KR940001855B1 - 친화펩티드를 이용한 단백질의 정제 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

친화펩티드를 이용한 단백질의 정제

제1도는 프로인슐린의 펩타이드를 지령하도록 고안한 유전자의 합성설계도이며,

제2도는 화학적으로 합성한 올리고 뉴클레오티드를 프로인슐린을 지령하는 유전자로 조립한 후 DNA 분리용 변성 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동을 수행하여 확인한 결과이며,

제3도는 조립된 프로인슐린 유전자를 대장균의 플라스미드 pUC19에 삽입하여 플라스미드 pPINS를 구축하는 과정을 나타내며,

제4도는 플라스미드 pPINS 내에 존재하는 프로인슐린 유전자를 디데옥시 뉴클레오시이드를 이용한 염기서열 결정 방법에 따라 확인한 결과중의 일부이며,

제5도는 융합단백질의 발현을 위해 갈락토시다제의 일부유전자와 프로인슐린 유전자가 연결된 플라스미드 pPSH를 나타내며,

제6도는 발현을 위하여 프로인슐린의 5말단쪽에 친화펩티드(Affinity Tag)을 삽입하는 모식도로 이펩티드는 갈락토시다제 서열과 친화부위인 호모펩티드로 구성되어 있음을 나타내며,

제7도는 친화펩티드의 DNA 염기와 아미노산 서열과 제한효소의 위치를 나타내며,

제8도는 프로인슐린 융합단백질 유전자발현을 위한 플라스미드 pPRO를 나타내며,

제9도는 프로인슐린 융합유전자의 발현정도를 변성폴리아크릴 아미드젤 전기영동으로 확인한 결과이며,

제10도는 제9도에서 비교된 결과를 덴시토미터(densitometer)를 이용하여 정량적인 발현정도를 나타내며,

제11도는 금속염에 의한 프로인슐린 융합단백질 선별정제 결과를 나타내며,

제12도는 시안화브롬에 의해 융합단백질을 절단하였을 때 나타나는 펩티드를 변성 폴리아크릴 아미드젤로 전기영동한 결과이며,

제13도는 프로인슐린 융합단백질을 절단하고 그 산물에 대해 금속염(염화니켈)을 처리하여 아황산-프로인슐린이 정제됨을 폴리아크릴 아미드 젤상에서 확인한 결과이며,

제14도는 정제된 프로인슐린의 순도를 확인하는 방법으로 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이고,

제15도는 정제한 펩티드가 프로인슐린임을 확인하기 위하여 실시한 웨스턴 블럿팅의 결과를 나타낸다.

본 발명은 융합단백질로부터 원하는 단백질을 효율적으로 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 외래 단백질을 대장균등의 미생물에서 발현시킬 경우, 발현시키고자하는 외래 단백질(이하 '목적단백질'이라 함)의 분자량이 작거나 생체내에서 불안정할 경우, 흔히 비교적 안정한 단백질과 융합한 상태로 발현되도록 한후 목적단백질을 분리하는 방법을 사용하는데 (Goeddel. D.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 106-110(1979) ; Goldberg. A.L. and Dice, J.F., Ann. Rev. Biochem. 835-869(1974) ; Lin, S. and Zabin, I., J. Biol. Chem. 247, 2205-2211(1972)), 본 발명은 이 경우 융합 단백질에서 목적단백질 부분외의 단백질(이하, '기타 단백질'이라함)과 목적단백질을 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.

특히 목적단백질과 기타 단백질의 분자량 또는 물성이 비슷할 경우 이들의 분리가 매우 어렵게 되므로 정제가 어려워 수율과 순도에 문제가 생기게 되나 본 발명에서는 친화펩티드의 도입으로 물성을 변화시켜 금속염을 이용한 선별방법을 사용하여 손쉽게 이들을 분리, 정제할 수 있는 방법을 제공하며, 아울러 아황산화에 따르는 단백질의 물성 변화를 이용하여 융합단백질로부터 목적 단백질을 더욱 용이하게 분리, 정제할수 있는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 목적을 위해 적절히 제조된 플라스미드를 제공한다. 즉, 프로모터, 목적단백질과 융합시킬 기타 단백질을 코딩하는 유전자 및 친화펩티드를 코딩하는 DNA 염기서열을 포함하는 발현 플라스미드를 제공하여 발현시키고자 하는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 적절히 도입함으로서, 분리하기 손쉬운 형태의 융합단백질 즉, 친화 펩티드를 포함하는 융합단백질을 얻을수 있게 하며 아울러 상기 플라스미드에 의해 형질 전환된 대장균 균주도 제공한다.

이하 본 발명을 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.

인슐린, 인터페론등 동물 유래의 단백질은 임상적으로 각종 질환의 치료제로서 많이 사용되나 이들의 생산을 위한 동물체의 안정적 공급 문제와 제조공정상에서 미량의 불순물과 기타 상이한 단백질의 잔재로 말미암아 면역반응등을 유발시키고 바이러스등에 감염될 위험성을 충분히 내포하고 있었다. 그러나 유전공학기술을 이용하여 미생물로부터 이들 단백질을 생산하는 방법은 상기 문제점을 극소화하여 주요 단백질들을 안전하고 저렴하게 공급하는 것을 가능하게 하고 있다.

유전공학적 기법을 이용한 단백질의 생산에 있어서 가장 중요한 문제는 수율, 안정성, 순도 및 활성을 꼽을 수 있다. 인슐린등 몇몇 단백질을 대장균등의 미생물내에서 직접 발현되지 않아서 융합단백질의 형태로 발현을 시켜왔다. (Goeddel. D.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 106-110(1979) ; Talmadge, K. and Gilbest, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 1830-1833(1982) ; Lin, S. and Zabin, I., J. Biol. Chem. 247, 2205-2211(1972)),

일단 융합단백질이 발현되면 세포를 구성하는 단백질로부터 융합단백질을 고순도로 분리하는 것이 필요하며 이러한 형태로 다량 수득한 융합단백질로부터 목적단백질만을 분리·정제하는 것이 그 다음의 중요한 과제인데 이 경우 정제하고자 하는 목적단백질과 기타단백질의 분자량 또는 물성의 차이가 있어야만 용이하게 고순도로 정제할수 있다.

이러한 물성의 차이를 일으키는 방법에는 여러 가지가 있을 수 있으나, 본 발명에서는 융합단백질내 기타 단백질과 목적단백질의 연결부위에 7-15개의 아미노산으로 구성된 친화펩티드를 도입시킨 유전자를 제조하여 융합 단백질을 발현시킨 후 이 친화 펩티드로 인한 융합단백질의 물성 즉, 금속염과의 친화성을 변화시킴으로써 통상의 단백질 정제과정(Deutcher, M. P., Methods in Enzymoloqy, 182, 309-432)에 필요한 크로마토그래피 등의 복잡한 정제과정을 거치지 않고도 분리정제를 가능하게 하고 있다.

금속염을 이용한 친화성 선별 정제에서, 호모펩티드와 금속이온과의 친화성에 관해서는 1975년 호모 히스티딘과 니켈 또는 구리 이온과의 결합(Porath, J. et al., Nature 258, 598-599(1975)이 알려진 이래 간혹 관련 논문(Smith, M.C et al., Inorg. Chem. 26, 1965-1969(1975) ; Suh, Sung-sup et al., Protein Eng. 4권 3책 301-305(1991))이 발견되고 있으나 배위 결합에 의해 결합된다는 것외에 아직 분명한 기작은 밝혀지지 않고 있으며, 더구나 유용한 다른 단백질의 분리에 이를 이용한 예는 아직 발견되지 않고 있다. 다만 히스티딘-트립토판의 2개 아미노산으로 구성된 팹티드를 이용하여 인슐린을 융합한 trpLE 단백질로부터 정제한 사실이 있으나(Smith, M.C. et al., J. Biol. Chem 263, 7211-7215(1988)) 실제로 이용하기에는 융합단백질로부터 목적단백질만을 절단하여 분리하기가 어려운 문제점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 이를 개선하고자 연구한 결과 융합 단백질내 기타 단백질과 목적 단백질의 연결부위에 7-15개의 아미노산으로 구성된 친화펩티드를 도입하여 이 팹티드의 금속염 친화성을 이용함으로써 용이하게 목적단백질을 분리, 정제하는 방법을 개발하게 되었다.

본 발명에서 사용되는 바람직한 친화펩티드는 7-15개의 아미노산으로 구성되는 펩티드이며, 제7도에 도시한 바와같이, 호모알라닌, 호모히스티딘, 호모글루타민, 호모페닐알라닌, 호모글루탐산, 호모트립토판, 호모시스테인, 호모리신 또는 호모세린 등의 호모펩티드 또는 루이신-발린 또는 트레오닌-세린 등 2종류의 아미노산이 반복되어 나타나는 펩티드일 수 있다. 이들중 호모시스테인으로 구성된 친화펩티드가 특히 바람직하다.

또한 친화펩티드 및 목적 단백질의 아미노산 조성에 따라 아황산화 과정을 거쳐 정제과정을 더욱 완벽하게 수행할수 있다.

이러한 분리, 정제 방법에 있어서 유의해야할 점은 (ⅰ) 목적단백질과 기타단백질의 분자량에 차이를 두고, (ⅱ) 목적단백질의 아미노산 조성에 따라 도입되는 친화펩티드의 아미노산 서열을 결정하며(가능한한 서로 반대적 물성을 갖도록), (ⅲ) 목적단백질과 기타 단백질을 절단하는 방법에 따라 가능한한 편리하도록 아미노산 서열을 조정하는 것이다. 예를들면, 만약 시안화브로마이드(CNBr)에 의한 메티오닌 분해 방법(Gross ＆ Witkop, J. Biol. Chem. 273, 1856(1961)으로 단백질을 절단할 경우 절단되어야 할 부위외의 다른 부분에 있는 메티오닌 잔기를 유사한 아미노산으로 대치하여야만 목적단백질이 불필요하게 분해되는 것을 막을수 있으며, 목적 단백질이 특정 아미노산으로 된 호모펩티드 부분을 포함할 경우 같은 아미노산으로 이루어진 친화펩티드는 사용하지 않는 것이 좋다.

본 발명의 금속염을 이용한 친화성 선별 방법을 이용한 목적 단백질의 분리 정제에 사용할수 있는 금속염으로는 CuCl₂, MnCl₂, FeCl₂, CoCl₂, NiCl₂, ZnCl₂, 및 MgCl₂등이 있다. 이러한 금속염은 친화펩티드의 몰수 및 친화펩티드를 구성하는 아미노산 개수에 따라 결정되는, 반응시 포함되는 총 아미노산 몰수(친화펩티드중에 포함되는) 이상의 몰수를 갖도록 농도를 조절하여 사용한다.

본 발명의 단백질의 분리, 정제 방법에 따르면, 별도의 크로마토그래피 등 복잡한 정제과정 없이도 용이하게 목적단백질을 95% 이상의 고순도를 얻을 수 있다.

또한 본 발명에서 제공하는 발현 플라스미드의 프로모터는 대장균내에서 작동가능한 프로모터는 모두 사용할 수 있으며 tac 프로모터가 바람직하나 여기에 한정되지는 않고, 또한 다른 박테리아나 효모등의 미생물에 응용할 경우 원하는 숙주세포내에서 작동가능한 프로모터는 어느 것이든 사용할 수 있으며, 또한 목적단백질에 융합시킬 기타 단백질은 세포내에서의 안정성이 입증된 갈락토시다제(유럽특허 0055945, 미합중국 특허 4, 451,396)의 일부 또는 전부를 사용하는 것이 바람직하고 갈락토시다제의 특성을 크게 변화시키지 않는 범위내에서 일부 아미노산 서열을 변형시켜 사용하는 것도 가능함은 물론이며, 갈락토시다제외의 안정성있는 단백질도 유용하게 사용할수 있다.

목적단백질은, 생성하고자 하는 외래 단백질은 모두 가능하며 특히 인슐린, 인터페론, 특정 바이어스 항원 단백질등 임상적으로 유용한 단백질의 생산에 사용할수 있다.

아래의 실시예들은 본 발명을 구체화하여 설명하기 위해 제공하는 것이고 본 발명의 범위가 여기에 제한 되는 것은 결코 아니다.

[실시예 Ⅰ]

[프로인슐린과 갈락토시다제 융합 단백질의 발현을 위한 플라스미드의 제조]

[(단계1) 프로인슐린 유전자의 제조 ]

자동화된 고상 포스파이트 합성법(Carthers, M.H., 71 page, In Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene fragment, Eds. Gasser, H.G. and Lang, A., Verlag Chemie, Weinheim, F.R.G)을 채택하여 제1도와 같이 설계한 프로인슐린의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 합성한 올리고뉴클레오티드를 6-15%의 변성 폴리아크릴아미드 젤에서 전지영동하여 정제하였으며, 이 올리고뉴클레이티드중 5'- 말단을 제외한 15개 올리고뉴클레오티드 단편의 5'-말단의 수산기를 γ-³²P-ATP를 이용하여 DNA 인산화효소 반응에 의해³²P로 인산화시켰다.

이후 방사성을 가진 각 올리고 뉴클레오티드들은 셉 팩칼럼을 통과시켜 미반응의 ATP를 제거한후, 방사능을 측정하여 동일량이 되도록 조정하였다. 이 올리고뉴클레오티드를 DNA 결합 효소를 이용하여 14℃에서 12시간 반응시켜 연결조립하였다. 최종적으로 조립된 유전자들을 5-10%의 DNA 분리용 변성 폴리아크릴아미드 젤 상에서 전기영동을 수행하고 이를 X-선 필름에 노출 및 감광시켜 프로인슐린 유전자의 위치를 확인한후 (제2도), 겔상에서 이 유전자에 해당하는 부위만을 절취하여 완충액을 용출해낸 다음 에탄올에서 침전시켜 프로인슐린 유전자를 정제 회수하였다.

[(단계 2) 합성 프로인슐린 유전자의 클로닝 및 염기서열 확인]

공지의 대장균 플라스미드(plasmid) pUC 19(Norrander, J. et al., Gene 26, 101-106(1983))를 제한효소 Shp Ⅰ과 Bam HⅠ 으로 절단한후 여기에 상기에서 제조한 프로인슐린 유전자를 대체하여 삽입하였다. 제한 효소 Sph Ⅰ 과 Bam H Ⅰ을 동시에 첨가하고 30∼40℃에서 1시간 반응시킨 플라스미드 pUC 19를 절단한후 페놀(phenol) 및 클로로포름(chloroform)으로 추출하고 에탄올로 침전시켜정제 회수한 플라스미드 단편 0.1㎍에, 단계 1에서 정제한 프로인슐린 유전자를 2배몰량 첨가하고 14℃에서 2시간 동안 DNA 결합효소(New England Biolabs in USA. 1 unit/10㎕), APT(1mM), 50mM Tris-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl₂, 20mM 디티오트레이톨 및 소혈청알부민(50㎍/㎖) 존재하에 총부피를 30㎕로 하여 반응결합시켜 삽입하였다.

상기 연결 반응 혼합물을 사용하여 대장균 균주 JM109(KCTC No. 2427)을 형질 전환시킨 후, 선별용 배지에서 원하는 플라스미드를 가진 대장균을 선별 분리하였다. 형질전환을 하기 위해 하나한(D. Hanahan)에 의해 공지된 방법(DNA Cloning, 제1권, 109∼135쪽(1985)을 사용하였다. 대장균 플라스미드 pUC 19에 프로인슐린 유전자가 삽입되면 갈락토시다제(galactosidase)의 유전자가 활성을 잃는다는 사실을 바탕으로 하여, 배지 1밀리리터당 50마이크로 그램의 암피실린(ampliclin)과 1마이크로몰의 아이피티지(IPTG, isopropy-β-D-thiogalactopyranoside)및 0.02%의 엑스갈(X-gal, 5-bromo-4-chlor-o-3-indolyl-gaactopyranoside)을 가진 엘비(LB)고체 배지(1리터당 박토트립톤 10g, NaCl 10g, 효모 추출액 5g 및 박토아가 16g 포함)를 선별용 배지로 하여 흰색 콜로니를 형성하는 대장균을 분리선별해 내었다. 이렇게 선별분리한 대장균 균주로부터 공지의 방법에 따라 플라스미드를 정제하고, 이들 제한효소 Eco RⅠ. Bam H Ⅰ, Hind Ⅲ, Pvu Ⅱ 그리고 Stu Ⅰ등으로 분해하여 프로인슐린의 유전자가 원하는 위치에 원하는 방향으로 삽입된 플라스미드인지 여부를 확인하여 이를 pPINS라고 명명하였다(제3도).

플라르스미드 pPINS 내의 프로인슐린 유전자가 삽입되어 있는 위치 주변의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드들(5'-ACAACGTCGTGHCTGGGAAAACCC-3', 5'-GCTATGACCATGATTACGCCA-3')을 프라이머(primer)로 하여, 생거(F.Sanger)등에 의해 공지된 디데옥시뉴클레오사이드(dideoxynucleoside)를 이용하는 염기서열 결정법 (Proc. Natl. Acad. U. S. A 74, 543, (1977))에 따라 삽입된 프로인슐린 유전자내의 염기서열을 확인하였다. 제4도는 플라스미드 pPINS에 삽입된 프로인슐린 유전자의 염기서열을 결정한 것 중 일부로서, 앞서 고안 및 설계한 것과 동일한 것을 알수 있었다.

(단계3) 프로인슐린 및 갈락토시다제 융합 유전자의 발현벡터 제조 프로인슐린 유전자를 대장균 내에서 발현시키기 위해서는, 이들 유전자가 강한 프로모터(promoter) 에 연결되어야 하며, 또한 유전자산물의 생산을 최대화하기 위해서는 유전자 발현이 유도되는 체계이어야 한다. 우선 프로인슐린 유전자 그 자체를 발현시키기 위해서 발현 벡터의 일종인 pKC 223-3(Pharmacia사로부터 구입 ; Brosius, J and Holy. A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 81, 6929(1984))에 PUC 플라스미드의 복제개시점을 도입하여 제조한 플라스미드 pKC 의 탁(tac)프로모터 뒤에 프로인슐린 유전자의 해석 단위가 일치하도록 연결하였다. 즉, 이들 플라스미드를 제한 효소 Hind Ⅲ으로 분해한후, 이를 Sl 핵산분해효소(nuclease)로 분해하여 접착 말단(cohesive ends)을 평활 말단(blunt ends)으로 만들었다. 이렇게 얻은 플라스미드 단편에 단계 1에서와 같은 방법으로 합성한 Eco RI 연결체 올리고뉴클레오티드(5'-CGGAATTCCG-3')를 DNA 결합 효소의 존재하에서 결합시키고 대장균 균주 JM 109에 도입시킨 다음, 플라스미드를 분리하여 제한 효소 Hind Ⅲ의 인식부위를 상실한 것을 선별하였다. 제한 효소 Hind Ⅲ위치가 Eco RI으로 바뀐 플라스미드 pPINS를 제한효소 Eco RI으로 절단하고 프로인슐린 유전자만을 아가로스 겔상에서 용출하여 플라스미드 pKC의 탁(tac)프로모터 다음의 제한효소 Eco RI 위치에 삽입하였다. 이와같이 하여 플라스미드 pPINS에서 다시 결합된 플라스미드를 pKPIN이라고 명명하였다.

또한, 플라스미드 pT-6(Choi, Y.C. et al., Kor. Biochem. J. 21 102(1988))를 제한효소 Pst Ⅰ과 Sal Ⅰ으로 절단하여 탁(tac)프로모터 영역을 지닌 단편과 베타갈락토시다아제 서열 일부를 단계 1의 프로인슐린 유전자와 같은 방법으로 화학적으로 합성하여 조립하고 위의 단편에 연결시킨후 Hind Ⅲ와 Sst Ⅰ으로 분리한 프로인슐린 유전자를 삽입하여 연결하여 융합단백질 발현벡터를 제조하였다. 이렇게 하여 제조한 플라스미드를 pPSH 이라 명명하였다(제5도 참조).

[실시예 2]

[친화펩티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드의 합성 및 발현 벡터로의 삽입]

상기 실시예 1의 단계 1서와 같은 방법으로 제7도에 나타낸 친화펩티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 자동 DNA 합성기(Applied Biosystem)를 이용하여 고상 트리에스테르포스파이트(triesterphosphite)방법으로 합성한 후 각 올리고 뉴클레오티드들은 DNA 키나제로 인산기를 붙였다. 이때 운반체인 앞의 플라스미드 pPSH를 제한효소 Bal Ⅱ로 절단하고 소의 장에 있는 포스파타아제로 인산기를 제거한후 인산화된 올리고뉴클레오티드를 넣어 DNA 결합효소(T₄DNA Ligase)를 사용하여 연결시켰다. 제한 효소 Pvu Ⅱ를 절단한후 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 친화펩티드를 코딩하는 올리고 뉴클레오티드가 삽입되었음을 확인하여 플라스미드 pPRO(제8도)를 구축하였다. 친화펩티드로 10개의 히스티딘을 포함하는 플라스미드 pPRO를 함유하는 대장균 E. coli MV 1184/pPRO를 1991년 11월 21일자로 유전자 은행에 기탁번호 KCTC 0024 BP로 기탁하였다.

[실시예 3]

[친화 펩티드를 포함하는 융합 단백질의 발현]

친화펩티드를 코딩하는 올리고 뉴클레오티드 및 프로 인슐린 융합 단백질의 유전자가 삽입된 플라스미드 pPRO를 대장균 균주 MV 1184내로 도입하고 다음과 같은 방법으로 복제 발현시켰다. 즉, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 가하여 2시간 정도 배양하고 이때 얻은 대장균을 변성 폴리아크릴 아미드 젤에서 전기영동하였다(제9도). 제9도에서 제1열은 표준분자량 단백질(킬로달톤 단위), 제2열은 발현을 유도하지 않은 대장균의 전체 단백질, 제3열은 플라스미드 pPSH를 함유하는 대장균의 발현이 유도되었을때의 전체 단백질을 나타내며 제4열은 플라스미드 pPRO를 함유하는 대장균이 발현유도 되었을 때의 전체 단백질을 나타낸다.

[실시예 4]

[금속이온 흡착에 의한 프로인슐린 융합단백질의 정제]

실시예 3의 대장균 균주를 대량으로 배양하면서 발현시켜 프로인슐린 융합단백질을 다량 생산한 후, EDTA를 포함하는 50mM 트리스 완충용액(pH 8.0, NaCl 100mM, 10% 슈크로즈 포함)에 현탁하여 초음파 파쇄기로 분쇄한 다음 원심분리하여 다량의 융합 단백질 부분을 얻었다. 강한 단백질 변성용액인 우레아나 구아니딘-HCl을 포함하는 상기 트리스 완충용액에 녹였다. 이런 방법으로 융합단백질을 정제하는 것은 공지의 사실(Fiona A.O. Marston, Biotechnology, 9월호, 800쪽(1984))이다. 이 융합 단백질을 9배 부피의 20mM 인산화칼륨 완충용액(pH 10.7)로 회석시켜도 녹아있게 된다. 일반적으로 투석을 통해 융합 단백질을 용출시키지만 금속염용액(CuCl₂, MnCl₂, FeCl₂, CoCl₂, NiCl₂, ZnCl₂또는 MgCl₂)을 총 히스티딘의 개수에 따르는 물농도와 같은 몰 농도를 갖도록 가했을 때 단백질 침전되었고 이때 융합단백질만이 침전되었음을 확인한 것이 제11도에서 확인할 수 있다. 제11도에서 제1열 및 제2열은 융합단백질 용액에 황산구리(CuSO₄)를 가한 상층액 및 침전물, 제3열 및 제4열은 융합단백질 용액에 염화니켈(NiCl₂)를 가한 상층액 및 침전물, 제5열 및 제6열은 융합단백질 용액에 염화아연(ZnCl₂)을 가한 상층액 및 침전물을 나타내며 제7열 및 제8열은 융합단백질 용액에 염화마그네슘(MgCl₂)를 가한 침전물 및 상층액을 각각 나타낸다.

[실시예 5]

[융합 단백질의 절단 및 금속 이온 흡착을 이용한 프로 인슐린의 정제]

아미노산 메티오닌이 시안화브롬에 의해 분해된다는 사실은 이미 널리 알려졌으며, 그 메카니즘까지 규명되었다. (Gross ＆ Witkop, J. Biol, Chem 237, 1856(1961)). 실시예 4에 의해 정제된 융합단백질을 1-5㎎/㎖가 되게 증류수에 녹였다. 동량의 중탄산 암모늄 완충용액(0.4M)과 2%(v/v)의 머켑토에탄올을 가해 주었다. 완전히 공기와 차단시킨 후 상온에서 약 18시간 방치하여 융합단백질을 포함하는 팹티드 이외의 화합물을 녹여내고 이를 진공건조를 통해 완전히 건조시켰다. 용매로 70% 개미산(formic acid)에 녹인 다음 메티오닌에 대해 100배의 몰비로 시안화 브롬을 가했다. 공기가 차단된 상태, 즉 질소가스로 채운후 밀봉하고 빛이 차단된 상태에서 24시간 상온 반응을 실시하였다. 이후 시안화브롬을 제거하고 증류수에 투석하여 절단된 팹티드를 회수하였다(제12도). 제12도에서 제1열은 표준분자량 단백질, 제2열은 부분정제한 융합단백질을 나타내며 제3열은 부분정제한 융합단백질을 시안화브롬으로 절단하여 친화펩티드를 포함하는 갈락토시다제와 프로인슐린으로 나뉜 것을 각각 나타낸다. 융합 단백질의 절단 후 산물은 잘리지 않은 융합 단백질, 친화펩티드를 포함하는 갈락토시다제 그리고 프로인슐린으로 이는 하기의 웨스턴 블럿팅 단계에서 확인할수 있다.

시환화브롬에 의해 절단된 펩티드를 pH 4.5, pH 5.0, pH 8.0, pH 10.7의 증류수에 차례로 투석한 후, 염화니켈(NiCl₂)에 의한 침전을 시도하였다(제13도). 제13도에서 제1열은 부분 정제한 융합단백질, 제2열은 시안화브롬으로 절단한 융합단백질, 제3열은 금속에 의해 정제된 프로인슐린, 제4열은 금속에 의해 침전되어 분리된 융합단백질과 친화펩티드를 각각 나타내며 제5열은 표준 단백질을 나타낸다.

시안화브롬에 의해 절단된 산물은 세가지(절단되지 않은 융합단백질, 친화펩티드를 포함하는 갈락토시다제 및 프로인슐린)로 이중 프로인슐린만이 친화팹티드를 포함하지 않고 있으므로 금속염에 의해 침전되지 않아 간단하게 정제하였다. 이때, 펩티드에 대한 염화니켈의 비율은 호모펩티드를 이루는 아미노산의 개수 및 호모 펩티드의 몰수에 따라 그 총 아미노산 몰수 이상의 몰수를 갖도록 조성하였으며, 본 실험결과는 과량의 염화니켈을 가한 것이다. 비교적 호모펩티드의 길이가 길기 때문에 거의 모든 pH 구간에서 정제된 상태의 프로인슐린을 보여주었다. 정제된 단백질이 프로인슐린이라는 것은 웨스턴 블럿팅과 아미노 말단의 펩티드 서열분석을 통해 확인할 수 있었고, 그 정제 정도를 변성 폴리아크릴 아미드 젤(제15도)과, 고속 액체크로마토그래픽 분석으로 확인 (제14도)한 결과 순도가 95%로 나타났다.

제14도의 고속 액체크로마토그래피에 의한 분속에서 용매는 0.1% TFA(trifluoro acetic acid)를 완충용액으로 하여 아세토니트릴을 0에서 100%까지 농도구배를 주어 분석하였고 분석 파장은 220㎚였다. 속도는 분당 2㎖씩 흘러보냈고 컬럼은 역상 C₁₈컬럼을 사용하여 금속침전에 의해 정제된 프로인슐린을 분석하였다.

제15도에서 A는 변성 폴리아크릴아미드 젤을 코마시블루로 염색한 것이고 B는 같은 젤을 웨스턴 블럿팅한 결과를 나타낸다. 제1열은 세포파쇄액의 상층액, 제2열은 세포파쇄액의 침전물, 제3열은 부분정제한 융합단백질, 제4열은 시안화브롬으로 절단한 후의 융합 단백질을 각각 나타내며 제5열은 금속에 의해 정제된 프로인슐린을 나타낸다.

[실시예 6]

[아황산화에 의한 프로인슐린의 정제]

프로인슐린 융합단백질의 우레아(urea)추출과, 이어서 시안화브롬에 의한 이 융합단백질의 절단과 아황산화를 별도의 정제과정 없이 진행하였다. 이때 프로인슐린(5g), 7.5M 우레아와 1mM EDTA가 들어있는 탄산암모늄 완충용액(400㎖)에 녹인후, 에탄올아민(∼1mM)으로 pH9.0으로 조정하였다. 여기에 5% 아황산나트륨(w/v)와 2.5% 테트라 티오산나트륨(w/v)을 50㎖씩 가하고 질소공기하에서 12시간 교반하여 반응시켰다(유럽특허 81306193. 4). 반응후 40mM 글리신 완충용액(pH 10.6)으로 투석하고, 얻어진 용액에 금속염(CuCl₂10mM, NiCl₂10mM등)을 처리하여 아황산-프로인슐린을 95% 이상의 순도로 정제하였다. 이결과를 폴리아크릴아미드젤 전기영동에서 확인하였다.(제13도). 이어서 금속에 비해 과량의 EDTA를 포함한 글리신 완충용액으로 투석하여 금속을 제거하였다. 프로인슐린 활성화는 공지된 방법으로 수행하였다(유럽특허 81306193. 4, P.G.Katsoyanis, P.N.A.S. (55) 1554(1966) ; Chin-Chen Wang, Biochemistry(25, 5336)(1986)). 프로인슐린 100㎎을 포함하는 아황산-프로인슐린 용액에 머캅토에탄올(1M, 1㎖)을 가하고, 95℃, 6분 반응 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이어서 공기산화방법으로 활성 프로인슐린을 제조할수 있었다.

상기와 같은 단백질 정제방법은 통상의 전문가에게 자명한 변형을 가해 사용하여도 기본의 발명사상을 같이하는 이상 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다.

또한 상기 실시예의 인슐린외에도 어떠한 유용한 단백질의 정제에도 본 발명을 적용할 수 있음은 물론이다.

Claims (14)

1. 목적단백질을 코딩하는 유전자를 기타의 펩티드나 단백질을 코딩하는 유전자와 융합시켜 생체내에서 발현시켜 생성된 융합 단백질로부터 목적단백질을 분리, 정제하는 방법에 있어서, 목적단백질을 코딩하는 유전자와 기타의 펩티드나 단백질을 코딩하는 유전자의 연결점에 7-15개의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열을 도입하여 목적단백질과 기타의 펩티드나 단백질의 사이에 7-15개의 아미노산으로 구성된 친화펩티드를 생성하고 이에 의한 단백질 물성 변화에 따른 금속염에 대한 친화성의 차이를 이용하는 선별방법을 포함하는, 융합단백질로부터 목적단백질을 분리, 정제하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 융합단백질을 절단반응하여 목적단백질을 융합된 기타 단백질에 친화펩티드가 포함되도록 절단한 후 금속염을 이용한 친화성 선별방법을 이용하여 목적단백질을 분리, 정제하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 융합단백질의 절단 반응 다음에 아황산화 반응을 거친 후 금속염 친화성 선별 방법을 수행하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 융합단백질 절단반응은 시안화브롬 절단반응을 사용하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 목적단백질의 융합단백질을 구성하는 다른 단백질로서 갈락 토시다제의 전체 또는 일부 또는 변형된 형태를 이용하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 친화펩티드가 7-15개의 글루탐산으로 구성된 호모펩티드인 방법.
7. 제1항에 있어서, 친화펩티드가 7-15개의 히스티딘으로 구성된 호모펩티드인 방법.
8. 제1항 내지 제7항의 어느 한 항에 있어서, 목적단백질이 프로인슐린인 방법.
9. 프로모터, 갈락토시다제 유전자의 전부 또는 일부, 및 7-15개의 아미노산으로 구성된 친화펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하며 임의의 단백질의 유전자를 연결하여 발현할수 있도록 제조된 플라스미드.
10. 제9항에 있어서, 상기 임의의 단백질의 유전자가 프로인슐린 유전자 플라스미드.
11. 제10항에 있어서, tac 프로모터 및 10개의 히스티딘으로 구성된 친화 펩티드를 포함하는 플라스미드 pPRO (KCTC 0024 BP) .
12. 제9항의 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 균주.
13. 제12항에 있어서, 대장균 E.coli MV 1184/pPRO(KCTC 0024 BP).
14. 제1항에 있어서 상기 금속염이 CuCl₂, MnCl₂, FeCl₂, CoCl₂, NiCl₂, ZnCl₂, 또는 MgCl₂인 방법.