JPH04503154A

JPH04503154A - 変型ヒト成長ホルモン

Info

Publication number: JPH04503154A
Application number: JP2500041A
Authority: JP
Inventors: マーシャル，ヨセフ; ルコート，コリーン
Original assignee: ルニベルシー・ド・ルタ・ア・リージュ
Priority date: 1988-11-07
Filing date: 1989-11-07
Publication date: 1992-06-11
Also published as: EP0441889A1; WO1990005185A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１４ニーそのコンピテント宿主細胞のポリメラーゼにより認識されるプロモータ、翻訳開始及び終止要素を特に含む調節要素の制御下にそれ自体置かれている前記変型タンパク質に対してコード化するヌクレオチド配列を含む核酸で予め形質転換されているコンピテント宿主細胞の培養段階、及び −二の宿主細胞の表現生成物から生成された変型タンパク質の回収段階、を含む、請求項１乃至１０のいずれか１項記載の変型ヒト成長ホルモンの生産方法。

１５、請求項１乃至１０のいずれか１項記載の変型ヒト成長ホルモンを有効成分として含む医薬組成物。

１６、脳下垂体不全又は成長ホルモン欠乏症の治療、成長遅延又は成長不足の治療、肥満症の治療、事故後又は術後の廠痕の処置、老化現象の治療を、特に悪液質患者、老人又は新生児に対し、糖尿病誘発効果及び／又はインシュリン効果を呈することなくほどこすことを目的とする薬の調製に対する、請求項１乃至１０のいずれか１項記載の成長ホルモンの利用。

１７、脳下垂体不全又は成長ホルモン欠乏症の治療、成長遅延又は成長不足の治療、肥満症の治療、事故後又は術後の廠痕の処置、老化現象の治療を、特に悪液質患者、老人又は新生児に対し、糖尿病誘発効果及び／又はインシュリン効果を呈することな（はどこすことを目的とする薬の調製に対する、天然ヒト成長ホルモンの最初の１３個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む成長ホルモンの利用。

明　細　書パ　ヒト　ホルモン本発明は、アミノ末端にもはや最初の２つのアミノ酸をもたず、骨及び体細胞の成長の刺激というその生物学的主要活性は保持しているが、ｈＧＨの投与の際に一般に見られる過渡的インシュリン効果及び糖尿病誘発性効果をもはや示さないような、ヒト成長ホルモン（以下ｈＧＨという略語で記す）から誘導されたタンパク質に関する。

背景技術として、成長ホルモンが脳下垂体前葉の成長ホルモン産生細胞により合成１分泌されるタンパク質であるということを喚起しておく。人間の成長においてこのホルモンが果たす重要な役割については充分に知られており、治療学においてこのホルモンは、成る種の形態の小人症の原因である脳下垂体不全を補うことができる。ヒト成長ホルモンは、一方では残基５３と１６５の間、他方では１８２と１８９の間（図１）に２つのジスルフィド架橋を有する分子量２２０００ダルト・ンの、１９１個のアミノ酸のポリペプチド分子である。

ヒト成長ホルモンの特徴は、その生物学的活性の多さにある。その主要特性は、軟骨形成、タンパク質合成及び細胞増殖の増加による骨及び体細胞の成長の刺激にある。これらの体細胞原性効果は、基本的に肝臓レベルでｈＧＨの影響下で分泌される成長因子（ソマトメジン又はＩＧＦ因子「インシニリン様成長因子」）によって媒介される。その上、成長ホルモンは、以下のように要約できる一連の代謝効果を及ぼす：ｒ　１尿五笠１Ｊ効果。これは、炭水化物の代謝に作用する抗インシュリン効果であり、インシュリンに対する感受性の減少に結びついたグルコース度同化の減少に相応する。この効果は、ｈＧＨの過度の分泌（先端巨大症）の場合又はこのｈＧＨがグルコースの過負荷の直前に或いは慢性的に糖尿病患者に投与された場合に見られる（　Ｌｅｖｉｎｅ及びＬｕｆｔ、　１９６４年）、ｈＧＨのこの抗インシュリン効果は同様に脂質の代謝レベルでも現われ、脂肪分解の刺激（脂肪分解効果）をもたらすことになる；実際、成長ホルモンは、（脂肪酸の形での）肝臓への脂質の授動に有利に作用し、アミノ酸及び糖の酸化との関係においてその酸化を刺激する（Ｆａｉｎ他、１９６５年；　Ｇｏｏｄ−ｍａｎ　、　１９６８年）。

−脳下垂体不全又は成長ホルモン欠乏症の患者において、ヒトｈＧＨの投与は、一時的低血糖症をひき起こすインシュリンタイプの過渡的効果を及ぼす（Ｍｅｒｉｍｅｅ、　１９７２年；　Ｇｏｏｄｍａｎ　、　１９８１年）。インシュリンと同様に、ｈＧＨはこの場合筋肉内（Ｐａｒｋ他、１９５２年）及び脂肪細胞内（Ｇｏｏｄｍａｎ、　１９６７年）へのグルコースの進入及びそこでの利用を増大させることができると同様に、重大な抗脂肪分解効果を示す（Ｂｉｒｎｂａｕｍ及びＧｏｏｄｍａｎ、　１９７６年）、これらの効果全体はそれでも数時間しか持続せず、その後組織は、成長ホルモンのこのインシュリン効果に対して反応しな（なり、逆に前述のその抗インシュリン効果に対して敏感になる。

糖尿病誘発性効果及びインシュリン効果は異なる形で発現するものの、これらが生物学的及び分子的に共通点を有すると想定することが可能である。図２には、ｈＧＨの作用様式ならびに、下垂体前葉からのその分泌の包括的調節システムがまとめられている。

現在のところ、さまざまな形態の脳下垂体欠乏症の治療のために、微生物内でクローニングされ表現された遺伝子から生成された２つのタイプの組換え型成長ホルモンが、治療学にて利用されている。すなわち、脳下垂体抽出物から分離された天然ホルモンと同じである真正組換え型ホルモンｈＧＨ５ならびにそのアミノ末端に付加的メチオニンを１つ有する組換え型ホルモンｍｅｔ−ｈ　Ｇ　Ｈである。これら２つの組換え型タンパク質は、天然ホルモンと全（同じ特性を有し、このことはすなわち、脂質分解及び糖尿病誘発活性及び過渡的インシュリン効果がヒト成長ホルモンの固有の特性であることを示している。糖尿病誘発活性が備わっていない成長ホルモンの開発は、炭水化物耐性に対するｈＧＨの代謝効果を避けな（てはならないような成る種の臨床例の治療（悪液質患者、新生児、高齢者）にとって治療学的に極めて重要な利点を有することになろう。

本発明では、特に遺伝子によるｈＧＨの一次構造の変更が、天然ホルモンや組換え型ホルモンに比べ改善された特性及びさまざまな生物学的活性を示す変型ｈＧＨを結果としてもたらすということが立証されている。

本発明の目的は、体成長刺激活性を示す変型ヒト成長ホルモンにおいて、一天然ヒト成長ホルモンの最初のｎ個のＮ末端アミノ酸の欠失を含んでいること（なおここでｎは２以上で、天然ヒト成長ホルモンとの関係における体成長刺激活性の変更をひきおこす値を超えない）；−及び、ｎが１３でないことを条件として、炭水化物の代謝レベルで作用するインシュリン活性又は糖尿病誘発活性又は両方の活性が備わっていないこと、を特徴とする変型ヒト成長ホルモン、にある。

本発明の好ましい一実施態様によると、成長ホルモンは、欠失したアミノ酸の数ｎが、天然ヒト成長ホルモンとの関係における天然三次元構造の変更をひきおこす値を超えないことを特徴とする。

本発明の目的は、ｎが１３ではない２から２４までの任意の値をとるものとしてヒト成長ホルモンの最初のｎ個のＮ末端アミノ酸の欠失を含んでいることを特徴とする変型ヒト成長ホルモンにある。

本発明の好ましい一実施態様に従うと、ヒト成長ホルモンは、ｎが２から１５までの任意の値例えば１５をとることを特徴とする。

本発明のもう１つの好ましい実施態様に従うと、ヒト成長ホルモンは、ｎが２から１４までの任意の値例えば１４をとることを特徴とする。

本発明のもう１つの好ましい実施態様に従うと、ヒト成長ホルモンは、ｎが２から１２までの任意の値例えば１２をとることを特徴とする。

本発明のもう１つの好ましい実施態様に従うと、ヒト成長ホルモンは、ｎが２から９までの任意の値例えば９をとることを特徴とする。

本発明のもう１つの好ましい実施態様に従うと、ヒト成長ホルモンは、ｎが２から７までの任意の値例えば７をとることを特徴とする。

本発明のもう１つの好ましい実施態様に従うと、ヒト成長ホルモンは、ｎが２から５までの任意の値例えば５をとることを特徴とする。

本発明のもう１つの好ましい実施態様に従うと、ヒト成長ホルモンは、ｎが２に等しいことを特徴とする。

本発明の好ましい実施態様においては、天然ｈＧＨ遺伝子の２つのアミノ酸の除去は、ｈＧＨ遺伝子の最初の２つのコドンを削ることにより遺伝子工学によって行なわれた。その結果、その成長刺激活性を全て保持しながらしかも炭水化物代謝に対する二次的効果を備えていない変型ｈＧＨタンパク質が得られる。

本発明は同様に、上述の本発明に基づく変型成長ホルモンに対してコード化する組換え型ＤＮＡにも関する。

本発明は同様に、本発明に従って変型ｈＧＨタンパク質の生産方法にも関する。

この方法は特に、そのコンピテント宿主細胞のポリメラーゼにより認識されるプロモータ、翻訳開始及び終止要素を特に含む調節要素の制御下にそれ自体置かれている変型ｈＧＨタンパク質に対してコード化するヌクレオチド配列を含む核酸で予め形質転換されているコンピテント宿主細胞の培養段階、及びこの宿主細胞の表現生成物から生成された変型タンパク質の回収段階を含んでいる。

同様に、変型ｈＧＨ遺伝子の配列の転写を制御するプロモータ、翻訳開始及び終止要素を含む調節要素を含んで成る１つのヌクレオチド配列が前にあるような上述の核酸も、本発明に属している。

本発明は同様に、複製にとって可欠的なその部位の１つで変更されたｈＧＨに対してコード化する核酸によって変更されたファージ、プラスミド、コスミドといったこの種の組換え型ベクターにも関する。

さらに限定的に言うと、本発明は、前記組換え型ベクターによって形質転換されたコンピテント宿主細胞の中での組換え型ＤＮＡの表現を可能にする適当な調節要素及びプロモータの制御下にある、上述の組換え型ＤＮＡのうちの１つから成る挿入体により変更されたベクターに関する。

本発明の特定の一実施態様によると、上述の組換え型ベクターは、その複製にとって可欠なその部位の１つに、本発明の変型ｈＧＨについてコード化する核酸の宿主細胞内での表現を促進するのに必要な要素、この宿主細胞と相容性あるプロモータ特に誘導性プロモータを含む表現ベクターである。

本発明はさらに、前記微生物内で複製でき、宿主内での本発明の変型タンパク質に対してコード化する核酸配列の表現を可能にする調節要素を含むベクターである上述のとおりの組換え型ベクターによって形質転換された宿主細胞にも関する。

好ましい第１の宿主細胞は、以下の実施例において記述するような組換え型ベクターにより形質転換されたＥ、　ｃｏｌｉ（大腸菌）により構成されている。

本発明はさらに限定的に言って、上述の条件下で形質転換され、本発明に基づき変更されたｈＧＨを合成することのできる細胞培養にも関する。

本発明は、有効成分として本発明の変型ヒト成長ホルモンを含む薬剤化合物に関する。

本発明の医薬組成物は、次の治療に適しているニー　脳下垂体不全又は成長ホルモン欠乏症の治療、−成長遅延又は成長不足の治療 −肥満症の治療 −事故後又は術後の痔痕の処置、 −老化現象の治療、本発明は、同様に、脳下垂体不全又は成長ホルモン欠乏症の治療、成長遅延又は成長不足の治療、肥満症の治療、事故後又は術後の廠痕の処置、老化現象の治療を、特に悪液質患者、老人又は新生児に対し、糖尿病誘発効果及び／又はインシュリン効果を呈することなくほどこすことを目的とする薬の調製に対する、本発明の成長ホルモンの利用にも関する。

本発明は同様に、脳下垂体不全又は成長ホルモン欠乏症に治療、成長遅延又は成長不足の治療、肥満症の治療、事故後又は術後の層痕の処置、老化現象の治療を、特に悪液質患者、老人又は新生児に対し、糖尿病誘発効果及び／又はインシュリン効果を呈することなくほどこすことを目的とする薬の調製に対する、天然ヒト成長ホルモンの最初の１３個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む成長ホルモンの利用にも関する。

本発明は同様に、組織を再生するのに適した量での本発明の成長ホルモンの投与及び廠痕が減弱又は消滅して患者の外観が改良されるまでの投与用量の更新を含む、廠痕を有する人間の身体の様相を改善するための方法にも関する。

本発明はさらに、本発明に基づ（成長ホルモンの化粧品としての利用にも関する。

本発明は同様に、本発明の成長ホルモンを含む化粧品化合物にも関する。

本発明の生成物の化粧品への利用は、癲痕の減弱又は消滅においてであれ又はしわといったような老化作用の防止においてであれ、本発明に基づく変型成長ホルモンの組織再生特性の結果として得られることである。

■ 刑ｈＧＨンバク　に・してコード　るｈＧＨ゛　のクローニング　びｈＧＨの伝令ＲＮＡが豊富に含まれている先端巨大症患者の脳下垂体腸瘍からヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に対しコード化する遺伝子をクローニングする。個々の腫瘍の全ＲＮＡを抽出した後、オリゴ−［ｄＴ］−セルロース上でのアフィニテイ・クロマトグラフィにより伝令ＲＮＡを純化した。無細胞性の翻訳試験により識別された、ｈＧＨに対してコード化する伝令ＲＮＡを最も豊富に含む試料を次に、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＭａｃ　Ｄｏｎｎａｌｄの方法（１９７９年）に従って相補性ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）の合成のために使用した。セファロース４Ｂ上で分割された２重連鎖ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ部位を含む合成オリゴヌクレオチドを用いることによってラムダ６４１ベクターのＥｃｏＲＩ部位の中に挿入した。

組換え型ＤＮＡのｂ　（Ｌ’　ｖｉ”’）カプシド化の後、ｃＤＮＡのライブラリを、ｈＧＨ遺伝子を含むプラスミドｐｃｈ　Ｇ　Ｈ８００から得たプローブを用いてスクリーニングした（　Ｍａｒｔｉａｌ他、１９７９年）。

陽性クローンのｃＤＮＡを次にプラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２の中でクローニングし、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。無傷の天然成長ホルモンに対してコード化する、図３に配列を示したプラスミドｐ　Ｄ　Ｍ　１００ｈＧＨのｃＤＮＡを、変型ｈＧＨ遺伝子の構造内において用いた。

変型ｈＧＨ遺伝子を表現するために用いた表現システムは、２つのシストロンの原核生物システムである。ここで第１のシストロンは、Ｃｕ／Ｚｎヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈｓＯＤ）についてコード化するｃＤＮＡで構成され、第２のシストロンはｃＤＮＡ−ｈＧＨから成る。これら２つの遺伝子は唯一のプロモータこの場合はｔａｃプロモータに依存した状態にある。

図４ａは、使用されたベクターｐｓＯＤを表わしている。このプラスミドはＣｕ／Ｚｎヒトスーパーオキシドジスムターゼ又はｈｓＯＤに対してコード化するｃＤＮＡが中でクローニングされたベクターｐ　ｔａｃ５から誘導されたものである（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ他、１９８５年）。このプラスミドは、ｔａｃプロモータに依存した状態でのこのタンパク質ｈｓＯＤの表現を可能にする（ｄｅ　Ｂｏｅｒ他、１９８３年）、ｃＤＮＡ−ｈｓＯＤのもとの配列はその端部３′において、ベクターｐｓＯＤにおけるｃＤＮＡ　ｈＧＨのクローニングのために用いられることになる制限部位Ｎ　ｃｏ　Ｉ及び５ａｌＩを含み図４ｂに配列が示されているポリリンカーの挿入によって、変更された。

プラスミドｐＤＭ１００−ｈＧＨから分離させたｃＤＮＡ　ｈＧＨのフラグメントＸｂａＩ−ＳａｌＩから変型ｈＧＨ遺伝子を構築した。ｃＤＮＡのこのフラグメントは、長さがｓｇｏｂｐであり、その５′末端はｈＧＨのアミノ酸７のコドンの第２のヌクレオチドに相応する。これは図５の部分すに示されている。変型ｈＧＨ遺伝子は、５′の側でこのフラグメントに対して図５の部分ａに表わされている合成オリゴヌクレオチドを付加することによって構築された。なおこの合成オリゴヌクレオチドの配列には、ＮｃｏＩ末端と相容性のある５′末端；　Ｓｈｉｎｅ−ＤａｌｇａｒｎｏのＡＧＧＡ配列；第１のシストロンの終を決定する翻訳終止コドンＴＡＡ　、第２の伝令ＲＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧ　。

ｈＧＨのアミノ酸３．４．５及び６に対するコドン；末端ＸｂａＩと相容性ある末端３′が含まれている。

従って、結果として得られた変型ｈＧＨ遺伝子は、天然ｈＧＨ遺伝子の最初の２つのコドンの欠失、及び５′末端の付加的なメチオニン開始コドンを呈する。

図５に示されている合成りＮＡとフラグメントｃＤＮＡ−ｈＧＨの結紮の後、最初の２つのアミノ酸が欠失しＮＨ，末端に付加的なメチオニン１個を有するｈＧＨタンパク質についてコード化する配列を含む長さ６１０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントをＮｃｏＩ−ＳａｌＩ末端に得た。ｃＤＮＡのこのフラグメントを、Ｔ４ −ＤＮＡリガーゼを用いてベクターｐｓＯＤの部位Ｎ　ｃｏ　Ｉと５ａｌＩの間に挿入した（図６）。Ｌ匹旦Ｄ　１２１０の形質転換後に得られた組換え型クローンを、カットトランスファによりｓａｐで標識付けされたｃＤＮＡ−ｈＧＨから誘導された放射性の特異的プローブを用いた雑種形成によって検出した。

ｔａｃプロモータの誘導の後ＳＤＳが存在する中で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、形質転換された細菌内で表現された全タンパク質を分析した。

プラスミドｐＳＯＤ−ｈＧＨを含む細菌の抽出物中には、誘導されていない試料と比較して、２つの補足的タンパク質の出現が観察できる。すなわち、ｈＳＯＤと、変型ｈＧＨに対して予想されたものと同じサイズをもつ第２のタンパク質である。

変型ｈＧＨの表現ベクターの構築における第２に段階は、変型ｈＧＨの表現レベルに影響を及ぼさないよう、末端５′及び３′を無傷のままに保ちながら、ｈＳＯＤ遺伝子の内部領域を欠失させることから成る。そのため、ｃＤＮＡ−ｈｓＯＤの配列内に、リーディングフレームを変更することなくこのｃＤＮＡの一部分を欠失できるようにする頻繁でない又は独自の制限部位２つをめた。すなわち、ｃＤＮＡ−ｈＳＯＤのコドン４１のレベルの部位５ｔｕＩ及びｃＤＮＡ−ｈのコドン１５３のレベルの部位Ｎ　ｃｏ　Ｉである。酵素ＮｃｏＩでのプラスミドｐｓＯＤ−ｈＧＨの消化及びそれに続＜ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントでの処理の後、プラスミドをＤＮＡリガーゼの作用によって円形にし、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｄ　１２１０内で形質転換させた（図７）、形質転換させた細菌のクローンの中に存在するプラスミドを分析したところ、無作為にとり上げた１２のクローンのうち、１０がｐＳＣＨＤと呼ばれる欠失プラスミドを含んでいた。

これらのクローン内で表現された全タンパク質の電気泳動によりプラスミドｐＳＧＨＤを含むクローン内で表現されたタンパク質を分析した。この電気泳動試験は、プラスミドｐＳＧＨＤを有する細菌が、以前に誘導された２つのタンパク質のうちの１つだけ、すなわち変型ヒト成長ホルモンに対して予想されたサイズに一致するサイズを有するもの（図８８）しか生成しないことを、はっきりと示している。このホルモンの表現率は、全細菌タンパク質の８％であると評価された。この高い表現効率により、表現されたタンパク質を純化するため単純化された手順を用いることが可能になるだろう。

プラスミドｐＳＧＨＤにより表現された変更ｈＧＨタンパク質の部分的純化は、一方では封入体の分離と可溶化及び他方ではＨＰＬＣクロマトグラフィによるその純化という２段階で行なわれた。実際、Ｉ　ＰＴＧでの誘導の後に生成された変型ｈＧＨタンパク質は可溶性をもたず、封入体の中に沈殿物の形で存在しているということが観察された。これらの封入体は基本的に、ｐＨ７，０のリン酸塩緩衝液５０ｍ　Ｍ内に溶解させられた尿素溶液８Ｍの中で大気温に保温することによって可溶化された成長ホルモンから成る（図８ｂ）０次にこの溶液を、大量のＮ　Ｈ−ＨＣＯｓ　５０　ｍ　Ｍに対して透析し、次に凍結乾燥させる。第２の純化段階は、陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ上のＨＰＬＣクロマトグラフィである。このクロマトグラフィは、抽出物起源のｈＧＨに対して設定された条件に従って行なわれた。

図９に示されている結果を見るとわかるように、この手順により、充分に純化された変型ｈＧＨタンパク質の分画を得ることができる。

パ斧ｈＧＨの　づ番最初の２個のアミノ酸の欠失が変型ｈＧＨタンパク質の三次元構造及び体細胞原性成長刺激という主要な生物学的活性に対して影響を及ぼさなかったことを実証するため、（１）脳下垂体ｈＧＨ２２にの特異的なボリクローナル又はモノクローナル抗体の存在する中での放射性免疫測定、（２）妊娠した雌ウサギの肝臓から分離した肝受容体の調製剤に対する結合実験、及び（３）！　（ｉｎ　ＶｉＶＯ）体細胞原性活性試験を行なった。

＝’１ＲＩＡ。

使用された抗体の性質が異なる３回のＲＩ　Ａ、、測定を行なった：すなわち使用された抗体は、天然ホルモンに対し導かれたウサギの血清、そのＮＨ，末端に対し導かれたモノクローナル抗体、そしてホルモンの内部領域に対して導かれた第２にモノクローナル抗体である。測定は、変型ｈＧＨタンパク質と（”’Ｉ− ｈＧＨ）で標識づけされた脳下垂体成長ホルモンの間の競合に基づいて実施された。

抗体トレーサー（Ｅ　Ｄ　５０）の固定を５０％だけ変位させるために必要な変型ｈＧＨホルモンの用量を、同じ変位を誘発する脳下垂体ホルモン用量と比較した。こうして各々の抗体について、脳下垂体ホルモンの競合能力の百分率の単位で表わした、トレーサー１２Ｊ−ｈＧＨに対する変型ｈＧＨタンパク質の競合能力を評価した。

これらのＲＩＡ測定は、純化された変型ｈＧＨが、脳下垂体ホルモンに対して導かれた抗血−清特にこのホルモンの一内部領域に対して導かれたモノクローナル抗体について脳下垂体トレーサの優れた競合者であることを示している。モノクローナル抗体の場合、変型ｈＧＨタンパク質は、標準的ｈＧＨのものの８０％に相当するトレーサに対する競合能力を実際有している。

これに対して、変型ｈＧＨは、ＮＨ，末端モノクローナル抗体についてのトレーサとは全（競合しない。この結果は、変型ｈＧＨタンパク質が天然ホルモンのアミノ酸１及び２を欠失したものであることから見て、驚くべきものである。

１！１生立二旦塗：成長ホルモンが基本的に、このホルモンがソマトメジンの合成を刺激しグルコース新酸や脂肪酸代謝といった代謝システムの調節に関与する肝臓のレベルにおいて作用する、ということは充分に立証されている。従って、肝臓は、成長ホルモンの特異的受容体がうである（　Ｐｏ５ｎｅｒ他、１９７４年）。従って、結合実験に用いられる肝受容体は、妊娠した雌ウサギの肝臓の小胞体及び原形質膜が濃厚に含まれる分画から調製される。一定の与えられたホルモンの放射レセプタ測定は、秤量すべき低温ホルモン濃度が増大してい（、標識づけされたホルモン（トレーサ）を一定量保温することから成る。受容体に結合されたトレーサの量は、平衡状態で測定され、低温ホルモンの濃度及び親和力が高くなればなるほど少な（なる。得られた結果を見ると、ｈＧＨは、肝受容体に対するトレーサー１２Ｊ−ｈＧＨの初期結合を５０％変位させることに関して（ＥＤ５０．）国際標準ｈＧＨの能力との関係において１２５％の相対的能力を有するということがわかる。

従って変型ｈＧＨは、標準脳下垂体ホルモンの変位能力を土建る変位能力を示している。

′　：通常肝臓の体細胞原性ホルモンの受容体に結びつく変型ｈＧＨタンパク質が体細胞原性刺激というその主要な生物学的活性を充分に保持していることを確認するため、１つの試験すなわち（１）脛骨試験（Ｇｒｅｅｎ−ｓｐａｎ他、１９７４年）を用いた。

この脛骨試験においては、下垂体切除した若いラットで変型ｈＧＨ及び国際ｈＧＨ標準により誘導された前端軟骨の肥厚を、量的に比較した。得られた結果は、２つのホルモンについてのホルモン用量の対数とスプライスの間の同じ直線的関係を実証している。

″パドゞ　：細胞試験ＮＢ２（タナ力Ｔ、、　５ｈｉｕ　Ｒ，Ｐ、Ｃ，、Ｇｏｕｔ　Ｐ。

Ｗ、Ｂｅｅｒ　Ｃ，Ｔ、Ｎｏｂｌｅ　Ｒ，Ｌ、、Ｆｒ１ｅｓｅｎ　Ｈ，Ｇ、１９８０年−「臨床的内分泌学及び代謝ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、５１巻、ｐ１０５８−１０６３）において、変型ｈＧＨ及びｈＧＨ国際櫃準の影響下で血清の無い状態でラットのＮＢ２細胞の成長刺激を測定した。結果は、変形ｈＧＨが、国際ｈＧＨ標準に全く匹敵する１２時間、２４時間及び３６時間後のＮＢ２細胞の増殖を誘発したことを明らかに実証していた。

結論として、これらの試験は、変型ｈＧＨタンパク質が標準脳下垂体ｈＧＨホルモンのものときわめて類似する３次元立体配座を有するだけでなく、つねにその体細胞原性成長刺激という主要な生物学的活性を１００％保持していることを実証している。

・・Ｆｆ′ｈＧＨのインシュリンゞヒト成長ホルモンの過渡的なインシュリン活性は、ｈＧＨが欠乏した組織からとったラットの脂肪細胞について行なわれた、脂質生成刺激試験により！生３で測定することができる。内因性成長ホルモンの存在は実際、ｈＧＨのインシュリン効果に対する脂肪組織の耐性を誘発する。組換え型変型ｈＧＨのインシュリン活性試験は、ｈＧＨの増大していく用量の付加に応じての脂質内のトリチウム標識グルコースの取り込みの測定をベースとしており、インシュリンによる脂質生成の刺激については記述された試験（Ｍｏｏｄｙ他、１９７５年）に基づいている。インシュリン活性は以下のようにして測定された。

ｉ級皿凰立且ｌ：頚椎の脱臼によりラットを安楽死させ、腎臓及び精巣上体の脂肪組織を採取した。小片に切断したこの組織を直ちに、透析済みＢ　Ｓ　Ａ　３５ｍｇ／ｍｌとグルコース０、２７ｍ　Ｍを含むｐＨ７，４のＫＲＨ緩衝液の中で、１匹あたりＫＲＨ緩衝液を３ａ＋１用いて、激しく撹拌しながら３７℃で３０分間コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で消化させた。

ガーゼでのろ過の後、細胞懸濁液を３０秒間６００ｇで遠心分離すると、緩衝液よりも低い密度の脂肪細胞が表面に浮かび上がって（る。下澄液を、長い針の備わった注射器で吸引し、新鮮な緩衝液内で細胞を再度懸濁状態に置く。細胞を５回、１％のＢＳＡを含むｐＨ７，４の３７℃のＫＲＨ緩衝液中で洗浄する。

１１工威、ｌＩＪ：インシュリン活性を測定するために用いられたプロトコールは、Ｍｏｏｄｙ他（１９７５年）のインシュリンによる脂質生成刺激試験に適合されたものである。

ラットの脂肪細胞をまず１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ濃度のＫＲＨ緩衝液の中で３７ ℃で４時間再度保温し、次に洗浄し、０．８　ＸＩＯ’細胞／細胞７濃ｌで再度懸濁状態にお（。この試験は、ポリエチレン製で用量１０ｍ１のフラスコ中で３回行なわれる。このときこのフラスコ内には、続々と、−４００μρの脂肪細胞懸濁液、−増大する用量のｈ　Ｇ　Ｈ（０，１−１１００００ｎ／ｍｌ）又はインシュリン（０，０５〜１１００ｎ／ｍｌ）を含むＫＲＨ緩衝液５０μｆｉ、− 総量０．５ｍｌ中に５００００ｄｐｉから１００．０００ｄｐｉを含む、トリチウム標識グルコース（Ｄ　＝　［３−”Ｈｌグルコース）５０μ２が付加される。脂肪細胞の最終的濃度は、正常なラットの脂肪細胞についての実験の場合１％（Ｖ／Ｖ）であり、低酸素血症のラットの脂肪細胞については２％（Ｖ／Ｖ）である。この濃度はインシュリンについて０．５％（Ｖ／Ｖ）に戻される。フラスコを、穏やかに撹拌しながら３７℃で２時間保温する。この保温は、閃輝（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔｅ）有機相を試験管１本あたり５ｎ＋１付加することにより（１リツトルのトルエン＋０．３グラムのジメチルＰＯＰＯＰ＋５グラムのＰＰ０）中断させ、フラスコを閉じ３０秒間激しく撹拌して細胞を破壊する。有機相中の脂質の抽出を可能にするため１時間放置する。有機相中で抽出された放射能は、ベータ計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｌ　Ｓ　１８８０）内にて測定する。計数効率は、トリチウム標識づけされた標準上で較正された内部標準化プログラムにより各試料について個々に測定され、結果はｄｐｍ単位で与えられる。基礎脂質生成は、試験管内にｈＧＨ又はインシュリンを付加することな（全試験を行なうことによって得られる。非特異的な放射能は、脂肪細胞無しで全試験を行なうことにより得られ、全ての結果から控除される。

図１０に示されている得られた結果は、天然脳下垂体成長ホルモン及び変型ｈＧＨについて得られるインシュリン効果を示している。脳下垂体成長ホルモンとは異なり、変型ｈＧＨは、ｌＯμｇ／ｍｌにまで及ぶ濃度においてさえ基礎脂質生成のいかなる増大も誘発しない。換言すると、変型ｈＧＨは、内因性ｈＧＨが欠乏したシステムの場合であるにもかかわらず、いかなる過渡的インシュリン効果も明らかにしていない。

インシュリンタイプのこの生物学的活性は、その他の組換え型ｈＧＨ特にＭｅｔ −ｈ　Ｇ　Ｈｒソマトノルム」（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ報告書、１９８５年；　Ｇｏｏｄｍａｎ　％１９８４年）及び天然ホルモンと同じ配列をもつ「ゲノトロビン」（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍの医学情報速報、１９８７年）についても立証されているため、インシュリン活性の不在は、最初の２つのアミノ酸の欠失の直接的結果であるという結論を出すことができる。

パ刑ｈＧＨの　＃　・変型ｈＧＨが糖尿病誘発活性を示さないか否かを確認するため、試験を行なった。使用した試験は、ＡＤＥＲ他、１９８７年に記されているように変型ｈＧＨホルモンで処置されたイタにおけるインシュリン耐性を測定することから成る。結果は、国際ｈＧＨ標準で見られたインシュリン耐性の効果とは異なり、変型ｈＧＨが、低用量（０，０２５ｍｇ／ｋｇ／日）での１５日の慢性的注入の間にインシュリンに対する感受性の低減を全く誘発しなかったことを実証した。このことはすなわち、変型ｈＧＨが糖尿病誘発活性を全（もたないことを証明している。

変型ｈＧＨの糖尿病誘発活性を、ラットの脂肪細胞についても試験した。変型ｈＧＨが存在する中又は不在の状態でのインシュリンによるグルコースの輸送の刺激を測定し、天然のものに比較した。変型ｈＧＨは、天然ｈＧＨと異なり、この試験においてインシュリンの作用を抑制せず、このことは再度、変型ｈＧＨが糖尿病誘発活性をもたないことを表している。

１１Ω呈！皇且朋一区ユ：ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のペプチド配列。

ＮＨｚ二アミノ末端Ｃ０ＯＨ：カルボキシ末端一匡ユ：ヒト成長ホルモンの生物学的活性及び調節の図式。

−皿且：プラスミドｐＤＭ１００−ｈＧＨ内でクローニングされたｃＤＮＡ　ｈＧＨの配列。成熟ｈＧＨのアミノ酸のコドンには番号がふられている。

−Ｌ４１！１：表現プラスミドｐｓｏＤの遺伝子構造及び物理的地図の図式である。

ＳＯＤ　：ヒトスーパーオシキドジスムターゼに対してコード化するＤＮＡ。

一区Ａ」江− ベクターｐｓＯＤ内で遺伝子ｈｓＯＤの３′末端に挿入されたポリリンカーの配列である。

−Ｌ：変型ｈＧＨ遺伝子の構成を示す図式である。

（ａ）ｈＧＨ遺伝子のアミノ末端配列を変更するために用いられる合成オリゴヌクレオチド配列。

（ｂ）ｃＤＮＡ　ｈＧＨのフラグメントＸｂａＩ−Ｓａｉｌの末端の配列。

（ｃ）変型ｈＧＨ遺伝子を含むフラグメントＮｃｏＩ　−３ａｌ　Ｉの末端の配列。

ｃＤＮＡ−ｈｓＯＤ　：ヒトスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子に属する配列。

Ｓ　Ｄ　：　Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅ１ｇａｒｎｏ配列。

−匡旦：変型ｈＧＨ遺伝子を含む表現プラスミドｐｓｏＤ−ｈＧＨの構成を示す図式である。

ｈＧＨＭ：変型ｈＧＨタンパク質に対してコード化するＤＮＡ。

ｃＤＮＡ−ｈｓＯＰ　：ヒトスーパーオキシドシスムターゼに対してコード化するＤＮＡ。

−区ｌ：欠失したｈｓＯＤ遺伝子を含む表現プラスミドの構成を示す図式である。

ｃＤＮＡ−ｈｓＯＤ　：ヒトスーパーオキシドジスムターゼに対してコード化するＤＮＡ。

−区玉二蛙：Ｅ、　ｃｏｎ菌株Ｄ１２１０（ｐＳＧＨＤ）内（７）ｈＧＨＭ遺伝子の表現のｒＰＴＧでの誘発の後［＋］又は誘発無し［−］の全タンパク質の１５％のＰＡＧＥ−ＳＤＳによる分析。矢印は、ｈＧＨＭタンパク質を示す。

−皿上ユ凱：Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０　（ｐＳＧＨＤ）のＩＰＴＧでの誘発の後得られた封入体内に含まれているタンパク質のＰＡＧＥ−ＳＤＳによる分析。矢印は、ｈＧＨＭタンパク質を示す。

１、細菌性タンパク質の全抽出物。

２、純化された封入体のタンパク質の抽ａ物。

−１旦：ＨＰＬＣクロマトグラフィにより純化された封入体から可溶化されたｈＧＨＭタンパク質の純化。

（ａ）　０．０２から０．４ＭのＮＨ，ＨＣＯｓの直線勾配を伴う、得られた溶離曲線。

（ｂ）クロマトグラフィにより溶離されたピーク各々の１５％のＰＡＧＥ−５ＤＳ、矢印はｈＧＨＭタンパク質な示す。

一１旦：国際ｈＧＨ標準及び変型ｈＧＨのインシュリン活性の比較。成長ホルモンを含まない媒質内で４時間予備保温されＤ　−［３−”Ｈｌグルコース及び増大する濃度の変型ｈＧＨ（★）又は脳下垂体ｈＧＨ（・）が存在する中で３７℃で２時間保温されたラットの脂肪細胞内でのｈＧＨによる脂質生成の刺激の測定。トリチウム標識グルコースの取込み（基礎脂質生成の百分率単位で表されたもの）は、付加されたホルモンの用量に応じて測定されている。

参考文献 −ＢｉｒｎｂａｕｒｎＲ，Ｓ及びＧｏｏｄｒｎａｎ　Ｈ，Ｍ共著（１９７６年）、「成長ホルモンの抗脂肪分解効果のメカニズムに関する研究Ｊ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　（内分泌学）　、　９９．１３３６−１３４５゜ −ｄｅ　Ｂｏｅｒ　Ｈ，Ａ、、　Ｃｏｍ５ｔｏｃｋ　Ｌ、Ｊ、及びＶａｓｓｅｒ　Ｍ、共著（１９８３年）。

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Claims

【特許請求の範囲】１．体成長刺激活性を示す変型ヒト成長ホルモンにおいて、 −天然ヒト成長ホルモンの最初のｎ個のＮ末端アミノ酸の欠失を含んでいること（なおここでｎは２以上で、天然ヒト成長ホルモンとの関係における体成長刺激活性の変更をひきおこす値を超えない）；−及びｎが１３でないことを条件として、炭水化物の代謝レベルで作用するインシュリン活性又は糖尿病誘発活性又は両方の活性が備わっていないこと、を特徴とする変型ヒト成長ホルモン。２．欠失したアミノ酸の数ｎは、天然ヒト成長ホルモンとの関係における天然三次元構造の変更をひきおこす値を超えないことを特徴とする、請求項１の変型ヒト成長ホルモン。３．ｎが１３ではない２から２４までの任意の値をとるものとしてヒト成長ホルモンの最初のｎ個のＮ末端アミノ酸の欠失を含んでいることを特徴とする変型成長ホルモン。４．ｎは２から１５までの任意の値をとることを特徴とする、請求項３の変型ヒト成長ホルモン。５．ｎは２から１４までの任意の値をとることを特徴とする、請求項３の変型ヒト成長ホルモン。６．ｎは２から１２までの任意の値をとることを特徴とする、請求項３の変型ヒト成長ホルモン。７．ｎは２から９までの任意の値をとることを特徴とする、請求項３の変型ヒト成長ホルモン。８．ｎは２から７までの任意の値をとることを特徴とする、請求項３の変型ヒト成長ホルモン。９．ｎは２から５までの任意の値をとることを特徴とする、請求項３の変型ヒト成長ホルモン。１０．ｎは２に等しいことを特徴とする、請求項３の変型ヒト成長ホルモン。１１．請求項１乃至３のいずれかの変型タンパク質に対しコード化する組換え型ＤＮＡ。１２．その組換え型ベクターによって形質転換されたコンピテント宿主細胞の中での組換え型ＤＮＡの表現を可能にする適当な調節要素及びプロモータの制御下にある、請求項１１の組換え型ＤＮＡから成る挿入体により変更されたベクター。１３．請求項１２の組換え型ベクターによって形質転換された細胞培養。１４：−そのコンピテント宿主細胞のポリメラーゼにより認識されるプロモータ、翻訳開始及び終止要素を特に含む調節要素の制御下にそれ自体置かれている前記変型タンパク質に対してコード化するヌクレオチド配列を含む核酸で予め形質転換されているコンピテント宿主細胞の培養段階、及び −この宿主細胞の表現生成物から生成された変型タンパク質の回収段階、を含む、請求項１乃至１０のいずれか１項記載の変型ヒト成長ホルモンの生産方法。１５．請求項１乃至１０のいずれか１項記載の変型ヒト成長ホルモンを有効成分として含む医薬組成物。１６．脳下垂体不全又は成長ホルモン欠乏症の治療、成長遅延又は成長不足の治療、肥満症の治療、事故後又は術後の瘢痕の処置、老化現象の治療を、特に悪液質患者、老人又は新生児に対し、糖尿病誘発効果及び／又はインシュリン効果を呈することなくほどこすことを目的とする薬の調製に対する、請求項１乃至１０のいずれか１項記載の成長ホルモンの利用。１７．脳下垂体不全又は成長ホルモン欠乏症の治療、成長遅延又は成長不足の治療、肥満症の治療、事故後又は術後の瘢痕の処置、老化現象の治療を、特に悪液質患者、老人又は新生児に対し、糖尿病誘発効果及び／又はインシュリン効果を呈することなくほどこすことを目的とする薬の調製に対する、天然ヒト成長ホルモンの最初の１３個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む成長ホルモンの利用。