CN109776654A - 一种亲和肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗体分离、纯化技术领域，具体涉及一种亲和肽及其应用。所述亲和肽的氨基酸序列如下：Glu Trp Trp Tyr Cys；该亲和肽可与免疫球蛋白结合，用于免疫球蛋白的清除、分离或纯化，与Protein A/G的效果相当，且安全性更好。

Description

一种亲和肽及其应用

技术领域

本发明涉及抗体分离、纯化技术领域，具体涉及一种亲和肽及其应用。

背景技术

抗体是一种由浆细胞分泌，能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。由于其特异性的结合能力可以作为治疗疾病的药物、疾病诊断的试剂和亲和分离的介质等，在生物、医药和化工等领域中有着广泛的应用，具有重大的社会和经济效益。

抗体的分离纯化是抗体应用的基础，目前工业中抗体的分离纯化采用Protein A/G亲和纯化介质，存在介质价格昂贵、易失活、清洗困难、Protein A/G脱落污染等问题。而其他的分离手段和介质也都不尽如人意，存在非特异性吸附、配体免疫原性和毒性等问题。所以抗体的分离纯化技术依然有待提高。

CN 103087150A公开了一种小分子亲和肽，所述小分子亲和肽的结构特征，自N端至C端如下：NH₂-R¹-R²-R³-R⁴-COOH，其中，R¹为Glu或Asp，R²和R³为Trp或Tyr或Phe，R⁴为Cys。并公开了其中一种亲和肽的氨基酸序列为Glu Trp Trp Cys，并通过实验验证了该亲和肽与免疫球蛋白IgG的结合常数为4.24×10⁴，解离常数为8.43×10^-4，反应平衡常数为1.99×10^-8；另一种亲和肽的氨基酸序列为Glu Trp Tyr Cys，该亲和肽与免疫球蛋白IgG的结合常数为1.18×10⁵，解离常数为1.11×10^-3，反应平衡常数为9.4×10^-9。但上述亲和肽用于配制亲和介质(与商用Protein A/G介质同材质)，并将上述亲和介质用于AKTA蛋白纯化系统纯化免疫球蛋白时，所得到的产物的纯度仅为90％左右，低于Protein A/G，纯化效果不理想。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种与Protein A/G纯化效果相当的亲和肽。本发明还提供了上述亲和肽的应用。本发明的目的还在于提供一种可用于免疫球蛋白纯化的亲和介质、该亲和介质的制备方法、包含上述亲和介质的用于纯化免疫球蛋白的亲和柱以及采用上述亲和介质进行免疫球蛋白纯化的方法。

本发明的亲和肽采用如下技术方案：一种亲和肽，所述亲和肽的氨基酸序列如下：Glu Trp Trp Tyr Cys。

优选的，所述亲和肽可与免疫球蛋白结合。

如上所述的亲和肽在非疾病诊断与治疗目的的分离、纯化或清除免疫球蛋白IgG中应用。

优选的，所述亲和肽在制备亲和介质或亲和柱中的应用。

一种亲和介质，包括如权利要求1或2所述的亲和肽和固体介质，所述固体介质可为酶标板、硝酸纤维素膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、透析器的中控纤维膜和葡聚糖凝胶等。

优选的，所述固体介质与商用Protein A/G介质同材质，例如为葡聚糖凝胶。

如上所述的亲和介质的制备方法，包括如下步骤：将所述亲和肽溶解于pH＝7.4的Hepes缓冲液中；加入巯基活化后的葡聚糖凝胶混合反应12h；反应结束后，用Hepes缓冲液洗涤葡聚糖凝胶颗粒，即可得所述亲和介质。

一种纯化免疫球蛋白的亲和柱，包括如上所述的亲和介质。

一种纯化免疫球蛋白的方法，包括如下步骤：使含有免疫球蛋白的待纯化样品接触如上所述的亲和介质；洗脱，收集所述免疫球蛋白。

优选的，所述洗脱液为：pH＝2.0的0.1M Hcl-Gly缓冲液,以保证洗脱同时不损伤蛋白。

本发明的有益效果是：

1)高效：该亲和肽可以与抗体特异性结合，用于纯化免疫球蛋白的效果与ProteinA/G纯化效果相当。

2)安全：该亲和肽无免疫原性，其残基序列取自20种必需氨基酸，安全无毒。

3)经济：该亲和肽由固相合成而得，技术成熟，廉价易得且便于质量管控。

4)Cys末端的巯基提供唯一交联端，可以实现定向交联，便于亲和介质制备，且不会影响亲和肽和免疫球蛋白的分离。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1亲和肽合成

1)活化树脂：称取1000mg Fmoc Cys-wang Resin，在DMF中浸泡30min溶胀。

2)脱保护：压滤除去DMF，加入含20％哌啶的DMF溶液氮气吹沸反应15min，压滤除去；用异丙醇洗涤树脂三次，10mL DMF洗三次，而后用茚三酮法(应呈黑色或紫色)检测树脂Fmoc脱除状况。

3)缩合反应：连接下一个氨基酸，称取1.4mmol FMOC-Tyr，以910mgTBTU、0.45gHOBt和0.52mL DIEA的10mL DMF混合溶液为反应液，室温下氮气吹沸反应2h。反应后，用异丙醇洗涤树脂三次，然后用DMF洗涤树脂三次，茚三酮法检测。

4)重复步骤2)～3)：按多肽的顺序自C端向N端延伸多肽。重复脱保护、洗涤、缩合的过程，依次将Trp、Trp和Glu连接完毕，完成多肽的连接。

5)多肽切割：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，采用TFA(三氟乙酸)、phenol、H₂O、thioanisole、EDT和TIS混合物(TFA/phenol/H₂O/thioanisole/EDT/TIS＝80/5/5/5/3/2，体积比)为切割试剂。将肽树脂置于圆底烧瓶中，加入上述切割试剂磁力搅拌2小时，过滤，除去树脂，滤液直接抽入冷冻乙醚中，3000r/min离心收集沉淀，冻干至恒重即得粗肽。

6)粗肽用HPLC纯化至95％以上，质谱鉴定。

实施例2亲和介质制备

1)取10mg亲和肽(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)溶解于10mL Hepes缓冲液，pH7.4。

2)取巯基活化后的葡聚糖凝胶1mL。

3)上述两者混合反应12小时。

4)反应完毕后，以Hepes缓冲液洗涤凝胶颗粒，可得亲和介质。

实施例3将实施例2得到的亲和介质用于分离纯化抗体

1)配制10mmol/L Hepes缓冲液，pH7.0，NaCl含量0.15M。设定流速1mL/min。

2)以1)中配制液体为流动相，运行AKTA蛋白纯化系统。

3)取实施例2制得的亲和介质1mL填装分离柱，以1mL Protein A/G预装柱为对照。

4)分别上样抗体发酵液1mL。抗体发酵液可为杂交瘤细胞的抗体发酵液或大肠杆菌的抗体融合蛋白发酵液。

5)配制pH2的0.1M HCl-Gly缓冲液作为洗脱液。

6)分别上样洗脱液3mL，收集洗脱液。

7)分别测定抗体发酵液、抗体吸附肽介质和Protein A/G介质的洗脱液中抗体含量和纯度，计算提取率(SDS凝胶电泳法测纯度，考马斯亮蓝法测含量)，结果参见下表1。

表1亲和介质分离柱和Protein A/G介质分离柱吸附特性比较

由表1可知，填装有本发明的亲和介质的分离柱可以实现将抗体从混合物中分离、纯化或清除出来的功能，性能与Protein A/G介质相当。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南阳师范学院

<120> 一种亲和肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Trp Trp Tyr Cys

1 5

Claims (10)

1.一种亲和肽，其特征在于：所述亲和肽的氨基酸序列如下：Glu Trp Trp Tyr Cys。

2.根据权利要求1所述的亲和肽，其特征在于，所述亲和肽可与免疫球蛋白结合。

3.根据权利要求1或2所述的亲和肽在非疾病诊断与治疗目的的分离、纯化或清除免疫球蛋白IgG中应用。

4.根据权利要求3所述的亲和肽在制备用于免疫球蛋白纯化的亲和介质或亲和柱中的应用。

5.一种亲和介质，其特征在于，包括固体介质和如权利要求1或2所述的亲和肽。

6.根据权利要求5所述的亲和介质，其特征在于，所述固体介质为葡聚糖凝胶。

7.一种根据权利要求6所述的亲和介质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述亲和肽溶解于pH＝7.4的Hepes缓冲液中；加入巯基活化后的葡聚糖凝胶混合反应12h；反应结束后，用Hepes缓冲液洗涤葡聚糖凝胶颗粒，即可得所述亲和介质。

8.一种纯化免疫球蛋白的亲和柱，其特征在于，包括如权利要求5-7中任意一项所述的亲和介质。

9.一种纯化免疫球蛋白的方法，其特征在于，使含有免疫球蛋白的待纯化样品接触如权利要求5或6所述的亲和介质；洗脱液洗脱，收集所述免疫球蛋白。

10.根据权利要求9所述的纯化免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述洗脱液为：pH＝2.0的0.1M Hcl-Gly缓冲液。