TW321651B - - Google Patents

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321651 A6 B6 五、發明説明——（1) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 琎明領城 本發明係蛋白質纯化的領域。更確切地說，係结合饜析 法與補體受體蛋白質鈍化法的應f。 發明赀县： 歷史上，蛋白質純化的程序可依分子大小、霣荷和欲纯 化蛋白費"與不要的蛋白·雜霣間之溶解度等差異加以設^ 實驗步驟根據i些參數*包括體樓篩斥層析法，離子交換 層析法，差異沉澱法等而制定。 體積篩斥曆析法，一般人稱為膠體過濾或通過膠體層析 法，係依據移動相中巨分子在固定相孔洞的穿透率而達成 分離效果。差異穿透率是粒子流體動力體積的函數。於是 ，在理想狀態下，大分子被摒除於内部粒子之外；而小分 子則易接近内涉粒子，故可根據蛋白質大小預判其先後溶 離順序，。因為在溶離體積與分子量之對數間存有一線性 闞係。體積-筛斥層析法的支撐物有交互鍵结的葡萄糖，如 色發羅.斯(Sephadex)，球形洋菜耱小珠如色裔羅斯 (Sephadex)(二者皆購:自瑞典，俄普撖拉，泛美視^司（一_ Pharmacia A§.))，交互鐽结的聚丙烯»胺如Bio-Gel®» ( 經濟部中央標準局貝工消费合作社印髮 齓自加州，雷曲蒙得，百爾瑞德實驗室（Bio Rad Laboratories)，或是乙二酵一異丁嫌酸酯共聚合物如 TOYOPEARL HW65S (購自 ToyoSoda CO·，東京.日本），均 為本發明所採用。 沉澱法是依據蛋白質粗混合物中，個別蛋白質藺.溶解度 -3 - 82.6. 40,000 本紙張尺度適用中國鹵家標準（CIVS)甲4规格（210 X 297公货〉 經濟部中央標準局βκ工消费合作社印製 321651 A6 _____B6_ 五、發听説明(2 ) 的差異而設計。雖然一棰蛋白質在水溶液介質中的溶解度 受許多因素的影響，但針對此處的討論，一般來說一種蛋 白質當與溶離的交互作用力大於與相同蛋白質分子或類似 分子間的交互作用力時，便會溶於溶劑中。為免受限於任 何描述沉澱琨象的特殊楗制理論，於是相信蛋白質和水分 子間的交耳作用為輿許多型態的無電荷基因產生氫鐽.且 在靜電學-上為偁極體，-與帶電荷基團和沉澱劑如一償陽離 · 子播類（碕酸i)與蛋白質競爭水分子•因此在高濃度鹽 類的環境下’蛋白質形同“脫水》 ，遂滅低與水溶液環境 的交互作用力；與相同或類似蛋白質分子間的凝聚力增加 ，於是從介質中沉澱析出。 離子交換層析法乃樣品中帶電荷之功能基團與吸附劑表 面相反電荷的離子功能基團之交互作甩。一般有二種形態 。陰離子交換學析法是帶負電荷的胺基酸支鍵（如天冬胺 酸和麩胺酸）與正電荷表面的交互作用，陽離子交換層析 法是帶正電荷的胺基酸殘基（如賴胺酸和精胺酸）與負電 荷表面JT交互作用。 ' 近年來親和性層析和:厭水性作用力層析技術的發g提供 一 傳铳的體積蹄/斥和離子交換層析法更多的支援A親和性層 析-法是蛋白質與一固定配位體的交互作用。配位體可針對 特定蛋白質有專一性，如基質，基質類似物，抑制劑或抗 體。有時候配位體可與許多蛋白質·反應。這些一般性配位 體例如腺核苷一磷酸，腺核苷二隣酸，尼古丁腺二核苷或 採用某些染劑回收特定類蛋白質。 -4 - 本紙張尺度適用中酉®家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.6. 40,000 L---.-----------------裝-------ΤΓ-----^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第8 2 10 5 9 8 6號專利申請案 Μ 說明書修正頁（83年f科9:度補克 於親和 間臂姐 水性作 質與厭 子強度 後，非 ，離子 水性作 和 考下列 素结合 ，介白 專利 和 五、發明説明（子） 厭水性作用力層析法最初 性膠體上，雖沒有親和性配 成。雖然有時亦使用術語厭 用力層析法（Η I C )較恰當’ 水性膠體間，並非層析程序 下最大，因此本分離法用於 常方便。從Η IC支撐物中溶 強度改變或加入亂度劑或有 用力層析法的一般原理可參 4,000,098 。應用 H 1C 純化 文獻：人類生長激素（美國 物（美國專利4,771, 128)， 4 , 743，680 )，腫瘤壞死因子 素-2 (美國專利4,908,434 ) 4,9 2 0 , 1 9 (5)和溶菌酶（風斯 F.E.雷格尼（Regnier), J. 359:13卜1 46 (1986) )。 本發明係關於將離子交換 析法结合應用K純化補體受 是觀察到蛋白質仍留置 位體，但膠體由碳氫空 水性層析法，但術語厭 因其交互作用發生於溶 。厭水性作用力在高離 鹽析法或離子交換法之 離蛋白質會受溶劑pH值 機修飾劑如乙二醇。厭 考美國專利3,917,527 特殊蛋白質的例子可參 專利 4,332,717) ，毒 抗溶血因子（美國專利 (美國專利4,8 9 4 , 4 3 9 ) ，人類淋巴毒素（美國 諾（Fausnaugh), J . L . Chroma tog 、沉澱法、Η I C和體積篩斥層 體分子及補體受體類似分子。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 線 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 發明篛沭： 本發明是一種從含有相似成份的混合物中纯化補體受體 蛋白質的方法，依序將混合物置於陽離子層析支撐物，厭 水性作用力層析支撐物和體積篩斥層析支撐物中，並選擇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 A6 B6 五、發説明.- (4 ) 性地從每一支撐物中溶離蛋白質。 本發明另提供從细胞質體中純化補體受艏蛋白質的方法 •含蛋白質的培養基依序置於3)陽離子交換層析* b)硫酸 銨沉#，c)厭水性作用力層析，d)陰《子交換層析· e)再 一次隈離子交換層析，f)體積篩斥層析中純化。 本發明另提供一種從细胞培養基中纯化補《I受體蛋白質 的方法如下述： ' (a) 濃縮细Ϊ培養基； (b) 將補體受體蛋白霣吸附於陽離子交換層析管柱中； (c) 用緩衝液清洗吸附蛋白質至少一次； (d) 將洗過之蛋白質溶離出； (e) 用硫酸銨沉澱蛋白質； (f) 再次溶解蛋白質； (g) 把（f)纟蛋白質吸附於厭水性作用力層析支撐物上 > (h) 選擇_性溶雄出蛋白質； (i) -吸Ί时（h)之溶離物於陰《子交換樹脂上Γ (j) 溶離皈附之蛋白：質；· '

(k) 吸附之溶離物於賜離子交換管柱中4 -（U溶離吸附之蛋白質L 經濟部中央標準局3工消费合作社印製 ()將（1)之溶離物置於體積篩斥層析中和； (η)回收蛋白質。 窃昍譁诚： - -6 - 82.6. 40,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 321651 A6 B6 五、發明"説明(5 ) (請先閱讀背面之注意事項再堉寫本頁) 本發明係鬮於補體受體蛋白質大量純化之蛋白質純化技 術。本發明非常有用，因其對受體蛋白質的回收率大於95 %之蛋白純度。本發明可應用於許多補體受體蛋白質和類 似蛋白宵的純化。 補體是一群血清蛋白質，依序被限制性水解活化，為人 體兔疫系竦的重要作用。補體活化是由先前已活化的補» 成份和抗Γ原/抗體複合物產生的交互作用。蛋白質水解片 斷是單獨由此i活化程序產生或其他蛋白質活化額外的補 體蛋白質，造成血液凝结因子功能的蛋白質水解連鎖反應 。另外，補涠可被细菌的细胞壁成份，蛋白質水解酶（如 血嫌維蛋白溶酶），或醣類複合物（如胰島素）活化。許 多生物活動是由補體系統（如免疫细胞分解、遇敏毒素的 產生、溶菌作用、向化性、溶血作用、調理作用和呑噬作 用）參與。 _ 目前已知四類補體受體（CR1-CR4)。補體受體1(CR1)是 補體成份db和C4b的受體。補體受體2(CR2)是C3dg或 C3d的-受賭。補體受體3(CR3)是C3bi的受體。福體受體 4 (CR4)是 C3dg的受體。- . 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 補體受g氣一型（CR1)存在於紅血球，單梭细胞/巨噬 胍胞」顆粒姐胞、B细胞 '某些T细胞，脾臓濾泡樹狀突 细胞和腎小球足樣细胞的细胞膜中。CR1與C3b和C4b结 合，是C3b/C4b最佳受體。—级序列已被定出（克 里克斯坦（K1 i p k s e i η )等人，J. Exp. Med. 165 ： 1095-1 1 12 ( 1987)，克里克斯迢等人，J . Exp . He-d . 本紙張尺度適用中國國家標準（CN—S)甲4规格（210 X 297公!* ) 82.6. 40,000 經濟部中央標準局8工消費合作社印製 A6 ___B6_ 五、發明·説明:(6 ) 168:1699-1717 (1988);荷爾蓋德(Hourcade)等人，«L_ Exp. Med. 1 68 ： 1 255 - 1 270 ( 1 988)。CR1 由 30儷短重複序 列（SCR)姐成，每個重複有60-70個胺基酸，其中有29個 平均65個胺基酸的SCR被保存下來。一般認為每個SCR會 形成一個三度空間的三環结構•乃經由第三與第一和第四 與第二半Μ肢酸的二硫鐽鍵结。7個SCRs進一步姐成四涸 長均質重~複（LHRs)。祺導序列之後•由N-端LHR-A分子姐 成C4b結合區，其後二涸重裡LHR-B和LHR-C ，姐成C3b 结合區，C端LHR-D之後有二個額外的SCRs，一為25個殘 基的假設通透膜區，一為43個殘基的细胞質尾巴。 CR1是均質SCR大家族的一員。此家族成員亦包括 C3/C4鍵结功能，如CR2, C4bP ,，因子Η, B和C2，Μ及 無此功能的蛋白質如介白素-2受體，釀蛋白I, Clr， 结合球蛋白α_，和因子Xlllb。 CR1是一譲蛋白·且其胺基酸序列中有24僩位置極易與 细胞外的寡""糖產生N-端鍵蛣。然而，在tunicamycin(庙必 蛮 aub-TTn)等人，·Τ . B i ο 1 · . 26.1 : 5736 (1'986)的存 在下，CR1的合成和葡糖胺含量分析（信（SU) / R i orhftm 23 2:883(1985)顬示。只有6-8偁位置可鍵结 寡此醣蛋白的N -端似乎.被阻斷了。 四種不同變異型的CR1 ，其長度有30-50 JcD的差異。這 些對偶基因的多樣性（變異型）在人類族群中有所差異（ 侯勒（Η ο 1 e r)等人 * P r 〇 c K a t i Acad S c i . USA 84:2459-2463(1987)) 。 F (或A)變異型是由4 個 LHR 姐 本紙張尺度適用中ail家搮準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.6. 40,000 ------------------------裝------#-----線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 經濟部中央標準局3工消费合作杜印製 五、發阱説明.（7 ) 成，約250KD ;較大的S (或B)變異型含有第5個LHR * 是5’-LHR B的一半和3’-LHR A的一半組成之怪物，被認為 擁有C3b第三個结合位置（王（Wong))等人_，IXL·.· 169 :847 (1 989))，約 290KD 。最小的 F，（或）C 變 異型會隨病人全身紅斑性狼瘡（SLE)的增加而增加（汎丹 (Van Π v π )等人 » Clin R x p . T m ι» υ η o 1 . 68:570(1987))和 狄克曼 HTy k m a π )' 等人 » Prod· Nat] · Arad. S c i , USA 80:1698(1983))，最可能起因於LHR-B和一個C3b結合位 置的刪除。 自然產生的可溶性CRl ,是在健康人和SLE的某些患者血 獎中發現（尤恩和法昂（Yoon & Fearon) »L_ Immuno 1 .… 134:3332-3338 ( 1985))。其特激與紅血球（细胞表面） CR1的结構和功能相似。 荷蓋德（Houncade)等人 J. Exp. Med . 168 :1255-1270(1988))同時覬察到人體CR1轉錄單位的另 一種聚腺有1酸化作用位置，CR1轉錄單位被認為能製造分 泌型^1一。由此短序列轉錄的》1^纟姐成01{1最^的8.5 ! , SCR ;如C4b结合區，：能編碼約80KD的蛋白質。當cDNA對 一一 應到此短序列，，會轉殖入C0S细胞並表現出所期待的 C4b .，但沒每C3b结合作用.（奇爾奚（Kyrch)等丄， F.A.S.R.B. J. 3：A368 (1 9 8 9 ))。奇爾奚等人亦在許多人 體细胞株中觀察到一個相似於所預‘测的niRNA*並假定此一 能與C4b结合的短、可溶性CRI是在人體中合成。 許多CR1可溶性Η斷均經由重組DNA步琢產生’籍消除 -9 - 本紙張又度適用中國a家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐〉 82.6. 40,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. 訂. Ψ. 經濟部中央標準曷貝工消费合作社印製 A6 B6 五、發咐説明.（8 ) 正在表現之DNA的透膜區域即可達成（法昂奪人.Inti. 專利案W089/09220 , 1 989 . 10 . 5和法昂茸人，Inti.專利 案W091 /05047, 1991.4.1 8 > °CR1可溶性片斷仍有活性 ，因荇能與C3b.和/或C4b鍵结，並依其所含的區域表現 因子I的輔因子活性。此外，它們可做為離jMCRl功能的 抑制劑，坷嗜中性氧化燔裂，補體參與之溶血作用，和 C3a ，CFa的製造。一種由質體sCRl/pBSCRlc纗碼的可溶 性CR1结構，ί逆被動arthus反應中檢視其活性（法昂塞_ 1，1989 & 1991和葉（Yeh)等人，免疫學期刊（J .

Immunol. )(1991))和抑制性後缺血心肌發炎和壞死（法昂 等 λ 1989 & 1990 和維士門(Weisman)!?人，科學 2 49 : 146- 1 51 (1990))。此外，sCRl/pBSCRlc產物與對-苯 甲醚化之人體血纖維蛋白溶酶原-鏈激酶-活化物之複合 物（APS AC)起共同作用形成類似APS AC的抗溶血活性，顯 示SCR1補體抑制劑與的聯合使用是一種有效的治療姐合物 (法昂 Inti.專利案 No. W091/05047, 1991.4.18) 0 - 補體受體類似蛋白質:亦可用本文方法純化，如果k行工 作上有必要^這些步驟可加以修改，非原創性的調整不會 影-響實驗的進行。這些蛋白質包括CRs之變異型和等位基 因*較短型•化學修飾型如PEG處理，和包含一部份的CR 的融合蛋白質。這些蛋白質被歸為補體受體類似蛋白質， 因為它們保有完整的CR1蛋白質特性，可依本發明步驟純 化。除非特別命名，否則術語補體受體蛋白質亦包·括補體 -10 - 本紙張尺度適用中aia家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.6. 40,000 ----------------. --------裝------訂-----線 {請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 321651 A6 _B6___ 五、發听説明（9 ) 受體類似蛋白質。CR-1類似蛋白質代表一群類似CR之蛋白 質•包括等位基因，較短型，化學修飾型和源自CR-1變異 型之融合蛋白。可溶性補體受體1 (sCRl)，本文定義為人 體CR1之可溶形式，含有30個细胞外SCR區域，是CR-1類 似蛋白質的一個特殊例子。 本發明之補體受體蛋白質可用許多技術製得。如果需要 整條原始'蛋白鐽，可由_上述特定细胞來源中抽取原始分子 。當需要可溶形式時，原始蛋白質分子的片斷較合逋。於 是可利用DN A編碼所需之蛋白鏈片斷·如重姐DAN方式般 表現蛋白質片斷。本發明對於從調轚之各棰生產sCRl重姐 细胞株培養基中纯化sCRl特別有效。也許有人會認為每代 细胞株間和和種補體受體產物間會有變異，本文已採用一 種普通技藝•使特定细胞株產生特定的補體受體蛋白質。 經濟_中喪標準房貝工消费含作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再壜寫本頁) - 通常，基因編碼蛋白質如補體受體，是將需要的多胜呔 區域DNA片斷植人重姐DNA載體（如病媒）中*再將載髑 轉殖入適當之原核或真核寄主中。適合的原核寄主包括* 但不止―贝厂此，大腸桿菌Escherichia ·.鍵徽菌 S t. r ft d t 〇 m v π e s，芽抱+桿-菌B~a c i 1 1 u s等等。適合的真核寄主 包括，但不.止·如此，酵母菌如Saccharomyce's._’和動物培養 勝胞如V E ROtHeLa，老鼠C127，中國倉鼠卵巢细胞（CH0), WI-38, BHK, COS, MDCK，和昆蟲细胞株。特別合適者為缺 少二氫葉酸堪原酶如ATCC CRL 179 3, CRL 9096的CH0细 胞株和其他後述的细胞株。逭些重姐技術現在均已非常普 遍，記載於睹素方法學(學院出版社）6 5，6 9卷（V9 7 9 )和 -11- 本紙張尺度適用中國Η家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 82.6. 40 〇〇〇 321651 A6 ___B6______ 五、發明説明（；.10) 100，101卷（1983)中*參考文獻均出於此處。最普遍使用 的重組DNA方法且廣泛討論技術细節者是曼尼亞蒂斯 (Han iat is) ^ λ 分孑撰殖，冷泉港實驗室（1 9 8 2 )或分1立_ 生物昜新播作步皤，綠出販社（1988，1991)。 取得所需多胜肽如補體受體之DN Α片斷的一種方法•是 利用cDNA霉殖法。在此法中，傅訊RNAURHA)自巳知佃胞 或被認為II產生需要蛋白質的细胞中分離出來。經過一連 串酵素反應，i胞的mRNA族群複製成一個互補DNA(cDNA)。 再將cDNA插入選殖載體中，最後轉形成一個遴當的原核或 直核寄主。產生的cDNA “圖書館”是由轉形寄主细胞的一 個族群姐成，每個细胞含有單一基因或基因片斷。整個麵 書館理論上可提供A混合物中編碼資訊具代表性的樣品 ，用做最初實驗材料。 圖書館可用核酸或抗體探針篩選，鑑定特殊DNA順序。 一旦分離出，這些DNA序列可加Μ修飾或姐合成完整基因 。另外•如''本發明所述，一個基因的特殊片斷可單獨製成 該基因-其·餘的部份。由此基因Η斷編碼成的蛋0質片斷在 自然界中找不到，但它-們在處理不良生理狀況時非k有用 。本發明之可，溶性補體受髏的基因工程和/或有鼷補體活 動-失調的處理就是一例。 經濟部中央標準房貝工消费合作社印氧 (請先《讀背面之注意事項*填寫本頁) f 基因或基因片斷一旦選殖完畢· DN A將嵌入表現載體， 並由載體載入適當寄主细胞中。表現載體具有控制表現的 基因特徴如本文所定義。當有興趣之DNA序列嵌入其中時 ’載體會指引此段DNA序列在含有載體之寄主细胞内製造 _ - 12 - 82.6. 40,000 本纸張尺度適用中B國象標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 經濟部中央襟準扃典工消费合作杜印製 A6 _ B6 _ 五、發咐說明（11 ) 產物。依據本發明特別文獻，將一個單一編碼序列姐合成 片斷，使其表琨出可溶性受體蛋白質是6可能的。對SCR1重 姐基因之製造特別有效的應用技術是法昂等人-，P C T應用 WO 89/09220,.1989.10.5 出版和 W0 91/05047 * 1991.4.18 出版。 重姐產玲I製造好後·最好將其回收。如果產物是由细胞 所分泌直接從细胞培養基中回收產物。若產物留在细 胞内，必須以i枱、化學或生物方法破壞细胞，取得其中 的產物。 本蛋白質產物的例子中•並非可提供完全無其他蛋白質 的純化方法，但純度至少80%，甚至超過95% (相對於所 有蛋白質在準備液中的比例），但亦可能降到可接受的程 度，含有其他寄主细胞污染物，DNA ，RNA ，潛伏的熱源 等。 _ 如上所述*許多寄主细胞可做為本發明生產受體之用。 特殊寄主细~胞的選擇均在普通公認技術之内* inter alia 受體性霄*，其合成速率、衰敗率和控制受體表瘍之重姐載 體的特性。寄主细胞表:現糸統的選擇與所採用的细is培養 方法間有極大_的翮聯。一旦表現糸統選定後，便要決定特 殊-的製造型態如個刖製造或連鑛製造，旋轉式或氣壓帶動 式，液態或固定態。.於是要決定採用液體床生物反應器或 中空纖维管生物反應器，旋轉瓶培養，或攪拌茼生物反應 器•是否有细胞微載體等生物反應器。這些選擇的檷準在 细胞培養技S中均有說明，因不屬於本發明範圍本y文不再 本紙張尺度適用中國國·家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.6. 40,000 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) -----—I —------ΤΓ—----/Μ 後濟部t央標準局貝工消费合作社印製 321651 A6 _B6 _ 五、發^明·（ 12) 詳述。本發明係闞於從细胞培養基中純化補體受體的方法 〇 如前所述，本發明係關於，inter alia，應用厭水性作 用力層析（HIC)_技術純化、分析補體受體蛋白質。在液體 溶劑中之厭水性分子會自動聚集•乃厭水性作用力之故。 現在發現巨分子如蛋白質的表面，除了親水性基團外，a 有廣泛ΘΤ厭水性區域。1IC便是利用層析支撐物上的厭水 性配位體與這i區域間的交互作用達到分離的目的。當厭 水性配位體鐽结至支撐物上，本文稱為HIC支撐物，HIC 膠體或HIC管柱。進一步發現蛋白質和HIC支撐物間交互 作用力的強度，不只是蛋白質表面非極性與極性比例的函 數*且與表面非極性的分佈有闞。 有許多材料可做為HIC管柱的製備•最廣為採用的是洋 菜糖。也可用矽和有機聚合物樹脂。有用的厭水性配位體 包括（但不限於此）含有2-10個碳原子的烷基_，如丁基 、丙基或辛''基；或芳香基團如苯基。傳統HIC之膠體和管 柱產品-可*向下列公司購買，泛美視Pharmacia 1；KB AB， Uppsala ，瑞典，類」產品稱為丁基-色發羅斯®，苯基 -色發羅斯®LCL-4B ，辛基-色發羅斯® PF·和苯基-色發 落斯FF ;多梭（Tosoh)公司，東京，日本，其產品稱為 T0Y0PEARL 丁基 650M(Fractogel TS!(丁基-650)或 TSK-膠 體苯基- 5PW ;麥爾-亞達（Miles-Yeda), Rehovot W色列 ，產品名稱為烷基-洋菜糖，本文之烷基團含有2-10個碳 原子，和《1.1'.貝克（831^1')，卩11111丨？51)11「8，|^.(?.，產品 -14 — 本紙張尺度適用中國a家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.6. 40,000 (請先閱讀背面之注意事嘈再填寫本頁) _裝· 訂. 經濟部中央播準局R工消费合作社印製 A6 B6 五、發明Ut明（13 ) 名稱為貝克麻德（Bakerbond) WP-HI-丙基。 亦可用傳統化學法製備所需HIC管柱。例如，基質/配 位體Μ下述形式姐合： ΚΗ2

I M-〇-C-NH-CH2(CH2)e-CH3 * 其中M t基質，例如洋菜糖與烷基胺偶合經溴化氰活化如 爾（Er-el) , Z.等人生物化學生物物理研究里舍 ( 1 972)。此外*亦有下述形式的姐合：

OH 0H

I I

M-〇-CH2-CH-CH2-〇-(CH2)e-CH3或 M-〇-CH2-CH-CH2-〇-A ，其中Μ為基質如洋菜糖，A為芳香基，可用slycidyl醚 偁合反應製備」厄布列曲（U 1 b r ί c h ) , V · H Call， C?:ech· nhfim- Com mum. 9:1466(1964))。簡言之，一種膠 體，通常為'"洋菜糖，轉移至有機溶劑，如1,4 -環氧己烷。 按步驟.的"順序依次於Buchner槽中進行（1〇〇 i升樣品配 - 1 100毫升沉降膠體） ：：（1)从水- I,4 -環氧己烷（4:1)清洗 一次，（2)水/1 , 4-環氧己烷（3:2)清洗一次，(·3)水-1，4-落氧己烷（2 L3 )清洗，次，_ U )水-l·，4 -環氧己烷（1 : 4 )清 洗一次，.100毫升1 ,4-環氧己烷中加入1 00奄升沉降膠體 和2毫升48%溶於乙醚之氟化砸etherate溶液’播拌5分 鐘。大約1毫升s 1 yc i dy 1键溶於1〇毫升1，4_瑁氧己焼中’ 由分液漏斗一滴滴加入。反懕40分鐘後’將膝賭移-回液頻 -15 - 本紙張Λ/t適用中SB—家襻準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂.

δ2!6&82105986號專利申請案 中文說明書修正頁（83年9月 五、發明説明（年） 環境中•依相反順序重複步驟（4)-U)，最後Μ水清洗之 。偶合至膠體上的配位體含量可利用改變加入反應混合物 中glyc idyl醚的量來控制。此反應可以下列反應式表示： / \ BF3Et2〇 |

M-0H + CH2~CH-CH2-0R----------H-0-CH2-CH-CH2-0R 其中Μ為基質如洋菜糖，R為烷基或芳香基。 配位體密度是很重要的參數，不只影w交互作用強度， 而且影響管柱的容量。商品化之苯基或辛苯基膠體的配位 體密度是40微莫耳/毫升膠體床。膠體容量是特殊蛋白質 與pH、溫度和鹽類濃度的函數，通常介於3-20毫克/毫米 膠體。 特殊膠體的選擇可由有經驗的技術人員決定。一般來說 ，蛋白質和HIC配位體間交互作用的強度，會隨烷基配位 體的鏈長增加，但是配位體之碳原子數Μ 4-8個適合大多 數之分離。苯基團擁有與戊基團相同的厭水性，但是選擇 性可能截然不同，因為與蛋白質之芳香基間可能有Pi-Pi 的交互作用。 蛋白質在高鹽濃度下易吸附於HIC管柱上，但實際濃度 間差異很大，視蛋白質性質和所選擇的HIC配位體而定。 不同的離子可依soluphobic順序排列，取決於是否有促進 厭水性交互作用（鹽析效應）或破壞水的结構（亂度效懕 )，専致厭水性作用力減弱。陽離子依鹽析作用的強弱排 -16 ~ 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ----------裝------訂------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 83. 3. 10,000

105986號專利申請案 說明書修正頁（83年9月）

五、發明説明（/〇 列：Ba —<Ca*、Mg — <U*<CS*<Na-<K + <Rb、NH4♦。陰離子 依增加亂度的能力排列： P〇4 <S〇4_<CH3COO <Ci-<B「_<N〇3_<Cl〇4-,i-<scN-。所Μ 鹽類影饗交互作用強度的順序為： N a 2 S 0 4 > N a C 1 > ( Ν Η 4) 2 S 0 4 > Ν Η 4 C 1 > N a B r > N a S C Ν。通常，硫酸 銨濃度介於0.75-2M ，NaCl介於卜4M。 溫度對HIC分離法的影饗並不單純，雖然通常溫度下降 交互作用亦下降。然而，增加溫度所產生之利益亦必須去 除不利作用而評估，該增加可能影W蛋白質活性。 溶離*不論是依序進行或梯度進行，均有許多方法： (a)藉改變鹽類濃度，（b)藉改變溶劑極性或（c)加入清 潔劑。減低鹽類湄度，則吸附蛋白質會依厭水性由小到大 漸次溶離出。極性的改變可加入溶劑如乙二醇或（異）丙 醇，降低厭水性作用力。清潔劑功能為取代蛋白質，主要 用於膜蛋白的純化。 由前述可知，HIC與其他蛋白質純化技術連用時最為有 效。也就是Η I C最適合用在已被其他純化技術部份純化的 材料上。術語“部份純化”是指在一個蛋白質溶液中，目 標蛋白質的重量百分比至少有5%，10%更好，45 上 最佳。所Μ，HIC最適合懕用在補體受體蛋白質整個純化 流程中。其已被發現在有效之處，如將部份純化之已調整 钿胞培養基樣品進行HIC純化。術語“已調整细胞培養基 ”是指细胞培養基可支持细胞生長和/或維持细胞’且已 分泌有產物。這類濃縮過的培養基樣品先經1 -多步蛋白質 纯化，再用Η IC純化。樣品可先以離子交換層析法純化， -17 - ---------It衣------ΪΤ-----ά. (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） 83. 3.10,000 A6 B6 五、發呀説明；（16 ) 如前所述I有許多種類的陰、陽離子可取代物會吸附至基 質上，形成層析法之陰、陽離子支撐物。陰離子交換可取 代物包括二乙基胺乙基（DEAE)，四级乙胺（QAE)和四级胺 (Q)基。陽離子交換可取代物包括甲羧（CM) ·乙磺（SE)， 丙磺（SP)，磷酸根（P)和磺酸根（S)。纖維性離子交換樹 脂如 DE23’-DE32, DE52, CM-23, CM-32 和 CM-52 -可向華 特曼（W fiTt m an) -公司，Maidstone， Kent > 英國購買。K 色發迪斯®為基礎並交互鍵结的離子交換樹脂亦非常有名 。例如，DEAE-, QAE-, CM-.和 SP-色發迪斯和 DEAE-, Q-, CM- S-色發迪斯β，均可向泛美視ΑΒ購買。由DEAE和 CM進一步衍生之乙二酵一異丁烯酸酯共聚合物*如 TOYOPEARL DEAE-650S 和 TOYOPEARL CM-650S 可向多梭哈 斯（TOSO Haas)公司•費城，賓州購買。由於從離子支撐 物中溶雜通常須加入鹽類，如前所述，HIC在高鹽環境下 會促進功效，所以在離子交換層析或其他鹽類參與純化法 之後，進行HIC纯化特別理想。陽離子交換層析和碕酸銨 沉澱後"Πϋ行Η 1C純化最佳。可另外用其他的^法，但不 能妨礙進一步離子交.換層析、體積篩斥曆析法、病毒不活 化，濃缩和冷/凍乾嫌的進行。 從H 1C溶離出後，可做進一步離子交換層析•陰、陽離 子方法均可採用。 如前所述，膠體過»法受分子大小的影響。形成分子篩 型式。最好在基質和溶質間不要產生交互作用•因此，最 好是完全無活性的材料。基質最好多孔且強硬，在大量製 -18 - 本紙張Λ度適用中國國家標準（CNS〉甲4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 82.Α. 40,000 A6 __B6_ 五、發兩説明1 17) (請先閲讀背面之注意事項再塥窵本頁) 造的過程中·強度是最重要的參數，建構出整個流速。傳 統材料如色發迪斯<*或810-0£1^® 均無活性，各種大小的 孔洞皆有，然而•這些膠體相當柔軟•不逋合做為大量純 化之用。最近，補強膠體已發展出來（如SEPHACRYL® ， UTROGEL® ，FRACTOGEL*® 和 SUPEROSE® > 。所有這些材 料均可買到所需顆粒的大小，雖然比傳铳膠體顆粒小•即 使在高f速下，解析度不但一樣，甚至更高。TOYOPEARL HW糸列基質（多梭哈斯）較佳。 為閘明目的，將本發明懕用於可溶性補體受體的純化。 較特別地是，一涠可溶性CR1结構包含領導者，LHR-A ， LHR-B，LHR-C - LHR-D，SCR 29，SCR 30 區域♦並含有透 膜區第一個丙胺酸殘基；和質體pBSCRIc中CR1之編碼序 列，法昂等人；1989， Inti.專利公告號碼W089/09220, 1 989.1 0.5 (反後稱為“TP10HD”）。製造TP10HD的重姐糸 統结構在前述之PCT應用和後面的總结中會詳述。 將CH0 ίί胞Μ胰蛋白W處理•取5xl0s/60毫米盤，放 入生長基^中（哈姆斯（Hans) F12營養基（041-lf65)含1 % 麩氨醯胺（043-05030)盤尼西林/連耀素 ' (043-0507Q),和 10% 胎牛血清（0H-6290)，Gibco， 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製

Pa i si ey ，蘇格蘭）在37X；有濕度調節的培養箱中培養， C02 5% /空氣95%。 21小時後，细胞即可用來轉殖。一 種含SCR1編碼序列源自pBSCRIc的表現質體，與pSV2dhfr 一起轉殖入需要dhfr的中國倉氱卵巢细胞株中（ CH0DUXBII)。在生長基中進行轉殖並採鈣共沉澱甘油剌 -19 - 82.6. 40,000 本紙張尺度適用中S國家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） A6 B6 五、發听説明(18 ) 激法，如DNA選殖* D.M.葛拉佛（Glover) ed.(第15章， C.葛曼（Gorman))書中所述。與 pBSCRlc/pTCSgpt和 pSV2dhfr*—起轉殖後·细胞培養在生長基中46小時（如前 述生長條件下），再進行篩選工作。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 篩選和共同放大的步驟基本上是根據R.J.考夫曼 (Kaufman)萁人（Mnl. 1 1 . R i ο 1 . 5 ： 1750-1759 ( 1985)厂。轉殖後46小時，將细胞移入篩選培養基MEM ALPHA (041 -02571 )，1%麩氨醯胺，1%盤尼西林/鏈微 素（043-05070)，並Μ胎牛血清（220-6300AJ) (Gibco, Paisley >蘇格Η)透析。细胞培養在篩基中8-10天直到 dhf r-菌落出現。當菌落建立，則將细胞移入含氨甲蝶呤 (A6770 , Sigma化學公司，聖路易斯，Mo.)的篩選基中。 起初氨甲蝶呤濃度為0.02微莫耳，遞次增至5微莫耳。在 放大期間，源自生長细胞的生長纖維素M ELISA做TP10HD 分泌的生物檢定。裉據本發明，任何分泌補體受體的重姐 细胞株（如_ATCC CRL 10052)均可供懕已調整培養基做為 純化的I料，但特殊细胞株不在此限内。能製TP10HD的 轉殖CH0细胞株才繼績各種细胞培養技術培養。本發明 在應用上'對/特殊培養方法並不設限，然而為方便說明， 缶此舉—個细胞培養法為Μ ·其為連續灌注法，係根據美 國專利 4,861,714 ; 4,863,856 ; 4,978,616 和 4,997,753所述之Verax流體床技術，引用之内容請參考 該文獻。所M，將上述轉殖细胞培養在CCM-3培養基（ DMEM，哈姆斯F-12，牛血清蛋白和其他營養素的混-合）中 -2 0 - 82.6. 40,000 {請先閱讀背面之注意事項再壜寫本頁) 本紙張又度適用中國a家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局tex消费合作社印製 Α6 Β6 五、發明説明...(19 ) *加入10%胎牛血清（FBS)和5毫莫耳氨甲蝶呤（KTX)。 佃胞族群在旋轉瓶中增殖，直到數量足夠接種至生物反應 器為止。在接種至S2 00生物反應器之前，機器先進行清潔 (C IP)和蒸氣（SIP)循環。注入CCM-3培養基，内含5% FBS並加入450克微顆粒。微顆粒事先Μ培養基調整。將 细胞植入尽應器中.搡作參數包括：pH 7.2，37t ,入口 (流體3Γ底部）氧氣Μ介於100-400 torr，出口 （流體床 頂部）氧氣壓i介於0-200 torr。取初槽浴期後，接著是 注入培養基，時間增加下仍得維持葡萄糖濃度於1.0克/升 。直到足夠数量的细胞積聚在反應器中才接種至S 2000生 物反應器内。CIP與SIP完畢後，S-2000反應器注入 CCM-3培養基，内含5% FBS和5毫莫耳MTX*並加入 5000克微顆粒。這些微顆粒事先Μ培養基調整。操作條件 如溫度、反應薄Κ置和氧氣滬度均如前述。來自S-200反 應器的微顆粒未經滅菌即移入S-2000反應器中啟動槽浴期 。當葡萄糖''濃度低於1.5克/升時，注入培養基（CCM-3 ， 5% 和5 mM ΜΤΧ)啟動生長期*生長速率歲持在葡萄 糖濃度1 . 0克/升。细胞:生長情形Μ氧氣的利用和葡'萄糖的 消耗量做監.测_。當足量细胞累積在反應器時·*改注入 CGM-3-過渡培養基内含l%,FBS和5mMMTX。注人速率 修正為維持葡萄糖濃度於1.0克/升。生產培養基之後換 成生產培養基，CCM-3中有5mM ΜΤΧ 。注入速率增加至維 持葡萄糖濃度於1.0克/开。因此，'不論是出口的氧氣或 再循環流速的設定點，均較低Μ維持反應器的運作*。生產 -21 - • --------------- -------装------訂-----^1 (請先閲讀背面之注意事項再螭寫本頁) 本纸張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货〉 82.6. 40,000

第82105986號專利申請案 中文說明書修正頁（83年9月） 五、發明説明（） 期一般持績約60天。 400 - 1 600升之反應器滹過物貯存在4-8 下，K密理博 (Millipore) Prostak微過濾糸統過滹。不含细胞之·滅過 物再經超過濾步驟後，以密理博螺旋絲糸統濃縮30-60X， 濃縮物放在置物箱中·滅乾，糸统中注入5-20升50mM磷酸鹽 緩衝液，PH7.5 。清洗緩衝液也在此糸统中漶乾，並與濃 縮物结合。超過濾濃縮先進行前過濾，再M〇.22mm濾膜過 濾至高壓Halgene滅菌瓶中。通常每瓶裝800毫升，冰凍 保存。 如前所述•特殊重姐生產糸统和特殊细胞培養方法均超 出本發明範圍之外。先前討論的糸统和方法是許多技術選 擇的代表，在本文中出現只是為了方便說明而已。純化方 法才是本發明重點，例行作業上可稍加修飾，其可以應用 。在各種重姐補體受體和類受體蛋白質，不必考慮他們是 如何製造培養的。 按本發明方法所獲得之純化補體受體蛋白質有下列特性 :1)重量百分比超過95%之CR蛋白質；2)在410下至少3個 月不會蛋白質水解；3)内毒素含量低（<1E.U./mg蛋白質 );4)DNA含量低（<1兆分之一克/毫克蛋白質）；5)非CR-白質〈5% (重量百分比）；和6)病毒不活化。下面範例進 —步閫明本發明，但並非限制申請專利範圍。 節何Μ 前官 下面的方法是針對從已調整之细胞培養基濃縮物中，分 -22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公羞） ----------^.------,訂------.^ (請先閱讀背面之注意事項(寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 經濟部中央標準局MK工消费合作社印製 A6 ____ B6___ 五、發听説明:.(21 ) 離並純化可溶性補體受體- l(sCRl)。本方法是設計製備 sCRl，從寄主细胞，细胞培養基或其他生原料中去除雜質 *使纯度超過95%。回收程序包含9個步驟，包括陽離子 、陰離子交換？厭水性作用力，和體積篩斥層析法；硫酸 銨沉澱；和二次病毒不活化處理。每個步驟均在下面詳述 。步驟卜5」在2-8¾ 下進行，步驟6-9在20-25Ϊ：下進行 步嫌1:怯着某 > 前虚捆 一面播拌，一面加入IN HC1使已調整之培養基濃縮物pH 值為5.2 。加完HC1後，繼績攪拌，以pH顯示計監視10分 鐘。pH的調整會產生許多沉澱。藉密理博P〇lygard-CR過 滤系統，進行一系列的微過濾（5微米到0.5微米再到 0.1微米），達到分類的目的。sCRl在濾過物中回收。 培養基濃縮物的酸化和過濾，可除去非sCRl蛋白和非蛋 白材質；R5調鏊含濾過物之sCRl至逋當出值*有肋於後績 S色發-羅~斯層析法之進行。 ' 舟皤泛羔相.S色發繙斯快谏層析法 -將出5.2過濾物填充至事先以媛銜液A平衡之泛美視S 色發羅斯快速膠體管柱中，流速6〇公分/小時，容最為<3 克s CR1/公升床體積。M3-5倍床‘體積之緩衝液A ，流速 150公分/小時，清洗管柱。再Μ 5-10倍床體積之媛衝液B 清洗。sCRl鍵结在管柱上，Μ緩衝液C溶離。用3〃倍床體 -23 - 、 本紙張尺度適用中國鹵家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.6. 40,000 -----------------------装------.玎-----4, (請先閱讀背面之注意事項再螭寫本頁) 321651 A6 B6 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 五、發·明説吗62 ) 積之缓衝液D清洗管柱。 S色發羅斯層析法除去大部份细胞和培養基内的雑質（ 特別是蛋白質）•在緩衝液C管柱中溶離濃縮物sCRl，做 進一步分析。_ 步皤3 :硫酴銥沉艄 在S色-發羅斯缓衝液 C溶離物中加入緩衝液E ，調至碲 酸銨濃度1.2 i耳。加完緩衡液E後，亦停止攒拌，讓混 合物靜置過夜。 含sCRl之沉澱Μ離心方式（8000XG，10分鐘）收集。 沉澱物Μ約4升緩衝液F溫和攪拌再懸浮之。另外繼績 加入缓衝液F直到溶液在280nm下的吸光度為1.50.D為止 。溶液攪拌過夜，用密理博Polygard-CR 0.1微米濾膜過 滤。 _ 硫酸銨沉澱可除去額外雜質，製備厭水性作用力層析所 需之s C R 1。 朱皤4 : TDYnPF AR丨丁某-6·50Μ龎栎法 ' 再溶解及邕濾硫酸銨沉澱，並加入級衡液Η；攪拌調整硫 勝銨穠度至0.8Μ。 緩衝液Ε加完後，混合物填充至事先Μ緩衝液G平衡之 T0Y0PEARL 丁基-650Μ膠體管柱中。流速150公分/小時 ，容量< 4克總蛋白/升管柱體稹。緩衝液和管柱均保存 在2-8=。填充完後’Μ2-3倍床體積之緩衝液G·清洗管 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) _裝_ -ΤΓ .線. 本紙張尺度適用中a國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公藿） 82.6. 40,000 經濟部中央標準局w工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明:（23 ) 柱，再K3倍床體積之媛衝液Η澝洗’以緩衝液I溶離 sCRl ° 击》R:病表不法彳h及泛差祺色链油浙G-25層析法 固體GuHCl加入丁基緩衝液I溶離物中，形成濃度約2M •攪拌至完全溶解。監测pH值，若有須要•以2.5N NaOH調 至 pH 7Γ〇·。 — 當GuHCl完^溶解後，溶液靜置6分鐘，並填充至泛美 視色發迪斯G-25管柱中，事先Μ媛衝液J平衡之，流速60 公分/小時。填充髑積不得超過色發迪斯G-25管柱之25% 〇 sCRl溶離出後（在voidSi積溶離出），K緩衝液J清洗 管柱直到“鹽”峰溶離出，導電度降回基線為止。加入 2.5Μ NaOH，將色發迪斯G-25產物調至pH為11，維持溶液 於此pH值16分鐘，再用2.5M HC調整回pH 9.0。材料現已 適合作陰離子交換層析分析。

GuHCr^pH 11處理使病毒不活化，若有任何病毒存在， - ! 色發迪斯G-25層析製備:DEA.E T0Y0PEARL曆析所需之sCRl產 物。 .， 1¾ r ： TnynpRARL dfar-rsoss m m .將色發迪斯G-25產物填充至事先‘M缓衝液J平衡之 T0Y0PEARL DEAE-650S膠體管柱内，流速150公分/小時 ，容量<6克蛋白/升管柱體積。填充後K3倍床〃體積之 -25 - » 本紙張尺度適用中aΪ5家樣準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 82.6. 40,000 ---------------- ------裝------訂-----.^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 五、發听説明:(24 ) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 鍰衝液J清洗管柱。鍵结之sCRl用5倍管柱體積之線性梯 度溶離，最初為 100%媛衝液J ，直到100% 緩衝液K 。 用3倍床體積之緩衝液U清洗管柱。 T0Y0PEARL QEAE層析法去除蛋白，DNA雜質和潛藏之病 毒雜質。 朱皤 7 :~TflYnPRARI. CMm 析法 M2倍體積i緩衝液Μ稀釋DEAE產物，並以2.5N HC1調 整pH至5.5 。填充此稀釋混合物至T0Y0PEARL CM-650M管 柱内*事先Μ媛衝液Μ平衡之，流速150公分/小時，容 量<11克蛋白/升管柱體積。填充完畢後，M3倍床體積 之鑀衝液Μ清洗，用5倍管柱體積線性梯度溶離鍵结之 sCRl，由100%緩衝液Μ到100% 嫒衝液H 。以3倍床體 積之緩衝液0清洗管柱。含溶離物之產物以1/10體積0.5Μ 磷酸納二鹼基中和之，方可進行體積篩斥層析法。 T0Y0PEARL CM-650S層析法可除去蛋白質，DNA雜質， 和潛藏.2*病毒雜質。 ' . ' ! 經濟部中央櫺準局S工消费合作杜印製 朱皤8: THYnPRARl」HW 6 5S腫析法 -將；TOYOPEAEL CM產品填充至事先Μ緩衝液F平衡之 T0Y0PEARL HW 65S管柱内，流速30公分/小時。填充體積 不得超過整個TO Υ0 PEARL H W 65S管柱體積之5%。收集整 個產物高峰•直到吸光度降至最大吸光度的10%為止。材 料可進行最後的濃縮° 82.6. 40.000 本紙張尺度適用中國囪家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 936號専利申請案 3¾爾1 中文說明書修正頁（8 6年8月） A7 B7 五、發明説明（）

經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 體積筛斥層析法可除去最後刺餘之低分子量雜蛋白質， 並有助將sCRl換至最终目標緩衝液。 朱嫌9:灌煽和暑紡的碘濾 TOYOPEARL HW 65S收集物K泛美視迷你超過《器過濃缩 至5-6毫克/毫升，採用100K MWCO之Onega膜。湄縮產 物再用密理博0.2微米之Millipak過濾。 緩衝液 壊衝液 A 20毫莫耳磷酸納，60毫其耳NaCl，pH 5.2 緵衝液B 20毫莫耳磷酸納，100毫莫耳NaCl , pH 6.0 緩衝液C 20毫莫耳磷酸納，500毫莫耳NaCl，pH 7-0 緵衝液D 1 M NaCl 緩衝液E 3M硫酸銨，100毫莫耳磷酸納，pH 7.0 緩銜液F 10毫莫耳瞵酸納，0. 9!« w/v NaCl , pH 7 緩衝液G 0.8 Μ硫酸銨，100毫莫耳磷酸納，pH 7·0 緩衝液Η 0.7 Μ硫酸銨，100毫莫耳鱗酸納，pH 7.0 緩衝液I 0.09 Μ硫酸銨，100毫莫耳磷酸納，pH 緩衝液 J 50毫莫耳 Tris/Tris.HCl , pH 9.0 緩衝液 K 50毫莫耳 Tris/Tris.HCl , 0.2 M NaCl，pH 9.0 谡衝液 L 50毫莫耳 Tris/Tris.HCl, 1.0 M NaCl，pH 9.0 緩衝液 M 50毫莫耳 *MES/MES . Na , pH 5 . 5 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -27- 本紙張尺度速用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） 第82105986號專利申請案 中文說明書修正頁（86年8月） A7 B7 五、發明説明（

緩衝液 Η 50毫莫耳 MES/MES . Na , 0 . 25 M NaC 1 , pH 5 . 5 緩衝液 0 50毫莫耳 MES/MES . Na , 1 . 0 M NaCl , pH 5 . 5 * MES代表2-(N -嗎啉基）乙烷磺酸 ----------裝------訂------Λ. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） 五、發明説明（ 83年 9, A7 B7 (l — ilos 3a/=3) o 00 s (96 ) “ -H味 5) ms 0’0 51 Cl： 90 001

60 LS 00T 9 I _ 0b ς, u 丨 <s) 1301 s · 0 01 0 TO ‘ 0 TO · 0 Cl , 0 LI · 0 s 6ς 19 s s G9 G6 56 s 001 08 0 -忑 9 · 一^ π* s t'完 5 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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Claims (1)

1. 第82105986號專利申請案 難正本伽年8月） Α8 Β8 C8 D8 々、申請專利範圍

   邠.8. p補充 公告本 經濟部中央梂準局貝工消费合作社印装 1. 一種從已調整细胞培養基純化補體受體蛋白質的方法· 包括： (a) 濃縮已調整细胞培養基； (b) 吸附補體受體蛋白質於陽離子層析支撐物上； (c) 用至少一種緩衝液，其含20mM璘酸納及60mM氛化納 ，pH5.2 ，清洗吸附之蛋白質； (d) Μ含20mM磷酸納及500bM氛化納，PH6.0之緩衝液溶 雛清洗過之蛋白質； (e) 以硫酸銨沉澱蛋白質； (f) 重新溶解沉澱蛋白質； U)吸附步驟（f)之溶解蛋白質於經含0.8M硫酸铵及 IOObM磷酸納，PH7.0之緩衝液平衡之厭水性作用層 析支撐物上， (h) Μ含0.09M硫酸銨及IOObM磷酸納，PH7.0之緵衝液 選擇性溶離出蛋白質； U)於50mM Tris. HC1 PH9.0中吸附步驟（h)之溶離物 於陰離子交換支撐物上； (j) 藉於50mM Tris. HC1 pH9.0中梯度溶離至0.2M氛化 納溶離吸附之蛋白質； (k) 於 50inM MES/MES. Na，pH5.5 中將來自步驟（j)之 溶離物吸附於陳離子交換支撐物上•其中MES代表 2- (N-嗎啉基）乙烷磺酸； (l) 藉於50mM MES/MES. Na, pH5.5中梯度溶離至 0.25M氯化納溶離吸附之蛋白質； (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 3^1651 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) U)將來自步驟（1)之溶離物施Μ於lOmM瞵酸納及0.9 w/v氯化納，pH7.0中賭積篩斥層析管柱中； (η)回收所產生之蛋白質。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中若有病毒存在， 包括使病毒不活化的步驟。 3. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中使病毒不活化的 步驟是在步驟（h)之後（ί)之前執行，包括用酴和胍氫氯 酸鹽處理溶離物。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（b)中第一 次陽雔子交換層析採用的支撐物選自CM-23-，CM-32-， CM-52-纖維素；CM-和SP-色發迪斯（SEPHADEX)，CM-和 S-色發羅斯（SEPHAR0SE)和 CM-650S T0Y0PEARL ，而 Μ 緩衝鹽溶液溶離之。 5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（d)之溶離 物調整到1 . 2M硫酸銨。 6. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中步琢（g)中厭水 性交互作用層析支撐物選自烷基C2-C8-洋菜糖*芳香基 -洋菜糖*烷基-矽石，烷基-有機聚合樹脂。 經濟部中央榡準局負工消費合作社印策 7. 根據申請專利範圍第6項的方法，其中支撐物選自丁基 -，苯基-和辛基-色發羅斯，和丁基-，苯基-和醚-T0Y0PEARL ° 8· 根據申請專利範圍第7項的方法，其中支撐物是丁基-T0Y0PEARL 。 9· 根據申請專利範園第1項之方法，其中步驟（i)中陰離 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） AS B8 C8 D8 321651 々、申請專利範圍 子交換層析採用的支撐物選自DEAE -嫌維素，DEAE-色 發迪斯，QAE-色發迪斯，DEAE-色發羅斯 ，Q-色發羅斯 和 TOYOPEARL DEAE 650S 。 10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中支撐物是 T0Y0PEARL DEAE 650S 〇 11. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（k)之陽離 子交換支撐物是選自羧甲基•硫乙基，硫丙基·和磷酸 鹽取代之缴維性樹脂，色發迪斯*色發羅斯和 T0Y0PEARL 。 12. 根據申請專利範圍第11項之方法，其中陽離子支撐物是 T0Y0PEARL CM650S ° 13. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中體積篩斥層析法 採用一種支撑物選自 SEPHACCYL UTR0GEL ， FRACT0GEL ，SUPER0SE和 T0Y0PEARL HW 65S 〇 14. 根據申請專利範困第13項之方法·其中支撐物是 T0Y0PEARL HW 65S 〇 15. 根據申請專利範圍第1項之方法*其中蛋白質的回收是 收集及用超高速雄心法濃縮層析步驟（m)中含有蛋白質 之部份。 16. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中受體選自CR1 · CR2 · CR3 R CR4 。 17. 根據申請專利範圍第16項之方法，其中受髁是CR1和其 片段。 18. 根據申請專利範圍第17項之方法•其中受體是CR1可溶 -3 - 本紙張尺度適用中S國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） --------^裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Μ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 321651 I D8 々、申請專利範圍 性片段。 19.根據申請專利範圍第18項之方法，其中受體是TP10HD。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 -4 - 本紙張尺度.適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）