SU1417800A3 - Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК pER-33,кодирующей зрелый @ -интерферон человека - Google Patents
Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК pER-33,кодирующей зрелый @ -интерферон человека Download PDFInfo
- Publication number
- SU1417800A3 SU1417800A3 SU853935004A SU3935004A SU1417800A3 SU 1417800 A3 SU1417800 A3 SU 1417800A3 SU 853935004 A SU853935004 A SU 853935004A SU 3935004 A SU3935004 A SU 3935004A SU 1417800 A3 SU1417800 A3 SU 1417800A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- fragment
- plasmid
- eco
- per
- interferon
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
Abstract
Изобретение относитс к области генетической инжекции, в частности к способу получени плазмиды, пригодной дл получени интерферона типа о. Предлагаемый способ получени рекомй, бинантной плазмиды заключаетс в том, что в плазмиду pER 103 ввод т промотор-операторный RBS-фрагмент, после обработки Hind HI эндонуклеазой и фосфатазой данную плазмидную ДНК через линкерную последовательность легируют с 1РЫ-о -последов 1тельностью, причем в полученную таким образом плазмиду через EcoRI-Bam HI линкер ввод т par-Lokus, выделенный EcoRI эндонуклеазой из плазмиды рРМ 31, или же ДНК фрагмент длиной л/130 Ьр, полученный путем обработки плазмиды pER 33 ферментами EcoRI и Ват HI. I СО
Description
см
Изобретение относитс к генетической инженерии, в частности к способу получени плазмиды, пригодной дл получени интерферона типа d .,
Предлагаемый способ получени плаз- МИДЫ, кодирующей зреЛый о/-интерферон
человека, заключаетс в том, что плазмиду pER 103, .которую получают путем расщеплени pBR322 эндонуклеазами с последующим удалением Есо Rl-Hind Ill-фрагмента длиной 29 Ьр и введением ДНК-последовательности формулы
5 AATTCACGCTGATCCCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3 GTGCGACTAGCGATTTTGTAAGACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG
I Promotor -
GCGAACCAGTTAAGTAGTACAGAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA Promotor/Operator
20
в результате реакции лигировани пос- ле его обработки Hind ИГ и фосфата- зой спивают с линкерной последовательностью формулы
LinkerИ
AGGTTAAAGATGTGT
ATTTGTACACAGTAG
ИН FN-o/-Gen
к которой присоедин ют кодирующую IEN- i -последовательность, причем дополнительно в полученную таким образом плазмиду через Есо Ri-BamHI-линкер ввод т par-Lokus, выделенный Есо RI эндонуклеазой из плазмиды рРМ 31, или же ДНК-фрагмент длиной примерно 1300 Ър, полученный путем обработки 30 плазмиды pER33 ферментами Есо RI и Вага HI.
Конечную плазмиду трансформируют в Escherichia coli НВ 101, и отбирают
25
DMTr-0Чо
у
IГ
Si-(CH2)3-N-CO-(CH2)2-CO-0
OC2Hj
ОС2Н5 Н
Удельна нагрузка составл ет 68- 104 мкмоль нуклеозида на 1 г материала-носител .
П р и м е р 2.- 5 -Диметикситритил- дезокситимидин-3 -хлорметоксифосфит.
Полностью защищенные нуклеозид-3 - хлорметоксифосфиты синтезируют по 50 .известным способам, 544,6мг (1,0ммоль) 5 -диметокситритил-тимидина (DMTrTd; раствор ют в 1,О мл абсолютного ТГФ и этот раствор при -78°С в течение 15 мин в атмосфере аргона прикапывают к перемешиваемому раствору 0,9 мкмоль метилдихлорфосфита в 0,5 мл абсолютного пиридина и 2,0 мл абсолютного
нужные клоны, трансформированные плаз- мидой и культивируют их известными методами.
Изображение иллюстрируетс следую щими примерами.
И р и м е р 1. Функционализацию полимерного материала-носител осуще- .ствл ют по известным способам. В качестве материала-носител служит HPLC- силикаГель (Macherey SNageL), размер зерен 20 мкм, размер пор 200 А). Его дериватизируют методом Mateucci и .Caruthers, за исключением того, что стадию сукцинировани осуществл ют с помо.щью ангидрида нтарной кислоты в безводном пиридине. Защищенные нук- леозиды таким образом св зывают ковалентно с силикагелем соответстен- но следующей формуле
DMTr-0ТГФ . Через 10 мин реакционный раство нагревают, до комнатной температуры и центрифугируют. Надосадочную жидкость перенос т с помощью пипетки в сухую заполненную аргоном колбу со шлифом (25 мл). При комнатной температуре растворитель отсасывают в ва- .кууме, затем добавл ют по 0,5 мл толуола И ТГФ и снова выпаривают, причем в качестве продукта остаетс бесцветное вспененное твердое вещество . Этот продукт не анализируют на его чистоту, а раствор ют в 10,0м абсолютного пиридина и этот раствор хран т под аргоном при -20°С вплоть
/до дальнейшего применени (максимально в течение одной недели).
П р и м е р 3. 5 -Диметокситритил- N -изобутирил-дезоксигуанозин-З -хлор- метоксифосфит.
Аналогично примеру 2 получают -раствор этого нуклеозидфосфорохлоридита в 10,0 мл пиридина из 640,0 мг (1,0 ммоль- З -диметокситритил-N -изобутил-дезок- сигуанозина.
Пример4. 5 -.Т иметокситритилсмесью н-бутанол-дутид
в)осуществл ют 4 п абсолютным пиридином;
г)неконденсировани нуклеотидной единицы: го раствора 5 -диметок ситимидин-З -хлорметок мер 5) (примерно 100 м
Q гоном добавл ют, в фрит му носителю и его встр воре, врем реакции со
д)осуществл ют 3 п
N-бензоил-дезоксицитидин-З -хлорметок-- абсолютным пиридином; сифосфит.
Аналогично примеру 2 получают раствор этого нуклеозидфосфорохлоридита в 10.,О мл пиридина из 683,7 мг (1,0 ммоль) 5 -диметокситритил-N 15 е) осуществл ют оки три-эфиром фосфористой мощью 100 мг иода, рас 3 мл смеси из ТГФ, луг ( 2:2:1), врем реакции
бензоил-гдезоксицитгидина.
ПримерЗ. 5 -Диметокситритил- N -бензоил-дезоксиаденозин-З -хлор30
метоксифосфит,
Аналогично примеру 2 получают раствор этого нуклеозидфосфорохлоридита в 10,0 мл пиридина из 657,7 мг (1,0 ммоль) З -диметокситритил-Ы - бензоил-дезоксиаденозина.
П р и м е р 6. Синтез d-TCCTTA.
50 мг (5 мкмоль) содержащего MTrdA полимерного носител (см, пример 1) внос т в стекл нную фритту Соответственно .следующему шагу затем обавл ют различные растворители и растворы реактивов; носитель в ней кратковр еменно встр хивают и раствор после желательного взаимодействи снова удал ют тем, что с помощью тока аргона его вытесн ют вверх через
фритту.
Ч40
а)Отщепл ют ВЖг-группы с помощью
3 мл раствора из 70 г бромида цинка, 00 мл нитрометана и 5 мл воды, врем реакции 10 мин;
б)осуществл ют 4 промывки по 3 мл
25
35
45
498
.Нагрузка (мкмоль/г)2а О2бци )(Фактор разбавлени )
вес носител (мг)
можно рассчитать загрузку материала- носител диметокситритильными защитными группа ми. Получают 43 мкмоль/г. Это соответствует среднему выходу 83% на. стадию конденсации.
Отщепление метильных остатков от триэфирных групп фосфорной кислоты.
Материал носител в течение 43 мин встр хивают в 4 мп раствора тиофено- ла, триэтиламина и диоксана (1:1:2),
смесью н-бутанол-дутидин-ТГФ (4:1:5);
в)осуществл ют 4 промывки по 4 мл абсолютным пиридином;
г)неконденсирование ближайшей нуклеотидной единицы: 1 мп пиридинового раствора 5 -диметокситритил-дезок- ситимидин-З -хлорметоксифосфита (пример 5) (примерно 100 мкмоль) под аргоном добавл ют, в фритту к полимерному носителю и его встр хивают в растворе , врем реакции составл ет 10 мин;
д)осуществл ют 3 промывки по 3 мл
абсолютным пиридином;
е) осуществл ют окисление сложным три-эфиром фосфористой кислоты с помощью 100 мг иода, растворенного н 3 мл смеси из ТГФ, лугидина и воды (2:2:1), врем реакции 7 мин;
ж) осуществл ют 3 промывки по 4 мл
ТГФ;
з) ацетилируют непревращенные З - ОН-группы с помощью раствора 150 мг 4-диметиламино1Шридина, 0,3 мл кол- лидина, 0-, 25 мп ацетангидрида и 2,5 мл ТГФ, врем реакции 3 мин;
и) осуществл ют 4 промывки по 3 мл нитрометаном.
Цикл от а) до и) повтор ют теперь четыре раза, причем на стадии г) используетс необходимый дл последовательности нуклеотидный структурный элемент.
После приконденсировани последнего нуклеотидного структурного элемента материал носител высушивают в вакууме масл ного насоса, пробу взве- щивают с точностью до 1 мг и смешивают с 10,0 мл 0,1 М раствора толуол- сульфокислоты в ацетонитриле. Путем происход щего при этом отщеплении ди- метокситритил-катиона получают оранжево-красный окрашенный раствор, абсорбци которого измер етс при 498 нм. По формуле
498
50
55
затем промывают метанолом, после этого эфиром.
Материал носител в течение 14 ч нагревают с 10 мл концентрированного аммиака при , водный раствор затем отсасывают и фильтрат концентрируют в вакууме примерно до 2 мл.
Полученный сырой продукт, содержащий на 5 -конце диметокситритильную группу, подвергаетс воздействию об 5 . 14 ратимой фазы HPLC. Колонна -Bonda- pak С. фирмы Waters; элюант: 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер с рН 7 с 25% ацётонитрила; истечение 2 мл/ /мин; врем удержани 14 мин Со.бран- иыб фракции лосле элюировани концентрируют примерно до объема 1 мл., смешивают с 10 мл 80%-ной уксусной кислоты и оставл ют на 30 мин при . комнатной температуре. Затем концентрируют в вакууме при досуха, остаток раствор ют в 25 мл воды и отщепленный диметокситританол экстрагируют 3 раза по 15 мл эфиром. Водную фазу снова концентрируют досуха, остаток раствор ют в 2,5 мл воды, обессоливают на биогеле Р 2.Сколонна: 60 X 1,7 см) и диофйлизируют.
В качестве контрол чистоты служит аналитическа HPLC-диаграмма. Колонна 300 X 3,9 мм, p-Bondapak фирмы Waters; элюанты: 0,1- М триэтилам™ монийацетатный буфер с рН 7 с 12% ацётонитрила; истечение 1,5 мл/мин, врем удерживани 3,7 мин.
Пример 7. Синтез d-TAAGGAGGTTTA.
Получают аналогично примеру .6 ис- ,од из 300 мг. (30 мкмоль) DMTrdA -P
HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 X 3,9 мм, fx-Bondapak С/, фирмы Waters; элюант 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер с рН 7 с 12% ацето- .нитрила; истечение 1,5 ил/мин, врем удерживани 4,4 мин.
И РИМ е р 8/ Синтез d-ACCTTAAACC
Получают аналогично примеру б исход из 200 мг (16 мкмоль) DMTrdC -P.
HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 X 3,9 мм, (U-Bondapak С(, фирмы Waters; элюант 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер с рН 7с 12% ацётонитрила; истечение 1,5 мл/мин, врем удерживани .3,4 мин. П р и М е р 9. Синтез d-CATCTTTA.
Получают аналогично примеру 6 ис - ход из 150 мг ( 1,32 мкмоль) DMTrdA -P.
HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 X 7,8 мм, |U-Bondapak С g фирмы Waters; элюант: 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер с рН 7с 20% ацётонитрила; истечение 1,5 мл/мин; врем удерживани 7,7 мин.
ПрИ Мер 10, Синтез d-AGCTTAAAGATG
Получают аналогично примеру 6 исход из.. 200 мг (16,2 мкмоль). DMTrdG Р.
V
800 6
HPLC-диаграмма продукта: колонна.. 300 X 7,8 мм, |U-Bondapak С. фирмы Waters; элюант 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер, рН 7 с 26% ацётонитрила; истечение .1,5 мл/Мин; врем удерживани 5,2 мин. . П р и М е р 11 . Синтез d-TGTGATCTGCCTCA;
Получают аналогично примеру 6 ис- 0 ход из 250 мг (22 мкмоль) DMTrdA -P.
HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 X 7,8 мм, (U-Bondapak С- фирмы Waters; элюан-т 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер, рН 7 с 25% ацетонит- 5 рила; истечение 1,5 мл/мин; врем удерживани 6,1 мин.
Пример 12. Синтез d-CAGATCACA. Получают аналогично примеру 6 исхо- , д из 150 мг (13,2 .мкмоль) DMTrdA -P. 0 HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 X 7,8 мм, wBondapak фирмы Waters; элюант 0,1 М триэтиламмоний-. ацетатный буфер с рН 7 с 20% ацётонитрила; истечение 0,2 мл/мин; врем 5-удерживани 5,2 мин.
Анализ последовательностей синтетически полученных олигодеоксинуклео- тидов осз ществл ют посла того, как они встроены в интерферрнпродуцирую-, 0 щую плазмиду pER 33.-С, помощью этого анализа одновременно подтверждают правильность последовательности оснований в олигооксинуклеотидах.
П р и М е р 13. Плазмида рВР 101, котора содержит примерно фрагмент размером Ю ОО Ьр, кодирующий трипто- фановый оперон Serratia marcescens, представл ет собой- исходный ма.териал дл выделени промотор-операторной области. Эта регул торна область находитс . внутри Есо RI-Hae Ill-фрагмента длиной 90 Ьр, в котором промо- тор -ориентирован в направлении Есо RI-- Нае III.5 Примерно 25 мг плазмиды рВР 101 переваривают рестрикцис1нно.й эндонуклеа- зой Есо RI, два образующихс фрагмента отдел ют друг от друга путем гель- электрофоре з а (1,4% агарозы) и-фраг0 мент длиной 200 Ьр электтрофоретически элюируют из гел . Этот фрагмент затем переваривают с. помощью Нае III, оба продукта переваривани раздел ют на - 6%-ном полиакр иламидном геле и фраг
5 мент длиной 90 Ьр (промотор-оператор) - снова выдел ют из -гел .
RBS составл ют из 3-х синтетичес ких олигонуклеотидов: 6-мера 5 -ТССТТА, 10-мера 5 -AGCTTAAACC и 12-мера 55
Q
7141
TAAGGAGGTTTA. 500 n-моль 6-мера фос- .форилируют с помощью фермента полн- нуклеотидкиназы и при этом радиоактивно маркируют. Реакционную смесь в течение 10 мин нагревают при , чтобы .инактивировать киназу, после чего добавл ют эквимол рные количества (не фосфорилированных) 10-мера и 12-мера, смесь олигонуклеотидов нагревают до и затем медленно (примерно через 3 ч) охлаждают, до 30- 35 С, причем олигонуклеотиды гибриди-. зуютс один с другим:
12 тег
dTAAGGAGGTTTA dATTCCTCCAAATTCGA
бтег 10 тер
Благодар добавке 0,25 мкмоль АТР и 5 мкмоль ДТТ 6-мер и 10-мер с помощью фермента ДНК-лигазы ковалентно св зывают друг с другом. Отсутствие фосфатных остатков на 5 -концах 12- мера и 10-мера предотвращает возникновение многомерных продуктов лигатуры . После реакции осуществл ют нагре- .вание в течение 10 мин при , чтобы инактивировать лигазу, после чего добавл ют 0,5 ммоль АТР и 5 ммоль ДТТ в дальнейшую реак1щю киназы также ки- назируют 5 -концы 12-мера и .10-мера, благодар чему получаетс RBS.
12 пмоль Есо RI-Hae-III-промотор- операторного фрагмента длиной 90 Ьр лигируют в стандартных услови х с помощью 60 пмоль RBS. Полученный благодар Нае III разрезу тупой конец фрагмента размером 90 Ьр легируют с тупым концом RBS и получают молекулы, в которых содержат RBS в направлении ориентации вниз от промотора. После реакции лигазу инактивируют в течение 10 мин при , устанавливают концентрацию ТА-буфера и дополнительно переваривают с помощью 200 единиц Hind III и 10 единиц Есо RI.
В образующихс в реакции мульти- мерах нар ду с желатальной реакцией могут, лигироватьс друг с другом как Есо RI-концы, так и также Hind III- концы и снова превращатьс в мономеры . Затем пробу раздел ют на 6%-ном полиакриламидном геле и вырезают из гел промотор-операторный RBS-фраг- мент. размером 100 Ьр, который имеет
08
Есо RI- и Hind Ill-концы электрофо- ретически элюируют, 1тобы отделить от избытка нелигированного RBS. При этом ответственна за экспрессию часть экспрессионного плазм11да готова .
Примерно 2 мг плазмлды pBR 322 разрезают с помощью рестрикционных
ферментов Есо RI и Hind III, причем образуютс два фрагмента:- большой с 4382 Ьр и малый с 29 Ьр. Большой фрагмент путем -электрофореза на 0,8%-ном геле агарозы отдел ют от маленького
фрагмента, вырезают из гел и элюируют . Примерно 0,4 пмоль этого фрагмента затем лигируют с 10 (пмол ми промотор ) onepafop-RBS-фрагмента.
pBR 322-фрагмент из-за своих двух
не подход щих друг к другу выступающих концов не может лигироватьс сам с собой, поэтому промотор-операторный RBS-фрагмент может лигироватьс только в одной ориентации в плазмиде в
направлении Hind III-сайта, до тетра- циклинрезистентного гена pBR 322.
Escherichia coli KB 101 трансформируют с помощью реакционной смеси последне:го лигировани известным образом , трансформанты селекционируют на содержащих ампициллин агаровых пластинках. Дл этого Е-.coli НВ 101- клетки выращивают до плотности примерно 2 X 10® клеток/мл. Клетки пеллети- руют и суспендируют в 100 мкмоль раствора CaClj (20 при ). После этого клетки инкубируют с реакционной смесью реакции лигазы в течение 5 мин при О - 4° С и в течение 5 мин при
37°С. После добавки 0,5-1 мл 1-бульо- на инкубируют далее в течение 15- 30 мин при 37°С. Выбирают 19 трансформантов и с помощью Нйе 111-рестрик- ционных -перевариваний испытывают на
их возможное содержание промотор-операторного RBS-фрагмента. pBR 322/Нае- Ш-фрагмент длиной 192 Ьр замен ют 264 Ьр-фрагментом (16 Ьр размером Нае III с сайтом на конце в pBR 322
50
влево от Есо RI-сайта + 103 Ьр промотор/операторного RBS-фрагмента + -+ 145 Ьр Hind Ill-места среза вплоть до ближайшего Нае dIII-места среза вправо от него, в 322). Из 19 . gg отобранных трансформантов 18 обладают ожидаемым образцом переваривани .
Дл того чтобы установить правильность сконструированной экспресссион- ной плазмиды одну из этих плазмид
9 . . 14
(pER 103) подвергают последовательному анализу и его положение устанавливают в pBR 322. Последовательный анализ провод т по методу Махат и Gilbert в направлении от Есо Rl-сайта в направлении Hind III-санта (и сверх 1него), как также от Hind-III-сайта в направлении Есо RI-сайта (и сверх него).
Плазмида pER 103 таким образом содержит промотор-операторную область триптофанового оперона Serratia marce scens в, комбинации с синтетической RBS. Нова плазмида прокотирует транс крипцию генов, которые встраиваютс в его Hind I II-сайт, и позвол ет осуще- , ствл ть эффективную трансл цию этих
продуктов транскрипции.
I
Пример 14, Примерно 1 мкг Pst 1-вставки 1F17 переварива:ют с помощью Sau ЗА и из полиакрил- амидного гел выдел ют фрагмент длиной 177 Ьр, который простираетс от Sau ЗА-сайта на NHj-концевом цистеи- новом кодоне вплоть до ближайшего Sau ЗА-сайта и содержит Ava Ill-сайт, Его обрабатывают 1 единицей щелочной фосфатазы и после удалени фосфатазы благодар экстракции фенолом и эфир ром осаждают с помощью этанола. Фрагмент затем обрабатывают Ava II, благодар чему получают желательный фрагмент 34 Ьр Sau 3A-Ava II и 143 bp- фрагмент,
12 тер
AGCTTAAAGATGTGTiGATCTGCCTCA
3 ATTTCTACACACTAckc t„j tI I
Hind Ш
8mer9mer
Ii
Mel Cyc
Получают 4 синтетических олигонук- леотида, а именно 14-мер -
TGTGATCTGCCTCA, 1 2-мер 5 -AGCTTAAAGATG 9-мер 5 -CAGATCACA и 8-мер 5 -
САТСТТТА.
По 250 пмоль 8-мера, 9-мера и 14-мера фо сфорилируют после реакции киназу инактивирувдт путем нагревани при 95 С, добавл ют 250 пмоль неки- назированного 12-мера и олигонуклео- тидную смесь медленно (примерно
780010
Параллельно этому из плазмиды1Р17 препарируют интерферонспецифический Ava II-фрагмент размером 646 Ьр, который простираетс от Ava 11-сайта внутри Sau ЗА-фрагмента размером 177 Ьр за концевой кодон. Примерно 0,5 мкг этого Ava II-фрагмента размером 646 Ьр вместе со смесью из
Q 34 Ьр и. 143 Ьр Sau 3A-Ava
II-фрагментов инкубируют с ДНК-лига- вой. Образующиес благодар этому фрагменты Ava II, которые ковалентно св заны, фланкируют Ava Il-Sau ЗА- . 5 фрагментами. Как только Ava Il-Sau ЗА-фрагмент лигируетс с фрагментом Ava II, на этом месте не может более происходить никаких других лигироваг. НИИ, так как Sau ЗА-концы дефосфори0 лируютс . После лигировани осуществл ют нагревание в течение 10 мин при , чтобы инактивировать фермент, затем добавл ют 5 мкмоль ДТТ и 0,25 мкмоль АГР и дефосфорилированные
5 Sau ЗА-концы снова кинезируют. Реакционную смесь раздел ют на 6%-ном по- лиакриламидном геле и молекулы в области 700-800 Ьр (646 Ьр Ava II-фрагмент фланкирован двум Ava Il-Sau
0 ЗА-фрагментами) и в области 1300- 1500 Ьр (два друг с другом лигирован- ные 646 Ьр Ava II-фрагменты фланкироч ваны Ava Il-Sau ЗА-фрагментами) элю- ируют.
Получение олигонуклеотидного ком35
плекса формулы 14гпер
Sau ЗА
в. течение 3 ч) охлаждают до 35 С, чтобы сделать возможной гибридизацию олигонуклеотидов. Затем после добавки 5 мкмоль ДТТ и 0,25 мкмоль АТР олигонуклеотиды лигируют друг с другом. Отсутствие фосфатного остатка на 5 -конце 12-мера предотвращает образование димеров; выступающий нец 14-мера не самокомплементарен, он не может приводить к димеризации.
11
Лликвотную часть (25 пмоль) лиги- рованного олигонуклертидного комплекса переваривают с помощью 80 единиц Sau ЗА, чтобы получить подобающий интерфероногену Sau ЗА-конец. Затем пробу нагревают в течение 10 мин при 75 С, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Таким образом, последовательный фрагмент, который св зывает интерфероноген с Hind 11Г-.срезанным pER 103 согласно изобретению, г отов.
Св зывание интерфероногена и оли- гонуклеотидного комплекса, лигирова- ние в pER 103. .
Изолированные фрагменты интерферона , которые представл ют собой примерно 1 пмоль молекул, св зывают с Sau ЗА-разрезанным олигонуклеотидным комплексом (примерно 25 пмоль) путем лигировани когазивных Sau ЗА-коицо.в. Снова отсутствие фосфатного остатка на Hind Ill-конце олигонуклеотидного комплекса (12-мер) предотвращает возникновение мультимеров. Образуютс молекулы интерфероногена, которые с обеих сторон олигонуклеотидного комплекса фланкирова.ны свободными Hind Ill-концами. После денатурировани . при нагревании .лигазы и добавки 5 мкмоль ДТТ и 0,25 мкмоль АТР .эти концы фосфорилируют, -затем осуществл ют , осаждени е с помощью из опро пано- ла, чтобы отделить также образовавшиес в реакции лигировани димеры олигонуклеотидного комплекса. После этого конструкцию лигируют с помощью 0,05 мкг Hind III, обработанной эндо- нуклеазой и фосф.атазой плазмиды pER 103. Обработка фосфатазой Hind Ill- разрезанной плазмиды уменьшает его рециркул цию в реакции лигированн . Таким образом, смесь плазмиды готова, она содержит до 50% продуцирующих интерферон -плазмид (а-именно тех плаз- ид,. которые получают из Э4 Ьр Sau 3A-Ava 1Г-фрагмента в лигировании с помощью 646 Ьр Ava II-фрагмента на начал.е гена. .
Трансформаци Es cherichia coli. ИВ 101 и анализ трансформации в отношении продуцировани интерферона.
Полученными плазмидами трансф.ор- мируют штамм Е.coli ИВ 101. Примерно 20% полученных трансформантов имеют вс тавки, из которых многие исследуютс на эксп рессию интерферона. Дл это- о 100 мл бактериальной культуры в М9 минимальной среде,, в которую до41
т .
. - , -
10
15
20
30
35
40
45
50
55
780012
бавлены все аминокислоты, кроме триптофана (20 мкг/м,п на аминокислоту), а также тиамин (1 мкг/мл),- глюкоза (0,2%) и индуктор триптофаноноперона индол-(3)-акрилова кислота (IAA, 20 мкг/мл, вьфащивают до оптической
плотности 0,6-0,8.- Бактерии пеллети- руют благодар центрифугированию в течение 10. мин при числе оборотов 7000 в 1 мин, промывают 1 раз 50 мп трис-HCl, рН 8, 30 мкмоль NaCL и суспендируют в 1,5 мл такого же буфера. После инкубации с 1 мг/мл лизозима в течение 30 мин на льду бактерии п ть раз замораживают и оттаивают и затем удал ют фрагменты клеток путем центрифугировани в течение 1 ч при 40000.об/мин. Надосадочную жидкость стерильно отфильтровыватот и испытывают в тесте по уменьшению п тен с
, 73-клетками и вирусом Vesicular, Stomatitis на интерферонную активность . Примерно половина всех клонов
25 (со вставками) обладает значительной инте-рферонной экспрессией: 2x10° единиц (международные стандартные единицы ) на 1л культуры.
Выбирают один из этих продуцирующих интерферон клонов (pER 33) и от промотор-операторной области подвергают последовательному -анализу далее вплоть до интерфероногена, чтобы установить правильность сконструированного плазмида. Последовательный анализ с нова осуществл ют по Махат и Gilbert от радиоактивно маркированного на З -конце Есо RI-сайта в .направлении интерферонгена.
Плазмида pER 103 содержит промотор- олераторную последовательность трип- тофаноперона Serratia marcescens в комбинации с синтетической последовательностью рибосомного св зывани . Встроенные в плазмиду pER 103 пригод- ньтм образом гены показывают высокие значени экспрессии. Плазмида pER 103 штамм бактерий в E.coli К, ВВ 10.1 сдана на хранение в немецкое собрание микроорганизмов, GrisebachstraBe 8, 3400 Геттинген/ФРГ, под номером DSM 2773 от 27 окт бр 1983 г., согласно Будапештскому .договору.
Пр И мер 15. 2 мкг pER 33 разре- вают с помощью рестрикционной системы Есо RI и Вага HI, благодар чему образуютс два фрагмента длиной примерно 1300 Ьр и примерно 4000 bpi Эти фрагменты равдел ют электрофоретиче.с1314
ки на 1,2%-ном агарозном геле. Более короткий, фрагмент выдел ют из гел путем электроэлюировани . Концы этих ДНК благодар добавке по 1,25 нмоль dATP, dGTP, dCTP и атТР, а также 2-х единиц Klenow-фрагмента ДНК-полимера зы 1 перевод т в тупые концы. ДНК очищают путем экстракции фенолом и осаждени из этанольного раствора и затем раствор ют- в 15 мкл HjO.
Примерно 15 пмоль Есо RI-линкера фосфорилируют по 5 -концам путем добавки у -р-АТР и Т4-полинуклеотид- киназы в 5 мл реакционного раствора. После инактивации нагреванием киназы добавл ют 5 пмоль АТР и О,1 единицы Т4-лигазы и инкубируют 16 ч при 14°С Реакционный продукт очищают путем осаждени изопропанолом от низкомолекул рных веществ.
ДНК затем разрезают с помощью 20 единиц рестрикционного фермента Есо RI, еще раз -очищают путем осаждени изопропанолом и раствор йт в 10 мкл воды.
Примерно 2 мкг pER 33 обрабатывают :рестрикционным ферментом Есо RI. Затем добавл ют щелочную фосфотазу, чтобы удалить 5 -фосфатные остатки длиной примерно 5300 Ьр, линейную ДНК путем электрофореза в 1, геле агарозы и электроэлюировани очищают от остаточной не разрезанной pER 33. ДНК экстрагируют фенолом и эфиром, осаждают из этанольного раствора и раствор ют в 10 мкл воды.
4 мкл снабженного Есо RI-линкерами ДНК-фрагмента, который содержит IFNaA ген плюс регул торные элементы лиги- руют друг с другом с 0,5 мкл обработанной Есо RI и дефосфорилированной pER-33 плазмидой в 20 мкл реакционного раствора с помощью 0,1 единицы Т4-лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 14 С фермент разлагают путем нагревани при .
Escherichia coli НВ 101 трансформируют аналогично примеру 1. Два из таким образом полученных клонов испытывают аналогично примеру 2 на экспрессию интерферона посредством теста на уменьшение п тна. В то врем как клон pER 33 содержит до 200 х 10 единиц IFN на 1 л культуры, с помощью одного из новых клонов pER 21/1 получают более чем 300 к 10 единиц на 1 л культуры.
0
Плазмиду pER 21/1 :выдел ют в большом количестве и анализируют с помо- щью переваривани рестрикционными ферментами с помощью Hind III. Так
j.
как введенна в pER 33 вместо Есо RI ДНК имеет два идентичных Есо RI-сай- та, то возможны две ориентации этой ДНК и pER 21/1. Рестрикционное ферментное переваривание плазмиды pER 21/1 Hind III 21/1 с параллельно направленными интерферонгенами должно давать фрагменты примерной величины 4100, 950 (2 фрагмента) и 450 Ьр.
Когда оба ориентированы противоположно , размеры фрагментов следующие 4350, 950 (2 фрагментаэ.и 200 Ьр. Пе- реванивание примерно 2 мкг pER 21/1 с помощью рестрикционной системы Hind
III и последующий электрофорез в
1,4%-ном геле агарозы дают фрагменты примерной величины 4100, 950 и 450 Ьр, Поэтому оба IFNaA-гена ориентированы параллельно друг другу.
Пример 16. Примерно 200 пмоль Есо RI линкера (New England Biolabs. inc.) в 20 мкл реакционного раствора фосфорилируют на концах с помощью. 9 единиц Т4-полинуклеотидкиназы и
10 пмоль АТР, затем фермента, инакти- вируют при нагревании.
8 мкг плазмиды рРМ 31 разрезают с помощью эндонуклеазы Ava.1. Концы этой разрезанной плазмиды путем, добавки по 5 пмоль dATP, dGTP,,dTTP, а также 4 единиц фермента Klenow- фрагмента полимеразы 1 перевод т в тупые концы.ДНК очищают путем экстракции фенолом и осаждени из этаг
нольного раствора и раствор ют в 40 мкл воды.
Есо RI линкер вместе с .обладающей линеоризованными и тупыми концами ДНК в 70 мкл реакционного раствора с
б пмоль АТР и 1 единицей Т4-лигазы обрабатывают 16 ч при 14°С. После инактивации фермента при нагревании в растворе устанавливают рН 7,6 с помощью 50 ммоль NaCl и 50 мкмоль
трис-С1 и ДНК обрабатывают 300 единицами Есо RI. Спуст 2 ч времени инкубации рестрикционный фермент денатурируют при,нагревании и ДНК отдел ют электрофоретически в 1,4%-ном
геле агарозы. Содержащий par-Lokus отрезок ДНК примерно длиной 400 Ьр электроэлюируют из гел , очищают путем экстракции фенолом и осаждени из этанольного раствора и раствор ют
151..:
1) 50 MKJi воды. Этот отрезок ДНК имеет специфические выступы на своих концах Есо RI.
Примерно 2 мкг pER 33 обрабатывают с помощью рестрикциониого фермента Есо R1. Затем добавл ют щелочную фосфата ЗУ, чтобы удалить 5 -фосфатные остатки. Линейную DNS длиной
5300 Vjp очИ1цают путем электроф.феза в 1,2%-ном геле аг ароэы и электроэлю- ировани от ocTiiTO4Horo не разрезанного pER 33.
ДНК-раствор экстрагируют фенолом и эфиром, осаждают из этанольного раствора и раствор ют в 50 мкл воды.
1 мкл разрезанной плазмидной ДНК лигируют с 1 мкл par-Lokus ДНК в 20 мкл реакционного раствора с помощью 0,1 единицы Т4-лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 14°С фермент инактивируют нагреванием. Escherichia coli НВ 101 трансформируют аналогично примеру 1. Получают примерно 50 колоний. Из 10 этих колоний выдел ют незначительное количество шшзмида ДНК и разрезают с помощью рестрикционного фермента Pst 1. Из анализа путем электрофореза в агарозе следует, что все плазмиды содержат примерно 400 Ьр длиной par-Lokus. Выбирают один из этих плазмид и обозначают par pER 33.
Аналогично примеру 2 культивируют бактерии, которые содержат либо pER, либо par pER 33, и затем испытывают в тесте с уменьшением п тна на содержание интерферона. Оба штамма показывают примерно один и тот же уровень экспрессии интерферона.
В опыте, осуществл емом длительное врем , который распростран етс на 120 генераций бактерий, исследуют стабильность плазмидов рЕК 33 pER 33 и Escherichia coli НВ 101 в от- Ьутствии селекционного давлени благодар антибиотику ампициллину. В регул рные интервалы берут из культуры пробы и испытывают бактерии на содержание интерферона.
Из этого устанавливают, что pER 33 бактерии, содержащие pER 33, после примерно 60 генераций продуцируют интерферон . Бактерии, которые содержат par pER 33, продуцируют интерферон Л А спуст еще 120 генераций.
Таким образом, показано, что введение par-Lokus в pER 33 (par pER 33)
17800И
повышает стаби.аыюсть плазмиды в Escherichia col i Н15 101.
5
Claims (3)
1.Способ конструировани рекомби- нантной плазмидной ДНК pER-33, кодирующей зрелый 0 -интерферон человека
путем выделени промот ор-операторной области размером 90 Ьр из плазмиды pBR 101 в результате обработки фрагмента ДНК, кодирующего тринтофановый оперон Serratia marcescens раз-мером
5 1000 Ьр эндонуклеазами Есо RI 6-мера 5 -СААТТС и Нае III 4-мера 5 -GGCC, (Конструировании последовательности рибосомного св зывани - RBS из трех синтетических олигонуклеотгщов
0 6-мера 5 -ТССТТА, 10-мера 5-. AGCTTAAACC и 12-мера 5 -TAAGGAGGTTTA, с последующим лигированием Есо RI- Нае Ill-фрагмента, кодирующего промотор-операторную область с последо5 вательностью рибосомного св зывани и дальнейшим встраиванием промотор- операторного RBS-фрагмента в плазми- ду pBR 322 путем лигировани большого фрагмента Есо RI-Hind III разме0 ром 4332 Ьр с промотор-оператором- RBS-фрагментом, с последующей трансформацией бактерии Escherichia coli полученными рекомбинантными плазми- дами и отбором клонов, содержащих
плазмиду pBR 103, при этом структурный ген fff-интерферона получают в результате лигиров ани Ava II-фрагмен- та размером 646 Ьр из Pst 1-вставки клона 1F7 со смесью фрагментов разQ мером 34 Ьр и 143 Ьр, полученных в результате обработки Pst 1-вставки клона 1F7, эндонуклеазой Sau ЗА, фос- форилированием полученного фрагмента длиной 177 Ьр с последующей обработкой Ava II-эндонуклеазой и св зыванием с олигонуклеотидным комплексом , сконструированным из синтетических олигонуклеотидов 14-мера 5- TGTGATCTGCCTCA, 12-мера 5 -AGCTTAAAGATG, 9-мера 5 -CAGATCACA и 8-мера 5- САТСТТТА, лигаты фосфорилируют и сшивают с 0,05 мкг Hind III, разрезанного и обработанного фосфотазой pER 103 с последующим трансформированием штамма бактерий E.coli НВ 101 полученными плазмидами и отбором клонов, содержащих конечную плазмиду.
2.Способ по п, V, отличающийс тем, что, с целью повыше5
0
5
171417800 8
ни стабильности плазмидЕЛ, плазмиду
3. Способ по п. 1,отличаюpER 33 обрабатывают Есо RI-эндонукле-щ и и с тем, что, с целью повышеазой н щелочной фосфазой, фрагментни выхода (/-интерферона, концы Есо
размером 5300 Ьр св зывают с par-Lo-RI-Bara Н1-фрагмента размером 1300 Ьр
kus, который получают путем лигирова-плазмиды pER 33 затупл ют Klenow-фрагни Есо RI фосфорилированного линкерамента ДНК полимеразы I в присутствии
с 8 мкг плазмиды рРМ 31, предвари-dATP, dGTP, dCTP и dTTP и лигируют
телнир расщепленной Ava 1-эндонуклеа-с Есо RI фосфорилированным линкером,
ЗОЙ и затупленной с помощью фрагмента юполученный фрагмент встраивают в лиKlenow полимеразы I в присутствиинеаризированную плазмиду pER 33, обdATP , dGTP, dCTP и dTTP, полученной рабатьшают щелочной фосфатазой
рекомбинантной ДНК трансформируюти лигируют с вьщеленньм ранее
штамм E.coli НВ 101 и отбирают клоны,геном, содержащие плазмиду par pER 33.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19823247922 DE3247922A1 (de) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1417800A3 true SU1417800A3 (ru) | 1988-08-15 |
Family
ID=6181687
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU833681952A SU1366064A3 (ru) | 1982-12-24 | 1983-12-23 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ θ' -ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА |
SU853935004A SU1417800A3 (ru) | 1982-12-24 | 1985-08-02 | Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК pER-33,кодирующей зрелый @ -интерферон человека |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU833681952A SU1366064A3 (ru) | 1982-12-24 | 1983-12-23 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ θ' -ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0115613B1 (ru) |
JP (2) | JPH088868B2 (ru) |
KR (1) | KR930005455B1 (ru) |
AT (1) | ATE62018T1 (ru) |
AU (1) | AU579991B2 (ru) |
DD (1) | DD216043A5 (ru) |
DE (2) | DE3247922A1 (ru) |
DK (1) | DK576983A (ru) |
ES (4) | ES528350A0 (ru) |
FI (1) | FI86991C (ru) |
GR (1) | GR78766B (ru) |
HU (1) | HU202277B (ru) |
IL (1) | IL70523A (ru) |
MX (1) | MX9202878A (ru) |
NO (1) | NO173742C (ru) |
NZ (1) | NZ206700A (ru) |
SU (2) | SU1366064A3 (ru) |
UA (1) | UA8035A1 (ru) |
ZA (1) | ZA839519B (ru) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0170204B1 (de) * | 1984-08-01 | 1991-09-25 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Neue genetische Sequenzen, die durch sie codierten Interferon-Peptide vom Typ I und diese sie produzierende Organismen |
US6291662B1 (en) | 1984-12-05 | 2001-09-18 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences |
DE3587875T3 (de) * | 1984-12-06 | 2003-01-02 | Amgen Inc N D Ges D Staates De | Rekombinantverfahren zur herstellung von serinproteaseinhibitoren, sowie dns-sequenzen dazu. |
FI90990C (fi) * | 1984-12-18 | 1994-04-25 | Boehringer Ingelheim Int | Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi |
DK151585D0 (da) * | 1985-04-03 | 1985-04-03 | Nordisk Gentofte | Dna-sekvens |
DK156072C (da) * | 1985-04-03 | 1989-11-06 | Nordisk Gentofte | Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted |
DE3514113A1 (de) * | 1985-04-19 | 1986-10-23 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Veraenderung der dna-sequenz zwischen shine-dalgarno-sequenz und startcodon des trp-operons zur steigerung der proteinexpression |
US4874703A (en) * | 1985-08-26 | 1989-10-17 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for use in E. coli |
DE3607835A1 (de) * | 1986-03-10 | 1987-09-24 | Boehringer Ingelheim Int | Hybridinterferone, deren verwendung als arzneimittel und als zwischenprodukte zur herstellung von antikoerpern und deren verwendung sowie verfahren zu ihrer herstellung |
DE3642096A1 (de) * | 1986-12-10 | 1988-06-16 | Boehringer Ingelheim Int | Pferde-(gamma)-interferon |
GB8813032D0 (en) * | 1988-06-02 | 1988-07-06 | Boehringer Ingelheim Int | Antiviral pharmaceutical composition |
WO1990005186A1 (en) * | 1988-11-04 | 1990-05-17 | The Upjohn Company | Somatotropin expression using a serratia promoter |
EP0626448A3 (de) * | 1993-05-26 | 1998-01-14 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von alpha-Interferon |
US5531880A (en) * | 1994-09-13 | 1996-07-02 | Microelectronics And Computer Technology Corporation | Method for producing thin, uniform powder phosphor for display screens |
FR2724665B1 (fr) * | 1994-09-16 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production de proteines recombinantes, plasmides et cellules modifiees |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
ATE25985T1 (de) * | 1980-06-12 | 1987-04-15 | Japan Found Cancer | Plasmid. |
ZA814375B (en) * | 1980-07-01 | 1982-07-28 | Hoffmann La Roche | Interferons and process for their preparation |
IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
DE3280127D1 (de) * | 1981-03-27 | 1990-04-12 | Ici Plc | Genetisch modifizierte mikroorganismen. |
DE3220116A1 (de) * | 1982-05-28 | 1983-12-01 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung |
DE3247923A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | Neue oligonucleotide und verfahren zu ihrer herstellung |
-
1982
- 1982-12-24 DE DE19823247922 patent/DE3247922A1/de not_active Withdrawn
-
1983
- 1983-12-02 GR GR73142A patent/GR78766B/el unknown
- 1983-12-14 DK DK576983A patent/DK576983A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-12-20 DE DE8383112812T patent/DE3382233D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1983-12-20 AT AT83112812T patent/ATE62018T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-20 EP EP83112812A patent/EP0115613B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-21 FI FI834700A patent/FI86991C/fi not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 NZ NZ206700A patent/NZ206700A/en unknown
- 1983-12-22 DD DD83258476A patent/DD216043A5/de unknown
- 1983-12-22 IL IL70523A patent/IL70523A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 ZA ZA839519A patent/ZA839519B/xx unknown
- 1983-12-22 HU HU834419A patent/HU202277B/hu not_active IP Right Cessation
- 1983-12-23 UA UA3681952A patent/UA8035A1/ru unknown
- 1983-12-23 JP JP58243626A patent/JPH088868B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-23 SU SU833681952A patent/SU1366064A3/ru active
- 1983-12-23 ES ES528350A patent/ES528350A0/es active Granted
- 1983-12-23 NO NO834792A patent/NO173742C/no unknown
- 1983-12-23 KR KR1019830006147A patent/KR930005455B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-12-23 AU AU22832/83A patent/AU579991B2/en not_active Ceased
-
1984
- 1984-06-07 ES ES533213A patent/ES533213A0/es active Granted
- 1984-06-07 ES ES533214A patent/ES8504930A1/es not_active Expired
- 1984-06-07 ES ES533197A patent/ES8503372A1/es not_active Expired
-
1985
- 1985-08-02 SU SU853935004A patent/SU1417800A3/ru active
-
1992
- 1992-01-23 JP JP4009692A patent/JP2637328B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-15 MX MX9202878A patent/MX9202878A/es unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Goeddel D.V. et.al. Human leukocyte interferon produced by E.coli is biologically active. Nature, 1930, 287, p. 411-416. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SU1417800A3 (ru) | Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК pER-33,кодирующей зрелый @ -интерферон человека | |
IE851475L (en) | Process for manufacture of thrombin derivatives | |
JP6817493B2 (ja) | 一本鎖rnaの製造方法 | |
HU197043B (en) | Process for the stabilization and selection of host-cells comprising recombinant dna | |
EP0225633B1 (en) | Production of thrombin inhibitors | |
EP0119621A1 (en) | Interleukin-2 | |
FI86993C (fi) | Foerfarande foer skyddande av en bakterie mot en i naturen foerekommande bakteriofag | |
EP0108387B1 (en) | Preparation of recombinant growth releasing factors | |
Hostomský et al. | Solid-phase assembly of cow colostrum trypsin inhibitor gene | |
KR100407835B1 (ko) | 니트릴히드라타제(NitrileHydratase)유전자발현을위한조절유전자 | |
JP2545377B2 (ja) | Dna配列体 | |
Putkey et al. | [25] Bacterial expression vectors for calmodulin | |
JP2587764B2 (ja) | N−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 | |
US6410272B1 (en) | Production of thrombin inhibitors | |
RU1438240C (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РТNF 22, СОДЕРЖАЩАЯ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИЙ ГЕН ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА - ПРОМЕЖУТОЧНАЯ ПЛАЗМИДА ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pTNF 31, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА | |
JPH06319567A (ja) | 大豆のホスホエノールピルビン酸 カルボキシラーゼ遺伝子 | |
RU1438241C (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк ртnf 33, кодирующая полипептид со свойствами фактора некроза опухоли человека, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека | |
JP2591713B2 (ja) | アシネトバクター・カルコアセチカスからの酵素ムタロターゼの製造のためのdna配列、組換えdna分子および方法 | |
RU1445193C (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pGA 23 - ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ ПРОДУКТ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pTNF 311Δ,-/,, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pTNF 311Δ,-/,, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА | |
EP0105521A2 (en) | Novel DNA, microorganism transformed therewith and use thereof | |
EP0248984A2 (en) | Production of cytokinins by microorganisms | |
EP3484907A1 (en) | Novel phosphotriazole mrna 5'-end cap analogs, composition comprising the same, rna molecule incorporating the same, uses thereof and method of synthesizing rna molecule, protein or peptide | |
JP2516737B2 (ja) | プラスミドベクタ−、その製造法および用法 | |
SU1294824A1 (ru) | Рекомбинантна плазмида @ 5 @ ,способ ее конструировани и штамм @ . @ @ 600 @ 5 @ -продуцент сайт-специфической эндонуклеазы @ п | |
JP2628961B2 (ja) | 新規ポリペプチド |