JP2006500927A - コドン翻訳効率に基づく遺伝子発現系 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中における個々の同義語コドンについての翻訳効率の値の実験的決定に部分的に基礎を置いている。有意に、これらの値は、例えば、Seed(前出)によって開示されたような、高度に発現された哺乳動物タンパク質コード遺伝子のコレクションにわたって、コドンがそれらの対応するアミノ酸をコードするために使用された頻度の分析から誘導可能なコドン頻度の値とは隣接していない。結果として、本発明は、CHO細胞中での効率的な発現のためにコドン最適化される、タンパク質コードポリヌクレオチドの構築を最初に可能にする。
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、上記同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、CHO細胞中で第1のコドンとは異なる翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;および
上記合成ポリヌクレオチドを構築するために、上記第1のコドンを上記同義語コドンで置き換える工程、を包含し、
ここで、コドンの翻訳効率の比較が表1:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、上記同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、CHO細胞中で第1のコドンよりも高い翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;および
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、を包含し、
ここで、第1のコドンおよび同義語コドンは表5:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、上記同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、CHO細胞中で第1のコドンよりも低い翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;および
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、を包含し、
ここで、第1のコドンおよび同義語コドンは表6:
ポリペプチドの産生の速度を制限し、かつ第1のポリヌクレオチドのコドンに対応するイソ-tRNAをコードする第2のポリヌクレオチドをCHO細胞に導入する工程を包含し、ここでコドンが、
からなる群より選択され、そして第2のポリヌクレオチドが調節ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、上記同義語コドンは、表1または表4によって表されるように、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、上記CHO細胞中で第1のコドンとは異なる翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、
上記合成ポリヌクレオチドを上記CHO細胞に導入する工程;および
上記CHO細胞中で合成ポリヌクレオチドを発現し、それによって、上記ポリペプチドが上記CHO細胞中で上記親のポリヌクレオチドからとは異なるレベルで上記合成ポリヌクレオチドから産生される工程、を包含する。
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、上記同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、上記CHO細胞中で第1のコドンよりも高い翻訳効率を示すということに基づいて選択され、そして上記第1のコドンと上記同義語コドンの両方は、表2または表5から選択される、工程;
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、
上記合成ポリヌクレオチドを上記CHO細胞に導入する工程;および
上記CHO細胞中で合成ポリヌクレオチドを発現し、それによって、上記ポリペプチドが上記CHO細胞中で上記親のポリヌクレオチドからよりも高いレベルで上記合成ポリヌクレオチドから産生される工程、を包含する。
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、上記同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、上記CHO細胞中で第1のコドンよりも低い翻訳効率を示すということに基づいて選択され、そして上記第1のコドンと上記同義語コドンの両方は、表3または表6から選択される、工程;
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、
上記合成ポリヌクレオチドを上記CHO細胞に導入する工程;および
上記CHO細胞中で合成ポリヌクレオチドを発現し、それによって、上記ポリペプチドが上記CHO細胞中で上記親のポリヌクレオチドからよりも低いレベルで上記合成ポリヌクレオチドから産生される工程、を包含する。
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、上記同義語コドンは、表1または表4によって表されるように、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、上記CHO細胞中で第1のコドンよりも高い翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程;および
調節ポリヌクレオチドに作動可能に連結された上記合成ポリヌクレオチドを上記CHO細胞に導入する工程、を包含し、
それによって、上記合成ポリヌクレオチドが上記CHO細胞中でウイルス粒子の産生を可能にするのに十分なレベルで上記ポリペプチドを産生するために発現される。
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、上記同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、上記CHO細胞中で第1のコドンよりも高い翻訳効率を示すということに基づいて選択され、そして上記第1のコドンと上記同義語コドンの両方は、表2または表5から選択される、工程;
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程;および
調節ポリヌクレオチドに作動可能に連結された上記合成ポリヌクレオチドを上記CHO細胞に導入する工程、を包含し、
それによって、上記合成ポリヌクレオチドが上記CHO細胞中でウイルス粒子の産生を可能にするのに十分なレベルで上記ポリペプチドを産生するために発現される。
からなる群より選択されるコドンに対応し、上記方法は、
イソ-tRNAをコードし、かつ調節ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている第2のポリヌクレオチドをCHO細胞中に導入する工程を包含し、
それによって、上記第2のポリヌクレオチドが、上記ポリペプチドの産生の速度を増加させるのに十分なレベルでイソ-tRNAを産生するように発現され、その結果、上記CHO細胞中で上記ウイルス粒子の産生を可能にする。
1. 定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるのと同様かまたは等価な任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的のために、次の用語が以下に定義される。
HPV:ヒトパピローマウイルス
PV:パピローマウイルス
VLP:ウイルス様粒子
HGH:ヒト成長ホルモン
gfp:グリーン蛍光タンパク質遺伝子
GFP:グリーン蛍光タンパク質
本発明は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で個々の同義語コドンについて翻訳効率の値を最初に提供する。これらの値は、人工の開始コドンおよび5つの同一のコドンのタンデムリピートがインフレームに先行する、gfp遺伝子を各々含む一連の59のレポーター構築物でCHOをトランスフェクトすることによって決定された。このシリーズはWO 00/42215において詳細に記載され、アミノ酸をコードする同義語コドンの完全なセットを網羅する。次いで、一過性にトランスフェクトされたCHO細胞の蛍光強度がフローサイトメトリーによって決定され、各構築物から産生されたGFPの測定を提供した。CHO細胞によって産生されるGFPの量は、試験下で同一のコドンのタンデムリピートに対応するイソ-tRNA種の細胞内の豊富さに感受性であり、それゆえに、CHO細胞中での所定のコドンの翻訳効率の直接的補正を提供する。従って、CHO細胞中で所定の構築物から産生されるGFPの量が高いほど、その構築物中でタンデムに反復されているコドンの翻訳効率が高くなる。
(1)Seedによって好ましいコドンと見なされたいくつかのコドン(AlaGCC、ArgCGC、AspGAC、GlyGGC、およびThrACC)は、実際は他の同義語コドンよりもはるかに低い翻訳効率を有する;
(2)Seedによって好ましくないコドンと見なされたいくつかのコドン(AlaGCA、AspGAT、GluGAA、GlyGGA、およびLeuTTG)は、実際は他の同義語コドンよりもはるかに高い翻訳効率を有する;
(3)Seedによって好ましいコドンと見なされたいくつかのコドン
またはSeedによって好ましくないコドンと見なされたいくつかのコドン
は、実際は中程度の翻訳効率を有する;ならびに
(4)Seedによって好ましさが低いコドンと見なされたコドンLeuCTCは、実際は高い翻訳効率のコドンである。
1つのコドンの別のコドンへの置き換えは、当該分野において公知の標準的な方法を使用して達成され得る。例えば、親のポリヌクレオチドのコドン改変は、いくつかの公知の変異誘発技術(例えば、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いる変異誘発、および領域特異的変異誘発を含む)を使用してもたらされ得る。典型的なインビトロ変異誘発技術は、例えば、U.S. Patent Nos. 4,184,917, 4,321,365, および4,351,901またはAusubelら(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. 1997)およびSambrookら(MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, 1989)の関連する節において記載されている。インビトロ変異誘発の代わりに、合成ポリヌクレオチドが、例えば、U.S. Patent No 4,293,652に記載されるような容易に利用可能な機構を使用してデノボ合成され得る。しかし、本発明は、合成ポリヌクレオチドを構築するための任意の1つの特定の技術に依存せず、およびそれを指向していないことに注意するべきである。
本発明はまた、タンパク質が、タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドからよりも高いレベルで産生可能であるようにCHO細胞を改変する方法を特徴とする。この方法は、第1のポリヌクレオチドのコドンを選択する工程を包含し、その翻訳効率がタンパク質の産生を制限し、そしてその対応するイソアクセプティング転移RNA(イソ-tRNA)はCHO細胞中で比較的高い豊富さでは産生されない。次いで、第2のポリヌクレオチドがCHO細胞に導入され、これは、そのイソ-tRNAを、第1のポリヌクレオチドからのタンパク質の産生を増強するのに十分なレベルまで産生することが可能である。
からなる群より選択され得る。好ましい態様において、供給されるイソ-tRNAは、CHO細胞中で「低い」翻訳効率を有するコドンに特異的であり、これは、表4に示されており、および
からなる群より選択され得る。
本発明はまた、CHO細胞中でウイルス粒子を産生する方法を提供する。このウイルス粒子は、代表的には、ウイルスアセンブリーのために必要である少なくとも1種のタンパク質を含み、ここで、各タンパク質は、親のポリヌクレオチドから、そこに生産的なウイルスアセンブリーを可能にするために十分なレベルで細胞中に産生可能ではなく、これらは、本明細書中以後でアセンブリー制限タンパク質と呼ばれる。この方法は、同義語コドンを用いる置き換えのための親のポリヌクレオチドの第1のコドンを、前出の表1または2から選択する工程を包含し、ここで、この同義語コドンは、それがCHO細胞中で第1のコドンよりも高い翻訳効率を示すということに基づいて選択される。適切な選択は、第3節に従ってなされ得る。次いで、第1のコドンは、例えば、第4節に記載されるように、合成ポリヌクレオチドを構築するために同義語コドンで置き換えられる。このように産生された合成ポリヌクレオチドは、調節ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、次いで、CHO細胞に導入され、それによってアセンブリー制限タンパク質は、ウイルス粒子のアセンブリーのために必要な他のウイルスタンパク質の存在下で細胞中で産生され、その結果ウイルス粒子を産生する。
本発明のさらなる特徴は、このようなポリペプチドを使用して改善可能な状態の徴候を処置、予防、または緩和するための薬学的組成物中の活性物質としての、第4節および第5節に従って産生されるポリペプチドの使用である。適切には、この薬学的組成物は薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の投与の経路に依存して、当該分野において周知である種々の薬学的に受容可能なキャリアが使用され得る。このようなキャリアは、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝化溶液、乳化剤、等張食塩水、および発熱物質を含まない水を含む群から選択され得る。
実施例1
CHO細胞中での発現の増強のためのコドン改変Enbrel(登録商標)コードポリヌクレオチドの構築
Enbrel(登録商標)(etanerceptとしても知られる)は、ヒトIgG1分子のFcフラグメントによって連結される2つの可溶性TNFレセプターからなる組換え融合タンパク質であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示される。改変されていない遺伝子配列はSEQ ID NO:1に示され、いくつかのコドン(Leu10およびLeu14をコードするCTG;Glu15およびGlu35をコードするGAG;Gly37をコードするGGG;Gly60をコードするGGC;Lys56およびLys64をコードするAAA;His62をコードするCAT;Phe66をコードするTTC;およびThr68およびThr70をコードするACC)はこの配列中で同定され、これらは表1および2において示されるような低い翻訳効率を有する。次いで、より高い翻訳効率を有する同義語コドン(LeuCTC、GluGAA、GlyGGA、LysAAG、HisCAC、PheTTT、およびThrACA)を、低い翻訳効率コドンを置き換えるために選択した。便宜上、これらの置き換えを図1に示し、これは、改変されたEnbrel(登録商標)遺伝子配列および改変されていないEnbrel(登録商標)遺伝子配列の比較を示す。
CHO細胞中で発現の増強のためのコドン改変HPV16E7コードポリヌクレオチドの構築
HPV16E7の野生型コード配列はSEQ ID NO:4に示され、いくつかのコドン(His2、His9、およびHis51をコードするCAT;Pro6をコードするCCT;Pro17およびPro98をコードするCCA;Pro47をコードするCCG;Leu8、Leu15、Leu67、およびLeu79をコードするTTG;Leu13、Leu28、およびLeu83をコードするTTA;Leu65をコードするCTT;Leu82をコードするCTG;Leu87をコードするCTA;Glu18、Glu26、Glu33、Glu34、およびGlu35をコードするGAG;Thr20およびThr78をコードするACT;Thr56をコードするACC;Cys24、Cys58、Cys61、およびCys94をコードするTGT;Asn29およびAsn53をコードするAAT;Asp30、Asp48、Asp62、Asp75、およびAsp81をコードするGAC;Ser32をコードするTCA;Ala42をコードするGCT;Ala50をコードするGCC;Gly85をコードするGGC;ならびにLys97をコードするAAA)はこの配列中で同定され、これらは表1および4において示されるような低い翻訳効率を有する。次いで、より高い翻訳効率を有する同義語コドン
を、低い翻訳効率コドンを置き換えるために選択した。便宜上、これらの置き換えを図2に示し、これは、改変されたHPV16E7コード配列および野生型HPV16E7コード配列の比較を示す。
CHO細胞中での発現の増強のためのコドン改変ヒト成長ホルモンcDNAの構築
ヒト成長ホルモン(hGH)の野生型コード配列はSEQ ID NO:7に示され、いくつかのコドン(Ala2、Ala12、およびAla29をコードするGCT;Ala26、Ala43、Ala50、およびAla60をコードするGCC;Thr3をコードするACA;Thr29およびThr53をコードするACC;Gly4、Gly14、およびGly24をコードするGGC;Ser5、Ser8、およびSer33をコードするTCC;Ser25をコードするAGT;Ser69をコードするTCA;Leu9、Leu11、Leu15、Leu18、Leu46、およびLeu49をコードするCTG;Leu21をコードするCTT;Leu32をコードするTTA;Glu23およびGlu56をコードするGAG;Phe27およびPhe70をコードするTTC;Pro28およびPro63をコードするCCA;Pro35をコードするCCT;Arg34をコードするAGG;Arg42をコードするCGC;Asp37をコードするGAC;ならびにHis44をコードするCAT)はこの配列中で同定され、これらは表1および2において示されるような低い翻訳効率を有する。次いで、より高い翻訳効率を有する同義語コドン
を、低い翻訳効率コドンを置き換えるために選択した。便宜上、これらの置き換えを図3に示し、これは、改変されたhGHコード配列および野生型hGHコード配列の比較を示す。
CHO細胞中での発現の増強のためのコドン改変ヒト成長ホルモンゲノムDNAの構築
ゲノムhGHクローンを、pCDNA3にサブクローニングし、このサブクローンのBamHI/SacIフラグメントをさらにpUC18にサブクローニングした。得られたpUC18サブクローンを、以下のプライマーを使用して、PCR増幅のためのテンプレートとして使用した:
を、低い翻訳効率コドンを置き換えるために選択した。改変hGHゲノム配列のヌクレオチド配列はSEQ ID NO:28に提示される。便宜上、これらの置き換えを図4に示し、これは、改変されたhGHゲノム配列および野生型hGHゲノム配列の比較を示す。
コドン改変Enbrel(登録商標)構築物を用いるCHO細胞の一過性トランスフェクションおよびウェスタンブロッティング
チャイニーズハムスター卵巣細胞を、10%胎仔ウシ血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン溶液(Gibco BRL)を補充したDMEM/F12培地(Invitrogen)中で培養した。細胞を、Lipofectamine Plus(Invitrogen)を使用してトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの16時間前にT25フラスコ中に播種した。プラスミドDNA、4μgの非改変Enbrel(登録商標)構築物またはコドン改変Enbrel(登録商標)構築物のいずれかを、750μLのOptiMEM I(商標)培地(Invitrogen)中で希釈し、20μLのPlusReagent(Invitrogen)と混合し、そして室温で30分間インキュベートし、その後30μLのLipofectamine試薬(Invitrogen)を含む750μLのOptiMEM I(商標)培地を加え、室温で30分間インキュベーションを行った。細胞単層を、OptiMEM I培地で1回洗浄し、5mLのOptiMEM I(商標)培地およびトランスフェクション混液とともに一晩インキュベートし、その後5mLの減少増殖培地(DMEM/F12、2%胎仔ウシ血清)で置き換え、収集の前にもう一度24時間培養した。5mLの細胞培養上清を収集した。次いで、試料を50 000 MWCOスピンフィルター(Amicon)を使用して100μLまで濃縮した。試料を-20℃で保存した。
コドン改変HPV16E7構築物を用いるCHO細胞の一過性トランスフェクションおよびウェスタンブロッティング
チャイニーズハムスター卵巣細胞を、10%胎仔ウシ血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン溶液(Gibco BRL)を補充したDMEM/F12培地(Invitrogen)中で培養した。細胞を、Lipofectamine Plus(Invitrogen)を使用してトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの16時間前にT25フラスコ中に播種した。プラスミドDNA、4μgのHPV 16 E7野生型またはHPV 16 E7 CHO改変のいずれかを、750μLのOptiMEM I(商標)培地(Invitrogen)中で希釈し、20μLのPlusReagent(商標)(Invitrogen)と混合し、そして室温で30分間インキュベートし、その後30μLのLipofectamine試薬(Invitrogen)を含む750μLのOptiMEM I(商標)培地を加え、室温で30分間インキュベーションを行った。細胞単層を、OptiMEM I(商標)培地で1回洗浄し、5mLのOptiMEM I(商標)培地およびトランスフェクション混液とともに一晩インキュベートし、その後5mLの増殖培地(DMEM/F12、10%胎仔ウシ血清)で置き換え、収集の前にもう一度24時間培養した。細胞を収集およびペレット化し、次いで0.1mLの溶解バッファー(0.1% NP-40、2μg/mL アプロチニン、5mg/mL DTT、1μg/mL ロイペプチン、2mM PMSF)中に再懸濁し、超音波処理し、そして-20℃で保存した。
(図1)ヒトIgG1分子のFcフラグメントによって連結される2つの可溶性TNFレセプターからなる組換え融合タンパク質である、Enbrel(登録商標)(etanerceptとしても知られる)をコードする親のヌクレオチド配列[SEQ ID NO:1]を示す図表示である。そのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示される。コドン改変されたEnbrel(登録商標)ヌクレオチド配列[SEQ ID NO:3]を産生するために親のヌクレオチド配列に導入される変異は、親の配列の対応するヌクレオチドの下に示される。これらのヌクレオチドの置き換えは、親のEnbrel(登録商標)ヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を生じるが、置き換えられたコドンよりもCHO細胞中でより高い翻訳効率を有する同義語コドンを有する。
(図2)ヒトパピローマウイルス(HPV)タイプ16E7タンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列[SEQ ID NO:4]を示す図表示であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO:5に示される。コドン改変されたHPV16E7ヌクレオチド配列[SEQ ID NO:6]を産生するために野生型配列に導入される変異は、野生型配列の対応するヌクレオチドの下に示される。これらのヌクレオチドの置き換えは、野生型HPV16E7ヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を生じるが、置き換えられたコドンよりもCHO細胞中でより高い翻訳効率を有する同義語コドンを有する。
(図3)ヒト成長ホルモン(hGH)をコードする野生型cDNA配列[SEQ ID NO:7]を示す図表示であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO:8に示される。コドン改変されたhGHヌクレオチド配列を産生するために野生型配列に導入される変異は、野生型配列の対応するヌクレオチドの下に示される。これらのヌクレオチドの置き換えは、野生型hGHヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を生じるが、置き換えられたコドンよりもCHO細胞中でより高い翻訳効率を有する同義語コドンを有する。
(図4)ヒト成長ホルモン(hGH)をコードする野生型ゲノム配列[SEQ ID NO:26]を示す図表示であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO:8または27に示される。コドン改変されたhGHゲノム配列を産生するために野生型配列に導入される変異は、野生型配列の対応するヌクレオチドの下に示される。これらのヌクレオチドの置き換えは、野生型hGHゲノム配列と同じアミノ酸配列をコードする改変ゲノム配列を生じるが、置き換えられたコドンりもCHO細胞中でより高い翻訳効率を有する同義語コドンを有する。
(図5)CHO細胞中でのEnbrel(登録商標)の産生が、親または未改変のEnbrel(登録商標)ヌクレオチド配列[SEQ ID NO:1]からよりも、コドン改変されたEnbrel(登録商標)ヌクレオチド配列[SEQ ID NO:3]からで約5倍高いことを示すウェスタンブロットの写真表示である。
(図6)CHO細胞中でのHPV16E7の産生が、親または未改変のHPV16E7ヌクレオチド配列[SEQ ID NO:4]からよりも、コドン改変されたHPV16E7ヌクレオチド配列[SEQ ID NO:6]からで約2.5倍高いことを示すウェスタンブロットの写真表示である。
Claims (34)
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドからとは異なるレベルでポリペプチドが産生可能な合成ポリヌクレオチドを構築する方法であって、該方法は以下の工程:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、該同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、該CHO細胞中で第1のコドンとは異なる翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;および
該合成ポリヌクレオチドを構築するために、該第1のコドンを該同義語コドンで置き換える工程、を包含し、
ここで、コドンの翻訳効率の比較が以下の表1によって表される、方法。
表1
- 同義語コドンによって置き換えられる第1のコドンよりも高い翻訳効率を有する該同義語コドンを選択することによって、ポリペプチドがより高いレベルで産生される、請求項1記載の方法。
- 同義語コドンが、該同義語コドンによって置き換えられるコドンの少なくとも約110%の翻訳効率である、CHO細胞中での翻訳効率を有するように選択される、請求項2記載の方法。
- 第1のコドンおよび同義語コドンが、ポリペプチドがCHO細胞中で親のポリヌクレオチドから産生されるレベルの少なくとも110%のレベルで該CHO細胞中で合成ヌクレオチドから産生されるように該ポリペプチドが選択される、請求項2記載の方法。
- 親のポリヌクレオチドにおいて少なくとも約5%の第1のコドンが同義語コドンで置き換えられる、請求項1記載の方法。
- 同義語コドンによって置き換えられる第1のコドンよりも低い翻訳効率を有する該同義語コドンを選択することによって、ポリペプチドがより低いレベルで産生される、請求項1記載の方法。
- 同義語コドンが、該同義語コドンによって置き換えられるコドンの約90%未満の翻訳効率である、CHO細胞中での翻訳効率を有するように選択される、請求項7記載の方法。
- 親のポリヌクレオチドにおいて少なくとも約5%の第1のコドンが同義語コドンで置き換えられる、請求項1記載の方法。
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドからとは異なるレベルでポリペプチドが産生可能な合成ポリヌクレオチドを構築する方法であって、該方法は以下の工程:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、該同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、該CHO細胞中で第1のコドンとは異なる翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;および
合成ポリヌクレオチドを構築するために、該第1のコドンを該同義語コドンで置き換える工程、を包含し、
ここで、コドンの翻訳効率の比較は表4によって表される、方法。
表4
- ポリペプチドが、それによって置き換えられる第1のコドンよりも高い翻訳効率を有する同義語コドンを選択することによってより高いレベルで産生される、請求項11記載の方法であって、ここで、(a)該第1のコドンが「低い」翻訳効率コドンとして分類されるならば、該同義語コドンが「高い」または「中程度の」翻訳効率コドンから選択され;および(b)該第1のコドンが「中程度の」翻訳効率コドンとして分類されるならば、該同義語コドンが「高い」翻訳効率コドンから選択される、方法。
- ポリペプチドが、それによって置き換えられる第1のコドンよりも低い翻訳効率を有する同義語コドンを選択することによってより低いレベルで産生される、請求項11記載の方法であって、ここで、(a)該第1のコドンが「高い」翻訳効率コドンとして分類されるならば、該同義語コドンが「中程度の」または「低い」翻訳効率コドンから選択され;および(b)該第1のコドンが「中程度の」翻訳効率コドンとして分類されるならば、該同義語コドンが「低い」翻訳効率コドンから選択される、方法。
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドからよりも高いレベルでポリペプチドが産生可能な合成ポリヌクレオチドを構築する方法であって、該方法は以下の工程:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、該同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、該CHO細胞中で該第1のコドンよりも高い翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;および
合成ポリヌクレオチドを構築するために、該第1のコドンを該同義語コドンで置き換える工程、を包含し、
ここで、該第1のコドンおよび該同義語コドンは表5から選択される、方法。
表5
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドからよりも低いレベルでポリペプチドが産生可能な合成ポリヌクレオチドを構築する方法であって、該方法は以下の工程:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、該同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、該CHO細胞中で該第1のコドンよりも低い翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;および
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、を包含し、
ここで、該第1のコドンおよび該同義語コドンは表6から選択される、方法。
表6
- 請求項1、14、および15のいずれか1項に従って構築される合成ポリヌクレオチド。
- 請求項17記載の方法から得られた、改変チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞。
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドからとは異なるレベルで合成ポリヌクレオチドからポリペプチドを産生する方法であって、該方法は以下の工程:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、該同義語コドンは、請求項1および11に規定されているように、それぞれ、表1または表4によって表されるように、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、該CHO細胞中で第1のコドンとは異なる翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、
該合成ポリヌクレオチドを該CHO細胞に導入する工程;および
該CHO細胞中で合成ポリヌクレオチドを発現し、それによって、該ポリペプチドが該CHO細胞中で該親のポリヌクレオチドからとは異なるレベルで該合成ポリヌクレオチドから産生される工程、を包含する、方法。 - チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドからよりも高いレベルで合成ポリヌクレオチドからポリペプチドを産生する方法であって、該方法は以下の工程:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、該同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、該CHO細胞中で該第1のコドンよりも高い翻訳効率を示すということに基づいて選択され、そして該第1のコドンと該同義語コドンの両方は、請求項6および14に規定されているように、それぞれ、表2または表5から選択される、工程;
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、
該合成ポリヌクレオチドを該CHO細胞に導入する工程;および
該CHO細胞中で合成ポリヌクレオチドを発現し、それによって、該ポリペプチドが該CHO細胞中で該親のポリヌクレオチドからよりも高いレベルで該合成ポリヌクレオチドから産生される工程、を包含する、方法。 - チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドからよりも低いレベルで合成ポリヌクレオチドからポリペプチドを産生する方法であって、該方法は以下の工程:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、該同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、該CHO細胞中で第1のコドンよりも低い翻訳効率を示すということに基づいて選択され、そして該第1のコドンと該同義語コドンの両方は、請求項9および15に規定されているように、それぞれ、表3または表6から選択される、工程;
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、
該合成ポリヌクレオチドを該CHO細胞に導入する工程;および
該CHO細胞中で合成ポリヌクレオチドを発現し、それによって、該ポリペプチドが該CHO細胞中で該親のポリヌクレオチドからよりも低いレベルで該合成ポリヌクレオチドから産生される工程、を包含する、方法。 - CHO細胞からポリペプチドを単離または精製する工程をさらに包含する、請求項20から22のいずれか一項記載の方法。
- 請求項20から22のいずれか一項記載の方法に従って産生されたポリペプチド。
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中でウイルス粒子を産生する方法であって、ここで該ウイルス粒子は該ウイルス粒子のアセンブリーのために必要なポリペプチドを含み、そして該ポリペプチドは該CHO細胞中で親のポリヌクレオチドから産生されるが、その中での生産的なウイルスアセンブリーを可能にするには十分なレベルではなく、該方法は以下の工程:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、該同義語コドンは、請求項1および11に規定されているように、それぞれ、表1または表4によって表されるように、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、該CHO細胞中で第1のコドンよりも高い翻訳効率を示すということに基づいて選択される、工程;
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、
調節ポリヌクレオチドに作動可能に連結された該合成ポリヌクレオチドを該CHO細胞に導入する工程、を包含し、
それによって、該合成ポリヌクレオチドが該CHO細胞中でウイルス粒子の産生を可能にするのに十分なレベルで該ポリペプチドを産生するように発現される、方法。 - チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中でウイルス粒子を産生する方法であって、ここで該ウイルス粒子は該ウイルス粒子のアセンブリーのために必要なポリペプチドを含み、そして該ポリペプチドは該CHO細胞中で親のポリヌクレオチドから産生されるが、その中での生産的なウイルスアセンブリーを可能にするには十分なレベルではなく、該方法は以下の工程:
同義語コドンを用いる置き換えのために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する工程であって、ここで、該同義語コドンは、それが試験CHO細胞中のコドンの翻訳効率と比較して、該CHO細胞中で第1のコドンよりも高い翻訳効率を示すということに基づいて選択され、そして該第1のコドンと該同義語コドンの両方は、請求項6および14に規定されているように、それぞれ、表2または表5から選択される、工程;
合成ポリヌクレオチドを構築するために、第1のコドンを同義語コドンで置き換える工程、
調節ポリヌクレオチドに作動可能に連結された該合成ポリヌクレオチドを該CHO細胞に導入する工程、を包含し、
それによって、該合成ポリヌクレオチドが該CHO細胞中でウイルス粒子の産生を可能にするのに十分なレベルで該ポリペプチドを産生するように発現される、方法。 - チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中でウイルス粒子を産生する方法であって、ここで該ウイルス粒子は該ウイルス粒子のアセンブリーのために必要な少なくとも1種のポリペプチドを含み、そして該ポリペプチドは該CHO細胞中で第1のポリヌクレオチドから産生されるが、その中での生産的なウイルスアセンブリーを可能にするには十分なレベルではなく、そして第1のポリヌクレオチドのコドンに特異的な豊富なイソ-tRNAがポリペプチドの産生の速度を制限し、かつ
からなる群より選択されるコドンに対応し、該方法は、
イソ-tRNAをコードし、かつ調節ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている第2のポリヌクレオチドをCHO細胞中に導入する工程を包含し、
それによって、該第2のポリヌクレオチドが、該ポリペプチドの産生の速度を増加させるのに十分なレベルでイソ-tRNAを産生するように発現され、その結果、該CHO細胞中でウイルス粒子の産生を可能にする、方法。 - CHO細胞からウイルス粒子を単離または精製する工程をさらに包含する、請求項25から27のいずれか一項記載の方法。
- 請求項25から27のいずれか一項記載の方法に従って産生されたウイルス粒子。
- 請求項25から27のいずれか一項記載の方法から得られたCHO細胞。
- ポリペプチドがEnbrel(登録商標)、HPV16E7、およびヒト成長ホルモンからなる群より選択される、請求項2、11、および14のいずれか一項記載の方法。
- 配列番号:3(SEQ ID NO:3)に記載されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号:6(SEQ ID NO:6)に記載されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号:9(SEQ ID NO:9)に記載されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
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