JP7257788B2 - 組換えタンパク質の生成 - Google Patents
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Description
が提供される。
i)本発明に記載の改変細胞を提供するステップ、
ii)上記改変細胞により発現される1つまたは複数の組換えタンパク質/ペプチドの発現に好適な細胞培養条件下でi)の細胞をインキュベートするステップ、および任意選択で
iii)改変細胞または細胞培養培地から、発現した組換えタンパク質/ペプチドを単離するステップ
を含む、方法が提供される。
i)発現させようとする組換えタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を分析して、1つまたは複数のコドン/アンチコドンtRNAミスマッチを特定するステップ、
ii)少なくとも1つのコドンにおける少なくとも1つの塩基対形成ミスマッチを修正する1つまたは複数のtRNA遺伝子を含む1つまたは複数の転写カセットで細胞をトランスフェクトまたは形質転換して、改変細胞を提供するステップ、
iii)発現させようとする組換えタンパク質で上記改変細胞をトランスフェクトまたは形質転換するステップ、および任意選択で
iv)上記組換えタンパク質を発現するための細胞培養条件を提供するステップ
を含む、方法が提供される。
i)発現させようとする組換えタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を分析して、1つまたは複数のコドン/アンチコドンtRNAミスマッチを特定するステップ、
ii)上記組換えタンパク質をコードするmRNAおよび上記mRNA中の少なくとも1つのコドンにおける少なくとも1つの塩基対形成ミスマッチを修正する1つまたは複数のtRNAを含む反応混合物を提供するステップ、および
iii)上記mRNAからの上記組換えタンパク質の合成のための反応条件を提供するステップ
を含む、方法が提供される。
1つまたは複数のtRNA遺伝子を含む発現ベクター、任意で
1つまたは複数の組換え核酸分子を受容するように適合した発現ベクター、ならびに
サブクローニングおよび/またはトランスフェクション/形質転換に必要な酵素および緩衝液
を含むキットが提供される。
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル抗体、CDRを含むヒト化およびキメラ抗体ならびに由来断片を含む。
医薬タンパク質の例は、「サイトカイン」を含む。サイトカインは、いくつかの多様な細胞機能に関連する。これらは、免疫系の調節、エネルギー代謝の調節ならびに増殖および発達の制御を含む。サイトカインは、標的細胞上の細胞表面で発現される受容体を介してそれらの効果を仲介する。サイトカインの例として、インターロイキン、例えばIL1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32および33が挙げられる。他の例として、成長ホルモン、レプチン、エリスロポエチン、プロラクチン、腫瘍壊死因子[TNF:tumour necrosis factor]、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF:granulocyte colony stimulating factor)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF:granulocyte macrophage colony stimulating factor)、毛様体神経栄養因子(CNTF:ciliary neurotrophic factor)、カルジオトロフィン-1(CT-1:cardiotrophin-1)、白血病阻止因子(LIF:leukemia inhibitory factor)およびオンコスタチンM(OSM:oncostatin M)、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンε、インターフェロンκおよびωインターフェロンが挙げられる。
ヒトtRNA-Tyr-ATA遺伝子のpcDNA3へのクローニング
5’末端でattB配列の付加を伴い、BglII(5’)およびXhoI(3’)制限酵素配列を端部に有するヒトtRNA-Tyr-ATA遺伝子(chr2:219110270-219110770)を含有する500bpゲノムDNA断片(配列番号1)をLife Technologies社により合成し、ベクターpMK-Tyr_ATAで提供した。この配列を、BglIIおよびXhoIによる37℃での消化により放出し、ゲルを精製した。真核生物発現ベクターpcDNA3をBglIIおよびXhoIで消化して、CMVプロモーターを除去し、ゲルを精製した。2つのDNA断片を、T4リガーゼ(NEB社)を使用して接合し、化学誘導コンピテントE.coliに42℃で1分間のヒートショックにより導入した。プラスミドを続いて、得られたカルベニシリン抵抗性(50μg/ml)コロニーから単離し、インサートの存在を制限酵素消化および続くシークエンシングにより確認した。
CHO-K1細胞を、10%ウシ胎児血清で補充したハムF12培地中で生育させ、37℃で5%CO2中にて培養した。トランスフェクションのために、3mlの培地を含む6ウェルプレート中の1ウェル当たり350,000個の細胞を播種した。翌日、培地を除去し、1mlの新しい培地で置換し、X-fect試薬(Clontech社)を使用して製造者の使用説明書に従い5μgのプラスミドを細胞に導入した。24時間後、3ウェルからの全ての細胞を回収し、pcDNAベクターがネオマイシン抵抗性遺伝子を有するので、400μg/ml G418を補充した15mlの培地を含むT75フラスコに再播種した。これらの細胞を3日後に1:4に分け、G418は600μg/mlまで増大させた。細胞を続いて2~3日毎に1:4に分け、G418はさらに12日目で800μg/mlまで増大させた。完全に形質転換された抵抗性細胞株を示す、さらなる細胞死が起こらなくなるときまで、選択を800μg/mlで継続した。G418の存在下で培養した形質転換されていない細胞は増殖せず、着実に数が減った。
1ml/ウェルのTrizol(Life technologies社)を使用して製造者の使用説明書に従い、CHO細胞からRNAを抽出した。沈殿後、RNAペレットを、4uのRNアーゼ非含有DNアーゼ1(NEB社 M0303S)を含有する30μlの1×DNアーゼ1緩衝液中に懸濁し、RNAを37℃で30分間インキュベートし、その後反応を70℃で10分間にて停止させた。その後、以下のように、SuperScript IV(Life Technologies社)およびランダムモノマー(Sigma社)を使用して、1μgのRNAをcDNAに逆転写した[1μgのRNA、1μlのランダムモノマー、1μlの10mM dNTP混合物、RNアーゼ非含有水を14μlになるように混合し、70℃まで5分間加熱し、その後氷上で冷却し、4μlの5×SSIV緩衝液、1μlの100mM DTTおよび1μlのSuperScript IV逆転写酵素を添加し、室温で10分間、その後55℃で30分間静置し、その後反応を80℃で10分間にて停止させる]。このcDNAを続いてDNアーゼ/RNアーゼ非含有水で100μlまで希釈し、OneTaqポリメラーゼ2×混合物(NEB社)および遺伝子特異的プライマー(配列番号2:ATAフォワード-GCTGGTAGAGCAGAGGACTAT、配列番号3:ATA(2)リバース-TCGAACCAGCAACCTAAGGAC)でのPCR反応で使用した。[標準緩衝液を伴うOneTaq2×-10μl、cDNA-2μl、10μMプライマー-0.2μl、dH2Oで20μlにする]。PCR条件-[94℃-3分間、(94℃-30秒間、62℃-12秒間、68℃-12秒間)×35、68℃-3分間]。PCRの結果は、3%TBEアガロースゲル上でSYBR Safe DNA染色(Invitrogen社)にて可視化した。
各tRNA遺伝子につき、Ile-GAT1-1 hg19_dna範囲ChrX:3756418~3756491、Asn-ATT1-1 hg19_dna範囲chr1:147718729~147719202である配列を以下のようにして得た。これらの配列を、それらを分離するHindIII部位を有し、pcDNA-Tyr-ATA中のTyr-ATA tRNA配列に隣接するクローニングのためのBamHI部位を端部に有するDNAの1断片(配列番号4)として合成した(図3)。得られた構築物は、pcDNA.YINと命名した。
pcDNA-Tyr-ATAについて上記に説明するように、pcDNA-YINを、CHO K1細胞に安定にトランスフェクトした。tRNA-Tyr-ATAについて上記に説明するように、各tRNAの発現をトランスフェクタントにおいて確認した(図4)。tRNA-Ile-GATのプライマー配列は、(配列番号5:フォワード-TCAGGCGGCCGGTTAGC、配列番号6:リバース-GCTAACGCCGTGGCCGGTG)であり、tRNA-Asn-ATTのプライマー配列は、(配列番号7フォワード-TCGCTAGTACCTGTCTCTGTGGおよび配列番号8:リバース-CCTGGGTGGTCTTGAACTACTC)であった。
細胞がトランスフェクション時に50~70%コンフルエントになるように、トランスフェクションの1日前に、3×105個のCHO細胞を、6ウェルCostar透明TC処理細胞培養プレート(Corning社)中の1mlの完全増殖培地(F12/DMEM)中に播種した。微量遠心分離管中で、ハーセプチン(トラスツズマブ)をコードする5μgのプラスミドpCET 1006L+H(図5)DNAを、最終体積が100μlになるようにXfect反応緩衝液で希釈し、高速で5秒間のボルテックスにより混合した。1.5μl Xfectポリマーを、希釈したプラスミドDNAに添加し、高速で10秒間のボルテックスにより十分に混合した(ポリマー:DNAの比は一定に維持した:1μgのプラスミドDNA当たり0.3μlのXfectポリマー)。混合物を室温で10分間インキュベートしてナノ粒子複合体を形成させた。100μlのナノ粒子複合体溶液全てを、ウェル中の細胞培養培地に一滴ずつ添加した。プレートを37℃、5%CO2で4時間から一晩インキュベートし、その後ナノ粒子複合体を吸引により細胞から除去し、2~3mlの新しい完全増殖培地で置換し、プレートを37℃のインキュベーターに戻した。24時間後、細胞をトリプシン処理し、計数し、非処理プレート中のGlutamax(Gibco社)およびピューロマイシン(10μg/ml)で補充したClonaCell(商標)半固体培地(Stem Cell Technologies社)中に200、500または1000個の細胞/mlで再懸濁した。プレートを、コロニーが明らかに見えるようになるまで、37℃、5%CO2で14~21日間インキュベートした。個々のコロニーを、10%FCSおよび10ug/mlピューロマイシンを補充した液体F12培地にピペットで入れ、増殖させ、その後、ウェスタンブロットにより分析した。
ハーセプチン(トラスツズマブ)発現がどのように、pcDNA.YINを使用したヒトtRNA-IleGAT1-1、tRNA-AsnATT1-1およびtRNA-TyrATA遺伝子の一過性または安定的導入によるゆらぎ抑制に応答するか試験するために、pCET 1006L+Hで安定にトランスフェクトしたクローンを使用した。CHO細胞は、これらの3つのtRNAを有さず、それゆえIle、AsnおよびTyrについて、それぞれ、ATC、AATおよびTATコドンを解読するためにゆらぎに依存する。
質量分析(MS:mass spectrometry)による分析のために、ハーセプチンを、Pierce社Protein A磁気ビーズ(Thermo Scientific Pierce社 50μl、0.5mg)を使用して、安定に発現するCHO細胞の単一細胞クローンの播種後72~96時間で回収した細胞培養上清(10% Ultra-Low IgG FBS[Thermo Scientific社]を含むF12:DMEM培地)から精製した。磁気ビーズをピペットで微量遠心分離管に移した。管を磁石上に置いて保存溶液からビーズを分離した。磁気ビーズを1mlの洗浄緩衝液(0.05% Tween-20洗剤を含有するTBS)で洗浄し、ビーズを磁石により回収し、上清を除去した。30mlの細胞培養上清を、Ultracel-50膜(Merck Millipore社)を有するAmicon社製Ultra-15遠心分離フィルターユニットを使用して1.5mlまで濃縮し、ビーズに添加し、回転しながら室温で60分間インキュベートした。管を磁石上に置き、上清を除去した。ビーズ/抗体複合体を、500μlの洗浄緩衝液中に再懸濁し、穏やかなピペッティングにより洗浄した。ビーズ/抗体複合体を全部で3回洗浄し、各洗浄の間に磁石上で分離した。ビーズ懸濁液を、管壁に結合したタンパク質の共溶出を避けるために、クリーン管に移した。100μlの溶出緩衝液(50mMグリシンpH2.8)をビーズに10分間添加して抗体を溶出し、15μl 1M TRIS pH7.5を添加することにより緩衝液を中和した。溶出したタンパク質を、LDS試料緩衝液(Biorad社、4:1)と混合し、DTT(最終濃度100mM)により還元した。混合物を95℃で10分間加熱し、4~15% SDS-PAGEゲル(Biorad社)上にローディングした。ゲルを製造業者の使用説明書に従って泳動した(180V、30~40分)。SDS-PAGEゲルを、InstantBlueクーマシーベースタンパク質染色(Expedeon社)を使用して染色した。DTEでの還元およびヨードアセトアミドでのS-カルバミドメチル化後に、ゲル内トリプシン消化を行った。ゲル片を、25mM炭酸水素アンモニウムを含有する50%(v:v)水性アセトニトリルで2回、その後アセトニトリルで1回洗浄し、真空濃縮器内で20分間乾燥させた。シークエンシンググレードの改変ブタトリプシン(Promega社)を50mM酢酸中に溶解し、その後25mM炭酸水素アンモニウムで5倍希釈して0.02μg/μLの最終トリプシン濃度を得た。ゲル片を、25μLのトリプシン溶液を添加することにより再水和し、10分後、十分な25mM炭酸水素アンモニウム溶液を添加してゲル片を覆った。消化物を37℃で一晩インキュベートした。ペプチドを、0.1%トリフルオロ酢酸(v:v)を含有する50%(v:v)水性アセトニトリルで3回洗浄することにより抽出し、その後真空濃縮器内で乾燥させ、水性0.1%トリフルオロ酢酸(v:v)中に再構成した。ペプチドを、PepMap 100Å C18、5μmトラップカラム(300μm×5mm、Thermo社)およびAcclaim PepMap RSLCまたはEasyNanoカラム、2μm、100Å(C18、75μm×150mm、Thermo社)を備えたUltiMate 3000 RSLCナノHPLCシステム(Thermo社)上にローディングした。トラップ洗浄溶媒は水性0.05%(v:v)トリフルオロ酢酸であり、トラッピング流速は15μl/分であった。トラップを3分間洗浄し、その後キャピラリーカラムへの流動に変えた。分離は、2つの溶媒(溶媒A:水性1%(v:v)ギ酸;溶媒B:1%(v:v)ギ酸を含有する水性80%(v:v)アセトニトリル)の勾配溶出を使用した。キャピラリーカラムの流速は、300nl/分であった。カラム温度は40℃であり、勾配プロファイルは、7分間にわたる直線3~10%B、30分間にわたる直線10~35%B、5分間にわたる直線35~99%Bであり、その後99%溶媒Bでの4分間の洗浄に進めた。カラムを初期条件に戻し、15分間再平衡化し、その後続いて注入した。
上流末端および下流末端で、それぞれ、BamHIおよびSpeI制限酵素部位を端部に有するtRNA49-LeuCAG遺伝子(chr1:1527350-1527050)を含有する、分裂酵母Schizosaccharomyces pombeの第1染色体からのゲノムDNAの300bp断片(配列番号9)を、Life Technologies社により合成した。この配列を37℃でのBamHIおよびSpeIによる消化により放出し、ゲル精製した。このDNA断片を、BamHIおよびSpeIで切断したベクターpRS426(図9)に導入して、T4リガーゼ(NEB社)を室温で2時間使用してプラスミドpAU39を作製し、化学誘導コンピテントE.coli(DH5α)に42℃で0.5分間のヒートショックにより導入した。得られたアンピシリン抵抗性(100μg/ml)コロニーからプラスミドpAU39を続いて単離し、インサートの存在を制限酵素消化により確認した後、配列決定を行った。
Saccharomyces cerevisiae株COG8-TAP(遺伝子型his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0、COG8-TAP::HIS3、Mat a)を、酢酸リチウムを使用して、pAU39または空のpRS426ベクターで形質転換した。形質転換体を標準の最小限培地(SD、プラスミド選択に適切なアミノ酸を欠いている)中で生育させた。5 OD600単位相当の細胞を対数増殖期の液体培養物から回収し、120μl溶解緩衝液中に再懸濁し、その後95℃で2分間インキュベートし、100μgのガラスビーズ(425~600μm、酸で洗浄済み)の存在下で3分間ボルテックスした。溶解物を8%SDS PAGEにより分離し、その後、上記のとおり、COG8に対する抗体およびローディング対照Pgk1でのウェスタンブロッティングにより分析した(図10)。
Claims (18)
- 第1の核酸分子でのトランスフェクションまたは形質転換により改変された単離された真核細胞であって、
前記第1の核酸分子は転写カセットを含み、当該転写カセットが、トランスファーRNA[tRNA]遺伝子をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、前記tRNAが、AGC、GGC、CGC、UGC、ACC、GCC、CCC、UCC、AGG、GGG、CGG、UGG、AGU、GGU、CGU、UGU、AAC、GAC、CAC、UAC、AAA、GAA、AUU、GUU、CUU、UUU、AUC、GUC、CUC、UUC、AGA、GGA、CGA、UGA、ACU、GCU、ACG、GCG、CCG、UCG、CCU、UCU、AAG、GAG、CAG、UAG、CAA、UAA、AAU、GAU、UAU、CAU、AUA、GUA、ACA、GCA、AUG、GUG、CUG、UUG、及びCCAからなる群から選択されるアンチコドンヌクレオチド配列を含み、
前記tRNA遺伝子が、真核細胞にないアンチコドンヌクレオチド配列を含み、
前記細胞は、組換え治療用抗体をコードする第2の核酸分子での形質転換またはトランスフェクションによりさらに改変され、
前記アンチコドン配列が、前記組換え治療用抗体をコードする対応するメッセンジャーRNA[mRNA]コドンにおける第3のヌクレオチド位置で塩基ミスマッチを修正して、翻訳効率を改善する、および/または、遺伝子コードの縮重の結果としてのアミノ酸誤取り込みを減少させて、前記細胞の前記mRNAの翻訳中のゆらぎに対する依存を低減する、単離された真核細胞。 - 前記第1の核酸分子が、前記tRNAの真核生物発現に適合された発現ベクターの一部である、請求項1に記載の単離された真核細胞。
- 前記発現ベクターが、哺乳動物細胞における発現に適合されている、請求項1又は2に記載の単離された真核細胞。
- 前記発現ベクターが、真菌細胞における発現に適合されている、請求項1又は2に記載の単離された真核細胞。
- 前記発現ベクターが、昆虫細胞における発現に適合されている、請求項1又は2に記載の単離された真核細胞。
- 前記発現ベクターが、植物細胞における発現に適合されている、請求項1又は2に記載の単離された真核細胞。
- 昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
- 単離された前記哺乳動物細胞が、非ヒト哺乳動物細胞である、請求項7に記載の単離された真核細胞。
- 単離された前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣[CHO]、HEK293、NS0またはCAP細胞からなる群から選択される、請求項7又は8に記載の単離された真核細胞。
- 前記真菌細胞が、酵母:Saccharomyces cerevisae(サッカロミセス・セレビシエ)、Schizosaccharomyces pombe(シゾサッカロミセス・ポンベ)、Yarrowia lipolytica(ヤロウイア・リポリチカ)、Pichia pastoris(ピシア・パストリス)、Aspergillus(アスペルギルス)、Kluyveromyces lactis(クリベロミセス・ラクチス)およびTrichoderma reesei(トリコデルマ・レエセイ)からなる群から選択される、請求項7に記載の単離された真核細胞。
- 前記Aspergillus(アスペルギルス)が、A.niger(アスペルギルス・ニガー)である、請求項10に記載の単離された真核細胞。
- 前記発現カセットが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の異なるtRNAをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
- 前記第1の核酸が、Ala-tRNA、Arg-tRNA、Asp-tRNA、Asn-tRNA、Cys-tRNA、Glu-tRNA、Gln-tRNA、Gly-tRNA、His-tRNA、Ile-tRNA、Leu-tRNA、Lys-tRNA、Met-tRNA、Phe-tRNA、Pro-tRNA、Ser-tRNA、Thr-tRNA、Trp-tRNA、Tyr-tRNAおよびVal-tRNAの群から選択されるトランスファーRNAをコードする、請求項1から12のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
- 前記細胞が、7SLヌクレオチド配列を含む第3の核酸分子での形質転換またはトランスフェクションによりさらに改変されている、請求項1から13のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
- 前記第3の核酸分子が、配列番号10で示されるヌクレオチド配列または配列番号10で示されるヌクレオチド配列に全長にわたり少なくとも90%のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列バリアントを含む、請求項14に記載の単離された真核細胞。
- 前記第3の核酸分子が、配列番号10で示されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号10で示されるヌクレオチド配列からなる、請求項15に記載の単離された真核細胞。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載の単離された真核細胞を含む細胞培養容器。
- 前記細胞培養容器が、バイオリアクターである、請求項17に記載の容器。
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