FI109202B - Proteiinin puhdistus - Google Patents

Description

10920?

Proteiinin puhdistus - Proteinrengöring Tämä keksintö koskee proteiinin puhdistusta. Tarkemmin tämä keksintö koskee so-5 vellutusta yhdistää kromatografia komplementtireseptoriproteiinien puhdistukseen.

Historiallisesti proteiinin puhdistuskaaviot on ennustettu erilaisuuksista koon, varauksen ja liukoisuuden molekyyliominaisuuksissa puhdistettavan proteiinin ja ei-toivottujen proteiinikontaminanttien välillä. Protokolliin, jotka perustuivat näihin 10 parametreihin, kuuluu kokoekskluusiokromatografia, ioninvaihtokromatografia, dif-ferentiaalisaostus ja sen kaltaiset.

Kokoekskluusiokromotografia, muuten tunnettu geelisuodatuksena tai geeliläpäisy-kromatografiana, perustuu makromolekyylien läpäisyyn liikkuvassa faasissa sta-15 tionäärisen faasin partikkelien huokosiin. Differentiaaliläpäisy on partikkelien hydrodynaamisen tilavuuden funktio. Sen mukaisesti ihanteellisissa olosuhteissa suuremmat molekyylit suljetaan pois partikkelien sisäosasta samalla kun pienemmät molekyylit pääsevät helposti tähän tilaan ja poissulkemisen jäijestys voidaan ennustaa proteiinin koosta, koska on olemassa lineaarinen suhde eluutiotilavuuden ja mo-20 lekyylipainon login välillä. Kokoekskluusiokromatografiakannattajat, jotka perus-| tuvat ristiinsitoutuneisiin dekstraaneihin, esim. SEPHADEXR, pallomaiset aga- roosihelmet, esim. SEPHAROSEr (molempia saadaan kaupallisesti Pharmacia ABista Uppsala, Ruotsi), jotka perustuvat ristiinsitoutuneisiin polyakryyhamideihin, esim. BIO-GELR (kaupallisesti saatavilla, BioRad Laboratories, Richmond, Kali-·:··: 25 fomia) tai perustuen etyleeniglykolimetakrylaattikopolymeeriin, esim. TOYO- ··· PEARL HW65S (kaupallisesti saatavilla ToyoSoda Co., Tokio, Japani) ovat hyö- .:. dylhsiä tämän keksinnön käytännön suorituksessa.

> · · ’Saostumismenetelmät ennustetaan perustuen tosiasiaan, että proteiinien karkeissa 30 seoksissa yksittäisten proteiinien liukoisuudet todennäköisesti vaihtelevat laajasti. Vaikka proteiinin liukoisuus vesipitoisessa alustassa riippuu suuresta määrästä teki-‘ ’ jöitä, tämän keskustelun tarkoituksiin voidaan yleisesti sanoa, että proteiini on liu- ’...: koinen, jos sen vuorovaikutus liuottimen kanssa on voimakkaampi kuin sen vuoro- vaikutus saman tai samanlaisten proteiinimolekyylien kanssa. Ilman että toivotaan ....: 35 olevan sitouduttu mihinkään erityiseen mekaaniseen teoriaan, joka kuvaa saostusil-miötä, uskotaan siitä huolimatta, että vuorovaikutus proteiini- ja vesimolekyylien välillä tapahtuu vetysidoksella useiden tyyppisten varautumattomien ryhmien kans-·...’· sa ja elektrostaattisesti dipoleina, varautuneiden ryhmien kanssa ja että saostimet, 109202 2 kuten yksiarvoisten kationien suolat (esim. ammoniumsulfaatti) kilpailevat proteiinien kanssa vesimolekyyleistä, täten korkeissa suolapitoisuuksissa proteiineista "poistetaan vesi" vähentämällä niiden vuorovaikutusta vesipitoisen ympäristön kanssa ja lisäämällä aggregaatiota samankaltaisten tai samanlaisten proteiinien 5 kanssa, mikä johtaa alustasta saostumiseen.

Ioninvaihtokromatografiaan sisältyy varautuneiden ryhmien vuorovaikutus näytteessä ionisesti toiminnallisten, vastakkaista varausta olevien ryhmien kanssa adsor-benttipinnalla. Tiedetään kaksi yleistä tyyppiä olevaa vuorovaikutusta. An-10 ioninvaihtokromatografia, jota välittää negatiivisesti varautuneet aminohapposivu-ketjut (esim. asparagiinihappo ja glutamiinihappo), jotka ovat vuorovaikutuksessa positiivisesti varautuneiden pintojen kanssa ja kationinvaihtokromatografia, jota välittävät positiivisesti varautuneet aminohappojäännökset (esim. lysiini ja arginiini), jotka ovat vuorovaikutuksessa negatiivisesti varattujen pintojen kanssa.

15 Äskettäin on kehitetty affiniteettikromatografia- ja hydrofobiset vuorovaikutuskro-motografiatekniikat täydentämään perinteisemmät kokoekskluusio- ja ioninvaihtokromatografia protokollat. Affiniteettikromatografia riippuu proteiinin vuorovaikutuksesta immobilisoidun ligandin kanssa. Ligandi voi olla spesifinen tietylle 20 kiinnostuksen kohteena olevalle proteiinille, missä tapauksessa ligandi on substraatti, substraattianalogi, inhibiittori tai vasta-aine. Vaihtoehtoisesti ligandi voi kyetä reagoimaan lukuisten proteiinien kanssa. Sellaisia yleisiä ligandeja kuin adenosiinimonofosfaattia, adenosiinidifosfaattia, nikotiiniadeniinidinukleotidia tai . ·.: tiettyjä värejä voidaan käyttää saamaan tietyn luokan proteiineja.

25 •· · Hydrofobinen vuorovaikutuskromotografia kehitettiin ensin havainnon seurauksena, .:. että proteiineja voitaisiin saada affiniteettigeeleihin, jotka koostuvat hiilivetytilakä- ‘ . sivarsista, mutta joilta puuttui affiniteettiligandi. Vaikka tällä alueella käytetään jos- kus termiä hydrofobinen kromatografia, on termi hydrofobinen vuorovaikutuskro-' 30 matografia (HIC) edullinen, koska liuenneen aineen ja geelin välinen vuorovaikutus on hydrofobinen, ei kromatografinen menetelmä. Hydrofobiset vuorovaikutukset ' ' ovat voimakkaimmat suuressa ionivahvuudessa, siksi tämä erotusmuoto suoritetaan mukavasti suolasaostusten tai ioninvaihtomenetelmien jälkeen. Eluusioon HIC-'": kannattajista voidaan vaikuttaa muutoksilla liuottimessa, pH:ssa, ionivahvuudessa ,...: 35 tai lisäämällä kaotrooppisia aineita tai orgaanisia muokkaajia, kuten etyleeniglykoli.

Hydrofobisen vuorovaikutuskromatografian yleisten periaatteiden kuvaus voidaan löytää U.S. patentista nro 3 917 527 ja U.S. patentista nro 4 000 098. HIC:n sovel-tamista spesifisten proteiinien puhdistamiseen valaistaan esimerkein viittaamalla 3 109202 seuraaviin esityksiin: ihmisen kasvuhormoni (U.S. patentti 4 332 717), toksiinikon-jugaadt (U.S. patentti 4 771 128), antihemolyyttinen tekijä (U.S. patentti 4 743 680), tumor necrosis factor (U.S. patentti 4 894 439), interleukiini-2 (U.S. patentti 4 908 434), ihmisen lymfotoksiini (U.S. patentti 4 920 196) ja lysotsyymilajit (Faus-5 naugh, J.L. ja F.E. Regnier, J. Chromatog. 359:131-146 (1986)).

Tämä keksintö koskee ionivaihdon, saostumisen, HIC:n ja kokoekskluusio-kromotografian yhdistelmän soveltamista komplementtireseptorimolekyylien ja komplementtireseptorin kaltaisten molekyylien puhdistamiseen.

10 Tämä keksintö koskee menetelmää komplementtireseptoriproteiinin puhdistamiseksi sitä sisältävästä seoksesta, johon menetelmään sisältyy, että altistetaan peräkkäin mainittu seos kationiselle kromatografiselle kannattajalle, hydrofobiselle vuorovai-kutuskromatografiakannattajalle ja kokoekskluusiokromatografiselle kannattajalle 15 ja eluoidaan selektiivisesti proteiini jokaisesta kannattajasta.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Eräässä toisessa näkökohdassa keksintö esittää komplementtireseptoriproteiinin 20 puhdistuksen konditioidusta soluviljelmäalustasta, jolloin proteiinia sisältävä alusta altistetaan peräkkäin a) kationinvaihtokromotografialle, b) ammoniumsulfaatti-saostukselle, c) hydrofobiselle vuorovaikutuskromotografialle, d) anioninvaihto-kromatografialle, e) edelleen kationinvaihtokromatografialle ja f) kokoekskluusio-kromatografialle.

·:·: 25

Eräässä toisessa näkäkohdassa tämä keksintö liittää menetelmän komplementti-.:. reseptoriproteiinin puhdistamiseksi konditioidusta solualustasta, johon menetelmään ,:. sisältyy: '!!(a) väkevöidään konditioitu solualusta; 30 (b) adsorboidaan komplementtireseptoriproteiini kationinvaihtokromatografiapyl- vääseen; • * ‘ ' (c) pestään adsorboitu proteiini ainakin yhdellä puskurilla; ’...: (d) eluoidaan pesty proteiini; ; ‘: (e) saostetaan proteiini ammoniumsulfaatilla; ....: 35 (f) liuotetaan uudestaan saostettu proteiini; (g) adsorboidaan proteiini vaiheesta (f) hydrofobiselle vuorovaikutuskromatografia-kannattajalle; :... · (h) eluoidaan selektiivisesti proteiini; 109202 4 (i) adsorboidaan proteiini vaiheesta (h) anioninvaihtokromatografiahartsiin; (j) eluoidaan adsorboitu proteiini; (k) adsorboidaan eluaatti vaiheesta (j) kationinvaihtokromatografiapylvääseen; (l) eluoidaan adsorboitu proteiini; 5 (m) altistetaan vaiheen (1) eluaatti kokoeksluutiokromatografialle ja (n) eristetään proteiini siitä.

Tämä keksintö koskee proteiinin puhdistustekniikoita, joilla on sovellutusta komp-lementtireseptoriproteiinien suuren mittakaavan puhdistuksessa. Keksintö on erityi-10 sen hyödyllinen, koska se sallii reseptoriproteiinin, jossa on >95 %:n proteiini-puhtaus, keräämisen. Keksintöä voidaan soveltaa lukuisten komplementtireseptori-proteiinien ja komplementtireseptorin kaltaisten proteiinien puhdistukseen.

Komplementti on seerumiproteiinien ryhmä, jotka on peräkkäin aktivoitu rajoitetul-15 la proteolyysillä, jotka ovat tärkeitä nesteimmuuniuden vaikuttajia. Komplementin aktivointi tapahtuu aikaisin toimivien komplementtikomponenttien vuorovaikutuksella antigeeni-/vasta-aine-kompleksien kanssa. Proteolyyttiset fragmentit, jotka ovat seurauksena tästä aktivaatiosta yksin tai toisten proteiinien kanssa, aktivoivat lisäksi tulevia komplementtiproteiineja johtaen proteolyyttiseen veren hyytymisteki-20 joiden toiminnan portaittaiseen muistutukseen. Vaihtoehtoisesti, komplementin voi aktivoida bakteerin soluseinän komponentit, proteolyyttiset entsyymit (esim. plas-miini) tai kompleksit hiilihydraatit (esim. inuliini). Komplementtisysteemin komponentit välittävät lukuisia biologisia aktiviteettejä (esim. immuunisytolyysi, anafy-latoksiinin tuottaminen, bakteriolyysi, kemotaksis, hemolyysi, opsonisaatio ja fa-•: · : 25 gosytoosi).

.:. Tunnetaan neljä komplementtireseptorien (CR) luokkaa (CR1-CR4). Komplement- tireseptori 1 (CR1) on komplementtikomponenttien C3b ja C4b reseptori. Komple-menttireseptori 2 (CR2) on komponentin C3dg tai C3d reseptori. Komplementti-30 reseptori 3 (CR3) on C3bi:n reseptori. Komplementtireseptori 4 (CR4) on C3dg:n reseptori.

Komplementtireseptori tyyppiä 1 (CR1) on läsnä erytrosyyttien, monosyyt-. " ·. tien/makrosyyttien, granulosyyttien, B-solujen, joidenkin T-solujen, pernan rakku- ,.,.: 35 lan haaraisten solujen ja erityisten sormimaisilla ulokkeilla varustettujen munuais-kerästen epiteelisolujen membraaneissa. CR1 sitoo C3b:tä ja C4b:tä ja siihen viita-.. · · taan C3b/C4b-reseptorina. Sen primäärinen sekvenssi on määritetty (Klickstein et ai., J. Exp. Med. 165:1095-1112 (1987), Klickstein et ai., J. Exp. Med. 168:1699- 109202 5 1717 (1988); Hourcade et ai., J. Exp. Med. 168: 1255-1270 (1988)). Se koostuu 30 lyhyestä konsensus, toistuvasta pätkästä (SCRs), joissa on 60-70 aminohappoa, joista 29 keskimääräisestä 65 aminohaposta/SCR ovat säilyneet. On ehdotettu, että jokainen SCR muodostaa kolmiulotteisen kolmoissilmukkarakenteen disulfidisidosten 5 kautta kolmannen ja ensimmäisen ja neljännen ja toisen puolikysteiinien kanssa di-sulfidisidoksissa. SCR:t on edelleen jäljestetty 4 pitkäksi homologiseksi toistuvaksi pätkäksi (LHR), joissa kussakin on 7 SCR:ää. Johtavan sekvenssin jälkeen molekyyli koostuu suurimmaksi osaksi N-terminaalisesta LHR-4:stä, jossa on C4b:tä sitova domeeni, kaksi seuraavaa toistuvaa pätkää, LHR-B ja LHR-C, joissa on C3b:tä 10 sitovat domeenit, ja suurin osa C-terminaali LHR-D:tä, jonka jälkeen on 2 lisäksi tulevaa SCR:ää, 25 jäännöksen oletettu membraanien välinen alue ja 43 jäännöksen sytoplasminen häntä.

CR1 on supeiperheen jäsen, joka karakterisoidaan SCR-homologialla. Tässä super-15 perheessä on jäseniä, joilla on myös C3/C4-sitomistoimintaa, kuten CR2, C4bp, tekijä H, tekijä B ja C2, samoin kuin proteiinit ilman tätä toimintaa, kuten interleukii-ni-2-reseptori, p2-glykoproteiini I, Clr, haptoglobiinin α-ketju ja tekijä XHIb.

CRl:n tiedetään olevan glykoproteiini ja sen dedusoidulla aminohapposekvenssillä 20 on 24 mahdollista kohtaa N-sidotuille oligosakkarideille solun ulkopuolisella alueella. Kuitenkin CRl:n synteesi tunimysiinin läsnäollessa (Lublin et ai., J. Biol. Chem. 261:5736 (1986)) ja glukosamiinisisällön analyysi (Sim, Biochem. J. 232:883 (1985)) antaa olettaa, että vain 6-8 saatavilla olevista kohdista on todella . ’ ·.: liittyneet oligosakkarideihin. Glykoproteiinin N-loppupää näyttää olevan Mokattu.

·;··: 25 .;· On olemassa 4 erilaista CR1 -allotyyppiä, jotka eroavat kooltaan 30-50 kD lisäyksil- :. lä. Näiden alleelisten polymorfismien (allotyypit) geenifrekvenssit eroavat ihmispo- " pulaatiossa (Holer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 2459-2463 (1987)). F- (tai 1A-) allotyyppi koostuu neljästä LHR:stä ja on noin 250 kD; suuremmassa S- (tai B-) • ‘ 30 allotyypissa on viides LHR, joka on LHR-B:n 5'-puolikkaan ja LHR-A:n 3'-puolik kaan sekoitus ja sillä on ennustettu olevan kolmas C3b sitomiskohta (Wong et ai., J.

: * Exp. Med. 169: 847 (1989)) ja on noin 290 kD. Pienimmällä F- (tai C-) allotyypillä on kohonnut esiintymistiheys potilaissa, joilla on systeeminen punahukka (SLE) . · · ·: (Van Dyne et ai., Clin. Exp. Immunol. 68: 570 (1987) ja Dykman et ai., Proc. Natl.

35 Acad. Sei. USA 80: 1698 (1983)) ja todennäköisesti johtuu LHR-B:n ja yhden C3b sitomiskohdan deleetiosta.

6 109202

Luonnostaan esiintyvä liukoinen CRl:n muoto on havaittu normaalien yksilöiden plasmassa ja tietyillä yksilöillä, joilla on SLE (Yoon & Fearon J. Immunol. 134: 3332-3338) (1985)). Sen luonteenominaisuudet ovat samankaltaiset kuin punasolun (solun pinta) CRlrn, sekä rakenteellisesti että toiminnallisesti.

5

Hourcade et ai., (J. Exp. Med. 168:1255-1270 (1988) havaitsivat myös vaihtoehtoisen polyadenylaatiokohdan ihmisen CRl:n transkriptionaalisessa yksikössä, jonka ennustettiin tuottavan CRl :n eritetyn muodon. mRNA, joka saa alkunsa tästä typistetystä sekvenssistä, sisältää ensin CRl:n 8,5 SCR:n; esim. C4b sitomisdomeeni ja 10 voisi koodata noin 80 kD proteiinia. Kun cDNA, joka vastasi tätä typistettyä sekvenssiä, transfektoitiin COS-soluihin ja ekspressoitiin, se osoitti odotetun C4b:n, mutta ei Cb3 sitomisaktiivisuutta (Kyrch et ai., F.A.S.E.B J. 3:A368 (1989)). Krych et ai. havaitsivat myös mRNA:n, joka oli samanlainen kuin ennustettu useissa ihmisen solulinjoissa ja olettivat, että sellaista tylpennettyä CRl.n liukoista muotoa, joka 15 kykenee sitomaan C4b:n, voidaan syntetisoida ihmisessä.

CRl:n lukuisia liukoisia fragmentteja on myös tuotettu rekombinantti-DNA-tuottajien kautta eliminoimalla transmembraanialueen DNA:sta, joita ekspressoi-daan (Fearon et ai., kansainv. patenttijulkaisu numero W089/09220, julkaistu 5. lo-20 kakuuta 1989 ja Fearon et ai. kansainv. patenttijulkaisu numero W091/05047, julkaistu 18. huhtikuuta 1991). Liukoiset CRl-fragmentit olivat toiminnallisesti aktiivisia, koska ne kykenivät sitomaan C3b:tä ja/tai C4b:tä ja osoittavat tekijä I kofak-toriaktiivisuutta riippuen alueista, joissa niitä oli. Lisäksi ne kykenivät toimimaan in vitro CRl-toimintojen, inhibiittoreina, kuten neutrofiilin oksidatiivinen halkeami-25 nen, komplementin välittämä hemolyysi ja C3a- ja C5a-tuotto. Liukoinen CR1 ra-·· kenne, jota plasmidi sCRl/pBSCRlc koodaa, osoitti myös in vivo aktiivisuutta käänteisessä passiivisessa arthus-reaktiossa (Fearson et ai. 1989 & 1991 ja Yeh et ai., J. Immunol. (1991)) ja esti sydänlihakseen riittämättömän verenvirtauksen jälkeisen tulehduksen ja kuolion (Fearon et ai. 1986 & 1990 ja Weisman et ai., Science 30 249: 146-151 (1990)). Lisäksi sCRl/pBSCRl-tuoton samanaikainen formulointi p- anisyloidun ihmisen plasminogeeni-streptokinaasi-aktivaattori-kompleksin kanssa (APSAC johti samankaltaiseen antihemolyyttiseen aktiivisuuteen kuin APSAC yksin, osoittaen, että komplementti-inhibiittorin, sCRl, yhdistäminen trombolyyttisen aineen kanssa voisi olla hyödyllinen yhdistelmäterapia (Fearson et ai., kansainv. pa-,. : 35 tenttijulkaisu numero W091/05047, julkaistu 18. huhtikuuta 1991).

Komplementtireseptorin kaltaiset proteiinit ovat proteiineja, jotka voidaan puhdistaa • protokollan mukaisesti, joka on tässä kuvattu, sellaista protokollaa muunnellaan, jos } 7 109202 tarpeellista, rutiinilla ei-keksinnöllisiä säätöjä, jotka eivät vaadi liiallista kokeilua. Sellaisiin proteiineihin sisältyy CR:ien allotyyppejä ja alleeleja, tylpennettyjä muotoja, kemiallisesti modifioituja muotoja, kuten PEG-käsittely ja fuusioproteiinit, joissa on CR-osa. Näihin proteiineihin viitataan reseptorin kaltaisena komplement-5 tina, koska niillä on tai ne pitävät tarpeeksi CR-proteiinin ominaisuuksia hyväksymään tämän keksinnön prosessin mukaisen puhdistuksen. Ellei erityisesti toisin tunnisteta, termi komplementtireseptoriproteiini sisältää myös komplementtiresep-torin kaltaiset proteiinit. CR-l:n kaltaiset proteiinit edustavat osajoukkoa CR:n kaltaisista proteiineista, alleelit, tylpennetyt, kemiallisesti modifioidut ja fuusioproteii-10 nit, jotka on johdettu CR-l-allotyypistä. Liukoinen komplementtireseptori 1 (sCRl), tässä kuvattu ihmisen CRl:n liukoisena muotona sisältäen 30 solun ulkopuolista SCR-domeenia, on spesifinen esimerkki CR-l:n kaltaisesta proteiinista.

Tämän keksinnön komplementit reseptoriproteiinit voidaan tehdä lukuisilla teknii-15 koilla. Jos vaaditaan täysipitkiä, natiiveja ketjuja, silloin voidaan natiivit molekyylit uuttaa edellä tunnistetuista solulähteistä. Kun toivotaan liukoisia muotoja, ovat na-tiivien, täysipitkien molekyylien fragmentit edullisia. Sen mukaisesti DNAit, jotka koodaavat toivottuja ketjufragmentteja, ekspressoidaan rekombinanttisesti tuotettuina proteiinifragmentteina. Tämä keksintö on erityisen edullinen sCRl:n puhdistuk-20 seen konditioidusta soluviljelmäalustasta, jossa on erilaisia sCRl:tä tuottavia re-kombinanttisolulinjoja. Vaikka voidaan odottaa jonkin verran muunnelmaa solulin-jasta solulinjaan, ja erilaisten komplementtireseptorituotteiden joukossa, perustuen tähän esitykseen on hyvin ammattimiehen toimialan puitteissa soveltaa tätä keksin-. töä erityiseen komplementti-reseptoriproteiinin ja tuottavan solulinjan yhdistel- . . · · 25 mään.

, Yleisesti, geenejä, jotka koodaavat proteiineja, kuten komplementtireseptorit, voi- t ’ ‘ j daan kloonata liittämällä DNA-fragmentit, jotka koodaavat polypeptidin toivottuja alueita, rekombinantti-DNA-välineeseen (esim. vektori) ja transformoimalla tai 30 transfektoimalla sopivia prokaryoottisia tai eukaryoottisia isäntiä. Sopiviin proka-ryoottisiin isäntiin kuuluvat, mutta ei ole rajoitettu, Escherichia, Streptomvces. Ba-: ”: cillus ja sen kaltaiset. Sopivia eukaryoottisia isäntiä ovat, mutta niihin ei rajoituta, hiiva, kuten Saccharomvces ja eläinsoluja viljelmässä, kuten VERO, HeLa, hiiri , · * *. C217, Kiinan hamsterin munasarja (CHO), WI-38, BHK, COS, MDCK ja hyönteis- 35 solulinjat. Erityisen edullinen isäntä on CHO-solulinjat, joilla on vikaa dihydrofo-laattireduktaasissa, kuten ATCC CRL 1793, CRL 9096 ja muut tässä jäljempänä ’: kuvatut solulinjat. Sellaiset rekombinanttitekniikat ovat nyt tulleet tunnetuiksi ja nii- ..tä on kuvattu teoksessa Methods in Enzymology, (Academic Press), nidokset 65 ja s 109202 69 (1979), 100 ja 101 (1983) ja tässä viitatuissa viitteissä. Laaja tekninen keskustelu, joka sulkee piiriinsä yleisimmin käytetyt rekombinantti-DNA-metodologiat, voidaan löytää teoksessa Maniatis, et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) tai Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing (19-5 88, 1991).

Eräs tapa saada DNA-fragmentti, joka koodaa toivottua polypeptidiä, kuten komp-lementtireseptori, on cDNA:n kautta tapahtuva kloonaus. Tässä prosessissa lähetti RNA (mRNA) eristetään soluista, joiden tiedetään tai epäillään tuottavan toivottua 10 proteiinia. Entsymaattisten reaktioiden sarjan kautta kopioidaan solujen mRNA-populaatio komplementaariseen DNAihan (cDNA). Saatu cDNA insertoidaan sitten kloonausvälineisiin ja sen jälkeen käytetään transformoimaan sopiva pro-karyoottinen tai eukaryoottinen isäntä. Saatu cDNA-"kiijasto" koostuu transformoitujen isäntäsolujen populaatiosta, joissa jokaisessa on yksittäinen geeni tai geeni-15 fragmentti. Kokonainen kirjasto, teoriassa, antaa edustavan näytteen koodaustiedos-ta, jota on mRNA-seoksessa, jota on käytetty tässä lähtömateriaalina.

Kirjastoja voidaan seuloa käyttämällä nukleiinihappo- tai vasta-ainekoettimia, jotta tunnistetaan spesifiset DNA-sekvenssit. Kun on kerran eristetty, nämä DNA-20 sekvenssit voidaan modifioida tai yhdistää kokonaisiksi geeneiksi. Vaihtoehtoisesti, kuten tässä keksinnössä on kuvattu, voidaan geenin spesifiset fragmentit työstää riippumatta geenin lopusta. Näiden työstettyjen geenifragmenttien koodaamia pro-teiinifragmentteja ei ehkä löydetä luonnosta, lisäksi niillä saattaa olla merkittävää ·.· hyötyä ei-toivottavien fysiologisten tilojen käsittelyssä. Liukoisen komplementti- . ..: 25 reseptorin geneettinen työstö estämään ja/tai käsittelemään häiriöitä sisältäen komp- .:. lementtiaktiivisuuden, on eräs sellainen tapaus.

» « t · > » ♦ · ' ’ Kun geeni tai geenifragmentti on kloonattu, DNA voidaan viedä ekspressiovektoriin •;;ja tuota rakennetta käytetään transformoimaan sopiva isäntäsolu. Ekspressiovektoria I I · 30 karakterisoidaan sillä, että sillä on ekspression kontrollisekvenssit, kuten tässä kuvattiin, siten, että kiinnostuksen kohteena oleva DNA-sekvenssi liitetään siihen :käyttökelpoisesti, vektori kykenee ohjaamaan kiinnostuksen kohteena olevan DNA-sekvenssin koodaaman tuotteen tuottamista. Viittaamalla erityisesti tähän keksin-, · · ·. töön on mahdollista koota yksittäisen koodaussekvenssin fragmentteja siten, että / . 35 ekspression jälkeen muodostuu liukoista reseptoriproteiinia. Erityisen tehokas tämän protokollan sovellutus SCRl-rekombinantin tuottamiseksi löydetään Fearon, et .,.Γ ai. PCT hakemus W089/09220, julkaistu 5. lokakuuta, 1989 ja W091/05047, jul- ’·.,,: kaistu 18. huhtikuuta, 1991, viitattu edellä.

9 109202

Sen jälkeen kun rekombinanttituote on tuotettu, on toivottavaa kerätä tuote. Jos tuotteen kuljettaa pois sen tuottanut solu, voidaan tuote kerätä suoraan soluviljelmä-alustasta. Jos tuote pidetään solun sisällä, täytyy solut rikkoa fysikaalisesti mekaanisin, kemiallisin tai biologisin keinoin, jotta saadaan solunsisäinen tuote.

5

Proteiinituotteen tapauksessa puhdistusprotokollan ei pitäisi antaa ainoastaan proteiinituotetta, jossa ei olennaisesti ole muita proteiineja, millä tarkoitetaan vähintään 80 % ja edullisesti enemmän kuin 95 % puhtautta verrattuna kokonaisproteiiniin valmisteessa, mutta se myös eliminoi tai vähentää hyväksyttävälle tasolle muita 10 isäntäsolukontaminantteja, DNA.ta, RNAita, mahdollisia kuumeen aiheuttajia ja sen kaltaisia.

Kuten edellä mainittiin, voidaan käyttää lukuisia isäntäsoluja tuottamaan tämän keksinnön reseptoreja. Erityisen isäntäsolun valinta on ammattimiehen alueella ot-15 taa huomioon, muun muassa, reseptorin luonne, sen synteesinopeus, sen hajoamis-nopeus ja rekombinanttivektorin, joka ohjaa resoptorin ekspressiota, luonteenominaisuudet. Isäntäsolun ekspressiosysteemin valinnan sanelee suureksi osaksi käytettävien soluviljelmämenetelmien luonne. Erityisen tuotantomuodon valinta, oli se sitten erä-muotoinen tai jatkuva, pyörivä tai paineilma, neste tai immobilisoitu, voi-20 daan tehdä kun ekspressiosysteemi kerran on valittu. Sen mukaisesti nestepetibio-reaktorit, onttokuitubioreaktorit, pyörivät pulloviljelmät tai sekoitetut tankkibiore-aktorit, solun mikrokantajan kanssa tai ilman, voidaan käyttää vaihtelevasti. Kriteeri sellaiseen valintaan ymmärretään soluviljelyssä. Niitä ei esitetä tässä yksityiskohtai-• sesti, koska ne ovat tämän keksinnön piirin ulkopuolella. Tämä keksintö koskee .; 25 komplementti-reseptorien, jotka ovat syntyneet konditioidussa soluviljelyalustassa, ,:. puhdistusta.

Kuten edellä mainittiin, tämä keksintö koskee, muun muassa, hydrofobisen vuoro-vaikutuskromatografian (HIC) sovellutusta komplementtireseptoriproteiinien puh-30 distukseen ja analysointiin. Hydrofobiset molekyylit vesipitoisessa liuottimessa liittyvät itsestään yhteen. Tämä yhteenliittyminen johtuu hydrofobisista vuorovaikutuksista. Nyt ymmärretään, että makromolekyyleillä, kuten proteiinit, on niiden pinnalla laajia hydrofobisia läikkiä odotettujen hydrofiilisten ryhmien lisäksi. HIC on ennustettu, osittain, näiden läikkien vuorovaikutukseen hydrofobisten ligandien ; 35 kanssa, jotka ovat kiinnittyneet kromatografisiin kannattajiin. Hydrofobiseen ligan-diin, joka on kytkeytynyt matriisiin, viitataan tässä erilailla, kuten HlC-kannattaja, HIC-geeli tai HlC-pylväs. Lisäksi on ymmärrettävä, että vuorovaikutuksen voimakkuus proteiinin ja HIC-kannattajan välillä ei ole ainoastaan ei-pooliset pooliset pin- 10 109202 natsuhteen funktio proteiinissa, vaan ei-poolisten pintojen jakaantuminen yhtä hyvin.

Valmistettaessa HlC-pylväitä voidaan käyttää lukuisia matriiseja, eniten käytetty on 5 agaroosi. Piihappo- ja orgaanisia polymeerihartseja voidaan käyttää. Hyödyllisiin hydrofobisiin ligandeihin kuuluvat, mutta niihin ei rajoittuta, alkyyliryhmät, joissa on noin 2 - noin 10 hiiliatomia, kuten butyyli, propyyli tai oktyyli; tai aiyyliryhmät, kuten fenyyli. Tavanomaisia HIC-tuotteita geeleille ja pylväille voidaan saada kaupallisesti tuottajilta, kuten Pharmacia LKB AB, Uppsala, Ruotsi, tuotenimillä bu-10 tyyli-SEPHAROSER, fenyyli-SEPHAROSER CL-4B, oktyyli-SEPHAROSER FF ja fenyyli-SEPHAROSER FF; Tosoh Corporation, Tokio, Japani, tuotenimillä TO-YOPEARL Butyl 650M (Fractogel TSK Butyl-650) tai TSK-GEL phenyl-5PW; Miles-Yeda, Rehovot, Israel, tuotenimellä alkyl-agarose, jossa alkyyliryhmässä on 2-10 hiiliatomia ja J.T. Baker, Phillipsburg, N.J., tuotenimellä Bakerbond WP-HI-15 propyl.

On myös mahdollista valmistaa toivottu HlC-pylväs käyttämällä tavanomaista kemiaa. Esimerkiksi matriisi/ligandi-yhdistelmät muodosta 20 NH2 M-0-t-NH-CH2-(CH2)6-CH3, jossa M on matriisi, kuten agaroosi, voidaan muodostaa agaroosin syaanibromidi-aktivaation jälkeen kytkemällä alkyyliamiinin kanssa, kuten on opetettu Er-el, Z. et ai. Biochem. Biophys. Res. Comm. 49: 383 (1972). Vaihtoehtoisesti yhdistelmät muodosta 25

OH <j)H

";:. M-0-CH2-CH-CH2-0-(CH2)6-CH3 tai m-o-ch2-ch-ch2-o-a, ; jossa M on matriisi, kuten agaroosi, ja A on aryyli, voidaan valmistaa glysidyylieet- 30 terikytkentämenetelmällä (Ulbrich, V. et ai. Coll. Czech. Chem. Commun. 9: 1466 (1964)). Lyhyesti, geeli, tavallisesti agaroosi, siirretään orgaaniseen liuottimeen, » esim. dioksaani. Tämä tehdään vaiheittain (100 ml annokset 100 ml:aan laskeutu-: nutta geeliä) Biichner-suppilossa: (1) yksi pesu vesi-dioksaanilla (4:1), (2) yksi pesu vesi-dioksaanilla (3:2), (3) yksi pesu vesi-dioksaanilla (2:3), (4) yksi pesu vesi-: 35 dioksaanilla (1:4) ja (5) 7 pesua dioksaanilla. Lisätään 100 ml dioksaania 100 ml:aan laskeutunutta geeliä ja lisätään 2 ml 48-prosenttisesti booritrifluorieteraatti-liuosta dietyylieetterissä ja sekoitetaan 5 min. Lisätään pisaroittani 1 ml sopivaa J glysidyylieetteriä, joka on liuotettu 10 ml: aan dioksaania, erotussuppilosta. Reaktio π 109202 kestää noin 40 min. Reaktion jälkeen derivoitu geeli siirretään ta- kaisin vesipitoiseen ympäristöön, mutta kääntäen edellä olleet vaiheet (4)-(1) ja lopetetaan lopullisella vesipesulla. Ligandin määrää, joka on tarkoitus kytkeä geeliin, voidaan kontrolloida vaihtelemalla reaktioseokseen lisätyn glysidyylieetterin määrää. Reaktio 5 voidaan esittää yleisesti seuraavasti:

χΟχ BF3Et20 OH

M-OH + CH2-CH- ch2-or------------m-o-ch2-(!:h-ch2-or jossa M on matriisi, kuten agaroosi ja R on alkyyli tai aryyli.

10

Liganditiheys on tärkeä parametri siksi, että se ei vaikuta ainoastaan vuorovaikutuksen voimakkuuteen, vaan pylvään kapasiteettiin yhtä hyvin. Kaupallisesti saatavilla olevien fenyyli- tai oktyylifenyyligeelien liganditiheys on kertaluokkaa 40 pmol/ml geelipeti. Geelikapasiteetti on tietyn kyseessä olevan proteiinin funktio, samoin kuin 15 pH, lämpötila ja suolapitoisuus, mutta yleisesti sen voidaan odottaa putoavan alueelle 3-20 mg/ml geeliä.

Tietyn geelin valinnan voi ammattimies päättää. Yleensä proteiinin ja HIC-ligandin vuorovaikutuksen voimakkuus kasvaa alkyyliligandin ketjun pituuden mukaan, 20 mutta ligandit, joilla on noin 4 - noin 8 hiiliatomia, ovat sopivia useimpiin erotuksiin. Fenyyliryhmällä on noin sama hydrofobisuus kuin pentyyliryhmällä, vaikka selektiivisyys voi olla aivan erilainen johtuen pi-pi-vuorovaikutuksen mahdollisuudesta proteiinin aromaattisten ryhmien kanssa.

..: 25 Proteiinien adsorptiota HlC-pylvääseen suosivat korkeat suolapitoisuudet, mutta to- .:. delliset pitoisuudet voivat vaihdella suuresti riippuen proteiinin luonteesta ja erityi- ' ‘ ’ ·. sesti valitusta HIC-ligandista. Erilaisia ioneja voidaan jäljestää niin kutsuttuihin so- ’' ‘ lufobisiin Saijoihin riippuen, edistävätkö ne hydrofobisia vuorovaikutuksia (suolaus :;; irti liuoksesta -vaikutukset) vai rikkovatko ne veden rakenteen (kaotrooppinen vai- ‘ ‘ 30 kutus) ja johtavat hydrofobisen vuorovaikutuksen heikkenemiseen. Kationit luokite taan kasvavan suolaus irti liuoksesta vaikutuksen mukaan, kuten Ba++< Ca++< : “: Mg++< Li+< Cs+< Na+< K+ < Rb+< NH4+. Kun taas anionit voidaan luokittaa kasva- ,/ van kaotrooppisen vaikutuksen mukaan, kuten P04'~< S04~< CH3COO'< Cl'< Br < , ’ -. N03'< C104'< Γ< SCN\ Sen mukaisesti suolat voivat olla formuloidut, että ne vai- , (: 35 kuttavat vuorovaikutuksen voimakkuuteen, kuten on annettu seuraavassa suhteessa:

..: i * Na2S04> NaCl> (NH^SC^ mUC\> NaBr> NaSCN

109202 12

Yleensä suolapitoisuudet, jotka ovat noin 0,75 - noin 2 M ammoniumsulfaattia tai noin 1 - 4 M NaCl, ovat hyödyllisiä.

Lämpötilan vaikutus HIC-erotuksiin ei ole yksinkertainen, vaikka yleisesti lämpöti-5 lan lasku nostaa vuorovaikutusta. Kuitenkin mikä tahansa etu, joka voisi tulla osaksi nostamalla lämpötilaa, täytyy punnita haittavaikutuksia vastaan, kuten se, että kasvulla saattaa olla vaikutusta proteiinin aktiivisuuteen.

Eluutio, joko vaiheittain tai gradientin muodossa, voidaan suorittaa eri tavoin: (a) 10 muuttamalla suolapitoisuutta, (b) muuttamalla liuottimen poolisuutta tai (c) lisäämällä detergenttejä. Vähentämällä suolapitoisuutta adsorboituneet proteiinit ehioi-daan, jotta lisätään hydrofobisuutta. Muutoksiin poolisuudessa voidaan vaikuttaa liuottimien lisäyksellä, kuten etyleeniglykoli tai (iso)-propanoli, täten vähentämällä hydrofobisten vuorovaikutusten voimakkuutta. Detergentit toimivat proteiinien kor-15 vaajina ja niitä on käytetty ensi sijassa membraaniproteiinien puhdistuksen yhteydessä.

Kuten edellä mainittiin, on HIC erityisen hyödyllinen käytettynä yhdessä muiden proteiinin puhdistustekniikkoj en kanssa. Tämä tarkoittaa, että on edullista käyttää 20 HIC:ta materiaaliin, joka on puhdistettu erityisesti muilla proteiinin puhdistusteknii-koilla. Termillä "erityisesti puhdistettu" tarkoitetaan proteiinivalmistetta, jossa kiinnostuksen kohteena olevaa proteiinia on läsnä ainakin 5 paino-%, edullisemmin ainakin 10 % ja edullisimmin ainakin 45 %. Sen mukaisesti HIC:n käyttö on parhai-. i ten ymmärrettävissä komplementtireseptoriproteiinien kokonaispuhdistusprotokol- ..: 25 lan yhteydessä. On havaittu hyödylliseksi, esimerkiksi altistaa konditioidun soluvil- jelyalustan näyte osittaiseen puhdistukseen ennen HIC:n soveltamista. Termillä "konditioitu soluviljelyalusta" tarkoitetaan soluviljelyalustaa, jossa on ollut solu- * j kasvua ja/tai solun ylläpitoa ja sisältää eritetyn tuotteen. Sellaisen alustan väkevöity näyte altistetaan yhdelle tai useammalle proteiinin puhdistusvaiheelle ennen HIC- • ’ ‘ 30 vaiheen soveltamista. Näyte voidaan altistaa ioninvaihtokromatografialle ensimmäi senä vaiheena. Kuten edellä mainittiin, voivat erilaiset anioniset tai katumiset sub-: ‘: stituentit kiinnittyä matriiseihin muodostaakseen anioniset tai kationiset kannattajat kromatografialle. Anioninvaihtosubstituentteihin kuuluvat dietyyliaminoetyyli t · ·. (DEAE), kvatemäännen aminoetyyli (QAE) ja kvatemääriset amiini-(Q)iyhmät.

, , 35 Kationinvaihtosubstituentteihin kuuluvat karboksimetyyli (CM), sulfoetyyli (SE); sulfopropyyli (SP), fosfaatti (P) ja sulfonaatit (S). Selluloosaioninvaihtohartseja, ku-ten DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 ja CM-52, on saatavilla, Whatman Ltd. Maidstone, Kent, U.K. SEPHADEXR-pohjaiset ja ristiinsidotut ionionvaihtajat ovat 109202 13 myös tunnettuja. Esimerkiksi DEAE-, QAE-, CM- ja SP-SEPHADEXR ja DEAE-, Q-, CM- ja S-SEPHADEXr kaikkia saadaan Pharmacia AB:ltä. Lisäksi sekä DEAE- että CM-derivoitua etyleeniglykolimetakrylaattikopolymeeriä, kuten TOYOPEARL DEAE-650S ja TOYOPEARL CM-650S, saadaan Toso Haas Coilta, 5 Philadelphia, Pa. Koska eluutioon ionisista kannattajista tavallisesti sisältyy suolan lisäys ja koska, kuten edellä mainittiin, HIC lisääntyy kasvaneissa suolapitoisuuksissa, on HIC-vaiheen käyttäminen ioninvaihtokromatografiavaiheen tai muun suolan välittämän puhdistusvaiheen jälkeen erityisen edullinen. On edullista, että ka-tioninvaihtokromatografiavaihe ja ammoniumsulfaattisaostusvaihe ovat HIC:n käy-10 tön edellä. Lisäksi tulevia puhdistusprotokollia voidaan lisätä sisältäen, mutta ei välttämättä rajoittuen lisäksi tulevaan ioninvaihtokromatografiaan, kokoekskluusio-kromatografiaan, virusinaktivointiin, väkevöintiin ja kylmäkuivaukseen.

Kun HIC:stä saatu eluaatti altistetaan edelleen ioninvaihtokromatografiaan, on edul-15 lista, että käytetään sekä anionisia että katumisia menetelmiä.

Kuten edellä mainittiin, geelisuodatuskromatografia vaikuttaa erotukseen, joka perustuu molekyylien kokoon. Se on itse asiassa molekyyliseulonnan muoto. On toivottavaa, että matriisin ja liuenneen aineen välillä ei tapahdu vuorovaikutusta, 20 siksi täysin inertit matriisimateriaalit ovat edullisia. On myös toivottavaa, että matriisi on jäykkää ja erittäin huokosta. Suuren mittakaavan prosesseihin jäykkyys on tärkeintä, koska tuo parametri perustaa kokonaisvirtausnopeuden. Perinteiset materiaalit, esim. SEPHADEXR tai BIO-GELR olivat riittävän inerttejä ja saatavilla ,' ,: huokoskokoalueella, kuitenkin nämä geelit olivat suhteellisen pehmeitä ja eivät ; · 25 erityisen hyvin sopineet suuren mittakaavan puhdistukseen. Äskettäin on kehitetty geelejä, joilla on lisääntynyt jäykkyys (esim. SEPHACRYLr, UTROGELr, FRACTOGELr ja SUPEROSEr). Kaikkia näitä materiaaleja saadaan partikke-‘ likokoina, jotka ovat pienempiä kuin perinteisissä kannattajissa saatavilla olevat siten, että resoluutio säilytetään jopa korkeimmissa virtausnopeuksissa.

‘ ‘ 30 TOYOPEARL HW -Saijojen matriisit (Toso Haas) ovat edullisia.

": Valaisevia tarkoituksia varten vain tätä keksintöä sovelletaan liukoista tyyppiä ole- van komplementtireseptorin puhdistukseen. Tarkemmin, liukoiseen CR1 rakentee-,··*, seen, jossa on johtaja, LHR-A, LHR-B, LHR-C, LHR-D, SCR29, SCR30 alueet 35 ylöspäin ja sisältäen transmembraanialueen ensimmäisen alaniinijäännöksen; ja vas- . täten CR1 koodaussekvenssejä plasmidilla pBSCRl, Fearon et ai.; 1989, kansainv.

patenttijulkaisu numero W089/09220, julkaistu 5. lokakuuta 1989 (tämän jälkeen "TP10HD"). Rekombinanttisysteemin rakentaminen TP10HD:n tuottamiseksi on 109202 14 kuvattu yksityiskohtaisesti edellä mainitussa PCT hakemuksessa ja tiivistettynä seuraavasti.

CHO-solut trypsinoitiin ja maljattiin 5 x 105/60 mm maljalle ja jätettiin kasvualus-5 taan (Hams F12 ravintoalusta (041-1765), jossa oli 1 % glutamiinikantaliuos (043-05030), 1 % pen/strep kantaliuos (034-05070) ja 10 % naudan vasikan sikiön seerumia (011-6290), Gibco, Paisley, Skotlanti) 37 °C:ssa kostutetussa inkubaattorissa 5 % CO2/95 % ilma ilmakehässä. 21 h:n kuluttua solut käytettiin DNA-transfektioon. Ekspressioplasmidi, jossa oli sCRl koodaussekvenssi pBSCRliltä 10 transfektoitiin samanaikaisesti pSV2dhfr:n kanssa dhfriää vaativaan Kiinan hamsterin munasarjasolulinjaan (CHODUXBII). Transfektio suoritettiin kasvualustassa ja käytettiin kalsiumin kanssa tapahtuvaa saostumis/glyserolishokki-menetelmää, joka on kuvattu teoksessa: DNA Cloning, D.M. Glover toim. (kappale 15, C. Gorman).

I Sen jälkeen, kun oli transfektoitu pBSCRl/pTCSgpt:llä ja pSV2dhfr:llä, soluja pi- ! 15 dettiin kasvualustassa 46 h kasvuolosuhteissa (kuten edellä kuvattiin) ennen valin- j tamenetelmää.

Valinta- ja samanaikaisesti tapahtuva amplifikaatio-menetelmä suoritettiin olennaisesti kuten R.J. Kaufman et ai. ovat kuvanneet (Mol. Cell. Biol. 5: 1750-1759) 20 (1985)). 46 h transfektion jälkeen solut vaihdettiin valinta-alustaan MEM ALPHA

(041-02571), 1 % glutamiinikantaliuos, 1 % pen/strep kantaliuos (034-05070) ja dialysoitiin naudan vasikan sikiön seerumia vastaan (220-6300AJ) (Gibco, Paisley, Skotlanti). Soluja pidettiin selektiivisessä alustassa 8-10 d, kunnes ilmestyi dhfr+ • pesäkkeitä. Kun pesäkkeet muodostuivat, solut vaihdettiin selektiiviseen alustaan, .: 25 jossa oli metoreksaattia (A6770, Sigma Chem. Co., St.Louis, Mo.). Metoreksaatti- ,:. pitoisuus oli alunperin 0,02 μΜ ja nostettiin vaiheittain 5 μΜ:ϋη. Amplifikaatiome- •, netelmän aikana annoksista kasvualustaa kasvavista soluista määritettiin TP10HD- "! tuotto ELISA:lla. Mitä tahansa komplementtireseptoria, joka erittää re- kombinanttisolulinjaa (esim. ATCC CRL 10052) voidaan käyttää toimittamaan

t I

30 konditioitua alustaa puhdistukseen tämän keksinnön mukaisesti, mutta erityistä so-lulinjaa ei varmastikaan vaadita.

Transfektoitua CHO-solulinjaa, joka kykenee tuottamaan TP10HD:ta, voidaan vil-. jellä lukuisilla soluviljelyn tekniikoilla. Tämän keksinnön sovellutusta varten erityi-35 nen menetelmä viljellä, ei ole kriittinen, kuitenkin valaisevia tarkoituksia varten, eräs menetelmä soluviljelyä varten, jota voidaan käyttää, on jatkuva kaatamismene-telmä, joka perustuu Verax nestepetiteknologiaan, kuten on U.S. patenteissa 4 861 ; J 714; 4 863 856; 4 978 616 ja 4 997 753, joiden sisällöt on liitetty tähän viitteeksi.

109202 15

Sen mukaisesti transfektoidut solut, kuten ne, jotka on kuvattu edellä, korotetaan CCM-3-alustaan (DMEMin, Ham's F-12:n, naudan seerumialbuminin ja muiden ra-vintolisäaineiden seos), johon on lisätty 10 % naudan sikiön seerumia (FBS) ja 5 mM metoreksaattia (MTX). Solupopulaatio kasvoi pyörivissä pulloissa, kunnes saa-5 tavilla oli riittävä määrä soluja ymppäämään bioreaktori. Ennen ymppäämistä S200 bioreaktorille suoritettiin puhdista-paikalla ("clean-in-place", CIP) ja höyiytä-pai-kalla ("steam-in-place", SIP)syklit. Sitten se täytettiin CCM-3-alustalla, jossa oli 5 % FBSrää ja varustettiin 450 g:lla mikropalloja. Mikropallot konditioitiin ennen ymppäämistä. Reaktio ympättiin soluilla ja toimintaparametrit olivat: pH 7,2, 37°C, 10 sisääntulo (nestepetin pohja) liuennut O2 100-400 torr, ulostulo (nestepetin yläosa) liuennut O2 0-200 torr. Ensimmäisen batch-vaiheen jälkeen aloitettiin alustaperfuu-sio, jossa oli jaksottaisia nopeuden kasvuja siten, että ylläpidettiin glukoosipitoisuus 1,0 g/1. Tätä jatkettiin, kunnes riittävä määrä soluja oli kerääntynyt reaktoriin ymppäämään S2000 bioreaktori. CIP:n ja SIP:n jälkeen S-2000 reaktori täytettiin CCM-15 3-alustalla, jossa oli 5 % FBS.ää ja 5 mM MTX:ää ja varastettiin 5000 g:lla mikro-palloja. Nämä mikropallot konditioitiin ennen ymppäämistä. Toimintaolosuhteet lämpötilan, reaktorijäijestelyjen ja liuenneen 02:n suhteen olivat kuten edellä on annettu. Mikropallot S-200 reaktorista siirrettiin aseptisesti S-2000 reaktoriin aloittamaan batch-vaihe. Kun glukoosipitoisuus putosi alle 1,5 g/1, aloitettiin kasvuvaihe 20 aloittamalla alustan perfuusio (CCM-3, 5 % FBS ja 5 mM MTX) nopeudella, joka oli riittävä ylläpitämään glukoosipitoissuus 1,0 g/1. Solukasvua tarkkailtiin on-line mittaamalla hapen sisäänotto- ja glukoosin kulutusnopeudet. Kim riittävä määrä soluja oli kerääntynyt reaktoriin, vaihdettiin perfuusioalusta CCM-3-transitioalustaan, . : johon oli lisätty 1 % FBS:ää ja 5 mM MTX:ää. Jälleen tätä perfuusionopeutta modi- 25 fioitiin ylläpitämään 1,0 g/1 glukoosipitoisuus. Sen jälkeen kun transitioalustassa oli ., lisää kasvua, perfuusioalusta vaihdettiin kerran jälleen tuottoalustaan, CCM-3, jo- "1j hon oli lisätty 5 mM MTX.ää. Perfuusionopeutta nostettiin ylläpitämään 1,0 g/1 ' ; glukoosipitoisuus. Sen jälkeen alennettiin joko ulosmenon liuennutta 02:ta tai kier- 1 » * rätysvirtausnopeuden asetusarvoja ylläpitämään reaktorin kontrollia. Tuottofaasi 30 kestää tyypillisesti noin 60 d. 1 400-1600 1 reaktorin läpikulkenutta nestettä varastoitiin 4-8°C, työstettiin Millipore

Prostak -mikrosuodatusyksiköllä. Fermenttorialusta tästä toiminnasta, jossa ei ollut soluja, korvasi ultrasuodatusvaiheen. Fermenttorialusta väkevöitiin 30-60 X Milli- t , 35 pore Spiral Wound -systeemillä. Väkevöinnin jälkeen, retentaatti valutettiin varaus-tankkiin ja systeemi täytettiin 5-20 1:11a 50 mM fosfaattipuskuria, pH 7,5. Pesu-puskuri valutettiin systeemistä ja yhdistettiin retentaatin kanssa. Ultrasuodatuskon- ‘: sentraatti suodatettiin esisuodattimen ja lopullisen 0,22 mm suodattimen läpi etukä- 109202 16 teen autoklavoituun Nalgene-pulloon. Nimellisesti 800 ml konsentraattia dispergoi-daan jokaiseen pulloon ja varastoidaan jäädytettynä.

Kuten aikaisemmin mainittiin, erityinen rekombinanttituottosysteemi ja erityinen 5 soluviljelyprotokolla on tämän keksinnön piirin ulkopuolella. Edellä keskusteltu systeemi ja protokolla on malli monista, saatavilla olevista, ammattimiehelle vapaasti valittavista ja ne ovat mukana vain valaisevia tarkoituksia varten. Puhdistus-protokolla, joka on tämän keksinnön kohde, on sovellettavissa, vain rutiinimodi-fikaatioin, lukuisiin rekombinantti-komplementtireseptori- ja reseptorin kaltaisiin 10 proteiineihin, huolimatta siitä kuinka ne on tuotettu tai viljelty.

Puhdistetuilla komplementtireseptoriproteiineilla, jotka on saatu tämän keksinnön käytännön menetelmällä, on seuraavia ominaisuuksia: 1) enemmän kuin 95 paino-% CR-proteiinia; 2) stabiili proteolyyttiselle hajotukselle 4°C:ssa ainakin 3 kk; 3) al-15 hainen (< 1 E.U./mg proteiinia) endotoksiini; 4) alhainen (< 1 pg/mg proteiinia) DNA; 5) ei-CR-proteiini < 5 paino-%; ja 6) virus-aktiivinen. Seuraavat esimerkit kuvaavat lisää tätä keksintöä, mutta niitä ei ole annettu rajoittamaan tässä olevia patenttivaatimuksia.

20 Esimerkki 1

Seuraavassa luonnosteltu menetelmä kehitettiin eristämään ja puhdistamaan liukois-*, : ta komplementtireseptori-l:tä (sCRl) konditioidusta soluviljelyalustakonsentraatis- ’ _ J ta. Tämä menetelmä on suunniteltu valmistamaan sCRl, jossa on >95 % proteiini- 25 puhtaus, samalla poistaen epäpuhtaudet, jotka johtuvat isäntäsolusta, soluviljely- • · ; alustasta tai muista raaka-aineista. Keräysmenetelmä koostuu 9 vaiheesta, joihin si- • · · sältyy kationin- ja anioninvaihto, hydrofobinen vuorovaikutus ja ko- koekskluusiokromatografia; ammoniumsulfaattisaostus; ja kaksi viruksen inakti-:: vointikäsittelyä. Jokainen vaihe on kuvattu yksityiskohtaisesti alla. Vaiheet 1-5 suo- 30 ritetaan 2-8 °C:ssa ja vaiheet 6-9 suoritetaan 20-25 °C:ssa.

t · ' “: Vaihe 1: Alustojen esikäsittely 1 · 2 ‘ Samalla kun sekoitetaan, säädetään konditioitujen alustojen konsentraatti pH 5,2:ksi 35 lisäämällä 1 N HCl:ää. Kun lisäys on täydellinen, jatketaan sekoitusta ja pH:ta tarkkaillaan 10 min. pH:n säätö tuottaa raskaan saostuman. Selkeytyminen saavutetaan . 2; mikrosuodatuksella 3 Millipore Polygard-CR-suodatinsarjan läpi, jotka on yhdistetty tandemina (5 μ - 0,5 μ - 0,1 μ). sCRl saadaan suodokseen.

2 109202 17 !

Alustakonsentraatm happamaksi tekeminen ja suodatus poistaa sekä ei-sCRl-proteiinin että ei-proteiinipitoisen materiaalin; ja säätää sCRlitä sisältävän suodok-sen sopivaan pH:hon myöhemmin seuraavaa S SEPHAROSE-kromatografiaa var-5 ten.

Vaihe 2: Pharmacian nopean virtauksen kromatografla pHiltaan 5,2 oleva suodos laitetaan Pharmacian nopean virtauksen S SEPHAROSE 10 geeliin, joka on aikaisemmin tasapainotettu puskurilla A, virtausnopeudella 60 cm/h, ja < 3 g sCRl/1 petidlavuutta kapasiteetilla. Pylväs pestään 150 cm/h 3-5 peti-tilavuudella puskuria A, jonka jälkeen 5-10 petitilavuudella puskuria B. sCRl sitoutuu pylvääseen ja eluoidaan puskurilla C. Pylväs puretaan pesemällä 3 petitilavuudella puskuria D.

15 S SEPHAROSE -kromatografia poistaa suuren osan solun ja alustojen johtamia epäpuhtauksia (erityisesti proteiini) ja väkevöi sCRl:n puskuri C -pylväseluaatissa lisäprosessointia varten.

20 Vaihe 3: Ammoniumsulfaattisaostus S SEPHAROSE -puskuri C -eluaatti säädetään 1,2 Miksi ammoniumsulfaatiksi li-•, ; säämällä puskuria E. Kun lisäys on täydellinen, sekoitus lopetetaan ja seoksen anne- taan seistä yön yli.

V 25 i *"; Saostuma, jossa on sCRl, kerätään sentrifiigoimalla 10 min 8000 X G.

Pelletoitu materiaali suspendoidaan uudestaan sekoittamalla kevyesti noin 4 lissa ;: puskuria E. Lisätään vielä puskuria F, kunnes liuoksen absorbanssi 280 nmissä on

30 1,5 OD-yksikköä. Liuosta sekoitetaan yön yli ja suodatetaan Millipore Polygard-CR

•: ·: 0,1 μ:η suodattimen läpi.

Ammoniumsulfaattisaostus poistaa lisäepäpuhtauksia ja valmistaa sCRlin hydro-' · · · ’ fobiseen vuorovaikutuskromatografiaan.

IIIM

\ 1 35

I I I

i i I I

» « » 109202 18

Vaihe 4: TOYOPEARL butyyli-650M -kromatografia

Uudelleen liuotettu ja suodatettu ammoniumsulfaattipelletti säädetään 0,8 M am-moniumsulfaatiksi lisäämällä puskuria E samalla sekoittaen.

5

Kun lisäys on täydellinen, seos laitetaan TOYOPEARL butyyli-650 M -geelipyl-vääseen, joka on aikaisemmin tasapainotettu puskurilla G, virtausnopeudella 150 cm/h ja < 4 g kokonaisproteiini/1 pylvästilavuus-kapasiteetilla. Puskurit ja pylväs pidetään 2-8 °C:ssa. Kun lisääminen on täydellinen, pylväs pestään 2-3 petitilavuu-10 della puskuria G, pestään 3 petitilavuudella puskuria H, ja sidottu sCRl eluoidaan puskurilla I.

Vaihe 5: Viruksen inaktivointi ja Pharmacia SEPHADEX G 25 -kromatografia 15 Lisätään kiinteää GuHClitä butyyli puskuri I eluaattiin noin 2 M:n pitoisuuteen ja sekoitetaan, kunnes on täydellisesti liuennut. pH:ta tarkkaillaan ja jos tarpeellista, säädetään pH 7,0:ksi käyttämällä 2,5 N NaOH:ta.

Kun GuHCl on täydellisesti liuennut, liuosta pidetään 6 min ja laitetaan Pharmacia ! 20 SEPHADEX G25-pylvääseen, joka on aikaisemmin tasapainotettu puskurilla J, vir tausnopeudella 60 cm/h. Annoksen tilavuus ei saisi ylittää 25 % SEPHADEX G25-pylvään tilavuudesta.

Sen jälkeen, kun sCRl on eluoitu (eluutteja huokostilavuudessa), pylväs pestään 25 puskurilla J, kunnes "suola"-piikki on eluoitunut ja johtokyky palasi perusviivan ta-• ·; solle. SEPHADEX G25 tuote säädetään pH 11 :ksi lisäämällä 2,5 M NaOHita, liuos-

. ·.: ta pidetään pH 1 l:ssä 16 min ja säädetään uudestaan pH 9,0:ksi käyttämällä 2,5 M

HCl:ää. Materiaali on nyt valmista anioninvaihtokromatografiaan.

30 GuHCl ja pH 11 käsittelyt saavat aikaan retrovirus-inaktivaation, jos viruksia on :·*· läsnä, ja SEPHADEX G25 -kromatografia valmistaa sCRl-tuotteen DEAE •. TOYOPEARL -kromatografiaan.

Vaihe 6: TOYOPEARL DEAE-650S -kromatografia 35 ·· SEPHADEX G25 -tuote viedään TOYOPEARL DEAE-650S -geelipylvääseen, jo-. · *. ka on aikaisemmin tasapainotettu puskurilla J, virtausnopeudella 150 cm/h ja < 6 g -proteiini/1 pylvästilavuus-kapasiteetilla. Sen jälkeen kun pylväs on täytetty, se pes- 19 109202 tään 3 petitilavuudella puskuria J. Sidottu sCRl eluoidaan 5 pylvästilavuudella lineaarista gradienttia aloittamalla 100 %:sta puskuria J ja ulottumalla 100 %:iin puskuria K. Pylväs puretaan pesemällä 3 petitilavuudella puskuria L.

5 TOYOPEARL DEAE -kromatografia poistaa kontaminanttiproteiinit, DNA:n ja mahdolliset virusepäpuhtaudet.

Vaihe 7: TOYOPEARL CM-650S -kromatografia 10 Laimenna DEAE-tuote 2 tilavuudella puskuria M ja säädä pH 5,5:ksi 2,5 N HClillä. Laita laimennettu seos TOYOPEARL CM -650S geelipylvääseen, joka on aikaisemmin tasapainotettu puskurilla M, virtausnopeudella 150 cm/h ja < 11 g proteii-ni/1 pylvästilavuus-kapasiteetilla. Sen jälkeen kun pylväs on täytetty, pese 3 petitilavuudella puskuria M ja eluoi sidottu sCRl 5 pylvästilavuudella lineaarista gradient-15 tia ulottumalla 100 %:sta puskuria M 100 %:iin puskuria N. Pylväs puretaan pesemällä 3 petitilavuudella puskuria O. Tuote, jossa on eluaatti, neutraloidaan 1/10 tilavuudella 0,5 M kaksiemäksistä natriumfosfaattia ja on nyt valmis kokoekskluu-siokromatografiaan.

20 TOYOPEARL CM -kromatografia poistaa kontaminanttiproteiinit, DNA:n ja mahdolliset virusepäpuhtaudet.

Vaihe 8: TOYOPEARL HW65S -kromatografia 25 TOYOPEARL CM -tuote viedään TOYOPEARL HW65S -pylvääseen, joka on ai-···· . kaisemmin tasapainotettu puskurilla F, virtausnopeudella 30 cm/h. Laitettavan ai- neen tilavuus ei saisi ylittää 5 % kokonais- TOYOPEARL HW65S -pylväs-...i‘ tilavuudesta. Kerää koko tuotepiikki, kunnes absorbanssi laskee 10 %:iin maksi- : : : miabsorbanssista. Materiaali on nyt valmis lopulliseen väkevöintiin.

30

Kokoekskluusiokromatografia poistaa pienimolekyylisten proteiiniepäpuhtauksien .··. viimeiset jäljet ja toimii puskurina vaihtamaan sCRl:n lopulliseen kohdepuskuriin.

‘ · ··1 Vaihe 9: Väkevöinti ja lopullinen suodatus ·;··: 35 TOYOPEARL HW65S -keräymä väkevöidään 5-6 mg/ml käyttämällä Pharmacia .·1. Minisette -ultrasuodatusyksikköä, joka on sovitettu 100 K MWCO Omega 20 10920? -membraanin kanssa. Väkevöity tuote suodatetaan Millipore 0,2 μ Millipak -suodattimen läpi.

PUSKURIT

5 Puskuri A 20 mM natriumfosfaatti, 60 mM NaCl, pH 5,2 Puskuri B 20 mM natriumfosfaatti, 100 mM NaCl, pH 6,0 Puskuri C 20 mM natriumfosfaatti, 500 mM NaCl, pH 7,0 Puskuri D IM NaCl

Puskuri E 3 M ammoniumsulfaatti, 100 mM natriumfosfaatti, pH 7,0 10 Puskuri F 10 mM natriumfosfaatti, 0,9 % w/v NaCl, pH 7,0

Puskuri G 0,8 M ammoniumsulfaatti, 100 mM natriumfosfaatti, pH 7,0 Puskuri H 0,7 M ammoniumsulfaatti, 100 mM natriumfosfaatti, pH 7,0 Puskuri I 0,09 M ammoniumsulfaatti, 100 mM natriumfosfaatti, pH 7,0 Puskuri J 50 mM Tris/Tris.HCl, pH 9,0 15 Puskuri K 50 mM Tris/Tris.HCl, 0,2 M NaCl, pH 9,0

Puskuri L 50 mM Tris/Tris.HCl, 1,0 M NaCl, pH 9,0 Puskuri M 50 mM MES/MES.Na, pH 5,5 Puskuri N 50 mM MES/MES.Na, 0,25 M NaCl, pH 5,5 Puskuri O 50 mM MES/MES.Na, 0,25 M NaCl, pH 5,5 20 1 f I · » · 109202 g ώ I ν •ώ (5fl o e oo gg r» ^ — o o ^ o t d n ό o"· o" o o' o' o' o" «Ω

G

QJ

G

·£ • ^4

\C

rt

*3 © Γ" VO 0\ 00 rr -H 0\ M

p © cv oc vo vo Ό vo m »n

o M

Λ CO ^ rS © r- cv o © -3- </ί Γ"- oo c3 o Gv 00 OOOCTvOvOvOv

> — -H

S

o ~ J. 7.

(N un r*> <r> —i VO </3 Tf Γ- Tl· Ό O > , ^ r··^ ^ rv rv rv rv rv ^ rv rv ^ 1 caCj — © vi oo oo vo o 3· vt «v

c en Tf vt n N N N N N N O

J§ X

o -a en ^ -S *Λν ΰ -η νο_ © ολ <ν — ™ . . 2 Tt -3- o" Ή c\ os' Γ'-'1 «τΓ «η ·· Ο,ονοοο η (Μ (S (S (Ν Ν § : \ο «τ> 8 ω .:. 'V en r- νο ’κβ : m oo rt oo t"- r*-> r-~ -3· σν a* r„ -3- w in vo -3- σν r- on on c a (j o © — ooosc^-Hu-v-a 3 «o e | -a Ξ n .a il rt) o 11 •s o a- -3- vo o σν o r" m « . _ p O Tl· -3- f' </V V—' (N Ό 3 , , JB rv rv rv rv rv rv rv rv rv .· -M CL, VO «nm O O CO Tf -r >/-> :eö ?V co ;2 ... co 33

, · C/3 · · I—I

• a s« .2 as ... CO _ ^-1 ' · 33 o ce '... 33 oo e 33 (N 3 ,,..: 3 ·η .J o » · cl ζΛ o - « seooga^s-g: ,;. o a .2 a.a^vo^^c/ipo § -7. ,¾ 3¾ <u 3 g£2-a :...: ! > 5 ^ 3 O | N ΐ > & -o n 6 co '3 λ <ζρϋ<^ HE— ί> iO<!W(Zl<lt/3CÖwQUiiJ a-oo

Claims (15)

109202 !

1. Menetelmä komplementtireseptoriproteimin tai komplementtireseptorin kaltaisen proteiinin puhdistamiseksi sitä sisältävästä seoksesta, tunnettu siitä, että se käsittää: 5 (a) saatetaan seos kosketuksiin kationisen kromatografisen kantajan kanssa ja eluoidaan selektiivisesti proteiini, (b) saatetaan eluaatti kohdasta (a) kosketuksiin hydrofobisen vuorovaikutus-kromatografiakantajan kanssa ja eluoidaan selektiivisesti proteiini, (c) saatetaan eluaatti kohdasta (b) kosketuksiin kokoekskluusiokromatografia-10 kantajan kanssa ja eluoidaan selektiivisesti proteiini.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini on CR1 ja/tai sen fragmentti.

3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att receptom är ett lösligt fragment av CR1.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reseptori on CRl:n liukoinen fragmentti.

4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att receptom är TP10HD.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reseptori on TP10HD. 20

5. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att 5 (a) den katjoniska kromatografiska bäraren väljs ur en grapp som bestär av kar- boximetylsubstituerad cellulosa, karboximetylsubstituerade och sulfopropylsubsti-tuerade tvärbundna dextraner, karboximetylsubstituerade och sulfonatsubstituerade agarosgranuler, karboximetylsubstituerade etylenglykol-metakrylatkopolymerer, och elueringen sker genom tillsats av buffrad saltlösning; 10 (b) den hydrofoba interaktionskromatografiska bäraren väljs ur en grupp som bestär av alkylC2-C8-agaros, arylagaros, alkylsilika, ett alkyl/organisk polymer-harts; och (c) den storleksexklusionskromatografiska bäraren väljs bland tvärbundna poly-akrylamider och etylenglykol-metakrylatkopolymerer. 15 6. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat av att (a) den katjoniska bäraren utgörs av sulfonatsubstituerade agarosgranuler och den buffrade saltlösningen är 20 mM natriumfosfat, 500 ml NaCl, pH 7,0; (b) den hydrofoba interaktionskromatografiska bäraren är en butyletylenglykol- 1 metakrylatkopolymer och proteinet elueras selektivt med 100 mM natriumfosfat- 20 buffert, pH 7,0 som innehäller 0,09 M ammoniumsulfat; och (c) den storleksexklusionskromatografiska bäraren är en etylenglykol-metakry-latkopolymer och elueringen sker med 10 mM natriumfosfat, 0,9 % v/vol NaCl, pH 7. ···; 7. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat av att det dessutom omfattar ··..·* 25 ett steg i vilket de uppsamlade TPlOHD-innehällande fraktionema sammansläs. • * · . : ·. 8. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att nämnda komplementre- ceptorprotein är ett komplementreceptorprotein av typ 1 eller ett fragment därav, . och nämnda blandning är ett detta innehällande konditionerat cellodlingsunderlag, och förfarandet omfattar följande steg i vilka: ;·’ 30 (a) odlingsunderlaget utsätts för en första katjonbytarkromatografi, :": (b) odlingsunderlaget frän steg (a) utsätts för fallning med ammoniumsulfat, (c) odlingsunderlaget frän steg (b) utsätts för hydrofob interaktionskromatogra- (d) odlingsunderlaget frän steg (c) utsätts för anjonbytarkromatografi, 109202 (e) odlingsunderlaget frän steg (d) utsätts för en andra katjonbytarkromatografi, och (f) odlingsunderlaget frän steg (e) utsätts för storleksexklusionskromatografi.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (a) kationinen kromatografinen kantaja valitaan ryhmästä, joka koostuu karbok- •. : simetyylisubstituoidusta selluloosasta, karboksimetyylisubstituoiduista ja sulfopro- ♦ * · · pyylisubstituoiduista ristisidotuista dekstraaneista, karboksimetyylisubstituoiduista * · . 25 ja sulfonaattisubstituoiduista agaroosihelmistä, karboksimetyylisubstituoiduista ety- • · ’; leeniglykoli-metakrylaattikopolymeereistä, ja eluutio tapahtuu lisäämällä puskuroi- « t · • · ·: tua suolaliuosta; (b) hydrofobinen vuorovaikutuskromatografiakantaja valitaan ryhmästä, joka v : koostuu alkyyliC2-c8-agaroosista, aryyliagaroosista, alkyylisilikasta, alkyyli/orgaani- 3. nen polymeeri -hartsista; ja : · ·: (c) kokoekskluusiokromatografiakantaja valitaan ristisidotuista polyakryyliami- • ‘ ‘ ; deista ja etyleeniglykoli-metakrylaattikopolymeereistä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ‘ 35 (a) kationinen kantaja on sulfonaattisubstituoituja agaroosihelmiä ja puskuroitu j ’: suolaliuos on 20 mM natriumfosfaattia, 500 ml NaCl, pH 7,0; 23 109202 (b) hydrofobinen vuorovaikutuskromatografiakantaja on butyylietyleeniglykoli-metakrylaattikopolymeeri ja proteiini eluoidaan selektiivisesti 100 mM:lla natrium-fosfaattipuskuria, pH 7,0 sisältäen 0,09 M ammoniumsulfaattia; ja (c) kokoekskluusiokromatografiakantaja on etyleeniglykoli-metakrylaattikopo-5 lymeeri ja eluutio suoritetaan 10 mM:lla natriumfosfaattia, 0,9 % p/til. NaCl, pH 7.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen TP lOHD ita sisältävien, kerättyjen fraktioiden yhdistämiseksi.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu komplementtireseptoriproteiini on komplementtireseptori tyyppi 1 -proteiini tai sen fragmentti ja mainittu seos on konditioitu, sitä sisältävä soluviljelyalusta, ja menetelmä käsittää vaiheet: (a) altistetaan viljelyalusta ensimmäiselle kationinvaihtokromatografialle, 15 (b) altistetaan viljelyalusta vaiheesta (a) ammoniumsulfaattisaostukselle, (c) altistetaan viljelyalusta vaiheesta (b) hydrofobiselle vuorovaikutuskromato-grafialle, (d) altistetaan viljelyalusta vaiheesta (c) anioninvaihtokromatografialle, ,! *. I (e) altistetaan viljelyalusta vaiheesta (d) toiselle kationinvaihtokromatografialle, 20 ja .:. (f) altistetaan viljelyalusta vaiheesta (e) kokoekskluusiokromatografialle. " ” 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ;;; (a) ensimmäinen kationinen kromatografia käyttää kannattajaa, joka valitaan ' · ’ ' 25 ryhmästä, joka koostuu karboksimetyylisubstituoidusta selluloosasta, karboksime- tyylisubstituoiduista ja sulfopropyylisubstituoiduista ristisidotuista dekstraaneista, karboksimetyylisubstituoiduista ja sulfonaattisubstituoiduista agaroosihelmistä, ' karboksimetyylisubstituoiduista etyleeniglykoli-metakrylaattikopolymeereistä, ja :v, eluutio tapahtuu lisäämällä puskuroitua suolaliuosta; .! 30 (b) ammoniumsulfaattia on läsnä 1,2 M pitoisuutena; : ’ (c) hydrofobinen vuorovaikutuskromatografian kantaja valitaan ryhmästä, joka koostuu alkyyliC2-c8-agaroosista, aryyliagaroosista, alkyylisilikasta, alkyyli/orgaa-':": ninen polymeeri -hartsista; (d) anioninvaihtokromatografia käyttää kantajaa, joka valitaan ryhmästä, joka 35 koostuu dietyyliaminoetyyli-selluloosasta, dietyyliaminoetyyli- ja kvatemäärisestä aminoetyyli-ristisidotuista dekstraaneista, dietyyliaminoetyyli-, kvatemäärisistä amiiniagaroosihelmistä ja dietyyliaminoetyylietyleeniglykoli-metakrylaattikopoly-meereistä; 109202 (e) toinen kationinvaihtokromatografia käyttää kantajana karboksimetyyliety-leeniglykoli-metakrylaattikopolymeerejä; ja (f) kokoekskluusiokromatografia käyttää kantajaa, joka on valittu ristisidotuista polyakryyliamideista ja etyleeniglykoli-metakrylaattikopolymeereistä. 5

9. Förfarande enligt patentkrav 8, kännetecknat av att 5 (a) man vid den första katjoniska kromatografm använder en bärare som väljs ur en grupp som bestär av karboximetylsubstituerad cellulosa, karboximetylsubstitue-rade och sulfopropylsubstituerade tvärbundna dextraner, karboximetylsubstituerade och sulfonatsubstituerade agarosgranuler, karboximetylsubstituerade etylenglykol-metakrylatkopolymerer, och elueringen sker genom tillsats av en buffrad saltlös-10 ning; (b) ammoniumsulfat är närvarande i en koncentration av 1,2 M; (c) den hydrofoba interaktionskromatografiska bäraren väljs ur en grupp som bestär av alkylC2-Cg-agaros, arylagaros, alkylsilika, ett alkyl/organisk polymer-harts; och 15 (d) man vid den anjonbytar kromatografm använder en bärare som väljs ur en grupp som bestär av dietylaminoetylcellulosa, dietylaminoetyl- och kvatemära aminoetyl-tvärbundna dextraner, dietylaminoetyl-, kvatemära aminagarosgranuler och dietylaminoetyletylenglykol-metakrylatkopolymerer; (e) man vid den andra katj onbytarkromatografin använder karboximetyletylen-20 glykol-metakrylatkopolymerer som bärare; och (f) man vid storleksexklusionskromatografin använder en bärare som väljs bland tvärbundna polyakrylamider och etylenglykol-metakrylatkopolymerer. ' · ·: 10. Förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat av att ‘:(a) den första katjoniska bäraren är sulfonatagarosgranuler och saltlösningen är ,.; J' 25 natriumfosfat, 500 ml NaCl, pH 7,0; ;:· (b) den hydrofoba interaktionskromatografiska bäraren är butyletylenglykol- ··· metakrylatkopolymer och proteinet elueras selektivt med 100 mM natriumfosfat, ; *: ·. pH 7,0, som innehäller 0,09 mM ammoniumsulfat; och (c) anjonbytarbäraren är en dietylaminoetyl-etylenglykol-metakrylatkopolymer; . 30 och (d) storleksexklusionskromatografiska bäraren är en etylenglykol-metakrylat-kopolymer.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (a) ensimmäinen katuminen kantaja on sulfonaattiagaroosihelmiä ja suolaliuos on natriumfosfaatti, 500 ml NaCl, pH 7,0; (b) hydrofobinen vuorovaikutuskromatografiakantaja on butyylietyleeniglykoli-10 metakrylaattikopolymeeri ja proteiini eluoidaan selektiivisesti 100 mM:lla natrium- fosfaattia, pH 7,0 sisältäen 0,09 mM ammoniumsulfaattia; ja (c) anioninvaihtokantaja on dietyyliaminoetyyli-etyleeniglykoli-metakrylaatti-kopolymeeri; ja (d) kokoekskluusiokromatografiakantaja on etyleeniglykoli-metakrylaattikopo-15 lymeeri.

11. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att komplementreceptor-proteinet är ett komplementreceptorprotein eller ett komplementreceptorprotein-v ; 35 liknande protein och den iakttagna blandningen är ett konditionerat cellodlings- : ‘' ·’ underlag, och förfarandet innefattar att: 109202 (a) det konditionerade cellodlingsunderlaget koncentreras; (b) komplementreceptorproteinet adsorberas pä en katjonisk kromatografisk bä-rare; (c) det adsorberade proteinet tvättas med ätminstone en buffert; 5 (d) det tvättade proteinet elueras; (e) proteinet falls ut med ammoniumsulfat; (f) det utfallda proteinet loses upp pä nytt; (g) det lösta proteinet frän steg (f) adsorberas pä en hydrofob interaktionskroma-tografisk bärare; 10 (h) proteinet elueras selektivt; (i) eluatet frän steg (h) adsorberas pä anjonbytarbäraren; (j) det adsorberade proteinet elueras; (k) eluatet frän steg (j) adsorberas pä katjonbytarbäraren; (l) det adsorberade proteinet elueras; 15 (m) eluatet frän steg (1) utsätts för storleksexklusionskromatografi; (n) proteinet uppsamlas.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että komple-menttireseptoriproteiini on komplementtireseptoriproteiini tai komplementtiresep-torin kaltainen proteiini ja havaittu seos on konditioitu soluviljelyalusta, ja mene- 20 telmä käsittää: (a) väkevöidään konditioitu soluviljelyalusta; (b) adsorboidaan komplementtireseptoriproteiini kationiseen kromatografiseen kantajaan; (c) pestään adsorboitu proteiini ainakin yhdellä puskurilla; ·:··· 25 (d) eluoidaan pesty proteiini; ·:. (e) saostetaanproteiini ammoniumsulfaatilla; | (f) liuotetaan uudestaan saostunut proteiini; *”j. (g) adsorboidaan huotettu proteiini vaiheesta (f) hydrofobiseen vuorovaikutus- kromatografiakantajaan; ’ 30 (h) eluoidaan proteiini selektiivisesti; (i) adsorboidaan eluaatti vaiheesta (h) anioninvaihtokantajaan; ’ : (j) eluoidaan adsorboitu proteiini; ... ·' (k) adsorboidaan eluaatti vaiheesta (j) kationinvaihtokantajaan; ... ·: (1) eluoidaan adsorboitu proteiini; 35 (m) altistetaan eluaatti vaiheesta (1) kokoekskluusiokromatografialle ja • (n) kerätään proteiini siitä. » t 109202

12. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-11, kännetecknat av att det om-fattar efter den hydrofoba interaktionskromatografin ett eventuellt steg däri virusen inaktiveras. 20 13. Förfarande enligt patentkrav 11, kännetecknat av att katjonbytarbäraren i steget (b) är sulfonatsubstituerad agaros; eluaten i steget (d) justeras till 1,2 M med ammoniumsulfat; •: : katjonbytarbäraren i steget (k) är karboximetyl-etylenglykol-metakrylatkopolymer; ’: ‘· anjonbytarbäraren är dietylaminoetyl-etylenglykol-metakrylatkopolymer; 25 den hydrofoba interaktionskromatografiska bäraren är butyletylenglykol-metakiy- • * · latkopolymer; och • j. storleksexkhisionskromatografin använder etylenglykol-metakrylatkopolymer. • t«· « »* • · ·

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siihen sisältyy hydrofobisen vuorovaikutuskromatografian jälkeen mahdollinen vaihe, jossa inaktivoidaan virukset.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen (b) kationinvaihtokantaja on sulfonaattisubstituoitu agaroosi; vaiheen (d) eluaatti säädetään 1,2 Miksi ammoniumsulfaatilla; vaiheen (k) kationinvaihtokantaja on karboksimetyyli-etyleeniglykoli-metakrylaat-tikopolymeeri; 10 anioninvaihtokantaja on dietyyliaminoetyyli-etyleeniglykoli-metakrylaattikopoly-meeri; hydrofobisen vuorovaikutuskromatografian kantaja on butyylietyleeniglykoli-me-takrylaattikopolymeeri; ja kokoekskluusiokromatografia käyttää etyleeniglykoli-metakrylaattikopolymeeeriä. 15

14. Förfarande enligt patentkrav 11, kännetecknat av att uppsamlingssteget (n) . 30 utförs genom att kombinera och koncentrera de protein innehällande fraktionema ... ’ frän det sista kromatografisteget (m) med ultrafiltrering.

14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että talteenot-tovaihe (n) suoritetaan yhdistämällä ja konsentroimalla proteiinia sisältävät fraktiot viimeisestä kromatografiavaiheesta (m) ultrasuodatuksella.

15. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se sisältää hydrofobisen vuorovaikutuskromatografian jälkeen vaiheen (h), jossa inaktivoidaan virukset, mikäli niitä on läsnä, käsittelemällä hydrofobisen vuorovaikutuskromatografian eluaatti emäksellä ja guanidiinihydrokloridilla. ·;··· Patentkrav » · · · 25 1. Förfarande för rening av ett komplementreceptorprotein eller ett komple- ’ i. mentreceptorlikt protein ur en blandning som innehäller dessa, kännetecknat av att '! det innefattar att man: (a) bringar blandningen i kontakt med en katjonisk kromatografisk bärare och selektivt eluerar proteinet, 1 ' 30 (b) bringar eluatet frän punkt (a) i kontakt med en hydrofob interaktionskroma- ...: tografisk bärare och eluerar proteinet selektivt, ...: (c) bringar eluatet frän punkt (b) i kontakt med en storleksexklusionskromato- ....: grafisk bärare och eluerar proteinet selektivt. *’ 2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att proteinet är CR1 “: 35 och/eller fragment därav. 109202

15. Förfarande enligt patentkrav 11, kännetecknat av att det innehäller efter :··: den hydrofoba interaktionskromatografin ett steg (h), däri virusen inaktiveras, om I. 35 de är närvarande genom att behandla eluaten frän den hydrofoba interaktions- ’ kromatografin med alkali och guanidinhydroklorid. » ·