HU209878B - Method for producing polipeptids in a new escherichia coli expression - Google Patents
Method for producing polipeptids in a new escherichia coli expression Download PDFInfo
- Publication number
- HU209878B HU209878B HU842749A HU274984A HU209878B HU 209878 B HU209878 B HU 209878B HU 842749 A HU842749 A HU 842749A HU 274984 A HU274984 A HU 274984A HU 209878 B HU209878 B HU 209878B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plasmid
- vector
- bgh
- host cell
- sequence
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 46
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 124
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 12
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 7
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 59
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 48
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 31
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 17
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 16
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 16
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 14
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 8
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 8
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 claims 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 81
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 61
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 abstract description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 17
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 15
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 14
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 abstract description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 abstract description 11
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000009877 rendering Methods 0.000 abstract 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 57
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 55
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 44
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 42
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 35
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 33
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 23
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 21
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 15
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 13
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 13
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 13
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 13
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 12
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 12
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 12
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 11
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 11
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 11
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 10
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 9
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 7
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 7
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 7
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 7
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 6
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 6
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 5
- QXOHLNCNYLGICT-YFKPBYRVSA-N Met-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O QXOHLNCNYLGICT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 4
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- -1 methionine amino acid Chemical class 0.000 description 4
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 4
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 229910004616 Na2MoO4.2H2 O Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940088174 thiamine 1 mg Drugs 0.000 description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 2
- JQECLVNLAZGHRQ-CIUDSAMLSA-N Met-Asp-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O JQECLVNLAZGHRQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- DNDVVILEHVMWIS-LPEHRKFASA-N Met-Asp-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DNDVVILEHVMWIS-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000046974 Tscherskia triton Species 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 108091060592 XDNA Proteins 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000003111 growth hormone derivative Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013029 homogenous suspension Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(4-hydroxyphenyl)propanoate Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000651036 Arabidopsis thaliana Galactolipid galactosyltransferase SFR2, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 108010037936 CCCGGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101100412102 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) rec2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- RNAGAJXCSPDPRK-KKUMJFAQSA-N Met-Glu-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 RNAGAJXCSPDPRK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PBOUVYGPDSARIS-IUCAKERBSA-N Met-Leu Chemical group CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PBOUVYGPDSARIS-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KSIPKXNIQOWMIC-RCWTZXSCSA-N Met-Thr-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N KSIPKXNIQOWMIC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 108010013127 Met-human growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700006385 OmpF Proteins 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241001582367 Polia Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 101710185500 Small t antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100311302 Sordaria macrospora (strain ATCC MYA-333 / DSM 997 / K(L3346) / K-hell) pro11 gene Proteins 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 230000001983 lactogenic effect Effects 0.000 description 1
- IXHBTMCLRNMKHZ-LBPRGKRZSA-N levobunolol Chemical compound O=C1CCCC2=C1C=CC=C2OC[C@@H](O)CNC(C)(C)C IXHBTMCLRNMKHZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 108010070915 orgotein Proteins 0.000 description 1
- 229960004534 orgotein Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 208000010916 pituitary tumor Diseases 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- TUGDLVFMIQZYPA-UHFFFAOYSA-N tetracopper;tetrazinc Chemical compound [Cu+2].[Cu+2].[Cu+2].[Cu+2].[Zn+2].[Zn+2].[Zn+2].[Zn+2] TUGDLVFMIQZYPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás egy új E. coli kifejező rendszerben polipeptidek előállítására.
A genetikai manipulációs technika (génsebészet) egyik formája eukarióta forrásból származó idegen DNS szekvencia beiktatása Escherichia coli-ba, vagy más mikroorganizmusokba. A genetikai manipulációs technika egy további finomításának tekinthető az így nyert mikroorganizmus indukálása az idegen DNS által kódolt polipeptidek termelésére. A polipeptidek előállítása kétlépéses folyamatnak tekinthető, ahol minden egyes lépésen belül több al-lépés található. A két fő lépés az átírás (transzkripció) és a transzláció. Hogy a polipeptidet hatásosan és kellő mennyiségben termelhessük, a folyamat mindkét lépésének hatékonynak kell lennie. Az átírás az mRNS termelése a génből (DNS). A transzláció a polipeptid termelése az mRNSből.
Az átírási folyamat kritikus al-lépése a beindítás (iniciáció), azaz az RNS polimeráz kötése a promoteroperátor területre. Apromoter-területet alkotó dezoxiribonukleotid bázisok, szekvenciája változhat és ezáltal hatással lehet a promoter viszonylagos hatékonyságára. A hatékonyság függ az RNS polimeráz promoterhez való affinitásától.
A transzláció hatékonyságára az mRNS stabilitása hat. Az mRNS megnövekedett stabilitása javult transzlációt tesz lehetővé. Bár az mRNS stabilitásának pontos meghatározó tényezői tökéletesen nem ismertek, az ezért ismert, hogy az mRNS másodlagos szerkezetének, amint azt a bázisainak szekvenciája meghatározza, szerepe van a stabilitásban.
A transzláció beindító al-lépése magában foglalja a riboszóma kötését az mRNS-en levő egyik bázis-szekvenciához, amely Shine-Dalgamo szekvenciaként vagy riboszóma kötőhelyként (RBS) ismeretes. A polipeptidek szintézise akkor kezdődik el, amikor a riboszóma végigvándorol az mRNS mentén a transzláció AUG start kodonjáig. Általában ezek a kodonok mintegy 10 bázis távolságra befelé találhatók a Shine-Dalgamo helytől. Kimutatták, hogy az mRNS másodlagos szerkezete a Shine-Dalgarno szekvencia és az AUG kodon környezetében, valamint a Shine-Dalgarno szekvencia és az AUG kodon közti távolság egyaránt kritikus szerepet játszik a transzláció hatékonyságának meghatározásában. Más tényezők még, amelyek a transzláció hatékonyságára hatnak, az idő előtti befejezés és a legyengülés. A transzláció hatékonyságát javítani lehet a legyengülést okozó helyek eltávolításával.
Egy olyan nehézség, amellyel szembe kell nézni a nagymennyiségű eukarióta polipeptid baktérium-sejtekben történő termelésére irányuló kísérletekben az, hogy a nagymennyiségű mRNS-t termelő sejtek nem képesek hatékonyan növekedni. Ezt a nehézséget ki lehet küszöbölni a transzkripció megelőzésével egy olyan folyamat segítségével, amely represszióként ismert. A represszió esetében a géneket kikapcsolják egy fehérje-inhibitor (represszor fehérje) segítségével, amely az operátor helyhez kötődve meggátolja a transzkripciót. Miután a sejtek a kívánt sejtsűrűségig nőttek, a represszált géneket vagy a represszor elroncsolásával vagy induktorként olyan ismert molekulák hozzáadásával, amelyek a represszor hatását meghaladják aktiválják.
Számos közlemény található az eukarióta géneknek λ-bakteriofágból származó PL promotort tartalmazó plazmidokban történő klónozásával kapcsolatban [Bernard, Η. V. és munkatársai: Gene (1979) 5, 59; Derom,
C. és munkatársai: Gene (1982) 17, 45; Gheysen, D. és munkatársai: Gene (1982) 17, 55; Hedgpeth, J. és munkatársai: Mól. Gén. Génét. (1978) 163, 197; Remaut, E. és munkatársai: Gene (1981) 75, 81; és Derynck, R. és munkatársai: Natúré (1980) 287, 193.] Ezen kívül a 041 767 számú, 1981. december 16-án publikált európai szabadalmi bejelentés is ír le λ-bakteriofágból származó PL promotert tartalmazó kifejeződést közvetítő (expressziós) vektorokat. Ezeknek az irodalmaknak azonban egyike sem írja le a Cn riboszomális kötőhely alkalmazását.
A λ-bakteriofágból származó PL promotert tartalmazó vektor és a Cn riboszomális kötőhely alkalmazását leírták már [Oppenheim, A. B. és munkatársai: J. Mól. Bioi. (1982) 158, 327; és Shimatake, H. és Rosenberg, M.: Natúré (1981) 292, 128). Ezek a közlemények a Cn fehérje megnövekedett szintű termelését írják le, de nem ismertetik az eukarióta fehérjék termelését.
1982-ben Shatzman és Rosenberg mutattak be egy posztert a 14. Miami Téli Szimpóziumon (kivonat a 98. oldalon 1982). Miami Téli Szimpóziumon (kivonat a 98. oldalon 1982). Ez a kivonat egy λ-bakteriofágból származó PL-t tartalmazó vektor, Nut és a Cn riboszomális kötőhely alkalmazásának nem teljes értékű felfedezését nyújtja egy „eukarióta” polipeptid szintetizálására (az SV40 kis T antigénje valójában nem eukarióta polipeptid, hanem vírus-fehérje) a sejt-fehérjére számítva több, mint 5% mennyiségben, egy meg nem nevezett bakteriális gazdasejtben. Az alkalmazott operátort nem határozták meg. Sem a replikáció eredetét, sem a szelektálható fenotípushoz tartozó gént nem azonosították. Erről a rendszerről, amelyhez a vektort alkalmazták, azt írták le, hogy bizonyos gazda-lizogéneket is foglal magába, amelyekbe a vektort stabilan lehet transzformálni. A jelen találmány egyik kiviteli formája, azaz a pMG 100, bizonyos hasonlósággal rendelkezik ehhez a vektorhoz. Ez azonban nincs egy gazda-lizogénbe transzformálva, inkább olyan megfelelő E. coli gazda-törzsekbe, amelyek a hőlabilis Cj represzszort és az N-gént tartalmazzák, de amelyekből a lizogén maradékát eltávolítottuk. Ezen túl, amikor ezeken bGH és hGH analógok előállítására alkalmazzuk, a nevezett fehérjék a teljes sejt-fehérje több, mint 20%-át alkotják.
A jelen találmány egy másik kiviteli formájában a CD-től eltérő riboszomális kötőhelyeket alkalmazunk. Ezen kívül a jelenleg legelőnyösebb vektorokban, a pND5-ben és származékaiban, nem lényeges szekvenciákat távolítunk el, hogy olyan vektort alkossunk, amely olyan nagy mennyiségben teszi lehetővé a polipeptid termelését, amely több, mint 10%-kal több, mint amelyet pMG 100-zal nyerünk.
HU 209 878 Β
A 4 578 355 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egy olyan megoldást ismertet, amelyben a szerző jelzi ugyan azt, hogy a gazdaszervezet fontos (8. oldal 17. sor), de nem adja meg az alkalmas gazdaszervezetet. A megoldás továbbá a λ mutáns alkalmazásától függ, amelyet viszont nem határoz meg pontosabban (4. oldal 20. sor). A szerző azt is jelzi, hogy a gazdaszervezet lizogéneket tartalmaz (8. oldal
18. sor), ellentétben a találmánnyal, amelyben a gazdaszervezet nem tartalmaz lizogéneket. A nevezett szabadalmi leírás egy eukarióta gén, a majom metallotionein-gén klónozását és kifejeződését (7. oldal 18. sor) említi, de nem ad részleteket ezzel kapcsolatban. Leírja, hogy a Cn riboszomális kötő területen egyik nukleotidnak sem változtatták meg sem a szekvenciáját, sem a helyét (3. oldal, 27. sor). A találmányban viszont ilyen változások lehetségesek.
Jelenleg a szakterületen nincsen olyan találmány, amely a szarvasmarha vagy ember növekedési hormonok PL-Cirt tartalmazó vektorrendszerének sikeres kifejeződésére, biológiai aktivitással bíró bGH vagy hGH analógok termelésére, ilyen analógokat tartalmazó kompozíciókra, vagy olyan indukciós módszerekre vonatkozna, amelyek a gazdaszervezet által termelt teljes fehérje-mennyiség több, mint 20%-nyi mennyiségét kitevő polipeptid-mennyiség elérését teszi lehetővé.
Az egyetlen felfedezés a szakterületen, amely bGH analógok genetikailag manipulált vektorokkal transzformáit gazdaszervezetek segítségével történő termelésére vonatkozik, magában foglalja a Trp promoter alkalmazását egy olyan bGH analóg termelése érdekében, amely a természetes bGH fenilalamin-formájának N-terminálisánál Met aminosavval rendelkezik [Seeburg, P. H. és munkatársai: DNS (1983) 2, 37].
Az egyetlen felfedezés a szakterületen, amely genetikailag manipulált vektorokkal transzformált gazdaszervezetek segítségével hGH analógok termelésére vonatkozik, magában foglalja a Lac és Trps promoterek alkalmazását egy olyan hGH analóg termelése érdekében, amely a természetes hGH N-terminálisánál Met aminosavval rendelkezik [Goedell, D. V. és munkatársai: Natúré (1979) 281,544].
A találmány lényegét a következőkben foglaljuk össze.
Ez a találmány olyan, javított kifejeződést közvetítő vektorra vonatkozik, amely a Ct hólabilis represszort tartalmazó megfelelő bakteriális gazdasejtbe, nevezetesen Escherichia coli-ba bevezetve a gazdasejtet képessé teszi
- a gazdasejt hőmérsékletének növelésével olyan hőmérsékletre, amelyen a represszor elroncsolódik - a vektorba beiktatott gén kifejeződésének és a gén által kódolt polipeptidek termelésének megvalósítására, amely vektorra jellemző,
- olyan kettős szálú DNS-molekula, amely 5'-»3' irányban a következőket foglalja magában:
- egy DNS-szekvenciát, amely a lambda-bakteriofágból származó PLOL promotert és operátort tartalmazza;
- a gazdaszervezet által termelt N antiterminátor fehérjéhez való kötésre szolgáló N-hasznosító helyet;
- egy olyan DNS-szekvenciát, amely riboszomális kötőhelyet tartalmaz, amely lehetővé teszi, hogy a kívánt gén mRNS-e a gazdaszerveten belül a riboszómához kötődjön;
- egy ATG beindító (iniciációs) kodont vagy egy olyan DNS szekvenciát, amely átalakul ATG beindító kodonná a kívánt génnek a vektorba történő beépítésekor; és
- egy restrikciós enzim-helyet a kívánt génnek a vektorba történő beépítéséhez, amely az ATG beindító kodonnal azonos fázisban van;
- a vektorra jellemző továbbá, hogy ezeken felül magában foglal egy olyan DNS szekvenciát, amely egy replikációs induló („origó”) helyet tartalmaz egy olyan bakteriális plazmidból, amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes, valamint egy olyan DNS szekvenciát, amely egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz, amely érvényre jut, amikor a vektor jelen van a gazdasejtben. Előnyös vektorok a pMG 100 és pND5.
A kívánt polipeptideket, mint pl. növekedési hormonokat, ezen belül marha-, sertés-, csirke- vagy emberi növekedési hormonokat, szuperoxid diszmutázt, apoprotein E-t, a száj- és körömfájás vírus 1. vírus-fehérjéjét, a S. aureus ,A” fehérjéjét, interleukin ΠΙ-at, valamely enzimet, vagy ezek analógjait kódoló géneket, azaz cDNS-eket be lehet iktatni a vektor restrikciós enzim-helyére, ilyen módon plazmidokat hozva létre. A plazmidokat viszont be lehet vezetni megfelelő gazdaszervezetbe, ahol a géneket ki lehet fejezni és a kívánt polipeptideket előállítani. A bGH-hoz előnyös plazmidok a pRec 2/3 és pROll; a hGH-hoz a pTV18(l) és a pTV 104(2). A megfelelő gazdaszervezetek között találjuk az Escherichia coli A 1637, A 1645, A 2602 és A 1563 törzseket, ezek közül jelenleg az A 1637-et tartjuk a legelőnyösebbnek.
Az így nyert gazda-vektor rendszereket alkalmazhatjuk polipeptidek előállítására. A plazmidokat tartalmazó gazdasejteket olyan megfelelő körülmények között növesztjük, amely lehetővé teszi a polipeptidek termelését, és az így nyert polipeptideket kinyerjük. Jelenleg a legelőnyösebb körülményeknek a kb. 42 °C hőmérsékleten 10-30, előnyösen 15 percig tartó növesztést tartjuk, amelyet további növesztés követ 37-39 °C hőmérsékleten annyi ideig, hogy a teljes növesztési időtartam 60-90 perc legyen, előnyösen a 38-39 °C hőmérsékleten történő növesztés 75 percig tart. Jelenleg előnyös tápközegnek a glükózzal kiegészített laktalbumin-hidrolizátumot vagy az agy-szív főzetet tartjuk.
A gazdasejt-vektor rendszert használva a bGH és a hGH analógjait állítottuk elő. Ezek az analógok állatorvosi és orvosi készítmények hatóanyagként alkalmazhatók. A megfelelő analógokat közvetlenül vagy ilyen készítmények formájában alkalmazni lehet szarvasmarháknál tej- vagy hústermelés fokozására, vagy embereknél növekedési hormon-hiány kezelésére.
HU 209 878 Β
Az ábrák leírása
1. ábra pMG 100 kifejeződést közvetítő vektor megalkotása.
Ezt a plazmidot a λ-fág DNS HaeIH (38 150. hely) és Sau31 (38 362. hely) restrikciós helyei közötti fragmensének ΗραΙ-gyel és EamHI-gyel hasított pKC 30 plazmid DNS-be történő beiktatásával építettük fel. A HaeIII-Sau3A fragmenst nutR, tR1, cy fenotípust és Cn fehérje (CírRBS) riboszomális kötőhelyét hordozza. A Cn-RBS-t tartalmazó DNS szubklónozása pKC 30-ba a pMG 100-at hozza létre, amely egy egyedi BamHI restrikciós helyet tartalmaz a Cn-RBS AIG beindulási kodonja után jobbra és egy Ndel restrikciós helyet az ATG tripleten belül (lásd a lap alján a beiktatott részletet). A zárójelben levő számok a λ-fág DNS-en levő restrikciós helyek elhelyezkedését jelzik.
2. ábra A pRec 2/3 plazmid megalkotása
Egy bGH cDNS-t tartalmazó D4 plazmidot emésztettünk Haell-vei. Az így létrejött 1600 bp méretű nagy fragmenst tisztítottuk, és 37 °C hőmérsékleten 5 perces emésztésnek tettük ki 5 egység SÍ exonukleázzal. Egy szintetikus EcoRI kapcsolót (linker) kötöttünk hozzá kapcsolással (ligációval), amely EcoRI kapcsoló szekvenciája:
GGAATTCC
CCTTAAGG
Az így keletkezett terméket EcoRI-gyel elhasítottuk és egy EcoRI-gyel elhasított pBR 322-be iktattuk be. Egy pALRl jelzésű kiónt izoláltunk, amely EcoRIes hasítással egy 1200 bp méretű fragmens keletkezett
AATTCCCA...
GGGT...
szekvenciával az 5' végen. Egy ilyen szekvencia képződése azt demonstrálja, hogy a pALRl egy EcoRI restrikciós helyet tartalmaz, amely magában foglalja az autentikus bGH 1. számú (fenilalanin) gyökének TTC kodonját. A pALRl-et Esti-gyei részleges hasításnak vetettük alá 37 °C-ban, és 2 percenként vettünk mintát. Az emésztett anyagot HindHI kapcsolókkal (linkerekkel) kötöttük össze, és EcoRI-gyel, valamint HindlHmal hasítottunk. A kívánt konstrukciók kiválogatását restrikciós enzimes térképezéssel végeztünk, annak megállapítására, hogy a PstI érintetlen maradt a bGM kódoló területen belül (azaz a PstI emésztés részleges volt). A bGH cDNS-t tartalmazó fragmenst izoláltuk, és pBR 322-be az EcoRI és HindHI restrikciós helyek közé szubklónoztuk, így nyerve a pAL500-at. Azután a szubklónozott bGH cDNS fragmenst a pAL500-ból EcoRI-gyel és HindíH-mal kivágtuk, „feltöltöttük” DNS-polimeráz „Klenow” fragmenssel, és beiktattuk a pMG 100 expressziós vektorba (lásd 1. ábra), amelyet a BamHI helyen kinyitottunk, és szintén „feltöltöttünk” Klenow-fragmenssel. Az így nyert vektor, a pRec 2/2, egy módosított bGH-t fejez ki, amely amino-terminálisánál a következőképpen van megváltoztatva:
Met Asp Gin Phe1 Pro2 ... bGH
A pRec 2/2-t Esíl-gyel emésztettük, és a PL promotert, valamint a bGH gén 5' végét (,A” fragmensnek jelölve) tartalmazó fragmenst izoláltuk. Ezt a fragmenst egy pAL500-ból származó PstI fragmensthez („B” fragmensnek jelölve) kapcsoltuk. Az így keletkezett vektor, a pRec 2/3, egy módosított bGH-t fejez ki, amely aminoterminálisán a következőképpen van megváltoztatva:
Met Asp Gin Phe1 Pro2 ... bGH
3. ábra pND5, pND55 és pROll expressziós vektorok megalkotása pOG7 plazmidot [A. Oppenheim, S. Gottesman és M. Gottesman: J. Mól. Bioi. (1982) 158, 327] hasítottunk AWel-gyel. A PL promotort, nutL-t, tR-t és CnRBS-t hordozó nagy fragmens végeit összekapcsoljuk, így pND5 expressziós vektort nyertünk. Ezt a pND5 vektort DNS-t Ndel-gyel felnyitottuk. A pRec 2/3-ból (2. ábra) származó, a bGH cDNS-t tartalmazó Ndel fragmensnek a beiktatása egy pROll plazmidot eredményez, amely a 2. ábránál leírt módosított bGH jobb kifejeződését eredményezi, mint a pRec 2/3. A
TATGAGCTCA ACTCGAGTAT szekvenciájú szintetikus kapcsoló beiktatása az Ndelgyel hasított pOG7-be a pND55 expressziós vektort eredményezi, amely egy egyedi SacI restrikciós helyet tartalmaz az ATG előtt. Amikor a pND55-öt Sacl-gyel hasítjuk és DNS polimeráz „Klenow” fragmenssel kezeljük, egy ATG beindító kodont nyerünk, amely a PL promotort és a Cn-RE5-t követi. Ez a vektor számos, az ATG beindító kodont nélkülöző eukarióta gének expressziójához alkalmas.
4. ábra pTV 18(1) és pTV 104(2) megalkotása.
pTVHGH plazmidot úgy készítettünk, hogy a hGH-t kódoló cDNS-t a pBR 322 HindHI helyére klónoztuk, standard módszerekkel [Meth. Enzymol. (1979) 68, 75]. Ezt a plazmidot Hínz/M-mal emésztettük. Az így nyert 800 bázispár méretű fragmenst tisztítottuk és tovább emésztettük Em/DII-vel, és feltöltöttük DNS polimeráz „Klenow” fragmenssel. Ez a kezelés eltávolítja a hGH első 16 aminosavjához tartozó kodonokat. Az így nyert DNS-fragmenst egy szintetikus kapcsolóval kapcsoltuk össze, amely a Met14-től helyreállítja a hGH szekvenciához tartozó kodonokat, és regenerál egy Ndel restrikciós helyet a Met14-hez tartozó ATG kodon előtt. AWel-gyel történő kezelés után ezt a félszintetikus DNS-t egy Ndelgyel felnyitott pND5 vektorba iktatjuk be. Az így nyert pTV 18(1) plazmid a hGH-t a PL promoter ellenőrzés alatt fejezi ki. Ez a hGH egy olyan analóg, amelyből hiányzik az első 13 aminosav-gyök, és az N-terminálisán Met14-gyel rendelkezik.
pTV 18(1) plazmidot részlegesen emésztettünk /Vdd-gyel, 37 °C-on, és a 2 percenként vett mintákat összekapcsoltuk egy szintetikus kapcsolóval, amely a hGH 1-13 aminosavainak kodonjait tartalmazta:
TATGTTCCCAACCATTCCATTATCCCGTCTGTTCGACAACGC
ACAAGGGTTGGTAAGGTAATAGGGCAGACAAGCTGTTGCGAT
HU 209 878 Β
A kapcsoló szintén komplementer a pTV 18(l)-en levő Ndel helyre és a komplett hGH génnek azokra a helyeire, amelyek a pND5 expressziós vektor (3. ábra)
ATG beindító kodonjaival fázisban vannak. A kívánt konstrukció kiválogatását restrikciós enzimes térképe- 5 zéssel végeztük annak megállapítására, hogy a linker a hGH szekvencia 5'-végére került, helyes orientációban, így a keletkező pTV 104(2) plazmid olyan natív hGH-t fejez ki, amely az N-terminálisnál egy extra metionint tartalmaz. 10
5. ábra a pAL Trp 46 vektort mutatja be, amely a Trp promotert és a Trp E gén első hét aminosavát tartalmazza, amely Trp E gén a β-gal aktozidáz génnel van átírás szerint fuzionálva.
6., 7. és 8. ábrák a (Tac) expressziós vektorok sorozatát 15 mutatják be, ezek a Trp promoter és a Lac operátor egy részét tartalmazzák, amelyeket egy kívánt gén és a bGH Tac promoter szabályozása alatti kifejeződés beiktatására szolgáló restrikcióshelyek követnek. 20
9. és 10. ábrák expressziós vektorokat mutatnak be,
CCATATGTCCTTGTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCT amelyek bGH cDNS-t tartalmaznak, a hisztidin promoter szabályozása alatt.
11. ábra All. ábra bGH gén beiktatását mutatja be egy expressziós vektorba a Lac promoter szabályozása alatt.
12. ábra a bGH gén kifejeződését mutatja be az
OmpF promoter szabályozása alatt.
13. ábra Met^bGH analóg, pAL40I, pND6 és pNDll kifejeződést közvetítő expressziós vektorok megalkotása megváltozott restrikcióshelyekkel.
A pAL401-et, amely a bGH-nak olyan módosított formáját fejezi ki, amelyben a bGH amino-terminálisánál az első három aminosav hiányzik (Met4 bGH), a következők hármas kapcsolásával hoztuk létre:
a) egy 623 bázispárból álló bGH DNS fragmens, amelyet PvuII-vel és //íuz/III-mal vágtunk ki pAL 500ból;
b) egy kapcsoló, amelyet két DNS szál szintézisével képeztünk, amely szálakat tisztítás után termosztáltunk
-t nyerve, amelyet azután DNS polimeráz „Klenow” fragmenssel feltöltöttünk, majd AWel-gyel és PvuII-vel elhasítottunk, így egy 58 bázispárból álló fragmenshez jutottunk, amelyet kinyertünk és tisztítottunk; és
c) pNDll, amelyet úgy nyertünk, hogy egy pCG7 expressziós vektort [Oppenheim és munkatársai, J. Mól. Bioi. 158, 327 (1982)] a 7/ínríin hely és az Ndel helyek egyikének (az ATG beindító kodontól távol) eltávolításával megváltoztattunk, így pND6-ot kaptunk, majd HindXY. kapcsolókat vezettünk be egy SaR helyre. 37 °C-on Ndel-gyel emésztettünk, és a 2 percenként vett mintákat ligáltuk a kapcsolóval. Ezután restrikciós enzimes térképezéssel ellenőriztük, hogy csak az egyik Ndel távolítódott-e el. Ezután Klenowenzimmel feltöltöttük a végeket, a 13. ábránál ismertetett módon szelektáltuk,és elvégeztük a Hindül-vágást, majd újra Klenow-enzimes feltöltést végeztünk.
14. ábra Az amino-terminálisnál metioninnal módosított autentikus bGH és a bGH különböző analógjainak megalkotása.
a) pAL401 plazmidot kezeltünk Ndel-gyel. Egy ATG beindító szignált és a natív bGH amino terminálisánál levő első három aminosavhoz tartozó kódot tartalmazó szintetikus (foszforamidit módszenei szintetizált) DNS kapcsolót (linkért) kapcsoltunk az Ndel helyhez. Az így nyert pAL601 vektor olyan natív bGH kifejeződését eredményezi, amely egy extra metionin gyököt tartalmaz az amino terminálisnál.
b) Az a) pontban leírt stratégiát alkalmazva, de az oligodezoxi-ribonukleotid kapcsoló szerkezetét módosítva egy sor módosított marha növekedési hormont kódoló vektort hoztunk létre. A módosított növekedési hormonok metioninnal indulnak az N-terminálisnál, ezt követi a 20 természetben előforduló aminosav bármelyike az 1 és 2 helyzetekben, és a természetben előforduló 20 aminosav bármelyike a Glu, Gin, Lys, Met vagy Trp kivételével a 3. helyzetben. A 4. helyzettől a COOH-terminálisig a szekvencia a natív 6GH megfelelő szekvenciájával azonos.
15. ábra Tibia-vizsgálat
Ez az ábra az autentikus bGH és a pRec 2/3 bGH analóg hatásának összehasonlítását mutatja a hipofízisüktől megfosztott patkányok csontlemezének növekedésére.
16. ábra pTV333(31) konstruálása
A pTV333(31) plazmid (deponálási szám: ATCC 39 981) az új, Met-Leu-hGH szekvenciájú hGH analóg expresszióját biztosítja. A pTV333(31) plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pTV18(l) plazmidban (lásd 4. ábra) levő Met14hGH 5' végéhez egy szintetikus oligonukleotid szekvenciát kapcsoltunk. A szintetikus oligonukleotid szekvencia a következő:
5' TATGTTGTTCCCAACCATTCCATTATCCAGACTTTTTGACAACGC
ACAACAAGGGTTGGTAAGGTAATAAGGTCTGAAAAACTGTTGCGAT
17-18. ábra A pTV18(l) és pTV104(2) által termelt hGH analógok aktivitására vonatkozó tesztek eredményét mutatja. A teszteket a 9. példában ismertetjük.
19. ábra A SÓD DNS és aminosavszekvenciája
Az ábra a kettősszálú cDNS molekula kódoló szálá- 60 nak nukleotid szekvenciáját mutatja, amely a humán citoplazma szuperoxid-diszmutázt kódolja. Az ábrán a cDNS által kódolt humán szuperoxid-diszmutáz-polipeptid aminosavszekvenciáját is bemutatjuk.
20. ábra pNd-SODm-12 konstrukciója
A pSODNG-10 plazmidot Ndel-gyel emésztettük,
HU 209 878 Β és öt egység borjúbél alkálikus foszfatázzal kezeltük 37 °C-on 30 percig. A kapott DNS-t a következő szekvenciával rendelkező szintetikus kapcsolóval ligái tűk:
AGCTTCCATATGGA
AGGTATACCTTCGA így a pSODNN-12 plazmidot kaptuk. A szintetikus kapcsolót foszforamidit módszerrel készítettük [Beaucage, S. L., Carnthers, Μ. H., Tetrahedron Letters 22, (20) 1859-1862 (1961): Deoxynucleoside Phosphoranidites - A New Class of Key Intermediates fór Deoxypolynucleoside Synthesis], Ezt a plazmidot Ndelgyel hasítottuk, így 590 bázispár méretű SODcDNS fragmenst kaptunk. Ezt a fragmenst izoláltuk. A pND plazmidot (lásd 3. ábra) Ndel-gyel hasítottuk, majd borjúbél alkálikus foszfatázzal kezeltük, és az 590 bp SODcDNS fragmenshez ligáltuk. A kapott plazmiddal E. coli (1645 törzs) törzset transzformáltunk, így háromféle kiónt kaptunk. Az egyik, amelyet pNdSODnn-12 jellel jelöltünk, növesztésre és indukcióra szuperoxid-diszmutáz aktivitással rendelkező proteint termelt. Ezt a plazmidot ATCC 53 166 sz, alatt deponáltuk.
21. ábra p802 plazmid konstruálása
A p802 plazmid egy olyan cDNS klón, amely az érett sertés növekedési hormon (pGH) teljes kódoló szekvenciáját tartalmazza. Az iniciáló kodon mellett egy Ndel restrikciós hely található. A gén 3' vége szintén egy Ndel restrikciós helyhez kapcsolódik.
Apl07 plazmidot úgy állítottuk elő, hogy egy Pstlgyel hasított pBR322 plazmidba pGH cDNS-t építettünk be. A cDNS-t sertés agyalapi mirigy szövetből készítettük, C-farokkal láttuk el polinukleotid kináz segítségével. A pBR322-t a Pstl-gyel emésztettük és G-farokkal láttuk el polinukleotid kináz segítségével, majd ligáltuk a C-farokkal ellátott cDNS-sel. A pozitív kiónokat a D4 plazmidból (ATCC 31 826) izolált 720bp hosszúságú bGH-ffagmenshez való hibridizációval azonosítottuk. Egy pozitív kiónt, amely a teljes pGH gént tartalmazza, pl07-ként jelöltünk. A pl07 a pGH teljes kódoló szekvenciáját és a vezetőszekvenciát tartalmazza.
Az érett pGH kódoló szekvenciáját úgy kaptuk meg, hogy a DNS szekvenciát Hgi Al restrikciós endonukleázzal emésztettük, majd egy szintetikus DNS kapcsolót kapcsoltunk hozzá, amely a pGH génen belül a HgiAI restrikciós helytől az ATG iniciáló kodonig terjed. A szintetikus kapcsolót úgy készítettük, hogy az ATG iniciáló kodonnál egy Ndel restrikciós helyet tartalmazzon, és az Ndel helytől felfelé egy Eco Rí helyet. A szintetikus kapcsoló szekvenciája:
5' TGAATTCATATGTTCCCAGCTATGCCTCTATCTAGTCTATTCGCTAACGCTGT 3' ACTTAAGTATACAAGGGTCGATACGGAGATAGATCAGATAAGCGATTGCGACA GCTCAAGCTTA 3'
CGAGTTCGAAT 5'
A p802 plazmidot a pGH 22-ből állítottuk elő úgy, hogy a pGH cDNS 3' végénél található Pstl helyet Ndel hellyé formáltuk, szintetikus DNS kapcsolók segítségével.
22. ábra p3007 konstrukciója
A p3007 plazmid a Met-pGH expresszióját a PL promoter és a cll riboszóma kötőhely kontrollja alatt végzi.
A p902 expressziós vektort úgy állítottuk elő, hogy a p802-ből Ndel-gyel végzett hasítás után izolált, pGH cDNS-t pND5 expressziós vektorba építettük be. A p902 plazmid olyan pGH változatot fejez ki, amely 2-3 kilodaltonnal kisebb, mint az autentikus pGH. Ez nyilvánvalóan a cDNS szekvenciában található értelmetlen kodon 45 eredménye. Ennek kiigazítására, és olyan plazmid előállítására, amely a teljes méretű pGH-t fejezi ki, a p902ben található cDNS gén 3' végét a p9 plazmidból származó 3'-cDNS-vel helyettesítettük. (Ap9 plazmidot ugyanúgy állítottuk elő, mint a p 107 plazmidot, amely a 21. áb- 50 rán látható, ez egy másik pozitív klón). A p902 plazmidot Apai-gyei és PvuII-vel emésztettük, majd alkálikus foszfatázzal kezeltük. Az ábrán „A”-vaI jelölt Apai-Apai fragmenst izoláltuk. Ez a pGH gén 5'-vége. A nagy fragmenst, amely a Pvull helytől az első Apai helyig teijedő 55 szegmenst tartalmazta, a p9 plazmid Apal-Pvuü emésztése után izolált, az ábrán „B”-vel jelölt kis Apal-PvuII fragmenssel ligáltuk. A kapott plazmidot p2021-ként jelöltük, ez tartalmazza a pGH gén 3' végét. Ezután a p2021 plazmidot Apai-gyei hasítottuk, és az említett, ,Λ’’-val jelölt kis Apai-Apai fragmenssel ligáltuk. A kapott plazmidot p3007-ként jelöltük. A p3007 plazmid a teljes méretű Met-pGH expresszióját biztosítja.
23. ábra p37 konstrukciója
A p37 plazmidot úgy terveztük meg, hogy olyan pGH analógot fejezzen ki, amelynek első aminosavmaradéka a metionin, amely az érett pGH-ban a negyedik aminosav (Met4 pGH). Ap37-t a p902-ből állítottuk elő úgy, hogy a gén 5' végét eltávolítottuk. A p902 plazmidot Ndel-gyel és Apai-gyei emésztettük, ekkor a következő fragmenseket kaptuk:
- ,Λ’’-val jelölt Ndel-Apai kis fragmens,
- „B”-vel jelölt Apai-Apai fragmens,
- C-D jelű Ndel-Apai nagy fragmens,
- Ndel-Ndel nagy fragmens.
A pNDS plazmidot Ndel-gyel emésztettük, majd ligáltuk a szintetikus E kapcsolóval és a fenti C-D jelű Ndel-Apal nagy fragmenssel. A kapott plazmidot p28ként jelöltük. A p28 plazmidot ezután kezeltük, majd ligáltuk a „B” jelű Apai-Apai fragmenssel. A kapott plazmidot p37-ként jelöltük. A szintetikus E kapcsoló szekvenciája a következő:
5' TATGCCCTTGTCCAGCCTATTTGCCAACGCCGTGCTCCGGGCC 3' 3' ACGGGAACAGGTCGGATAAACGGTTGCGGCACGAGGC 5'
HU 209 878 Β
A kapott p37 plazmid olyan pGH analóg expresszióját biztosítja, amely kisebb, mint a remélt Met4-pGH analóg. Ez nyilvánvalóan a gén 3' vége közelében található értelmetlen kodonnak köszönhető.
24. ábra pRec pig 24 konstruálása
Ez a plazmid a Met-Asp-Gln-pGH szekvenciával rendelkező pGH analóg expresszióját biztosítja. Ezt a plazmidot p515 plazmidból állítottuk elő, amely a Met4-pGH expresszióját biztosítja.
Ap37 plazmid (23. ábra) olyan pGH expresszióját biztosítja, amely Met4 maradékkal indul, de egyértelmetlen kodon következtében korábban fejeződik be. A p37-ben található gén 3' végét a p3007 plazmidban található végével helyettesítettük. Ehhez a p37 plazmid B55HI-PvuII emésztésével kapott nagy fragmenst izoláltunk a p3OO7 plazmid B55HI-PvuII emésztésével kapott kis fragmenssel. A kapott, p515 jelű plazmid tartalmazza a p37-ből a pGH 5'-végét és a p3007-ből a pGH 3'-végét. A kapott p515 plazmid a Meri-pGH analóg expresszióját biztosítja.
A pRec pig 24 plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a következő szekvenciával rendelkező szintetikus DNS kapcsolót vezettük be:
5' TATGGATCAATTCCCAGC 3'
3' ACCTAGTTAAGGGTCGAT 5'
A pRec pig 24 plazmidot E. coli A4255 törzsben deponáltuk ATCC 53 433 számon.
A következőkben a találmányt részletesen ismertetjük.
Egy olyan vektort fejlesztettünk ki, amely egy gén kifejeződésének, így egy polipeptid kifejeződésének emelt szintje elérésére képes. A vektor kétszálú DNS molekula. A vektort a hőlabilis C[ represszort tartalmazó megfelelő bakteriális gazdasejtbe bevezetve és a gazdasejt hőmérsékletét olyan hőmérsékletre emelve, amelyen a represszor elroncsolódik, a vektor a gazdasejtet képessé teszi a vektorba beiktatott gén kifejeződésének és a gén által kódolt polipeptidek termelésének megvalósítására.
A vektor az 5'—>3' irányban a következőket foglalja magában:
- egy DNS szekvenciát, amely a lambda-bakteriofágból származó PLOL promotert és operátort tartalmazza;
- a gazdasejt által termelt N antiterminátor fehérjéhez való kötésre szolgáló N-hasznosító helyet;
- egy DNS szekvenciát, amely olyan riboszomális kötőhelyet tartalmaz, amely lehetővé teszi, hogy a kívánt gén mRNS-e a gazdasejten belül a riboszómához kötődjön;
- egy ATG iniciáló kodont vagy egy olyan DNS szekvenciát, amely a kívánt génnek a vektorba történő beépítésekor ATG iniciáló kodonná alakul; és
- a kívánt génnek a vektorba történő beépítéséhez egy restrikciós enzim-helyet, amely az ATG kodonnal fázisban van.
A vektor ezeken felül magában foglal egy olyan DNS szekvenciát, amely egy replikációs induló („origó”) helyet tartalmaz egy olyan bakterális plazmidból, amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes, valamint egy olyan DNS szekvenciát, amely egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz, amely érvényre jut, amikor a vektor jelen van a gazdasejtben.
A vektorhoz alkalmazott gazdasejt Escherichia coli. A jelenleg előnyös törzsek az A 1637, A 1645, A 2602 és A 1563. Az A 1637 a jelenleg legelőnyösebb törzs. Ezt C600-ból nyertük oly módon, hogy egy olyan transzpozont építettünk bele, amely a galaktóz operonon belül egy tetraciklin rezisztencia gént tartalmaz, továbbá a lambda expressziós rendszert, amely közvetlenül a galaktóz operon mellett helyezkedik el. Ezt az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben [American Type Culture Collection, (ATCC), Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok] helyeztük el, ez a törzs különböző plazmidokat tartalmaz, amelyeket a későbbiekben sokkal részletesebben fogunk leírni. Az összes letétbehelyezés a mikroorganizmusok letétbe helyezésének nemzetközi elismerésére vonatkozó Budapesti Szerződés előírásai szerint történt.
Az A 1645-öt az A 1637-ből nyertük a Gal+-ra (a galaktóz fermentálásának képessége) és a tetraciklin rezisztencia hiányára szelektálva. Ez még tartalmaz lambda expressziós rendszert, de a szelekcióval a transzpozon egy részét eltávolítottuk. A törzs fenotípusa: C 600 r m+ gal thr leu- lac Z~ (Xcl 857 ΔΗ1 ΔΒΑΜ N+).
Az A 2602 és A 1563 az SA 500-ból származik. Ezek fenotípusa: SA500 his ilu- . gal+ Δ8 (λΟ857ΔΗ1ΔΒΑΜΝ+) és SA500 his- ilu gal+ Δ8 lac ZxA21 (ÁCI859 int2 xis2 xisl nutL3 ΔΗ1).
A vektor előnyösen egy kovalensen zárt köralakú kettős-szálú molekula. Nem feltétlenül szükséges azonban, hogy a vektor kovalensen zárt legyen.
A vektor akkor éri el a megnövekedett kifejeződési szintet, miután a gazdasejtet olyan hőmérsékletre melegítettük, amelynél a Cj represszor elroncsolódik. A 42 °C fölötti hőmérséklet hatásos erre a célra, és mivel kívánatos, hogy a fölösleges hőkárosodást a gazdasejtnél elkerüljük olyan nagy mértékben, ahogyan ez csak lehetséges, általában kívánatos, hogy a hőmérséklet a 42 °C-ot sohase haladja meg néhány foknál jobban.
A vektor egyik fontos komponense a riboszóma kötőhely. Megfelelő helyek: a lambda bakteriofág eredetű Cn, amelynek szekvenciája a következő: TAAGGAAATACTTACAT
ATTCCTTTATGAATGTA;
egy szintetikus olegonukleotid a következő szekvenciával:
TAAGGAAGTACTTACAT
ATTCCTTCATGAATGTA; és a lambda bakteriofág fő fej-fehéije génje a következő szekvenciával:
TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG
AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC.
A vektor egy másik komponense a kívánt gének vektorba történő beiktatásához szükséges restrikciós enzim-hely az ATG iniciáló kodonnal fázisban. Számos ilyen helyet lehet alkalmazni. A jelenleg előnyös helyek a PöotHI, 5ACI és Ndel helyek.
A vektor magában foglal egy replikációs „origó”
HU 209 878 Β helyet is egy olyan bakteriális plazmidból, amely autonóm replikációra képes a gazdasejtben. Ilyen alkalmas replikációs „origó” helyeket számos forrásból lehet nyerni. Jelenleg azok a replikációs „origó” helyek az előnyösek, amelyek a pHR 322-ből vagy pH 1-ből származnak.
Egy DNS szekvencia, amely egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz, amely érvényre jut, amikor a vektor jelen van a gazdasejtben, szintén egyik komponense a vektornak. A megfelelő gének azok lehetnek, amelyek hőmérséklet-érzékenységgel, vagy gyógyszer-rezisztenciával, pl. ampicillin, klóramfenikol vagy tetraciklin rezisztenciával társulnak.
A tudományos irodalomban korábban leírt vektorokhoz viszonyítva a találmány szerinti vektorokat a kívánt polipeptid termékeket kódoló gének széles választékának megnövekedett kifejeződésének elérésére lehet alkalmazni. Alkalmas gének a növekedési hormonokat, pl. sertés-, csirke-, vagy emberi növekedési hormonokat, valamint szuperoxid diszmutánst: a poprotein E-t, a száj- és körömfájás vírus 1. sz. vírus-fehérjéjét, a S. aureus „A” fehérjéjét, interleukin ΙΠ-at, enzimeket, vagy a fentiek mindenféle analógját kódolják. Az analóg olyan polipeptidet jelent, amelynek aktivitása azonos, mint a természetben előforduló polipeptidé, de egy vagy több eltérő aminosavval rendelkezik a polipeptid N-terminálisánál.
A vektort a találmány szerinti szakterületen jártas szakemberek számára jól ismert módszerekkel lehet kialakítani. Ilyen módszereket nagy részletességgel írnak le különböző publikációkban, amelyeket itt idézünk is, és amelyet tartalmát referenciaként be is építjük a jelen bejelentésbe abból a célból, hogy teljesebb információt nyújtsunk a technika állásáról.
Egy jelenleg előnyös vektor a pMG 100, amelynek restrikciós térképét az 1. ábra mutatja be. Ez a vektor marha növekedési hormont kódoló cDNS-sel rendelkezik a ΒΑΛΤΗ 1 restrikciós helyre beiktatva. Az ebből készített plazmidot pRec 2/3-ként jelöljük. Ennek restrikciós térképét a 2. ábra mutatja be. A pRec 2/3 plazmidot A 1637 Escherichia coli törzsbe vezetjük be, hagyományos transzformációs módszereket alkalmazva. Az így nyert gazdaszervezet vektor rendszert ATCC 39 385 számon deponáltuk.
Egy másik jelenleg előnyös vektor, a pND5, melynek restrikciós térképét a 3. ábra mutatja be. Marha növekedési hormon cDNS-t iktattunk be ennek Ndel restrikciós helyére. Az így létrejött plazmidot pROllgyel jelöljük. Ennek restrikciós térképe szintén a 3. ábrán látható. A pROll plazmidot az A 1637 E. coli törzsbe vezetjük be transzformáció útján. A gazdasejtvektor rendszert, amely így létrejött, deponáltuk ATCC 39 390 számon.
A pND5-öt szintén használtuk a humán növekedési hormon klónozásához. Egy pTV 18(l)-gyel jelölt plazmidot és egy másik, pTV 104(2)-vel jelölt plazmidot hoztunk létre a hGH cDNS beiktatásával a Ndel restrikciós helyekbe. A pTV 18(l)-et a 4. ábra mutatja be. Ezt vezetjük be az A 1637 E. coli törzsbe transzformációval. Az így létrejött gazdasejt-vektor rendszert ATCC 39 386 számon deponáltuk. ApTV 104(2)-t szintén a 4. ábrában mutatjuk be. Ezt is A 1637 E. coli törzsbe vezetjük be. Az így létrejött gazdasejt-vektor rendszert ATCC 39 384 számon deponáltuk.
Ugyanezt a megközelítést alkalmazva más plazmidokat is előállíthatunk egy kívánt polipeptidet kódoló génnek egy találmány szerinti vektor restrikciós enzim helyére történő beiktatásával
Az előzőekben az A 1637 E. coli gazdaszervezetvektor rendszert mutattuk be. Amint azonban korábban is jeleztük, más törzseket is lehet alkalmazni erre a célra, pl. A 1645, A 2602 és A 1563 törzseket. Ezeket a gazdaszervezet-vektor rendszereket lehet alkalmazni olyan polipeptidek előállítására, mint pl. marha- és emberi növekedési hormonok. Hogy ezt elérjük, a gazdasejt-vektor rendszert olyan megfelelő körülmények között kell növeszteni, amely lehetővé teszi a polipeptidek előállítását, amelyeket azután kinyerünk.
A megfelelő körülmények a következőket jelentik: a gazdaszervezet-vektor rendszer növesztése megfelelő időtartamig 42 °C hőmérsékleten, majd növesztés tovább 37-39 °C hőmérsékleten egy további időtartamig. A növesztést egy megfelelő tápközegben hajtjuk végre.
A kezdeti növesztési periódus kívánatos időtartama 42 °C hőmérsékleten 10-30 perc, ezután következik a növesztés 37-39 °C hőmérsékleten a megfelelő időtartamig, úgy, hogy a növesztés teljes időtartama 60-90 perc legyen. Előnyös a növesztést 42 °C hőmérsékleten 15 percen át folytatni, majd 75 percig 38-39 °C hőmérsékleten. A megfelelő tápközeg lehet laktalbumin hidrolizátum, glükóz vagy agy-szív főzet hozzáadásával. Abból a célból, hogy stabilan megtartsuk a vektort a gazdasejtben, kritikus tényező, hogy a gazdasejtet szelektív kényszer alatt tartsuk, pl. antibiotikum hozzáadásával.
Az előző módszerek segítségével számos bGH és a hGH analógot készítettünk. Ezek a természetben előforduló hormonok aktivitásával rendelkeznek vagy rendelkezhetnek.
A bGH analógok a természetes bGH aktivitásával és azonos aminosav-szekvenciával rendelkeznek, kivéve az N-terminálison az 5. aminosavig terjedő területen levő változásokat. Erre példák a következők:
1. ) metionin aminosav van hozzákapcsolva a fenilalanin formájú bGH N-terminálisához.
2. ) metionin aminosav van hozzákapcsolva az alanin-formájú bGH N-terminálisához.
3. ) Met-Asp-Gln aminosav-szekvencia van hozzákapcsolva a fenilalanin-formájú bGH N-terminálisához.
4. ) Ala-Gly aminosav-szekvencia van hozzákapcsolva az alanin-formájú bGH N-terminálisához.
5. ) Met-Gly aminosav-szekvencia van hozzákapcsolva az alanin-formájú bGH N-terminálisához.
6. ) Met-Asp-Pro-Met-Gly aminosav-szekvencia van hozzákapcsolva az alanin-formájú bGH N-terminálisához.
7. ) Met-Asp-Pro aminosav-szekvencia van hozzákapcsolva a fenilalanin-formájú bGH N-terminálisához.
HU 209 878 Β
8. ) Met-Thr-Arg aminosav-szekvencia van hozzákapcsolva a fenilalanin-formájú bGH N-terminálisához.
9. ) Az aminosavak a metioninig (4. hely) el vannak távolítva a fenilalanin-formájú bGH N-terminálisáról.
Egy bGH analóg aminosav szekvenciája a következő lehet:
Met-(X)n-Y-Met...
ahol Met az N-terminális, X a húsz természetben előforduló aminosav bármelyike, Y a húsz természetben előforduló aminosav bármelyike, kivéve a Glu, Gin, Lys, Met vagy Trp aminosavakat, n egy O-tól 6-ig terjedő egész szám és Met... a természetes bGH szekvenciája a 4. helyzettől a COOH-terminálisig (191. helyzet).
A hGH analógok a természetes hGH aktivitásával és azonos aminosav-szekvenciával bírnak, kivéve a változásokat az N-terminálisnál. Erre példák a következők:
1. ) Metionin-aminosav van hozzákapcsolva a természetes hGH N-terminálisához.
2. ) Az aminosavak a metioninig (14. helyzet) el vannak távolítva a hGH N-terminálisáról.
Egy hGH analóg aminosav szekvenciája a következő lehet:
Met-(X)„-Y-Met...
ahol Met az N-terminális, X a húsz természetben előforduló aminosav bármelyike, Y a húsz természetben előforduló aminosav bármelyike, kivéve a Glu, Gin, Lys, Met vagy Trp aminosavakat, n egy O-tól 13-ig terjedő egész szám, és Met ... a természetes hGH szekvenciája a 14. helyzettől a COOH terminálisig (191. helyzet). Állatorvosi kompozíciókat lehet előállítani, amelyek egy vagy több bGH analóg hatásos mennyiségét és alkalmas hordozót tartalmaznak. Az ilyen alkalmas hordozók jól ismertek a szakterületen jártasak számára. Az analógokat be lehet adni közvetlenül, vagy egy készítmény formájában a marháknak, hogy növeljük a tej- vagy hústermelést.
Gyógyászati kompozíciókat lehet előállítani, amelyek egy vagy több hGH analóg hatásos mennyiségét és alkalmas hordozót tartalmaznak. Az ilyen alkalmas hordozók jól ismertek a szakterületen jártasak számára. Az analógokat be lehet adni közvetlenül, vagy egy készítmény formájában az embereknek, azaz azoknak, akik törpe-növésben szenvednek, hogy a hGH termelésben mutatkozó hiányosságaikat kezeljük.
Példák
A következő példákkal a találmány szerinti eljárást közelebbről szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül. A példák nem foglalnak magukban részletes leírásokat az alkalmazott hagyományos módszerekről a vektorok megalkotásánál, a szóban forgó polipeptideket kódoló gének beiktatásánál ilyen vektorba, vagy az így létrejött plazmidok bevezetésénél a bakteriális gazdasejtbe. Az ilyen módszerek jól ismertek azok számára, akik jártasak a szakterületen. Ezen kívül számos publikáció is foglalkozik ezekkel, ilyenek pl. a következők:
Principles of Gene Manipulation, An Introduction to Genetic Engineering (A gén-manipuláció alapelvei, Bevezetés a génsebészetbe) 2. kiadás. Szerkesztette: Old, R. W. és Primrose, S. B. Univ. of Calif, Press (1981);
Met. Enzymol, 68. kötet. Recombinant DNA (Rekombináns DNS). Szerkesztette: Ray Wu; Academic Press;
Met, Enzymol. 65. kötet. Nucleic Acids (Nukleinsavak). 1. rész. Szerkesztette: Crossman, Lawrence és Moldave, Kivié; Academic Press; Maniatis, T., Fritasch, Ε. E, Sambrook, J.: Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Molekuláris klónozás; Laboratóriumi kézikönyv). Gold Spring Harbor Laboratory, NY (1982);
Bemard, Η. V. és munkatársai: Gene (1979) 5, 59;
Oppenheim, A. B. és munkatársai: J. Mól. Bioi. (1982) 158, 327;
Remaut, E. és munkatársai: Gene (1981) 75, 81.
7. példa
Expressziós vektorok
Ahogyan itt használjuk, az „expressziós vektor” kifejezés a plazmidok olyan csoportjára vonatkozik, amely baktériumokban, elsősorban E. coli-ban a kívánt gén kifejeződéséhez alkalmazható. A kívánt gént be lehet iktatni az expressziós vektorba, vagy más módszer szerint az expressziós vektoron levő promotereket ki lehet metszeni és a kívánt gén eléhelyezni.
I. PL expressziós vektorok
A. pMG 100
A pMG 100, amint ezt az 1. ábrában bemutattuk és az Ábrák leírása fejezetben részletesen leírtuk, a többkópiás pBR322 plazmidba iktatott XDNS-ből van öszszeállítva. A XDNS szembetűnő vonása az, hogy a XPL promotert, az L és R jelzésű N-hasznosító helyeket (nutL és nutR), befekeződő (terminációs) Rl helyet (tR1), a Cn riboszomális kötőhelyet és egy ATG iniciáló kodont tartalmaz. Az egyéb vonásokat az 1. ábra mutatja be.
A pMG 100-at pKC 30-ból készítettük. A pKC 30-at viszont a PL promoter szubklónozásával állítjuk elő a következő módon.
λ fág DNS-t emésztünk XHől és Smal restrikciós endonukleázokkal és a 6393 bázispárból álló egyedi fragmenst tisztítottuk, majd Hindül és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztettük. Az így nyert 2397 bázispárból álló és PL promotert tartalmazó fragmenst tisztítottuk és hozzákapcsoltuk (ligáltuk) a pBR 322 DNS nagy fragmenséhez, amelyet 7/zWni-mal és BamHI-gyei történő emésztéssel nyertünk. A szubklónt telep-hibridizációval azonosítottuk, kinyertük és a plazmid DNS-t izoláltuk [Oppenheim, A. és munkatársai: J. Mól. Bioi. (1982), 158, 327],
Ezt a plazmidot és eukarióta géneket tartalmazó származékait megfelelő E. coli gazdasejtekben, például E. coli A1645, E. coli A4255 vagy E. coli A1637 törzsben tartjuk fenn. A gazdasejt legfontosabb vonása az, hogy a Cl 857 hőérzékeny represszort és az antiterminációs N-fehérjét tartalmazza [Gottesman, Μ. E. és munkatársai: J. Mól. Bioi. (1978) 140, 197].
HU 209 878 Β
ApMGlOO vektor számos előnnyel bír a korábban leírt expressziós vektorokkal szemben, ezek a következők:
1. ) A kifejeződés rendkívül magas szintje
Ez a vektor képes az idegen fehérje kifejeződését E. coliban úgy irányítani, hogy ez a teljes sejtfehérje mennyiségének 15—25%-át is elérje.
2. ) A kifejeződés hővel indukált szabályozása
A PL promotor inaktív abban az esetben, ha Cl represszor van hozzá kötve. A CI857 represszor hőérzékeny, azaz 30 °C hőmérsékleten a promoterhez kötődik, 42 °C hőmérsékleten viszont inaktiválódik. így a fermentáció hőmérsékletét 42 °C-ra emelve a gazda baktériumsejt indukálódik, a kívánt fehérjét termeli.
Az ilyen rendszer előnyei a következők:
a) egy olyan idegen fehérjét is elő lehet állítani, ha szükséges, amely E. coli-ra toxikus, ilyen módon kerülve el a sejt korai halálát a fermentációs folyamatban.
b) a fehérje-túltermelés stabilizálhatja ezt a rendszert és megelőzi a proteolitikus lebomlást [Cheng, Y. E. és munkatársai: Gene (1981) 14, 121], így a „pillanatnyi” túltermelés, amely egy szorosan szabályozott promotert használ, mint pl. PL-t, előnyös lehet a folyamatos alacsony szintű termeléshez.
3. ) Nagy kópia-szám
A PL promoter a pMG 100-ban egy nagy kópiaszámú plazmidon található magától a λ-tól megkülönböztetve, amely kis kópiaszámban van jelen az E. coli-ban. Ez megnöveli a kifejeződés szintjét.
4. ) Riboszóma kötőhely és iniciáló kodon
Ez az expressziós vektor egy erős prokarióta riboszomális kötőhelyet (RBS), valamint egy transzlációs iniciáló kodont (ATG) tartalmaz. így bármiféle eukarióta gént lehet klónozni anélkül, hogy iniciáló kodont kellene hozzáadni. Ezen túl a hatásos RBS növeli a kifejeződés szintjét.
5. ) Kényelmes restrikciós helyek
Az expressziós vektornak van egy őamHI helye közvetlenül az ATG iniciáló kodont követően elhelyezve, amely lehetővé teszi a kívánt gén megfelelő elhelyezését abból a célból, hogy az optimális kifejeződést elérjük.
6. ) Nut hely
Az N-fehérje, amelyet a gazdaszervezet szolgáltat, az expressziós vektor Nut helyéhez kötődik és ezáltal megakadályozza az átírás befejeződését a tR1 helynél.
B. pND5
Amint ez a 3. ábrán látható, a pND5 tartalmazza a PL promotert és a jelen találmány szerinti expressziós vektorok más fontos komponenseit. Magában foglal egy egyedi Ndel helyet közvetlenül a riboszomális kötőhely után. A riboszomális kötőhely különbözik a normál Cn helytől. Ennek szekvenciája:
TAAGGAAGTACTTACAT
ATTCCTTCATGAATGTA
Ez származtatható egy mutánsból, vagy kémiailag lehet szintetizálni ismert módon. Amint az Ábrák leírása fejezetben részletesen leírtuk, a pND5 és pOG7-ből származik [Oppenheim, A. és munkatársai: J. Mól. Bioi. (1982) 158, 327]. Ez a vektor nem tartalmaz transzlációs iniciáló kodont. Az a bGH és hGH egészen kiváló kifejeződését eredményezi, különösen megemelt kitermelést egy bGH analógot tartalmazó pMG 100-hoz viszonyítva.
C. pND55
A pND55 és pND5 egyik származéka, amely a kényelmes Sacl restrikciós helyet tartalmazza a CnRBS és az ATG iniciáló kodon előtt. A plazmid hasítása ennél a helynél, majd az ezt követő kezelés DNS polimeráz Klenow fragmenssel lehetővé teszi, hogy ATG iniciáló kodont nyerjünk, amelyhez bármiféle kívánt gént hozzá lehet kapcsolni (3. ábra, és leírás a 3. ábrához).
II. TRP expressziós vektorok
A. pAL Trp 46
A pAL Trp 46 tartalmazza a Trp promotert és a β-galaktozidáz génnel fuzionált Trp E gén első hét aminosavát (5. ábra). A kívánt gént be lehet iktatni a BamHI helyre, amely a Trp E 7. aminosavát követi.
B. pAL Trp 47; Trp 46 gyengítő kiiktatása
Ez olyan konstrukció, amely Trp 46-ra alapozódik, amelyből a Trp promoter gyengítő területét kiiktattuk.
C. Trp-Lac fúziók
Ennek a promoternek a megalkotása, amely a p47 54 plazmidon található, a 6. és 7. ábrákban van bemutatva. Ennek a konstrukciónak változatait körvonalazza a 8. ábra.
III. Hisztidin-promoter expressziós vektorok
Az ilyen kifejeződést közvetítő vektorok megalkotása a 9. és 10. ábrákban van bemutatva.
IV. Más alkalmazott promoterek
A. Lac
Ezt a promotert a pYL 301 megalkotásában alkalmaztuk, amint ezt a 11. ábra bemutatja.
B. Omp F
Ez olyan promoter rendszer, amely egy, a szignál szekvenciához kötött fehérjét fejez ki. Amikor a fehérje átjut a membránon keresztül (12. ábra), a szignál-szekvencia leszakad róla.
2. példa
Marha növekedési hormon
A bGH cDNS módosítására szolgáló kiindulási anyag a D4 plazmid, amelyet már korábban leírtak. [Keshet, E. és munkatársai, Nucleic Acids Research (1981), 9, 19]. A D4 plazmidot leírták a 245 943 számú amerikai egyesült államokbeli függő szabadalmi bejelentésben (iktatva 1981. március 20-án) is, amelynek igényelt elsőbbsége az 59 690 számú izraeli szabadalmi bejelentés (iktatva 1980. március 24-én). Egy E. coli gazdasejtbe foglalva az már korábban deponálva volt az American Type Culture Collection-nál, ATCC 32 826 számon.
I. pHec 2/3 bGH
A pRec 2/3 megalkotását a 2. ábra mutatja be és az Ábrák leírása című fejezet írja le. A D4-ből származó bGH cDNS-t még a pMG 100-ba történő beiktatás előtt úgy alakítottuk, hogy a korrekt leolvasó keretbe kerüljön. Ezt úgy értük el, hogy a pRec 2/2 előállítása során a bGH-hoz történő hibridizációban pozitívnak mutatkozó kiónokat izoláltuk; ezek az előzetes, SÍ exonukleázos
HU 209 878 Β emésztés következtében egy sorozat bGH törlési fragmenst tartalmaztak. (A pRec 2/2 az az első expressziós plazmid, amelyben a bGH korrekt leolvasási keretben van.) A pALRl kiónt szekvencia meghatározással (Maxam-Gilbert-módszer) kiválasztottuk, mert ez az N-terminálison a kívánt szekvenciával (lásd a 2. ábra leírásánál, 10. oldal alulról a 6. és 7. sor) rendelkezik. Ez a szekvencia biztosítja a korrekt leolvasási keretet a későbbi, plazmidokban történő kifejezés során.
A pRec 2/3-at különböző E. coli törzsekbe iktattuk be, beleértve az A 1637-et is, transzformációval, ismert módszereket alkalmazva. A pRec 2/3-at tartalmazó A 1637-et ATCC 39 385 számon deponáltuk. Ez a törzs a növesztés és indukció hatására egy olyan bGH analógot termel, amely Met-Asp-Gln aminosav-szekvenciával rendelkezik a természetes bGH fenil-alanin-formájának N-terminálisához kapcsolva. A pRec 2/3 által termelt bGH analóg mennyisége kb. 23%-a volt a baktérium által termelt összes fehéijének, Coomasie-festett SDS poliakrilamid-gélek vizsgálata alapján számítva.
II. pROll
A pROll megalkotását a 3. ábra mutatja be és az Ábrák leírása c. fejezet írja le. A pND5 vektor DNS-t Wel-gyel hasítjuk. Az Ndel fragmens beiktatása a pRec 2/3-ből (2. ábra), amely a bGH cDNS-t tartalmazza, eredményezi a pROll plazmidot,
A pROll-t transzformációval vezetjük be az A 1637 E. coliba. Az így létrejött gazdaszervezet-vektor rendszert ATCC 39 390 számon helyeztük letétbe. Ez a törzs, amikor növesztjük és indukáljuk, ugyanazt az analógot termeli, mint a pRec 2/3. Az előzetes eredmények azt jelzik, hogy a pROl 1 akár 20%-kal több bGH analógot termelhet, mint a pRec 2/3. A törzs növesztéséhez használt módszerek, valamint a termelt bGH analóg kinyerése és tisztítása azonos, mint amelyet a 4. példában pRec 2/3-hoz leírunk.
ΙΠ. pAL401
ApAL401 megalkotását a 13. ábrán mutatjuk be és az Ábrák leírása c. fejezetben írjuk le. A D4-ből származó bGH cDNS-t pAL 500 közvetítésével iktattuk be pND 11-be, amint ezt a 13. ábrában bemutatjuk. A pAL401-et be lehet vezetni A 1637 E. coli-ba transzformációval. Az így nyert törzs egy olyan bGH analógot termel, amelyben a természetes bGH Met3 4-e az N-terminálisnál van és a Met4-et megelőző aminosavak ki vannak iktatva.
IV. pAL601
A pAL601 megalkotását a 14. ábra mutatja be és az Ábrák leírása c. fejezet úja le. Ez a pAL401 egyik származéka (13. ábra). ApAL601-et be lehet vezetni A1637 E. coli törzsbe transzformációval. Az így létrejött törzs egy olyan bGH analógot termel, amelyben Met kapcsolódik a fenilalanin-formájú bGH N-terminálisához.
3. példa
Emberi növekedési hormon
A hGH cDNS-hez a kiindulási pont akromegáliás betegekből nyert hipofízis-tumorból tisztított mRNSeredetű cDNS klónozása pBR 322 HindlII helyére. PoliA+mRNS-t izoláltunk humán hipofízisből, és a cDNS-t Maniatis és munkatársai módszerével készítettük. A cDNS-hez HindlII-kapcsolókat (AAAGCTTT) ligáltunk. A cDNS-t HindlII-mal emésztett és defoszforilezett pBR322-be iktattuk be.
A pozitív kiónokat D4 klón Pstl/PStI bGH fragmenséhez történő hibridizációval azonosítottuk. Néhány izolátumnak meghatároztuk a szekvenciáját a cDNS teljes méretének a megállapítására.
I. pTV 18(1)
A pTV 18(1) megalkotását a 4. ábra mutatja be, és az Ábrák leírása c. fejezet írja le. A hGH cDNS-t a pND5-be való bevitel előtt úgy alakítottuk, hogy a korrekt leolvasó keretbe kerüljön.
A pTV 18(l)-et A 1637 E. coliba vezettük be transzformációval. Az így keletkezett baktériumokat ATCC 39 386 számon helyeztük letétbe. Ez a törzs növekedés és indukció hatására egy olyan hGH analógot termel, amely a Met)4-től kezdve a természetes hGH szekvenciájával rendelkezik, viszont az 1-13 aminosavak hiányoznak belőle. A pTV 18(1) által termelt hGH analógok mennyisége a baktériumok által termelt összfehérje mintegy 8%-a.
II. pTV 104(2)
A pTV 104(2) megalkotását a 4. ábra mutatja be, és az Ábrák leírása c. fejezet írja le. A hGH cDNS-t a pND5-be való bevitel előtt úgy alakítottuk ki, hogy a korrekt leolvasó keretekbe kerüljön.
Ezt pTV 104(2)-t A 1637 E. coliba vezetjük be transzformációval. A kapott törzset ATCC 39 384 számon deponáltuk.
Ez a törzs növekedés és indukció hatása egy olyan hGH analógot termel, amely a természetes hGH szekvenciájával rendelkezik, de egy Met előzi meg az eredeti N-terminálist. A pTV 104(2) által termelt hGH analógok mennyisége a baktériumok által termelt összfehéije több, mint 25%-a.
4. példa
A pRec 2/3 növesztése
Törzstenyészetek. Az A 1637-ben levő pRec 2/3 törzstenyészeteit BHI tápközegben (lásd az inokulumnál) tenyésztjük, majd foszfát-citrát puffért tartalmazó 87%-os glicerin-oldattaj kétszeresére hígítjuk, és -70 °C hőmérsékleten tároljuk.
Inokulum. Az inokulumot BHI-tápközegben (37 g/1) szaporítjuk [agy-szív főzet (DIFCO)]. A steril tápközeget rázólombikban inokuláljuk a törzstenyészetből és 15 órán át inkubáljuk rázógépen (200 fordulat/perc) 30 °C hőmérsékleten. Az inokulum szaporításának ezt követő stádiumait kevert, levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápközeget literenként 0,2 ml rázólombik-tenyészettel inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7±0,5-nél, keverés és levegőztetés mellett úgy, hogy az oldott oxigénszintet 20% levegő-telítettség fölött tartjuk.
Termelés. A termelő tápközeg a következő összetételű:
Laktalbumin hidrolizátum (enzimes) 20 g/1
Élesztőkivonat 10 g/1
K2HPO4 2,5 g/1
HU 209 878 Β
NaCl | 10 g/1 |
Ampicillin | o,ig/i |
Biotin | 0,1 mg/1 |
Tiamin | 1 mg/1 |
Nyomelem-oldat | 3ml/l |
Az ampicillint, biotint és tiamint oldatban, külön- | |
külön szűréssel sterilezzük és így adjuk a steril termelő | |
tápközeghez inokulálás | előtt. Steril glükóz-oldatot |
adunk hozzá úgy, hogy kezdetben 10 g/1 legyen a glü- | |
kóz koncentrációja, és az | indukció, valamint a kifeje- |
ződési folyamat során a | glükóz szintjét 10 g/1 fölött |
tartjuk. | |
A nyomelem-oldat a következőket tartalmazza: | |
MgSO4.7H2O | 170 g/1 |
FeCl3 | lógd |
ZnCl2.4H2O | 2g/l |
CoCl2.6H2O | 2 g/1 |
Na2MoO4.2H2O | 2 g/1 |
CaCl2.2H2O | ig/1 |
CuCl2 | ig/1 |
h3ho3 | 0,5 g/1 |
Konc. sósavoldat | 100ml/l |
A tápközeget 5-10% inokulum-tenyészettel inoku- |
láljuk és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A levegőztetés és kezeltetés sebességét úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén-szint a levegő-telítettség 20%-a fölött legyen. A pH-t 7± 0,2 értéken tartjuk ammónia segítségével. Amikor a sejt-koncentráció eléri a kb. 3 g/1 [Optikai sűrűség (OD 660) = 10] értéket, megkezdjük az indukciót.
A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük. Ezen a hőmérsékleten tartjuk 15 percen át, majd a hőmérsékletet 38 ’C-ra csökkentjük. 1-1,5 órás 38 °C hőmérsékleten történő inkubálás után a tenyészetet lehűtjük és a sejteket centrifugálással kinyerjük a hormon-tisztításhoz.
A bGH kinyerése kg baktérium-sejtet szuszpendálunk 10 térfogat 50 mmol/l-es Tris-Cl-t (pH 7,4), 50 mmol/liter EDTA-t és 25% szacharózt tartalmazó oldatban, a szuszpendálást Warring keverőben végezve, a keverő sebességét úgy szabályozva, hogy a habképződés minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan nyomjuk keresztül egy Dynomill sejt-zúzó berendezésen (disruptor) (Willy A., Bachofen, Basel) és a szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját először egy Sharplesscentrifugában végzett centrifugálással, ezt követően pedig 20 000 fordulat/perccel Sorvall-centrigufával végzett folyamatos centrifugálással készítjük. A csapadékot mindkét centrifugálási lépésből összegyűjtjük, 50 mmól/liter koncentrációjú Tris-Cl pufferral mossuk (pH 7,4) és újra szuszpendáljuk 500 ml azonos pufferban. Lizozimet adunk hozzá 2 ml/ml végső koncentrációban és a szuszpenziót 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Triton Χ-100-at adunk hozzá ez után 1% véső koncentrációban, a szuszpenziót 4 ’C hőmérsékletre lehűtjük, és 20 000 ford/perccel 20 percen át centrifugáljuk Sorvall SS34 rotorban. A csapadékot összegyűjtjük, kétszer mossuk 50 mmól/liter Tris-HCl-ben, újra szuszpendáljuk 500 ml 50 mmól/literes Tris-HClben (pH 7,4), amely 5 mmól/liter MgCI2-t is tartalmaz, és dezoxiribonukleázt adunk hozzá 20 μ/ml végső koncentrációban. 30 perces inkubálás után szobahőmérsékleten a csapadékot összegyűjtjük a fentiek szerint, kétszer mossuk 500 nml 20 mmól/literes Tris-Cl-el (pH 7,4), amely 100 mmól/liter NaCl-t és 10 mmól/liter EDTA-t is tartalmaz, majd ezt követi két mosás 500 ml desztillált vízzel. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, amely így -20 ’C hőmérsékleten meghatározatlan ideig tárolható. Ebben a stádiumban a bGH 80%-os tisztaságú, amint ez a nátrium-dodecil-szulfátos elektroforézisből elbírálható. A kitermelés mintegy 15 g bGH.
A bGH tisztítása
100 g precipitátumot szuszpendálunk 40 ml desztillált vízben és szolubilizáljuk 0,5 mólos NaOH-oldattal titrálva (pH 11,8). Az oldatot ez után 2 percen át ultrahanggal kezeljük, és 20 000 fordulat/perccel egy sorvall SS34 rotorban 20 percen átvégzett centrifugálással tisztítjuk. Az oldatot ez után egy pH 11,8 értékű 6,5 mmól/literes borát-pufferral kiegyensúlyozott Sepharose CL-GB oszlopra visszük. Az oszlopot 100 ml/óra sebességgel kifejlesztjük és 12 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az oszlopot elhagyó első csúcsot eldobjuk. A következő két csúcsot elkülönítjük és összegyűjtjük. Az első csúcs egy aggregálódott bGH-t képvisel kis aktivitással; a második bGH, nagy aktivitással.
DEAE-Sephacel (25 g/100 g ekvivalens precipitátum) oszlopot 6,5 mmól/literes borát-pufferral (pH 9,0) kiegyensúlyozunk. A második bGH csúcsot 9,0 pH-ra állítjuk be Hcl-el, és a Sephacel oszlopra visszük 250 ml/óra sebességgel. Az oszlopot 7,5 ml
6,5 mmól/literes borát pufferral mossuk (pH 9,0), és
6,5 mmól/literes borát pufferral (pH 9), amely 75 mmól/liter NaCl-t is tartalmaz, eluáljuk. A frakciókat, amelyek OD280 értéke 0,3 fölött van, összegyűjtjük, dializáljuk H2O ellen Millipore Pellicon dializáló készüléken, majd liofilizáljuk.
5. példa pRec 2/3 által termelt bGH analóg aktivitása
1. ) A bGH analógok radioimmunassay összehasonlítása a természetes bGH-val. (17., 18. ábra)
100 mg/ml bGH analógot tartalmazó oldatot készítünk foszfáttal pufferolt sóoldatban (1% BSA, bovin szérum albumin). Ezt az oldatot széria-hígításnak vetjük alá, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 és 0,78 mg/1 koncentrációjú oldatokat készítve. 0,1 ml-es alikvotokat ezekből az oldatokból két párhuzamosban RIA mérésnek vetünk alá, kettős antitest-eljárást alkalmazva. A hígítási görbe hasonló ahhoz, amelyet természetesen bGH-val nyertünk.
2. Radioreceptor kötés mérés
Radioreceptor kötés mérést hajtunk végre nyúlmájmembránokon, ahogyan ezt Tushima T. és Freisen H. G. leírták [Y. Chin. Endocr. Metab. (1973) 37, 334, l23I-hGH-t alkalmazva nyomjelzőként és autentikus bGH oldatokat a kalibrációs görbék készítéséhez. A mintákat három párhuzamosban inkubáljuk két órán át szobahőmérsékleten 0,3 ml mérő-pufferban [50 mmól/1 Tris, 15 mmól/1 CaCl2 és 5 mg/ml szarvas12
HU 209 878 Β marha szérum albumin, pH 7,6], A csövek 125I-t (20 000 beütés/perc 30-60 pci/pg-os preparátumból), 150-250 μg máj-membrán fehérjét és természetes bGH-t (1-100 mg), vagy bakteriális bGH extraktumot tartalmaznak. Az eredmény azt demonstrálja, hogy a bGH analóg bGH aktivitása hasonló a természetes bGH aktivitásához.
3.) Tibia-vizsgálat (15. ábra)
A pRec 2/3 bGH analóg bioaktivitását, amely analógot a 4. példa szerint átalakított bakteriális sejtből nyertünk ki, tibia-vizsgálattal értékeljük [Parlow, A. F. és munkatársai: Endocrinology (1965) 77, 1126],
28-30 napos patkányok hipofízisét kiirtjuk, majd 10-14 napig kezelés nélkül tartjuk az állatokat. Marha hipofízisből vagy rekombináns E. coliból származó marha növekedési hormont oldunk fel 0,15 mól/1 NaCl + 0,01 mól/1 borát-pufferban (pH 10). A patkányok (47 db csoportonként) 5-125 μg/nap (0,2 ml-ben) menynyiségű bGH oldatot kapnak szubkután injekcióban 5 napon át, miközben normál étrenden tartjuk azokat. (Purina Rat-Chow, és víz tetszés szerint). Az állatokat a
6. napon leöljük, első láb térdcsontjaikat kiemeljük, hosszanti irányban elvágjuk, acetonnal fixáljuk és 2%os AgNO3 oldattal megfestjük. A csöves csont lemezek szélességét méljük egy preparáló két szemlencsés nagyítón (Nikon) keresztül. Az átlagértékeket (40 leolvasás patkányonként) használjuk a lóg dózis-válasz görbék megszerkesztéséhez. Az eredményeket a 15. ábra mutatja be.
6. példa bGH analógok
Az I. táblázat a plazmidok egy sorozatát mutatja be, amelyeket előállítottunk, és azokat az angolokat, amelyek ezeknek a plazmidoknak a segítségével termelődnek.
I. táblázat
Plazmid | A bGH analógok amino terminálisa |
Rec2/3 | Met Asp Gin Phe2 |
pBl | Met Asp Pro Met Gly Alá Phe2 |
pM4 | Met Asp Pro Phe2 |
pMl | Met Alá1 Phe2 |
pM 2 | Met Alá1 Phe2 |
pAL401 | Met4 |
pYL301 | Met Gly Alá1 Phe2 |
pAL302 | 11 aminosav + Alá1 Phe2 |
pHis 129 | Met Thr Arg Phe2 |
pAL312 | Met Gly Alá1 Phe2 |
Plazmid | A bGH analógok amino terminálisa |
pAL322 | Met Gly Alá1 Phe2 |
pAL 601 R | Met Gly Alá1 Phe2 |
p 18 | Met Gly Alá1 Phe2 |
PBTG-800 | Met Glu Phe2 |
pORF2-12 | Alá Gly Alá1 Phe2 |
7. példa
A pREC 2/3 bGH analóg hatása a laktogenezisre a tejelő tehenekben
A bGH laktogén (tej képző) hatását a tudományos irodalom jól dokumentálta [Bines, J. és munkatársai: Brit. J. nutri. (1980) 43, Π9; Peel, C. és munkatársai: J. Nutr. (1981) 111, 1662]. Bauman, D. és munkatársai [J. Dairy Sci., 1. kötet kiegészítése, 86. összefoglaló (1982) helyen arról számoltak be, hogy a tejtermelés növekedett rDNS bGH hatására. Kísérletet hajtottunk végre, hogy meghatározzuk a pRec 2/3 bGH hatását a laktogenezisre a természetes bGH-val összehasonlítva. 18 Holstein-tehenet, 141— 154 nappal az ellés után véletlenszerűen kijelöltünk kezelésre, és tejtermelésre állítottunk be a következő terv szerint:
Előkezelés | Kezelés | Napi GH injekció |
Kontroll | 5 nap | Sóoldat |
Természetes bGH | 5 nap | 25 mg/nap 10 napon át |
pRec 2/3 bGH | 5 nap | 25 mg/nap 10 napon át |
A bGH-adagokat 0,1 mól/l-es vizes NaHCO3 pufferban (pH 8,2) közvetlenül az egyes napi injekciók előtt készítve 1 mg/ml koncentrációban adtuk be. A teheneket placebóval, illetve bGH oldattal injektáljuk naponta 10 napon át a nyaki területen, egy szubkután helyen. Az 5 napos előkezelési időszakban nem adtunk injekciókat.
A teheneket naponta kétszer fejtük, kb. 6.00-kor reggel és 5.00-kor délután. A tej-mennyiséget Boumatic-rendszerrel mértük és a napi tej-adatrendszerben rögzítettük.
Az átlagos tejtermelési értékeket az előkezelési és bGH kezelési periódusban a II. táblázatban mutatjuk be. A kontroll tehenek termelési szintje változatlan volt, míg a tejtermelés mennyisége hasonló mértékben növekedett mindkét bGH-s csoportban. A természetes bGH 11,9%-os növekedést okozott a tejtermelésben a 10 napos perióduson át, míg a bGH analóggal történő kezelés 10,2% növekedést eredményezett. Az adatokat statisztikai szignifikanciára nem elemeztük az állatok kis száma miatt, a növekedés nagysága azonban hasonló ahhoz, amelyet az irodalomban leírtak.
HU 209 878 Β
Arra a következtetésre jutottunk, hogy a pRec 2/3 bGH stimulálja a laktogenezist a tehenekben a természetes bGH-hoz hasonló mértékben.
II. táblázat
A marha növekedési hormon hatása a laktogenezisre Természetes bGH összevetve a pRec 2/3 bGH-val
Kezelési csoport | Átlagos napi tejtermelés *lb/nap | |||
db | Az előkezelés 5 napja | A GH kezelés 10 napja | %-os növekedés az előkezeléshez viszonyítva | |
Kontroll | 6 | 57,23 | 57,26 | - |
Természetes bGH 25 mg/nap | 5 | 58,54 | 65,50 | 11 9 |
pRec 2/3 bGH 25 mg/nap | 6 | 57,58 | 63,34 | 10,2 |
Minden tehénnek adtunk naponta szubkután injekciót, vagy placebót, vagy bGH oldatot, naponta egyszer 10 napon át.
*1 lb = 45,36 dkg.
8. példa
Humán növekedési hormon analóg
A pTV333(31) (ATCC 39 981) megalkotását a 16. ábra mutatja, és az ábrák leírása ismerteti. A pTV333(31) megalkotásához szükséges intermedier plazmidokat a 4. ábra mutatja be, és az ábrák leírása ismerteti. A szintetikus oligonukleotidot foszforamiditmódszerrel készítettük.
A pTV333(31) plazmidot E. coli A2097 törzsbe transzformáltuk. A törzs növesztés és indukálás hatására humán növekedési hormon (hGH) analógot termel, amely a természetes hGH N-terminális fenilalanin aminosavjához kapcsolódó Met-Leu szekvenciával rendelkezik. A törzs által termelt hGH analóg mennyisége a baktérium által termelt összfehérjének körülbelül 6%-a volt, Coomassie-kékkel festett SDS poliakrilamid gélek hGH csíkjainak mérése és a Lowry módszerrel meghatározott fehérjemennyiség alapján számítva.
pTV333(3I) növesztése
I. Törzstenyészetek pTV333(31) törzstenyészetet növesztettünk kazein tápközegen (lásd Inokulum), majd fagyasztóközeggel kétszeresére hígítottuk, és -80 °C-on tároltunk. A fagyasztóközeg 500 ml-enként a következő komponenseket tartalmazza:
K2HPO4 | 6,3 g |
kh2po4 | 1,8 g |
Na-citrát | 0,45 g |
MgSO4.7H2O | 0,09 g |
(NH^SO, | 0,9 g |
Glicerin | 44,0 g |
II. Inokulum | |
Az inokulumot 20 g/1 triptont, | 10 g/1 élesztőkivonatot |
és 2 g/1 nátrium-kloridot tartalmazó oldatban szaporítottuk. Egy rázólombikban levő steril tápközeget beoltottunk a törzstenyészettel, és körülbelül 15 óra hosszat 30 °C-on, körülbelül 200 fordulat/perc sebességgel rázatva tenyésztettük. Kívánt esetben további inokulum szaporítást végeztünk keverős, levegőztetős fermentorokban. Steril tápközeget oltottunk be 2-10% inokulummak, és 15 óra hosszat 30 °C-on, pH = 7+5 értéknél keverés és levegőztetés közben inkubáltuk, az oldott oxigén szintet 20% levegő-telítettség fölött tartottuk.
III. Termelés
A termelő tápközeg összetétele a következő:
Tripton 20 g/1
Élesztőkivonat 10 g/1
K2HPO4 2,5 g/1
MgSO4.7H2O 1 g/1
NaCl 5 g/1
Biotin 0,1 mg/1
Tíamin 1 mg/1
Nyomelem-oldat 3 ml/1
A tápközeg 100 mg/1 ampicillint is tartalmaz. Az ampicillin adott esetben szükséges a termeléshez, de mindig megtalálható az inokulum növesztésére használt tápközegben.
A biotint, tiamint és ampicillint koncentrált oldatban külön-külön szűréssel sterilezzük, és így adjuk a steril termelő tápközeghez inokulálás előtt. A növesztés elején steril glükóz oldatot adagoltunk olyan mennyiségben, hogy a koncentráció 10 g/1 legyen. Az indukálási lépésnél további 10 g/1 glükózt adagoltunk.
A nyomelem oldat összetétele a következő: | |
FeCl3 | 16 g/1 |
ZnCl2.4H2O | 2 g/1 |
CoC12.6H2O | 2 g/1 |
Na2MoO4.2H2O | 2 g/1 |
CaCl2.2H2O | 1 g/1 |
CuCl2 | 1 g/i |
H3BO3 | 0,5 g/1 |
Konc. BC1 | 100 mid |
A tápközeget 0,5- | -10% oltótenyészettel beoltjuk, és |
’C-on inkubáljuk. A keverés és levegőztetés sebességét úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigénszint a levegő-telítettség 20%-a fölött legyen. A pH-t ammónia segítségével 7±0,2 értéken tartjuk. Amikor a sejtkoncentráció eléri a 3,5 g/1 (OD660 = 10) értéket, megkezdjük az indukciót.
A hőmérsékletet 42 ’C-ra emeljük, és ezen az értéken tartjuk 1-5 óra hosszat. Ezután a tenyészetet lehűtjük, és a sejteket hormon-tisztításhoz centrifugálással elválasztjuk.
9. példa pTV18(I) és pTV104(2) által termelt hGH analógok aktivitása
I. A hGH analógok radioimmun vizsgálatának összehasonlítása a természetes hGH-val
1000 ng/ml hGH analógot tartalmazó oldatokat készítünk foszfáttal pufferolt sóoldattal (1% BSA). Ezeket az oldatokat sorozathígítással a 17. ábrán látható koncenrációkra hígítottuk. Ezekből az oldatokból 0,1 ml alikvotokat két párhuzamos mérésben RIA mé14
HU 209 878 Β résnek vetettünk alá, kettős antitest-eljárást alkalmazva. A hígítási görbét a 17. ábra mutatja.
II. Radioreceptor-kötés mérés
Radioreceptor-kötés mérést hajtottunk végre nyúlmáj-membránokon T. Tushima and H. G. Freisen [Y. Chin., Endocr. Méta, (1973) 37, 334] helyen ismertetett módon, nyomjelzőként 125I-hGH-t, a kalibrációs görbék felvételéhez pedig autentikus hGH oldatokat használtunk. A mintákat három párhuzamos formájában 2 óra hosszat szobahőmérsékleten 0,3 ml mérőpufferban inkubáltuk, amelynek összetétele: 50 mmól trisz, 15 mmól/1 CaCl2 és 5 mg/ml szarvasmarha szérum albuminban, pH 7,6. A csövek 125I-hGH-t (20 000 beütés/perc pCi/pg preparátumból) 150-250 pg májmembrán-fehéqét és természetes hGH-t (1-1000 ng), vagy baktériumeredetű hGH analógot tartalmaztak. Az eredményeket a 18. ábra mutatja, ahonnan látható, hogy a Met-hGH analóg hGH-aktivitása összevethető a természetes hGH-val.
10. példa
Szuperoxid-diszmutáz (SÓD)
A szuperoxid-diszmutáz (SÓD) cDNS változatokhoz a pS61-10 plazmidból indulunk ki, amelyet a Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:2808 (1982) helyen ismertettek. A plazmidban található SÓD cDNS leírása a 489 786 számú párhuzamos amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben is megtalálható.
A pNd-SODNN-12 plazmid előállítását a 20. ábra mutatja be és az ábrák leírása ismerteti. Az SÓD cDNS-t úgy módosítottuk, hogy egy Ndel restrikciós helyet vezettünk be a gén 5' végénél, és egy HindllI restrikciós helyet a gén 3' végénél szintetikus linkerek beiktatásával, ahogyan a 25. ábrán bemutatjuk. A kapott pSOD NH-10 plazmid az SÓD cDNS-t unikális restrikciós helyekhez kapcsolva tartalmazza.
Az SÓD, azaz humán Cu/Zn SÓD expresszióját E. coliban úgy értük el, hogy a tovább módosított cDNS kiónt építettük be pND5 plazmidba, amint ezt a 20. ábrán bemutattuk. (A pND5 plazmid származékát, a pROll plazmidot, amely a szarvasmarha növekedési hormont kódoló gént tartalmazza, E. coli A1637 törzsbe transzformálva deponáltuk ATCC 39 390 számon). Először a pSODNH-10 plazmid HindllI helyére a következő szekvenciával rendelkező, foszforamidit módszerrel szintetizált kapcsolót építettük be: AGCTTCCATATGGA
AGGTATACCTTCGA így a pSODnn-12 plazmidot kaptuk, amely egy további Ndel helyet tartalmaz. Az Ndel restrikciós helyek által megkötött SÓD cDNS-t úgy izoláltuk, hogy a pSODNH-12-t Ndel-gyel hasítottuk, majd Ndel-gyel linearizált pND5 plazmiddal ligáltuk. Az E. coli A1645 törzsbe történő transzformálás három különböző típusú kiónt eredményezett, amelyeket pNd-SODNN-l, 4 és 12 jellel jelöltünk, amelyek a SÓD cDNS inzertet tartalmazták (lásd 20. ábra). A pNd-SODNN-l az SÓD inzertet rossz, órajárással ellentétes irányú orientációban tartalmazza, ezért negatív kontrollként szolgál. A 4 és 12 kiónokban a SÓD cDNS helyes, órajárással megegyező irányú orientációban található. A 4 jelű klón két tandem-kapcsolódó SÓD gént tartalmaz. A 4 és 12 jelű kiónok növesztés és indukció hatására olyan szuperoxid-diszmutázt termelnek, amely nincsen glikozilezve. A két klón által termelt SÓD mennyisége a baktérium által termelt teljes fehéije mintegy 0,1-0,3%-ának felel meg, Coomasie-val festett SDS-poliakrilamid gél mérés alapján számítva. A pNd-SODNN-12 plazmidot ATCC 53 166 szám alatt deponáltuk.
77. példa pNd-SOD^-I2 növesztése
Törzstenyészetek: A1645 törzsben levő pNdSODnn-12 törzstenyészeteit BHI tápközegben (lásd inoculum) készítettük, majd foszfát-citrát-puffert tartalmazó 87%-os glicerin-oldattal kétszeresére hígítottuk, és -70 °C-on tároltuk.
Inokulum: Az inokulumot BHI tápközegen (37 g/1 agy-szív-főzet/DIFCO) készítettük. Rázólombikban levő steril tápközeget a törzstenyészetből oltottuk be, és 15 óra hosszat 30 °C-on, 200 fordulat/perc rázatással inkubáltuk. Az inokulum szaporítását a következő szakaszokban keverővei és levegőztetővei ellátott fermentorokban végeztük. A steril tápközeget literenként 0,2 ml rázólombik-tenyészettel oltottuk be, és 15 óra hosszat 30 °C-on, 7±0,5 pH-értéknél keverés és levegőztetés közben inkubáltuk úgy, hogy az oldott oxigénszintet 20% levegő-telítettség fölött tartottuk.
Termelés: A termelő tápközeg összetétele a következő: | |
Laktalbumin hidrolizátum (enzimes) | 20 g/1 |
Elesztőkivonat | 10 g/1 |
K2HPO4 | 2,5 g/1 |
NaCl | 10 g/1 |
Ampicillin | 0,1 g/1 |
Biotin | 0,1 mg/1 |
Tiamin | 1 mg/1 |
Nyomelem-oldat | 3 ml/1 |
Az ampicillint, biotint és tiamint oldatban, külön- |
külön szűréssel sterileztük, és beoltás előtt adtuk a steril termelőtápközeghez. Steril glükóz-oldatot adagoltunk, a termelés kezdetén 10 g/1 koncentráció biztosítására, majd az indukció és expressziós eljárás során az 1 g/1 fölötti glükóz koncentráció biztosítására.
A nyomelem-oldat összetétele a következő volt:
MgSo4.7H2O 170 g/1
FeCl3 16 g/1
ZnCl2.6H2O 2 g/1
CoC12.6H2O 2 g/1
Na2MoO4.2H2O 1 g/1
CaCl2.2H2O 1 g/1
CuCl2O 1 g/1
H3BO3 0,5 g/1
Konc.Hcl 1000 ml/1
A tápközeget 5-10% oltótenyészettel oltottuk be, és 30 °C-on inkubáltuk. A levegőztetés és keverés sebességét úgy állítottuk be, hogy az oldott oxigén-szint a levegő-telítettség 20%-a fölött legyen. A pH-t ammónia segítségével 7±0,2 értéken tartottuk. Amikor a sejtkoncentráció elérte a 3,5 g/1 (OD660 = 10) értéket, megkezdtük az indukciót.
A hőmérsékletet 42 °C-ra emeltük. Ezen a hőmér15
HU 209 878 Β sékleten tartottuk 15 percig, majd 38 °C-ra csökkentettük. Ezután 38 ’C-on inkubáltunk 1-1,5 óra hosszat, majd a tenyészetet lehűtöttük, és a sejteket az enzimes tisztításhoz centrifugálással elválasztottuk.
SÓD kinyerése kg baktériumsejtet egy Waring-keverőben, tízszeres térfogatú olyan oldattal szuszpendáltunk, amelynek összetétele 50 mmól/1 trisz-Cl (pH = 7,4), 50 mmól/1 EDTA és 25% szacharóz, miközben a keverő sebességét úgy szabályoztuk, hogy a habzás minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan átengedtük egy Dynomill sejtzúzó berendezésben (Willy A. Bachofen, Bázel), és a szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját először egy Sharpless centrifugában végzett, majd 20 000 fordulat/perc sebességgel Sorvall centrifugában folyamatosan végzett centrifugálással tisztítottuk. A két centrifugálási lépés csapadékát összegyűjtöttük, 50 mmól/1 Trisz-Cl pufferrel (pH = 7,4) mostuk, és 500 ml ugyanolyan pufferban szuszpendáltuk. Ezután 2 mg/ml végső koncentrációig lizozimot adagoltunk, és a szuszpenziót 1 óra hosszat 37 ’C-on inkubáltuk. Ezután 1% végső koncentrációig Triton X-100-t adagoltunk, a szuszpenziót 4 ’C-ra lehűtöttük, és 20 000 fordulat/perc sebességgel 20 percig centrifugáltuk egy Sorvall SS34 rotorban. A csapadékot összegyűjtöttük, kétszer mostuk 50 mmól/1 Tris-Cl pufferrel, 5 mmól/1 MgCl2-t tartalmazó 500 ml 50 mmól/l-es Tris-Cl pufferban (pH = 7,4) újra szuszpendáltunk, és 20 pg/ml végső koncentrációig dezoxiribonukleázt adtunk hozzá. 30 percig szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a csapadékot a fenti módon összegyűjtöttük, kétszer mostuk 500 ml, 100 mmól/1 nátrium-kloridot és 10 mmól/1 EDTA-t tartalmazó 20 mmól/1 Tris-Cl pufferrel (pH = 7,4), majd kétszer mostuk 50 ml desztillált vízzel. A csapadékot centrifugálással összegyűjtöttük, amely így -20 ’C-on meghatározatlan ideig tárolható. Ennél a fokozatnál a SÓD 85%-os tisztaságú, amint ez a nátrium-dodecil-szulfátos elektroforézisből megítélhető. Akitermelés mintegy 15 g SÓD.
SÓD tisztítása
100 g csapadékot szuszpendálunk 40 ml desztillált vízben, és 0,5 mól/l-es nátrium-hidroxiddal titrálva szolubilizáljuk (pH = 11,8). Ezután az oldatot 2 percig ultrahanggal kezeljük, majd 20 000 fordulat/perc sebességgel 20 percig Sorvall SS 34 rotorban centrifugálva tisztítjuk. Ezután az oldatot Sepharose CL-6B oszlopra (5x100 cm) visszük fel, amelyet 6,5 mmól/l-es borátpufferrel (pH = 11,8) egyenlítettünk ki. Az oszlopot 100 ml/óra sebességgel fejlesztjük ki, és 12 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az oszlopot elhagyó első csúcsot eldobjuk. A következő két csúcsot elkülönítve összegyűjtjük. Az első agregálódott SOD-t tartalmaz alacsony aktivitással, a második pedig SOD-t magas aktivitással.
Egy DEAE-Sephacel oszlopot (25 g/100 g ekvivalens csapadék) 6,5 mmól/l-es borátpufferral (pH = 9,0) kiegyensúlyoztunk. A második SÓD csúcs pH-ját sósavval 9,0 értékre állítjuk, és 250 ml/óra sebességgel az oszlopra töltjük. Az oszlopot 7,5 ml, 6,5 mmól/l-es borátpufferral (pH = 9,0) mossuk, és 75 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 6,5 mmól/l-es borátpufferral (pH = 9,0) eluáljuk. A 0,3 fölötti OD280-értékű frakciókat Összegyűjtők, vízzel szemben Millipore Pellicon dializáló berendezésben dializáljuk és liofilezzük.
12. példa pNd-SOD^-12 által termelt SÓD aktivitása
Az E. coli A1645-ben pNd-SODNN-12 expressziójával termelt humán SÓD a nyúl-anti-hSOD antitestekkel reagál és SDS-poliakrilamid-gélen az autentikus hSOD-vel együtt vándorol. Ezenkívül a pNd-SODNN12 által termelt SÓD analóg enzimaktivitása az McCord and Fridovich, J. Bioi. Chem. (1969), 244, 6049-6055 helyen ismertetett ferricito-króm-c redukciógátlás mérése alapján hasonló a természetes humán SÓD (Sigma) és a szarvasmarha SÓD (Orgotein; Grunenthal GMBH) aktivitásával.
13. példa
Met-Asp-Gln-sertés növekedési hormon analóg
ApRec pig 24 plazmid előállítását a 24. ábra mutatja és az ábrák leírása ismerteti. Az intermedier plazmidok előállítását a 21-23. ábrák mutatják be, és az ábrák leírása ismerteti.
A pl07 és p9 plazmidok, amelyek a pGH cDNS-t tartalmazzák, másik hipofízis-izolátum cDNS-könyvtárból származnak. A cDNS-t C-farokkal láttuk el,míg a pBR322 PstI hasítási termékét G-farokkal láttuk el. A két preparátumot ligáltuk, és a kiónokat bGH D4 DNS bGH fragmenséhez történő hibridizációval a pGHszekvencia inzertre nézve válogattuk. A pozitív kiónokat, többek között a pl07 és p9 plazmidot elválasztottuk, és szekvenciájukat meghatároztuk.
A pRec pig 24 plazmidot transzformációval E. coli A2097 és A4255 törzsbe vezettük be. Ezek a törzsek növesztés és indukció hatására olyan sertés növekedési hormon (pGH) analógot termelnek, amelyben MetAsp-Gln szekvencia kapcsolódik a természetes pGH fenilalanin formája N-terminálisához. A törzsek által termelt pGH analóg mennyisége a baktériumok által termelt teljes fehérjemennyiség körülbelül 10%-át teszi ki, a Coomassie kékkel festett SDS poliakrilamid gélek pGH csíkjának mérése és a teljes fehérjemennyiség Biuret-módosított Lowry módszerrel [E. Layne, Methods in Enzymology 3, 450 (1957)] történt meghatározása alapján számítva.
14. példa pRec pig 24 növesztése E. coli A2097 törzsben
I. Törzstenyészetek
A pRec pig 24 törzstenyészeteit kazein tápközegen (lásd Inokulum) készítettük, majd fagyasztó közeggel kétszeresére hígítottuk, és -80 ’C-on tároltuk. A fagyasztó közeg 500 ml-enként a következő anyagokat
tartalmazza.: | |
K2HPO4 | 6,3 g |
kh2po4 | 1,8 g |
Na-citrát | 0,45 g |
MgSO4.7H2O | 0,09 g |
(NH4)2SO4 | 0,9 g |
Glicerin | 44,0 g |
HU 209 878 Β
II. Inokulum
Az inokulumot 20 g/1 triptont, 10 g/1 élesztőkivonatot és 5 g/1 nátrium-kloridot tartalmazó oldaton szaporítottuk. A rázólombikban levő steril tápközeget beoltottuk a törzstenyészettel, és 15 óra hosszat körülbelül 20 fordulat/perc sebességgel rázatva 30 °C-on inkubáltuk. Kívánt esetben az inokulum szaporításának következő fokozatait keverővei és levegőztetővei ellátott fermentorokban végeztük. A steril tápközeg 2-10% inokulummal oltottuk be, és 15 óra hosszat 30 °C-on, 7±0,5 pH-értéknél inkubáltuk keverés és levegőztetés közben olyan módon, hogy az oldott oxigénszint a levegőtelítettség 20%-a fölött legyen.
ΙΠ. Termelés
A termelő tápközeg összetétele a következő:
Tripton 20 g/1
Élesztőkivonat 10 g/1
K2HPO4 2,5 g/1
MgSO4.7H2O 1 g/1
NaCl 5 g/1
Biotin 0,1 mg/1
Tiamin 1 mg/1
Nyomelem-oldat 3 ml/1
A tápközeg 100 mg/1 ampicillint is tartalmaz. Az ampicillin a termelés esetén kívánt esetben van jelen, azonban az inokulum növesztésekor mindig tartalmazza a tápközeg.
A biotint, tiamint és ampicillint koncentrált oldatban külön-külön sterilre szűrjük, és a beoltás előtt adjuk a steril termelő tápközeghez. Steril glükóz oldatot is adagolunk olyan mennyiségben, hogy a koncentráció az elején 10 g/1 legyen. Az indukciós lépésnél további 10 g/1 glükózt adagolunk.
A nyomelem-oldat összetétele a következő: | |
FeCl3 | 27 g |
ZnCl2.4H2O | 2g |
CoC12.2H2O | 2g |
NaMo04.2H20 | 2g |
CaCI2.2H2O | 1 g |
CuCl2 | lg |
H3BO3 | 0,5 g |
Konc. HC1 | 100 ml |
Ionmentes víz | 900 ml |
A tápközeget 0,5- | -10% oltótenyészettel oltjuk be, |
°C-on ínkubáljuk. A keverés és levegőztetés sebességét úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigénszint a levegő-telítettség 20%-át meghaladja. A pH-t ammónia segítségével ±0,2 értéken tartjuk. Amikor a sejtkoncentráció eléri a kb.
3,5 g/1 (ODgg, = 10) értéket, megkezdjük az indukciót.
A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és ezen az értéken tartjuk 2 óra hosszat. Ezután a tenyészetet lehűtjük, és a sejteket a hormontisztításhoz centrifugálással elválasztjuk.
A pGH úgy nyerhető ki és tisztítható, mint ahogyan azt a 4. példában a bGH esetén ismertettük.
75. példa pRec pig 24 plazmid növesztése E. coli A4255 törzsben
I. törzstenyészetek
A törzstenyészeteket kazein tápközegen (lásd Inokulum) készítettük, majd fagyasztó tápközeggel kétszeresre hígítottuk, és -75 °C-on tároltuk. A fagyasztóközeg összetétele:
K2HPO4 | 6,3 g |
kh2po4 | 1,8 g |
Na-citrát | 0,45 g |
MgSO4.7H2O | 0,09 g |
(NH4)2SO4 | 0,9 g |
glicerol | 44,0 g |
Ionmentes víz | 450 ml |
II. Inokulum | |
Az inokulumot 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 nátri- |
um-kloridot tartalmazó minimál-tápközegen (lásd lejjebb) szaporítottuk. Egy rázólombikban levő steril tápközeget törzstenyészettel oltottunk be, és 15 óra hosszat körülbelül 250 fordulat/perc sebességgel rázatva 30 °C-on inkubáltuk. Kívánt esetben az inokulum szaporításának következő fokozatait keverővei és levegőztetővei ellátott fermentorokban végeztük. A steril tápközeget 2-10% inokulummal oltottuk be, és 15 óra hosszat 30 °C-on 7±0,5 pH-értéknél inkubáltuk keverés és levegőztetés közben olyan módon, hogy az oldott oxigénszint a levegő-telítettség 20%-a fölött legyen.
Minimáltápközegek
A pRec pig 24/A4255 esetén termelés céljára a következő minimális tápközeget alkalmaztuk:
k2hpo4 | 6 g/1 | 6 g/1 |
kh2po4 | 4 g/1 | 4 g/1 |
nh4ci | 1 g/1 | 1 g/i |
MgSO4.7H2O | 3 g/1 | 0,2 g/1 |
10% FeNH4 citrát | 0,3 ml/1 | 0,1 ml/1 |
Nyomelem-oldat | 3 ml/1 | lml/1 |
Habzásgátló, szilikon | 0,5 ml/1 |
Autokláv.
A tápközeghez 100 mg/1 ampicillin is adható. A rázólombikokba steril glükózt is adtunk a kezdeti 5 g/1 koncentráció biztosítására. A fermentorokhoz 50%-os glükózoldatot külön sterileztünk, és a 20 g/1 koncentráció biztosításához szükséges mennyiséget adagoltunk. További 50%-os glükózt adagoltunk a fermentáció során OD egységenként körülbelül 1,08 g glükóz arányban. A pH-t 25%-os ammónia adagolásával szabályoztuk. Habzásgátlót kívánt esetben adagoltunk. A biotint a fermentorokban 3 mg/1, a rázólombikokban 0,5 mg/1 koncentrációban alkalmaztuk.
A nyomelem-oldat összetétele a következő: | |
h3bo3 | 0,50 g/1 |
CuC12(CuSO4.5H2O) | 1,0 (1,85) g/1 |
CaCl2.2H2O | 3,0 g/1 |
MnSO4.H2O | 1,0 g/1 |
Na2MoD4.2H2O | 2,0 g/1 |
CaCl2.6H2O | 2,0 g/1 |
ZnCl2.4H2O (ZnSO4.7H2O) | 2,0 g/1 (2,78) |
Koncentrált HC1 | 100 ml |
Desztillált víz | 900 ml |
A zárójelben levő vegyületek | az előttük álló vegyü- |
letek helyett alternatív módon alkalmazhatók. A zárójelben levő mennyiség a zárójelben levő vegyületre vonatkozik. A tápközeget 0,5-10% oltótenyészettel oltjuk be, és 30 °C-on ínkubáljuk. A keverés és levegőzte17
HU 209 878 Β tés sebességét úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigénszint a levegő-telítettség 20%-a fölött legyen. A pH-t ammónia segítségével 7±0,2 értéken tartjuk. Amikor a sejtkoncentráció eléri a körülbelül 2,5 g/1 (OD660 = 10) értéket, megkezdjük az indukciót.
A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és ezen az értéken tartjuk 15 percig. Ezután az inkubációt 38 °C-on 120 percig folytatjuk. Ezután a tenyészetet lehűtjük, és a sejteket a hormontisztításhoz centrifugálással elválasztjuk.
A pGH a 4. példában a bGH esetére leírt módszerrel választható el és tisztítható.
16. példa
Met-sertés növekedési hormon analóg
A p3007 előállítását a 22. ábra mutatja, és az ábrák leírása ismerteti. A p3007 előállításához szükséges intermedier plazmidokat a 3. és 21. ábra szemlélteti és az ábrák leírása ismerteti.
Ap3007 plazmidot E. coli A1645 törzsbe transzformáltuk. Ez a törzs növesztés és indukció hatására olyan sertés növekedési hormon (pGH) analógot termel, amelyben egy metionin kapcsolódik a természetes pGH fenilalanin formájának N-terminálisához (MetpGH). A termelt pGH analóg mennyisége a baktérium által termelt Összes fehérje körülbo1il 10%-át teszi ki, a Coomassie-kékkel festett SDS poliakrilamid gélek pGH csíkjának mérése és a teljes fehérjemennyiség Biuret-módosított Lowry Módszerrel [E. Layne, Methods in Enzymology 3, 450 (1957)] történt meghatározása alapján számítva.
17. példa p3007 plazmid növesztése E. coli A1645 törzsben
I. Törzstenyészetek
A p3007 plazmid törzstenyészeteit kazein tápközegen (lásd Inokulum) készítettük, majd fagyasztóközeggel kétszeresére hígítottuk, és -80 °C-on tároltuk. A fagyasztóközeg 500 ml-enként a következő anyagokat
tartalmazza: | |
K2HPO4 | 6,3 g |
kh2po4 | 1,8 g |
Na-citrát | 0,45 g |
MgSO4.7H2O | 0,09 g |
(NH^SO, | 0,9 g |
Glicerin | 44,0 g |
II. Inokulum
Az inokulumot 20 g/1 triptont, 10 g/1 élesztőkivonatot és 5 g/1 nátrium-kloridot tartalmazó tápközegen szaporítottuk. A rázólombikban levő steril tápközeget a törzstenyészettel beoltottuk, és 15 óra hosszat körülbelül 200 fordulat/perc sebességgel rázatva 30 °C-on inkubáltuk. Kívánt esetben az inokulum szaporításának további fokozatait keverővei és levegőztetővei ellátott fermentorokban végeztük. A steril tápközeget 2-10% inokulummal oltottuk be, és 15 óra hosszat 30 °C-on 7±0,5 pH-értéknél inkubáltuk keverés és levegőztetés közben olyan módon, hogy az oldott oxigénszint a levegő-telítettség 20%-a fölött legyen.
ΙΠ. Termelés
A termelő tápközeg összetétele a következő:
Tripton | 20 g/1 |
Elesztókivonat | 10 g/1 |
K2HPO4 | 2,5 g/1 |
MgSO4.7H2 | 1 g/i |
NaCl | 5 g/1 |
Biotin | 0,1 mg/1 |
Tiamin | 1 g/1 |
Nyomelem-oldat | 3ml/l |
A tápközeg 100 mg/1 ampicillint is | tartalmaz. Az |
ampicillin a termelés esetén kívánt esetben alkalmazandó, az inokulum növesztésekor azonban a tápközeg mindig tartalmazza. A biotint, tiamint és ampicillint koncentrált oldatban külön-külön sterilre szűrtük, és a steril termelőtáp-közeghez az inokulálás előtt adagoltuk. Steril glükózoldatot is adagoltunk a kezdeti 10 g/1 koncentráció biztosítására. Az indukciós lépésben további 10 g/1 glükózt adagoltunk.
A nyomelem-oldat összetétele a következő: | |
FeCl3 | 27 g |
ZnCl2.4H2O | 2g |
CoC12.2H2O | 2g |
NaMoO4.2H2O | 2g |
CaCl2.2H2O | lg |
CuCl2 | lg |
H3BO3 | 0,5 g |
Konc. HC1 | 100 ml |
Ionmentes H2O | 900 ml |
A tápközeget 0,5- | -10% oltótenyészettel oltjuk be, és |
°C-on inkubáljuk. A keverés és levegőztetés sebességét úgy állítjuk be, hogy az oldottoxigénszint a levegő-telítettség 20%-a fölött legyen. A pH-t ammónia segítségével 7±0,2 értéken tartjuk. Amikor a sejtkoncentráció eléri a körülbelül 3,5 g/1 (OD^q = 10) értéket, megkezdjük az indukciót.
A hőmérsékletet 42 ’C-ra emeljük, és ezen az értéken tartjuk 2 óra hosszat. Ezután a tenyészetet lehűtjük, és a sejteket a hormontisztításhoz centrifugálással elválasztjuk.
A pGH a 4. példában a bGH esetére leírt módszerrel választható el és tisztítható.
18. példa
Az E. coli A1645 törzsben p3007 által termelt MetpGH analóg aktivitása
1. Met-pGH analóg összehasonlítása a természetes pGH-val radioimmun vizsgálattal
100 ng/ml Met-pGH analógot tartalmazó oldatot készítettünk foszfáttal pufferolt sóoldattal (1% BSA). Ezt az oldatot sorozathígítással 50, 25,12,5,6,25,3,12, 1,56 és 0,78 ng/1 koncentrációra hígítottuk. Ezekből az oldatokból két párhuzamos, 0,1 ml alikvot mintákat RIA mérésnek vetettünk alá kettős antitest-eljárást alkalmazva. A hígítási görbe hasonló volt ahhoz, mint amelyet a természetes pGH-val kaptunk.
2. Radioreceptor kötési vizsgálat
Radioreceptor kötés mérést hajtottunk végre nyúlmáj-membránokon, ahogyan ezt Tushima T. és Freisen H. G. leírták [Y. Chin. Endocr. Metab. (1937) 37, 334], 125I-hGH-t alkalmazva nyomjelzőként és autentikus bGH oldatokat a kalibrációs görbék készítéséhez. A mintákat
HU 209 878 B három párhuzamosban inkubáltuk két órán át szobahőmérsékleten 0,3 ml mérő-pufferban (50 mmól/1 Tris, 15 mmól/1 CaCl2 és 5 mg/ml szarvasmarha szérum albumin, pH = 7,6). A csövek 125I-t (20 000 beütés/perc 3060 pci/pg-os preparátumból), 150-250 μg máj-membrán fehérjét és természetes bGH-t (1-100 ng), vagy bakteriális pGH extraktumot tartalmaztak. Az eredmény azt demonstrálja, hogy a pGH analóg pGH aktivitása hasonló a természetes pGH aktivitásához.
3. A Met-sertés növekedési hormon analóg radioreceptor kötési vizsgálatánál alkalmazott eljárások
A. Májmembrán előállítása
Vemhes (harmadik harmadban levő) nyúl friss máját sóoldattal mossuk, apró darabokra vágjuk, majd egy Waring-keverőben kis sebességgel 4 °C-on 1 percig homogenizáljuk 2 ml/g 0,3 mól/l-es szacharóz-oldatban, amely 10 mól/1 p-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) tartalmaz. A homogenizátumot egy négyréteges szűrőkendőn átszűrjük, és 1000 g-vel 10 percig forgatjuk.
A kapott csapadékot 1 ml/g szacharóz-oldatban újra szuszpendáljuk, és újra megforgatjuk. A két felülúszót egyesítjük, és 20 000 g-vel 20 percig forgatjuk. A membráncsapadékot 1 ml/g máj 0,15 mól/1 kálium-klorid és 10 mól/1 PM5p-tartalmú oldatban újra szuszpendáljuk, és 20 000 g-vel 20 percig forgatjuk. A csapadékot ezután 1 ml/g máj desztillált vízzel homogenizáljuk. A homogenizátumot először 10 percig 1000 g-vel, majd a felülúszót 20 000 g-vel 20 percig forgatjuk, így kapjuk a végső membráncsapadékot. Ezt a csapadékot térfogatával azonos térfogatú vízben szuszpendáljuk, és 1 ml-es részletekben -20 °C-on vagy az alatt tároljuk.
B. Jódozott pGH
Autentikus tiszta pGH-t jódozunk szokásos módszerekkel, Bolton-Hunter reagenssel, majd Sepadex G25 gélszűréssel elválasztjuk.
C. Mérési módszer
Minden hígítást kötőpufferrel készítünk (25 mmól/1 Tris, 10 mmól/1 CaCl2 és 5 mg/ml szarvasmarhaszérum-albumin, pH = 7,4-7,6). A mérést 10x75 mm-es polisztirolcsövekben végezzük. Minden cső tartalmazza a következő anyagokat:
- 0,1 ml I25I-pGH oldat (körülbelül 10 000 beütés/perc);
- 0,1 ml ismert autentikus pGH oldat vagy ismeretlen minta;
- 0,1 ml membrándoldat (fagyasztott törzsoldat 2 térfogat pufferrel hígítva).
A kicsapás során gondoskodni kell a membránkészítmény folyamatos keveréséről, azért, hogy a részecskék leülepedését elkerüljük.
Az autentikus pGH standard oldatok koncentrációja 10 és 1000 ng/ml közötti. A mérést három párhuzamosban végezzük. A csöveket rázatás közben két óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd 1,5 ml kötőpuffert adunk minden csőhöz, és 20 percig 3000 fordulat/perc sebességgel forgatjuk. A felülúszót gyorsan leszivatjuk, és a membráncsapadékot tartalmazó csöveket gammaszámlálásnak vetjük alá.
A kalibrációs görbét a standard minták kapott radioaktivitás értékeinek a koncentráció függvényében történő ábrázolásával kapjuk, és az ismeretlen növekedési hormon minta aktivitását összehasonlítása alapján számoljuk.
19. példa pRec pig 24 által termelt Met-Asp-Gln-pGH analóg aktivitása
1. Met-Asp-Gln-pHG analóg összehasonlítása MetpGH analóggal radioimmun vizsgálat alapján 250 ng/50 ml Met-Asp-Gln-pGH analógot tartalmazó oldatot készítettünk RIA pufferrel (pH = 8,5). Ezt az oldatot sorozathígítással 125, 62,5, 31,25, 15,6, 7,8, 3,9, 1,9 és 0,9 ng/50 μΐ koncentrációra hígítottuk. Két párhuzamos 50 ml alikvot mintákat RIA mérésnek vetettünk alá, a második antitest helyett nyers protein A-t alkalmazva. A hígítási görbe hasonló volt ahhoz, mint amelyet a Met-pGH-val kaptunk. RIA puffer: 50 nmól/1 nátriumbarbital, 150 nmól/1 nátrium-klorid, 10 nmól/1 EDTA, 0,05% Triton X-100,1% BSA, 0,2% SDS.
2. Radioreceptor-kötési vizsgálat
Radioreceptor-kötési mérést végeztünk nyúlmáj membránnal [T. Tushima and H. G. Freisen (Y. Chin., Endocr. Metab.) (1973), 37, 334] nyomjelzőként l25IpGH-t alkalmaztunk,és a kalibrációs görbéket Met-pGH analóg oldattal vettük fel. Három párhuzamos mintát inkubáltunk 2 óra hosszat szobahőmérsékleten 0,3 ml mérőpufferban (50 mmól/1 Tris, 15 mmól/1 kalcium-klorid és 5 mg/ml szarvasmarhaszérum-albumin, pH = 7,6). A csövek 125I-bGH-t (30 000 beütés/perc/100 μΐ), 250250 ng) vagy Met-Asp-Gln-pGH analóg extraktumokat tartalmaztak. Az eredmények azt mutatták, hogy a MetAsp-Gln-pGH analóg pGH-aktivitása összehasonlítható a Met-pGH aktivitással, amely a 18. példa szerint összetéveszthető a természetes pGH-val.
20. példa
Met-Asp-Gln-pGH és Met-pGH analógok biológiai aktivitása
Egy nemrégen megjelent tanulmány (C. A. Spence és munkatársai, Abstract entitled „Effect of Exogenous Growth Hormoné On Fetal Energy Storage and Lactation Performance in Sows, írom the Annual Meeting of the American Society of Animál Science, Univ. of Missouri, Aug. 7-10, 1984) azt ismerteti, hogy az agyalapi mirigy eredetű sertés növekedési hormon adagolása fokozza az anyadisznó tejelválasztását és a malacok életképességét. A tejelválasztási vizsgálatok azt mutatták, hogy a találmány szerinti eljárással előállított Met-Asp-Gln-pGH analóg és a Met-pGH analóg adagolása vemhes anyadisznóknak, javította az anyadisznó tejelválasztását és a malacok életképességét.
Claims (15)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás polipeptidek előállítására E. coli gazdasejtben, azzal jellemezve, hogy egy, 5'-3' irányban- egy lambda bakteriofágból származó PLOL promoter és operátor szekvenciát,- az E. coli gazdasejt által termelt N-antiterminá19HU 209 878 Β tor fehérjéhez való kötésre szolgáló N-hasznosítóhelyet,- egy riboszómakötőhelyet,- egy ATG iniciálé kodont,- egy a kívánt polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát, amely az ATG kodonnal illeszkedő leolvasási keretben van,- egy terminátor szekvenciát, továbbá egy, az E. coli gazdasejtben működőképes replikációs origót és egy szelektálható vagy azonosítható fenotípus jellemzővel társult gént tartalmazó plazmiddal olyan E. coli gazdasejtet transzformálunk, amely C, represszort és N-antiterminátor fehérjét termel, a sejteket növesztjük, majd a hőmérséklet emelésével a Cj represszort inaktiváljuk, a gazdasejtet tenyésztjük, és a tenyészléből a polipeptidet kinyerjük.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdasejtként A1637 vagy A1645 törzset transzformálunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy riboszóma kötőhelyként egyTAAGGAAATACTTACATATTCCTTTATGAATGTA nukleotid-szekvenciával rendelkező, lambda-bakteriofágból származó Cn szekvenciát tartalmazó plazmiddal transzformálunk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy riboszóma kötőhelyként egyTAAGGAAGTACTTACATATTCCTTCATGAATGTA szekvenciával rendelkező szintetikus oligonukleotidot tartalmazó plazmiddal transzformálunk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fenotípus jellemzőként gyógyszerrezisztenciáért vagy hőmérsékletérzékenységért felelős gént tartalmazó plazmiddal transzformálunk.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyógyszerrezisztenciaként ampicillin-, klóramfenikol- vagy tetraciklín-rezisztenciáért felelős gént tartalmazó plazmiddal transzformálunk.
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás szarvasmarha növekedési hormon aktivitású polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-szekvenciát alkalmazzuk.
- 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás sertés növekedési hormon aktivitású polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-t alkalmazzuk.
- 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás humán növekedési hormon aktivitású polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-t alkalmazzuk.
- 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás humán Cu/Zn szuperoxid-diszmutáz aktivitású polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-t alkalmazzuk.
- 11. Az 1. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként a 2. ábrán bemutatott pRec 2/3 jelű, ATCC 39 385 számon deponált plazmiddal transzformálunk.
- 12. Az 1. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként a 3. ábrán bemutatott pROll jelű, ATCC 39 390 számon deponált plazmiddal transzformálunk.
- 13. Az 1. vagy 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként a 4. ábrán bemutatott pTV18(l) jelű, ATCC 39 386 számon deponált plazmiddal transzformálunk.
- 14. Az 1. vagy 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként a 4. ábrán bemutatott pTV 104(2) jelű, ATCC 39 384 számon deponált plazmiddal transzformálunk.
- 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hőmérséklet 42 °C-ra történő emelésével a Cj represszort inaktiváljuk, majd a gazdasejtet 3739 °C-on tenyésztjük.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US51418883A | 1983-07-15 | 1983-07-15 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT34543A HUT34543A (en) | 1985-03-28 |
HU209878B true HU209878B (en) | 1994-11-28 |
Family
ID=24046152
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU842749A HU209878B (en) | 1983-07-15 | 1984-07-13 | Method for producing polipeptids in a new escherichia coli expression |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US4871835A (hu) |
EP (3) | EP0691406A1 (hu) |
JP (3) | JPH0687780B2 (hu) |
AT (2) | ATE66959T1 (hu) |
AU (2) | AU577298B2 (hu) |
BG (2) | BG49718A3 (hu) |
BR (1) | BR8403523A (hu) |
CA (1) | CA1254527A (hu) |
CZ (1) | CZ282867B6 (hu) |
DD (2) | DD240217A5 (hu) |
DE (2) | DE3486425T2 (hu) |
DK (1) | DK347184A (hu) |
ES (2) | ES8602947A1 (hu) |
FI (1) | FI90564C (hu) |
HK (1) | HK128095A (hu) |
HU (1) | HU209878B (hu) |
IE (2) | IE64174B1 (hu) |
IL (8) | IL72396A (hu) |
NZ (2) | NZ227962A (hu) |
RO (1) | RO91332B (hu) |
SK (1) | SK524684A3 (hu) |
ZA (1) | ZA845345B (hu) |
Families Citing this family (67)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
US5236828A (en) * | 1983-07-06 | 1993-08-17 | Papas Takis S | Plasmid pJL6 |
US5670371A (en) * | 1983-07-15 | 1997-09-23 | Bio-Technology General Corp. | Bacterial expression of superoxide dismutase |
BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
US5332805A (en) * | 1984-02-03 | 1994-07-26 | Celltech Limited | Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate |
DE3585170D1 (de) * | 1984-03-06 | 1992-02-27 | Lilly Co Eli | Expressionsvektoren fuer rinderwachstumshormonderivate. |
US5112744A (en) * | 1984-08-27 | 1992-05-12 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for the production of human Cu-Zn superoxide dismutase, bacterial hosts containing the plasmids and methods for production and recovery of such superoxide dismutase |
US6030611A (en) * | 1984-08-27 | 2000-02-29 | Bio-Technology General Corp. | Therapeutic SOD compositions and uses thereof |
CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
CA1267615A (en) * | 1984-08-27 | 1990-04-10 | Dan Hadary | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms |
US5759816A (en) * | 1984-08-27 | 1998-06-02 | Bio-Technology General Corp. | Expression vectors containing λPL promoter and T1 T2 rRNA termination sequence plasmids containing the vectors hosts containing the plasmids and related methods |
US5162217A (en) * | 1984-08-27 | 1992-11-10 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda PL promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof |
US5143836A (en) * | 1984-08-27 | 1992-09-01 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda pl promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof |
US4743546A (en) * | 1985-02-13 | 1988-05-10 | Biotechnica International, Inc. | Controlled gene excision |
US4861868A (en) * | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
FR2579223B1 (fr) * | 1985-03-25 | 1988-12-09 | Genetica | Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine |
DE3685424D1 (de) | 1985-06-26 | 1992-06-25 | Upjohn Co | Solubilisation und oxidation von somatotropin aus transformierten mikroorganismen. |
US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
US4762784A (en) * | 1985-07-15 | 1988-08-09 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermemtation process for the high level production of bovine growth hormone |
US4874703A (en) * | 1985-08-26 | 1989-10-17 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for use in E. coli |
US5631227A (en) * | 1985-09-18 | 1997-05-20 | The Upjohn Company | Somatotropin analogs |
EP0236452B1 (en) * | 1985-09-18 | 1990-10-31 | The Upjohn Company | Enhanced bioactivity of mammalian somatotropin through selective deamidation |
JPH07110232B2 (ja) * | 1985-10-14 | 1995-11-29 | 株式会社日立製作所 | 遺伝子組換え大腸菌の遺伝子生産物を採取する方法および装置 |
US6610520B1 (en) | 1985-11-22 | 2003-08-26 | Bio-Technology General Corp. | Gene encoding human manganese superoxide dismutase and recombinant polypeptide encoded thereby |
IE59498B1 (en) * | 1985-11-22 | 1994-03-09 | Bio Technology General Corp | Human manganese superoxide dismutase analog, plasmid for its expression and method of recovering it in enzymatically active form |
ES2019874B3 (es) * | 1986-10-08 | 1991-07-16 | Upjohn Co | Bioactividad mejorada de somatotropina de mamiferos mediante desamidacion selectiva. |
US5089406A (en) * | 1987-01-07 | 1992-02-18 | Allied-Signal Inc. | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences |
GB8701848D0 (en) * | 1987-01-28 | 1987-03-04 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US5240837A (en) * | 1987-02-19 | 1993-08-31 | The Upjohn Company | CDNAS encoding somatotropin, expression vectors and hosts |
JP2580303B2 (ja) * | 1987-02-19 | 1997-02-12 | ジ・アップジョン・カンパニー | 異種蛋白をコ−ド付けするcDNA類、発現ベクタ−類および宿主類 |
US5104796A (en) * | 1987-04-06 | 1992-04-14 | International Minerals & Chemical Corp. | High titer production of human somatomedin c |
US5047504A (en) * | 1987-04-28 | 1991-09-10 | Amgen, Inc. | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
US4966841A (en) * | 1987-05-22 | 1990-10-30 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Enhanced vector production and expression of recombinant DNA products |
US5030563A (en) * | 1987-07-07 | 1991-07-09 | Genetics Institute, Inc. | Bacterial hypersecretion using mutant repressor sequence |
US5079345A (en) * | 1988-08-19 | 1992-01-07 | Eli Lilly And Company | Proteins having growth hormone anabolic properties with reduced effect on carbohydrate metabolism |
ES2064412T3 (es) * | 1988-10-26 | 1995-02-01 | American Cyanamid Co | Procedimiento para reducir el contenido de aglomerado de materiales tipo hormona del crecimiento. |
US6780613B1 (en) | 1988-10-28 | 2004-08-24 | Genentech, Inc. | Growth hormone variants |
CA2001774C (en) * | 1988-10-28 | 2001-10-16 | James A. Wells | Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants |
EP0441889A1 (fr) * | 1988-11-07 | 1991-08-21 | Commission des Communautés Européennes | Hormone de croissance humaine modifiee |
US4975529A (en) * | 1989-08-18 | 1990-12-04 | Monsanto Company | Method of folding somatotropins |
US6583115B1 (en) | 1989-10-12 | 2003-06-24 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Methods for treating acromegaly and giantism with growth hormone antagonists |
US5958879A (en) * | 1989-10-12 | 1999-09-28 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Growth hormone receptor antagonists and methods of reducing growth hormone activity in a mammal |
IE912345A1 (en) * | 1990-08-03 | 1992-02-12 | Pharmacia Ab | Treatment of human lactation failure |
US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
US5844097A (en) * | 1990-11-30 | 1998-12-01 | Monoclonetics International, Inc. | Methods for the diagnosis of peripheral nerve damage |
CA2097426A1 (en) * | 1990-11-30 | 1992-05-31 | Bruce M. Cameron, Sr. | Method for the diagnosis of chronic lower back and cervical pain |
US5231178A (en) * | 1991-01-16 | 1993-07-27 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1 |
DE69231467T2 (de) * | 1991-05-10 | 2001-01-25 | Genentech Inc | Auswählen von agonisten und antagonisten von liganden |
US5395761A (en) * | 1991-11-27 | 1995-03-07 | Eli Lilly And Company | Plasmid pHKY334, an expression vector for EK-BGH and host cells transformed therewith |
ZA94169B (en) * | 1993-01-26 | 1994-09-07 | Lilly Co Eli | Non-denaturing potency assay for bovine somatotropin |
AU693478B2 (en) * | 1994-11-10 | 1998-07-02 | Metabolic Pharmaceuticals Limited | Treatment of obesity |
US20020142965A1 (en) * | 1994-11-15 | 2002-10-03 | Metabolic Pharmaceuticals, Ltd. | Treatment of obesity |
US6335319B1 (en) | 1994-11-15 | 2002-01-01 | Metabolic Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of obesity |
AU5881996A (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Methods of treatment using growth hormone antagonists |
KR970006498A (ko) * | 1995-07-31 | 1997-02-21 | 유충식 | 활성형 인성장호르몬의 정제 방법 |
DK1568772T3 (da) * | 1995-09-21 | 2010-10-18 | Genentech Inc | Varianter af humant væksthormon |
US5849293A (en) * | 1996-01-11 | 1998-12-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Use of human transferrin in controlling insulin levels |
CA2197408A1 (en) * | 1996-02-13 | 1997-08-14 | Kazuo Chihara | Mutant human growth hormones and their uses |
WO1999012969A1 (en) * | 1997-09-08 | 1999-03-18 | Metabolic Pharmaceuticals Ltd. | Treatment of obesity |
DE19951765A1 (de) * | 1999-10-27 | 2001-05-03 | Thomas Schweder | Wirts-Vektor-Systeme zur Überproduktion von thermolabilen Enzymen psychrophiler Organismen |
KR100400638B1 (ko) * | 2000-12-06 | 2003-10-08 | 주식회사 엘지생명과학 | 재조합 인간 성장호르몬 유사체의 분리방법 |
NZ527590A (en) | 2001-03-09 | 2005-12-23 | Genentech Inc | Process for production of polypeptides |
DE60332358D1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
EP1871795A4 (en) | 2005-04-08 | 2010-03-31 | Biogenerix Ag | COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE |
US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
EP2446898A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-05-02 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients |
Family Cites Families (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZA802992B (en) * | 1979-06-01 | 1981-10-28 | Univ California | Human pre-growth hormone |
US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
US4426323A (en) * | 1980-01-10 | 1984-01-17 | Ionics, Incorporated | Selected recovery of proteins from fermentation broths |
US4443539A (en) * | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
IL59690A (en) * | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
NO811119L (no) * | 1980-06-06 | 1981-12-07 | Biogen Nv | Forbedrede baerere, samt fremgangsmaate ved fremstilling av disse og for aa uttrykke klonede gener |
US4352443A (en) * | 1980-06-24 | 1982-10-05 | U.S. Cap & Closure, Inc. | Dispenser having a trigger-bulb pump |
JPS6045848B2 (ja) * | 1980-07-31 | 1985-10-12 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト成長ホルモンの製造方法 |
IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
DE3231658A1 (hu) | 1981-01-21 | 1983-11-17 | ||
EP0061250A3 (en) * | 1981-03-23 | 1983-09-28 | Biogen N.V. | Improved process for recovering products produced by host organisms |
NZ201918A (en) * | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
US4436815A (en) * | 1981-11-27 | 1984-03-13 | Eli Lilly And Company | Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cells |
US4665160A (en) * | 1982-03-22 | 1987-05-12 | Genentech, Inc. | Novel human growth hormone like protein HGH-V encoded in the human genome |
AU553017B2 (en) * | 1982-06-07 | 1986-06-26 | Chr. Hansen A/S | A process for the preparation of chymosin |
EP0103395A3 (en) * | 1982-08-17 | 1985-05-22 | Biogen N.V. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
CA1224168A (en) * | 1982-12-23 | 1987-07-14 | Dean H. Hamer | Human growth hormone produced by recombinant dna in mouse cells |
US4728609A (en) * | 1983-01-10 | 1988-03-01 | Hoffmann-La-Roche Inc. | Recombinant growth hormone releasing factor |
JPS59145876A (ja) * | 1983-02-09 | 1984-08-21 | 株式会社リコー | 開閉体用のヒンジ |
CA1254000A (en) * | 1983-03-07 | 1989-05-09 | Arthur M. Felix | Growth hormone releasing factor analogs |
JPH06102034B2 (ja) * | 1983-03-25 | 1994-12-14 | セルテク リミテツド | タンパク質の生産方法 |
US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
AU587176B2 (en) * | 1984-02-14 | 1989-08-10 | Mycogen Plant Science, Inc. | Transfer vector |
US4767709A (en) * | 1984-06-28 | 1988-08-30 | The Johns Hopkins University | Growth-related hormones |
DE3426532A1 (de) * | 1984-07-18 | 1986-01-30 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Verwendung einer dna-sequenz zur expression sowie dna-struktur und expressionsvektor mit der dna-sequenz |
CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
US4612367A (en) * | 1985-04-08 | 1986-09-16 | Eli Lilly And Company | Process for purifying growth hormone-like materials |
US4677196A (en) * | 1985-09-06 | 1987-06-30 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
US4656255A (en) * | 1985-09-09 | 1987-04-07 | International Minerals & Chemical Corp. | Protein recovery |
-
1984
- 1984-07-02 BG BG80683/87A patent/BG49718A3/xx unknown
- 1984-07-03 AT AT84107717T patent/ATE66959T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-03 AT AT88121246T patent/ATE136934T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-03 EP EP95114069A patent/EP0691406A1/en not_active Withdrawn
- 1984-07-03 EP EP84107717A patent/EP0131843B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-03 DE DE3486425T patent/DE3486425T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-03 DE DE8484107717T patent/DE3485003D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-03 EP EP88121246A patent/EP0319049B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-05 SK SK5246-84A patent/SK524684A3/sk unknown
- 1984-07-05 CZ CS845246A patent/CZ282867B6/cs unknown
- 1984-07-06 AU AU30345/84A patent/AU577298B2/en not_active Expired
- 1984-07-11 ZA ZA845345A patent/ZA845345B/xx unknown
- 1984-07-12 IL IL72396A patent/IL72396A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-07-12 BG BG66214A patent/BG49721A3/xx unknown
- 1984-07-12 IL IL91826A patent/IL91826A/xx unknown
- 1984-07-12 IL IL91828A patent/IL91828A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 NZ NZ227962A patent/NZ227962A/xx unknown
- 1984-07-13 DK DK347184A patent/DK347184A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-07-13 RO RO115224A patent/RO91332B/ro unknown
- 1984-07-13 JP JP59145876A patent/JPH0687780B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-13 IE IE181884A patent/IE64174B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 BR BR8403523A patent/BR8403523A/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 FI FI842842A patent/FI90564C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 NZ NZ208897A patent/NZ208897A/xx unknown
- 1984-07-13 ES ES534321A patent/ES8602947A1/es not_active Expired
- 1984-07-13 CA CA000458833A patent/CA1254527A/en not_active Expired
- 1984-07-13 HU HU842749A patent/HU209878B/hu unknown
- 1984-07-16 DD DD84283853A patent/DD240217A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-16 DD DD84265320A patent/DD229427A5/de not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-01-14 US US06/691,230 patent/US4871835A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-07-03 US US06/752,441 patent/US4831120A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-08 ES ES544976A patent/ES8604252A1/es not_active Expired
-
1988
- 1988-07-22 AU AU19777/88A patent/AU615663B2/en not_active Expired
-
1989
- 1989-03-07 US US07/320,320 patent/US4997916A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-28 IL IL91828A patent/IL91828A0/xx unknown
- 1989-09-28 IL IL91826A patent/IL91826A0/xx unknown
-
1992
- 1992-04-17 IL IL101629A patent/IL101629A0/xx unknown
- 1992-07-29 IE IE922469A patent/IE922469A1/en not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-12-01 JP JP5301898A patent/JP2568376B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-21 IL IL10810893A patent/IL108108A0/xx unknown
-
1994
- 1994-12-29 IL IL11217894A patent/IL112178A0/xx unknown
-
1995
- 1995-08-10 HK HK128095A patent/HK128095A/xx not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-07-10 JP JP18085896A patent/JP3146161B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU209878B (en) | Method for producing polipeptids in a new escherichia coli expression | |
KR940000756B1 (ko) | 인슈린 유사체의 제조방법 | |
US5330971A (en) | Growth hormone fusion proteins, methods of production, and methods of treatment | |
JP2857684B2 (ja) | ヒトリラキシンの単離のための方法および組成物 | |
EP0871474B1 (en) | Generation of human insulin | |
SK704783A3 (en) | Dna sequences, recombinant molecules of dna and a method of producing polypeptides similar to sow growth hormone | |
JPH08289792A (ja) | ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼcDNA、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの回収方法 | |
HU215160B (hu) | Eljárás humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz előállítására és tisztítására | |
US5256546A (en) | Bacterial expression of porcine growth hormone | |
US5637495A (en) | Plasmids for production of human growth hormone or polypeptide analog thereof, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby, and related methods | |
US5527691A (en) | Expression vectors containing lambdapl promoter and T1 T2 rRNA termination sequence, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods | |
US5198361A (en) | Plasmids for production of met-asp-gln bovine growth hormone, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby and related methods | |
US5112744A (en) | Plasmids for the production of human Cu-Zn superoxide dismutase, bacterial hosts containing the plasmids and methods for production and recovery of such superoxide dismutase | |
KR100247668B1 (ko) | 안정적이고 생물학적으로 활성인 변형된 소마토트로핀 | |
EP0511003B1 (en) | Superactive GRF analogs | |
US5151364A (en) | Expression vectors containing lambdapl promoter, T1 T2 RRNA termination sequence, and origin of replication derived from a constitutive high copy number plasmid, and hosts containing the plasmids | |
US5081020A (en) | Expression vectors containing λPL promoter, T1 T2 rRNA termination sequence and origin of replication derived from a constitutive high copy number plasmid hosts and related methods | |
JPS62181799A (ja) | 発酵工学により製造したカルジオジラチンを含む医薬およびその製造方法 | |
JPH04501064A (ja) | 成長ホルモン融合蛋白質 |