JPH0687780B2 - ポリペプチドの産生を増強する発現用プラスミド及び該プラスミドを含む形質転換宿主細胞 - Google Patents
ポリペプチドの産生を増強する発現用プラスミド及び該プラスミドを含む形質転換宿主細胞Info
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- JPH0687780B2 JPH0687780B2 JP59145876A JP14587684A JPH0687780B2 JP H0687780 B2 JPH0687780 B2 JP H0687780B2 JP 59145876 A JP59145876 A JP 59145876A JP 14587684 A JP14587684 A JP 14587684A JP H0687780 B2 JPH0687780 B2 JP H0687780B2
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 遺伝子工学の1つの特徴は、真核生物起源の外来DNA配
列を大腸菌(Escherichia coli)又はその他の微生物に挿
入することにある。遺伝子工学で得られる別の優れた特
徴は、外来DNAがコードしているポリペプチドの産生を
これら微生物中で誘発することにある。ポリペプチドの
産生は2段階プロセスで生じ、各段階が多数のサブステ
ップを含むと考えられている。2つの段階は転写段階と
翻訳段階である。ポリペプチドを効率的に量産するため
にはプロセスの2つの段階が共に効率的に行なわれる必
要がある。転写によって遺伝子(DNA)からmRNAが生成
し、翻訳によってmRNAからポリペプチドが生成する。
列を大腸菌(Escherichia coli)又はその他の微生物に挿
入することにある。遺伝子工学で得られる別の優れた特
徴は、外来DNAがコードしているポリペプチドの産生を
これら微生物中で誘発することにある。ポリペプチドの
産生は2段階プロセスで生じ、各段階が多数のサブステ
ップを含むと考えられている。2つの段階は転写段階と
翻訳段階である。ポリペプチドを効率的に量産するため
にはプロセスの2つの段階が共に効率的に行なわれる必
要がある。転写によって遺伝子(DNA)からmRNAが生成
し、翻訳によってmRNAからポリペプチドが生成する。
転写プロセスの重要なサブステップは開始、即ちプロモ
ーター−オペレーター領域へのRNAポリメラーゼの結合
である。プロモーター領域を構成するデオキシリボヌク
レオチド塩基の配列を変更し、これによってプロモータ
ーの相対的効率を加減してもよい。効率はRNAポリメラ
ーゼのプロモーター親和性に左右される。
ーター−オペレーター領域へのRNAポリメラーゼの結合
である。プロモーター領域を構成するデオキシリボヌク
レオチド塩基の配列を変更し、これによってプロモータ
ーの相対的効率を加減してもよい。効率はRNAポリメラ
ーゼのプロモーター親和性に左右される。
翻訳効率はmRNAの安定性の影響を受ける。mRNAの安定性
が増すと翻訳効率が上がる。mRNA安定性の正確な決定因
子は正確にはわかっていないが、塩基配列によって決定
されるmRNAの二次構造が安定性に寄与することが判明し
ている。
が増すと翻訳効率が上がる。mRNA安定性の正確な決定因
子は正確にはわかっていないが、塩基配列によって決定
されるmRNAの二次構造が安定性に寄与することが判明し
ている。
翻訳の最初のサブステップでは、Shine-Dalgarno配列又
はリボソーム結合部位(RBS)として知られるmRNA上の
塩基配列にリボソームが結合する。リボソームがmRNAに
沿ってAUG翻訳開始コドンまで移動するとポリペプチド
合成が開始される。これらのコドンは通常、Shine-Dalg
arno部位から約10塩基“下流に”存在する。翻訳効率を
高める要因の1つに、Shine-Dalgarno部位へのリボソー
ムの結合を増強することが含まれる。Shine-Dalgarno配
列及びAUGコドンの領域でのmRNAの二次構造とShine-Dal
garno配列からAUGコドンまでの間隔とは、夫々、翻訳効
率の決定に関して重要な役割を果たすことが判明してい
る。翻訳効率に影響を与える別の要因は、早期終結及び
減衰である。減衰部位を除去することによって翻訳効率
を向上させることが可能である。
はリボソーム結合部位(RBS)として知られるmRNA上の
塩基配列にリボソームが結合する。リボソームがmRNAに
沿ってAUG翻訳開始コドンまで移動するとポリペプチド
合成が開始される。これらのコドンは通常、Shine-Dalg
arno部位から約10塩基“下流に”存在する。翻訳効率を
高める要因の1つに、Shine-Dalgarno部位へのリボソー
ムの結合を増強することが含まれる。Shine-Dalgarno配
列及びAUGコドンの領域でのmRNAの二次構造とShine-Dal
garno配列からAUGコドンまでの間隔とは、夫々、翻訳効
率の決定に関して重要な役割を果たすことが判明してい
る。翻訳効率に影響を与える別の要因は、早期終結及び
減衰である。減衰部位を除去することによって翻訳効率
を向上させることが可能である。
細菌細胞中で真核生物ポリペプチドを多量に産生する計
画の障害となるのは、多量のmRNAを産生する細胞が効率
良く増殖できないことである。このような障害は、抑制
というプロセスにより転写を阻害することによって除去
され得る。抑制に於いては、オペレーター領域に結合し
て転写を阻害するタンパク阻害剤(リプレッサータンパ
ク)の作用によって遺伝子がスイッチオフされる。微生
物が所望の細胞濃度まで増殖した後に、リプレッサーを
破壊するか又はリプレッサーの効果を凌駕し得る誘導物
質として知られる分子を添加することによって抑制され
ている遺伝子を活性化する。
画の障害となるのは、多量のmRNAを産生する細胞が効率
良く増殖できないことである。このような障害は、抑制
というプロセスにより転写を阻害することによって除去
され得る。抑制に於いては、オペレーター領域に結合し
て転写を阻害するタンパク阻害剤(リプレッサータンパ
ク)の作用によって遺伝子がスイッチオフされる。微生
物が所望の細胞濃度まで増殖した後に、リプレッサーを
破壊するか又はリプレッサーの効果を凌駕し得る誘導物
質として知られる分子を添加することによって抑制され
ている遺伝子を活性化する。
λバクテリオファージ由来のPLプロモーターを含むプラ
スミド中での真核生物遺伝子のクローニングに関しては
文献中に多くの報告が見られる(H.V.Bernard et al.,Ge
ne(1979)5,59;C.Derome et al.,Gene(1982)17,45;D.Ghe
y-sen et al.,Gene(1982)17,55;J.Hedgpeth et al.,Mo
l.Gen.Genet.(1978)163,197;E.Remaut et al.,Gene(198
1)15,81;R.Derynck et al.,Nature(1980)287,193)。更
に、1981年12月16日公開の欧州特許出願第041.767号
は、λバクテリオファージ由来のPLプロモーターを含む
発現ベクターを記載している。しかしながら、これらの
参考文献はいずれもCIIリボソーム結合部位の使用につ
いては記載していない。
スミド中での真核生物遺伝子のクローニングに関しては
文献中に多くの報告が見られる(H.V.Bernard et al.,Ge
ne(1979)5,59;C.Derome et al.,Gene(1982)17,45;D.Ghe
y-sen et al.,Gene(1982)17,55;J.Hedgpeth et al.,Mo
l.Gen.Genet.(1978)163,197;E.Remaut et al.,Gene(198
1)15,81;R.Derynck et al.,Nature(1980)287,193)。更
に、1981年12月16日公開の欧州特許出願第041.767号
は、λバクテリオファージ由来のPLプロモーターを含む
発現ベクターを記載している。しかしながら、これらの
参考文献はいずれもCIIリボソーム結合部位の使用につ
いては記載していない。
λバクテリオファージ由来のPLプロモーターとCIIリボ
ソーム結合部位とを含むベクターの使用については、A.
B.Oppenheim et al.,J.Mol.Biol.(1982)158,327並びに
H.Shimatake及びM.Rosenberg,Nature(1981)292,128に記
載されている。これらの刊行物は、高レベルのCIIタン
パクの産生について記載しているが、真核生物タンパク
の産生を包含又は記載していない。
ソーム結合部位とを含むベクターの使用については、A.
B.Oppenheim et al.,J.Mol.Biol.(1982)158,327並びに
H.Shimatake及びM.Rosenberg,Nature(1981)292,128に記
載されている。これらの刊行物は、高レベルのCIIタン
パクの産生について記載しているが、真核生物タンパク
の産生を包含又は記載していない。
1982年にShatzman及びRosenbergは第14回Miami Winter
Symposiumにポスターを提出した(A.R.Shatzman及びM.Ro
senberg,第14回Miami Winter Symposium,抄録98頁[198
2])。この抄録には、λバクテリオファージ由来のPLと
NutとCIIリボソーム結合部位とを含むベクターを使用し
て“真核生物”ポリペプチドを細菌宿主中で細胞タンパ
クの5%より高い量で合成することが開示されている
が、(SV40小T(small T)抗原は実際には真核生物ポリペ
プチドでなくウィルスタンパクであるし)、細菌宿主名
が示されていない、使用したオペレーターが定義されて
いない、複製起点(開始点)も選択可能な表現型の遺伝
子も認識されてない等の理由によって上記の開示は実施
不能である。このようなベクターを使用するこの系は、
このベクターを安定に形質転換し得るような或る種の宿
主溶原菌(host lysogen)を含むと記載されている。本発
明に於ける1つの具体例、例えばpMG100は、前記ベクタ
ーに対していくつかの類似点を有する。しかしながら、
ベクターpMG100による形質転換に用いられるのは宿主溶
原菌でなく、非耐熱性リプレッサーCIとN遺伝子とを含
有しているが前記溶原ファージ(lysogen)の残部が除去
されている適当なE.coli宿主菌株である。更にベクター
pMG100は総細胞タンパクの20%を上回る量でbGH及びhGH
アナログ(類似体)を産生するために使用された。
Symposiumにポスターを提出した(A.R.Shatzman及びM.Ro
senberg,第14回Miami Winter Symposium,抄録98頁[198
2])。この抄録には、λバクテリオファージ由来のPLと
NutとCIIリボソーム結合部位とを含むベクターを使用し
て“真核生物”ポリペプチドを細菌宿主中で細胞タンパ
クの5%より高い量で合成することが開示されている
が、(SV40小T(small T)抗原は実際には真核生物ポリペ
プチドでなくウィルスタンパクであるし)、細菌宿主名
が示されていない、使用したオペレーターが定義されて
いない、複製起点(開始点)も選択可能な表現型の遺伝
子も認識されてない等の理由によって上記の開示は実施
不能である。このようなベクターを使用するこの系は、
このベクターを安定に形質転換し得るような或る種の宿
主溶原菌(host lysogen)を含むと記載されている。本発
明に於ける1つの具体例、例えばpMG100は、前記ベクタ
ーに対していくつかの類似点を有する。しかしながら、
ベクターpMG100による形質転換に用いられるのは宿主溶
原菌でなく、非耐熱性リプレッサーCIとN遺伝子とを含
有しているが前記溶原ファージ(lysogen)の残部が除去
されている適当なE.coli宿主菌株である。更にベクター
pMG100は総細胞タンパクの20%を上回る量でbGH及びhGH
アナログ(類似体)を産生するために使用された。
更に、本発明の別の具体例では、CIIとは異なるリボソ
ーム結合部位が使用される。現状で最も好ましいベクタ
ーであるpND5及びその誘導体に於いては、pMG100で得ら
れるよりも10%以上多い量でポリペプチドを産生し得る
ベクターを作成するために、必須でない配列は除去して
ある。
ーム結合部位が使用される。現状で最も好ましいベクタ
ーであるpND5及びその誘導体に於いては、pMG100で得ら
れるよりも10%以上多い量でポリペプチドを産生し得る
ベクターを作成するために、必須でない配列は除去して
ある。
出願人は最近、National Institutes of Health,Dept.o
f Health and Human Services,米国,によるM.Rosenber
g名義で係属中の米国特許出願第457,352号の存在を知っ
た。この出願のある部分はNational Technical Informa
tion Service,U.S.Dept.of Commerceから入手できた
が、特許請求の範囲はまだ機密であり入手不能である。
出願人は該出願の入手し得た部分について検討し、この
開示も実施不能であるとの結論を得た。即ち、この開示
によれば宿主が重要であるのに(8頁17行)いかなる適
当な宿主も確認されていない。更に該出願はλ突然変異
体の使用を基盤とするのにこの突然変異体が特定されて
いない(4頁20行)。更に該出願では宿主が溶原ファー
ジを含む(8頁18行)が、本発明では宿主が溶原菌でな
い。該出願は真核生物遺伝子、サルメタロチオネイン遺
伝子のクローニング及び発現に言及しているが(7頁18
行)これらについて詳細に説明していない。該出願では
CIIリボソーム結合領域のいかなるヌクレオチドの配列
も位置も変更していないと述べられている(3頁27
行)。しかしながら本発明では、このような変更が可能
である。
f Health and Human Services,米国,によるM.Rosenber
g名義で係属中の米国特許出願第457,352号の存在を知っ
た。この出願のある部分はNational Technical Informa
tion Service,U.S.Dept.of Commerceから入手できた
が、特許請求の範囲はまだ機密であり入手不能である。
出願人は該出願の入手し得た部分について検討し、この
開示も実施不能であるとの結論を得た。即ち、この開示
によれば宿主が重要であるのに(8頁17行)いかなる適
当な宿主も確認されていない。更に該出願はλ突然変異
体の使用を基盤とするのにこの突然変異体が特定されて
いない(4頁20行)。更に該出願では宿主が溶原ファー
ジを含む(8頁18行)が、本発明では宿主が溶原菌でな
い。該出願は真核生物遺伝子、サルメタロチオネイン遺
伝子のクローニング及び発現に言及しているが(7頁18
行)これらについて詳細に説明していない。該出願では
CIIリボソーム結合領域のいかなるヌクレオチドの配列
も位置も変更していないと述べられている(3頁27
行)。しかしながら本発明では、このような変更が可能
である。
ウシ又はヒト生長ホルモンのPL‐CII含有ベクター系に
よる発現の成功、生物学的活性を有するbGH又はhGHアナ
ログの産生、このようなアナログを含有する組成物及び
その使用、又は、宿主によって産生される総タンパクの
20%を上回る量のポリペプチドの産生を達成する誘導方
法に関する開示は当業界にまだ存在しない。
よる発現の成功、生物学的活性を有するbGH又はhGHアナ
ログの産生、このようなアナログを含有する組成物及び
その使用、又は、宿主によって産生される総タンパクの
20%を上回る量のポリペプチドの産生を達成する誘導方
法に関する開示は当業界にまだ存在しない。
遺伝子工学的に作成したベクターで形質転換された宿主
によるbGHアナログの産生に関する当業界の唯一つの開
示は、天然bGHのフェニルアラニン型のN−末端にアミ
ノ酸Metを有するbGHアナログを産生するためにTrpプロ
モーターを使用する方法である(P.H.Seeburg等,DNA(198
3)2,37)。
によるbGHアナログの産生に関する当業界の唯一つの開
示は、天然bGHのフェニルアラニン型のN−末端にアミ
ノ酸Metを有するbGHアナログを産生するためにTrpプロ
モーターを使用する方法である(P.H.Seeburg等,DNA(198
3)2,37)。
遺伝子工学的に作成したベクターで形質転換された宿主
によるhGHアナログの産生に関する当業界の唯一つの開
示は、天然hGHのN−末端にアミノ酸Metを有するhGHア
ナログを産生するためにLac及びTrpプロモーターを使用
する方法である(D.V.Goedell等,Nature(1979)281,54
4)。
によるhGHアナログの産生に関する当業界の唯一つの開
示は、天然hGHのN−末端にアミノ酸Metを有するhGHア
ナログを産生するためにLac及びTrpプロモーターを使用
する方法である(D.V.Goedell等,Nature(1979)281,54
4)。
発明の要約 本発明は改良された発現ベクターに係る。
本発明ベクターは、非耐熱性リプレッサーCIを含む適当
な細菌宿主細胞、例えばEscherichia coliに導入された
際、宿主細胞がリプレッサー破壊温度まで加熱された時
この宿主細胞が前記ベクターに挿入された所望遺伝子を
発現せしめ得且つ前記遺伝子によりコードされたポリペ
プチドを産生し得るようにする。本発明ベクターは、
5′から3′に向かって、 λバクテリオファージ由来プロモーター及びオペレータ
ーPLOLを含むDNA配列と、 宿主細胞によって産生される抗転写終結因子Nタンパク
を結合するN利用部位(N utilization site)と、 所望遺伝子のmRNAを宿主細胞内のリボソームに結合せし
め得るリボソーム結合部位を含むDNA配列と、 ATG開始コドン又は所望遺伝子のベクター内挿入の際にA
TG開始コドンに変換されるDNA配列と、 ATG開始コドンと位相を合わせて所望遺伝子をベクター
内に挿入するための制限酵素部位と、 を順次に含む二本鎖DNA分子を含んでおり、更に、 宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミド由来の複製
起点を含むDNA配列と、宿主細胞中にベクターが存在す
るときに現れる選択可能又は認識可能な表現形質に関連
する遺伝子を含むDNA配列とを含む。好ましいベクター
はpMG100及びpND5である。
な細菌宿主細胞、例えばEscherichia coliに導入された
際、宿主細胞がリプレッサー破壊温度まで加熱された時
この宿主細胞が前記ベクターに挿入された所望遺伝子を
発現せしめ得且つ前記遺伝子によりコードされたポリペ
プチドを産生し得るようにする。本発明ベクターは、
5′から3′に向かって、 λバクテリオファージ由来プロモーター及びオペレータ
ーPLOLを含むDNA配列と、 宿主細胞によって産生される抗転写終結因子Nタンパク
を結合するN利用部位(N utilization site)と、 所望遺伝子のmRNAを宿主細胞内のリボソームに結合せし
め得るリボソーム結合部位を含むDNA配列と、 ATG開始コドン又は所望遺伝子のベクター内挿入の際にA
TG開始コドンに変換されるDNA配列と、 ATG開始コドンと位相を合わせて所望遺伝子をベクター
内に挿入するための制限酵素部位と、 を順次に含む二本鎖DNA分子を含んでおり、更に、 宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミド由来の複製
起点を含むDNA配列と、宿主細胞中にベクターが存在す
るときに現れる選択可能又は認識可能な表現形質に関連
する遺伝子を含むDNA配列とを含む。好ましいベクター
はpMG100及びpND5である。
生長ホルモン例えばウシ,ブタ,トリ又はヒトの生長ホ
ルモン,スーパーオキシドジスムターゼ,アポタンパク
E,口蹄疫ウィルスのウィルス性タンパク1,S.aureus由来
プロテインA,インターロイキンIII,酵素又はそのアナロ
グの如き所望のポリペプチドをコードする遺伝子即ちcD
NAを、ベクターの制限酵素部位に挿入してプラスミドを
作成する。次にこのプラスミドは適当な宿主に導入され
得、該宿主中で遺伝子が発現され所望のポリペプチドが
産生され得る。bGH用の好ましいプラスミドは、pRec2/3
及びpRO11であり、hGH用の好ましいプラスミドはpTV18
(1)及びpTV104(2)である。適当な宿主としてEscherichi
a coli A1637,A1645,A2602及びA1563があり、現在ではA
1637が好ましい。
ルモン,スーパーオキシドジスムターゼ,アポタンパク
E,口蹄疫ウィルスのウィルス性タンパク1,S.aureus由来
プロテインA,インターロイキンIII,酵素又はそのアナロ
グの如き所望のポリペプチドをコードする遺伝子即ちcD
NAを、ベクターの制限酵素部位に挿入してプラスミドを
作成する。次にこのプラスミドは適当な宿主に導入され
得、該宿主中で遺伝子が発現され所望のポリペプチドが
産生され得る。bGH用の好ましいプラスミドは、pRec2/3
及びpRO11であり、hGH用の好ましいプラスミドはpTV18
(1)及びpTV104(2)である。適当な宿主としてEscherichi
a coli A1637,A1645,A2602及びA1563があり、現在ではA
1637が好ましい。
得られた宿主ベクター系をポリペプチドの製造に使用し
得る。プラスミドを含む宿主細胞をポリペプチド産生可
能な適当な条件下で増殖させ、得られたポリペプチドを
回収する。現行の好ましい条件としては、約42℃で10乃
至30分、特に15分間増殖させ、次に約37乃至39℃で総増
殖期間が約60乃至90分間になるまで、特に38乃至39℃で
約75分間増殖を継続する。現行の好ましい増殖培地は、
ブドウ糖を加えたラクトアルブミン水解物又はブレーン
ハートインフュージョン(brain heart in-fusion)であ
る。
得る。プラスミドを含む宿主細胞をポリペプチド産生可
能な適当な条件下で増殖させ、得られたポリペプチドを
回収する。現行の好ましい条件としては、約42℃で10乃
至30分、特に15分間増殖させ、次に約37乃至39℃で総増
殖期間が約60乃至90分間になるまで、特に38乃至39℃で
約75分間増殖を継続する。現行の好ましい増殖培地は、
ブドウ糖を加えたラクトアルブミン水解物又はブレーン
ハートインフュージョン(brain heart in-fusion)であ
る。
宿主ベクター系を使用してbGH及びhGHのアナログを調製
した。これらのアナログは、夫々、獣医用又は医薬組成
物に混入することができる。
した。これらのアナログは、夫々、獣医用又は医薬組成
物に混入することができる。
これらのアナログは、夫々、ウシの乳分泌もしくは肉増
加を刺激するため又はヒト生長ホルモンの欠乏を治療す
るために、直接に又は前記の如き組成物として使用し得
る。
加を刺激するため又はヒト生長ホルモンの欠乏を治療す
るために、直接に又は前記の如き組成物として使用し得
る。
図面の説明 第1図:pMG100発現ベクターの構築 このプラスミドは、HpalとBamH1とによって開裂したpKC
30プラスミドDNA中に、HaeIII制限部位(38150)とSau3a
制限部位(38362)との間に含まれるλファージDNAの断片
を挿入することによって構築される。HaeIII-Sau3a断片
は、nutR,tR1,cy-とCIIタンパクのリボソーム結合部位
(CII‐RBS)を担持している。CII‐RBSを含むDNAをpKC
30にサブクローニングして、CII‐RBSのATG開始コドン
の直後に唯一つのBamH1制限部位を含み且つATGトリプレ
ット内にNde1制限部位を含むpMG100を作成する(第1図
底部挿入図参照)。かっこ内の数字はλファージDNA上
制限部位の位置を示す。
30プラスミドDNA中に、HaeIII制限部位(38150)とSau3a
制限部位(38362)との間に含まれるλファージDNAの断片
を挿入することによって構築される。HaeIII-Sau3a断片
は、nutR,tR1,cy-とCIIタンパクのリボソーム結合部位
(CII‐RBS)を担持している。CII‐RBSを含むDNAをpKC
30にサブクローニングして、CII‐RBSのATG開始コドン
の直後に唯一つのBamH1制限部位を含み且つATGトリプレ
ット内にNde1制限部位を含むpMG100を作成する(第1図
底部挿入図参照)。かっこ内の数字はλファージDNA上
制限部位の位置を示す。
第2図:pRec2/3プラスミドの構築 bGHcDNAを含むプラスミドD4をHaeIIで消化した。得られ
た1600bpの大断片を精製し、5ユニットのS1エキソヌク
レアーゼで37℃で5分間消化した。配列: GGAATTCC CCTTAAGG の合成EcoR1リンカーを連結した。生成物をEcoR1で開裂
し、EcoR1で開裂してあるpBR322中に挿入した。EcoR1で
開裂すると5′端に配列: AATTCCCA…… GGGT…… を有する1200bp断片を遊離するクローンpALR1を単離し
た。この配列が生成するということは、pALR1が真正bGH
の1番目の残基(フェニルアラニン)をコードするTTC
コドンを含むEcoR1制限部位を含有することを示してい
る。pALR1をPst1で部分開裂した。消化物をHindIIIリン
カーで連結し、EcoR1とHindIIIとで開裂した。bGHcDNA
を含む断片を単離し、EcoR1及びHindIIIの制限部位間で
pBR322にサブクローニングしpAL500を得た。サブクロー
ニングしたbGHcDNA断片をEcoR1及びHindIIIでpAL500か
ら切除し、DNAポリメラーゼ“Klenow"断片で“充填(fil
l in)し”、BamH1部位で開き上記と同様に“充填し”た
pMG100発現ベクター(第1図)に挿入した。得られたベ
クターpRec2/2は、アミノ末端が次式: MetAspGlnPhe1Pro2………bGH の如く変化している変性bGHを発現する。プラスミドpRe
c2/2をPst1で消化し、PLプロモーターとbGH遺伝子の
5′端とを含む断片を単離した(断片A)。この断片を
pAL500から得たPst1断片(断片B)に連結した。ここで
得られたベクターpRec2/3はアミノ末端が次式: MetAspGlnPhe1Pro2………bGH の如く変化している変性bGHを発現する。
た1600bpの大断片を精製し、5ユニットのS1エキソヌク
レアーゼで37℃で5分間消化した。配列: GGAATTCC CCTTAAGG の合成EcoR1リンカーを連結した。生成物をEcoR1で開裂
し、EcoR1で開裂してあるpBR322中に挿入した。EcoR1で
開裂すると5′端に配列: AATTCCCA…… GGGT…… を有する1200bp断片を遊離するクローンpALR1を単離し
た。この配列が生成するということは、pALR1が真正bGH
の1番目の残基(フェニルアラニン)をコードするTTC
コドンを含むEcoR1制限部位を含有することを示してい
る。pALR1をPst1で部分開裂した。消化物をHindIIIリン
カーで連結し、EcoR1とHindIIIとで開裂した。bGHcDNA
を含む断片を単離し、EcoR1及びHindIIIの制限部位間で
pBR322にサブクローニングしpAL500を得た。サブクロー
ニングしたbGHcDNA断片をEcoR1及びHindIIIでpAL500か
ら切除し、DNAポリメラーゼ“Klenow"断片で“充填(fil
l in)し”、BamH1部位で開き上記と同様に“充填し”た
pMG100発現ベクター(第1図)に挿入した。得られたベ
クターpRec2/2は、アミノ末端が次式: MetAspGlnPhe1Pro2………bGH の如く変化している変性bGHを発現する。プラスミドpRe
c2/2をPst1で消化し、PLプロモーターとbGH遺伝子の
5′端とを含む断片を単離した(断片A)。この断片を
pAL500から得たPst1断片(断片B)に連結した。ここで
得られたベクターpRec2/3はアミノ末端が次式: MetAspGlnPhe1Pro2………bGH の如く変化している変性bGHを発現する。
第3図:発現ベクターpND5,pND55及びpRO11の構築 プラスミドpOG7(A.Oppenheim,S.Gottesman及びM.Gottes
man,J.Mol.Biol.(1982)158,327)をNde1で開裂した。PL
プロモーターnutL,tR及びCII‐RBSを担う大断片の末端
を連結してpND5発現ベクターを得た。このpND5ベクター
DNAをNde1で開いた。bGHcDNAを含むpRec2/3(第2図)
から得たNde1断片を挿入しプラスミドpRO11を得た。プ
ラスミドpRO11は、第2図の変性bGHの発現体(expresso
r)としてpRec2/3より優れていると考えられる。Nde1で
開裂したpOG7に配列: TATGAGCTCA ACTCGAGTAT を有する合成リンカーを挿入すると、ATGの手前に唯一
つのSac1制限部位を含む発現ベクターpND55が得られ
る。pND55をSac1で開裂しDNAポリメラーゼ“Klenow"断
片で処理すると、PLプロモーター及びCII‐RBSの後に存
在するATG開始コドンが得られる。このベクターは、ATG
開始コドンが欠失している種々の真核生物遺伝子の発現
に適している。
man,J.Mol.Biol.(1982)158,327)をNde1で開裂した。PL
プロモーターnutL,tR及びCII‐RBSを担う大断片の末端
を連結してpND5発現ベクターを得た。このpND5ベクター
DNAをNde1で開いた。bGHcDNAを含むpRec2/3(第2図)
から得たNde1断片を挿入しプラスミドpRO11を得た。プ
ラスミドpRO11は、第2図の変性bGHの発現体(expresso
r)としてpRec2/3より優れていると考えられる。Nde1で
開裂したpOG7に配列: TATGAGCTCA ACTCGAGTAT を有する合成リンカーを挿入すると、ATGの手前に唯一
つのSac1制限部位を含む発現ベクターpND55が得られ
る。pND55をSac1で開裂しDNAポリメラーゼ“Klenow"断
片で処理すると、PLプロモーター及びCII‐RBSの後に存
在するATG開始コドンが得られる。このベクターは、ATG
開始コドンが欠失している種々の真核生物遺伝子の発現
に適している。
第4図:pTV18(1)とpTV104(2)との構築 hGHをコードするcDNAをpBR322のHindIII部位に標準法で
クローニングしてプラスミドpTVHGHを調製した(Meth.En
zymol.(1979)68,75)。このプラスミドをHindIIIで消化
した。得られた800bp断片を精製し、FnuDIIで更に消化
してDNAポリメラーゼ“Klenow"断片で“充填した”。こ
の処理によってhGHの最初の16個のアミノ酸のコドンが
除去される。得られたDNA断片を、Met14以後のhGHの配
列のコドンを回復し且つMet14のATGコドンの手前のNde1
制限部位を再生する合成リンカーと連結した。Nde1で処
理後、この半合成DNAをNde1で開いたpND5ベクターに挿
入した。得られたプラスミドpTV18(1)は、PLプロモータ
ーのコントロール下でhGHを発現する。このhGHは、最初
の13個のアミノ酸が欠失しておりN−末端にMet14を有
するアナログである。
クローニングしてプラスミドpTVHGHを調製した(Meth.En
zymol.(1979)68,75)。このプラスミドをHindIIIで消化
した。得られた800bp断片を精製し、FnuDIIで更に消化
してDNAポリメラーゼ“Klenow"断片で“充填した”。こ
の処理によってhGHの最初の16個のアミノ酸のコドンが
除去される。得られたDNA断片を、Met14以後のhGHの配
列のコドンを回復し且つMet14のATGコドンの手前のNde1
制限部位を再生する合成リンカーと連結した。Nde1で処
理後、この半合成DNAをNde1で開いたpND5ベクターに挿
入した。得られたプラスミドpTV18(1)は、PLプロモータ
ーのコントロール下でhGHを発現する。このhGHは、最初
の13個のアミノ酸が欠失しておりN−末端にMet14を有
するアナログである。
プラスミドpTV18(1)をNde1で部分消化し、hGHのアミノ
酸1-13のコドンを含む合成リンカー: TATGTTCCCAACCATTCCATTATCCCGTCTGTTCGACAACGC ACAAGGGTTGGTAAGGTAATAGGGCAGACAAGCTGTTGCGAT と結合した。このリンカーは更に、pTV18(1)のNde1部位
と相補的であり、完全hGH遺伝子をpND5発現ベクター
(第3図)のATG開始コドンと位相を合わせて配置す
る。従って、得られたプラスミドpTV104(2)はN−末端
に付加メチオニンを有する天然hGHを発現する。
酸1-13のコドンを含む合成リンカー: TATGTTCCCAACCATTCCATTATCCCGTCTGTTCGACAACGC ACAAGGGTTGGTAAGGTAATAGGGCAGACAAGCTGTTGCGAT と結合した。このリンカーは更に、pTV18(1)のNde1部位
と相補的であり、完全hGH遺伝子をpND5発現ベクター
(第3図)のATG開始コドンと位相を合わせて配置す
る。従って、得られたプラスミドpTV104(2)はN−末端
に付加メチオニンを有する天然hGHを発現する。
第5図はTrpプロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子に転写的に融合されたTrp遺伝子の最初の7個のアミ
ノ酸とを含むベクターpALTrp46を示す。
子に転写的に融合されたTrp遺伝子の最初の7個のアミ
ノ酸とを含むベクターpALTrp46を示す。
第6図,第7図及び第8図は、Trpプロモーターの一部
及びLacオペレーターとそれに続く所望遺伝子を挿入し
てTacプロモーターのコントロール下でbGHを発現させる
ための制限部位を含む一連の発現ベクター(Tac)を示
す。
及びLacオペレーターとそれに続く所望遺伝子を挿入し
てTacプロモーターのコントロール下でbGHを発現させる
ための制限部位を含む一連の発現ベクター(Tac)を示
す。
第9図及び第10図は、ヒスチジンプロモーターのコント
ロール下にあるbGHcDNA含有発現ベクターを示す。
ロール下にあるbGHcDNA含有発現ベクターを示す。
第11図はLacプロモーターのコントロール下の発現ベク
ターへのbGH遺伝子の挿入を示す。
ターへのbGH遺伝子の挿入を示す。
第12図は、OmpFプロモーターのコントロール下でのbGH
遺伝子の発現を示す。
遺伝子の発現を示す。
第13図:変容した制限部位をもつMet4‐bGHアナログpAL
401と発現ベクターpND6及びpND11との構築 bGHのアミノ末端の最初の3個のアミノ酸が欠失した修
飾形bGH(Met4bGH)を発現するpAL401の構築には以下の3
断片連結(triple ligation)を用いる。
401と発現ベクターpND6及びpND11との構築 bGHのアミノ末端の最初の3個のアミノ酸が欠失した修
飾形bGH(Met4bGH)を発現するpAL401の構築には以下の3
断片連結(triple ligation)を用いる。
(a)pAL500から切除したPvuIIとHindIIIとを有する62
3bpのbGH DNA断片。
3bpのbGH DNA断片。
(b)2本のDNA鎖を合成し、精製後アニールして を形成し、DNAポリメラーゼ“Klenow"断片を用いて“充
填し”、次にNde1とPvuIIとで開裂して58bp断片を調製
し、回収精製して得たリンカー。
填し”、次にNde1とPvuIIとで開裂して58bp断片を調製
し、回収精製して得たリンカー。
(c)発現ベクターpOG7のHindIIIと(ATG開始コドンか
ら遠い)1個のNde1部位を除去して得たpND6のSal1部位
にHindIIIリンカーを導入して得たpND11。
ら遠い)1個のNde1部位を除去して得たpND6のSal1部位
にHindIIIリンカーを導入して得たpND11。
第14図:アミノ末端がメチオニンで修飾された真正bGH
及び種々のbGHアナログの構築 a)プラスミドpAL401をNde1で処理する。ATG開始シグ
ナルと天然bGHのアミノ末端の最初の3個のアミノ酸の
コドンとを含む合成DNAリンカーをNde1部位に連結す
る。得られたベクターpAL601は、アミノ末端に付加メチ
オニン残基を含む天然bGHを発現せしめる。
及び種々のbGHアナログの構築 a)プラスミドpAL401をNde1で処理する。ATG開始シグ
ナルと天然bGHのアミノ末端の最初の3個のアミノ酸の
コドンとを含む合成DNAリンカーをNde1部位に連結す
る。得られたベクターpAL601は、アミノ末端に付加メチ
オニン残基を含む天然bGHを発現せしめる。
b)オリゴデオキシリボヌクレオチドリンカーの構造を
変形しa)に記載の手順を用いて、一連の修飾ウシ生長
ホルモンをコードする一群のベクターを構築する。修飾
生長ホルモンは、N−末端のメチオニンで始まり、続い
て1番目と2番目の各々に20個の自然発生アミノ酸のい
ずれかが存在し、3番目にGlu,Gln,Lys,Met及びTrp以外
の20個のアミノ酸のいずれかが存在する。4番目からCO
OH−末端までの配列は天然bGHの配列に等しい。
変形しa)に記載の手順を用いて、一連の修飾ウシ生長
ホルモンをコードする一群のベクターを構築する。修飾
生長ホルモンは、N−末端のメチオニンで始まり、続い
て1番目と2番目の各々に20個の自然発生アミノ酸のい
ずれかが存在し、3番目にGlu,Gln,Lys,Met及びTrp以外
の20個のアミノ酸のいずれかが存在する。4番目からCO
OH−末端までの配列は天然bGHの配列に等しい。
第15図:脛骨テスト(Tibia test) 下垂体切除ラットの骨板(bone plate)生長に対するpRec
2/3bGHアナログと真正bGHの影響の比較を示す。
2/3bGHアナログと真正bGHの影響の比較を示す。
発明の詳細な説明 本発明により、遺伝子発現とポリペプチド発現のレベル
向上を達成し得るベクターが開発された。本発明のベク
ターは二本鎖DNA分子である。このベクターを非耐熱性
リプレッサーCIを含む適当な細菌宿主細胞に導入し、宿
主細胞の温度をリプレッサー破壊温度まで上昇すると、
このベクターにより、宿主細胞は、このベクターに挿入
された所望遺伝子を発現せしめ得且つこの遺伝子がコー
ドしているポリペプチドを産生し得るようになる。
向上を達成し得るベクターが開発された。本発明のベク
ターは二本鎖DNA分子である。このベクターを非耐熱性
リプレッサーCIを含む適当な細菌宿主細胞に導入し、宿
主細胞の温度をリプレッサー破壊温度まで上昇すると、
このベクターにより、宿主細胞は、このベクターに挿入
された所望遺伝子を発現せしめ得且つこの遺伝子がコー
ドしているポリペプチドを産生し得るようになる。
前記ベクターは、5′から3′に向かって、 λバクテリオファージ由来のプロモーター及びオペレー
ターPLOLを含むDNA配列と、 宿主細胞によって産生される抗転写終結因子(antitermi
nator)Nタンパクを結合するN利用部位と、 所望遺伝子のmRNAを宿主細胞内のリボソームに結合せし
め得るリボソーム結合部位を含むDNA配列と、 ATG開始コドン又は所望遺伝子のベクター内挿入の際にA
TG開始コドンに変換されるDNA配列と、 ATG開始コドンと位相を合わせて所望遺伝子をベクター
内に挿入するための制限酵素部位と、 を順次に含む。
ターPLOLを含むDNA配列と、 宿主細胞によって産生される抗転写終結因子(antitermi
nator)Nタンパクを結合するN利用部位と、 所望遺伝子のmRNAを宿主細胞内のリボソームに結合せし
め得るリボソーム結合部位を含むDNA配列と、 ATG開始コドン又は所望遺伝子のベクター内挿入の際にA
TG開始コドンに変換されるDNA配列と、 ATG開始コドンと位相を合わせて所望遺伝子をベクター
内に挿入するための制限酵素部位と、 を順次に含む。
本発明のベクターは更に、宿主細胞中で自律複製し得る
細菌プラスミドから得た複製起点を含むDNA配列と、宿
主細胞中にベクターが存在するときに現れる選択可能又
は認識可能な表現形質に対応する遺伝子を含むDNA配列
とを含む。
細菌プラスミドから得た複製起点を含むDNA配列と、宿
主細胞中にベクターが存在するときに現れる選択可能又
は認識可能な表現形質に対応する遺伝子を含むDNA配列
とを含む。
ベクターと共に使用される宿主は、Escherichia coliで
ある。現在好ましいと考えられる菌株はA1637,A1645,A2
602及びA1563であり、A1637が最も好ましいと考えられ
ている。この菌株は、C600のガラクトースオペロンとガ
ラクトースオペロンに近いλ発現系との内部にテトラサ
イクリン耐性遺伝子含有のトランスポゾンを挿入して得
られたものである。この菌株は、詳細に後述する如き種
々のプラスミドを含有させてAmerican Type Culture Co
llection,Rockville,メリーランド,アメリカに寄託さ
れている。これらの寄託は全て、International Recogn
ition of the Deposit of Microorganismsに関するブタ
ペスト条約に基づく。
ある。現在好ましいと考えられる菌株はA1637,A1645,A2
602及びA1563であり、A1637が最も好ましいと考えられ
ている。この菌株は、C600のガラクトースオペロンとガ
ラクトースオペロンに近いλ発現系との内部にテトラサ
イクリン耐性遺伝子含有のトランスポゾンを挿入して得
られたものである。この菌株は、詳細に後述する如き種
々のプラスミドを含有させてAmerican Type Culture Co
llection,Rockville,メリーランド,アメリカに寄託さ
れている。これらの寄託は全て、International Recogn
ition of the Deposit of Microorganismsに関するブタ
ペスト条約に基づく。
A1645はGal+(ガラクトース発酵能)とテトラサイクリ
ン耐性の欠失に対する選択によってA1637から得られ
た。A1645はλ発現系を維持しているが、トランスポゾ
ンの一部は選択によって除去されている。その表現型は
C600r-m+gal+thr-leu-lacZ-(λcI857ΔH1ΔBAM N+)であ
る。
ン耐性の欠失に対する選択によってA1637から得られ
た。A1645はλ発現系を維持しているが、トランスポゾ
ンの一部は選択によって除去されている。その表現型は
C600r-m+gal+thr-leu-lacZ-(λcI857ΔH1ΔBAM N+)であ
る。
A2602とA1563とはSA500から誘導される。これらの表現
型は夫々、SA500 his-ilu-gal+Δ8(λCI857ΔH1ΔBAM
N+)及びSA500 his-ilu-gal+Δ8lacZxA21(λCI859 int2
xis1 nutL3 ΔH1)である。
型は夫々、SA500 his-ilu-gal+Δ8(λCI857ΔH1ΔBAM
N+)及びSA500 his-ilu-gal+Δ8lacZxA21(λCI859 int2
xis1 nutL3 ΔH1)である。
好ましくはベクターが共有結合で閉鎖した環状二本鎖分
子である。しかしながら、ベクターが共有結合的に閉鎖
することは必須条件ではない。
子である。しかしながら、ベクターが共有結合的に閉鎖
することは必須条件ではない。
宿主細胞がCIリプレッサー破壊温度まで加熱されるとベ
クターが発現レベルの向上を達成する。このためには約
42℃を上回る温度が有効である。不要な加熱は宿主細胞
に損傷を与えるのでできるだけ避けたほうがよい。従っ
て、一般的には温度が42℃を2乃至3°しか上回らない
ようにするのが好ましい。
クターが発現レベルの向上を達成する。このためには約
42℃を上回る温度が有効である。不要な加熱は宿主細胞
に損傷を与えるのでできるだけ避けたほうがよい。従っ
て、一般的には温度が42℃を2乃至3°しか上回らない
ようにするのが好ましい。
ベクターの1つの重要な成分はリボソーム結合部位であ
る。適当な部位は、配列: TAAGGAAATACTTACAT ATTCCTTTATGAATGTA を有するλバクテリオファージからのCII; 配列: TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA を有する合成オリゴヌクレオチド;及び配列: TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC を有するλバクテリオファージの主要頭部タンパク遺伝
子(major head protein gene)である。
る。適当な部位は、配列: TAAGGAAATACTTACAT ATTCCTTTATGAATGTA を有するλバクテリオファージからのCII; 配列: TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA を有する合成オリゴヌクレオチド;及び配列: TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC を有するλバクテリオファージの主要頭部タンパク遺伝
子(major head protein gene)である。
ベクターの別の成分は、ATG開始コドンと位相を合わせ
て所望遺伝子をベクターに挿入するための制限酵素部位
である。このような部位として種々の部位が使用され得
る。現在好ましいと考えられるのはBamH1,Sac1及びNde1
である。
て所望遺伝子をベクターに挿入するための制限酵素部位
である。このような部位として種々の部位が使用され得
る。現在好ましいと考えられるのはBamH1,Sac1及びNde1
である。
ベクターは更に、宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラ
スミド由来の複製起点を含む。適当な複製起点は種々の
起源から得られる。現在好ましいと考えられるのはpBR3
22又はpR1由来の複製起点ある。
スミド由来の複製起点を含む。適当な複製起点は種々の
起源から得られる。現在好ましいと考えられるのはpBR3
22又はpR1由来の複製起点ある。
ベクターが宿主細胞中に存在するときに現れる選択可能
又は認識可能な表現形質に対応する遺伝子を含むDNA配
列もベクターの成分の1つである。適当な遺伝子は温度
感受性又は薬剤耐性例えばアンピシリン,クロラムフェ
ニコールもしくはテトラサイクリンへの耐性に対応する
遺伝子である。
又は認識可能な表現形質に対応する遺伝子を含むDNA配
列もベクターの成分の1つである。適当な遺伝子は温度
感受性又は薬剤耐性例えばアンピシリン,クロラムフェ
ニコールもしくはテトラサイクリンへの耐性に対応する
遺伝子である。
従来の科学文献に記載されたベクターに比較して本発明
のベクターは、所望ポリペプチド産物をコードする多く
の種類の遺伝子の発現向上のために使用され得る。適当
な遺伝子としては、生長ホルモン、例えばウシ,ブタ,
トリ(ニワトリ)もしくはヒトの生長ホルモン,スーパ
ーオキシドジスムターゼ,アポタンパクE,手足口病ウィ
ルスのウィルスタンパク1,S.aureusのプロテインA,イン
ターロイキンIII,酵素又はこれらのアナログをコードす
る遺伝子を挙げることができる。アナログなる用語は、
自然発生ポリペプチドと同じ活性を有するがポリペプチ
ドのN末端に1つ以上の別のアミノ酸を有するポリペプ
チドを意味する。
のベクターは、所望ポリペプチド産物をコードする多く
の種類の遺伝子の発現向上のために使用され得る。適当
な遺伝子としては、生長ホルモン、例えばウシ,ブタ,
トリ(ニワトリ)もしくはヒトの生長ホルモン,スーパ
ーオキシドジスムターゼ,アポタンパクE,手足口病ウィ
ルスのウィルスタンパク1,S.aureusのプロテインA,イン
ターロイキンIII,酵素又はこれらのアナログをコードす
る遺伝子を挙げることができる。アナログなる用語は、
自然発生ポリペプチドと同じ活性を有するがポリペプチ
ドのN末端に1つ以上の別のアミノ酸を有するポリペプ
チドを意味する。
ベクターは、本発明の分野の当業者に公知の方法で形成
され得る。これらの方法は本明細書中で参考として示し
た種々の刊行物に極めて詳細に記載されており、これら
の刊行物の内容は、技術状態に関する完全な情報を与え
るために本明細書中に含まれるものとする。
され得る。これらの方法は本明細書中で参考として示し
た種々の刊行物に極めて詳細に記載されており、これら
の刊行物の内容は、技術状態に関する完全な情報を与え
るために本明細書中に含まれるものとする。
現在好ましいとされるベクターの1つは、第1図の制限
地図を有するpMG100である。このベクターのBamH1制限
部位にウシ生長ホルモンをコードするcDNAを挿入した。
得られたプラスミドはpRec2/3と指称される。このプラ
スミドの制限地図を第2図に示す。プラスミドpRec2/3
は従来の形質転換法を用いてEscherichia coli A1637株
に導入された。得られた宿主ベクター系をATCC受託番号
39385で寄託した。
地図を有するpMG100である。このベクターのBamH1制限
部位にウシ生長ホルモンをコードするcDNAを挿入した。
得られたプラスミドはpRec2/3と指称される。このプラ
スミドの制限地図を第2図に示す。プラスミドpRec2/3
は従来の形質転換法を用いてEscherichia coli A1637株
に導入された。得られた宿主ベクター系をATCC受託番号
39385で寄託した。
現在好ましいとされる第2のベクターは第3図の制限地
図を有するpND5である。ウシ生長ホルモンcDNAをNde1制
限部位に挿入した。得られたプラスミドをpRO11と指称
する。pRO11の制限地図も第3図に示されている。プラ
スミドpRO11を形質転換によってE.coli A1637株に導入
した。得られた宿主ベクター系をATCC受託番号39390で
寄託した。
図を有するpND5である。ウシ生長ホルモンcDNAをNde1制
限部位に挿入した。得られたプラスミドをpRO11と指称
する。pRO11の制限地図も第3図に示されている。プラ
スミドpRO11を形質転換によってE.coli A1637株に導入
した。得られた宿主ベクター系をATCC受託番号39390で
寄託した。
ベクターpND5もまたヒト生長ホルモンのクローニングに
使用された。pTV18(1)なる名称の1つのプラスミドとpT
V104(2)なる名称の別のプラスミドとを、hGHcDNAをNde1
制限部位に挿入することによって作成した。pTV18(1)は
第4図に示されている。このプラスミドを形質転換によ
ってE.coli A1637株に導入した。得られた宿主ベクター
系をATCC受託番号39386で寄託した。pTV104(2)は第4図
に示されている。このプラスミドもまたE.coli A1637株
に導入された。得られた宿主ベクター系をATCC受託番号
39384で寄託した。
使用された。pTV18(1)なる名称の1つのプラスミドとpT
V104(2)なる名称の別のプラスミドとを、hGHcDNAをNde1
制限部位に挿入することによって作成した。pTV18(1)は
第4図に示されている。このプラスミドを形質転換によ
ってE.coli A1637株に導入した。得られた宿主ベクター
系をATCC受託番号39386で寄託した。pTV104(2)は第4図
に示されている。このプラスミドもまたE.coli A1637株
に導入された。得られた宿主ベクター系をATCC受託番号
39384で寄託した。
同じ手順を使用し、本発明のベクターの制限酵素部位に
所望ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入することに
よって別のプラスミドを調製し得る。
所望ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入することに
よって別のプラスミドを調製し得る。
上記の宿主ベクター系ではE.coli A1637を使用した。し
かしながら、既に示したようにA1645,A2602及びA1563の
如き別の菌株の使用も可能である。これらの宿主ベクタ
ー系は、ウシ及びヒトの生長ホルモンの如きポリペプチ
ドの産生に使用され得る。そのためには、ポリペプチド
を産生し得る適当な条件下で宿主ベクター系を増殖し、
次にポリペプチドを回収する。
かしながら、既に示したようにA1645,A2602及びA1563の
如き別の菌株の使用も可能である。これらの宿主ベクタ
ー系は、ウシ及びヒトの生長ホルモンの如きポリペプチ
ドの産生に使用され得る。そのためには、ポリペプチド
を産生し得る適当な条件下で宿主ベクター系を増殖し、
次にポリペプチドを回収する。
適当な条件とは、約42℃で適当な時間を要して宿主ベク
ター系を増殖させ、次いで約37〜39℃で更に或る程度の
時間増殖を継続することを意味し、この増殖は適当な培
地中で実施する。
ター系を増殖させ、次いで約37〜39℃で更に或る程度の
時間増殖を継続することを意味し、この増殖は適当な培
地中で実施する。
好ましくは、42℃での初期増殖時間が約10乃至30分間で
あり、37〜39℃での増殖時間は総増殖時間が約60乃至90
分間になるように選択される。好ましくは42℃で約15分
間の増殖と38〜39℃で約75分間の増殖とを順次に行う。
適当な培地としては、ブドウ糖を加えたラクトアルブミ
ン水解物とブレーンハートインフュージョンとがある。
宿主中でベクターを安定に維持するには、例えば抗生物
質を加えて宿主を選択圧(selective pressure)下に維持
することが不可欠である。
あり、37〜39℃での増殖時間は総増殖時間が約60乃至90
分間になるように選択される。好ましくは42℃で約15分
間の増殖と38〜39℃で約75分間の増殖とを順次に行う。
適当な培地としては、ブドウ糖を加えたラクトアルブミ
ン水解物とブレーンハートインフュージョンとがある。
宿主中でベクターを安定に維持するには、例えば抗生物
質を加えて宿主を選択圧(selective pressure)下に維持
することが不可欠である。
前記方法によって、多数のbGH及びhGHアナログを調製し
た。これらは自然発生ホルモンの活性を有するか又は有
し得る。
た。これらは自然発生ホルモンの活性を有するか又は有
し得る。
bGHアナログは天然bGHの活性を有しており、N−末端で
5個以内のアミノ酸が変化している以外は天然bGHと等
しいアミノ酸配列を有する。アミノ酸変化の例として
は、 (1)フェニルアラニン形bGHのN−末端に付加された
アミノ酸メチオニン, (2)アラニン形bGHのN−末端に付加されたアミノ酸
メチオニン, (3)フェニルアラニン形bGHのN−末端に付加された
アミノ酸配列Met-Asp-Gln, (4)アラニン形bGHのN−末端に付加されたアミノ酸
配列Ala-Gly, (5)アラニン形bGHのN−末端に付加されたアミノ酸
配列Met-Gly, (6)アラニン形bGHのN−末端に付加されたアミノ酸
配列Met-Asp-Pro-Gly, (7)フェニルアラニン形bGHのN−末端に付加された
アミノ酸配列Met-Asp-Pro, (8)フェニルアラニン形bGHのN−末端に付加された
アミノ酸配列Met-Thr-Arg, (9)フェニルアラニン形bGHのN−末端から除去され
たメチオニン(4番目)までのアミノ酸がある。
5個以内のアミノ酸が変化している以外は天然bGHと等
しいアミノ酸配列を有する。アミノ酸変化の例として
は、 (1)フェニルアラニン形bGHのN−末端に付加された
アミノ酸メチオニン, (2)アラニン形bGHのN−末端に付加されたアミノ酸
メチオニン, (3)フェニルアラニン形bGHのN−末端に付加された
アミノ酸配列Met-Asp-Gln, (4)アラニン形bGHのN−末端に付加されたアミノ酸
配列Ala-Gly, (5)アラニン形bGHのN−末端に付加されたアミノ酸
配列Met-Gly, (6)アラニン形bGHのN−末端に付加されたアミノ酸
配列Met-Asp-Pro-Gly, (7)フェニルアラニン形bGHのN−末端に付加された
アミノ酸配列Met-Asp-Pro, (8)フェニルアラニン形bGHのN−末端に付加された
アミノ酸配列Met-Thr-Arg, (9)フェニルアラニン形bGHのN−末端から除去され
たメチオニン(4番目)までのアミノ酸がある。
bGHアナログは、アミノ酸配列: Met-(X)n-Y-Met… [式中、MetはN−末端、Xは20個の自然発生アミノ酸
のいずれか、YはGlu,Gln,Lys,Met又はTrp以外の20個の
アミノ酸のいずれか、nは0乃至6の整数及びMet…
は、4番目からCOOH−末端(191番目)までの天然bGHの
配列である]を有する。
のいずれか、YはGlu,Gln,Lys,Met又はTrp以外の20個の
アミノ酸のいずれか、nは0乃至6の整数及びMet…
は、4番目からCOOH−末端(191番目)までの天然bGHの
配列である]を有する。
hGHアナログは天然hGHの活性を有しており、N−末端の
変化以外は天然hGHと等しいアミノ酸配列を有する。ア
ミノ酸変化の例としては、 (1)天然hGHのN−末端に付加されたアミノ酸メチオ
ニン, (2)hGHのN−末端から除去されたメチオニン(14番
目)までのアミノ酸がある。
変化以外は天然hGHと等しいアミノ酸配列を有する。ア
ミノ酸変化の例としては、 (1)天然hGHのN−末端に付加されたアミノ酸メチオ
ニン, (2)hGHのN−末端から除去されたメチオニン(14番
目)までのアミノ酸がある。
hGHアナログは、アミノ酸配列: Met-(X)n-Y-Met… [式中、MetはN−末端、Xは20個の自然発生アミノ酸
のいずれか、YはGlu,Gln,Lys,Met又はTrp以外の20個の
アミノ酸のいずれか、nは0乃至13の整数及びMet…
は、14番目からCOOH−末端(191番目)までの天然hGHの
配列である]を有する。
のいずれか、YはGlu,Gln,Lys,Met又はTrp以外の20個の
アミノ酸のいずれか、nは0乃至13の整数及びMet…
は、14番目からCOOH−末端(191番目)までの天然hGHの
配列である]を有する。
有効量の1種以上のbGHアナログと適当な担体とを含有
する獣医用組成物を調製し得る。このような担体は当業
者に公知である。ウシの乳分泌又は肉形成を促進するた
めにアナログを直接ウシに投与してもよく、又は組成物
にして投与してもよい。
する獣医用組成物を調製し得る。このような担体は当業
者に公知である。ウシの乳分泌又は肉形成を促進するた
めにアナログを直接ウシに投与してもよく、又は組成物
にして投与してもよい。
有効量の1種以上のhGHアナログと適当な担体とを含有
する薬剤組成物を調製し得る。これらの担体は当業者に
公知である。hGHの分泌不足を生じた患者を治療するた
めに、患者例えば小人症患者にアナログを直接投与して
もよく、又は組成物にして投与してもよい。
する薬剤組成物を調製し得る。これらの担体は当業者に
公知である。hGHの分泌不足を生じた患者を治療するた
めに、患者例えば小人症患者にアナログを直接投与して
もよく、又は組成物にして投与してもよい。
実施例 以下の実施例は本発明の理解を助けるために提示された
ものであり、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発
明の範囲を限定すると解釈されてはならない。実施例に
おいては、ベクターの構築、該当ポリペプチドをコード
する遺伝子のベクター内挿入、得られたプラスミドの細
菌宿主内導入等のために使用された従来方法について詳
細に説明していないが、これらの方法は当業者に公知で
あり、以下の如き多数の刊行物に記載されている。
ものであり、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発
明の範囲を限定すると解釈されてはならない。実施例に
おいては、ベクターの構築、該当ポリペプチドをコード
する遺伝子のベクター内挿入、得られたプラスミドの細
菌宿主内導入等のために使用された従来方法について詳
細に説明していないが、これらの方法は当業者に公知で
あり、以下の如き多数の刊行物に記載されている。
Principles of Gene Manipulation,An Introduction to
Genetic Engineering,2nd Edition,edited by R.W.Old
and S.B.Primrose,Univ.of Calif.Press(1981) Met.Enzymol.vol.68,Recombinant DNA,edited by Ray W
u Academic Press(1979) Met.Enzymol.vol.65,Nucleic Acids(Part 1),edited by
Lawrence Grossman and Kivie Moldave Academic Pres
s(1980) T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cl
oning;A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labor
atory,NY(1982) H.V.Bernard et al.,Gene(1979)5,59 A.B.Oppenheim et al.,J.Mol.Biol.(1982)158,327 E.Remaut et al.,Gene(1981)15,81 実施例1 発現ベクター 本明細書で使用される発現ベクターなる用語は、細菌特
にE.coli中で所望遺伝子を発現するのに有用な1群のプ
ラスミドを意味する。所望遺伝子を発現ベクター内に挿
入してもよく、又は発現ベクターのプロモーターを切除
して所望遺伝子の手前に入れてもよい。
Genetic Engineering,2nd Edition,edited by R.W.Old
and S.B.Primrose,Univ.of Calif.Press(1981) Met.Enzymol.vol.68,Recombinant DNA,edited by Ray W
u Academic Press(1979) Met.Enzymol.vol.65,Nucleic Acids(Part 1),edited by
Lawrence Grossman and Kivie Moldave Academic Pres
s(1980) T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cl
oning;A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labor
atory,NY(1982) H.V.Bernard et al.,Gene(1979)5,59 A.B.Oppenheim et al.,J.Mol.Biol.(1982)158,327 E.Remaut et al.,Gene(1981)15,81 実施例1 発現ベクター 本明細書で使用される発現ベクターなる用語は、細菌特
にE.coli中で所望遺伝子を発現するのに有用な1群のプ
ラスミドを意味する。所望遺伝子を発現ベクター内に挿
入してもよく、又は発現ベクターのプロモーターを切除
して所望遺伝子の手前に入れてもよい。
I.PL発現ベクター A.pMG100 第1図に示し、前記図面の説明中で詳細に説明したよう
にpMG100はマルチコピープラスミドpBR322に挿入された
λDNAを有する。λDNAの顕著な特徴は、λPLプロモータ
ーとN利用部位L及びR(nutL及びnutR)と終結R1部位(t
R1)とCIIリボソーム結合部位とATG開始コドンとを含む
ことである。別の特徴は、第1図に示される。
にpMG100はマルチコピープラスミドpBR322に挿入された
λDNAを有する。λDNAの顕著な特徴は、λPLプロモータ
ーとN利用部位L及びR(nutL及びnutR)と終結R1部位(t
R1)とCIIリボソーム結合部位とATG開始コドンとを含む
ことである。別の特徴は、第1図に示される。
pMG100はpKC30から調製された。pKC30はλPLプロモータ
ーを以下の如くサブクローニングして調製された。
ーを以下の如くサブクローニングして調製された。
λファージDNAをXhol及びSmal制限エンドヌクレアーゼ
で消化し、6393bpから成る唯一つの断片を精製し、続い
てHindIII及びBamH1制限エンドヌクレアーゼで消化し
た。2397bpから成り、PLプロモーターを含む断片が得ら
れた。この断片を精製し、HindIII及びBamH1消化物から
単離したpBR322DNA大断片に結合した。サブクローンを
コロニーハイブリダイゼーションで同定し、回収しプラ
スミドDNAを単離した(A.Oppenheim et al.,J.Mol.Biol.
(1982)158,327)。
で消化し、6393bpから成る唯一つの断片を精製し、続い
てHindIII及びBamH1制限エンドヌクレアーゼで消化し
た。2397bpから成り、PLプロモーターを含む断片が得ら
れた。この断片を精製し、HindIII及びBamH1消化物から
単離したpBR322DNA大断片に結合した。サブクローンを
コロニーハイブリダイゼーションで同定し、回収しプラ
スミドDNAを単離した(A.Oppenheim et al.,J.Mol.Biol.
(1982)158,327)。
このプラスミドと真核生物遺伝子を含む誘導体とは適当
なE.coli宿主中に維持し得る。宿主の最も重要な特徴は
この宿主が熱感受性リプレッサーCI857と抗転写終結因
子(antitermination)Nタンパクとを与えることである
(M.E.Gottesman et al.,J.Mol.Biol.(1978)140,197)。
なE.coli宿主中に維持し得る。宿主の最も重要な特徴は
この宿主が熱感受性リプレッサーCI857と抗転写終結因
子(antitermination)Nタンパクとを与えることである
(M.E.Gottesman et al.,J.Mol.Biol.(1978)140,197)。
このベクターは、従来の発現ベクターに比較して以下の
如き多くの利点を有する。
如き多くの利点を有する。
1.発現レベルが極めて高いこと このベクターはE.coli中の外来タンパクの発現を総細胞
タンパクの15〜25%という高レベルで誘発し得る。
タンパクの15〜25%という高レベルで誘発し得る。
2.発現を熱感応的に調節し得ること PLプロモーターはCIリプレッサーが結合しているときは
不活性である。CI857リプレッサーは熱感受性である。
即ち、30℃ではプロモーターに結合するが、42℃で失活
する。従って、発酵温度を42℃まで上げると宿主細菌で
所望タンパクの産生が誘発される。
不活性である。CI857リプレッサーは熱感受性である。
即ち、30℃ではプロモーターに結合するが、42℃で失活
する。従って、発酵温度を42℃まで上げると宿主細菌で
所望タンパクの産生が誘発される。
このような系は以下の利点を含む。
(a)E.coliに毒性の外来タンパクを所望の時に産生し
得、これにより発酵プロセスの早期での細胞死を回避し
得る。
得、これにより発酵プロセスの早期での細胞死を回避し
得る。
(b)タンパクの産生亢進が系を安定させ、タンパク分
解を阻止する(Y.E.Cheng et al.,Gene(1981)14,121)。
従って、厳密に調整されたプロモーター例えばPLを使用
する“瞬間的”産生亢進は連続的な低レベル産生よりも
好ましいであろう。
解を阻止する(Y.E.Cheng et al.,Gene(1981)14,121)。
従って、厳密に調整されたプロモーター例えばPLを使用
する“瞬間的”産生亢進は連続的な低レベル産生よりも
好ましいであろう。
3.コピー数が多いこと。
E.coli中に少ないコピー数で存在するλ自体と対照的
に、pMG100中のPLプロモーターはプラスミド上で多いコ
ピー数を示した。これにより発現レベルが上がる。
に、pMG100中のPLプロモーターはプラスミド上で多いコ
ピー数を示した。これにより発現レベルが上がる。
4.リボソーム結合部位と開始コドンとを有すること。
この発現ベクターは強力な原核生物リボソーム結合部位
(RBS)と翻訳開始コドン(ATG)とを含む。従って、開
始コドンの付加を要せずにいかなる真核生物遺伝子のク
ローニングも可能である。更に、有効RBSは発現レベル
を上げる。
(RBS)と翻訳開始コドン(ATG)とを含む。従って、開
始コドンの付加を要せずにいかなる真核生物遺伝子のク
ローニングも可能である。更に、有効RBSは発現レベル
を上げる。
5.適当な制限部位が存在すること。
発現ベクターはATG開始コドンの直後にBamHI部位を有し
ており、これにより最適発現を達成するために所望遺伝
子を適正配置し得る。
ており、これにより最適発現を達成するために所望遺伝
子を適正配置し得る。
6.Nut部位を有すること。
宿主によって与えられるNタンパクは発現ベクターのNu
t部位に結合し、これによりtR1部位での転写終了を阻止
する。
t部位に結合し、これによりtR1部位での転写終了を阻止
する。
B.pND5 第3図に示す如く、pND5はPLプロモーターと本発明の発
現ベクターの別の重要な成分とを含む。pND5はリボソー
ム結合部位の直後に唯一つのNde1部位を含む。リボソー
ム結合部位は正常なCII部位とは異なっており、配列: TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA を有する。
現ベクターの別の重要な成分とを含む。pND5はリボソー
ム結合部位の直後に唯一つのNde1部位を含む。リボソー
ム結合部位は正常なCII部位とは異なっており、配列: TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA を有する。
この配列は、突然変異体から誘導されるか、又は化学的
に合成され得る。前記図面の説明で詳細に記載したよう
にpND5はpOG7から誘導されたものである(A.Oppenheim e
t al.,J.Mol.Biol.(1982)158,327)。このベクターは翻
訳開始コドンを含まない。このベクターは、bGHアナロ
グを含むpMG100に比較して特に向上した収率で修飾bGH
及びhGHを最高度に発現すると考えられる。
に合成され得る。前記図面の説明で詳細に記載したよう
にpND5はpOG7から誘導されたものである(A.Oppenheim e
t al.,J.Mol.Biol.(1982)158,327)。このベクターは翻
訳開始コドンを含まない。このベクターは、bGHアナロ
グを含むpMG100に比較して特に向上した収率で修飾bGH
及びhGHを最高度に発現すると考えられる。
C.pND55 pND55はCII‐RBSとATG開始コドンとの手前に適当な制限
部位Sac1を含むpND5の誘導体である。プラスミドをこの
部位で開裂し、次にDNAポリメラーゼKlenow断片で処理
すると、ATG開始コドンが与えられる。このコドンに所
望の任意の遺伝子を結合し得る(第3図及び第3図の説
明参照)。
部位Sac1を含むpND5の誘導体である。プラスミドをこの
部位で開裂し、次にDNAポリメラーゼKlenow断片で処理
すると、ATG開始コドンが与えられる。このコドンに所
望の任意の遺伝子を結合し得る(第3図及び第3図の説
明参照)。
II.TRP発現ベクター A.pAL Trp46 pAL Trp46は、Trpプロモーターとβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子に融合したTrpE遺伝子の最初の7つのアミノ酸と
を含む(第5図)。所望の遺伝子は、TrpEの7個のアミ
ノ酸の後のBamHI部位に挿入され得る。
遺伝子に融合したTrpE遺伝子の最初の7つのアミノ酸と
を含む(第5図)。所望の遺伝子は、TrpEの7個のアミ
ノ酸の後のBamHI部位に挿入され得る。
B.pAL Trp47;アテニュエーターの欠失したTrp46 これはTrpプロモーターの減衰領域が欠失したTrp46に基
づいて構築されたものである。
づいて構築されたものである。
C.Trp-Lac融合物 プラスミドp4754上でのこのプロモーターの構築が第6
図及び第7図に示されている。この構築の変形が第8図
に示されている。
図及び第7図に示されている。この構築の変形が第8図
に示されている。
III.ヒスチジンプロモーター発現ベクター この発現ベクターの構築は第9図及び第10図に示されて
いる。
いる。
IV.使用される別のプロモーター A.Lac このプロモーターは第11図の如くpYL301の構築に使用さ
れた。
れた。
B.OmpF これは、シグナル配列に結合したタンパクを発現するプ
ロモーターシステムである。タンパクが膜を通って輸送
されるときにこのシグナル配列は除去される(第12
図)。
ロモーターシステムである。タンパクが膜を通って輸送
されるときにこのシグナル配列は除去される(第12
図)。
実施例2 ウシ生長ホルモン bGHcDNA修飾の出発点は既に知られているプラスミドD4
である(E.Keshet et al.,Nucleic Acids Research(198
1)9,19)。D4プラスミドはまた、1980年3月24日付イス
ラエル特許出願第59,690号の優先権を主張した1981年3
月20日付の米国特許出願第245,943号にも記載されてい
る。このプラスミドは、E.coli宿主中でAmerican Type
Culture CollectionにATCC受託番号31826で寄託されて
いる。
である(E.Keshet et al.,Nucleic Acids Research(198
1)9,19)。D4プラスミドはまた、1980年3月24日付イス
ラエル特許出願第59,690号の優先権を主張した1981年3
月20日付の米国特許出願第245,943号にも記載されてい
る。このプラスミドは、E.coli宿主中でAmerican Type
Culture CollectionにATCC受託番号31826で寄託されて
いる。
I.pRec2/3bGH pRec2/3の構築は第2図に示されており、前記図面の説
明中に記載されている。正しい解読枠を与えるためにD4
から得たbGHcDNAをpMG100に挿入する前に処理した。
明中に記載されている。正しい解読枠を与えるためにD4
から得たbGHcDNAをpMG100に挿入する前に処理した。
pRec2/3を公知方法の形質転換によってA1637をも含む種
々のE.coli株に導入する。pRec2/3を含むA1637はATCC受
託番号39385で寄託されている。この菌株は増殖及び誘
発されると、フェニルアラニン形天然bGHのN−末端に
付加されたアミノ酸配列Met-Asp-Glnを有するbGHアナロ
グを産生する。クーマシー染色SDSポリアクリルアミド
ゲルの走査によって算出すると、pRec2/3によって産生
されたbGHアナログの量は細菌によって産生される総タ
ンパクの約23%であった。
々のE.coli株に導入する。pRec2/3を含むA1637はATCC受
託番号39385で寄託されている。この菌株は増殖及び誘
発されると、フェニルアラニン形天然bGHのN−末端に
付加されたアミノ酸配列Met-Asp-Glnを有するbGHアナロ
グを産生する。クーマシー染色SDSポリアクリルアミド
ゲルの走査によって算出すると、pRec2/3によって産生
されたbGHアナログの量は細菌によって産生される総タ
ンパクの約23%であった。
II.pRO11 pRO11の構築は第3図に示されており、前記図面の説明
に記載されている。pND5ベクターDNAをNde1で制限す
る。bGHcDNAを含むpRec2/3(第2図)からのNde1断片を
挿入すると、プラスミドpRO11が得られる。
に記載されている。pND5ベクターDNAをNde1で制限す
る。bGHcDNAを含むpRec2/3(第2図)からのNde1断片を
挿入すると、プラスミドpRO11が得られる。
pRO11を形質転換によってE.coli A1637に導入した。得
られた宿主ベクター系をATCC受託番号39390で寄託し
た。この菌株は増殖し誘発されると、pRec2/3と同じア
ナログを産生する。予備的な結果ではpRO11がpRec2/3よ
りも20%以上の増加量のbGHを産生することが判明し
た。菌株の増殖、産生されたbGHアナログの回収及び精
製には実施例4のpRec2/3の場合と同じ方法を使用す
る。
られた宿主ベクター系をATCC受託番号39390で寄託し
た。この菌株は増殖し誘発されると、pRec2/3と同じア
ナログを産生する。予備的な結果ではpRO11がpRec2/3よ
りも20%以上の増加量のbGHを産生することが判明し
た。菌株の増殖、産生されたbGHアナログの回収及び精
製には実施例4のpRec2/3の場合と同じ方法を使用す
る。
III.pAL401 pAL401の構築は第13図に示されており、前記図面の説明
に記載されている。D4からpAL-500(第2図)を経由し
て得られたbGHcDNAは第13図に示す如く、pND11に挿入さ
れた。
に記載されている。D4からpAL-500(第2図)を経由し
て得られたbGHcDNAは第13図に示す如く、pND11に挿入さ
れた。
pAL401は形質転換によってE.coli A1637に導入され得
る。得られた菌株は天然bGHのMet4がN−末端にあり、M
et4の手前のアミノ酸が欠失しているbGHアナログを産生
する。
る。得られた菌株は天然bGHのMet4がN−末端にあり、M
et4の手前のアミノ酸が欠失しているbGHアナログを産生
する。
IV.pAL601 pAL601の構築は第14図に示されており前記図面の説明に
記載されている。このプラスミドはpAL401(第13図)の
誘導体である。
記載されている。このプラスミドはpAL401(第13図)の
誘導体である。
pAL601は形質転換によってE.coli A1637に導入され得
る。得られた菌株は、フェニルアラニン形bGHのN末端
にMetが付加されたbGHのアナログを産生する。
る。得られた菌株は、フェニルアラニン形bGHのN末端
にMetが付加されたbGHのアナログを産生する。
実施例3 ヒト生長ホルモン hGHcDNAの出発点は、末端肥大症患者の下垂体腫瘍から
精製したmRNAから得たcDNAをpBR322のHindIII部位にク
ローニングすることであった。
精製したmRNAから得たcDNAをpBR322のHindIII部位にク
ローニングすることであった。
I.pTV18(1) pTV18(1)の構築は第4図に示されており、前記図面の説
明に記載されている。正しい解読枠を与えるためにhGHc
DNAをpND5に挿入する前に処理した。
明に記載されている。正しい解読枠を与えるためにhGHc
DNAをpND5に挿入する前に処理した。
pTV18(1)を形質転換によってE.coli A1637に導入した。
得られた細菌をATCC受託番号39386で寄託した。この菌
株は、増殖及び誘発されると、Met14で始まりアミノ酸1
-13が欠失した天然hGHの配列を有するhGHアナログを産
生する。pTV18(1)によって産生されるhGHアナログの量
は、細菌によって産生される総タンパクの約8%であっ
た。
得られた細菌をATCC受託番号39386で寄託した。この菌
株は、増殖及び誘発されると、Met14で始まりアミノ酸1
-13が欠失した天然hGHの配列を有するhGHアナログを産
生する。pTV18(1)によって産生されるhGHアナログの量
は、細菌によって産生される総タンパクの約8%であっ
た。
II.pTV104(2) pTV104(2)の構築は第4図に示されており、前記図面の
説明に記載されている。正しい解読枠を与えるためにhG
HcDNAをpND5に挿入する前に処理した。
説明に記載されている。正しい解読枠を与えるためにhG
HcDNAをpND5に挿入する前に処理した。
pTV104(2)を形質転換によってE.coli A1637に導入し
た。得られた細菌をATCC受託番号39384で寄託した。こ
の菌株は増殖及び誘発されるとN−末端にMetを有する
天然hGHの配列を有するhGHアナログを産生する。pTV104
(2)によって産生されるhGHアナログの量は、細菌によっ
て産生される総タンパクの約25%を上回る。
た。得られた細菌をATCC受託番号39384で寄託した。こ
の菌株は増殖及び誘発されるとN−末端にMetを有する
天然hGHの配列を有するhGHアナログを産生する。pTV104
(2)によって産生されるhGHアナログの量は、細菌によっ
て産生される総タンパクの約25%を上回る。
実施例4 pRec2/3の増殖 保存培養物:A1637中のpRec2/3の保存培養物(stock cult
ure)をBHI培地で増殖し(接種物参照)、次に87%グリ
セロール含有クエン酸リン酸塩バッファで2倍に希釈
し、−70℃で保存する。
ure)をBHI培地で増殖し(接種物参照)、次に87%グリ
セロール含有クエン酸リン酸塩バッファで2倍に希釈
し、−70℃で保存する。
接種物:接種物をBHI培地(37g/l)即ちブレーンハート
インフュージョン(DIFCO)中で増殖させる。振盪フラス
コ中の無菌培地に保存培養物を接種し、30℃,200r.p.m.
のシェーカー上で15時間インキュベートする。以後の接
種物増殖段階は撹拌通気した発酵槽で行なう。無菌培地
に0.2ml/lのフラスコ培養物を接種し、30℃,pH7±0.5で
撹拌通気して溶存酸素レベルを空気飽和の20%より高く
維持しながら15時間インキュベートする。
インフュージョン(DIFCO)中で増殖させる。振盪フラス
コ中の無菌培地に保存培養物を接種し、30℃,200r.p.m.
のシェーカー上で15時間インキュベートする。以後の接
種物増殖段階は撹拌通気した発酵槽で行なう。無菌培地
に0.2ml/lのフラスコ培養物を接種し、30℃,pH7±0.5で
撹拌通気して溶存酸素レベルを空気飽和の20%より高く
維持しながら15時間インキュベートする。
産生:産生培地は、 ラクトアルブミン水解物(酵素的) 20 g/l 酵母抽出物 10 g/l K2HPO4 2.5 g/l NaCl 10 g/l アンピシリン 0.1 g/l ビオチン 0.1mg/l チアミン 1 mg/l 微量元素溶液 3 ml/l 溶液中のアンピシリン,ビオチン及びチアミンは別々に
フィルター滅菌され接種以前に無菌産生培地に加えられ
る。無菌ブドウ糖溶液は最初に10g/lになるように添加
し、誘発及び発現の過程ではブドウ糖を10g/lより多い
量に維持する。
フィルター滅菌され接種以前に無菌産生培地に加えられ
る。無菌ブドウ糖溶液は最初に10g/lになるように添加
し、誘発及び発現の過程ではブドウ糖を10g/lより多い
量に維持する。
微量元素溶液は以下の物質を含む。
MgSO4・7H2O 170 g/l FeCl3 16 g/l ZnCl2・4H2O 2 g/l CoCl2・6H2O 2 g/l Na2MoO4・2H2O 2 g/l CaCl2・2H2O 1 g/l CuCl2 1 g/l H3BO3 0.5 g/l 濃HCl 100 ml/l 培地に5乃至10%の接種培養物を接種し、30℃でインキ
ュベートする。撹拌−通気速度は、空気飽和の20%より
高い溶存酸素レベルが維持されるように設定される。NH
3でpHを7±0.2に維持する。細胞濃度が約3g/l(OD660=
10)に到達すると誘発が始まる。
ュベートする。撹拌−通気速度は、空気飽和の20%より
高い溶存酸素レベルが維持されるように設定される。NH
3でpHを7±0.2に維持する。細胞濃度が約3g/l(OD660=
10)に到達すると誘発が始まる。
温度を42℃に上げる。42℃に15分間維持し、次に38℃に
下げる。38℃で1乃至1.5時間インキュベート後、培養
物を急冷し、ホルモン精製のために遠心分離によって細
胞を回収する。
下げる。38℃で1乃至1.5時間インキュベート後、培養
物を急冷し、ホルモン精製のために遠心分離によって細
胞を回収する。
bGHの回収 Warring配合装置を用い、50mM Tris-Cl(pH7.4)と50mM E
DTAと25%ショ糖とを含む10倍容の溶液に1kgの細菌細胞
を懸濁させる。配合装置の速度は泡立ちを最小に抑える
ように調整する。均質懸濁液をDynomill細胞破砕装置(W
illy A.Bachofen,Basel)に連続的に通し、破砕細胞の均
質懸濁液を先ずSharpless遠心機で遠心し、次にSorvall
遠心機で20,000r.p.m.で連続遠心して清澄化する。双方
の遠心ステップで得られた沈澱物を回収し、50mM Tris-
Cl(pH7.4)で洗い、500mlの同じバッファに再懸濁させ
る。終濃度2mg/mlまでリゾチームを加え、懸濁液を37℃
で1時間インキュベートする。次に、Triton X-100を終
濃度1%まで加え、懸濁液を4℃に冷却し、Sorvall SS
34ロータ内で20,000r.p.m.で20分間遠心する。沈澱物を
収集し、50mM Tris-Clで2回洗い、500mlの50mM Tris-C
l(pH7.4),5mM MgCl2に再懸濁させ、デオキシリボヌクレ
アーゼを終濃度20μg/mlまで加える。室温で30分間イン
キュベーション後、沈澱物を前記同様に収集し、500ml
の20mM Tris-Cl(pH7.4),100mM NaCl及び10mM EDTAで2
回洗浄し、次に各500mlの蒸留水を用いて2回洗浄す
る。沈澱物を遠心によって収集し、−20℃で無限に長く
保存し得る。この段階でドデシル硫酸ナトリウムゲル電
気泳動から判断するとbGHは80%純粋である。bGHの収量
は約15gである。
DTAと25%ショ糖とを含む10倍容の溶液に1kgの細菌細胞
を懸濁させる。配合装置の速度は泡立ちを最小に抑える
ように調整する。均質懸濁液をDynomill細胞破砕装置(W
illy A.Bachofen,Basel)に連続的に通し、破砕細胞の均
質懸濁液を先ずSharpless遠心機で遠心し、次にSorvall
遠心機で20,000r.p.m.で連続遠心して清澄化する。双方
の遠心ステップで得られた沈澱物を回収し、50mM Tris-
Cl(pH7.4)で洗い、500mlの同じバッファに再懸濁させ
る。終濃度2mg/mlまでリゾチームを加え、懸濁液を37℃
で1時間インキュベートする。次に、Triton X-100を終
濃度1%まで加え、懸濁液を4℃に冷却し、Sorvall SS
34ロータ内で20,000r.p.m.で20分間遠心する。沈澱物を
収集し、50mM Tris-Clで2回洗い、500mlの50mM Tris-C
l(pH7.4),5mM MgCl2に再懸濁させ、デオキシリボヌクレ
アーゼを終濃度20μg/mlまで加える。室温で30分間イン
キュベーション後、沈澱物を前記同様に収集し、500ml
の20mM Tris-Cl(pH7.4),100mM NaCl及び10mM EDTAで2
回洗浄し、次に各500mlの蒸留水を用いて2回洗浄す
る。沈澱物を遠心によって収集し、−20℃で無限に長く
保存し得る。この段階でドデシル硫酸ナトリウムゲル電
気泳動から判断するとbGHは80%純粋である。bGHの収量
は約15gである。
bGHの精製 100gの沈澱物を40mlの蒸留水に懸濁させ、0.5MのNaOH,p
H11.8で滴定して可溶化する。次に溶液を2分間超音波
処理し、Sorvall SS34ロータで20,000r.p.m.で20分間遠
心して清澄化する。次に溶液を6.5mMホウ酸塩バッファ,
pH11.8で平衡したSepharose CL-6Bカラム(5×100cm)に
通す。100ml/時の速度でカラムを展開し、各12mlの画分
を収集する。カラムを出た第1のピークは捨てる。第1
ピークは低活性の凝集bGHを示し、第2ピークは高活性
のbGHを示す。
H11.8で滴定して可溶化する。次に溶液を2分間超音波
処理し、Sorvall SS34ロータで20,000r.p.m.で20分間遠
心して清澄化する。次に溶液を6.5mMホウ酸塩バッファ,
pH11.8で平衡したSepharose CL-6Bカラム(5×100cm)に
通す。100ml/時の速度でカラムを展開し、各12mlの画分
を収集する。カラムを出た第1のピークは捨てる。第1
ピークは低活性の凝集bGHを示し、第2ピークは高活性
のbGHを示す。
DEAE-Sephacel(25g/100gr当量ppt)カラムを6.5mMホウ酸
塩バッファ,pH9.0で平衡する。第2のbGHピークをHClで
pH9.0にし、DEAE Sephacelカラムに250ml/時の速度で充
填する。カラムを7.5mlの6.5mMホウ酸塩バッファ,pH9.0
で洗い、75mM NaClを加えた6.5mMホウ酸塩バッファ,pH
9.0で溶出する。0.3より高いOD280を示す画分をプール
し、Millipore Pellicon透析装置でH2Oに対して透析
し、凍結乾燥する。
塩バッファ,pH9.0で平衡する。第2のbGHピークをHClで
pH9.0にし、DEAE Sephacelカラムに250ml/時の速度で充
填する。カラムを7.5mlの6.5mMホウ酸塩バッファ,pH9.0
で洗い、75mM NaClを加えた6.5mMホウ酸塩バッファ,pH
9.0で溶出する。0.3より高いOD280を示す画分をプール
し、Millipore Pellicon透析装置でH2Oに対して透析
し、凍結乾燥する。
実施例5 pRec2/3により産生されるbGHアナログの活性 1.bGHアナログと天然bGHとのラジオイムノアッセイ比較 リン酸塩緩衝生理食塩水(1%BSA)中に100ng/mlのbGHア
ナログを含む溶液を調製した。この溶液を濃度50,25,1
2.5,6.25,3.12,1.56及び0.78ng/lまで順次希釈した。こ
れらの溶液について各0.1mlのサンプル群を2組抽出
し、二抗体法を用いるRIAにかけた。希釈曲線は天然bGH
で得られる曲線と同等であった。
ナログを含む溶液を調製した。この溶液を濃度50,25,1
2.5,6.25,3.12,1.56及び0.78ng/lまで順次希釈した。こ
れらの溶液について各0.1mlのサンプル群を2組抽出
し、二抗体法を用いるRIAにかけた。希釈曲線は天然bGH
で得られる曲線と同等であった。
2.ラジオレセプター結合アッセイ ウサギ肝膜に対するラジオレセプター結合アッセイを、
T.Tushima及びH.G.Freisen(Y.Chin,Endocr.Metab.(197
3)37,334)に記載の方法で、125I‐hGHをトレーサーと
し、真正bGH溶液を校正曲線用に用いて実施した。3組
のサンプルを0.3mlのアッセイバッファ(50mM Tris,15mM
CaCl2及び5mg/mlウシ血清アルブミン,pH7.6)中、室温
で2時間インキュベートした。試験管は、125I‐hGH(30
〜60μci/μgの調製物20,000cpm)と、150〜250μgの
肝膜タンパクと、天然bGH(1〜100ng)又は細菌bGH抽出
物のいずれかとを収容していた。結果は、bGHアナログ
のbGH活性が天然bGHと同じ活性に匹敵することを示し
た。
T.Tushima及びH.G.Freisen(Y.Chin,Endocr.Metab.(197
3)37,334)に記載の方法で、125I‐hGHをトレーサーと
し、真正bGH溶液を校正曲線用に用いて実施した。3組
のサンプルを0.3mlのアッセイバッファ(50mM Tris,15mM
CaCl2及び5mg/mlウシ血清アルブミン,pH7.6)中、室温
で2時間インキュベートした。試験管は、125I‐hGH(30
〜60μci/μgの調製物20,000cpm)と、150〜250μgの
肝膜タンパクと、天然bGH(1〜100ng)又は細菌bGH抽出
物のいずれかとを収容していた。結果は、bGHアナログ
のbGH活性が天然bGHと同じ活性に匹敵することを示し
た。
3.脛骨テスト 実施例4で操作した細菌細胞から回収されたpRec2/3bGH
アナログの生物活性を脛骨テストで測定した(A.F.Parlo
w et al.,Endocrinology(1965)77,1126)。
アナログの生物活性を脛骨テストで測定した(A.F.Parlo
w et al.,Endocrinology(1965)77,1126)。
生後28〜30日のネズミを下垂体切除し、次に処置しない
で10〜14日維持した。ウシ下垂体又は組換体E.coliから
誘導したウシ生長ホルモンを0.15M NaCl+0.01Mホウ酸
塩,pH10.0に溶解した。ネズミ(1群4〜7匹ずつ)を
正常食(Purina Rat-Chow及び任意量の水)で維持し、bG
H溶液の皮下注射(0.2cc中、5〜125μg/日)を5日間
続けた。6日目に動物を殺し、前肢膝骨を取り出して長
手方向に切開し、アセトンで固定して2%AgNO3で染色
した。双眼解剖器(Nikon)で観察して骨端プレートの幅
を測定した。(ラット当たり40回の読み取りを行なっ
た)平均値を用いて対数投与量−応答曲線を描いた。結
果を第15図に示す。
で10〜14日維持した。ウシ下垂体又は組換体E.coliから
誘導したウシ生長ホルモンを0.15M NaCl+0.01Mホウ酸
塩,pH10.0に溶解した。ネズミ(1群4〜7匹ずつ)を
正常食(Purina Rat-Chow及び任意量の水)で維持し、bG
H溶液の皮下注射(0.2cc中、5〜125μg/日)を5日間
続けた。6日目に動物を殺し、前肢膝骨を取り出して長
手方向に切開し、アセトンで固定して2%AgNO3で染色
した。双眼解剖器(Nikon)で観察して骨端プレートの幅
を測定した。(ラット当たり40回の読み取りを行なっ
た)平均値を用いて対数投与量−応答曲線を描いた。結
果を第15図に示す。
実施例6 bGHアナログ 表Iは、構築された一連のプラスミドとこれらのプラス
ミドから産生されたアナログとを示す。
ミドから産生されたアナログとを示す。
実施例7 乳牛の催乳に対するpRec2/3bGHアナログの効
果 bGHの催乳効果は科学文献でよく知られており、例え
ば、J.Bines et al.,Brit J.Nutri.(1980)43,179及びC.
Peel et al.,J.Nutri.(1981)111,1662等の報告がある。
D.Bauman et al.,J.Dairy Sci.Vol.Supp.1,Abst 86(198
2)は、rDNAbGHによって乳分泌が増加することを報告し
ている。天然bGHと比較したpRec2/3bGHの催乳効果を測
定する実験を実施した。分娩141乃至154日後の18頭のホ
ルスタイン雌牛を無作為にグループ分けし、以下の如く
処理して乳分泌をテストした。投 与 物 予処理 1日の注射量 コントロール 5日 生理食塩水 天然bGH 5日 25mg/日を10日間 pRec2/3bGH 5日 25mg/日を10日間 毎日の注射の直前にbGHを濃度1mg/mlで0.1M NaHCO3水性
バッファ(pH=8.2)に溶解した。雌牛の頸部にプラシー
ボ又はbGH溶液を10日間毎日皮下注射した。5日間の予
処理期間は注射しなかった。
果 bGHの催乳効果は科学文献でよく知られており、例え
ば、J.Bines et al.,Brit J.Nutri.(1980)43,179及びC.
Peel et al.,J.Nutri.(1981)111,1662等の報告がある。
D.Bauman et al.,J.Dairy Sci.Vol.Supp.1,Abst 86(198
2)は、rDNAbGHによって乳分泌が増加することを報告し
ている。天然bGHと比較したpRec2/3bGHの催乳効果を測
定する実験を実施した。分娩141乃至154日後の18頭のホ
ルスタイン雌牛を無作為にグループ分けし、以下の如く
処理して乳分泌をテストした。投 与 物 予処理 1日の注射量 コントロール 5日 生理食塩水 天然bGH 5日 25mg/日を10日間 pRec2/3bGH 5日 25mg/日を10日間 毎日の注射の直前にbGHを濃度1mg/mlで0.1M NaHCO3水性
バッファ(pH=8.2)に溶解した。雌牛の頸部にプラシー
ボ又はbGH溶液を10日間毎日皮下注射した。5日間の予
処理期間は注射しなかった。
午前6時頃と午後5時頃との1日2回雌牛から搾乳し
た。ミルク重量をBoumatic系で記録し、乳データ系に記
録した。
た。ミルク重量をBoumatic系で記録し、乳データ系に記
録した。
予処理期間とbGH処理期間とにおける乳分泌の平均値を
表IIに示す。コントロール雌牛の産生レベルは変わらな
かったが、双方のbGH処理グループでは乳量が同程度に
増加した。天然bGHでは10日間の処理で乳が11.9%増加
し、bGHアナログ処理では10.2%増加した。動物数が少
ないのでデータを統計的に分析できなかったが、増加の
程度は文献に報告されたものと同様である。
表IIに示す。コントロール雌牛の産生レベルは変わらな
かったが、双方のbGH処理グループでは乳量が同程度に
増加した。天然bGHでは10日間の処理で乳が11.9%増加
し、bGHアナログ処理では10.2%増加した。動物数が少
ないのでデータを統計的に分析できなかったが、増加の
程度は文献に報告されたものと同様である。
従って、pRec2/3bGHは天然bGH同様に雌牛の催乳を刺激
するという結論が得られる。
するという結論が得られる。
各雌牛に対し、プラシーボ又はbGH溶液の皮下注射を1
日1回ずつ10日間続けた。
日1回ずつ10日間続けた。
第1図は発現ベクターpMG100の構築説明図、第2図はプ
ラスミドpRec2/3の構築説明図、第3図は発現ベクターp
ND5,pND55及びpRO11の構築説明図、第4図はpTV18(1)及
びpTV104(2)の構築説明図、第5図はベクターpAL Trp46
の構築説明図(Trpプロモーターとリーダー,アテニュ
エーター及びE遺伝子の25bpのサブクローニングを示す
図)、第6図乃至第8図は夫々一連の発現ベクター(Ta
c),即ちp4754,pAL312及びpAL601(R)の構築説明図
(第6図はTacプロモーターの構築説明図、及び第8図
はTrp-Lac融合プロモータープラスミドへのbGHのクロー
ニングを示す図)、第9図及び第10図は夫々ヒスチジン
プロモーターを含む発現ベクターpHis102及びpHis-bGH
の構築説明図(第9図はHisプロモーターによるbGHの発
現を示す図)、第11図はpYL301の構築説明図(即ち、Ha
eII断片と合成BamH1リンカーからpYL301を構築する工程
図)、第12図はOmpFプロモーターを含むbGH遺伝子発現
用プラスミドの構築説明図、第13図はMet4‐bGHアナロ
グ発現用プラスミドpAL401の構築説明図、第14図はMet-
bGH発現用プラスミドpAL601の構築説明図、第15図は脛
骨テストの結果(下垂体由来ウシ成長ホルモンと組換ウ
シ成長ホルモンの、下垂体切除ラットに皮下注射して5
日後の骨板成長に対する影響)を示すグラフである。
ラスミドpRec2/3の構築説明図、第3図は発現ベクターp
ND5,pND55及びpRO11の構築説明図、第4図はpTV18(1)及
びpTV104(2)の構築説明図、第5図はベクターpAL Trp46
の構築説明図(Trpプロモーターとリーダー,アテニュ
エーター及びE遺伝子の25bpのサブクローニングを示す
図)、第6図乃至第8図は夫々一連の発現ベクター(Ta
c),即ちp4754,pAL312及びpAL601(R)の構築説明図
(第6図はTacプロモーターの構築説明図、及び第8図
はTrp-Lac融合プロモータープラスミドへのbGHのクロー
ニングを示す図)、第9図及び第10図は夫々ヒスチジン
プロモーターを含む発現ベクターpHis102及びpHis-bGH
の構築説明図(第9図はHisプロモーターによるbGHの発
現を示す図)、第11図はpYL301の構築説明図(即ち、Ha
eII断片と合成BamH1リンカーからpYL301を構築する工程
図)、第12図はOmpFプロモーターを含むbGH遺伝子発現
用プラスミドの構築説明図、第13図はMet4‐bGHアナロ
グ発現用プラスミドpAL401の構築説明図、第14図はMet-
bGH発現用プラスミドpAL601の構築説明図、第15図は脛
骨テストの結果(下垂体由来ウシ成長ホルモンと組換ウ
シ成長ホルモンの、下垂体切除ラットに皮下注射して5
日後の骨板成長に対する影響)を示すグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 アヴイグドル・レヴアノン イスラエル国、ネタニア、ブロデツキイ・ ストリート・3 (72)発明者 アモス・オツペンハイム イスラエル国、エルサレム、ラマト・シヤ レツト、シユレム・ストリート5/12 (72)発明者 テイクヴア・フオーゲル イスラエル国、レホヴオツト、コソヴエ ル・ストリート・4 (72)発明者 エリシヤ・ゼーロン イスラエル国、ハシヴア、モシヤヴ・ミシ ユマール、エリヤフ・シヤミール・ストリ ート・7 (72)発明者 メナヘム・ゼエヴイ イスラエル国、ラマト・ガン、ハギルガ ル・ストリート・73 (56)参考文献 特開 昭56−21596(JP,A) 特公 昭57−35957(JP,B2) Nature,1981〔292〕P.128− 132 Gene,1979〔5〕P.59−76
Claims (24)
- 【請求項1】真核生物ポリペプチド産生用プラスミドで
あり、λバクテリオファージの非耐熱性リプレッサーCI
を含有する適切な細菌宿主細胞に導入されると、宿主細
胞が、宿主細胞の温度がリプレッサー不活化温度まで上
昇した際所望のポリペプチドを発現せしめ得るようにな
り、5′から3′に向かって、λバクテリオファージ由
来のプロモーター及びオペレーターPLOLを含むDNA配列
と、宿主細胞が産生する抗転写終結因子Nタンパクを結
合するN利用部位と、 配列: を有する突然変異体CIIリボソーム結合部位と、ATG開始
コドンと、 ATG開始コドンと位相を合わせた、ポリペプチドをコー
ドしているDNAと、を順次に含む二本鎖DNA分子を含んで
おり、更に、宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミ
ド由来複製起点を含むDNA配列と、宿主細胞中に当該プ
ラスミドが存在するときに現れる選択可能又は同定可能
な表現形質に関連する遺伝子を含むDNA配列とを含むプ
ラスミド。 - 【請求項2】ポリペプチドが成長ホルモン、スーパーオ
キシドジスムターゼ、アポリポタンパクE、又は、これ
らのアナログであって天然に存在するポリペプチドと実
質的に同じアミノ酸配列を有しそのポリペプチドの生物
学的活性を有するポリペプチドアナログであることを特
徴とする特許請求の範囲第1項に記載のプラスミド。 - 【請求項3】適切な細菌宿主細胞が大腸菌(Escherichia
coli)であることを特徴とする特許請求の範囲第1項に
記載のプラスミド。 - 【請求項4】大腸菌(Escherichia coli)がA1637株、A16
45株、A2602株又はA1563株であることを特徴とする特許
請求の範囲第3項に記載のプラスミド。 - 【請求項5】二本鎖DNA分子が環状であることを特徴と
する特許請求の範囲第1項に記載のプラスミド。 - 【請求項6】CIリプレッサーが約42℃の温度で非耐熱性
であることを特徴とする特許請求の範囲第1項に記載の
プラスミド。 - 【請求項7】複製起点がpBR322に由来することを特徴と
する特許請求の範囲第1項に記載のプラスミド。 - 【請求項8】複製起点がpR1に由来することを特徴とす
る特許請求の範囲第1項に記載のプラスミド。 - 【請求項9】表現形質が薬剤耐性又は温度感受性である
ことを特徴とする特許請求の範囲第1項に記載のプラス
ミド。 - 【請求項10】薬剤耐性がアンピシリン、クロラムフェ
ニコール又はテトラサイクリンに対する抵抗性であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第9項に記載のプラスミ
ド。 - 【請求項11】ポリペプチドをコードしているDNAが成
長ホルモン、スーパーオキシドジスムターゼ、アポリポ
タンパクE又はこれらのポリペプチドアナログをコード
していることを特徴とする特許請求の範囲第1項に記載
のプラスミド。 - 【請求項12】成長ホルモンをコードしているDNAがウ
シ成長ホルモンをコードしていることを特徴とする特許
請求の範囲第11項に記載のプラスミド。 - 【請求項13】成長ホルモンをコードしているDNAがヒ
ト成長ホルモンをコードしていることを特徴とする特許
請求の範囲第11項に記載のプラスミド。 - 【請求項14】成長ホルモンをコードしているDNAがブ
タ成長ホルモンをコードしていることを特徴とする特許
請求の範囲第11項に記載のプラスミド。 - 【請求項15】成長ホルモンをコードしているDNAがニ
ワトリ成長ホルモンをコードしていることを特徴とする
特許請求の範囲第11項に記載のプラスミド。 - 【請求項16】pRO11と命名され、添付の第3図に示す
制限地図を有し、ATCC No.39390として寄託されている
ことを特徴とする特許請求の範囲第12項に記載のプラス
ミド。 - 【請求項17】pTV104(2)と命名され、添付の第4図に
示す制限地図を有し、ATCC No.39384として寄託されて
いることを特徴する特許請求の範囲第13項に記載のプラ
スミド。 - 【請求項18】λバクテリオファージの非耐熱性リプレ
ッサーCIを含有する細菌宿主細胞中に、真核生物ポリペ
プチド産生用プラスミドであり、λバクテリオファージ
の非耐熱性リプレッサーCIを含有する適切な細菌宿主細
胞に導入されると、宿主細胞が、宿主細胞の温度がリプ
レッサー不活化温度まで上昇した際所望のポリペプチド
を発現せしめ得るようになり、5′から3′に向かっ
て、λバクテリオファージ由来のプロモーター及びオペ
レーターPLOLを含むDNA配列と、宿主細胞が産生する抗
転写終結因子Nタンパクを結合するN利用部位と、 配列: を有する突然変異体CIIリボソーム結合部位と、ATG開始
コドンと、 ATG開始コドンと位相を合わせた、ポリペプチドをコー
ドしているDNAと、を順次に含む二本鎖DNA分子を含んで
おり、更に、宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミ
ド由来複製起点を含むDNA配列と、宿主細胞中に当該プ
ラスミドが存在するときに現れる選択可能又は同定可能
な表現形質に関連する遺伝子を含むDNA配列とを含むプ
ラスミドを含んでなるポリペプチド産生用の形質転換宿
主細胞。 - 【請求項19】ポリペプチドをコードしているDNAがウ
シ成長ホルモンまたはそのポリペプチドアナログをコー
ドしていることを特徴とする特許請求の範囲第18項に記
載の形質転換宿主細胞。 - 【請求項20】プラスミドがpRO11と命名され、添付の
第3図に示す制限地図を有し、ATCC No.39390として寄
託されていることを特徴とする特許請求の範囲第19項に
記載の形質転換宿主細胞。 - 【請求項21】ポリペプチドをコードしているDNAがヒ
ト成長ホルモンまたはそのポリペプチドアナログをコー
ドしていることを特徴とする特許請求の範囲第18項に記
載の形質転換宿主細胞。 - 【請求項22】プラスミドがpTV104(2)と命名され、添
付の第4図に示す制限地図を有し、ATCC No.39384とし
て寄託されていることを特徴する特許請求の範囲第21項
に記載の形質転換宿主細胞。 - 【請求項23】適切な細菌宿主が大腸菌(Escherichia c
oli)であることを特徴とする特許請求の範囲第18、19、
20、21又は22項のいずれかに記載の形質転換宿主細胞。 - 【請求項24】大腸菌(Escherichia coli)がA1637株、A
1645株、A2602株又はA1563株であることを特徴とする特
許請求の範囲第23項に記載の形質転換宿主細胞。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US51418883A | 1983-07-15 | 1983-07-15 | |
US514188 | 1983-07-15 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5301898A Division JP2568376B2 (ja) | 1983-07-15 | 1993-12-01 | 精製動物成長ホルモンの回収方法 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6091986A JPS6091986A (ja) | 1985-05-23 |
JPH0687780B2 true JPH0687780B2 (ja) | 1994-11-09 |
Family
ID=24046152
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59145876A Expired - Lifetime JPH0687780B2 (ja) | 1983-07-15 | 1984-07-13 | ポリペプチドの産生を増強する発現用プラスミド及び該プラスミドを含む形質転換宿主細胞 |
JP5301898A Expired - Lifetime JP2568376B2 (ja) | 1983-07-15 | 1993-12-01 | 精製動物成長ホルモンの回収方法 |
JP18085896A Expired - Lifetime JP3146161B2 (ja) | 1983-07-15 | 1996-07-10 | スーパーオキシド・ディスムターゼを発現するプラスミド及びスーパーオキシド・ディスムターゼの製造方法 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5301898A Expired - Lifetime JP2568376B2 (ja) | 1983-07-15 | 1993-12-01 | 精製動物成長ホルモンの回収方法 |
JP18085896A Expired - Lifetime JP3146161B2 (ja) | 1983-07-15 | 1996-07-10 | スーパーオキシド・ディスムターゼを発現するプラスミド及びスーパーオキシド・ディスムターゼの製造方法 |
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---|---|
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EP (3) | EP0691406A1 (ja) |
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BG (2) | BG49718A3 (ja) |
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US5670371A (en) * | 1983-07-15 | 1997-09-23 | Bio-Technology General Corp. | Bacterial expression of superoxide dismutase |
BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
US5332805A (en) * | 1984-02-03 | 1994-07-26 | Celltech Limited | Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate |
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US6030611A (en) * | 1984-08-27 | 2000-02-29 | Bio-Technology General Corp. | Therapeutic SOD compositions and uses thereof |
CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
CA1267615A (en) * | 1984-08-27 | 1990-04-10 | Dan Hadary | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms |
US5759816A (en) * | 1984-08-27 | 1998-06-02 | Bio-Technology General Corp. | Expression vectors containing λPL promoter and T1 T2 rRNA termination sequence plasmids containing the vectors hosts containing the plasmids and related methods |
US5162217A (en) * | 1984-08-27 | 1992-11-10 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda PL promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof |
US5143836A (en) * | 1984-08-27 | 1992-09-01 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda pl promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof |
US4743546A (en) * | 1985-02-13 | 1988-05-10 | Biotechnica International, Inc. | Controlled gene excision |
US4861868A (en) * | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
FR2579223B1 (fr) * | 1985-03-25 | 1988-12-09 | Genetica | Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine |
DE3685424D1 (de) | 1985-06-26 | 1992-06-25 | Upjohn Co | Solubilisation und oxidation von somatotropin aus transformierten mikroorganismen. |
US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
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US5631227A (en) * | 1985-09-18 | 1997-05-20 | The Upjohn Company | Somatotropin analogs |
EP0236452B1 (en) * | 1985-09-18 | 1990-10-31 | The Upjohn Company | Enhanced bioactivity of mammalian somatotropin through selective deamidation |
JPH07110232B2 (ja) * | 1985-10-14 | 1995-11-29 | 株式会社日立製作所 | 遺伝子組換え大腸菌の遺伝子生産物を採取する方法および装置 |
US6610520B1 (en) | 1985-11-22 | 2003-08-26 | Bio-Technology General Corp. | Gene encoding human manganese superoxide dismutase and recombinant polypeptide encoded thereby |
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