CN102864141A

CN102864141A - 一种构建大容量同义密码库及优化基因模板的方法

Info

Publication number: CN102864141A
Application number: CN201210338706XA
Authority: CN
Inventors: 王明蓉; 张雪梅; 葛永红; 何明跃
Original assignee: Chengdu Institute of Biological Products Co Ltd
Current assignee: Chengdu Institute of Biological Products Co Ltd
Priority date: 2012-09-13
Filing date: 2012-09-13
Publication date: 2013-01-09
Also published as: WO2014040444A1

Abstract

本发明公开了构建大容量同义密码库及优化基因模板的方法，它是通过优化基因模板,改进蛋白质的理化性质。本发明优化基因的方法可以改进编码目标蛋白的核苷酸密码，并维持目标蛋白的原氨基酸序列不变,进而改进目标蛋白的可溶性、功能、产量和/或稳定性。该方法具有良好的市场应用前景。

Description

一种构建大容量同义密码库及优化基因模板的方法

技术领域

本发明涉及一种构建大容量同义密码库及优化基因模板的方法。

背景技术

自然界中，细胞通过转录和翻译工程将储藏在DNA中的遗传信息合成蛋白质。核糖体作为蛋白质合成的执行元件，将mRNA中的信息翻译成多肽链，多肽链再进一步折叠成具有生物活性所需的构象。虽然功能蛋白质形成的相关分子机制目前尚不完全明确，但长期以来科学界普遍认为氨基酸序列中包含所有的指导蛋白质折叠成活性三维构象的信息，也就是常说的蛋白质的一级结构决定其高级结构。

细胞使用61种密码子编码20种氨基酸。因此,许多氨基酸可由多个密码子来编码,这些编码同一氨基酸的密码子称为同义密码子。研究发现，同义密码子在生物界中并非随机分布，不同生物体对同义密码子的使用呈现偏好性，导致异源细胞表达蛋白时常常出现合成效率低或产生大量不溶的聚合物（包涵体）的现象。据统计，约有40%的人类基因不能在E.coli中表达，或者只能低水平表达。优化异源蛋白在表达宿主/载体中的表达活性，是一个亟待解决的问题。

现有大量文献报道，根据大肠杆菌的密码偏好性，定点突变改变外源蛋白的核苷酸序列以优化其表达特性。但是，通过定点突变改变外源蛋白某个位点或者某几个位点密码偏好性的方式来优化基因，只能单个构建，基因优化的效率极低，工作量也很大。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种优化基因的方法，还提供一种同义密码突变库的构建方法，即根据表达宿主/载体的密码偏好性，对外源蛋白的核苷酸密码进行高通量同义突变，以适应表达宿主/载体的表达环境。

本发明为筛选大容量同义密码库优化基因模板的方法，它是通过优化基因模板,改进蛋白质的理化性质,同时维持原蛋白的氨基酸序列不变。

其中，所述理化性质为蛋白质可溶性、功能和/或稳定性。

其中，该方法包括如下步骤：

（a）构建同义密码基因库；

（b）表达步骤(a)同义密码基因库；

（c）筛选所需性质的目标蛋白；

(d)获得基因优化摸板。

其中，步骤(a)所述的同义密码基因库是重组基因库。

所述同义密码基因库包括指定位点上的同义密码库或全长基因同义密码库。同义密码基因库含有低、中或/和高使用频率的同义密码子。

步骤(b)中，同义密码基因库通过蛋白表达系统产生蛋白；所述蛋白表达系统为原核,真核及无细胞系统。

同义密码基因库所编码蛋白质可以是不同形式的蛋白,重组蛋白或多肽。

所述表达可以是分子伴侣共表达。

步骤(c)中，筛选鉴定所需性质的蛋白方法是高通量筛选,包括但不限于蛋白质展示或者其他富集方法。

步骤(c)中，根据蛋白目标蛋白的可溶性、功能、产量和/或稳定性进行筛选。

所述可溶性是指在蛋白表达或生理学缓冲液条件下保持可溶的状态。

所述功能包括受体与配体结合、分子相互作用、底物特异性、抗原性和酶活性。

所述稳定性包括高温稳定性、中温稳定性以及对低pH和/或高pH环境的稳定性。

所述筛选鉴定方法中可以使用报告基因，如绿色荧光蛋白GFP。

同义密码突变库的构建方法，包括如下步骤：

（1）根据异源宿主的密码子偏好性，将目标蛋白的基因序列设计为密码子兼并序列；

（2）将步骤（1）的兼并序列，分别按正向和反向截断为长度为12~100bp的基因序列，合成得到相互重叠的正向基因序列与反向基因序列；

（3）取步骤（2）所得基因序列，混合，PCR扩增，，得扩增产物；

（4）取步骤（2）兼并序列的前端和末端基因序列分别作为上游引物和下游引物，以步骤（3）的扩增产物作为模板，PCR扩增，回收PCR产物，即为同义密码突变库。

所述同义密码突变库是指核苷酸序列不同但编码的蛋白的氨基酸序列相同的基因的集合。

其中，步骤（2）所述基因序列的长度为12-100bp。

其中，步骤（3）中，PCR扩增的条件为：

其中，步骤（4）所述上游引物和下游引物上设置酶切位点；

其中，步骤（4）所述扩增的条件为：

本发明还提供了一种基因的优化方法，它包括如下步骤：

a、取编码目标蛋白的天然基因，按照前述方法构建同义密码突变库;

b、取步骤a构建得到的同义密码突变库，通过表达的方式筛选得到优化的基因。

本发明还提供了一种目标蛋白的表达方法，它包括如下步骤：

Ⅰ、取前述方法得到的优化的基因；

Ⅱ、将优化的基因克隆到表达载体上，转化宿主，表达即可。

其中，步骤Ⅱ所述宿主是异源宿主。

本发明还提供了一种构建同义密码突变库及优化基因模板的试剂盒，它包括合成编码目标蛋白的兼并基因序列的相关试剂、对该兼并序列进行PCR扩增、PCR产物回收的相关试剂，以及对该兼并序列进行基因表达的载体、异源宿主和相关试剂。

所述基因模板是目标蛋白的表达基因。

本发明还提供了SEQ ID NO.42~43所示的核苷酸序列。它们编码的蛋白质的亲和力显著提高。

本发明方法，根据外源表达宿主/载体的密码子偏好性，对目标蛋白的核苷酸序列进行同义突变，通过PCR扩增条件的优化，得到了同义密码突变库。与传统方法定点改变某个位点的密码偏好性相比，本发明通过同义密码突变库的构建得到大容量同义突变库，有效地适应了表达宿主/载体的密码偏好性，极大的提高基因优化的效率，为目标蛋白的外源表达提供了极方便有效的手段，可以实现目标蛋白的工业化生产，具有良好的工业应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1全人源重组抗IgE抗体同义突变库构建示意图

图2重链及轻链同义突变库的电泳图谱

图3重链及轻链未突变模板

图4全长重链与轻链突变库

图5测序图谱

图6重链突变库可溶性蛋白的产量及亲和性

图7轻链突变库可溶性蛋白的产量及亲和性

图8重轻链突变库总蛋白的产量及亲和力

图9同义突变株抗体的亲和力比较

图10GFP-TNFa-R融合蛋白的可溶性表达

具体实施方式

实施例1全人源重组抗IgE抗体同义密码突变库的构建

1、构建方法

（1）同义密码突变库模板

以人源抗IgE scFv抗体基因作为模板，该重组抗体在临床上可用于开发IgE介导的自身免疫性疾病如过敏性哮喘等治疗的药物或诊断试剂，其核苷酸序列和氨基酸序列见专利号为ZL200810032639.2，发明名称为一全人源重组IgE抗体的发明专利。

（2）兼并序列

Ⅰ、为了分别分析重链和轻链同义突变对重组抗体的影响，分别构建两个独立的重链同义突变库和轻链同义突变库，突变库结构见图1。

（a）重链同义突变库，红色为同义突变区，绿色为未突变区，

黄色为his-tag区。

（b）轻链同义突变库，红色为同义突变区，绿色为未突变区，

黄色为his-tag区。

Ⅱ、根据日本Kazusa DNA Research Institute提供的密码子使用数据库（Codon Usage Database http://www.kazusa.or.jp/codon)中大肠杆菌密码子使用表，选择高中低频率的密码子设计同义密码突变引物：

突变位点为氨基酸密码子第三位碱基，兼并码为：Y=C+T;R=A+G;H=A+T+C;D=G+A+T;V=G+A+C;B=G+T+C，同义密码突变序列如表1所示：

表1:同义密码突变序列设计

分别引入E.coli高中低三种频率的密码子突变设计为兼并密码，并在5’端和3’端分别引入限制性内切酶NdeI和EcoR I酶切位点，得到的IgE scFv抗体基因的兼并序列如SEQ ID NO.1所示。

GCGACATATGGARGTVCARCTDGTVCARTCHGGVGCBGARGTVAARAARCCV

GGVGCBTCHGTVAARGTVTCHTGYAARGCBTCHGARTAYACVTTYACVGGVTAYT

AYATGCAYTGGGTVCGVCARGCBCCVGGVCARGGVCTDGARTGGATGGGVTGGA

THAAYCCVACVAGYGGVGGVCCVGTVTAYGCBCARAARTTYCARGGVAGRGTVAC

VATGACVATGGAYACVTCHTTYACVACVGCBTAYATGGARCTDAGYAGRCTDAGRT

CHGAYGAYACVGCBGTVTAYTAYTGYGCBAGRGTVATHCTDTTYGGVCGVGCBTT

YGAYATHTGGGGVCARGGVACVCTDGTVACVGTVTCHTCHTCHGGTGGCGGCGG

TTCTGGCGGTGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGTTCGAGCTCCGACATTGTGATGAC

VCARTCHCCVTCHTCHGTVTCHGCBTCHGTVGGVGAYCGVGTVACVATHACVTG

YCGVGCBAGYCARGGVATHAGYAGYTGGTTRGTVTGGTAYCARCARAARCCVGG

VAARGCBCCVAARCTDCTDATHTAYGCBGCBTCHAGYTTRCARAGYGGVGTVCCV

TCHAGRTTYAGYGGVGGVGGVTCHGGVACVGAYTTYACVCTDACVATHAGYAGYC

TDCARCCVGARGAYTTYGCBACVTAYTAYTGYCARCARGCBATHACVTTYCCVCG

VACVTTYGGVCARGGVACVAARGTVGARATHAARCGVACVGTGGCTGCACCATCT

CATCACCATCACCATCAC

GAATTCGGCCGG

（3）同义突变引物的设计

按照SEQ ID NO.1所示重链同义突变库的序列，正向截断，序列如下（引物方向为5’-3’）：

EVHM1B gcgacatatggargtvcarctdgtvcartchggvgcbgargtvaaraarc

EVHM2B cvggvgcbtchgtvaargtvtchtgyaargcbtchgartayacvttyac

EVHM3B vggvtaytayatgcaytgggtvcgvcargcbccvggvcarggvctdgartggatg

EVHM4B ggvtggathaayccvacvagyggvggvccvgtvtaygcbcaraarttycarggvag

EVHM5B rgtvacvatgacvatggayacvtchttyacvacvgcbtayatggarctdagyag

EVHM6B rctdagrtchgaygayacvgcbgtvtaytaytgygcbagrgtvathctdttyg

EVHM7B gvcgvgcbttygayathtggggvcarggvacvctdgtvacvgtvtchtchtchg

EVHM8B gtggcggcggttctggcggtggtggctctggcggtggcggttcgagctccgacattg

按照SEQ ID NO.1所示重链同义突变库的序列，反向截断，序列如下（引物方向为5’-3’）：

EVHM1F cagaagatggagactgggtcatcacaatgtcggagctcgaaccgccaccgccag

EVHM2F agccaccaccgccagaaccgccgccaccdgadgadgabacbgtbachagbgtbccytg

EVHM3F bccccadatrtcraavgcbcgbccraahagdatbacyctvgcrcartartabac

EVHM4F vgcbgtrtcrtcdgaycthagyctrcthagytccatrtavgcbgtbgtraadgabgtrtc

EVHM5F catbgtcatbgtbacyctbccytgraayttytgvgcrtabacbggbccbccrctbg

EVHM6F tbggrttdatccabcccatccaytchagbccytgbccbggvgcytgbcgbac

EVHM7F ccartgcatrtartabccbgtraabgtrtaytcdgavgcyttrcadgabac

EVHM8F yttbacdgavgcbccbggyttyttbacytcvgcbccdgaytgbachagytg

EVHM1B中设计了一个NdeI酶切位点，用于连接载体。

按照SEQ ID NO.1所示轻链同义突变库的序列，正向截断，序列如下

（引物方向为5’-3’）：

DVLM1B tcgagctcc gacattgtg atgacvcartchccvtchtchgtvtchgcbtc

DVLM2B hgtvggvgaycgvgtvacvathacvtgycgvgcbagycarggvathagyagytg

DVLM3B gttrgtvtggtaycarcaraarccvggvaargcbccvaarctdctdathtayg

DVLM4B cbgcbtchagyttrcaragyggvgtvccvtchagrttyagyggvggvggvtc

DVLM5B hggvacvgayttyacvctdacvathagyagyctdcarccvgargayttygcbac

DVLM6B vtaytaytgycarcargcbathacvttyccvcgvacvttyggvcarggvac

DVLM7B vaargtvgarathaarcgvacvgtggctgcaccatctcatcaccatc

按照SEQ ID NO.1所示轻链同义突变库的序列，反向截断，序列如下（引物方向为5’-3’）：

DVLM1F ccggccgaattcttagtgatggtgatggtgatgagatggtgcagccacbgtbc

DVLM2F gyttdatytcbacyttbgtbccytgbccraabgtbcgbggraabgtdatvgcytg

DVLM3F ytgrcartartabgtvgcraartcytcbggytghagrctrctdatbgthag

DVLM4F bgtraartcbgtbccdgabccbccbccrctraayctdgabggbacbccrctytg

DVLM5F yaarctdgavgcvgcrtadathaghagyttbggvgcyttbccbggyttytgytgrtac

DVLM6F cabacyaaccarctrctdatbccytgrctvgcbcgrcabgtdatbgtbac

DVLM7F bcgrtcbccbacdgavgcdgabacdgadgabggdgaytgbgtc

DVLM1F中设计了一个EcoRI酶切位点，用于连接载体。

（4）同义密码突变库的构建

（a）重链和轻链突变库构建

采用DNA聚合酶，通过PCR方法将上述同义密码突变库引物分别组装成重链和轻链突变库，PCR组装条件为：

得扩增产物；

取扩增反应产物2μL加入50μL含有外侧扩增引物（重链突变库：上游引物5’gcgacatatggargtvcarctdg，下游引物为5’cagaagatggagactgggtcatc；轻链突变库：上游引物5’tcgagctccgacattgtg ，下游引物为5’ccggccgaattcttagtg的PCR体系进行扩增。PCR条件为：

电泳鉴定正确后用胶回收，并按照胶回收纯化试剂盒厂家说明书纯化反应产物，即分别获得重链及轻链同义突变库，电泳结果见图2。

（b）构建全长同义突变库，分别将重链同义突变库与未突变的轻链连接，轻链同义突变库则与未突变的重链连接：

用质粒提取试剂盒提取人源抗人IgE scFv质粒；分别设计模板上未突变重链与轻链的外侧特异上下游引物（重链未突变序列：上游引物5’gcgacatATGGAGGTGCAG，下游引物为5’cagaagatggagactgggtcatc；轻链未突变序列：上游引物5’tcgagctccgacattgtg ，下游引物为5’ccggccgaattcttagtg；

以未突变序列为模板通过PCR扩增分别合成未突变的重链与轻链，反应条件为：

电泳鉴定正确后用胶回收，用胶回收纯化试剂盒按厂家说明书纯化反应产物，即分别为重链及轻链未突变模板，电泳结果见图3；

通过PCR装配同义突变库全长：将重链或轻链同义突变库分别与轻链或重链未突变模板通过PCR组装全长突变库，上游引物为5’gcgacatatggargtvcarctdg，下游引物为5’ccggccgaattcttagtg；反应条件为：

电泳鉴定正确后用胶回收，用胶回收纯化试剂盒按厂家说明书纯化反应产物，即为全长重链突变库与全长轻链突变库，电泳结果见图4。

同义突变基因库可以直接用于转化或采用核糖体展示技术富集后进行转化与表达。

（5）同义密码突变基因的克隆、测序

a)采用Nde I及EcoR I双酶切分别消化质粒pET22(b)和全长重链、轻链同义突变库，反应条件按照书进行；

b)酶切消化产物进行电泳鉴定，用胶回收纯化试剂盒纯化消化后的目的产物；

c)将消化后的质粒分别与全长重轻链同义突变库，按照摩尔比1:3的比例，采用T4连接酶试剂盒进行连接，连接条件按说明书进行；

d)连接产物直接用于转化：按照标准的电转化或化学转化方法，将PCR连接产物转化到表达宿主细胞，如BL21(DE3)或Rosetta(DE3)；

核糖体展示筛选出的基因序列与载体的连接亦可采用上述方法完成体外克隆后转化至表达型宿主细胞中；

基因测序。

2、检测结果

基因测序结果如图5所示，在所有第三位设计的同义密码子突变位点出现预期的目标套峰，证实成功地构建了氨基酸第三位由同义密码子组成的突变基因库。

实施例2全人源重组抗IgE抗体的表达及筛选

1、表达及筛选

（1）表达

取实施例1构建的同义密码突变库，克隆到大肠杆菌上表达（构建方法同实施例1步骤（5））。

表达条件：

阳性菌接种于10mL含50ng·L-1氨苄的LB或2YT培养基中，37℃振荡培养过夜；

5%接种量接种于新鲜LB或2×YT(含50ng·L-1Amp)培养基，37℃振荡培养至对数生长期加IPTG诱导(终浓度为0.3～1mmol·L-1)，37℃振荡培养4-6h，1300×g离心10min收集菌体并收获目标细胞；

使用Bugbuster溶液破碎细胞，破碎液经18,000rpm,4℃离心20分钟后，获得含可溶性scFv抗体的上清液；

（2）筛选

1）可溶性蛋白产量改进的突变株的筛选

采用ELISA法检测单链抗体的含量：

用兔抗抗-IgE scFv血清抗体捕获待检的目标单链抗体(scFv)，然后用辣根酶（HRP）偶联的anti-(His)6抗体检测scFv抗体含量，以原始scFv克隆菌株为对照(可溶性表达量为0.5mg/L)，判断同义密码突变克隆菌表达可溶性scFv的相对含量。具体操作如下：

以1ug/孔的兔多克隆抗抗-IgE scFv抗体包被酶标板，4℃过夜；

第二天用PBS溶液洗板后用1%BSA溶液室温封闭2小时；

随后按照100ul/孔用量加入待检scFv样品，置酶标板于30℃孵育1小时后，用PBST溶液洗涤酶标板3次；

向孔内加入100ul的辣根酶标记的抗His标签的单克隆抗体（Sigma，1:6000稀释），置酶标板于37℃孵育1小时；

PBST溶液洗涤酶标板3次，最后加入100ul/孔的TMB显色溶液于37℃反应10分钟，用100ul1N HCl溶液终止反应，置450nM波长下酶标仪读数。

2）抗体亲和力改进的突变株的筛选

除了使用0.1ug/孔的人IgE蛋白包被酶标板外，scFv抗体的亲和力检测采用上述同样ELISA方法。以未突变的原始scFv抗体为对照，通过比对同义密码突变前后scFv抗体样品的吸光度数值变化，计算出突变后抗体的相对亲和力的改变。

抗体的相对可溶性产量及抗原结合活性按下述公式计算：

scFv可溶性产量抗体或相对活性（%）=（待检样品吸光度数值-阴性对照样品吸光度数值）/原始scFv样品吸光度数值x细胞稀释倍数x100%

采用IBM SPSS 19.Data软件对实验数据进行统计学分析，得到平均值±SD，方差t–分析用于样品间的差异检测。

2、实验结果

（1）如图6~图8所示，获得了一系列可溶性抗体产量及亲和力提高的同义密码突变克隆菌。

（2）如图9所示，获得了两株亲和力显著提高的抗体，原始scFv抗体的亲和力为10^-8M，其中两株株突变体（IgE scFv VH-H和IgE scFv VL-H）表达的scFv抗体亲和力分别提高了32倍和4倍，这2株抗体的DNA序列如SEQ IDNO.42~43所示。

SEQ ID NO.42

ATGGAGGTACAGCTGGTGCAATCCGGCGCTGAAGTCAAGAAACCAGGAGCGTCTGTCAAAGTATCTTGTAAAGCT

TCTGAGTATACATTTACAGGATATTATATGCATTGGGTACGACAAGCTCCAGGCCAAGGGCTGGAATGGATGGGATGG

ATAAATCCAACAAGTGGAGGACCAGTATATGCCCAAAAATTCCAAGGCAGAGTCACAATGACAATGGACACGTCATTT

ACAACAGCTTATATGGAACTAAGTAGACTAAGATCAGATGATACAGCTGTGTATTATTGCGCGAGAGTGATACTATTT

GGACGAGCTTTTGATATTTGGGGACAAGGCACACTGGTAACAGTATCATCATCAGGTGGCGGCGGTTCTGGCGGTGGT

GGCTCTGGCGGTGGCGGTTCGAGCTCCGACATTGTGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGAC

AGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGTTTGGTATCAGCAGAAACCAGGCAAAGCC

CCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTACAAAGTGGGGTCCCTTCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCTGGGACC

GATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTTCAGCCTGAAGATTTTGCTACTTACTATTGTCAACAGGCTATCACTTTCCCT

CGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTCATCACCATCACCATCACTAA

SEQ ID NO.43

ATGGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCT

GAATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGATGGATC

AACCCTACCAGTGGTGGCCCAGTCTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCATGGACACGTCCTTCACC

ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTGATTCTGTTTGGC

CGGGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCATCCGGTGGCGGCGGTTCTGGCGGTGGTGGC

TCTGGCGGTGGCGGTTCGAGCTCCGACATTGTGATGACACAGTCACCGTCTTCAGTCTCTGCGTCTGTAGGAGACCGA

GTCACAATCACGTGCCGCGCCAGTCAGGGAATAAGTAGTTGGTTAGTATGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCTCCC

AAACTACTGATTTATGCTGCTTCTAGTTTACAAAGTGGCGTACCATCCAGATTCAGTGGGGGCGGATCAGGGACCGAT

TTTACGCTTACAATTAGTAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCTACATACTATTGCCAACAAGCTATCACATTTCCGCGA

ACGTTTGGCCAGGGCACAAAAGTAGAGATTAAACGCACAGTGGCTGCACCATCTCATCACCATCACCATCACTAA

实验结果证明，本发明根据大肠杆菌密码子偏好性，通过构建的同义密码突变库的方法，分别得到了可溶性好、亲和力高的全人源重组抗IgE抗体以及相应的重组大肠杆菌。

（3）利用核糖体展示技术筛选同义密码基因库

利用核糖体展示技术先对抗-IgE抗体同义密码基因库进行富集筛选，然后再通过E.coli表达并筛选目标抗体。这种途径也获得了可溶性及亲和力改进的scFv抗体。

实施例3GFP-TNFa-R融合蛋白的优化（同义密码基因与标签蛋白的融合表达）

1、同义突变密码库的构建和表达

TNFa-R蛋白为E.coli表达的一种重组蛋白片段，现有技术用表达的TNFa-R蛋白以不溶性的包涵体形式表达。应用本发明中所述的同义密码突变技术对TNFa-R蛋白基因进行同义密码子修饰。为了便于检测可溶性蛋白的表达，将GFP报告基因设计到TNFa-R蛋白基因的N-末端。随后按照本发明所述方法构建同义密码基因库并在E.coli细胞中表达GFP-TNFa-R融合蛋白。

2、结果

表达结果如图10所示，获得系列可溶性的GFP-TNFa-R融合蛋白。

实施例4本发明构建同义密码突变库及优化基因模板的试剂盒及其使用方法

1、构建同义密码突变库及优化基因模板的试剂盒包含如下组分：

编号	组分
		1	合成目标蛋白兼并基因序列的相关试剂
2	兼并序列PCR扩增相关试剂
		3	兼并序列PCR产物回收相关试剂
4	兼并序列基因表达的载体、异源宿主
		5	兼并序列基因表达相关试剂

2、试剂盒的使用方法

1）同义密码突变库的构建（使用编号1、2和3的组分）

根据异源宿主的密码子偏好性，合成目标蛋白的兼并基因序列；

PCR扩增，回收，得到同义密码突变库；

实验条件参照实施例1。

2）基因模板优化（使用编号4和5的组分）

取前述方法构建同义密码突变库，克隆到载体中，转化异源宿主，表达筛选即可。

实验条件参照实施例2。

综上，本发明同义密码子突变库的构建方法，可以根据外源表达载体的偏好性，即各密码子出现的频率，对目标蛋白基因序列进行改造，制备得到同义密码突变库，并通过高通量筛选同义密码突变库，可以获得理化性质优化的目标基因。本发明为目标蛋白基因序列的优化提供了非常有效的手段，可以极大地提高蛋白基因优化效率，降低工作量，具有良好的工业应用前景。