FR2579222A1 - Sequence d'adn, vecteur, hote transforme et procede pour preparer un facteur de croissance de l'epiderme, et methode pour depiler un animal au moyen de ce facteur - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR PREPARER UN FACTEUR DE CROISSANCE DE L'EPIDERME (FCE). UNE SEQUENCE D'ADN QUI CODE UNE PROTEINE DE FUSION COMPRENANT UNE PROTEINE DE SUPPORT LIEE PAR UN RESIDU LYS A UN FCE OU ANALOGUE DE FCE NE CONTENANT PAS DE RESIDU LYS INTERNE ET POUVANT ETRE CLIVE DE LA PROTEINE DE FUSION PAR UNE PROTEASE SPECIFIQUE DE LYS EST INCLUSE DANS UN VECTEUR ET UN HOTE EST TRANSFORME PAR CE VECTEUR. LE PROCEDE CONSISTE A CULTIVER CET HOTE TRANSFORME POUR QUE LA PROTEINE DE FUSION SOIT EXPRIMEE ET A TRAITER CELLE-CI PAR UNE PROTEASE SPECIFIQUE DE LYS POUR LIBERER LE FCE OU ANALOGUE DE FCE. APPLICATION A LA DEPILATION D'ANIMAUX ET NOTAMMENT DE MOUTONS.
Description
La présente invention concerne la production de
facteur de croissance de l'épiderme (FCE).
La synthèse de gènes et l'expression dans des
microorganismes sont une technologie récente mais bien éta-
blie. Cependant, on observe en général que l'expression
directe de polypeptides courts, tels que des chaînes d'in-
suline, dans E. Coli est extrêmement inefficace. Cela est
principalement dû au fait que la protéolyse par les pro-
téases intracellulaires est rapide. Cependant, la cause en est également qu'il est nécessaire de construire un site
efficace de liaison de ribosomes et des séquences environ-
nantes à l'intérieur du gène qui soient compatibles avec la séquence aminoterminale désirée. Les règles présidant à l'efficacité de l'initiation de la translation ne sont pas
pleinement comprises. En outre, un codon initiateur de mé-
thionine est nécessaire et la méthionine N-terminale ne peut
pas-être efficacement éliminée par les mécanismes de syn-
thèse protéique de l'hôte, comme c'est par exemple le cas avec la somatotrophine, notamment aux taux d'expression
élevés.
Comme alternative à l'expression d'un polypeptide achevé, un gène de synthèse peut être soudé à une partie d'un gène correspondant à une protéine de l'hôte qui peut elle-même être exprimée à des taux élevés d'une manière
déterminable (EP-A-0 001 930). La protéine de fusion résul-
tante peut être bien stabilisée à l'encontre de la protéo-
lyse. Un polypeptide recherché peut ensuite être libéré par
un clivage enzymatique ou chimique spécifique.
FCE peut faire tomber la laine des moutons (GB-A-
2 082 186). Cependant, d'importantes quantités du facteur de croissance sont requises à cet effet, à une dose de 3 à mg par mouton. FCE peut être extrait des glandes sous- maxillaires de souris mâles adultes. Ce FCE murin (mFCE)
est un polypeptide à 53 résidus dont la structure fondamen-
tale est connue. Cependant, les quantités de mFCE que l'on
peut extraire par cette voie sont insuffisantes.
La-Demanderesse a maintenant découvert qu'une pro-
téine de fusion contenant un maillon de lysine (Lys) de liai-
son à mFCE peut être exprimées dans E. Coli et être clivée
par une protéolyse spécifique de Lys pour libérer le mFCE.
mFCE est dénué de Lys et est donc résistant aux protéases
spécifiques. Cette approche présente une applicabilité géné-
rale et permet la production de quantités bien plus grandes qu'il n'était possible d'en obtenir antérieurement de tout FCE ou analogue de FCE qui ne contient pas de résidu Lys interne. Plusieurs autres constructions de protéines de fusion qui ne procédaient pas par cette approche ont échoué
à produire mECE.
Selon la présente invention, il est proposé une séquence d'ADN codant une protéine de fusion comprenant une
protéine de support liée par un résidu Lys à un FCE ou ana-
logue de FCE, cet FCE ou analogue de FCE ne contenant pas de résidu Lys interne et pouvant être clivé de la protéine
de fusion par une protéase spécifique de Lys.
L'invention propose de plus un vecteur qui inclut
cette séquence d'ADN et qui est capable, dans un hôte trans-
formé, d'exprimer la protéine de fusion. Un hôte transformé
par un tel vecteur fait aussi partie de l'invention.
L'invention propose également un procédé pour pré-
parer un FCE ou analogue de FCE ne contenant pas de résidu Lys interne, ce procédé consistant à cultiver un tel hôte transformé de telle façon que la protéine de fusion soit
exprimée et à traiter la protéine de fusion par une pro-
téase spécifique de Lys pour libérer le FCE ou analogue de
FCE. Le FCE ou analogue de FCE ainsi obtenu peut être uti-
lisé pour dépiler un animal, notamment pour enlever la
laine d'un mouton, par administration à l'animal.
Une séquence d'ADN capable d'exprimer une protéine de fusion contenant un maillon Lys de liaison à un FCE ou analogue de FCE ne contenant pas Lys est présentée dans un vecteur,par exemple un plasmide. Les codons correspondant au résidu Lys et au FCE ou analogue de FCE sont présentés dans le même
cadre de lecture que les codons correspondant à la pro-
téine de support. Ces codons sont précédés d'un promoteur.
Un hôte est transformé par le vecteur. En général, l'hôte est un hôte bactérien tel que E. Coli. La protéine de fusion est exprimée par l'hôte. La Demanderesse a découvert qu'une séquence d'ADN
appropriée comprend un promoteur suivi par un gène de pro-
téine de support lié par un codon de Lys au gène correspon-
dant au FCE ou analogue de FCE, lequel est à son tour immé-
diatement suivi par un codon d'arrêt. On peut construire
cette séquence en construisant tout d'abord un gène synthé-
tique dans lequel le gène correspondant au FCE ou analogue
de FCE est immédiatement précédé d'un codon de Lys et immé-
diatement suivi d'un codon d'arrêt. On ligature ce gène synthétique avec une séquence d'ADN comprenant un promoteur pour la protéine de support et le gène de la protéine de support. De préférence, le gène de la protéine de support et le début du gène synthétique (l'extrémité portant le
codon de Lys) sont pourvus dans ce but d'extrémités appa-
riées adhérentes. La ligature est agencée de telle façon que les codons du gène synthétique soient dans le cadre
de lecture correct par rapport au promoteur et à la pro-
téine de support.
En variante, la protéine de fusion codée par une séquence d'ADN peut comprendre deux ou plusieurs séries à chaque fois d'un FCE ou analogue de FCE. Une série est liée à la suivante par un résidu Lys, de sorte que le traitement de la protéine de fusion par une protéase spécifique de Lys libère chaque FCE ou analogue de FCE. Pour cette forme de réalisation, on construit un gène synthétique dans lequel les séquences d'ADN codant chaque FCE ou analogue de FCE
sont reliées en cascade par des codons de Lys. Des répéti-
tions d'une séquence d'ADN correspondant à un FCE ou ana-
logue de FCE peuvent par conséquent être liées par l'inter-
médiaire de codons de Lys. On peut ensuite ligaturer un tel
gène synthétique avec une séquence d'ADN comprenant un pro-
moteur pour la protéine de support et le gène de la protéine
de support, comme ci-dessus.
I1 est important que le FCE ou analogue de FCE faisant partie de la protéine de fusion ne contienne pas de résidu interne de lysine. De préférence, FCE est mFCE. Les analogues de FCE sont des dérivés naturels ou synthétiques
de la famille des polypeptides ECE, qui contiennent une sé-
quence d'aminoacides (ou substituts d'aminoacides) efficace
pour régler la pousse des poils et notamment pour l'enlève-
ment de la laine des moutons. Les analogues de FCE peuvent par conséquent être des fragments d'un FCE, par exemple
mFCEl-45, mFCEl-47, mFCEl-48 ou mFCE1-51. De même, un ana-
logue peut contenir, à la place d'un résidu naturel d'amino-
acide, un résidu qui n'affecte pas la faculté de l'analogue à régler la pousse des poils et en particulier à agir comme
agent d'enlèvement de la laine pour le mouton.
On peut construire le gène synthétique par des
méthodes classiques. Les oligodésoxynucléotides du gène peu-
vent être synthétisés par une méthode manuelle en phase solide, par exemple semblable à celle décrite par Sproat et Bannwarth (1983). Ces oligodésoxynucléotides, excepté ceux
qui donnentles extrémités 5'-OH du gène assemblé, sont en-
suite totalement kinasés avec un excès de [y32P]-ATP et de
polynucléotide-kinase. On conduit les expériences de liga-
ture en utilisant différents sous-lots d'oligodésoxynucléo-
- tides, on purifie ensuite les intermédiaires ainsi obtenus, par exemple par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, et on les ligature ensuite ensemble pour former le gène synthétique dans lequel le gène du FCE ou analogue de FCE est intercalé entre un codon-Lys et un codon d'arrêt. Les méthodes employées peuvent être semblables à celles décrites
antérieurement par Smith et coll. (1982) et Edge et coll.
(1981). En général, le gène synthétique est muni d'extré-
mités adhérentes pour aider à la ligature dans un vecteur approprié. On transforme ensuite un hôte avec le vecteur
et sélectionne les colonies contenant le gène synthétique.
Le gène synthétique est ligaturé avec une séquence d'ADN comprenant un promoteur pour une protéine de support et le gène de la protéine de support. La séquence peut être un fragment séparé ou faire partie d'un vecteur. La séquence peut aussi inclure un opérateur et/ou un atténuateur selon le système d'expression qui est utilisé. On a utilisé une
partie d'un opéron Trp contenant le promoteur trp, l'atté-
nuateur et une partie du gène TrpE. Toutefois, le gène syn-
thétique peut être placé sous le contrôle de tout promoteur
procaryotique approprié. On peut utiliser un promoteur/opé-
rateur tel qu'un promoteur-opérateur tac.
La protéine de support doit former une protéine
de fusion qui ne soit pas susceptible de clivage protéoly-
tique sous l'action des protéases endogênes de l'hôte dans lequel est exprimée la protéine de fusion. Avantageusement, la majeure partie de la protéine de fusion est présente dans
l'hôte sous forme de corps d'inclusion. La protéine de sup-
port peut être ou non par elle-même une protéine complète.
Comme indiqué ci-dessus, on a utilisé une partie d'un opé-
ron Trp. Par conséquent, la protéine de fusion que l'on a obtenue était composée d'une partie de la protéine TrpE liée
à mFCE par l'intermédiaire d'un résidu Lys.
On peut préparer de toute manière appropriée un hôte, procaryotique ou eucaryotique, capable d'exprimer la protéine de fusion. Par exemple, on peut produire un vecteur d'expression pour la protéine de fusion en ligaturant le gène synthétique dans le cadre de lecture correct avec
le gène de la protéine de support qui est lui-même une par-
tie d'un fragment d'ADN comprenant un promoteur, et en pré-
sentant ce produit de ligature dans un vecteur approprié.
On utilise ensuite le vecteur pour transformer un hôte.
On cultive l'hôte dans des conditions propres à assurer l'expression de la protéine de fusion. La Demanderesse a découvert que le taux de production de la protéine de fusion peut être augmenté en augmentant le nombre de copies d'un plasmide qui exprime la protéine de fusion en utilisant un
plasmide thermosensible à nombre de copies illimité.
On obtient le FCE ou analogue de FCE en extrayant la protéine de fusion des cellules-hôtes et en la faisant
digérer avec une protéase spécifique de Lys. Le FCE ou ana-
logue de FCE est ainsi libéré et on peut le purifier, par exemple par chromatographie. Une protéase spécifique de Lys appropriée est l'endoprotéinase LysC qui clive les protéines
au niveau du groupe carboxyle de Lys (US-A-4 414 332).
On a obtenu l'endoprotéinase LysC comme suit. On a inoculé une culture inclinée d'une nuit de Lysobacter enzymogenes (ATCC 27796) et l'a cultivée dans des fioles à secousses de 500 ml contenant 0,25 % d'extrait de levure, 0,1 % de glucose, 1,0 % de tryptone-soja et MgCl2 1,OmM dans H20, en faisant tourbillonner à 25 C pendant 53 h. On
a recueilli le surnageant du produit de fermentation par-
centrifugation et obtenu l'endoprotéinase LysC comme décrit (US-A-4 414 332). Le pH final du produit de fermentation
était de 8-9, mais le pH n'a pas été particulièrement réglé.
Le FCE ou analogue de FCE qui est obtenu peut être
utilisé pour dépiler des animaux et en particulier pour en-
lever la laine des moutons. Le FCE ou analogue de FCE peut
être administré à un mouton par injection ou perfusion sous-
cutanée ou par administration à libération lente à partir d'une capsule implantée ou par voie orale. De préférence, on administre suffisamment du FCE ou analogue de FCE pour abaisser la force moyenne d'arrachage des fibres à 6 N/ktex ou moins, par exemple à 2-6 N/ktex. Des méthodes pour faire cette mesure sont décrites par A.J. Gordon dans Aust. J. of
Exp. Agric. Anim. Husb., 20, 40-49, et par Moore et coll.
dans Search., 12, 128-129. On administre typiquement 3 à
5 mg de FCE ou analogue de FCE à chaque mouton.
Les exemples non limitatifs suivants illustrent la présente invention en regard des dessins annexés sur lesquels: la figure 1 montre la séquence du gène Lys-mEGF de l'Exemple 1; la figure 2 montre la construction du Vecteur d'Expression pWRL500 de l'Exemple 2; la figure 3 montre la construction du Vecteur d'Expression pWRL505 de l'Exemple 5; et la figure 4 montre la construction du Vecteur
d'Expression pFCEtactrp2 de l'Exemple 6.
Exemple 1: Synthèse du gène Lys-mFCE et préparation d'un plasmide contenant ce gène On a conçu le gène Lys-mFCE comme le montre la figure 1. Le gène code la séquence des aminoacides de mFCE et une protéine de liaison, Leu-Lys. La protéine de liaison permet l'insertion du gène dans le site BglII qui comprend
le codon pour lle-323 dans un gène TrpE. Ceci permet l'ex-
pression d'une protéine de fusion composée de 378 résidus d'aminoacides, à partir de laquelle mFCE, qui est dénué de
résidus de lysine, peut être libéré par une protéase spéci-
fique de la lysine, l'endoprotéase LysC. Au bout de ce gène est placé un codon d'arrêt suivi d'un site de restriction EcoRI pour faciliter le clonage dans le site BamHI-EcoRI de pAT153.
Les codons sont choisis sur la base d'une utili-
sation préférentielle par E. coli dans des protéines forte-
ment exprimées (Grantham et coll., 1981; Gouy & Gautier, 1982). Un certain nombre de modifications sont faites pour éliminer des régions de complémentarité indésirable et des répétitions qui pourraient gêner la ligature correcte des segments d'oligodésoxynucléotide. Une longueur moyenne
de 21 résidus est choisie pour la synthèse des oligodésoxy-
nucléotides, étant donné que ceux-ci peuvent être efficace-
ment synthétisés et purifies et présenter de bons chevau-
chements pour une hybridation efficace avant ligature.
Les seize oligodésoxynucléotides FCE-3 à FCE-19 que montre la figure 1 sont synthétisés par une méthode manuelle en phase solide basée sur celle décrite par Duckworth
et coll. (1981) et Gait et coll. (1982), mais avec les modi-
fication suivantes, semblables à celles décrites par Sproat & Bannwarth (1983). Le désoxynucléosideen position 3'-terminale est relié par l'intermédiaire d'une portion 3'-O-succinamido à des perles de verre à pores réglés comportant des groupes
3-aminopropyle (taille de pores, 24 nm). Des sels de tri-
éthyl-ammonium des dinucléotides protégés sont préparés
selon la méthode de Chattopadhyaya & Reese (1979). Du mési-
tylène-sulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazole avec du N-méthyl- imidazole sont utilisés comme catalyseur (Efimov et coll., 1982) pour activer les diesters phosphoriques de mono- et di-désoxynucléotides à chaque étape de condensation. De l'acide trichloracétique à 10 % dans du l,l,ltrichloréthane est utilisé pour éliminer le groupe protecteur diméthoxytrityle à chaque cycle, pendant le temps minimum nécessaire tel
qu'estimé par la disparition de matière colorée (40-80 se-
condes). L'oligodésoxynucléotide protégé final est traité
avec de la 4-nitrobenzaldoxime etdela 1,1,3,3-tétraméthyl-
guanidine dans du dioxanne à 50 % pour séparer les groupes
2-chlorophényle protecteurs et pour séparer l'oligodésoxy-
nucléotide du support de verre. Des étapes d'élimination des protections sont ensuite effectuées avec de l'ammoniac et de l'acide acétique, comme décrit (Duckworth et coll.,
1981).
Les oligodésoxynucléotides sont purifiés par chromatographie d'échange d'ions en phase liquide à haute pression sur une colonne de Partisil SAX à 55 C dans du formamide à 30 % avec des gradients de KH2PO4 10-700mM et débarrassés des sels sur une colonne de Sephadex G25. Chaque
oligonucléotide est pur, comme le révèle une autoradiogra-
phie de la matière marquée au [E 32P]-phosphate séparée par électrophorèse sur gels à 15 % de polyacrylamide dans de
l'urée 8M.
A titre préparatif, les oligodésoxynucléotides FCE-3 à FCE-15 et FCE-18 sont phosphorylés au niveau de
leurs groupes 5'-hydroxyle au moyen de polynucléotide-
kinase et d'un excès de [ 32p]-ATP. Les ligatures sont con-
duites sur trois lots d'oligodésoxynucléotides: le lot E contenant 40 pmoles de FCE-17, 17,5 pmoles de chacun de FCE-3, FCE-4, FCE-5 et FCE-18 kinasés, et 20,4 pmoles de FCE-6 kinasé; le lot F contenant 20,4 pmoles de FCE-7 et FCE-11 kinasés, et 17,5 pmoles de chacun de FCE-8, FCE-9 et FCE-10 kinasés; le lot G contenant 20,4 pmoles de FCE-12 kinasé, 17,5 pmoles de chacun de FCE-13, FCE-14 et FCE-15, et 40 pmoles de FCE-16. Les oligodésoxynucléotides sont introduits dans des tubes de polypropylène dans un total de 15-18 p1 de H20 pour chaque mélange. Les tubes sont chauffés à 100 C pendant 2 minutes, puis laissés à refroidir lentement pendant une nuit dans un bain de 2 litres d'eau porté initialement à C et placé dans une enveloppe isolante. Les tubes sont
refroidis à 0 C, 15 p1 de tampon ligase avec 0,1 % de sérum-
albumine bovine (SAB) sont ajoutés à chacun, puis 1 1 de ligase T4-DNA de BioLabs. La ligature se fait pendant 1 h à 37 C. Les ADN produits sont précipités avec de l'alcool éthylique et les fragments d'ADN correctement dimensionnés sont purifiés par électrophorèse sur gel d'acrylamide à 12 % à rôle de séparation. Les produits des trois ligatures séparées sont mélangés et mis ensemble sous forme bicaténaire par chauffage à 100 C et refroidissement lent. Du tampon ligase avec 0,1% de SBA est ajouté, ainsi que 1 pl de T4-DNA. Après 1 heure
à 37 C, l'ADN est précipité avec de l'éthanol.
Ce produit est ligaturé dans le grand fragment EcoRI-BamHI de pAT153 à 7 C pendant une nuit, et le mélange final de ligature est utilisé pour transformer E. Coli K12
HB101. Des colonies résistantes à l'ampicilline sont sélec-
tionnées en fonction de leur sensibilité à la tétracycline, et les colonies sélectionnées sont étudiées par cartographie d'enzyme de restriction, en utilisant PstI + BstEII et EcorI + BamHI. Dans l'expérience effectuée, on a identifié dans 11 des 15 colonies testées les fragments attendus de 2700 et 790 paires de base (pb) dans le premier produit de digestion et de 3300 et 167 pb dans le dernier. Ces colonies
contenaient donc le plasmide désiré, dénommé pFCE6. La con-
firmation en a été faite au moyen d'une cartographie par HpaII, TagI et EcoRI. Les gènes FCE provenant de deux colonies
ont été complètement séquences par la technique de Maxam-
Gilbert (Maxam & Gilbert, 1980). Un isolat présentait la séquence correcte, tandis que l'autre contenait un seul changement de base qui n'affectait pas la séquence des aminoacides. Exemple 2: Construction d'un Vecteur d'Expression pour la protéine de fusion (partie de TrpE)-Lys-mFCE Le gène mFCE complet et les séquences avalsont
excisés de pFCE6 au moyen d'un produit de digestion BamHI-
PstI. Le plasmide pBRtrp, qui contient les gènes correspon-
dant à une partie de l'opéron Trp, est mis à digérer avec EcoRI et BglII, et le fragment contenant le promoteur trp, l'atténuateur et une partie du gène TrpE est isolé. Ces deux fragments sont ligaturés dans le grand fragment EcoRI-PstI
de pAT153 pour donner pWRL500 qui contient un gène corres-
pondant à une protéine de fusion (partie de TrpE)-Lys-mFCE, sous le contrôle du promoteur-opérateur Trp. Les longueurs des fragments utilisés pour construire pWRL500 sont: 2907 pb, Pst-EcoRI de pAT153 1210 pb, EcoRIBglII de pBRtrp 930 pb, Pst-BamHI de pFCE6
Les fragments sont ligaturés ensemble dans un seul mélange.
La construction de pWRL500 est représentée sur la figure 2.
Le plasmide pBRtrp est un dérivé de pBR322, le fragment HpaI-Hind III à 2, 08 kb de l'opéron tryptophanne de E. coli
codant le promoteur, le peptide conducteur et le gène struc-
tural de TrpE étant localisés entre les sites EcoRI et Hind III
de pBR322.
Le plasmide pWRL500 est utilisé pour transformer E. coli HB101. Les colonies sont sélectionnées en fonction
de leur résistance à l'ampicilline et à la tétracycline.
Les plasmides de 20 colonies sont étudiés par cartographie
des restrictions EcoRI et les plasmides contenant les frag-
ments attendus à 3660, 1220 et 167 pb sont encore caracté-
risés par digestion avec PstI + BstEII. pWRL500 donne les
fragments attendus à 790 et 4257 pb.
Exemple 3: Expression de la protéine de fusion (partie de TrpE)-Lys-mFCE Les E. coli portant pWRL500 sont amenés à produire
des taux élevés, estimés à environ 10 % des protéine cellu-
laires totales par examen d'électrophorégrammes sur gels de polyacrylamide teintés au bleu de Coomassie, de la protéine
de fusion, Mr 42 085, à la suite d'une privation de trypto-
phanne et d'une addition d'acide indole-acrylique. La struc-
ture de la région de liaison de la protéine de fusion et la séquence d'ADN à ce niveau sont comme suit: clivage par Endoprotéinase Lys- r FCE TrpE(1-320)-Ile-Glu-Ile-Leu-LysAsn-Ser-Tyr
ATT GAG ATC CTT AAG AAT TCT TAT
TAA CTC TAG GAA TTC TTA GA ATA
fusion EcoRI BglII/BamHI Exemple 4: Purification de mFCE (i) en utilisant des récipients de fermentation de 2 litres Les E. coli récoltées (à partir de 24 000 unités A600 de culture) sont brisées au moyen de lysozyme/EDTA et
par congélation-décongélation, ce qui est suivi d'un traite-
ment à l'ADNase. La majeure partie de la protéine de fusion
est présente sous forme de corps d'inclusion, comme le mon-
tre une analyse immunocytochimique au moyen de-protéine A-
or colloïdal pour mettre en évidence des molécules d'immuno-
globuline G anti-mFCE de lapin liées à la protéine de fusion dans des cellules fixées de E. coli, et elle se trouve dans le culot après centrifugation à 40 000 g pendant 1 heure à C. Le culot est homogénéisé dans de l'urée 8M, EDTA lmM, 2-mercaptoéthanol lmM, NH4HCO3 50mM, pH 8,3, et le mélange est dilué de 5 fois dans NH4HCO3 50mM. Le mélange opalescent est centrifugé comme ci-dessus et le surnageant, contenant
la majeure partie de la protéine de fusion, est mis à digé-
rer avec l'endoprotéinase LysC (0,75 U, de Boehringer Mannheim
GmbH) pendant 24 h à 37 C. Un supplément de 0,75 U de pro-
téase est ajouté et la digestion poursuivie pendant 3 jours.
Le produit de digestion est dialysé pendant 2 heures contre NH4HCO3 lmM, EDTA 0,2mM, pH 8, à 4 C, puis contre HCl 50mM, NaCl 0,1M, pendant 2 heures. Le mélange est centrifugé à
000 g pendant 10 minutes à 40C, et le surnageant est con- -
centré jusqu'à 15 ml dans un élément d'ultrafiltration de
Amicon avec une membrane UM2. La solution est chromatogra-
phiée sur une colonne (2,5 cm x 80 cm) de Bio-Gel P-10 dans HCl 50mM, NaCl 0,1M, et le pic de mFCE, qui est élué après le volume total de la colonne (Savage & Cohen, 1972), est recueilli. La solution est ajustée à pH 5,6 avec NH3 et concentrée à quasi-siccité. Le résidu est dissous dans NH4OAc
mM, ajusté à pH 5,6 avec de l'acide acétique, et chromato-
graphié sur DEAE-cellulose dans un gradient d'acétate d'am-
monium tampon à pH 5,6. Le premier pic élué après applica-
tion du gradient est constitué de mFCE; un second pic con-
tient un mélange de protéines très semblables à mFCE et pro-
bablement des produits de dégradation. Un test de recherche d'endotoxine (test limulus) révèle de très faibles quantités
(3,1 ng/mg de mFCE).
(ii) en utilisant une masse de fermentation de 200 litres Les cellules de E. coli récoltées sont traitées
par charges de 1 kg d'agglomérat de cellules tassées et con-
servées à -20 C jusqu'à utilisation. Les cellules décon-
gelées sont mises en suspension dans 1,5 litre de H20 et
brisées par addition de 50 mg de fluorure de phénylméthane-
sulfonyle dans 10 ml d'éthanol, 50 ml de Tris-base, 50 ml
de EDTA 0,5M, pH 8, 1 ml de 2-mercaptoéthanol, 5 ml de dé-
tergent NP40, 2-3 ml de NaOH SM, pour ajuster le pH à 8,5,
et 1 g de lysozyme, ce qui est suivi d'une incubation à 30 C.
pendant 2 heures. 5 ml de MgCl2 1M et 50 mg d'ADNase sont
ajoutés et l'incubation est poursuivie pendant 2 heures.
ml de EDTA 0,5M, pH 8, sont ajoutés. Le mélange est cen-
trifugé à 27 000 g pendant 45 minutes à 200C. Le culot est homogénéisé avec 1,25 litres de NH4HCO3 50mM, EDTA lmM,
2-mercaptoéthanol lmM (pH 8,3) et recueilli par centrifuga-
tion répétée. De l'urée est ajoutée à raison de 0,9 g/g de culot et le mélange est chauffé à 37 C et homogénéisé. La solution visqueuse limpide est diluée de 2 fois, clarifiée par centrifugation et encore diluée jusqu'à 5 litres avec NH4HCO3 50mM. 2,75 ml de disulfure de 2hydroxyéthyle et 12 U d'endoprotéinase LysC sont ajoutés et le mélange est
mis à incuber à 37 C pendant 3 jours. Ces conditions déter-
minent un clivage presque complet.
Le produit de digestion est amené à 15 % dans l'acétonitrile et ajusté à. pH 3,75. La majeure partie de
la matière polypeptidique dénaturée précipite et est reti-
rée par sédimentation et filtration, et mFCE est isolé du surnageant par chromatographie à phase inversée sur gel de silice Prep RP18 dans un gradient de 15-50 % d'acétonitrile dans de l'acide trifluoracétique à 0,1 %. Le mFCE brut est dilué, neutralisé et chromatographié sur DEAEcellulose
* comme ci-dessus, et le pic de mFCE est acidifié et chromato-
graphié sur Bio-Gel P-10. Le produit final est neutralisé, dialysé et lyophilisé. Le rendement est d'environ 15 % sur la base d'estimations de la teneur en protéine de fusion dans l'agglomérat bactérien; on obtient environ 200 mg de mFCE. (iii) analyse de pureté Une chromatographie en phase liquide à haute pression par échange d'ions et à phase inversée du mFCE
indiquent une pureté supérieure à 85 %. L'analyse des amino-
acides et les résultats de cartographie peptidique sont en
accord avec la structure de mFCE.
Exemple 5: Construction d'un autre Vecteur d'Expression
pour la protéine de fusion (partie de TrpE)-
Lys-mFCE
Afin d'augmenter les taux d'expression de la pro-
téine de fusion, le gène (partie de TrpE)-Lys-mFCE est trans-
féré de pWRL500 à un vecteur thermosensible à nombre de co-
pies illimité, pMMl (Wong et coll., 1982). Ceci est repré-
senté sur la figure 3. Le fragment de 3,2 kb dérivé par digestion par BamHI et PstI du plasmide pMMl, contenant l'origine de réplication, est ligaturé avec pWRL500 digéré
par BamHI-PstI. E. coli HB101 est transformé avec le pro- duit de ligature et les colonies résistantes à l'ampicilline sont
sélectionnées en fonction d'une croissance à 30 C mais non à 42 C. Les colonies contenant le pWRL505 correctement formé sont identifiées par cartographie de restriction au
moyen de BamHI et PstI.
E. coli transformée par pWRL505 est développée à WC dans des milieux au glucose minimal avec des acides
aminés de caséine jusqu'à A600 = 1. La température est por-
tée à-37 C pendant 2 heures, ce qui augmente de plusieurs
fois le nombre de copies du plasmide, et de l'acide indole-
acrylique est ajouté pour provoquer l'expression à partir du promoteur Trp. Après 6 heures supplémentaires à 30"C, l'expression de (partie de TrpE)-Lys-mFCE atteint des taux d'environ 20 % des protéines cellulaires totales. Le mFCE est purifié comme décrit à l'Exemple 4-(ii) et sa pureté
est semblable à celle décrite à l'Exemple 4-(iii).
Exemple 6: Expression de la protéine de fusion (partie de
TrPE)-Lys-mFCE sous le contrôle du promoteur-
opérateur tac L'expression de protéine à taux élevés à partir
du promoteur trp nécessite une privation de tryptophanne.
L'expression de protéines contenant du tryptophanne, telles
que mFCE, n'est censément pas optimale dans ces conditions.
Le promoteur tac (de Boer et coll., 1983) peut être induit par l'isopropyl-3-D-thiogalactoside (IPTG) dans des milieux riches en acides aminés, et des taux élevés d'expression mieux reproductibles peuvent être escomptés. Le promoteur tac de ptac 12 (Amann et coll., 1983) est par conséquent utilisé pour construire un plasmide, pFCEtactrp2, capable d'exprimer une protéine de fusion comprenant mFCE lié par l'intermédiaire d'un résidu Lys à une partie de la protéine TrpE. La construction de pFCEtactrp2 est représentée sur la
figure 3.
pWRL500 de l'Exemple 2 est soumis à une digestion partielle par EcoRI pour réorienter le promoteur trp et le gène de la protéine de fusion. Le plasmide résultant est pFCEtrpl. Ce plasmide contient un site de reconnaissance
de BstXl à la base 80 de la séquence codant TrpE. Le promo-
teur trp de pFCEtrpl s'étendant jusqu'à ce site de recon-
naissance de BstXl du gène TrpE est remplacé par une séquence comprenant le promoteur tac de ptac 12 jusqu'à la base 80
de la séquence codant TrpE comme indiqué ci-après. Les sé-
quences de Shine-Dalgarno, les séquences de liaison de ribo-
somes, sont marquées SD. Le plasmide résultant, pFCEtactrpl,
est soumis à une digestion partielle par EcoRI pour réorien-
ter le promoteur tac et le gène de la protéine de fusion
pour obtenir pFCEtactrp2.
Séquence dela structure du promoteur tac utilisé pour l'ex-
pression de protéines de fusion dans pFCEtactrpl et 2
TTCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATC
40 60
-35 MetA
GGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTTATGA
100 120
-10 SD
snLeuGlyProAsnLysIleArgGluxxx MetGln..mTrpE
ATTTGGGCCCGAACAAAATTAGAGAATAACAATGCAA
SD E. coli K12 JM105 (Yanisch-Perron et coll. 1985) est transformé avec pFCEtactrp2. La souche est développée dans un milieu riche dans un fermenteur de 2 litres à 300C
et induite avec IPTG à D.O.650 = 1,0. Une analyse densito-
métrique d'électrophorégrammes sur gels de SDA-polyacryla-
mide teintés au bleu de Coomassie révèle que 38 % des pro-
téines cellulaires totales sont constitués de protéine de fusion (partie de TGrpE)-Lys-mFCE. Le mFCE est obtenu et purifié conformément à l'Exemple 4-(i) et sa pureté est
semblable à celle décrite à l'Exemple 4-(iii).
Références
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Yanish-Perron et coll. (1985) Gene 33, 103-119.
Claims (18)
1. Séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle code une protéine de fusion comprenant une protéine de support
liée par un résidu Lys à un facteur de croissance de l'épi-
derme (FCE) ou analogue de FCE, cet FCE ou analogue de FCE ne contenant pas de résidu Lys interne et pouvant être clivé
de la protéine de fusion par une protéase spécifique de Lys.
2. Séquence d'ADN selon la revendication 1, carac-
térisé en ce que le FCE ou analogue de FCE est un FCE murin
(mFCE), mFCEl-45, mFCE1-47, mFCE1-48 ou mFCE1-51.
3. Séquence d'ADN selon la revendication 1 ou 2,
caractérisée en ce que le FCE ou analogue de FCE est immé-
diatement suivi d'un codon d'arrêt.
4. Séquence d'ADN selon la revendication 3, carac-
térisée en ce qu'elle inclut la séquence d'ADN suivante: (Lys) (mFCEl)
G ATC CTT AAG AAT TCT TAT CCG GGT TGT CCG TCT TCT
(10) (20)
TAC GAC GGT TAC TGC CTG AAC GGT GGT GTT TGC
(30)
ATG CAC ATC GAA TCT CTG GAC TCT TAC ACT TGC
(40)
AAC TGC GTT ATC GGT TAC TCT GGT GAC CGT TGC CAG
(50) (ARRET)
ACT CGT GAC CTG CGT TGG TGG GAA CTG CGT TAA GG
5. Séquence d'ADN selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la protéine de fusion comprend deux ou plusieurs séries à chaque fois dudit FCE ou analogue de FCE.
6. Séquence d'ADN selon la revendication 5, carac-
térisé en ce qu'elle comprend des répétltions d'une séquence
d'ADN dudit ECE ou analogue de FCE, reliées en cascade.
7. Séquence d'ADN selon l'une quelconque des re-
vendications précédentes, caractérisée en ce que la protéine
de support est une partie de la protéine TrpE.
8. Vecteur caractérisé en ce qu'il inclut une séquence d'ADN telle que revendiquée dans l'une quelconque
des revendications précédentes et en ce qu'il est capable,
dans un hôte transformé, d'exprimer ladite protéine de fusion.
9. Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide.
10. Vecteur selon la revendication 8 ou 9, carac-
térisé en ce qu'il inclut l'opéron Trp de sorte que l'expres-
sion de la protéine de fusion est sous le contrôle du promo-
teur-atténuateur trp et que la protéine de support est une
partie du gène TrpE.
11. Vecteur selon la revendication 8 ou 9, carac-
térisé en ce que l'expression de la protéine de fusion est
sous le contrôle du promoteur-opérateur tac.
12. Hôte caractérisé en ce qu'il est transformé par un vecteur tel que revendiqué dans l'une quelconque des
revendications 8 à 11.
13. Hôte transformé selon la revendication 12,
caractérisé en ce que cet hôte est une souche de E. coli.
14. Procédé pour préparer un FCE ou analogue de FCE ne contenant pas de résidu Lys interne, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un hôte transformé tel que revendiqué dans la revendication 12 ou 13 de telle façon que ladite protéine de fusion soit exprimée et à traiter la protéine de fusion par une protéase spécifique de Lys pour
libérer le FCE ou analogue de FCE.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la protéase spécifique de Lys est l'endoprotéinase LysC.
16. Méthode pour dépiler un animal, caractérisée en ce qu'elle consiste à administrer à l'animal un FCE ou analogue de FCE ayant été obtenu par un procédé tel que
revendiqué dans la revendication 14 ou 15.
17. Méthode selon la revendication 16, caractérisée
en ce que le FCE ou analogue de FCE est utilisé pour enle-
ver la laine d'un mouton.
18. Méthode selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'il est administré au mouton suffisamment de FCE
ou analogue de FCE pour abaisser la force moyenne d'arra-
chage des fibres à une valeur de 2 à 6 N/ktex.
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