGGGAAAACTCATGAG CAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGA GGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAG TACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAG AGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCAT TAACAGACTTACAGGTTACCTCCGAAAC képletü DNS szekvenciákat vezetjük be. (Elsőbbsége: 1980.04.03.)
7. 7. A 2. igénypontszerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kifejeződést szabályozó szekvenciaként az alábbiak valamelyikét vezetjük be: lac rendszer, β-lac rendszer, trp rendszer, a λ fág fő operátor és promotor területe, fd burkoló fehérje szabályozó területe. (Elsőbbsége: 1980.04.03.)
8. 8. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti élj árás, azzal jellemezve, hogy a G-pPLa-HFIF-67-12, G-pPLa-HFIF-67-12A19, G-pPLc-HFIF-67-8, G-pPLa-HFIF-67-12AMl vagy G-pPLa-67-12A19 BX-2 rekombináns DNS-molekulákat állítjuk elő, amelyeket előnyösen a DSM 1851 —1854 letéti számon, illetve az ATCC 31824 letéti számon deponált törzsek hordoznak. (Elsőbbsége: 1980.06.06.)
9. 9. Eljárás IFN-p-típusú polipeptidet kódoló DNS szekvenciát kifejezni képes E. coli transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely E. coli törzset a 2—

   8. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított rekombináns plazmiddal tarnszformálunk, antibiotikum-rezisztencia alapján transzformánsokat izolálunk, és a transzformánsok közül az IFN-p-típusú polipeptidet kifejező transzformánsokat kiválasztjuk. (Elsőbbsége: 1980.04.03.)
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) /DSM 1851/, E. coli Κ12ΔΗΙ (G-pPLa-HFIF-67-12) /DSM 1852/, E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12A19) /DSM

    1853/, E. coli M5219 (G-pPLc-HFIF-67-8) /DSM 1854/, E.-coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12ΔΜ1) /ATCC 31824/ és E. coli Κ12ΔΗΙ (G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2) transzformánsokat választjuk ki. (Elsőbbsége: 1980.06.06.)
11. 11. Eljárás ΙΕΝ-β-típusú polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 9. vagy

    10. igénypont szerinti eljárással előállított transzformánsokat megfelelő tápközegben tenyésztjük, és a tenyészléből a polipeptidet kinyerjük, és kívánt esetben tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1980.04.03.)
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal

    5 jellemezve, hogy az E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) /DSM 1851/, E coli Κ12ΔΗΙ (G-pPLa-HFIF-67-12) /DSM 1852/ E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12Δ19) /DSM 1853/, E. coli M5219 (G-pPLc-HFIF10 -67-8) /DSM 1854/, E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12AMl) /ATCC 31824/ vagy E. coli Κ12ΔΗΙ (G-pPLa-HFIF-67- 12Δ19 BX-2) transzformánsokat tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1980.06.06.)
13. 15 13. A 11. igénypont szerinti eljárás

    Met-Thr-Asn-Lys-Cys-Leu-Leu-Gln-Ile-AlaLeu-Leu-Leu-Cys-Phe-Ser-Thr-Thr-Ala-LeuSer-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-GIy-Phe-LeuGln-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe-Gln-Cys-Gln-Lys20 Leu-Leu-Trp-GIn-Leu-Asn-Gly-Arg-Leu-GIuTyr-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-AspIie-Pro-GIu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-Gln-GlnPhe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr- IleTyr-Glu-Met-Leu-Gln-Asn-lle-Phe-Ala-Ile25 Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-TrpAsn-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-AIaAsn-Val-Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-LysThr-Val-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Glu-Lys-GIuAsp-Phe-Thr-Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser30 Leu-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-IleLeu-His-Tyr-Leu-Lys-Ala-Lys-Glu-Tyr-SerHis-Cys-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-Glu-Ile Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Tyr-Phe-Ile-AsnArg-Leu-Thr-Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn vagy Met35 Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-GIy-Phe-Leu-GIn-ArgSer-Ser-Asn-Phe-Gln-Cys-Gln-Lys-Leu-LeuTrp-Gln-Leu-Asn-Gly-Arg-Leu-Giu-Tyr-CysLeu-Lys-Asp-Arg-Met-asn-Phe-Asp-Ile-ProGlu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Phe-Gln40 Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr-GIuMet-Leu-GIn-Asn-Ile-Phe-Ala-Ue-Phe-ArgGln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn-GluThr-IIe-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-Ala-Asn-ValTyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-Lys-Thr-Val45 Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Glu-Lys-Glu-Asp-PheThr-Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu-HisLeu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Ile-Leu-HisTyr-Leu-Lys-Ala-Lys-Glu-Tyr-Ser-His-CysAla-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-Glu-Ile-Leu-Arg

    50 Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu-Thr-GlyTyr-Leu-Arg-Asn képietű polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tenyészléből a tárgyi kör polipeptidet nyerjük ki. (Elsőbbsége: 1980.04.03.)

    55 14. Eljárás vírus-, rák- és tumorelienes gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a 11 —13. igénypont bármelyike szerinti eljárással előállított ΙΕΝ-β-típusú polipeptidet valamely, a gyóθθ gyászaiban elfogadható hordozóval összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.

    (Elsőbbsége: 1980.04.03.)