CZ282867B6 - Expresní vektory pro zvýšenou produkci polypeptidů, plasmidy obsahující tyto vektory, hostitelé obsahující tyto plasmidy, získané produkty a související způsoby - Google Patents

Abstract

Vektor, který po zavedení buňky vhodného bakteriálního hostitele, obsahující termolabilní represor C.sub.I.n., vyvolá po zvýšení teploty hostitelské buňky na 42.sup.o.n.C, kdy je represor inaktivován, expresi genu, vloženého do vektoru, a produkci polypeptidu, kodovaného tímto genem, obsahující dvouvláknovou molekulu DNA, která ve směru 5' -> 3' obsahuje: promotor a operátor P.sub.L.n.O.sub.L .n. z bakteriofágu lambda, místo využití N pro navázání antiterminátorového N proteinu, produkovaného hostitelskou buňkou, sekvenci DNA, obsahující místo vazby ribosomů, pro navázání mRNA genu na ribosomy hostitelské buňky, kde místo vazby ribosomů je: (i) mutační ribosomové vazebné místo C.sub.II.n. z bakteriofágu lambda o sekvenci TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGA nebo (ii) syntetický oligonukleotid o sekvenci TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA nebo (iii) z převažujícího hlavního proteinového genu bakteriofágu lambda a má sekvenci TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC, iniciační kŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká expresních vektorů pro produkci polypeptidů, plasmidů obsahujících tyto vektory, hostitelů obsahujících tyto plasmidy, získaných produktů a souvisejících způsobů.

Dosavadní stav techniky

Jedna z oblastí genetického inženýrství se zabývá zaváděním cizích sekvencí DNA, odvozených z eukaryotických zdrojů, do Escherichia coli nebo jiných mikroorganismů. Navazující oblastí genetického inženýrství je produkce polypeptidů, kódovaných cizí DNA, pomocí takto získaných mikroorganismů. Produkci polypeptidů je možno považovat za dvoustupňový proces, ve kterém každý stupeň zahrnuje četné další kroky. Uvedené dva stupně jsou transkripce a translace. Aby bylo možno polypeptidy produkovat účinně a ve velkém množství, musí být účinné oba stupně procesu. Transkripce je produkce mRNA z genu (DNA). Translace je produkce polypeptidů z mRNA.

Kritickým krokem transkripčního procesu je iniciace, tj. vazba RNA-polymerasy v oblasti promotor-operátor. Sekvence desoxyribonukleotidových bází, které tvoří oblast promotoru, se může měnit, a tak ovlivňovat relativní účinnost promotoru. Účinnost závisí na afinitě RNApolymerasy k promotoru.

Účinnost translace je ovlivňována stabilitou mRNA. Zvýšená stabilita mRNA umožňuje lepší translaci. Ačkoli exaktní determinanty stability mRNA nejsou přesně známy, je známo, že určitou roli z hlediska stability hraje sekundární struktura mRNA, určovaná sekvencí bází.

První krok translace spočívá ve vazbě ribosomu k sekvenci bází mRNA, označované jako Shineova-Delgamova sekvence nebo místo vazby ribosomů (RBS). Synthesa polypeptidů začíná tak, že ribosom migruje podél mRNA k startovacímu kodonu AUG, kde dochází k translaci. Tento kodon se obvykle nachází přibližně 10 bází za Shineovou-Dalgamovou sekvencí. Mezi faktory, které zvyšují účinnost translace, patří ty, které podporují vazbu ribosomu k ShineověDalgamově sekvenci. Zjistilo se, že rozhodující roli při stanovení účinnosti translace hraje jak sekundární struktura mRNA v oblasti Shineovy-Dalgamovy sekvence a kodonu AUG, tak vzdálenost mezi Shineovou-Dalgamovou sekvencí a kodonem AUG. Dalšími faktory, které ovlivňují účinnost translace, jsou předčasná terminace a zeslabení. Účinnost translace lze zlepšit odstraněním zeslabovacích míst.

Překážka, na kterou narážejí pokusy o výrobu velkých množství eukaryotických polypeptidů v bakteriálních buňkách, spočívá v neschopnosti buněk, produkujících velké množství mRNA, účinně růst. Tento problém lze odstranit tak, že se zabrání transkripci postupem zvaným represe. Při represi se geny blokují působením inhibičního proteinu (represoru), který· zabraňuje transkripci tak. že se váže na operátor. Poté, co mikroorganismy dorostou na požadovanou hustotu buněk, blokované geny se aktivují destrukcí represoru nebo přídavkem molekul zvaných induktory, které ruší efekt represorů.

V literatuře je možno nalézt četné práce, zabývající se klonováním eukaryotických genů v plasmidech obsahujících promotor P_L z bakteriofágu λ (Bernard, Η. V. a d., Gene (1979) 5, 59, Derom, C. ad., Gene (1982) 17, 45, Gheysen, D. ad., Gene (1982) 17, 55, Hedgpeth, J. ad.,

- 1 CZ 282867 B6

Mol. Gen. Genet. (1978) 163, 197. Remaut, E. ad. Gene (1981) 15, 81 aDerynck, R., ad., Nátuře (1980) 287, 193). Evropská patentová přihláška, č. 041.767, zveřejněná 16.12.1981, popisuje expresní vektory, obsahující promotor P_L z bakteriofágu λ. Žádná z uvedených publikací však nepopisuje použití místa vazby ribosomů Cn5

Bylo popsáno použití vektoru, obsahujícího promotor P_L z bakteriofágu λ a místa vazby ribosomů Cu (Oppenheim, A. B. a d., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327 a Shimatake, H. a Rosenberg, M., Nátuře (1981) 292, 128). Tyto publikace popisují produkci zvýšeného množství proteinu C_n, avšak nezabývají se produkcí eukaryotických proteinů.

Shatzman a Rosenberg předvedli v r. 1982 na 14. Zimním symposiu v Miami panel (Shatzman, A. R. a Rosenberg, M., 14 Miami Wintvvr Symposium, anotace str. 98 (1982)). Tato anotace obsahuje neinstruktivní popis použití vektoru obsahujícího P_L z bakteriofágu λ, Nut a místa vazby ribosomů Cn k synthese eukaryotického polypeptidu (antigen SV40t), není ve 15 skutečnosti eukaryotický polypeptid, ale virový protein) v množství větším než 5 % buněčného proteinu v nejmenovaném bakteriálním hostiteli. Použitý operátor není definován. Rovněž není identifikován původ replikace ani gen pro selektivní fenotyp. Tento systém, používající vektor, je popisován jako systém obsahující určité hostitelské lysogeny, do nichž je možno vektor stabilně transformovat. Jedno z provedení našeho vynálezu, a sice pMGlOO, může být v určitých 20 rysech tomuto vektoru podobné. Netransformuje se však do hostitelského lysogenu, ale spíše do vhodných hostitelských kmenů E. coli, které obsahují termolabilní represor C[ a gen N, ale z kterých byl odstraněn zbytek lysogenu. Kromě toho byl použit k produkci analogů hovězího (bGH) a lidského (hGH) růstového hormonu v množstvích, převyšujících 20 % celkového buněčného proteinu.

V dalších provedeních našeho vynálezu se kromě toho používají místa vazby ribosomů, která se liší od Cn- Dále u vektoru pND5 a jeho derivátů, které jsou v současné době nej výhodnější, byly odstraněny nepodstatné sekvence za vzniku vektoru, umožňujícího produkci polypeptidů v množství více než o 10 % vyšším než u pMGlOO.

V nedávné době se přihlašovatel dozvěděl o existenci patentové přihlášky USA na jméno M. Rosenberga, podané pod č. 457 352 National Institutes of Health, Dept. of Health and Human Services, USA. Části této přihlášky byly získány z Národní technické informační služby (Dept. of Commerce. USA), avšak nároky nejsou dostupné a jsou udržovány v tajnosti. Dostupné části byly zhodnoceny a bylo zjištěno, že jsou neinstruktivní. Uvádějí, že hostitel je důležitý (str. 8, ř.

17), avšak neuvádějí žádného vhodného hostitele. Závisí dále na použití mutanty λ, která není specifikována (str. 4, ř. 20). Uvádějí, že hostitel obsahuje lysogeny (str. 8, ř. 18) na rozdíl od našeho vynálezu, kde hostitel není lysogenní. Zmiňují se o klonování a expresi eukaryotického genu, opičího metallothioneinového genu (str. 7, ř. 18), avšak neuvádějí podrobnosti. Uvádějí, že 40 ani sekvence, ani poloha žádného nukleotidu v oblasti vazby ribosomů Cn neby la změněna (str. 3, ř. 27). U našeho vy nálezu je taková alterace možná.

Známý stav techniky nezahrnuje: úspěšnou expresi hovězího nebo lidského růstového hormonu vektorovým systémem obsahujícím P_L-Cn, produkci biologicky účinných analogů bGH nebo 45 hGH, komposice obsahující takové analogy nebo jejich použití, indukční metody pro dosažení produkce polypeptidů v množství větším než 20 % celkové produkce proteinu hostitelem.

Jediná známá práce, týkající se produkce analogů bGH hostiteli transformovaným vektory metodou genetického inženýrství, se zabývá použitím promotoru Trp k produkci analogu bGH, 50 který má na N-konci feny lalaninové formy přírodního bGH aminokyselinu Met (Seeburg, P. H. ad., DNA (1983) 2, 37).’

-2CZ 282867 B6

Jediná známá práce, týkající se produkce analogů hGH hostiteli transformovanými vektory metodou genetického inženýrství, se zabývá použitím promotorů Lac a Trp k produkci analogu hGH, která má na N-konci přírodního hGH aminokyselinu Met (Goedell, D. V. a d., Nátuře (1979)281,544).

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je expresní vektor, který po zavedení do buňky vhodného bakteriálního hostitele, zejména Escherichia coli, obsahujícího termolabilní represor C[, umožňuje, aby hostitelská buňka po zvýšení teploty na teplotu destrukce represoru, tj. 42 °C, uskutečnila expresi požadovaného genu vloženého do vektoru a produkci polypeptidu, kódovaného genem, obsahující dvouvláknovou molekulu DNA, která ve směru 5' -> 3' obsahuje:

promotor a operátor P_LO_L z bakteriofágu lambda, místo využití N pro navázání antiterminátorového N proteinu, produkovaného hostitelskou buňkou, sekvenci DNA, obsahující místo vazby ribosomů, které umožňuje mRNA požadovaného genu, aby se navázala na ribosomy hostitelské buňky, kde místo vazby ribosomů je:

(i) mutační ribosomové vazebné místo Cn z bakteriofágu lambda o sekvenci

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA nebo (ii) syntetický oligonukleotid o sekvenci

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA nebo (iii) z převažujícího hlavního proteinového genu bakteriofágu lambda a má sekvenci

TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC, iniciační kodon ATG a oblast restrikčních enzymů pro vložení požadovaného genu do vektoru ve fázi s iniciačním kodonem ATG, a dále zahrnuje sekvenci DNA, obsahující původ replikace z bakteriálního plasmidu pBR322, schopného autonomní replikace v hostitelské buňce, a sekvenci DNA, obsahující gen, spojený se selektabilním nebo identifikovatelným fenotypickým rysem, který je manifestován, je-li vektor přítomen v hostitelské buňce. Výhodnými vektory jsou pMGlOO a pND5.

Geny, tj. cDNA. které kódují požadované polypeptidy, jako jsou růstové hormony, například hovězí, vepřový, kuřecí nebo lidský růstový hormon, superoxid-dismutasa, apoprotein E, virový protein 1 viru slintavky a kulhavky, protein A ze S. aureus, interleukin III, enzym nebo jeho analogy, mohou být vloženy do oblasti restrikčních enzymů vektoru, kde se vytvoří plasmidy.

-3 CZ 282867 B6

Plasmidy pak mohou být zavedeny do vhodných hostitelů, kde mohou být exprimovány geny a produkovány požadované polypeptidy. Výhodnými plasmidy pro gGH je pRec 2/3 apROll, pro hGH je to pTV 18(1) a pTV 104(2). Vhodnými hostiteli jsou Escherichia coli A1637, A1645, A2606 a A1563; v současné době se dává přednost A1637.

Získaný systém hostitel-vektor může být použit k produkci polypeptidů. Hostitelské buňky, obsahující plasmidy, se pěstují za vhodných podmínek, umožňujících produkci polypeptidů, a vzniklý polypeptid se isoluje. V současné době se považuje za výhodné kultivovat buňky 10 až 30, zejména 15 minut při asi 42 °C a pak při asi 37 až 39 °C po takovou dobu, aby celková doba kultivace činila asi 60 až 90 min; výhodné je kultivovat asi 75 min při 38 až 39 °C. Za výhodné růstové médium se v současné době považuje hydrolysát laktalbuminu s přídavkem glukosy nebo infuse mozkové dřeně.

S použitím systémů hostitel-vektor byly připraveny analogy bGH a hGH. Tyto analogy mohou být vpraveny do veterinárních, resp. farmaceutických komposic. Příslušné analogy mohou být použity přímo nebo v uvedených komposicích ke stimulaci produkce mléka nebo masa u hovězího dobytka nebo k léčbě nedostatku lidského růstového hormonu.

K bližší ilustraci vynálezu slouží připojené výkresy, jejichž význam je následující:

Obr. 1. Konstrukce expresního vektoru pMGlOO. Tento plasmid se buduje zavedením fragmentu DNA z fágu λ. nacházejícího se mezi restrikčními místy HaelII (poloha 38150) a Sau3a (poloha 38362). do DNA plasmidu pKC30, štěpené pomocí Hpal a BamHl. Fragment HaeIII-Sau3a nese nut_R, t_RI. cy’ a místo vazby ribosomů proteinu Cn (C_n-RBS). Subklonováním DNA, obsahující Cn-RBS. do pKC30 se vytvoří pMGlOO, obsahující jediné restrikční místo BamHl přímo za iniciačním kodonem ATG Cn-RBS a jedno restrikční místo Ndel v tripletu ATG (spodní zavedení). Čísla v závorkách označují polohu restrikčních míst v DNA fágu λ.

Obr. 2. Konstrukce plasmidu pRec 2/3. Plasmid D₄, obsahující cDNA z bGH, se digeruje Haell. Získaný fragment o 1600 párech bází (1600 bp) se čistí a podrobí se digeraci po dobu 5 min při 37 °C s 5 jednotkami Sl exonukleasy. Ligací se připojí synthetický linker EcoRl o sekvenci

GGAATTCC

CCTTAAGG

Produkt se štěpí pomocí EcoRl a zavede se do pBR322, který byl štěpen pomocí EcoRl. Isoluje se klon pALRl, který štěpením pomocí EcoRl uvolní fragment 1200 bp o sekvenci

AATTCCCA....

GGGT....

na 5' konci. Vznik této sekvence potvrzuje, že pALRl obsahuje restrikční místo EcoRl, které nese kodon TTC pro zbytek č. 1 (fenylalanin) autentického bGH. pALRl se podrobí částečnému štěpení pomocí Pstl. K výluhu se připojí ligací HindlII a štěpí se pomocí EcoRl a HindlII. Fragment obsahující cDNA z bGH se isoluje a subklonuje do pBR322 mezi restrikčními místy EcoRl a HindlII za vzniku pAL500. Subklonovaný fragment bGH cDNA se pak pomocí EcoRl a HindlII vyřízne z pAL500, naplní fragmentem DNA polymerasy Klenow a zavede do expresního vektoru pMGlOO (obr. 1), otevřeného v místě BamHl a rovněž stejně naplněného. Získaný vektor pREC 2/2 vyjadřuje modifikovaný bGH, který je na aminokonci pozměněn takto:

Met AspG lnPhe¹ Pro²......bGH

Plasmid pREC 2/2 se digeruje Pstl a isoluje se fragment obsahující na 5' konci genu bGH promotor P_L (označuje se jako fragment A). Tento fragment se ligací připojí k fragmentu Pstl z pAL500 (označovanému jako fragment B) Takto získaný vektor pRec 2/3 vyjadřuje modifikovaný bGH, který je na aminokonci pozměněn takto:

MetAspGlnPhe'Pro²......bGH

Obr. 3. Konstrukce expresních vektorů pND5. pND55 a pROl 1. Plasmid pOG7 (Oppenheim, A., Gottesman, S. a Gottesman, M., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327) se štěpí pomocí Ndel. Konce velkého fragmentu, nesoucí promotor P_L nut_L, t_R aCn-RBS, se spojí za vzniku expresního vektoru pND5. DNA tohoto vektoru se otevře pomocí Ndel. Zavedením toho fragmentu Ndel z pRec 2/3 (obr. 2), který obsahuje bGH cDNA, vznikne plasmid pROl 1, který se zdá být lepším expresorem modifikovaného bGH, popisovaného na obr. 2, než pRec 2/3. Zavedením synthetických linkerů o sekvenci

TATGAGCTCA ACTCGAGTAT do pOG7, štěpeného Ndel, vznikne expresní vektor pND55, který obsahuje jediné restrikční místo Sací před ATG. §těpí-li se pND55 pomocí Sací a podrobí působení fragmentu Klenow DNA polymerasy. vznikne iniciační kodon ATG, který následuje po promotoru P_L aCu-RBS. Tento vektor je vhodný pro vyjádření různých eukaryotických genů bez iniciačního kodonu ATG.

Obr. 4. Konstrukce pTV 18(1) a pTV 104(2). Plasmid pTVHGH se připraví klonováním cDNA obsahující kód hGH do pBR 322 v místě HindlII standardním způsobem (Meth. Enzymol. (1979) 68, 75). Vzniklý plasmid se digeruje HindlII. Získaný fragment s 800 páry bází se čistí a dále digeruje FnuDII a naplní fragmentem Klenow DNA polymerasy. Toto zpracování odstraňuje kodony pro prvních 16 aminokyselin hGH. Získaný fragment DNA se spojí se synthetickým linkerem, který· obsahuje kodony pro sekvenci hGH od Met¹⁴ a regeneruje restrikční místo Ndel před kodonem ATG pro Met¹⁴. Po zpracování Ndel se tato semisynthetická DNA zavede do vektoru pND5, otevřeného pomocí Ndel. Získaný plasmid pTV 18(1) vyjadřuje hGH pod kontrolou promotoru P_L. Je to analog hGH, postrádající prvních 13 zbytků aminokyselin a mající na N-konci Met¹⁴.

Plasmid pTV 18(1) se částečně digeruje Ndel a spojí se synthetickým linkerem, který obsahuje kodony pro aminokyseliny hGH č. 1 až 13:

TATGTTCCCAACCATTCCATATCCCGTCTGTTCGACAACGC ACAAGGGTTGGTAAGGTAATAGGGCAGACAAGCTGTTGCGAT

Tento linker je rovněž komplementární k místu Ndel v pTV 18(1) a umísťuje kompletní gen hGH do fáze s iniciačním kodonem ATG expresního vektoru pND5 (obr. 3). Získaný plasmid pTV 104(2) tak vyjadřuje nativní hGH s methioninem navíc na N-konci.

Obr. 5 zobrazuje vektor pAL Trp 46, který obsahuje promotor Trp a prvních 7 aminokyselin genu Trp E transkripčně převedených do genu β-galaktosidasy.

Obr. 6, 7 a 8 ukazují řadu expresních vektorů (Tac) obsahujících část promotoru Trp a operátoru Lac, následovanou restrikčními místy pro zavedení požadovaného genu a expresi bGH pod kontrolou promotoru Tac.

-5CZ 282867 B6

Obr. 9 a 10 ukazují expresní vektory obsahující bGH cDNA pod kontrolou histidinového promotoru.

Obr. 11 ukazuje zavedení genu bGH do expresního vektoru pod kontrolou promotoru Lac.

Obr. 12 představuje expresi genu bGH pod kontrolou promotoru Omp F.

Obr. 13. Konstrukce Met⁴-bGH-analogu pAL401 a expresních vektorů pND6 apNDll s pozměněnými restrikčními místy. pAL401, který vyjadřuje modifikovanou formu bGH, ve které chybějí na aminokonci bGH první tři aminokyseliny (Met⁴ bGH), se konstruuje trojitou ligací:

a) fragmentu DNA bGH o 623 párech bází s PvuII a HindlII vyříznutým z pAL500

b) linkeru, vzniklého synthesou dvou vláken DNA, která se po vyčištění ustálí ve formě

CCATATGTCCTTGTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCT GCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTGGTCGACG naplněného fragmentem Klenow DNA polymerasy a pak štěpeného Ndel a PvuII za vzniku fragmentu o 58 párech bází, který se isoluje a čistí

c) pNDll, který se připraví takto: Expresní vektor pOG7 se alteruje eliminací HindlII a jednoho z míst Ndel (vzdáleného od iniciačního kodonu ATG) za vzniku pND6. Pak se linkery HindlII zavedou do místa Sáli za vzniku pNDl 1.

Obr. 14. Konstrukce autentického bGH. modifikovaného na aminokonci methioninem, a různých analogů bGH.

a) Plasmid pAL401 se podrobí působení Ndel.

V místě Ndel se ligací připojí synthetický DNA linker, obsahující iniciační signál ATG a kód pro první tři aminokyseliny na aminokonci nativního bGH. Získaný vektor pAL601 vede k expresi nativního bGH obsahujícího na aminokonci navíc methionin.

b) Postupem podle a), avšak modifikací struktury oligodesoxyribonukleotidového linkeru, se konstruuje skupina vektorů, kódujících řadu modifikovaných hovězích růstových hormonů. Modifikované růstové hormony začínají na N-konci methioninem, v polohách 1 a 2 mají kterékoli z dvaceti v přírodě se vyskytujících aminokyselin a v poloze 3 kteroukoli z dvaceti přírodních aminokyselin kromě Glu, Gin, Lys, Met nebo Trp. Od polohy 4 do karboxylového konce je sekvence identická s nativním bGH.

Obr. 15. Tibiální test. Obrázek ukazuje srovnání vlivu analogu bGH pRec 2/3 a autentického bGH na růst kostní destičky hypofysektomisovaných krys.

Vektor podle vynálezu umožňuje dosažení vyšších hodnot exprese genů a polypeptidů. Jedná se o dvouvláknovou molekulu DNA. Při zavedení do buňky vhodného bakteriálního hostitele, obsahující termolabilní represor Ci, a zvýšení teploty hostitele na teplotu destrukce represoru umožňuje vektor v hostitelské buňce uskutečnit expresi požadovaného genu, vneseného do vektoru, a produkci polypeptidů, kódovaného genem.

Vektor obsahuje ve směru 5’ -> 3':

-6CZ 282867 B6 sekvenci DNA, obsahující promotor a operátor PlOl z bakteriofágu λ, místo využití N pro navázání antiterminátorového N proteinu, produkovaného hostitelskou buňkou, sekvenci DNA, obsahující místo vazby ribosomů, které umožňuje mRNA požadovaného genu, aby se navázala na ribosomy hostitelské buňky, iniciační kodon ATG nebo sekvenci DNA, která se zavedením požadovaného genu do vektoru mění na iniciační kodon ATG a místo restrikčních enzymů pro nastavení požadovaného genu do vektoru ve fázi s iniciačním kodonem ATG.

Vektor dále obsahuje sekvenci DNA, obsahující původ replikace z bakteriálního plasmidu, schopného autonomní replikace v hostitelské buňce, a sekvenci DNA, která obsahuje gen, spojený se selektabilním nebo identifikovatelným fenotypickým rysem, který je manifestován, je-li vektor přítomen v hostitelské buňce.

Hostitelem, používaným pro vektor podle vynálezu, je Escherichia coli. V současné době se dává přednost kmenům A1637, A1645, A2602 aA1563. Nej výhodnější je v současné době A1637. Byl získán zC600 zavedením transposonu, obsahujícího resistenční gen tetracyklinu, v oblasti galaktosového operonu a systém λ pro expresi, který je blízký galaktosovému operonu. Byl uložen v Američan Type Culture Collection v Rockville, Maryland, USA, kde jsou uloženy četné plasmidy. Všechny podobné sbírky jsou vybudovány v souladu s budapešťskou dohodou o mezinárodním uznávání ukládání mikroorganismů.

Kmen A1645 byl získán zA1637 selekcí na Gaf (schopnost fermentovat galaktosu) a ztrátu tetracyklinové resistence. Obsahuje dále expresní systém λ, ale část transposonu byla selekcí odstraněna. Jeho fenotyp je C600 r‘m~ gaf thr' leu' lac Z' (XcI857 ΔΗ1 ΔΒΑΜ N+).

Kmeny A2602 a AI 563 jsou odvozeny od SA500. Jejich fenotypy jsou SA500 his'ilu‘ gaf Δ8(λΟΙ857ΔΗ1ΔΒΑΜ N+ a SA500 hisihfgaf Δ8 lac ZxA21 (XCI859 int2 xisl nutL3 ΔΗ1).

Vektor má výhodně formu kovalentně uzavřené dvouvláknové molekuly. Není však nezbytné, aby byl vektor kovalentně uzavřen.

Vektor dosahuje zvýšených hodnot exprese poté, co je hostitelská buňka zahřáta na teplotu, při které se Ci represor destruuje. Pro tento účel je účinná teplota nad asi 42 °C a poněvadž je žádoucí zabránit zbytečnému tepelnému poškození hostitelských buněk v nejširším možném měřítku, je obvy kle žádoucí, aby teplota nikdy nepřekročila 42 °C o více než několik stupňů.

Jednou z důležitých komponent vektoru je místo vazby ribosomů (RBS). Vhodné jsou oblasti Cn z bakteriofágu λ o sekvenci

TAAGGAAATACTTACAT

ATTCCTTTATGAATGTA, synthetický oligonukleotid o sekvenci

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA a

-7CZ 282867 B6 gen převládajícího proteinu bakteriofágu λ o sekvenci

TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG AAAAAAATGCCCTAAAAAATAC

Další komponentou vektoru je místo restrikčních enzymů pro vnesení požadovaného genu do vektoru ve fázi s iniciačním kodonem ATG. Je možno používat různých takovýchto míst. V současné době se dává přednost místům BamHl, Sací aNdel.

Vektor rovněž obsahuje původ replikace z bakteriálního plasmidu, schopného autonomní replikace v hostitelské buňce. Původy replikace mohou být získány z různých zdrojů. V současné době jsou jako zdroje preferovány pBR322 nebo pRl.

Sekvence DNA. která obsahuje gen spojený se selektabilním nebo identifikovatelným 15 fenotypickým ry sem, který- je manifestován, je-li vektor přítomen v hostitelské buňce, je rovněž komponentou vektoru. Mezi vhodné geny patří geny spojené s teplotní citlivostí nebo resistencí vůči léčivům, například resistencí na ampicillin, chloramfenikol nebo tetracyklin.

Podobně jako vektory , popsané dříve ve vědecké literatuře, mohou být vektory podle vynálezu 20 použity k dosažení zvýšené exprese velkého množství genů, kódujících žádoucí polypeptidické produkty. Mezi vhodné geny patří ty, které kódují růstové hormony, například hovězí, vepřový, kuřecí nebo lidský růstový hormon, superoxid-dismutasu, apoprotein E, virový protein 1 viru slintavky a kulhavky . protein A ze S. aureus. interleukin III, enzymy nebo analogy uvedených látek. Analogem se rozumí poiypeptid o stejné aktivitě jako přírodně se vyskytující polypeptid.

avšak s jednou nebo více odlišnými aminokyselinami na N-konci polypeptidu.

Vektor může být vytvořen způsoby, které jsou odborníkům v oblasti, které se vynález týká, známé. Takové postupy jsou podrobněji popsány v různých zde zmiňovaných publikacích, které doplňují popis známého stavu techniky.

Jedním z vektorů, preferovaných v současné době, je pMGlOO, jehož restrikční mapa je znázorněna na obr. 1. V tomto vektoru byla na restrikční místo BamHl zavedena cDNA, kódující hovězí růstový' hormon. Výsledný plasmid se označuje pRec 2/3 bGH. Jeho restrikční mapa je zobrazena na obr. 2. Plasmid pRec 2/3 bGH byl zaveden do kmene A1637 Escherichia coli 35 běžnou transformační metodou. Získaný systém hostitel-vektor byl uložen ve sbírce pod číslem ATCC 39385.

Druhým vektorem, preferovaným v současné době, je pND5, jehož restrikční mapa je znázorněna na obr. 3. Do jeho restrikčního místa Ndel byla zavedena cDNA hovězího růstového hormonu. 40 Výsledný plasmid se označuje pROll. Jeho restrikční mapa je rovněž znázorněna na obr. 3.

Plasmid pROll byl transformací zaveden do kmene A1637 Escherichia coli. Získaný systém hostitel-vektor byl uložen pod číslem ATCC 39390.

Vektor pND5 byl rovněž použit ke klonování lidského růstového hormonu. Zavedením hGH 45 cDNA do restrikčních míst Ndel byl vytvořen plasmid označený pTV 18(1) a plasmid označený pTV 104(2). pTV 18(1) je znázorněn na obr. 4. Byl zaveden transformací do kmene A1637 Escherichia coli. Získaný systém hostitel-vektor byl uložen pod číslem ATCC 39386. PTV 104(2) je znázorněn na obr. 4. Byl rovněž zaveden do kmene A1637 Escherichia coli. Získaný systém hostitel-vektor byl uložen pod číslem ATCC 39384

Stejným způsobem je možno připravit jiné plasmidy zavedením genu, kódujícího požadovaný polypeptid, do enzymového restrikčního místa vektoru podle vynálezu.

-8CZ 282867 B6

Uvedené konkrétní systémy hostitel-vektor obsahují kmen Escherichia coli č. A1637. Jak bylo uvedeno, byly použity i jiné kmeny, zahrnující A1645, A2606 aA1563. Tyto systémy hostitelvektor je možno použít k výrobě polypeptidů, jako je hovězí a lidský růstový hormon. Za tím účelem se systém hostitel-vektor pěstuje za vhodných podmínek, umožňujících produkci polypeptidů, který se pak získává.

Vhodné podmínky zahrnují kultivaci systému hostitel-vektor po příslušnou dobu při asi 42 °C a pak další kultivaci při asi 37 až 39 °C opět po určitou dobu, přičemž se kultivace provádí ve vhodném médiu.

Počáteční doba kultivace má činit asi 10 až 30 min při 42 °C a pak se kultivuje při 37 až 39 °C po takovou dobu, aby celková doba kultivace činila asi 60 až 90 min. Výhodně se kultivuje asi 15 min při 42 °C a pak asi 75 min při 38 až 39 °C. Mezi vhodná média patří hydrolysát laktalbuminu s přídavkem glukosy a vývar z mozku a srdce. Za účelem stabilního uchování vektoru v hostiteli je rozhodující, aby byl hostitel udržován pod selektivním tlakem, například přídavkem antibiotika.

Popsanou metodou bylo připraveno množství analogů bGH a hGH, které mají nebo mohou mít aktivitu hormonů, vy skytujících se v přírodě.

Analogy bGH mají aktivitu přírodního bGH a identickou sekvenci aminokyselin kromě obměn na N-konci až do 5. aminokyseliny. Jako příklady je možno uvést:

1. aminokyselina methionin přidaná na N-konec fenylalaninové formy bGH

2. aminokyselina methionin přidaná na N-konec alaninové formy bGH

3. sekvence aminoky selin Met-Asp-Gln přidaná na N-konec fenylalaninové formy bGH

4. sekvence aminokyselin Ala-Gly přidaná na N-konec alaninové formy bGH

5. sekvence aminoky selin Met-Gly přidaná na N-konec alaninové formy bGH

6. sekvence aminoky selin Met-Asp-Pro-Met-Gly přidaná na N-konec alaninové formy bGH

7. sekvence aminokyselin Met-Asp-Pro přidaná na N-konec fenylalaninové formy bGH

8. sekvence aminokyselin Met-Thr-Arg přidaná na N-konec fenylalaninové formy bGH

9. aminokyseliny až po methionin (4. poloha) odstraněné zN-konce fenylalaninové formy bGH

Analog bGH o sekvenci aminokyselin

Met-(X)_n-Y-Met...

kde Met je N-konec. X je kterákoli z dvaceti přírodních aminokyselin, Y je kterákoli z dvaceti přírodních aminoky selin kromě Glu, Gin, Lys, Met nebo Trp, n je celé číslo od 0 do 6 a Met... je sekvence přírodního bGH od polohy 4 do COOH-konce (poloha 191).

Analogy hGH mají aktivitu přírodního hGH a identickou sekvenci aminokyselin kromě obměn na N-konci. Jako příklady je možno uvést:

1. aminokyselina methionin přidaná na N-konec přírodního hGH

-9CZ 282867 B6

2. aminokyseliny až po methionin (poloha 14) odstraněné z N-konce hGH

Analog hGH o sekvenci aminokyselin

Met-(X)_n-Y-Met...

kde Met je N-konec, X je kterákoli z dvaceti přírodních aminokyselin, Y je kterákoli z dvaceti přírodních aminokyselin kromě Glu, Gin, Lys, Met nebo Trp, n je celé číslo od 0 do 13 a Met... je sekvence přírodního hGH od polohy 14 do COOH-konce (poloha 191).

Je možno připravovat veterinární komposice, které obsahují účinné množství jednoho nebo více analogů bGH a vhodný nosič. Tyto nosiče jsou odborníkům známé. Analogy je možno podávat hovězímu dobytku přímo nebo ve formě komposice za účelem zvýšení produkce mléka nebo masa.

Je možno připravovat farmaceutické komposice, které obsahují účinné množství jednoho nebo více analogů hGH a vhodný nosič. Tyto nosiče jsou odborníkům známé. Analogy je možno podávat lidskému subjektu přímo nebo ve formě komposice například u jedinců postižených trpaslictvím k léčení nedostatků v produkci hGH subjektem.

Následují příklady provedení, které mají pomoci k pochopení vynálezu, avšak nemají v žádném případě omezovat jeho rozsah. Příklady neobsahují podrobný popis běžných metod, používaných při konstrukci vektorů, včleňování genů, kódujících požadované polypeptidy, do těchto vektorů nebo zavádění získaných plasmidů do bakteriálních hostitelů. Tyto metody jsou odborníkům známé a jsou popsány v četných publikacích, například

Principles of Gene Manipulation, An Introduction to Genetic Engineering, 2. vydání, vyd. R. W. Old a S. B. Primrose. Univ. of Calif. Press (1981),

Met. Enzymol., díl 68. Recombinant DNA, vyd. Ray WU,

Met. Enzymol.. díl 65. Nucleic Acids (část 1), vyd. Lawrence Gorsman a Kivie Moldave,

T. Maniatis, E. F. Fritsch a J. Sambrook., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory', ΝΎ (1982),

Η. V. Bernard a d. Gene (1979) 5, 59,

A. B. Oppenheim a d„ J. Mol. Biol. (1982) 158, 327,

E. Remaut a d., Gene (1981) 15, 81.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Expresní vektory

Termín expresní vektor se zde vztahuje na skupinu plasmidů, používaných pro expresi požadovaných genů v bakteriích, zejména v Escherichia coli. Požadovaný gen může být vložen do expresního vektoru nebo mohou být vyříznuty promotory na expresním vektoru a umístěny

- 10CZ 282867 B6 před požadovaný gen.

I. Expresní vektory P_L

A. pMG 100 pMG 100, jak je znázorněno na obr. 1, je složen z XDNA, vložené do násobně kopírovacího plasmidu pBR322. Význačným rysem XDNA je, že obsahuje promotor XP_L, utilisační místa L a R pro N (nut_L a nut_R), terminační místo R1 (t_R)), místo vazby ribosomů C_n a iniciační kodon ATG. Ostatní rysy jsou znázorněny na obr. 1.

pMG 100 se připraví zpKC30. pKC30 se připraví subklonováním promotoru ZP_L následujícím způsobem.

DNA fága λ se digeruje s restrikčními endonukleasami Xhol a Smál a jednotlivý fragment, obsahující 6393 párů bází, se vyčistí a pak digeruje s restrikčními endonukleasami HindlII a BamHl. Získaný fragment, tvořený 2397 páry bází, a obsahující promotor P_L, se čistí a liguje do velkého fragmentu pBR322 DNA, isolovaného zHindlII adigerátu BamHl. Subklon byl identifikován koloniovou hybridisací, isolován a plasmid DNA byl isolován (Oppenheim, A. a d., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327).

Tento plasmid a jeho deriváty, obsahující eukaryotické geny, může být uchováván ve vhodných hostitelích Escherichia coli. Nejdůležitějším znakem hostitele je, že poskytuje thermosensitivní represor CI857 a antiterminační N protein (Gottesman, Μ. E. a d., J. Mol. Biol. (1978) 140, 197).

Tento vektor má oproti dříve popsaným expresním vektorům četné výhody, mezi které patří:

1. Extrémně vysoká úroveň exprese.

Tento vektor je schopen řídit expresi cizích proteinů v Escherichia coli v úrovni 15 až 25 % celkového buněčného proteinu.

2. Thermoindukovatelná regulace exprese.

Promotor P_L je inaktivní, je-li k němu vázán represor Cl. Represor CI857 je thermosensitivní, tzn. že se při 30 °C váže na promotor, ale při 42 °C je inaktivován. Zvýšením teploty fermentace na 42 °C jsou hostitelské bakterie povzbuzeny k produkci požadovaného proteinu.

Mezi výhody takovéhoto systému patří:

a) je-li to žádoucí, je možno produkovat cizí protein, který je toxický vůči Escherichia coli, a tak zabránit odumření buněk v začátku fermentačního procesu,

b) nadprodukcí proteinu je ho možno stabilisovat a zabránit proteolytické degradaci (Cheng Y. E. ad., Gene (1981) 14, 121). Okamžitá nadprodukce s použitím pevně regulovatelného promotoru, například P_L, může tedy být výhodná pro kontinuální produkci nízké úrovně.

3. Vysoký počet kopií.

Promotor P_L v pMG 1 00 se nalézá na plasmidu s vysokým počtem kopií oproti samotnému λ, který je přítomen v Escherichia coli v nízkém počtu kopií. To zvyšuje úroveň exprese.

- 11 CZ 282867 B6

4. Místo vazby ribosomů a iniciační kodon.

Tento expresní vektor obsahuje silné prokaryotické místo vazby ribosomů (RBS) stejně jako translační iniciační kodon (ATG). Je tedy možno klonovat jakýkoli eukaryotický gen bez 5 nutnosti přidávání iniciačního kodonu. Účinné RBS dále zvyšuje úroveň exprese.

5. Vhodné restrikční místo.

Expresní vektor má místo BamHl, umístěné přímo za iniciačním kodonem ATG, které umožňuje 10 vhodné polohování požadovaného genu pro dosažení optimální exprese

6. Místo Nut

N protein, který je poskytován hostitelem, se váže na místo Nut na expresním vektoru, a tak 15 zabraňuje ukončení transkripce na místě t_R].

B. pND5

Jak je znázorněno na obr. 3, pND5 obsahuje promotor P_L a ostatní důležité komponenty 20 expresních vektorů podle vynálezu. Zahrnuje jednotlivé místo Ndel bezprostředně za místem vazby ribosomů. Místo vazby ribosomů se liší od normálního místa Cn- Má sekvenci

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA

Může být odvozeno od některých mutantů nebo může být synthetisováno chemicky. Jak je podrobně popsáno v objasnění významu obrázků, byl pND5 odvozen od pOG7 (Oppenheim, A. ad., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327). Tento vektor neobsahuje translační iniciační kodon. Vyskytuje se, aby poskytoval vyšší expresi modifikovaného bGH a hGH, zejména zvýšený 30 výtěžek, vztaženo k pMG 100, obsahujícímu analog bGH.

C. pND55 pND55 je derivát pND5, který obsahuje vhodné restrikční místo Sací před C_n-RBS a iniciačním 35 kodonem ATG. Rozštěpení plasmidu v tomto místě s následujícím působením fragmentu Klenow

DNA polymerasy umožňuje získat iniciační kodon ATG, ke kterému může být ligován kterýkoli požadovaný gen (obr. 3).

II. Expresní vektory Trp

A. pAL Trp 46 pAL Trp 46 obsahuje promotor Trp a prvních sedm aminokyselin genu Trp E včleněných do β45 galaktosidasového genu (obr. 5). Požadovaný gen může být zaveden do místa BamHl, které následuje za sedmi aminokyselinami Trp E.

B. pAL Trp 47, Trp 46 zbavený atenuátoru

Jedná se o konstrukci založenou na Trp 46, ve kterém byla vypuštěna zeslabovací oblast promotoru Trp.

- 12CZ 282867 B6

C. Spojování Trp-Lac

Konstrukce tohoto promotoru, nalézajícího se na plasmidu p3754; je ilustrována na obr. 6 a 7. Na obr. 8 je znázorněna její obměna.

III. Expresní vektory s histidinovým promotorem

Konstrukce tohoto expresního vektoru je ilustrována na obr. 9 a 10.

IV. Jiné používané promotory

A. Lac

Tento promotor byl použit při konstrukci pYL 301, jak je znázorněno na obr. 11.

B. Omp F

Jedná se o promotorovy systém, který vyjadřuje protein, připojený k signální sekvenci. Signální sekvence se odstraní při přemístění proteinu přes membránu (obr. 12).

Příklad 2

Hovězí růstový hormon

Výchozím bodem pro cDNA modifikace bGH je plasmid D₄, který již byl popsán (Keshet E. a d., Nucleic Acids Research (1981) 9, 19). Plasmid D₄ je rovněž popsán v související patentové přihlášce USA č. 245 943. podané 20. 3. 1981 s požadovanou prioritou z izraelské patentové přihlášky č. 56 690, podané 24. 3. 1980. Byl předem uložen v americké sbírce typových kultur v hostiteli Escherichia coli pod c. ATCC 31826.

I. pRec 2/3 bGH

Konstrukce pRec 2/3 je znázorněna na obr. 2. bGH cDNA z D₄ byla před včleněním do PMG100 podrobena manipulaci za účelem získání správného čtecího rámce.

pRec 2/3 byl zaveden do různých kmenů Escherichia coli včetně A1637 transformací známými metodami. Kmen A1637, obsahující pRec 2/3, byl uložen pod č. ATCC 39385. Tento kmen produkuje během růstu a indukce analog bGH se sekvencí aminokyselin Met-Asp-Gln, přidanou na N-konec fenylalaninové formy přírodního bGH. Množství analogu bGH, produkované pRec 2/3, činí asi 23 % celkového proteinu, produkovaného bakteriemi, vypočteno z měření na barveném polyakrylamidovém gelu SDS Coomasie.

II. pROll

Konstrukce pROll je znázorněna na obr. 3. DNA vektoru pND5 se podrobí restrikci Ndel. Zavedením fragmentu Ndel z pRec 2/3 (obr. 2), který obsahuje bGH cDNA, se získá plasmid pROll.

pROll byl zaveden do kmene Escherichia coli A1637 transformací. Získaný systém hostitelvektor byl uložen pod č. ATCC 39390. Tento kmen během růstu a indukce produkuje stejný analog jako pRec 2/3. Předběžné výsledky ukazují, že pROl 1 produkuje až o 20 % více analogu

- 13CZ 282867 B6 bGH než pRec 2/3. Pro pěstování kmene, isolaci získaného analogu bGH ajeho čištění se používají stejné metody jako v příkladu 4 pro pRec 2/3.

III. pAL401

Konstrukce pAL401 je znázorněna na obr. 13. bGH cDNA zD₄ přes pAL-500 (obr. 2) byla vložena do pNDl 1. jak je znázorněno na obr. 13.

pAL401 může byt transformací zaveden do kmene Escherichia coli A163 7. Získaný kmen produkuje analog bGH, ve kterém je na N-konci Met⁴ přírodního bGH a aminokyseliny před Met⁴ jsou vynechány.

IV. pAL601

Konstrukce pAL601 je znázorněna na obr. 14. Jedná se o derivát pAL401 (obr. 13).

pAL601 je možno transformací zavést do Escherichia coli A1637. Získaný kmen produkuje analog bGH, ve kterém je na N-konec fenylalaninové formy bGH přidán Met.

Příklad 3

Lidský růstový’ hormon

Výchozím bodem pro hGH cDNA je klonování cDNA z mRNA, čištěné z hypofysámího tumoru akromegalických pacientů, do místa HindlII v pBR322.

I. pTV 18(1)

Konstrukce pTV 18(1) je znázorněna na obr. 4. Před vložením do pND5 byla hGH cDNA podrobena manipulaci za účelem získání správného čtecího rámce.

pTV 18(1) byl transformací zaveden do Escherichia coli A1637. Získané bakterie byly uloženy pod číslem ATCC 39386. Tento kmen produkuje pěstováním a indukcí analog hGH o sekvenci přírodního hGH počínaje Met¹⁴ a bez aminokyselin 1 až 13. Množství analogu hGH. produkovaného pTV 18(1). činilo asi 8 % celkového proteinu, produkovaného bakteriemi.

II. pTV 104(2)

Konstrukce pTV 104(2) je znázorněna na obr. 4. Před vložením do pND5 byla hGH cDNA podrobena manipulaci za účelem získání správného čtecího rámce.

pTV 104(2) byl transformací zaveden do Escherichia coli A1637. Získané bakterie byly uloženy pod č. ATCC 39384. Tento kmen produkuje růstem a indukcí analog hGH o sekvenci přírodního hGH, před níž je na N-konci Met. Množství analogu hGH, produkovaného pTV 104(2), činilo přes 25 % celkového proteinu, produkovaného bakteriemi.

Příklad 4

Pěstování pRec 2/3

Zásobní kultury: Zásobní kultury pRec 2/3 v A1637 se pěstují na médiu BHI (viz inokulum), pak se dvojnásobně zředí 87% glycerolem, obsahujícím fosfátocitrátový pufr, a skladují při -70 °C.

- 14CZ 282867 B6

Inokulum: Inokulum se propaguje v médiu BHI (infuse mozkové dřeně 37 g/1, DIFCO). Sterilní médium v třepací baňce se inokuluje ze zásobní kultury a inkubuje se 15 h při 30 °C na třepačce o rychlosti 200 min'¹. Další stadia propagace inokula se provádějí vmíchaných provzdušňovaných fermentorech. Sterilní médium se inokuluje pokaždé 0,2 ml kultury z baňky a inkubuje se 15 h při 30 °C a pH 7±0,5 za míchání a provzdušňování za účelem udržení hladiny rozpuštěného ky slíku nad 20 % nasycení vzduchem.

Produkce: Produkční médium obsahuje:

hydrolysát laktalbuminu (enzymatický) kvasnicový extrakt K2HPO4 NaCl ampicillin biotin thiamin roztok stopových prvků

20 g/1 10 g/1 2,5 g/1 10 g/1 0,1 g/1 0,1 mg/1 1 mg/1 3 ml/1

Ampicillin, biotin a thiamin v roztoku se odděleně filtračně sterilisují a přidávají se k sterilnímu produkčnímu médiu před inokulací. Sterilní roztok glukosy se nejprve přidává do 10 g/1 a během indukce a procesu exprese tak, aby se udržoval obsah glukosy nad 10 g/1.

Roztok stopových prvků obsahuje:

MgSO4.7H2O	170 g/1
FeCL3	16 g/1
ZnCl2.4H2O	2 g/1
CoCl2.6H2O	2 g/1
Na2Mo04.2H20	2 g/1
CaCl3.2H:O	1 g/i
CuCl2	1 g/1
H3BÓ3	0,5 g/1
konc. HC1	100 ml/1

Médium se inokuluje 5 až 10% kulturou inokula a inkubuje se při 30 °C. Rychlost míchání a provzdušňování se nastavuje tak, aby hladina rozpuštěného kyslíku byla nad 20 % nasycení vzduchu. pH se udržuje pomocí NH₃ na 7±0,2. Když dosáhne koncentrace buněk asi 3 g/l (OD₆6o⁼10), je zahájena indukce.

Teplota se zvýší na 42 °C. Zde se udržuje po dobu 15 min, pak se sníží na 38 °C. Po 1 až 1 1/2 h trvající inkubaci při 38 °C se kultura ochladí, buňky se oddělí odstředěním a podrobí se čištění hormonu.

Získávání bGH kg bakteriálních buněk se v mixeru Warring suspenduje v 10 objemech roztoku obsahujícího 50 mM Tris-CI (pH 7,4), 50 mM EDTA a 25 % sacharosy, přičemž se kontroluje rychlost mixeru pro maximální zamezení pěnění. Homogenní suspense se nechá kontinuálně procházet rozrušovačem buněk Dynomill (Willy A. Bachofen, Basilej) a homogenní suspense rozrušených buněk se vyčeří nejprve odstředěním v odstředivce Sharpless, načež se kontinuálně odstřeďuje rychlostí 20 000 min'¹ v odstředivce Sorvall. Precipitát z obou odstředivek se shromáždí, promyje 50 mM Tris-Cl (pH 7,4) a znovu suspenduje v 500 ml stejného pufru. Přidá se lysozym

- 15CZ 282867 B6 do konečné koncentrace 2 mg/ml a suspense se inkubuje 1 h při 37 °C. Pak se přidá Triton X-100 do konečné koncentrace 1 %, suspense se ochladí na 4 °C aodstřeďuje 20 min rychlostí 20 000 min'¹ v odstředivce Sorvall SS34. Precipitát se shromáždí, promyje dvakrát 50 mM TrisCl, znovu suspenduje v 500 ml 50 mM Tris-Cl (pH 7,4), 5 mM MgCU a přidá se 5 desoxyribonukleasa do konečné koncentrace 20 pg/ml. Po inkubaci, trvající 30 min při teplotě místnosti, se precipitát shromáždí jak výše popsáno, promyje dvakrát 500 ml 20 mM Tris-Cl (pH 7,4), 100 mM NaCl a 10 mM EDTA a pak dvakrát 500 ml destilované vody. Precipitát se shromáždí odstředěním a může se skladovat při -20 °C po neomezenou dobu. V tomto stadiu je čistota bGH 80 %, soudě podle elektroforesy na natriumdodecylsulfátovém gelu. Výtěžek je ío přibližně 15 g bGH.

Čištění bGH

100 g precipitátu se suspenduje ve 40 ml destilované vody a solubilisuje titrací s 0,5 M NaOH, 15 pH 11,8. Roztok se pak 2 min podrobí působení zvuku avyčeří odstřeďováním rychlostí

000 min'¹ po dobu 20 min v odstředivce Sorvall SS34. Roztok se pak uvede na sloupec Sepharosy CL-6B (5 x 100 cm), ekvilibrovaný 6,5 mM borátového pufru, pH 11,8. Sloupec se vyvíjí rychlostí 100 ml/h a sbírají se frakce po 12 ml. První pík mimo sloupec se zlikviduje. Následující dva píky se oddělí a shromáždí. První představuje agregovaný bGH s nízkou 20 aktivitou; druhý bGH s vysokou aktivitou.

Sloupec DEAE-Sephacelu (25 g/100 gekv. ppt) se ekvilibruje 6,5 mM borátovým pufrem, pH 9,0. Druhý pík bGH se upraví na pH 9,0 pomocí HC1 dodávané na sloupec DEAE-Sephacelu rychlostí 250 mLh. Sloupec se promyje 7,5 ml 6,5 mM borátového pufru, pH 9,0, eluuje 6,5 mM 25 borátovým pufrem, pH 9.0, obsahujícím 75 mM NaCl. Frakce s OD₂so nad 0,3 se shromáždí, dialysují oproti H_:O v dialysním Millipore Pellicon a pak lyofilisují.

Příklad 5

Aktivita analogu bGH, produkovaného pRec 2/3

1. Radioimunotestové (RIA) porovnání analogu bGH s přírodním bGH

Roztok obsahující 100 ng/ml analogu bGH se připraví ve fysiologickém roztoku tlumeném fosfátovým pufrem (1 % BSA). Tento roztok se postupně ředí na koncentrace 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1.56 a 0,78 ng/1. Zdvojené 0,1 ml alikvotní podíly těchto roztoků se podrobí RIA postupem dvojité protilátky. Zřeďovací křivka je srovnatelná s přírodním bGH.

2. Test vazby radioreceptorů

Test vazby radioreceptorů se provádí s membránami z králičích jater, jak je popsáno v T. Tushima a H. G. Freisen (Y. Chin., Endocr. Metab. (1973) 37, 334, s použitím ¹²⁵I-hGH jako značené látky a autentických roztoků bGH po konstrukci kalibračních křivek. Vzorky se inkubují 45 ztrojeně po dobu 2 h při teplotě místnosti v 0,3 ml zkušebního pufru (50 mM Tris, 15 mM CaCl₂ a 5 mg/ml hovězího sérového albuminu, pH 7,6). Zkumavky obsahují ^l’’I-hGH (20 000 cpm přípravy 30 až 60 pci/pg). 150 až 250 pg proteinu membrány jater a buď přírodní bGH (1 až 100 ng). nebo extrakty bakteriálního bGH. Výsledek ukazuje, že aktivita analogu bGH je srovnatelná s přírodním bGH.

CZ 282867 B6

3. Tibiální test

Bioaktivita pRec 2/3-analogu bGH získaného inženýrstvím z bakteriálních buněk podle příkladu 4 se hodnotí tibiálním testem (parlow A. F. a d., Endocrinology (1965) 77, 1126).

Krysy se hypofýsektomisují ve věku 28 až 30 dní, pak se ponechají 10 až 14 dní bez terapie. Hovězí růstový· hormon odvozený z hovězí hypofysy nebo z rekombinantní Escherichia coli se rozpustí v 0,15 M NaCl + 0,1 M borátu, pH 10,0. Krysy (skupiny po 4 až 7) dostávají denně subkutánní injekce roztoků bGH (5 až 125 pg/den po 0,2 ml) po dobu 5 dnů, přičemž dostávají běžnou stravu (Purina Rat-Chow a vodu ad libitum). Zvířata se 6. dne usmrtí, odeberou se holenní kosti jejich předních noh, podélně se rozříznou, fixují acetonem a zbarví 2% AgNO₃. Šířka epifysálních destiček se měří pozorováním rozkladným binokulárem (Nikon). Střední hodnoty (40 čtení na krysu) se použijí pro konstrukci logaritmických křivek dávka-odpověď. Výsledky jsou uvedeny na obr. 15.

Příklad 6

Analogy bGH

Tabulka I uvádí sérii plasmidů, které byly konstruovány, a analogy, které z nich byly produkovány.

Tabulka I

plasmid	amino-konec-analogů bGH
Rec 2/3 pB 1 pM 4 pM 1 pM 2 pAL 401	Met Asp Gin Phe2 Met Asp Pro Met Gly Ala Phe2 Met Asp Pro Phe“ Met Ala1 Phe2 Met Ala1 Phe2 Met4
pYL301 pAL 302 pHis 129 pAL312 pAL 322 pAL 60IR p 18 PBTG-800 pORF 2-12	Met Gly Ala1 Phe2 11 AK + Ala1 Phe2 Met Thr Arg Phe2 Met Gly Ala1 Phe2 Met Gly Ala1 Phe2 Met Gly Ala1 Phe2 Met Gly Ala1 Phe2 Met Glu Phe2 Ala Gly Ala1 Phe2

Příklad 7

Účinek pRec 2/3-analogu bGH na laktogenesi dojnic

Laktogenní účinek bGH je dobře dokumentován ve vědecké literatuře v pracích Bines J. a d„ Brit. J. Nutri. (1980) 43, 179 a Peel C. a d., J. Nutr. (1981) 111, 1662. Bauman D. a d., J. Dairy Sci., díl dod. 1, abstrakt 86 (1982) zaznamenává, že produkce mléka se zvýší pomocí rDNA bGH. Byl proveden pokus za účelem stanovení účinku pRec 2/3-bGH na laktogenesi ve srovnání s přírodním bGH. 18 holštýnských krav ve stadiu 141 až 154 dní po porodu bylo náhodně vybráno k terapii a sestaveno do skupin podle dojivostí podle schématu předběžná terapie terapie injekce GH denně

kontrola	5 dní	fysiolog. roztok
přírodní bGH	5 dní	25 mg/den po 10 dní
pRec 2/3-bGH	5 dní	25 mg/den po 10 dní

Těsně před každodenní injekcí byly vzorky bGH převedeny do roztoku pomocí 0,1 M NaHCO₃ vodného pufru (pH 8,2) o koncentraci 1 mg/ml. Kravám bylo denně po 10 dní injikováno placebo nebo roztok bGH subkutánně v oblasti krku. Po dobu pětidenní předběžné terapie nebyly dávány žádné injekce.

Krávy byly dojeny dvakrát denně přibližně v 6.00 a 17.00. Hmotnosti mléka byly zaznamenávány systémem Boumatic a zanášeny do systému mlékárenských dat.

Průměrné hodnoty dojivosti pro dobu předběžné terapie a terapie bGH jsou uvedeny v tabulce II. Úroveň dojivosti kontrolních krav se nezměnila, zatímco u obou skupin, ošetřovaných bGH, objem mléka vzrostl podobnou měrou. Přírodní bGH způsobil vzrůst mléka za 10 dní o 11,9 % a analog bGH o 10,2 %. Údaje nebyly analysovány z hlediska statistického významu vzhledem k malému počtu zvířat, avšak velikost vzrůstu je podobná údajům z literatury.

Byl učiněn závěr, že pRec 2/3-bGH stimuluje laktogenesi dojnic podobně jako přírodní bGH.

Tabulka II

Účinek hovězího růstového hormonu na laktogenesi průměrná denní dojivost

skupina	kg/den počet předb. terap. podávání GH, % vzrůstu 5 dní 10 dní oproti předb. terap.
Kontrolní přírodní bGH 25 mg'den	6 25,96 25,97 5 26,55 29,71 11,9

pRec 2/3-bGH 25 mg/den 6 26,07 28,73 10,2

Každé krávě bylo lx denně po 10 dní subkutánně injikováno buď placebo, nebo roztok bGH.

Claims (65)

1. Expresní vektory, které po zavedení do buňky vhodného bakteriálního hostitele, obsahující termolabilní represor C_b umožňují aby hostitelská buňka po zvýšení teploty hostitelské buňky na 42 °C, kdy je represor inaktivován, uskutečnila expresi požadovaného genu, vloženého do vektorů, a produkci polypeptidů, kódovaného tímto genem, obsahující dvouvláknovou molekulu DNA, která ve směru 5' —> 3' obsahuje:

promotor a operátor PlOl z bakteriofágu lambda, místo využití N pro navázání antiterminátorového N proteinu, produkovaného hostitelskou buňkou, sekvenci DNA, obsahující místo vazby ribosomů, které umožňuje mRNA požadovaného genu, aby se navázala na ribosomy hostitelské buňky, kde místo vazby ribosomů je:

(i) mutační ribosomové vazebné místo Cn z bakteriofágu lambda o sekvenci

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA nebo (ii) syntetický oligonukleotid o sekvenci

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA nebo (iii) z převažujícího hlavního proteinového genu bakteriofágu lambda a má sekvenci

TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC, iniciační kodon ATG a oblast restrikčních enzymů pro vložení požadovaného genu do vektoru ve fázi s iniciačním kodonem ATG, a dále zahrnuje sekvenci DNA, obsahující původ replikace z bakteriálního plasmidu pBR322, schopného autonomní replikace v hostitelské buňce, a sekvenci DNA, obsahující gen, spojený se selektabilním nebo identifikovatelným fenotypickým rysem, který je manifestován, je-li vektor přítomen v hostitelské buňce.

2. Vektor podle nároku 1, kde vhodnou hostitelskou buňkou je Escherichia coli.

3. Vektor podle nároku 2, kde je použit kmen Escherichia coli A1637, A1645, A2602 nebo A1563.

4. Vektor podle nároku 1, kde dvouvláknová molekula DNA je kruhová.

- 19CZ 282867 B6

5. Vektor podle nároku 1, kde oblast restrikčních enzymů je BamHl. Sací nebo Ndel.

6. Vektor podle nároku 1, kde fenotypickým rysem je resistence vůči léčivům nebo citlivost vůči teplotě.

7. Vektor podle nároku 6, kde resistence vůči léčivům je resistence vůči ampicillinu, chloramfenikolu nebo tetracyklinu.

8. Vektor podle nároku 1, kde požadovaný gen kóduje růstový hormon, superoxid dismutasu, apolipoprotein E, virový protein 1 viru slintavky a kulhavky, protein A ze S. aureus, interleukin III, enzym nebo jeho analogy.

9. Vektor podle nároku 1, kde požadovaný gen kóduje hovězí růstový hormon nebo jeho analogy.

10. Vektor podle nároku 1, kde požadovaný gen kóduje lidský růstový hormon nebo jeho analogy.

11. Vektor podle nároku 1, kde požadovaný gen kóduje vepřový růstový hormon nebo jeho analogy.

12. Vektor podle nároku 1, kde požadovaný gen kóduje kuřecí růstový hormon nebo jeho analogy.

13. Vektor podle nároku 1 o názvu pMGlOO, mající restrikční mapu znázorněnou na obr. 1 a uložený pod číslem sbírky ATCC 39385 s bGH cDNA klonovanou do restrikčního místa BamHl, jak je znázorněno na obr. 2.

14. Vektor podle nároku 1 o názvu pND5, mající restrikční mapu znázorněnou na obr. 3 a uložený pod číslem sbírky ATCC 39384 a 39386 s hGH cDNA klonovanou do restrikčních míst Ndel, jak je znázorněno na obr. 4.

15. Plasmid pro produkci polypeptidu, obsahující vektor podle nároku 1 a gen, kódující polypeptid nebo jeho analog, vložený do oblasti restrikčních enzymů.

16. Plasmid pro produkci hovězího růstového hormonu, obsahující vektor podle nároku 1 a gen, kódující hovězí růstový hormon, nebo jeho analog, vložený do oblasti restrikčních enzymů.

17. Plasmid podle nároku 16 s označením pRec 2/3 bGH, mající restrikční mapu znázorněnou na obr. 2 a uložený pod číslem sbírky ATCC 39385.

18. Plasmid podle nároku 16 s označením pROl 1, mající restrikční mapu znázorněnou na obr. 3 a uložený pod číslem sbírky ATCC 39390.

19. Plasmid pro produkci lidského růstového hormonu, obsahující vektor podle nároku 1 a gen, kódující lidský růstový hormon, nebo jeho analog, vložený do oblasti restrikčních enzymů.

20. Plasmid podle nároku 19 s označením pTV 18(1), mající restrikční mapu znázorněnou na obr. 4 a uložený pod číslem sbírky ATCC 39386.

21. Plasmid podle nároku 19 s označením pTV 104(2), mající restrikční mapu znázorněnou na obr. 4 a uložený pod číslem sbírky ATCC 39384.

-20CZ 282867 B6

22. Systém hostitel-vektor pro produkci polypeptidu, vyznačující se tím, že obsahuje plasmid podle nároku 15 v hostitelské buňce E. coli.

23. Systém hostitel-vektor podle nároku 22, vyznačující se tím, že je použit kmen E. coli A1637, A1645, A2602 nebo A1563.

24. Systém hostitel-vektor pro produkci hovězího růstového hormonu, vyznačující se tím, že obsahuje plasmid podle nároku 16 v hostitelské buňce E. coli.

25. Systém hostitel-vektor podle nároku 24, vyznačující se tím, že je použit kmen E. coli A1637, A1645, A2602 nebo A1563.

26. Systém hostitel-vektor pro produkci hovězího růstového hormonu, vyznačující se tím, že obsahuje plasmid podle nároku 17 v hostitelské buňce E. coli.

27. Systém hostitel-vektor pro produkci hovězího růstového hormonu, vyznačující se tím, že obsahuje plasmid podle nároku 18 v hostitelské buňce E. coli.

28. Systém hostitel-vektor pro produkci lidského růstového hormonu, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku 19 v hostitelské buňce E. coli.

29. Systém hostitel-vektor podle nároku 28, vyznačující se tím, že je použit kmen E. coli A1637, A1645, A2602 nebo A1563.

30. Systém hostitel-vektor pro produkci lidského růstového hormonu, vyznačující se tím, že obsahuje plasmid podle nároku 20 v hostitelské buňce E. coli.

31. Systém hostitel-vektor pro produkci lidského růstového hormonu, vyznačující se tím, že obsahuje plasmid podle nároku 21 v hostitelské buňce E. coli.

32. Způsob produkce polypeptidu. vyznačující se tím, že se systém hostitel-vektor podle nároku 22 kultivuje 10 až 30 min při 42 °C a pak kontinuálně při 37 až 39 °C, přičemž celková doba kultivace činí 60 až 90 min, načež se izoluje výsledný polypeptid.

33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že kultivace se provádí 15 min při 42 °C a kontinuálně 75 min při 38 až 39 °C.

34. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že médiem je hydrolyzát laktalbuminu s přídavkem glukosy nebo mozkového a srdcového vývaru.

35. Způsob produkce hovězího růstového hormonu, vyznačující se tím, že se systém hostitel-vektor podle nároku 26 kultivuje za podmínek, umožňujících produkci bGH, a izoluje se výsledný bGH.

36. Způsob produkce hovězího růstového hormonu, vyznačující se tím, že se systém hostitel-vektor podle nároku 27 kultivuje za podmínek, umožňujících produkci bGH, a izoluje se výsledný bGH.

37. Způsob produkce lidského růstového hormonu, vyznačující se tím, že se systém hostitel-vektor podle nároku 30 kultivuje za podmínek, umožňujících produkci hGH, a izoluje se výsledný hGH.

- 71 CZ 282867 B6

38. Způsob produkce lidského růstového hormonu, vyznačující se tím, že se systém hostitel-vektor podle nároku 31 kultivuje za podmínek, umožňujících produkci hGH, a izoluje se výsledný hGH.

39. Analog bGH, exprimovaný vektorem podle nároku 1, s aktivitou přírodně se vyskytujícího bGH, mající podobnou sekvenci aminokyselin, která se od sekvence přírodního bGH liší až 5 aminokyselinami na N-konci.

40. Analog podle nároku 39, mající na N-konci fenylalaninové formy bGH aminokyselinu methionin.

41. Analog podle nároku 39, mající na N-konci alaninové formy bGH aminokyselinu methionin.

42. Analog podle nároku 39, mající na N-konci fenylalaninové formy bGH sekvenci aminokyselin Met-Asp-Gln.

43. Analog podle nároku 39, mající na N-konci alaninové formy bGH sekvenci aminokyselin Ala-Gly.

44. Analog podle nároku 39, mající na N-konci alaninové formy bGH sekvenci aminokyselin Met-Gly.

45. Analog podle nároku 39, mající na N-konci alaninové formy bGH sekvenci aminokyselin Met-Asp-Pro-Met-Gly.

46. Analog podle nároku 39, mající na N-konci fenylalaninové formy bGH sekvenci aminokyselin Met-Asp-Pro.

47. Analog bGH, exprimovaný vektorem podle nároku 1, mající sekvenci aminokyselin Met(X)_n-Y-Met..., kde Met je N-konec, X je kterákoli z dvaceti přírodně se vyskytujících aminokyselin, Y je kterákoli z dvaceti aminokyselin kromě Glu, Gin, Lys, Met nebo Trp, n je celé číslo 0 až 6 a Met... je sekvence přírodního bGH od polohy 4 do COOH-konce (poloha 191).

48. Analog podle nároku 39, mající sekvenci aminokyselin fenylalaninové formy bGH po odstranění aminokyselin až po methionin (poloha 4) na N-konci.

49. Analog podle nároku 39, mající na N-konci fenylalaninové formy bGH sekvenci aminokyselin Met-Thr-Arg.

50. Analog hGH, exprimovaný vektorem podle nároku 1, s aktivitou přírodně se vyskytujícího hGH, mající podobnou sekvenci aminokyselin odlišnou od sekvence přírodního hGH.

51. Analog podle nároku 50, mající sekvenci aminokyselin hGH po odstranění aminokyselin až po methionin (poloha 14) na N-konci.

52. Analog podle nároku 50, mající na N-konci přírodního hGH aminokyselinu methionin.

53. Veterinární prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství analogu bGH podle nároku 39 a vhodný nosič.

54. Veterinární prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství analogu bGH podle nároku 42 a vhodný nosič.

-22CZ 282867 B6

55. Veterinární prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství analogu hGH podle nároku 50 a vhodný nosič.

56. Způsob stimulace produkce mléka nebo masa u hovězího dobytka, vyznačující se

5 t í m , že se zvířeti podává účinné množství analogu bGH podle nároku 39.

57. Způsob stimulace produkce mléka nebo masa u hovězího dobytka, vyznačující se tím, že se zvířeti podává účinné množství analogu bGH podle nároku 42.

ío

58. Analog hGH, exprimovaný vektorem podle nároku 1, mající sekvenci aminokyselin Met(X)n-Y-Met..., kde Met je N-konec, X je kterákoli z dvaceti přírodně se vyskytujících aminokyselin, Y je kterákoli z dvaceti aminokyselin kromě Glu, Gin, Lys, Met nebo Trp, n je celé číslo 0 až 13 a Met... je sekvence přírodního hGH od polohy 14 do COOH-konce (poloha 191).

59. Způsob získávání čištěného živočišného růstového hormonu nebo jeho polypeptidického analogu, jako například hovězího, vepřového, kuřecího nebo lidského růstového hormonu nebo jeho analogu, majícího v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin a biologickou aktivitu jako odpovídající přírodně se vyskytující živočišný růstový hormon, z bakteriální buňky, v níž byl 20 živočišný růstový hormon nebo polypeptidický analog produkován prostřednictvím exprese vektoru podle nároku 1, kódujícího hormon nebo polypeptidický' analog, vyznačující se t í m , že

a) rozruší se stěna bakteriální buňky v tlumivém roztoku o neutrálním pH za vzniku lyzátu, 25 obsahujícího precipitát hormonu nebo polypeptidického analogu,

b) vý sledný precipitát hormonu nebo polypeptidického analogu se izoluje,

c) takto izolovaný precipitát hormonu nebo polypeptidického analogu se suspenduje 30 v destilované vodě,

d) na vzniklou suspenzi, obsahující uvedený precipitát, se působí roztokem hydroxidu sodného o alkalickém pH za účelem solubilizace precipitátu, a tedy v něm obsaženého hormonu nebo polypeptidického analogu,

e) solubilizovaný hormon nebo polypeptidický analog se oddělí od ostatních rozpustných složek gelovou filtrační chromatografií a

f) takto oddělený hormon nebo polypeptidický analog se podrobí ionexové chromatografií za 40 účelem přečištění hormonu nebo analogu, a tak se získává čištěný hormon nebo polypeptidický analog.

60. Způsob podle nároku 59, vyznačující se tím, že buňky se rozrušují 45 mechanicky.

61. Způsob podle nároku 59, vyznačující se tím, že k lyzátu se před úpravou pH přidá lysozym.

50

62. Způsob podle nároku 59, vyznačující se tím, žek lyzátu se před úpravou pH přidá desoxyribonukleasa.

-23 CZ 282867 B6

63. Způsob podle nároku 59, vyznačujíc se tím, že neutrální pHje 7,4.

64. Způsob podle nároku 59, vyznačující se tím, že alkalické pH je 11,8.

65. Způsob podle nároku 59, vyznačující se koncentruje dialýzou a lyofilizací.