JPS5944399A - 新規ｄｎａ - Google Patents
新規ｄｎａInfo
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- JPS5944399A JPS5944399A JP57156285A JP15628582A JPS5944399A JP S5944399 A JPS5944399 A JP S5944399A JP 57156285 A JP57156285 A JP 57156285A JP 15628582 A JP15628582 A JP 15628582A JP S5944399 A JPS5944399 A JP S5944399A
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- JP
- Japan
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- dna
- polypeptide
- nucleotide sequence
- ige
- human
- Prior art date
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- Granted
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
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- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規なＤＮＡに関する。さらに詳しくは、本
発明は、ヒト免疫グロブリンＥ−Ｈ鎖のポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ、当該Ｄ
ＮＡを含有する組み換え体、ならびに当該組み換え体の
培養によるヒト免疫グロブリンＥ−Ｒ鎖のポリペプチド
の製造法を提供するものである。
発明は、ヒト免疫グロブリンＥ−Ｈ鎖のポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ、当該Ｄ
ＮＡを含有する組み換え体、ならびに当該組み換え体の
培養によるヒト免疫グロブリンＥ−Ｒ鎖のポリペプチド
の製造法を提供するものである。
動物体液中に存在し、抗体と密接な関係をもつ免疫グロ
ブリンは、Ｈ（ｈｅａｂｙ）鎖およびＬ（ｌｉｇｔ）鎖
から成り、各々が抗原との結合特異性を規定するＶ領域
とイフェクターー（ｅｆｆｅｃｔｅｒ）機能を規定する
Ｃ領域を有し、Ｈ鎖の構成成分により、免疫グロブリン
（Ｉｇ）Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｍ、Ｅの５種類に分類される。
ブリンは、Ｈ（ｈｅａｂｙ）鎖およびＬ（ｌｉｇｔ）鎖
から成り、各々が抗原との結合特異性を規定するＶ領域
とイフェクターー（ｅｆｆｅｃｔｅｒ）機能を規定する
Ｃ領域を有し、Ｈ鎖の構成成分により、免疫グロブリン
（Ｉｇ）Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｍ、Ｅの５種類に分類される。
このうち、レアギンを構成する免疫グロブリンＥ（以下
ＩｇＥ）は、ヒトでは、その分子量が１９６．０００ダ
ルトンであり、７５，５００ダルトンのＨ鎖と２２，５
００ダルトンのＬ鎖がそれぞれ２本ずつジスルフィド結
合によって結ばれた分子である。ＩｇＥのＨ鎖のＣ領域
はＣＨ１〜ＣＨ４の４部位より成り、ＣＨ２において２
本のＨ鎖がジスルフィド結合によって結ばれる。そして
、アレルギー反応などの重要な生態反応を知っている。
ＩｇＥ）は、ヒトでは、その分子量が１９６．０００ダ
ルトンであり、７５，５００ダルトンのＨ鎖と２２，５
００ダルトンのＬ鎖がそれぞれ２本ずつジスルフィド結
合によって結ばれた分子である。ＩｇＥのＨ鎖のＣ領域
はＣＨ１〜ＣＨ４の４部位より成り、ＣＨ２において２
本のＨ鎖がジスルフィド結合によって結ばれる。そして
、アレルギー反応などの重要な生態反応を知っている。
すなわち、アレルギー反応は特異抗原と結合したＩｇＥ
の感作された肥満細胞や好塩基球への結合によって誘起
されることが知られている（Ｋ．Ｉｓｈｉｚａｋａ ａ
ｎｄ Ｔ．ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｄ
ａｌＲＥｖ．４１，１０９ １９７８）。従って、アレ
ルギー反応をおさえるために抗原結合部位を除いたＩｇ
Ｅ分子を用いることも考えられている。しかし生体内で
のＩｇＥに起因する種々の反応については、また未解決
な点が多い。十分な量のヒトＩｇＥ供給できなりことが
、この理由の一つとなっている。
の感作された肥満細胞や好塩基球への結合によって誘起
されることが知られている（Ｋ．Ｉｓｈｉｚａｋａ ａ
ｎｄ Ｔ．ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｄ
ａｌＲＥｖ．４１，１０９ １９７８）。従って、アレ
ルギー反応をおさえるために抗原結合部位を除いたＩｇ
Ｅ分子を用いることも考えられている。しかし生体内で
のＩｇＥに起因する種々の反応については、また未解決
な点が多い。十分な量のヒトＩｇＥ供給できなりことが
、この理由の一つとなっている。
まだ一方、坑ＩｇＥ抗体はアレルギー族量の診断に必要
欠くべからざる物質であり、需要も非常に多いが、その
生産には大量の純化人ＩＧＥを安価に大量生産できる技
術の間が待たされていた。
欠くべからざる物質であり、需要も非常に多いが、その
生産には大量の純化人ＩＧＥを安価に大量生産できる技
術の間が待たされていた。
必要とする。これらの理由のため、ヒトＩｇＥを安価に
大量生産できる技術の開発が待たれたいた。
大量生産できる技術の開発が待たれたいた。
ＩｇＥの生産方法としては、ヒトＩｇＥ産生性を有する
株化ヒト骨髄細胞の培養上漬より分取精製する方法が提
唱されているが、細胞培養であること、細胞の増殖能が
低いことなどから、安価に大量のＩｇＥを得るのは難し
い。
株化ヒト骨髄細胞の培養上漬より分取精製する方法が提
唱されているが、細胞培養であること、細胞の増殖能が
低いことなどから、安価に大量のＩｇＥを得るのは難し
い。
本発明者らはすでに、ヒトＩｇＥをコードするｍＲＮＡ
を細胞から分離することに成功している（昭和５６年特
許出願第５６−１２０５５５号、昭和５６年７月３０日
付出願）。
を細胞から分離することに成功している（昭和５６年特
許出願第５６−１２０５５５号、昭和５６年７月３０日
付出願）。
本発明者らはさらに、このｍＲＮＡをもとに研究を進め
、遺伝子操作技術を利用してヒトＩｇＥＨ鎖のポリペプ
チドをコードする遺伝子をクローニングし、得られた組
み替えＤＮＡ分子を宿主に導入して、ヒトＩｇＥ−Ｈ鎖
のポリペプチドを得ることのできる技術の開発研究を行
った結果、本発明を完成するにいたった。
、遺伝子操作技術を利用してヒトＩｇＥＨ鎖のポリペプ
チドをコードする遺伝子をクローニングし、得られた組
み替えＤＮＡ分子を宿主に導入して、ヒトＩｇＥ−Ｈ鎖
のポリペプチドを得ることのできる技術の開発研究を行
った結果、本発明を完成するにいたった。
すなわち、本発明はヒトＩｇＥ−Ｈ鎖のポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを含有する組み換え体、ならびに該ＤＮＡを含有する
組み換え体を培養することによるヒトＩｇＥ−Ｈ鎖のポ
リペプチドまたはこれと同様の免疫学的もしくは生物学
的活性を有するポリペプチドの製造法を提供するもので
ある。
コードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを含有する組み換え体、ならびに該ＤＮＡを含有する
組み換え体を培養することによるヒトＩｇＥ−Ｈ鎖のポ
リペプチドまたはこれと同様の免疫学的もしくは生物学
的活性を有するポリペプチドの製造法を提供するもので
ある。
本発明で得られるＤＮＡは、第１図に示されるヌクレオ
チド配列のポリヌクレオチドを含有するＤＮＡである。
チド配列のポリヌクレオチドを含有するＤＮＡである。
このうち、第１図においてヌクレオチド配列８３１−１
４８５として示されるポリヌクレオチドは、第２図にお
いてアミノ酸配列２７８−４９４で表わされるポリペプ
チド、つまりヒトＩｇＥＲ鎖のＣＨ３〜ＣＨ４をドース
する。
４８５として示されるポリヌクレオチドは、第２図にお
いてアミノ酸配列２７８−４９４で表わされるポリペプ
チド、つまりヒトＩｇＥＲ鎖のＣＨ３〜ＣＨ４をドース
する。
次に、第１図においてヌクレオチド配列４９０−１４８
５として示されるポリヌクレオチドは、第２図において
アミノ酸配列１０４−４９４として表わされるポリペプ
チド、つまりヒトＩＥＴ Ｈ鎮のＣＨ２〜ＣＨ４をコー
ドする。、 また、第１においてヌクレオチド配列８８−１４８５と
してで示されるポリヌクレオチドは、第２図においてア
ミノ酸配列１−４９４として表わされるポリペプチドを
コードする。このポリペプチドはヒト１ｇＥＨ鎖のＣＨ
１〜ＣＨ４のポリペプチドを含有する。
５として示されるポリヌクレオチドは、第２図において
アミノ酸配列１０４−４９４として表わされるポリペプ
チド、つまりヒトＩＥＴ Ｈ鎮のＣＨ２〜ＣＨ４をコー
ドする。、 また、第１においてヌクレオチド配列８８−１４８５と
してで示されるポリヌクレオチドは、第２図においてア
ミノ酸配列１−４９４として表わされるポリペプチドを
コードする。このポリペプチドはヒト１ｇＥＨ鎖のＣＨ
１〜ＣＨ４のポリペプチドを含有する。
同様に、第１図においてヌクレオチド配列１−１４８５
として示されるポリヌクレオチドは、第２図においてア
ミノ酸配列１−４９４として表わされるポリペプチドを
コードする、このポリペプチドはヒトＩｇＥ Ｈ鎖のＣ
Ｈ１〜ＣＨ４のポリペプチドを含有する。
として示されるポリヌクレオチドは、第２図においてア
ミノ酸配列１−４９４として表わされるポリペプチドを
コードする、このポリペプチドはヒトＩｇＥ Ｈ鎖のＣ
Ｈ１〜ＣＨ４のポリペプチドを含有する。
これらのポリヌクレオチドは、直接発現のために、５′
末端に読み取り枠を一致させるように、ＡＴＧを有して
いてもよい。この場合には、Ｎ末端にＭｅｔを有するポ
リペプチドをコードする。
末端に読み取り枠を一致させるように、ＡＴＧを有して
いてもよい。この場合には、Ｎ末端にＭｅｔを有するポ
リペプチドをコードする。
これらのポリヌクレオチドまたは読み取り枠を一致させ
るように５′末端にＡＴＧを有する当該ポリヌクレオチ
ドにプロモーターの下流に連結されていることが好まし
く、プロモーターとしてはトリプトファン合成（ｔｒｐ
）プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ラクトースプ
ロモーター等があげられ、とりわけｔｒｐプロモーター
ズが好適である。
るように５′末端にＡＴＧを有する当該ポリヌクレオチ
ドにプロモーターの下流に連結されていることが好まし
く、プロモーターとしてはトリプトファン合成（ｔｒｐ
）プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ラクトースプ
ロモーター等があげられ、とりわけｔｒｐプロモーター
ズが好適である。
本願明細書、図面および特許請求の範囲で用いる記号
の意義は第１表に示すとおりである。
の意義は第１表に示すとおりである。
第１表
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ 相補的デオキシリボ核酸
ＲＮＡ リボ核酸
ｍＲＩＡ 伝令リボ核酸
Ａ デオキシアデニル酸
Ｔ チミジル酸
Ｇ デオキシグアニル酸
Ｃ デオキシシチジル酸
Ｕ ウリジル酸
ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ チミ
ジン三リン酸 ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ チオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ドデシル硫黄ナトリウム Ｇｌｙ グリシン Ａｌａ アラニン Ｖａｌ パリン Ｌｅｕ ロイシン Ｉｌｅ イソロイシン Ｓｅｒ セリン Ｔｈｒ スレオニン Ｃｙｓ システイン Ｍｅｔ メチオニン Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｌｙｓ アスパラギン酸 Ａｒｇ アルギニン Ｈｉｓ ヒスチジン Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｔｒｙ チロシン Ｔｒｐ トリプトファン Ｐｒｏ プロリン Ａｓｎ アスパラギン Ｇｌｎ グルタミン ｂｐ 塩基対 本発明においては、昭和５６年特許願第５６−１２０５
５５号に記載されている方法もしくはこれに準ずる方法
によって製造されたヒトＩｇＥＨ鎖ポリペプチドをコー
ドするｍＲＮＡを用い、これを鋳型として、たとえば運
転写酸素を用いて、単語のｃＤＮＡを合成し、二本各Ｄ
ＮＡに導き、酵素（エクソヌクレアーゼ、エンドスクレ
アーゼ）を用いて消化し、アダプターを付加してプラス
ミドに導入したのち、たとえば大腸菌などに組み込み、
得られる組み換え体を培養してｃＤＮＡ含有プラスミド
を単離することにより、ヒトＩｇＥ Ｈ鎖のポリペプチ
ドをコードする二本鎖ＤＮＡを製造することができる。
ジン三リン酸 ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ チオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ドデシル硫黄ナトリウム Ｇｌｙ グリシン Ａｌａ アラニン Ｖａｌ パリン Ｌｅｕ ロイシン Ｉｌｅ イソロイシン Ｓｅｒ セリン Ｔｈｒ スレオニン Ｃｙｓ システイン Ｍｅｔ メチオニン Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｌｙｓ アスパラギン酸 Ａｒｇ アルギニン Ｈｉｓ ヒスチジン Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｔｒｙ チロシン Ｔｒｐ トリプトファン Ｐｒｏ プロリン Ａｓｎ アスパラギン Ｇｌｎ グルタミン ｂｐ 塩基対 本発明においては、昭和５６年特許願第５６−１２０５
５５号に記載されている方法もしくはこれに準ずる方法
によって製造されたヒトＩｇＥＨ鎖ポリペプチドをコー
ドするｍＲＮＡを用い、これを鋳型として、たとえば運
転写酸素を用いて、単語のｃＤＮＡを合成し、二本各Ｄ
ＮＡに導き、酵素（エクソヌクレアーゼ、エンドスクレ
アーゼ）を用いて消化し、アダプターを付加してプラス
ミドに導入したのち、たとえば大腸菌などに組み込み、
得られる組み換え体を培養してｃＤＮＡ含有プラスミド
を単離することにより、ヒトＩｇＥ Ｈ鎖のポリペプチ
ドをコードする二本鎖ＤＮＡを製造することができる。
ここで用いるｍＲＮＡは、たとえば下記の方法により製
造することかできる。
造することかできる。
ヒトＩｇＥ産生能を有する株化ヒト骨髄細胞Ｕ２６６を
培養増殖し、得られた細胞を遠心分離によって進め、た
とえば生理食塩水で洗ったのち、ＲＮａｓｅ阻害剤とし
て、たとえばヘパリン ジェチルピロカーボネイトなど
を加えた変性剤液中、たとえばＮ−ラウリルザルコシン
酸溶液中で細胞を溶解させて、それ自体公知の方法、た
とえば、５．７Ｍ ＣｓＣｌ溶液上に重層して遠心分離
、フェノールによる抽出によってＲＮＡを抽出する。つ
いでオリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セフアロー
スなどを用いて、ポリアデニル酸を含むＲＮＡを集め、
さらにショ糖密度勾配遠心処理で分画してｍＲＮＡを得
る。
培養増殖し、得られた細胞を遠心分離によって進め、た
とえば生理食塩水で洗ったのち、ＲＮａｓｅ阻害剤とし
て、たとえばヘパリン ジェチルピロカーボネイトなど
を加えた変性剤液中、たとえばＮ−ラウリルザルコシン
酸溶液中で細胞を溶解させて、それ自体公知の方法、た
とえば、５．７Ｍ ＣｓＣｌ溶液上に重層して遠心分離
、フェノールによる抽出によってＲＮＡを抽出する。つ
いでオリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セフアロー
スなどを用いて、ポリアデニル酸を含むＲＮＡを集め、
さらにショ糖密度勾配遠心処理で分画してｍＲＮＡを得
る。
こうして得られたｍＲＮＡを鋳型として、たとえば、逆
転写酵素を用いてそれ自体公知の方法で単鎖ｃＤＮＡを
合成し、さらにこのｃＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換を
行う（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、Ｃｅｌｌ、８，１６
３（１９７６）〕。
転写酵素を用いてそれ自体公知の方法で単鎖ｃＤＮＡを
合成し、さらにこのｃＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換を
行う（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、Ｃｅｌｌ、８，１６
３（１９７６）〕。
このＤＮＡをたとえばｄＧ−ｄＣあるいはｄＡ−ｄＴホ
モポリマー結合法〔Ｎｅｌｓｏｎ、Ｔ、Ｓ、Ｍｅｔｈｏ
ｄａｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８、４１（１
９７９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ）で、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩあるいはＳｐ
ｈＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位に組み込ませる。
モポリマー結合法〔Ｎｅｌｓｏｎ、Ｔ、Ｓ、Ｍｅｔｈｏ
ｄａｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８、４１（１
９７９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ）で、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩあるいはＳｐ
ｈＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位に組み込ませる。
これをたとえば大腸菌Ｘ１７７６下部に導入して形質転
換さえ、テトラシクリン耐性あるいはアンピシリン耐性
により組み換え体を選ぶことができる。
換さえ、テトラシクリン耐性あるいはアンピシリン耐性
により組み換え体を選ぶことができる。
ヒトＩｇＥＨ鎖の構造遺伝子断片はすでにクローニング
されており（Ｎｉｓｈｉｎｄａら，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ
，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９．３８３３ １９８２
）、そのごく一部の塩基配列も解析されている。この遺
伝子断片（大阪大学、医学部、木庶佑教授より入手）を
たとえばニックトランスレーション法（Ｒｉｇｂｙ；Ｐ
．Ｗ．Ｊら、Ｊ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＬ，１１３．２３７（
１９７７））により３２ｐでラベルし、あるいはヒトＴ
ｇＥ Ｈ鎖ポリペプチドのアミノ酸配列に対応すると考
えられるヌクレオチド配列をもったオリゴヌクレオチド
を化学合成したのち、これを３２ｐでラベルしでプロー
ブとなしたとえばそれ自体公知のコロニーハイブリダイ
ゼーション法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ．ａｎｄＨｏｇ
ｎｅｓｓ、Ｄ．Ｓ、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ、Ａｃｎｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ７２．３９６１（１９７５）〕によって、
すでに得たテトラサイクリン耐性あついはアンピシリン
耐性のトランスホーマントの中から求めるクローンを二
次スクリーニングする。このコロニーハイブリングイゼ
ーションによって陽性を示したクローンのヌクレオチド
配列を、たとえばＭａｘｅｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（Ｍａ
ｘａｍ、Ａ．Ｍ．＆Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ｗ．ＰＲｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ＵＳＡ、７４、５６０（１９
７７）〕あるいがファージＭ１３をジデオキシヌクレオ
チド合成鎖停止の方法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ら，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｅｓ ＲＥｓ、９．３０９（１９
８１）の方法によって決定し、ヒトＩｇＥ Ｈ鎖ポリペ
プチドをコードする遺伝子の存在を確認する。次に、得
られたクローンからヒトＩｐＥ Ｈ鎖ポリペプチドをコ
ードする遺伝子の全部あるいは一部をきり出し、適当な
プロモーター、ＳＤ（シャイン アンド ダルガーノ）
配列、翻訳な宿主に導入することもできる。また、プラ
スミドに組み込まれた適当な構造遺伝子、たとえば、β
−ラクタマーゼ遺伝子あるいはアンスラニレートシセタ
ーゼ遺伝子などの途中に組み込むことにより、これらの
構造遺伝子産物の一部あるいは全部と連結したキメラポ
リペプチドとして発現させることもできる。
されており（Ｎｉｓｈｉｎｄａら，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ
，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９．３８３３ １９８２
）、そのごく一部の塩基配列も解析されている。この遺
伝子断片（大阪大学、医学部、木庶佑教授より入手）を
たとえばニックトランスレーション法（Ｒｉｇｂｙ；Ｐ
．Ｗ．Ｊら、Ｊ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＬ，１１３．２３７（
１９７７））により３２ｐでラベルし、あるいはヒトＴ
ｇＥ Ｈ鎖ポリペプチドのアミノ酸配列に対応すると考
えられるヌクレオチド配列をもったオリゴヌクレオチド
を化学合成したのち、これを３２ｐでラベルしでプロー
ブとなしたとえばそれ自体公知のコロニーハイブリダイ
ゼーション法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ．ａｎｄＨｏｇ
ｎｅｓｓ、Ｄ．Ｓ、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ、Ａｃｎｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ７２．３９６１（１９７５）〕によって、
すでに得たテトラサイクリン耐性あついはアンピシリン
耐性のトランスホーマントの中から求めるクローンを二
次スクリーニングする。このコロニーハイブリングイゼ
ーションによって陽性を示したクローンのヌクレオチド
配列を、たとえばＭａｘｅｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（Ｍａ
ｘａｍ、Ａ．Ｍ．＆Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ｗ．ＰＲｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ＵＳＡ、７４、５６０（１９
７７）〕あるいがファージＭ１３をジデオキシヌクレオ
チド合成鎖停止の方法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ら，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｅｓ ＲＥｓ、９．３０９（１９
８１）の方法によって決定し、ヒトＩｇＥ Ｈ鎖ポリペ
プチドをコードする遺伝子の存在を確認する。次に、得
られたクローンからヒトＩｐＥ Ｈ鎖ポリペプチドをコ
ードする遺伝子の全部あるいは一部をきり出し、適当な
プロモーター、ＳＤ（シャイン アンド ダルガーノ）
配列、翻訳な宿主に導入することもできる。また、プラ
スミドに組み込まれた適当な構造遺伝子、たとえば、β
−ラクタマーゼ遺伝子あるいはアンスラニレートシセタ
ーゼ遺伝子などの途中に組み込むことにより、これらの
構造遺伝子産物の一部あるいは全部と連結したキメラポ
リペプチドとして発現させることもできる。
プロモーターとして、前記のプロモーターが挙げられ、
宿主としては、大腸菌や枯草菌細菌などが挙げられるが
、大腸菌（２９４、Ｗ３１１０など）、とりわけ２９４
が好ましい。
宿主としては、大腸菌や枯草菌細菌などが挙げられるが
、大腸菌（２９４、Ｗ３１１０など）、とりわけ２９４
が好ましい。
なお、２９４は公知の菌〔Ｂａｃｋｍａｎ．Ｋ．らＰｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７３、４
１７４（１９７６〕で財団法人［発酵研究所（ＩＮｓｔ
ｉｔｕｔｅ ＦｏｒＴｉｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、０ｓａ
ｋａ）にＩＦＯ−１４１７１として寄託もされている。
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７３、４
１７４（１９７６〕で財団法人［発酵研究所（ＩＮｓｔ
ｉｔｕｔｅ ＦｏｒＴｉｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、０ｓａ
ｋａ）にＩＦＯ−１４１７１として寄託もされている。
本発明のＤＮＡによる宿主の形質転換は、例えば公知の
方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｍ．ら、Ｐｒａｃ、Ｎａｔｌ．
Ａｃａ、ｄ。
方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｍ．ら、Ｐｒａｃ、Ｎａｔｌ．
Ａｃａ、ｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６９，２１１０（１９７２）〕により
行う、このようにして得られた組み換え耐をそれ自体公
知の培地で培養する。
行う、このようにして得られた組み換え耐をそれ自体公
知の培地で培養する。
培地としては、例えばグルコース、カーリミノ酸を含む
Ｍ９培地］Ｍｉｌｌｔｅｒ．Ｊ、ＥＸｐｒｅｉｍｅｔｎ
ｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｔａｒ Ｇｅｎｅｔｉｏｎ、４
３１−４３３（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ１９７））が挙げ
られる。ここに、必要によりプロモーターを効率よく働
かせるために、たとえが３β−インドリルアクリル酸の
ような燕剤を加えることができる。
Ｍ９培地］Ｍｉｌｌｔｅｒ．Ｊ、ＥＸｐｒｅｉｍｅｔｎ
ｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｔａｒ Ｇｅｎｅｔｉｏｎ、４
３１−４３３（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ１９７））が挙げ
られる。ここに、必要によりプロモーターを効率よく働
かせるために、たとえが３β−インドリルアクリル酸の
ような燕剤を加えることができる。
培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要によ
り、通気や攪拌を加えることもできる。
り、通気や攪拌を加えることもできる。
培養後、公知の方法で菌体を集め、たとえば、緩衝液に
懸濁させた後、たとえばリゾチーム処理、表面活性剤処
理あるいは超音波処理で菌体を破砕し、遠心分離により
上澄みを得る。
懸濁させた後、たとえばリゾチーム処理、表面活性剤処
理あるいは超音波処理で菌体を破砕し、遠心分離により
上澄みを得る。
当該上澄み液かｒｎａｏヒトＩｇＥ−Ｈ鎖のポリペプチ
ドの単離は、通常知られている蛋白質の精製方法に従え
ばよいが、抗ヒトＩｇＥ抗体カラムクロマトグラフィな
どの方法を用いることが、とりわけ有利である。
ドの単離は、通常知られている蛋白質の精製方法に従え
ばよいが、抗ヒトＩｇＥ抗体カラムクロマトグラフィな
どの方法を用いることが、とりわけ有利である。
本発明により製造されるヒトＩｇＥ−鎖のポリペプチド
またはこれと同等の免疫学的もしくは生物学的活性を有
するポリペプチドは従来の方法で製造されたヒトＩｇＥ
−鎖のポリペプチドと同等の免疫学的もしくは生物学的
活性を示し、これと同様の目的に、同様の用法により使
用することができる。
またはこれと同等の免疫学的もしくは生物学的活性を有
するポリペプチドは従来の方法で製造されたヒトＩｇＥ
−鎖のポリペプチドと同等の免疫学的もしくは生物学的
活性を示し、これと同様の目的に、同様の用法により使
用することができる。
参考例 ヒトＩｇＥをコードするｍＲＮＡの分離（１）
Ｕ−２６６細胞の培養牟考 株化ヒト骨髄腫細胞Ｕ−２６６（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
，３８，６３（１９７９）〕（細胞数２．５×１０５／
ｍｌ）をＲＰＭＩ−１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒ
ｋ ＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）培養液５０
０ｍｌで１０％の子牛胎児血清、およびペニシリン、ス
トレプトマイシン（武田薬品）を０．１ｋｇ／ｍｌと共
にローラーボトルにより３７℃で３日間培養した。
Ｕ−２６６細胞の培養牟考 株化ヒト骨髄腫細胞Ｕ−２６６（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
，３８，６３（１９７９）〕（細胞数２．５×１０５／
ｍｌ）をＲＰＭＩ−１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒ
ｋ ＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）培養液５０
０ｍｌで１０％の子牛胎児血清、およびペニシリン、ス
トレプトマイシン（武田薬品）を０．１ｋｇ／ｍｌと共
にローラーボトルにより３７℃で３日間培養した。
（２）ポリアデニル酸を含むＲＮＡのう調整Ｕ−２６６
細胞の前ＲＮＡを抽出する方法は主ににグリシンらの方
法に従った〔Ｂｉｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３、２６３
３（１９７４））。なわち、培養３日後のＵ−２６６細
胞をサーバル遠心機ｒｏｔｏｒＧＳＡを使用して２５０
０回転、５分遠心して集め、生理食塩水に懸濁した後、
さらに２５００回転で５分遠心して細胞を浄化した。こ
の細胞に５〜１０容量の４％Ｎ−ラウリルサルコシン緩
衝液（和光純薬）（２ｍｇ／ｍｌヘパリン（和光純薬）
、０、２％ピロカルボン酸ジエチチル（東京化成）、０
．０１ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．６〕を加え、３０
ｍｌのテフロンホモジナイザーで１５〜２０回すりつぶ
した。
細胞の前ＲＮＡを抽出する方法は主ににグリシンらの方
法に従った〔Ｂｉｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３、２６３
３（１９７４））。なわち、培養３日後のＵ−２６６細
胞をサーバル遠心機ｒｏｔｏｒＧＳＡを使用して２５０
０回転、５分遠心して集め、生理食塩水に懸濁した後、
さらに２５００回転で５分遠心して細胞を浄化した。こ
の細胞に５〜１０容量の４％Ｎ−ラウリルサルコシン緩
衝液（和光純薬）（２ｍｇ／ｍｌヘパリン（和光純薬）
、０、２％ピロカルボン酸ジエチチル（東京化成）、０
．０１ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．６〕を加え、３０
ｍｌのテフロンホモジナイザーで１５〜２０回すりつぶ
した。
この溶液にＣｓＣｌを０．５ｇ／ｍｌとなるように加え
た後、スピンコＳＷ２７ｒｏｔｏｒ用の遠心チューブ中
の５．７ＭＣｓＣｌ溶液７ｍｌ上に重層し、２６０００
回転で２０時間遠心してＲＮＡを沈澱させた。チューブ
中の上清を吸引除去した後、チューブの下方２ｃｍ稈度
を残して上部を切り取った後、ＲＮＡの沈澱を０．４％
のＮ−ラウリルサルコシン緩衝液に溶解した。この溶液
にＮａＣｌを０．２Ｍとなるように加えてＲＮＡを−２
０℃下に沈澱させた。
た後、スピンコＳＷ２７ｒｏｔｏｒ用の遠心チューブ中
の５．７ＭＣｓＣｌ溶液７ｍｌ上に重層し、２６０００
回転で２０時間遠心してＲＮＡを沈澱させた。チューブ
中の上清を吸引除去した後、チューブの下方２ｃｍ稈度
を残して上部を切り取った後、ＲＮＡの沈澱を０．４％
のＮ−ラウリルサルコシン緩衝液に溶解した。この溶液
にＮａＣｌを０．２Ｍとなるように加えてＲＮＡを−２
０℃下に沈澱させた。
（３）オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフ
イーによる分画 エタノール沈澱したＲＮＡをスピンコＳＷ２７．１ｒｏ
ｔｏｒで２０，０００回転，２０分間遠心して集めた後
、１０ｍｌのｌ１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６
）、０．５ＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｓ
ＤＳ緩衝液に溶解した。次にこれと同じ緩衝液に溶解し
たオリゴ（ｄＴ）セルロースを１０ｃｃの注射筒に高さ
４ｃｍ（４ｍｌ）に充め、上記のＲＮＡ試料をこのカラ
ムに流し、素通りした部分を再度カラムに流してポリア
デニル酸を含むＲＮＡを吸着させた。さらに、同じ緩衝
液で紫外線２６０ｎｍの吸収がなくなるまでカラムを洗
浄して未吸着のＲＮＡを洗い流した後、１０ｍＭＴｒｉ
ｃ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭＥＤＴＡｌ、０．３
ＳＤＳ緩衝液でポリアデニル酸を含むＲＮＡをカラトか
ら溶出しく１ｍｌ′／画分）Ｏ．Ｄ２６０ｎｍの吸収の
ＲＮＡを追跡した。ＲＮＡ分画を集め、−２０℃下にエ
タノール沈澱した。
イーによる分画 エタノール沈澱したＲＮＡをスピンコＳＷ２７．１ｒｏ
ｔｏｒで２０，０００回転，２０分間遠心して集めた後
、１０ｍｌのｌ１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６
）、０．５ＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｓ
ＤＳ緩衝液に溶解した。次にこれと同じ緩衝液に溶解し
たオリゴ（ｄＴ）セルロースを１０ｃｃの注射筒に高さ
４ｃｍ（４ｍｌ）に充め、上記のＲＮＡ試料をこのカラ
ムに流し、素通りした部分を再度カラムに流してポリア
デニル酸を含むＲＮＡを吸着させた。さらに、同じ緩衝
液で紫外線２６０ｎｍの吸収がなくなるまでカラムを洗
浄して未吸着のＲＮＡを洗い流した後、１０ｍＭＴｒｉ
ｃ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭＥＤＴＡｌ、０．３
ＳＤＳ緩衝液でポリアデニル酸を含むＲＮＡをカラトか
ら溶出しく１ｍｌ′／画分）Ｏ．Ｄ２６０ｎｍの吸収の
ＲＮＡを追跡した。ＲＮＡ分画を集め、−２０℃下にエ
タノール沈澱した。
（４）ショ糖密度勾配遠心法による分画前記操作で得た
ポリアデニル酸を含むＲＮＡ約２ｍｇを０．０５ＭＮａ
Ｃｌ、０３０１ＭＥＤＴＡ，０．０１ＭＴｒｉｐ・ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．６）、０．２％ＳＤＳ緩衝液に溶解した１
０〜３０％のショ糖濃度勾配溶液上に重層し、ＳＷ２７
ｒｏｔｏｒを使用して２４，０００回転で２２時間２０
℃下に転心した。この後、内容物を４０本に分画し、Ｏ
Ｄ．２６０ｎｍ分画ごとに集め、エタノール沈澱を行い
沈澱物としてｍＲＮＡを得た。
ポリアデニル酸を含むＲＮＡ約２ｍｇを０．０５ＭＮａ
Ｃｌ、０３０１ＭＥＤＴＡ，０．０１ＭＴｒｉｐ・ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．６）、０．２％ＳＤＳ緩衝液に溶解した１
０〜３０％のショ糖濃度勾配溶液上に重層し、ＳＷ２７
ｒｏｔｏｒを使用して２４，０００回転で２２時間２０
℃下に転心した。この後、内容物を４０本に分画し、Ｏ
Ｄ．２６０ｎｍ分画ごとに集め、エタノール沈澱を行い
沈澱物としてｍＲＮＡを得た。
実施例／
（ｉ）単鎖ＤＮＡの合成
上記参考例で得た５μｇｍＲＮＡおよび１００ユニツト
の逆転写酵素（Ｌｅｆｅ Ｓｃｌｅｎｃｅ社）を用い、
１００μｌの反応液（５μｇオリゴ（ｄＴ），１ｉｍＭ
ずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、
８ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭジチ
オスレイトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８
．３）中で４２℃、１時間インキュベートした後に、フ
ェノールで除蛋白し、０．１ＮＮａＯＲで７０℃，２Ｏ
分処理しでＲＮＡを分解除去した。
の逆転写酵素（Ｌｅｆｅ Ｓｃｌｅｎｃｅ社）を用い、
１００μｌの反応液（５μｇオリゴ（ｄＴ），１ｉｍＭ
ずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、
８ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭジチ
オスレイトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８
．３）中で４２℃、１時間インキュベートした後に、フ
ェノールで除蛋白し、０．１ＮＮａＯＲで７０℃，２Ｏ
分処理しでＲＮＡを分解除去した。
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡの合成
ここで合成された単鎖の相補ＤＮＡを５０μｌの反応液
（ｍＲＮＡとオリゴ（ｄＴ）を含まない以外は上記と同
じ反応液）中で４２℃２時間反応させることにより二本
鎖ＤＮＡを合成した。
（ｍＲＮＡとオリゴ（ｄＴ）を含まない以外は上記と同
じ反応液）中で４２℃２時間反応させることにより二本
鎖ＤＮＡを合成した。
（ｉｉｌ）ｄＣテイルの付加
この二本鎖ＤＮＡに６０ユニットのヌクレアーゼＳ１（
ＢｅｔｈＰＳｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社）を５０μｌの反応液（０．１Ｍ酢酸ナト
リウム，ｐＨ４，５，０．２５ＭＮａＣｌ，１．５ｍＭ
ＺｎＳＯ４）中で室温３０分間作用させ、フェノールで
除蛋白し、エタノールでＤＮＡを沈澱させた後、これに
３０ユニツトのターミナルトランスフェラーゼ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ社）を５０μｋの反応液（０．１４Ｍカコジル酸カ
リウム，０．３Ｍ Ｔｒｉｓ（塩基）、ｐＨ７，６，２
ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭＣｏＣｌ２，０．１
５ｍＭｄＣＴＰ）中で３分間３７℃で作用させ二本頭Ｄ
ＮＡの３′両端に約２０個のデオキシシチジン値を伸長
させた。
ＢｅｔｈＰＳｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社）を５０μｌの反応液（０．１Ｍ酢酸ナト
リウム，ｐＨ４，５，０．２５ＭＮａＣｌ，１．５ｍＭ
ＺｎＳＯ４）中で室温３０分間作用させ、フェノールで
除蛋白し、エタノールでＤＮＡを沈澱させた後、これに
３０ユニツトのターミナルトランスフェラーゼ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ社）を５０μｋの反応液（０．１４Ｍカコジル酸カ
リウム，０．３Ｍ Ｔｒｉｓ（塩基）、ｐＨ７，６，２
ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭＣｏＣｌ２，０．１
５ｍＭｄＣＴＰ）中で３分間３７℃で作用させ二本頭Ｄ
ＮＡの３′両端に約２０個のデオキシシチジン値を伸長
させた。
これらの一連の反応で約３００ｎｇのデオキシシチジン
鎖をもった二本鎖ＤＮＡを得た。
鎖をもった二本鎖ＤＮＡを得た。
（ｉｖ）大腸菌プラスミドの解製ならびにｄＧテイルの
付加 一方、１０μｇの大腸菌プラスミドｐＨＲ３２２ＤＮＡ
に２０ユニットの個限酵素ＰＡＴＩを５０μｌの反応液
〔５０ｍＨ ＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
７、４），６ｍＭ ＭｇＣｌ２，６ｍＭ２−メルカプト
エタノール、１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン〕中で
３時間３７℃で作用させてｐＲＲ３２２ＤＮＡ中に１ケ
所存在するＰａｔＩ認識部位を切断し、フェノールで除
蛋白した後、３０ユニツトのターミナルトランスフェラ
ーゼを５０μｌの反応液〔０．１４Ｍカコジル酸カリウ
ム、０．３ＭＴｒｉｓ（塩基），ｐＨ７，６，２ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭＣＯＣｌ２、２．０．１５ｍ
Ｎ ｄＧＴＰ〕中で３分間３７℃で作用させ上記オウラ
スミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの３両端に約８個のデオキシ
グアニン鎖を延長させた。
付加 一方、１０μｇの大腸菌プラスミドｐＨＲ３２２ＤＮＡ
に２０ユニットの個限酵素ＰＡＴＩを５０μｌの反応液
〔５０ｍＨ ＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
７、４），６ｍＭ ＭｇＣｌ２，６ｍＭ２−メルカプト
エタノール、１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン〕中で
３時間３７℃で作用させてｐＲＲ３２２ＤＮＡ中に１ケ
所存在するＰａｔＩ認識部位を切断し、フェノールで除
蛋白した後、３０ユニツトのターミナルトランスフェラ
ーゼを５０μｌの反応液〔０．１４Ｍカコジル酸カリウ
ム、０．３ＭＴｒｉｓ（塩基），ｐＨ７，６，２ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭＣＯＣｌ２、２．０．１５ｍ
Ｎ ｄＧＴＰ〕中で３分間３７℃で作用させ上記オウラ
スミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの３両端に約８個のデオキシ
グアニン鎖を延長させた。
（ｖ）ｃＤＮＡと大腸菌プラスミドとの会合ならびに大
腸菌の形質変換 このようにして得られた合成二本鎖ＤＮＡ０．１μｇと
上記プラスミドｐＢＲ３２２０．５μｇを０．１ｍＨＡ
Ｃｌ，５０ｍＭＴｒｌｓ・ＨＣＬ、ｐＨ７．６，１ｍＭ
ＥＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分間、４５℃２時
間加熱しその除例して会合させ、Ｅｎｃａらの方法〔Ｊ
．Ｍｏｌ．ＢｉｏＬ ９６，−４９５（１９７５）〕に
従って大腸菌Ｘ１７７６を形質転換させた。
腸菌の形質変換 このようにして得られた合成二本鎖ＤＮＡ０．１μｇと
上記プラスミドｐＢＲ３２２０．５μｇを０．１ｍＨＡ
Ｃｌ，５０ｍＭＴｒｌｓ・ＨＣＬ、ｐＨ７．６，１ｍＭ
ＥＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分間、４５℃２時
間加熱しその除例して会合させ、Ｅｎｃａらの方法〔Ｊ
．Ｍｏｌ．ＢｉｏＬ ９６，−４９５（１９７５）〕に
従って大腸菌Ｘ１７７６を形質転換させた。
（ｖｉ）ｃＤＮＡ含有プラスミドの単離こうして１４４
５のテトラサイクリン耐性株が単離され、これら各々の
ＤＮＡをニトロセルロースフイルターの上に固定した。
５のテトラサイクリン耐性株が単離され、これら各々の
ＤＮＡをニトロセルロースフイルターの上に固定した。
（Ｇｒｎｎｒｔｅｉｎ Ｍａｎｄ Ｈｏｇｅｗｓｓ、Ｄ
、Ｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
７２．３９６１（１９７５）） 一方、ヒトＩＧＥ Ｈ鎖のポリペプチドに対応した遺伝
子断片（前出）をニックトランスレーション法（前出）
を用いて３２Ｐラベルした。
、Ｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
７２．３９６１（１９７５）） 一方、ヒトＩＧＥ Ｈ鎖のポリペプチドに対応した遺伝
子断片（前出）をニックトランスレーション法（前出）
を用いて３２Ｐラベルした。
ＤＮＡ０．２μｇを２．５μｌの反応液〔５０ｍＭＴｒ
ｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７，５，５ｍＭ、ＭｇＣＬ２，１ｍ
Ｍβ−メルカプトエクノール、１０μＣｉｎ−３２Ｐ−
ｄＡＴＰ ０．４ｎｇ ウシ膵臓Ｄｎａｓｅ Ｉ（Ｗｅ
ｒ−ｔｈｉｎｇｔｏｎ）〕中２分間室温で反応させた。
ｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７，５，５ｍＭ、ＭｇＣＬ２，１ｍ
Ｍβ−メルカプトエクノール、１０μＣｉｎ−３２Ｐ−
ｄＡＴＰ ０．４ｎｇ ウシ膵臓Ｄｎａｓｅ Ｉ（Ｗｅ
ｒ−ｔｈｉｎｇｔｏｎ）〕中２分間室温で反応させた。
次に２５ユニツトの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＢｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を加えて３０分
間１５℃で反応させた後、フェノール抽出、エタノール
沈澱によりＤＮＡを精製し、均一に３２Ｐラベルされた
ＤＮＡを得た。
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を加えて３０分
間１５℃で反応させた後、フェノール抽出、エタノール
沈澱によりＤＮＡを精製し、均一に３２Ｐラベルされた
ＤＮＡを得た。
この３２Ｐ−ＤＭＡをプローブとしてＬａｗｎらの方法
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｎ Ｒｅｓ，９，６１０３
（１９８１）〕に従って上記のニトロセルロースフィル
ター上に固定したＤＮＡに会合させ、オートラジオグラ
フイーによって、プローブに反応するコロニー９個を単
離し、それぞれｐＧＥＴ１〜９と名ずけた。
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｎ Ｒｅｓ，９，６１０３
（１９８１）〕に従って上記のニトロセルロースフィル
ター上に固定したＤＮＡに会合させ、オートラジオグラ
フイーによって、プローブに反応するコロニー９個を単
離し、それぞれｐＧＥＴ１〜９と名ずけた。
これらの菌株の各々の菌体からプラスミドＤＮＡをＢｉ
ｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙの方法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ Ｈ
．Ｃ．＆Ｄｏｌｙ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ、７、１５１３（１９７９）〕によって単離した
。次にプラスミドＤＮＡの挿入部を制限酵素ＰｓｔＩに
より切り出し、分離したプラスミドのうちでその挿入部
のさの最も長い断片を含むもの（ｐＧＥＴ２ＤＮＡ）を
えらんだ。
ｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙの方法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ Ｈ
．Ｃ．＆Ｄｏｌｙ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ、７、１５１３（１９７９）〕によって単離した
。次にプラスミドＤＮＡの挿入部を制限酵素ＰｓｔＩに
より切り出し、分離したプラスミドのうちでその挿入部
のさの最も長い断片を含むもの（ｐＧＥＴ２ＤＮＡ）を
えらんだ。
このプラスミド中に挿入されたｃＤＮＡの制限酵素地図
を第３図に示す。次にこのｐＧＦＴ２プラスミド中に挿
入されたｃＤＮＡ配列の一次構造（ヌクレオチド配列）
をジデオギシヌクレオチド合成鎖停止法とＭａｘａｍ−
Ｇｉｌｂｅｒｔの方法によって決定した。そのヌクレオ
チド配列はは第４図の通りであった。ここで、第４図に
おいてヌクレオチド配列１８−１５０２として示される
ポリヌクレオチドは第１図で示されるポリヌクレオチド
に対応する。
を第３図に示す。次にこのｐＧＦＴ２プラスミド中に挿
入されたｃＤＮＡ配列の一次構造（ヌクレオチド配列）
をジデオギシヌクレオチド合成鎖停止法とＭａｘａｍ−
Ｇｉｌｂｅｒｔの方法によって決定した。そのヌクレオ
チド配列はは第４図の通りであった。ここで、第４図に
おいてヌクレオチド配列１８−１５０２として示される
ポリヌクレオチドは第１図で示されるポリヌクレオチド
に対応する。
このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配
列は、読み取り枠を一致さえることにより、Ｄｏｒｒｉ
ｎｇｔｏｎらの報告〔Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒ
ｅｖ４１、３（１６７８）〕しているＩｇＥ ＩＩ鎖ポ
リペプチドのアミノ酸配列とほぼ合致することから、ｐ
ＧＥＴ２に挿入されたｃＤＮＡはＩｇＥ Ｈ鎖のポリペ
プチドをコードし７ていることが確認された。このｃＤ
ＮＡはＤｏｒｒｉｎｇｔｏｎらの方向（前出）のＩｇＥ
Ｈ鎖のＶ領域の５３番目のアミノ酸をコードするコドン
より始っており、Ｃ領域はすべてコードしている。さら
に、ポリ（Ａ）構造が存在していることから、非コード
領域を含めて、ｍＲＮＡの３′末端側の構造をすべて保
持していると考えられる。
列は、読み取り枠を一致さえることにより、Ｄｏｒｒｉ
ｎｇｔｏｎらの報告〔Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒ
ｅｖ４１、３（１６７８）〕しているＩｇＥ ＩＩ鎖ポ
リペプチドのアミノ酸配列とほぼ合致することから、ｐ
ＧＥＴ２に挿入されたｃＤＮＡはＩｇＥ Ｈ鎖のポリペ
プチドをコードし７ていることが確認された。このｃＤ
ＮＡはＤｏｒｒｉｎｇｔｏｎらの方向（前出）のＩｇＥ
Ｈ鎖のＶ領域の５３番目のアミノ酸をコードするコドン
より始っており、Ｃ領域はすべてコードしている。さら
に、ポリ（Ａ）構造が存在していることから、非コード
領域を含めて、ｍＲＮＡの３′末端側の構造をすべて保
持していると考えられる。
従って、このプラスミドに挿入されたヌクレオチド配列
に翻訳開始コドンＡＴＧを読み取り枠が一致するように
５′末端に加えて、他の発現用プラスミドに組み込み、
これで大腸菌などを形質転換させることによりヒトＩｇ
Ｅの抗原性を狙っているＣ領域のポリペプチドを生産す
ることができる。
に翻訳開始コドンＡＴＧを読み取り枠が一致するように
５′末端に加えて、他の発現用プラスミドに組み込み、
これで大腸菌などを形質転換させることによりヒトＩｇ
Ｅの抗原性を狙っているＣ領域のポリペプチドを生産す
ることができる。
実施例２
実施例１で得たプラスミドｐＧＥＴ２の挿入部を制限酵
素ＰｓｔＩで切り出した。このＤＮＡ断片２μｇに６０
μｌ反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ，ｐＨ８，０，
０，６ＭＮａＣｌ，１２ｍＭＣａＣｌ２，１２ｍＭＭｇ
Ｃｌ２、１ｍＭＥＤＴＡ）中で２ｕｎｉｔのヌクレアー
ゼＢａｌ ３１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｎｇｓ社ＧｒａｙらＮｏｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、２、１４５９（１９７５）〕を３０℃１分
間作用させＤＮＡ断片の両端より部分的に消化した。
素ＰｓｔＩで切り出した。このＤＮＡ断片２μｇに６０
μｌ反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ，ｐＨ８，０，
０，６ＭＮａＣｌ，１２ｍＭＣａＣｌ２，１２ｍＭＭｇ
Ｃｌ２、１ｍＭＥＤＴＡ）中で２ｕｎｉｔのヌクレアー
ゼＢａｌ ３１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｎｇｓ社ＧｒａｙらＮｏｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、２、１４５９（１９７５）〕を３０℃１分
間作用させＤＮＡ断片の両端より部分的に消化した。
反応物よりフェノール抽出、エタノール沈澱によりＤＮ
Ａを精製したのち、翻訳開始コドンおよび制限酵素Ｃｌ
ａＩの認識部位を含むアダプター５′ＣＡＴＣＧＡＴＧ
３′をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ−Ｌａｎｄ
Ｂｌｏｌａｂｓ社）を用いて結合させた。
Ａを精製したのち、翻訳開始コドンおよび制限酵素Ｃｌ
ａＩの認識部位を含むアダプター５′ＣＡＴＣＧＡＴＧ
３′をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ−Ｌａｎｄ
Ｂｌｏｌａｂｓ社）を用いて結合させた。
一方、発現用プラスミドとして大腸菌のｔｒｐプロモー
ター部分〔プロモーター、オペレーターを含む２７６ｂ
ｐのＤＮＡ断片、Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｇ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ，１２１，１１３（１９７８）〕を含む
プラスミドｐｔｒｐ７７１（ベクターはｐＢＲ３２２）
を昭和５７年特許願第５７−８５２８０号に記載されて
いる方法に従って構築した。
ター部分〔プロモーター、オペレーターを含む２７６ｂ
ｐのＤＮＡ断片、Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｇ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ，１２１，１１３（１９７８）〕を含む
プラスミドｐｔｒｐ７７１（ベクターはｐＢＲ３２２）
を昭和５７年特許願第５７−８５２８０号に記載されて
いる方法に従って構築した。
この発現プラスミドｎｔｒｐ７７１を制限酵素ＣｌａＩ
で切断し、この部分に同じくＣｌａＩで切断した上記ｐ
ＧＥＴ２挿入ＤＮＡ−アダプター結合物を、Ｔ４ＤＮＡ
ガーゼを用いて挿入した。（第５図）この反応物を用い
てＣｏＨｅｎらの方法（前出）に従って大腸菌２９４を
形質転換させ、ヌクレアーゼＢａｌ３１による消化領域
の異なったプラスミドを含む多くのコローニーに得た。
で切断し、この部分に同じくＣｌａＩで切断した上記ｐ
ＧＥＴ２挿入ＤＮＡ−アダプター結合物を、Ｔ４ＤＮＡ
ガーゼを用いて挿入した。（第５図）この反応物を用い
てＣｏＨｅｎらの方法（前出）に従って大腸菌２９４を
形質転換させ、ヌクレアーゼＢａｌ３１による消化領域
の異なったプラスミドを含む多くのコローニーに得た。
得られたコロニーに対して、抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて
コロニーイムノアッセイ法〔Ｄ．Ｊ．ＫｅｍｐとＡ．Ｆ
．Ｃｏｗｍａｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｎｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７８，４２５０（１９８１）〕を行い、ヒ
トＩｇＥ日鎖のポリペブチドを酸性しているコロニーを
選択した。すなわち、ニトロセルロースフイルター上に
生やしたコロニーを、０．１ＭＮ２ＨＣＯ３，０．１％
トリトンＸ１００，２００μｇ／ｍｌリゾチーム溶液上
で溶解したのち、そのまま集荷シアンで活性化したロ紙
（Ｗｈａｔｍａｎ社、第５４０）上に多し、ロ紙に固定
化した。このロ紙にヤギ抗ヒトＩｇＦ２抗体（Ｍｉｌｅ
ｓ社製）を反応させた後、洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ＭＮａＣｌ，０，１
％トリトンＸ１００、１％牛血清アルブミン）で洗浄し
、さらに１２５ＩラベルされたプロティンＡ（英国ＲＣ
ＣＡｍｅｓｈａｍ社）を反応させた。反応後ロ紙をよく
洗ったのち、オートラジオグラフィーをとった。
コロニーイムノアッセイ法〔Ｄ．Ｊ．ＫｅｍｐとＡ．Ｆ
．Ｃｏｗｍａｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｎｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７８，４２５０（１９８１）〕を行い、ヒ
トＩｇＥ日鎖のポリペブチドを酸性しているコロニーを
選択した。すなわち、ニトロセルロースフイルター上に
生やしたコロニーを、０．１ＭＮ２ＨＣＯ３，０．１％
トリトンＸ１００，２００μｇ／ｍｌリゾチーム溶液上
で溶解したのち、そのまま集荷シアンで活性化したロ紙
（Ｗｈａｔｍａｎ社、第５４０）上に多し、ロ紙に固定
化した。このロ紙にヤギ抗ヒトＩｇＦ２抗体（Ｍｉｌｅ
ｓ社製）を反応させた後、洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ＭＮａＣｌ，０，１
％トリトンＸ１００、１％牛血清アルブミン）で洗浄し
、さらに１２５ＩラベルされたプロティンＡ（英国ＲＣ
ＣＡｍｅｓｈａｍ社）を反応させた。反応後ロ紙をよく
洗ったのち、オートラジオグラフィーをとった。
このアッセイで抗ヒトＩｇＥ抗体と最も強く反応したコ
ロニーに含まれるプラスミドをｐＧＥＴｔｒｐ１０４と
名ずけ、このプラスミドを菌体よりＢｉｒｎｂｏｉｍ−
Ｄｏｌｙの方法（前出）を用いて抽出した。このｐＧＥ
Ｔｔｒｐ１０４におけるヒトＩｇＥＨ鎖をコードするポ
リヌクレオチドのｐｔｒｐ７７１への挿入分部分のヌク
レオチド配列をジデオキシヌクレオチド合成鏡停止法（
前出）により検討したところ、翻訳開始コドンＡＴＧに
続いて、Ｄｏｒｒｉｎｇ−ｔｏｎの報告の９２番目のア
ミノ酸をコードするコドンより読み取り枠が一致して、
ヒトＩｇＥＨ鎖のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドが連結されており、３′末端側に、ｍＲＮＡ溝浩
の末端にあるポリ（Ａ）構造が保存されていることが明
らかとなった（第４図）。
ロニーに含まれるプラスミドをｐＧＥＴｔｒｐ１０４と
名ずけ、このプラスミドを菌体よりＢｉｒｎｂｏｉｍ−
Ｄｏｌｙの方法（前出）を用いて抽出した。このｐＧＥ
Ｔｔｒｐ１０４におけるヒトＩｇＥＨ鎖をコードするポ
リヌクレオチドのｐｔｒｐ７７１への挿入分部分のヌク
レオチド配列をジデオキシヌクレオチド合成鏡停止法（
前出）により検討したところ、翻訳開始コドンＡＴＧに
続いて、Ｄｏｒｒｉｎｇ−ｔｏｎの報告の９２番目のア
ミノ酸をコードするコドンより読み取り枠が一致して、
ヒトＩｇＥＨ鎖のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドが連結されており、３′末端側に、ｍＲＮＡ溝浩
の末端にあるポリ（Ａ）構造が保存されていることが明
らかとなった（第４図）。
実施例３
（１）実施例１．で得たプラスミドｐＧＥＴ２の挿入部
を制限酵素ＰｓｔＩで切り出した。このＤＮＡ断片をさ
らに制御酵素ＳａｌＩで切断し、一端がＳａｌＩ部位、
他端がＰｓｔＩ部位をもつ約１１５０ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。このＤＮＡ断片のＳａｌＩ部位の一本鎖接着Ｄ
ＮＡ末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエラージフラグメ
ントでうめた後、翻訳開始コドンおよび制限酵素Ｃｌａ
Ｉの認識部位を含むアダプター５′ＧＣＡＴＣＧＡＴＧ
Ｃ３′をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ 社）を用いて結合させた。この結合
物を制限酵素Ｃｌａ Ｉで１切断し、制限酵素Ｃｌａ
Ｉ，ＰｓｔＩで切断した発現プラスミドｐｔｒｐ７７１
と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた（第６図）
。これら一連の反応により、ｔｒｐプロモーターの下流
に翻訳開始コドンおよび新たに作成されたＬｅｎをコー
ドするコドンＣＴＣを有し、読み取り枠を一致させて、
ヒトＩｇＥ Ｈ鎖のポリペプチド、Ｄｏｒｒｏｉｎｇｔ
ｏｎの報告により２１８番目のアミノ酸をコードするコ
ドンより始する、ヒトＩｇＥＨ鎖のポリペプチド発現プ
ラスミドｐＧＥＴｔｒｐ３０２を構築した。
を制限酵素ＰｓｔＩで切り出した。このＤＮＡ断片をさ
らに制御酵素ＳａｌＩで切断し、一端がＳａｌＩ部位、
他端がＰｓｔＩ部位をもつ約１１５０ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。このＤＮＡ断片のＳａｌＩ部位の一本鎖接着Ｄ
ＮＡ末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエラージフラグメ
ントでうめた後、翻訳開始コドンおよび制限酵素Ｃｌａ
Ｉの認識部位を含むアダプター５′ＧＣＡＴＣＧＡＴＧ
Ｃ３′をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ 社）を用いて結合させた。この結合
物を制限酵素Ｃｌａ Ｉで１切断し、制限酵素Ｃｌａ
Ｉ，ＰｓｔＩで切断した発現プラスミドｐｔｒｐ７７１
と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた（第６図）
。これら一連の反応により、ｔｒｐプロモーターの下流
に翻訳開始コドンおよび新たに作成されたＬｅｎをコー
ドするコドンＣＴＣを有し、読み取り枠を一致させて、
ヒトＩｇＥ Ｈ鎖のポリペプチド、Ｄｏｒｒｏｉｎｇｔ
ｏｎの報告により２１８番目のアミノ酸をコードするコ
ドンより始する、ヒトＩｇＥＨ鎖のポリペプチド発現プ
ラスミドｐＧＥＴｔｒｐ３０２を構築した。
このプラスミドを用いて、Ｃｏｈｅｎらの方法に従って
大腸菌２９４を形質転換させることにより、求めるプラ
スミドｐＧＥＴｔｒｐ３０２を含む菌株を得た。
大腸菌２９４を形質転換させることにより、求めるプラ
スミドｐＧＥＴｔｒｐ３０２を含む菌株を得た。
（ｉｉ）実施例１．で得たプラスミドｐＧＥＴ２の挿入
部を制限酵素ＰｓｔＩで切り出し、ＤＮＡ断片をさらに
制限酵素ＨｉｎｆＩで切断し、一端がＨｉｎｆＩ部位，
他端がＰｓｔＩ部位である約８１０ｂｐのＤＮＡ断片を
得た。
部を制限酵素ＰｓｔＩで切り出し、ＤＮＡ断片をさらに
制限酵素ＨｉｎｆＩで切断し、一端がＨｉｎｆＩ部位，
他端がＰｓｔＩ部位である約８１０ｂｐのＤＮＡ断片を
得た。
このＤＮＡ断片のＨｉｎｆＩ部位の一本鎖接着ＤＮＡ末
端を大腸菌ポリメラーゼＩラージフラグメント（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌ
ｅｓ社）でうめ平滑末端とした後、実施例３（ｉ）で用
いたアダプター５′ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣ３′をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させた。
端を大腸菌ポリメラーゼＩラージフラグメント（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌ
ｅｓ社）でうめ平滑末端とした後、実施例３（ｉ）で用
いたアダプター５′ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣ３′をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させた。
この結合物を制限酵素ＣｌａＩで切断し、制限酵素Ｃｌ
ａＩ，ＰｓｔＩで切断した発現プラスミドｐｔｒｐ７７
１とＴ４ＤＮＡリガーを用いて結合させた（第６図）。
ａＩ，ＰｓｔＩで切断した発現プラスミドｐｔｒｐ７７
１とＴ４ＤＮＡリガーを用いて結合させた（第６図）。
これら一連の反応により、ｔｒｐプロモーターの下流に
、翻訳開始コドンおよびＨｉｓをコードするコドンＣＡ
Ｔを有し、読み取り枠が一致して、ヒトＩｇＥＨ鎖のポ
リペプチドが、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎの方向による３３
１番目のアミノ酸をコードするコドンより始まるヒトＩ
ｇＥＨ鎖のポリペプチド発現プラスミドｐＧＥＴｔｒｐ
４１０を構築した。このプラスミドを用いてＣｏｈｅｎ
らの方法に従って大大腸菌２９４を形質転換させること
により、求めるプラスミドｐＧＥＴｔｒｐ４１０を含む
菌株を得た。
、翻訳開始コドンおよびＨｉｓをコードするコドンＣＡ
Ｔを有し、読み取り枠が一致して、ヒトＩｇＥＨ鎖のポ
リペプチドが、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎの方向による３３
１番目のアミノ酸をコードするコドンより始まるヒトＩ
ｇＥＨ鎖のポリペプチド発現プラスミドｐＧＥＴｔｒｐ
４１０を構築した。このプラスミドを用いてＣｏｈｅｎ
らの方法に従って大大腸菌２９４を形質転換させること
により、求めるプラスミドｐＧＥＴｔｒｐ４１０を含む
菌株を得た。
実施例４
実施例２，３で得られたＩｇＥＨ鎖発現プラスミドを含
む菌株を２０ｍｌの１％グルコース、０．４％カザミノ
酸を含むＭ９培地で３７℃４時間培養した後、インドー
ルアクリル酸を３０μｇ／ｍｌに加え、さらに３７℃３
時間培養した。菌体を集め、食塩水で洗ったのち、０．
５ｍｌの溶菌液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８
．０，１０ｍＨＥＤＴＡ０．２ＭＨａＣｌ、１ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド，０．０２％トリト
ンＸ１００、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に混濁し、
０℃にて４５分，３７℃にて２分放置して溶菌させた。
む菌株を２０ｍｌの１％グルコース、０．４％カザミノ
酸を含むＭ９培地で３７℃４時間培養した後、インドー
ルアクリル酸を３０μｇ／ｍｌに加え、さらに３７℃３
時間培養した。菌体を集め、食塩水で洗ったのち、０．
５ｍｌの溶菌液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８
．０，１０ｍＨＥＤＴＡ０．２ＭＨａＣｌ、１ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド，０．０２％トリト
ンＸ１００、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に混濁し、
０℃にて４５分，３７℃にて２分放置して溶菌させた。
これをさらに軽く（３０秒）超音波処理を行って、溶出
した菌体のＤＮＡを切断した後、４℃で１５０００ｒｐ
ｍ（サーブルＳＳ３４ローター），３０分間の遠心分離
操作によって上澄みを得た。この上澄み液のＩｇＥ活性
をＩｇＥ測定キット（ＩｇＥテスト、シオノギ、塩野義
製薬意）を用いたＲＩＳＴ法〔Ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎ
ｏ ｓｏｒｂｅｎｔ ｔｅｓｔ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
，１４，２６５（１９６８）〕により定量した。
した菌体のＤＮＡを切断した後、４℃で１５０００ｒｐ
ｍ（サーブルＳＳ３４ローター），３０分間の遠心分離
操作によって上澄みを得た。この上澄み液のＩｇＥ活性
をＩｇＥ測定キット（ＩｇＥテスト、シオノギ、塩野義
製薬意）を用いたＲＩＳＴ法〔Ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎ
ｏ ｓｏｒｂｅｎｔ ｔｅｓｔ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
，１４，２６５（１９６８）〕により定量した。
結果を第２表に示した。ヒトＩｇＥ Ｈ鎖のポリペプチ
ドの産性量はｎＧＥＴｔｒｐ３０２を含む菌株が最も多
く４８０ｎｇ／ｍｌ抽出液であった。
ドの産性量はｎＧＥＴｔｒｐ３０２を含む菌株が最も多
く４８０ｎｇ／ｍｌ抽出液であった。
第２表
組換え体 ＩｇＥ Ｈ鎖産性量（ｎｇ／ｍｌ抽出液）
大腸菌２９４（ｐｔｒｐ７７１） ０大腸菌２
９４（ｐＧＥＴｔｒｐ１０４） ８４大腸菌２９４（ｐ
ＧＥＴｒｐ３０２） ４８０大腸菌２９４（ｐＧＥＴｔ
ｒｐ４１０） ４８実施例５ 昭和５６年特許願昭５６−１９３２４号参照例２に記憶
されている方法により抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体
を水不溶性担体アフイゲル１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に
結合された。抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体−アフイ
ゲル１０カラム１ｍｌに実施例４で得られたｐＧＥＴｔ
ｒｐ３０２を含む菌体抽出液５ｍｌをかけ、２０％デキ
スロースを含むＰＢＳ（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６
、８、９、１５ＮＮＲＣｌ）５０ｍｌを用いてカラムを
洗浄したのち、０．２Ｍ酢酸、０．１５ＭＭａＣｌ溶液
５ｍｌを用いて、カラムに吸着したヒトＩｇＥ Ｈ鎖を
カラムから溶出し、溶出液をただちに中和したのち、Ｐ
ＢＳ１ｌに対して５℃で２４時間■■した。この操作に
より純度８０％以上のヒトＩｇＥＨ鎖のポリペプチドが
約５０％の回収率で得られた。
大腸菌２９４（ｐｔｒｐ７７１） ０大腸菌２
９４（ｐＧＥＴｔｒｐ１０４） ８４大腸菌２９４（ｐ
ＧＥＴｒｐ３０２） ４８０大腸菌２９４（ｐＧＥＴｔ
ｒｐ４１０） ４８実施例５ 昭和５６年特許願昭５６−１９３２４号参照例２に記憶
されている方法により抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体
を水不溶性担体アフイゲル１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に
結合された。抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体−アフイ
ゲル１０カラム１ｍｌに実施例４で得られたｐＧＥＴｔ
ｒｐ３０２を含む菌体抽出液５ｍｌをかけ、２０％デキ
スロースを含むＰＢＳ（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６
、８、９、１５ＮＮＲＣｌ）５０ｍｌを用いてカラムを
洗浄したのち、０．２Ｍ酢酸、０．１５ＭＭａＣｌ溶液
５ｍｌを用いて、カラムに吸着したヒトＩｇＥ Ｈ鎖を
カラムから溶出し、溶出液をただちに中和したのち、Ｐ
ＢＳ１ｌに対して５℃で２４時間■■した。この操作に
より純度８０％以上のヒトＩｇＥＨ鎖のポリペプチドが
約５０％の回収率で得られた。
第１図はヒトＩｇＥ Ｈ鎖のポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を、第２図は第１図に示されるヌクレ
オチド配列に対応するアミノ酸配列を、第３図は実施例
１．で得られたｐＧＥＴ２中のｃＤＮＡの制限酵素地図
を、第４図はその一時構造（ヌクレオチド配列）を示す
。第５図は実施例２の構築図を、第６図は実施例３．の
構築図を表し、■部分はヒトＩｇＥ Ｈ鎖のポリペプチ
ドをコードする部分を示す。 第１図−（２） 第２図−（１） 第２図−（２） 第４図−（４） 川西市水明白１丁目１番地の５０ ・重分明者音田治夫 川西市多田院字順松２１番地の６
ヌクレオチド配列を、第２図は第１図に示されるヌクレ
オチド配列に対応するアミノ酸配列を、第３図は実施例
１．で得られたｐＧＥＴ２中のｃＤＮＡの制限酵素地図
を、第４図はその一時構造（ヌクレオチド配列）を示す
。第５図は実施例２の構築図を、第６図は実施例３．の
構築図を表し、■部分はヒトＩｇＥ Ｈ鎖のポリペプチ
ドをコードする部分を示す。 第１図−（２） 第２図−（１） 第２図−（２） 第４図−（４） 川西市水明白１丁目１番地の５０ ・重分明者音田治夫 川西市多田院字順松２１番地の６
Claims (18)
- （１）第１図においてヌクレオチド配列８３１−１４８
５として示されるポリスクレオチドを含有するＤＮＡ。 - （２）第１図においてヌクレオチド配列４９０−８３０
として示されるポリヌクレオチドまたはその断片が、同
図にたいてヌクレオチド配列８３１−１４８５として示
されるポリスクレオチドの５′末端に連結されている特
許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - （３）第１図においてヌクレオチド配列８８−４８９と
して示されるポリヌクレオチドまたはその断片が、５′
末端に直結されている特許請求の範囲第２項記載のＤＮ
Ａ。 - （４）第１図においてヌクレオチド配列１−８７として
示されるポリヌクレオチドまたはその断片が５′末端に
連結されている特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ。 - （５）５′末端に読み取り枠が一致するようにＡＴＧを
有することを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第４項
記載のＤＮＡ。 - （６）第２図において、アミノ酸配列２７８−４９４と
して示されるポリペプチドをコードすることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - （７）第２図において、アミノ酸配列１６４−２７７と
して示されるポリペプチドまたはその断片が同図におい
てアミノ酸配列２７８−４９４として示されるポリペプ
チドのＮ末端に連結されているポリペプチドをコードう
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ
。 - （８）第２図において、アミノ酸配列３０−１６３とし
て示されるポリペプチドまたはその断片が特許請求の範
囲第７項記載のポリペプチドのＮ末端に連結されている
ポリペプチドをコードすることを特徴とする特許請求の
範囲第３項記載のＤＮＡ。 - （９）第２図において、アミノ酸配列１−２９そして示
されるポリペプチドまたはその断片が特許請求の範囲第
８項記載のポリペプチドのＮ末端に連結されているポリ
ペプチドをコードすることを特徴とする特許請求の範囲
第４項記載のＤＮＡ。 - （１０）Ｎ末端にＭｅｔを有するポリペプチドをコード
することを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第９項記
載のＤＮＡ。 - （１１）ヒト免疫グロブリンＥ−Ｈ鎖のポリペプチドと
同等の免疫額的もしくは生物学的活性を有するポリペプ
チドをコードすることを特徴とする特許請求の範囲第１
項〜第１０項記載のＤＮＡ。 - （１２）組み換えＤＮＡ分子の一部であることを特徴と
する特許請求の範囲第１〜第１１項記載のＤＮＡ。 - （１３）プロモーターの下流に連結されていることを特
徴とする特許請求の範囲第１項〜第１２項記載のＤＮＡ
。 - （１４）プロモーターがトリプトファンプロモーターで
あることを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載のＤ
ＮＡ。 - （１５）ヒト免疫グロブリンＥ−Ｈ鎖ポリペピチドをコ
ードするｍＲＮＡを逆転写することを特徴とする第１図
においてヌクレオチド配列８３１−１４８５として示さ
れるポリヌクレオチドを含有するＤＮＡの製造法。 - （１６）第１図にヌクレオチド配列８３１−１４８５と
して示されるポリヌクレオチドを含有するＤＮＡを有す
る組み換え体。 - （１７）大腸菌であることを特徴とする特許請求の範囲
第１６項記載の組み換え体。 - （１８）第１図においてヌクレオチド配列８３１−１４
８５として示されるポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ
を有する組み換え体を培養し、培養物中にヒト免疫グロ
ブリンＥ−Ｈ酸のポリペチドまたはこれと同等の免疫学
的もしくは生物学的活性を有するポリペプチドを生成蓄
積せしめ、これを採取することを特徴とするヒト免疫グ
ロブリンＥ−Ｈ鎖のポリペプチドまたはこれと同等の免
疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプチドの製
造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57156285A JPS5944399A (ja) | 1982-09-07 | 1982-09-07 | 新規ｄｎａ |
| EP83108699A EP0102634B1 (en) | 1982-09-07 | 1983-09-03 | Recombinant dna, microorganism transformed therewith and use thereof |
| AT83108699T ATE35427T1 (de) | 1982-09-07 | 1983-09-03 | Rekombinante dna, damit transformierter mikroorganismus und dessen verwendung. |
| DE8383108699T DE3377220D1 (en) | 1982-09-07 | 1983-09-03 | Recombinant dna, microorganism transformed therewith and use thereof |
| CA000436121A CA1218318A (en) | 1982-09-07 | 1983-09-06 | Dna coding for human immunoglobulin e h-chain, recombinant dna, microorganism transformed therewith and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57156285A JPS5944399A (ja) | 1982-09-07 | 1982-09-07 | 新規ｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5944399A true JPS5944399A (ja) | 1984-03-12 |
| JPH0446559B2 JPH0446559B2 (ja) | 1992-07-30 |
Family
ID=15624469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57156285A Granted JPS5944399A (ja) | 1982-09-07 | 1982-09-07 | 新規ｄｎａ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0102634B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5944399A (ja) |
| AT (1) | ATE35427T1 (ja) |
| CA (1) | CA1218318A (ja) |
| DE (1) | DE3377220D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985004673A1 (en) * | 1984-04-10 | 1985-10-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel dna and its use |
| JP2015514405A (ja) * | 2012-04-16 | 2015-05-21 | ウニヴェルズィテート シュトゥットガルト | 二重特異性を有する融合タンパク質産生のための共有結合したホモ二量体化モジュールとしてのＩｇＭおよびＩｇＥ重鎖ドメイン２ |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8308235D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| DE3485850T2 (de) * | 1983-11-08 | 1993-01-21 | Teijin Ltd | Genfragmente, abgeleitet vom menschlichen immunoglobulin-gen. |
| US4758511A (en) * | 1984-03-16 | 1988-07-19 | Dnax Research Institute Of Molecular And Cellular Biology, Inc. | CDNA clones coding for polypeptides exhibiting IGE binding factor activity |
| US5576195A (en) * | 1985-11-01 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Vectors with pectate lyase signal sequence |
| US5618920A (en) * | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
| GB8727045D0 (en) * | 1987-11-19 | 1987-12-23 | Research Corp Ltd | Immunoglobulin e competitor |
| DE69718150T3 (de) | 1996-03-01 | 2009-03-05 | Novartis Ag | Peptid-immunogene zur schutzimpfung gegen und behandlung von allergien |
-
1982
- 1982-09-07 JP JP57156285A patent/JPS5944399A/ja active Granted
-
1983
- 1983-09-03 EP EP83108699A patent/EP0102634B1/en not_active Expired
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985004673A1 (en) * | 1984-04-10 | 1985-10-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel dna and its use |
| JP2015514405A (ja) * | 2012-04-16 | 2015-05-21 | ウニヴェルズィテート シュトゥットガルト | 二重特異性を有する融合タンパク質産生のための共有結合したホモ二量体化モジュールとしてのＩｇＭおよびＩｇＥ重鎖ドメイン２ |
| US10875928B2 (en) | 2012-04-16 | 2020-12-29 | Universität Stuttgart | IgM and IgE heavy chain domain 2 as covalently linked homodimerization modules for the generation of fusion proteins with dual specificity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0102634A1 (en) | 1984-03-14 |
| JPH0446559B2 (ja) | 1992-07-30 |
| EP0102634B1 (en) | 1988-06-29 |
| ATE35427T1 (de) | 1988-07-15 |
| DE3377220D1 (en) | 1988-08-04 |
| CA1218318A (en) | 1987-02-24 |
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