CN117821510A - 一种生产IgM抗体的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了生产IgM抗体的方法及其应用。通过本发明的方法进行生产时,可以正确、高效、更高表达量且更高比率地制备IgM五聚体。
Description
技术领域
本申请涉及抗体药物领域,更具体涉及IgM抗体领域。
背景技术
IgM抗体是在免疫系统接触免疫原后最早表达的抗体,在自然状态下IgM抗体在人体内以五聚体或者六聚体形式存在。传统的IgG只有两个臂,而IgM有10个臂或12个臂可以与靶抗原结合,额外的结合位点提供了卓越的结合能力和更高的亲和力。但是,IgM由于分子量巨大而在制造和应用上存在很大的挑战性。
与六聚体形式的IgM不同的是,五聚体形式的IgM抗体包含一个稳定抗体结构的J链,该链的主要功能是通过和聚合免疫球蛋白受体(pIgR)相互作用从而将IgM抗体转运到黏膜表面。因此,开发含有J链的重组IgM抗体的五聚体,发挥其黏膜免疫的作用,在相关呼吸道疾病的预防和治疗中具有潜在的应用价值。
纳米抗体(nanobody)是仅由重链可变区组成的单域抗体,也称为重链单域抗体VHH(variabledomain of heavy chain of heavy-chain-only antibody)。与常规单克隆抗体相比,纳米抗体具有生产成本较低,容易表达,人源化简单,亲和力高,稳定性强,可溶性好等优点。基于所述特点,纳米抗体作为治疗性药物已备受关注。2019年FDA批准Ablynx公司自主研发的卡普赛珠单抗用于治疗成人获得性血栓性血小板减少性紫癜(ATTP),是首个获批上市的纳米抗体药物。在此之后,更多基于VHH的治疗方法被推进到临床试验中,充分发挥其小体积的优势。
本领域仍然需要商业化生产上更简便、更稳定且IgM抗体五聚体表达产量更高的IgM抗体生产方法,以节省生产成本,同时获得纯度和质量更高的IgM抗体五聚体产品。
发明内容
基于IgM抗体卓越的结合能力,发明人在针对呼吸系统疾病的研究中成功生产了一种重组IgM五聚体抗体,其具有广谱的结合性能。同时,发明人还发现,利用哺乳动物细胞表达重组IgM时,表达产物会同时出现五聚体和六聚体形式,且在IgM五聚体和六聚体的活性分析中发现五聚体活性更优。由于IgM抗体六聚体形式很难从产物中除去,为了商业化大规模生产有效抗体,能够正确、高效、高质量、更高表达量且更高比率地制备IgM抗体五聚体至关重要。
此外,与原核表达相比,CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)等哺乳动物细胞的蛋白表达水平低,细胞大规模培养成本高,因此设计并优化表达方法是提高目的蛋白表达量的重要途径之一。
发明人意外地发现,通过控制融合蛋白(重链或H链)与J链蛋白的表达强度,可以更高质量、更高表达量且更高比率地制备IgM五聚体。
一方面,本发明提供一种生产由融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的方法,所述融合蛋白包含Fc片段,所述方法包括:
1)提供用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体;
2)通过所述表达载体在细胞中表达所述融合蛋白和所述J链蛋白;和
3)产生IgM抗体的五聚体;
其中所述融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,融合蛋白选自纳米抗体融合蛋白,纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段,纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接。
在一些实施方案中,用于表达融合蛋白和J链蛋白的表达载体包括:分别表达融合蛋白和J链蛋白的两个或更多个表达载体、表达融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体、或它们的组合。
在一些实施方案中,用于表达融合蛋白和J链蛋白的表达载体包括融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,所述表达单元包括启动子、目的基因(例如,融合蛋白和J链蛋白的编码序列)和任选存在的表达调控元件。
在一些实施方案中,融合蛋白和/或J链蛋白的N端连接有信号肽。
在一些实施方案中,表达载体在细胞中表达包括稳转表达和瞬转表达。
在一些实施方案中,Fc片段是人源IgM的Fc片段。
在一些实施方案中,J链蛋白是人源IgM的J链蛋白。
在一些实施方案中,融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1、约1:1至约9:1、约1:1至约8:1、约1:1至约7:1、约1:1至约6:1、约1:1至约5:1、约1:1至约4:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1。
另一方面,本发明提供融合蛋白和J链蛋白共表达在制备其形成的IgM抗体中的应用,所述融合蛋白包含Fc片段,所述融合蛋白和所述J链蛋白通过用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体在细胞中表达,其中,所述融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,融合蛋白选自纳米抗体融合蛋白,纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段,纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接。
在一些实施方案中,用于表达融合蛋白和J链蛋白的表达载体包括:分别表达融合蛋白和J链蛋白的两个或更多个表达载体、表达融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体、或它们的组合。
在一些实施方案中,用于表达融合蛋白和J链蛋白的表达载体包括融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,所述表达单元包括启动子、目的基因和任选存在的表达调控元件。
在一些实施方案中,融合蛋白和/或J链蛋白的N端连接有信号肽。
在一些实施方案中,表达载体在细胞中表达包括稳转表达和瞬转表达。
在一些实施方案中,Fc片段是人源IgM的Fc片段。
在一些实施方案中,J链蛋白是人源IgM的J链蛋白。
在一些实施方案中,融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1、约1:1至约9:1、约1:1至约8:1、约1:1至约7:1、约1:1至约6:1、约1:1至约5:1、约1:1至约4:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1。
在再一方面,本发明提供用于本发明的方法或应用的表达载体,其包含融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,其中融合蛋白的表达强度等于或者高于J链蛋白的表达强度。
在又一方面,本发明提供一种转化的或者转染的细胞,其包含本发明所述的表达载体或者包含本发明所述的表达载体包含的融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元。
附图说明
图1:融合蛋白形成的IgM抗体五聚体形式结构示意图。
图2:pASH-2-1载体图谱。
图3:稳定表达细胞池补料批培养过程的细胞活率。
图4:IgM抗体表达载体(含不同表达单元)图谱。
图5:稳定表达细胞池补料批培养的细胞上清液的SDS-PAGE分析。
具体实施方式
基于纳米抗体的优势及IgM抗体卓越的结合能力,发明人在针对呼吸系统疾病的研究中成功生产了一种由纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的重组IgM五聚体抗体,其具有广谱的结合性能。同时,发明人还发现,利用哺乳动物细胞表达重组IgM时,表达产物会同时出现五聚体和六聚体形式,且在IgM五聚体和六聚体的活性分析中发现五聚体活性更优。由于IgM抗体六聚体形式很难从产物中除去,为了商业化大规模生产有效抗体,能够正确、高效、高质量、更高表达量且更高比率地制备IgM抗体五聚体至关重要。
此外,与原核表达相比,CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)等哺乳动物细胞的蛋白表达水平低,细胞大规模培养成本高,因此设计并优化表达方法是提高目的蛋白表达量的重要途径之一。
发明人意外地发现,通过控制纳米抗体融合蛋白(重链或H链)与J链蛋白的表达强度,可以更高质量、更高表达量且更高比率地制备IgM五聚体。
下面对本发明的实施方式进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施方式是本发明一部分实施方式,而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。
以下,对本发明进行详述。
纳米抗体是指重链单域抗体,也称为VHH抗体,该类抗体只包含一个重链可变区,是最小的功能性抗原结合片段。
纳米抗体融合蛋白是指通过基因工程手段将纳米抗体VHH结构域与Fc片段进行融合后形成的重组蛋白。
J链是指一富含半胱氨酸的多肽链,主要功能是连接单体Ig分子使其成为多聚体。IgA的二聚体和IgM的五聚体均含J链,作用是使Ig分子分泌到黏膜表面,行使黏膜免疫作用。
IgM五聚体是IgM的一种存在形式,由5个单体借助二硫键彼此相连并与J链连接而成,其具有10个抗原结合部位。
IgM六聚体是IgM的一种存在形式,由6个单体借助二硫键彼此相连而成,其具有12个抗原结合部位。
基因表达包括从DNA转录成mRNA再翻译成蛋白的一个过程。基因表达强度通常是通过基因转录的mRNA的量来衡量,表达强度通常与表达单元拷贝数和表达单元中启动子强度、转录因子结合元件或诸如内含子的基因表达调控元件等的调节直接相关。因此,在提到H链和J链的表达强度时,如果H链和J链的表达强度之比为约1:1,则通常表示H链与J链的基因转录的mRNA的比率为约1:1。在某些情况下,基因表达强度也可以通过基因的量(表达单元拷贝数)来衡量,本领域技术人员会理解它与基因转录的mRNA的量基本相当,例如,具有相同启动子和表达调控元件的表达单元,表达强度与表达单元拷贝数直接相关。
本领域技术人员熟知调节基因表达强度的方法和手段,例如通过使用相同或不同的启动子,通过插入不同的基因表达调控元件进行调节,或通过控制目的基因表达单元的拷贝数来调节。例如,在本发明中,为了实现H链与J链的不同表达强度,通过在启动子与目的基因之间插入或不插入表达调控元件(例如,EF1a intron A)或者控制目的基因表达单元的拷贝数,对H链与J链不同的表达强度进行调控。
本领域技术人员熟知测定mRNA转录量和蛋白表达量的方法和手段,例如针对mRNA通过northern blot杂交、原位杂交、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、转录组测序等,针对蛋白使用western blot、HPLC等。
本领域技术人员理解,可以使用适合的启动子,例如常用的启动子有SV40、CMV、EF1a启动子等。本领域技术人员理解,可以使用适合的表达调控元件(表达强度调控元件),用于增强目的基因的表达强度。
Fc片段是指抗体的可结晶片段,是抗体分子与效应分子或者细胞相互作用的部位,IgG抗体的Fc段指重链恒定区CH2和CH3区域,IgM抗体的Fc段包含重链恒定区CH2、CH3、CH4和Tailpiece(TP)区域或包含重链恒定区CH3、CH4和TP区域。
信号肽是指蛋白质N-末端一段编码长度为5-30的含疏水性氨基酸的序列,用于引导新合成蛋白质向分泌通路转移。
表达载体是将外源的目的基因通过基因工程手段插入到质粒载体上,使得插入的外源目的基因在宿主细胞内能够进行复制、转录及翻译而形成的一类载体。
发明人意外地发现,通过控制融合蛋白(重链或H链)与J链的表达强度,可以更高质量、更高表达量且更高比率地制备IgM抗体。本发明的融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体包括靶点结合蛋白与Fc片段的融合蛋白和J链蛋白所形成的IgM分子(如图1所示的IgM样分子)。
一方面,本发明提供一种生产由融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的方法,所述融合蛋白包含Fc片段,所述方法包括:
1)提供用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体;
2)通过所述表达载体在细胞中表达所述融合蛋白和所述J链蛋白;和
3)产生IgM抗体的五聚体。
在一些实施方案中,所述融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,融合蛋白选自纳米抗体融合蛋白,纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段。
在一些实施方案中,本发明提供了一种生产由纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的方法,所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段,所述方法包括:
1)提供用于表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体;
2)通过所述表达载体在细胞中表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白;和
3)产生IgM抗体的五聚体;
其中所述纳米抗体融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的表达强度等于J链蛋白的表达强度。在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的表达强度高于J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接。在优选的实施方案中,连接基为(GGGGS)m,其中,m=0、1、2、3或4。
在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体包括:分别表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的两个或更多个表达载体、表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体、或它们的组合。
在优选的实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为分别表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的两个表达载体。
在优选的实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体。
在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体包括纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,所述表达单元包括启动子、目的基因和任选存在的表达调控元件。在一些实施方案中,表达单元包括启动子、目的基因、终止子和任选存在的表达调控元件,彼此可操作地连接。在一些实施方案中,表达调控元件位于启动子和目的基因之间,与启动子和目的基因可操作地连接。
在优选的实施方案中,表达载体包括1个纳米抗体融合蛋白表达单元或1个J链蛋白表达单元;或者表达载体包括1个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元;或者表达载体包括2个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元。
在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为分别表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的两个表达载体,其中一个表达载体包括纳米抗体融合蛋白表达单元,另一个表达载体包括J链蛋白表达单元。在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体,该表达载体包括1个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元;或者包括2个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元。
在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白表达单元包括表达调控元件,并且J链蛋白表达单元包括表达调控元件;或者纳米抗体融合蛋白表达单元包括表达调控元件,并且J链蛋白表达单元不包括表达调控元件。
在一些实施方案中,表达载体还包括筛选标记表达单元。在一些实施方案中,筛选标记选自嘌呤霉素、新霉素、潮霉素B、杀稻瘟菌素、谷氨酰胺合成酶和二氢叶酸还原酶。在优选的实施方案中,筛选标记为人谷氨酰胺合成酶。
在一些实施方案中,表达载体还包括PiggyBac转座子的反向末端重复序列。
在一些实施方案中,表达单元的启动子选自单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)启动子、猴空泡病毒40(SV40)启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子。
在优选的实施方案中,表达单元的启动子选自CMV启动子或其功能片段;在一些可选的实施方案中,启动子的功能片段的特征在于其包含该启动子的最小核心启动子序列。在一些实施方案中,CMV启动子为hCMV启动子;在优选的实施方案中,hCMV启动子序列如SEQID NO:17所示。在一些实施方案中,CMV启动子为mCMV启动子;在优选的实施方案中,mCMV启动子序列如SEQ ID NO:19所示。
在优选的实施方案中,表达单元的表达调控元件选自人真核翻译延伸因子1α内含子(EF1a intron A)或其功能片段。在优选的实施方案中,EF1a intron A序列如SEQ IDNO:20所示。
在一些实施方案中,表达单元的终止子选自猴空泡病毒40聚腺苷化信号(SV40PolyA)、牛生长激素聚腺苷化信号(bGH PolyA)、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶聚腺苷化信号(HSV-tk PolyA),和兔β-珠蛋白聚腺苷化信号(RBG PolyA)。
在优选的实施方案中,表达单元的终止子选自牛生长激素聚腺苷化信号(BGHpoly(A)signal)。在优选的实施方案中,BGH poly(A)signal序列如SEQ ID NO:21所示。
在一些具体的实施方案中,本发明提供了一种生产由纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的方法,所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段,所述方法包括:
1)提供用于表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体,所述用于表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体包括纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,其中,纳米抗体融合蛋白表达单元包括启动子mCMV和表达调控元件EF1aintron A,J链蛋白表达单元包括启动子mCMV和任选存在地表达调控元件EF1aintron A;
2)通过所述表达载体在细胞中表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白;和
3)产生IgM抗体的五聚体。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白和/或J链蛋白的N端连接有信号肽。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:5或9所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6或10所示的核苷酸序列编码;J链蛋白的信号肽具有如SEQ IDNO:5、7或11所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6、8或12所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列编码,并且J链蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,表达载体在细胞中表达包括稳转表达和瞬转表达。在本发明的实施方案中,稳转表达是指细胞通过在基因组中稳定整合用于表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体进行表达,或者在基因组中稳定整合所述表达载体包含的纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元进行表达。
在一些实施方案中,所述细胞是哺乳动物细胞,优选地,所述哺乳动物细胞是CHO细胞、HEK293细胞或Vero细胞。
在一些实施方案中,Fc片段是人源IgM的Fc片段。在一些实施方案中,Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示或Fc片段由SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白是指通过基因工程手段将纳米抗体与Fc片段进行融合后形成的重组蛋白。在本发明的实施方案中,纳米抗体可以为单价纳米抗体(单条纳米抗体VHH)或多条纳米抗体VHH通过连接基连接形成的多价纳米抗体。
在一些实施方案中,纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示或纳米抗体由SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或所述纳米抗体融合蛋白由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,J链蛋白是人源IgM的J链蛋白。
在一些实施方案中,J链蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或所述J链蛋白由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1、约1:1至约9:1、约1:1至约8:1、约1:1至约7:1、约1:1至约6:1、约1:1至约5:1、约1:1至约4:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1。在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约2:1至约10:1、约2:1至约9:1、约2:1至约8:1、约2:1至约7:1、约2:1至约6:1、约2:1至约5:1、约2:1至约4:1、约2:1至约3:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约8:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约8:1至约10:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约5:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约4:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约4:1至约5:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约2:1。
在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1和约10:1。
在另一方面,提供了由第一方面所述的方法产生的IgM抗体,其中所述IgM抗体主要以五聚体的形式存在。
所述产生的IgM抗体中,五聚体的含量显著高于六聚体,从而无需进一步的分离纯化过程。
在再一方面,提供了融合蛋白和J链蛋白共表达在制备其形成的IgM抗体中的应用,所述融合蛋白包含Fc片段,所述融合蛋白和所述J链蛋白通过用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体在细胞中表达。在一些实施方案中,所述融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,融合蛋白选自纳米抗体融合蛋白,纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段。
在一些实施方案中,提供了纳米抗体融合蛋白和J链蛋白共表达在制备其形成的IgM抗体中的应用,所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段,所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白通过用于表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体在细胞中表达,其中,所述纳米抗体融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的表达强度等于J链蛋白的表达强度。在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的表达强度高于J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接。在优选的实施方案中,连接基为(GGGGS)m,其中,m=0、1、2、3或4。
在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体包括:分别表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的两个或更多个表达载体、表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体、或它们的组合。
在优选的实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为分别表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的两个表达载体。
在优选的实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体。
在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体包括纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,所述表达单元包括启动子、目的基因(编码序列)和任选存在的表达调控元件。在一些实施方案中,表达单元包括启动子、目的基因、终止子和任选存在的表达调控元件,彼此可操作地连接。在一些实施方案中,表达调控元件位于启动子和目的基因之间,与启动子和目的基因可操作地连接。
在优选的实施方案中,表达载体包括1个纳米抗体融合蛋白表达单元或1个J链蛋白表达单元;或者表达载体包括1个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元;或者表达载体包括2个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元。
在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为分别表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的两个表达载体,其中一个表达载体包括纳米抗体融合蛋白表达单元,另一个表达载体包括J链蛋白表达单元。在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体,该表达载体包括1个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元;或者包括2个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元。
在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白表达单元包括表达调控元件,并且J链蛋白表达单元包括表达调控元件;或者纳米抗体融合蛋白表达单元包括表达调控元件,并且J链蛋白表达单元不包括表达调控元件。
在一些实施方案中,表达载体还包括筛选标记表达单元。在一些实施方案中,筛选标记选自嘌呤霉素、新霉素、潮霉素B、杀稻瘟菌素、谷氨酰胺合成酶和二氢叶酸还原酶。在优选的实施方案中,筛选标记为人谷氨酰胺合成酶。
在一些实施方案中,表达载体还包括PiggyBac转座子的反向末端重复序列。
在一些实施方案中,表达单元的启动子选自单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)启动子、猴空泡病毒40(SV40)启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子。
在优选的实施方案中,表达单元的启动子选自CMV启动子或其功能片段;在一些可选的实施方案中,启动子的功能片段的特征在于其包含该启动子的最小核心启动子序列。在一些实施方案中,CMV启动子为hCMV启动子;在优选的实施方案中,hCMV启动子序列如SEQID NO:17所示。在一些实施方案中,CMV启动子为mCMV启动子;在优选的实施方案中,mCMV启动子序列如SEQ ID NO:19所示。
在优选的实施方案中,表达单元的表达调控元件选自人真核翻译延伸因子1α内含子(EF1a intron A)或其功能片段。在优选的实施方案中,EF1a intron A序列如SEQ IDNO:20所示。
在一些实施方案中,表达单元的终止子选自猴空泡病毒40聚腺苷化信号(SV40PolyA)、牛生长激素聚腺苷化信号(bGH PolyA)、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶聚腺苷化信号(HSV-tk PolyA),和兔β-珠蛋白聚腺苷化信号(RBG PolyA)。
在优选的实施方案中,表达单元的终止子选自牛生长激素聚腺苷化信号(BGHpoly(A)signal)。在优选的实施方案中,BGH poly(A)signal序列如SEQ ID NO:21所示。
在一些具体的实施方案中,提供了纳米抗体融合蛋白和J链蛋白共表达在制备其形成的IgM抗体中的应用,所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段,所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白通过用于表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体在细胞中表达,所述用于表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体包括纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,其中,纳米抗体融合蛋白表达单元包括启动子mCMV和表达调控元件EF1a intron A,J链蛋白表达单元包括启动子mCMV和任选存在地表达调控元件EF1a intron A。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白和/或J链蛋白的N端连接有信号肽。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:5或9所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6或10所示的核苷酸序列编码;J链蛋白的信号肽具有如SEQ IDNO:5、7或11所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6、8或12所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列编码;并且J链蛋白的信号肽具有如SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,表达载体在细胞中表达包括稳转表达和瞬转表达。在本发明的实施方案中,稳转表达是指细胞通过在基因组中稳定整合用于表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体进行表达,或者在基因组中稳定整合所述表达载体包含的纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元进行表达。
在一些实施方案中,所述细胞是哺乳动物细胞,优选地,所述哺乳动物细胞是CHO细胞、HEK293细胞或Vero细胞。
在一些实施方案中,Fc片段是人源IgM的Fc片段。在一些实施方案中,Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示或Fc片段由SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白是指通过基因工程手段将纳米抗体与Fc片段进行融合后形成的重组蛋白。在本发明的实施方案中,纳米抗体可以为单价纳米抗体(单条纳米抗体VHH)或多条纳米抗体VHH通过连接基连接形成的多价纳米抗体。
在一些实施方案中,纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示或所述纳米抗体由SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或纳米抗体融合蛋白由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,J链蛋白是人源IgM的J链蛋白。
在一些实施方案中,J链蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或所述J链蛋白由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1、约1:1至约9:1、约1:1至约8:1、约1:1至约7:1、约1:1至约6:1、约1:1至约5:1、约1:1至约4:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1。在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约2:1至约10:1、约2:1至约9:1、约2:1至约8:1、约2:1至约7:1、约2:1至约6:1、约2:1至约5:1、约2:1至约4:1、约2:1至约3:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约8:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约8:1至约10:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约5:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约4:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约4:1至约5:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约2:1。
在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1和约10:1。
在再一方面,本发明提供用于本发明的方法或应用的表达载体,其包含融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元。在一些实施方案中,所述融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,融合蛋白选自纳米抗体融合蛋白,纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段。
在一些实施方案中,本发明提供用于本发明的方法或应用的表达载体,其包含纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,其中所述纳米抗体融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,提供了一种用于表达本发明所述的纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的表达载体,其包含纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,其中所述纳米抗体融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的表达强度等于J链蛋白的表达强度。在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的表达强度高于J链蛋白的表达强度。
在一些实施方案中,纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接。在优选的实施方案中,连接基为(GGGGS)m,其中,m=0、1、2、3或4。
在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的表达载体包括:分别表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的两个或更多个表达载体、表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体、或它们的组合。
在优选的实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为分别表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的两个表达载体。
在优选的实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体。
在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的表达载体包括纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,所述表达单元包括启动子、目的基因和任选存在的表达调控元件。在一些实施方案中,表达单元包括启动子、目的基因、终止子和任选存在的表达调控元件,彼此可操作地连接。在一些实施方案中,表达调控元件位于启动子和目的基因之间,与启动子和目的基因可操作地连接。
在优选的实施方案中,表达载体包括1个纳米抗体融合蛋白表达单元或1个J链蛋白表达单元;或者表达载体包括1个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元;或者表达载体包括2个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元。
在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的表达载体为分别表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的两个表达载体,其中一个表达载体包括纳米抗体融合蛋白表达单元,另一个表达载体包括J链蛋白表达单元。在一些实施方案中,用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达载体为表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白两者的单个表达载体,该表达载体包括1个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元;或者包括2个纳米抗体融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元。
在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白表达单元包括表达调控元件,并且J链蛋白表达单元包括表达调控元件;或者纳米抗体融合蛋白表达单元包括表达调控元件,并且J链蛋白表达单元不包括表达调控元件。
在一些实施方案中,表达载体还包括筛选标记表达单元。在一些实施方案中,筛选标记选自嘌呤霉素、新霉素、潮霉素B、杀稻瘟菌素、谷氨酰胺合成酶和二氢叶酸还原酶。在优选的实施方案中,筛选标记为人谷氨酰胺合成酶。
在一些实施方案中,表达载体还包括PiggyBac转座子的反向末端重复序列。
在一些实施方案中,表达单元的启动子选自单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)启动子、猴空泡病毒40(SV40)启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子。
在优选的实施方案中,表达单元的启动子选自CMV启动子或其功能片段;在一些可选的实施方案中,启动子的功能片段的特征在于其包含该启动子的最小核心启动子序列。在一些实施方案中,CMV启动子为hCMV启动子;在优选的实施方案中,hCMV启动子序列如SEQID NO:17所示。在一些实施方案中,CMV启动子为mCMV启动子;在优选的实施方案中,mCMV启动子序列如SEQ ID NO:19所示。
在优选的实施方案中,表达单元的表达调控元件选自人真核翻译延伸因子1α内含子(EF1a intron A)或其功能片段。在优选的实施方案中,EF1a intron A序列如SEQ IDNO:20所示。
在一些实施方案中,表达单元的终止子选自猴空泡病毒40聚腺苷化信号(SV40PolyA)、牛生长激素聚腺苷化信号(bGH PolyA)、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶聚腺苷化信号(HSV-tk PolyA),和兔β-珠蛋白聚腺苷化信号(RBG PolyA)。
在优选的实施方案中,表达单元的终止子选自牛生长激素聚腺苷化信号(BGHpoly(A)signal)。在优选的实施方案中,BGH poly(A)signal序列如SEQ ID NO:21所示。
在一些具体的实施方案中,提供了一种用于表达本发明所述的纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的表达载体,其包含纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,其中,纳米抗体融合蛋白表达单元包括启动子mCMV和表达调控元件EF1a intron A,J链蛋白表达单元包括启动子mCMV和任选存在地表达调控元件EF1a intron A。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白和/或J链蛋白的N端连接有信号肽。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:5或9所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6或10所示的核苷酸序列编码;J链蛋白的信号肽具有如SEQ IDNO:5、7或11所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6、8或12所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列编码,并且J链蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,Fc片段是人源IgM的Fc片段。在一些实施方案中,Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示或Fc片段由SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白是指通过基因工程手段将纳米抗体与Fc片段进行融合后形成的重组蛋白。在本发明的实施方案中,纳米抗体可以为单价纳米抗体(单条纳米抗体VHH)或多条纳米抗体VHH通过连接基连接形成的多价纳米抗体。
在一些实施方案中,纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示或纳米抗体由SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或所述纳米抗体融合蛋白由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,J链蛋白是人源IgM的J链蛋白。
在一些实施方案中,J链蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或所述J链蛋白由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1、约1:1至约9:1、约1:1至约8:1、约1:1至约7:1、约1:1至约6:1、约1:1至约5:1、约1:1至约4:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1。在一些实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约2:1至约10:1、约2:1至约9:1、约2:1至约8:1、约2:1至约7:1、约2:1至约6:1、约2:1至约5:1、约2:1至约4:1、约2:1至约3:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约8:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约8:1至约10:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约5:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约4:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约4:1至约5:1。在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约2:1。
在优选的实施方案中,纳米抗体融合蛋白和J链蛋白的表达强度之比为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1和约10:1。
在再一方面,提供了一种转化的或者转染的细胞,其包含本发明所述的表达载体或者包含本发明所述的表达载体包含的融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元。在一些实施方案中,提供一种转化的或者转染的细胞,其包含本发明所述的用于表达融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的表达载体或者包含所述表达载体包含的融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元。
在一些实施方案中,提供了一种转化的或者转染的细胞,其包含本发明所述的表达载体或者包含本发明所述的表达载体包含的纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元。在一些实施方案中,提供一种转化的或者转染的细胞,其包含本发明所述的用于表达纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的表达载体或者包含所述表达载体包含的纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元。
在一些实施方案中,细胞的基因组中稳定整合用于表达所述纳米抗体融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体,或者稳定整合所述表达载体包含的纳米抗体融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域的文献所描述的技术或条件或者按照产品、仪器说明书进行。所有试剂或仪器注明生产商者,均可以市购。
实施例1:用于由纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的双表达载体的构建及表达
本实施例中涉及的DNA序列均由苏州金唯智生物科技有限公司(简称苏州金唯智)合成。宿主细胞CHO-K1Q(购自中山康天晟合生物技术有限公司,简称康晟生物)。细胞培养用到的CD CHO Fusion培养基、CD02G4培养基(CD02G4=CD02+4mM L-Glutamine)、CD02M25培养基(CD02M25=CD02+25μM MSX)购自康晟生物,cell boost 7a和cell boost 7b补料培养基购自HyClone公司。所使用的限制性内切酶购自Thermo fisher,T4 DNA连接酶购自Invitrogen。
1.1双表达载体的构建
由纳米抗体融合蛋白(本文中称为重链或H链)和J链形成的IgM抗体的表达通过两个载体(双载体)实现,这两个载体分别表达H链和J链,H链和J链的不同表达强度可以通过控制转染宿主细胞时H链表达载体和J链表达载体的转染比例来实现。
H链是序列如SEQ ID NO:1所示的纳米抗体融合蛋白R14-Fc,其编码序列为SEQ IDNO:2,J链是如SEQ ID NO:3所示的人源IgM抗体的J链,其编码序列为SEQ ID NO:4。
首先通过基因合成的方式在纳米抗体融合蛋白R14-Fc的编码序列SEQ ID NO:2的5’端连接pASH信号肽(SEQ ID NO:5)的编码序列(SEQ ID NO:6),在J链的编码序列SEQ IDNO:4的5’端连接pASH信号肽的编码序列(SEQ ID NO:6)或J链信号肽1(SEQ ID NO:7)的编码序列(SEQ ID NO:8)。通过酶切连接(HindIII和EcoRI酶)的方式将上述三条序列分别构建入pASH-2-1载体中(pASH-2-1质粒载体图谱如图2所示,其中目的基因表达单元包含hCMV启动子(SEQ ID NO:17)及终止子SV40 polyA signal(SEQ ID NO:18)),测序筛选得到无任何突变发生的H链表达载体pASH-H和J链表达载体pASH-J-1(连接J链信号肽1)及pASH-J-2(连接pASH信号肽)。
1.2细胞株构建及培养
1)宿主细胞复苏及传代
取1管冻存的CHO-K1Q细胞于37℃水浴锅中进行复苏,待溶解后将细胞转移到含有10ml CD02G4培养基的50ml细胞培养管中进行至少3次传代培养使其生长状态恢复至活率大于95%,为稳转做准备。
CHO-K1Q宿主细胞传代策略为:可按照1.3×105cells/mL的接种密度每3天传代一次或按照0.6×105cells/mL的密度接种每4天传代一次。传代培养基为CD02G4培养基。
2)稳定表达细胞池转染
CHO-K1Q宿主细胞用CD02G4培养基每1~3天传代一次,并用Countstar BioTech(Countstar)细胞计数及活率分析仪测定细胞活率和活细胞密度。转染时,每个转染取1.0×107个细胞,200g离心5分钟,去除上清后使用400μL CD CHO Fusion培养基重悬细胞,将所获得的H链及J链表达载体以不同的转染比例(表1)加入到宿主细胞CHO-K1Q悬液中,按照每107个细胞转染30μg质粒的量加入质粒,同时按照每107个细胞3ug的量加入Amigo促转染试剂,混匀以后全部转移到电转杯中,使用电穿孔仪进行电转。
电转后,将转染的细胞转移到内含10mL预热的CD02G4培养基的摇管中,将摇管放置在摇床内培养,培养条件设置为:温度36.5℃,湿度80%,6% CO2,转速200转/分。
3)稳定表达细胞池加压筛选
每个转染的细胞为一个稳定细胞群。转染24小时后,将细胞200×g离心5分钟,去除上清后用10mL预热的CD02M25培养基重悬细胞,放回摇床进行压力培养,每2~4天传代一次,进行稳定转染细胞群筛选。
稳定细胞群传代所用的新鲜培养基为CD02M25。加压筛选的培养条件为温度36.5℃,湿度85%,5% CO2,转速200转/分。
4)稳定表达细胞池补料批培养
稳定细胞群用批次补料培养进行评估。具体地,将细胞通过稀释以0.5×106细胞/mL的密度接种至含CD02M25培养基的50mL摇管中,每个细胞池接种1管,分别命名为KLY-POOL1至KLY-POOL6(表1),置于温度36.5℃,湿度85%,5% CO2,转速200转/分的摇床中进行14天补料批培养。补料策略为:接种当天视为第0天,从第3天开始补料(3% V/V cellboost 7a及0.3% V/V cell boost 7b补料液)。每天进行细胞计数和活率分析(见图3)。
表1:各细胞池的表达载体转染用量
第14天,收获的培养液上清测定IgM抗体的表达量(尺寸排阻色谱柱SEC-HPLC检测)。H链与J链的不同表达强度比例实现的IgM抗体表达量的结果如表2所示,KLY-POOL1至KLY-POOL6在第14天的表达量分别为7.9、6.5、4.3、6.6、5.1及2.5g/L。补料批培养过程中的细胞活率如图3所示。令人意外的是,对于H链与J链表达强度之比为10:1的细胞池(本领域技术人员会了解,根据IgM抗体的结构,H链与J链表达强度为10:1理论上应为最优比例),收获培养液上清时(第14天)细胞活率过低,这将导致上清中毒性物质的增加,影响产品质量。
表2:双载体IgM稳定表达细胞池补料批培养时的表达量
实施例2:用于由纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的单表达载体的构建
本实施例中涉及的DNA序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;所使用的质粒提取和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自OMEGA,并按照说明书进行规范操作;所使用的限制性内切酶购自Thermo fisher,T4 DNA连接酶购自Invitrogen。本实施例中的宿主细胞CHO K1购自美国Merck公司。
发明人构建了不同的单表达载体以探索纳米抗体融合蛋白(重链或H链)表达单元与J链蛋白表达单元在单表达载体中的表达强度对形成的IgM抗体的表达量和IgM抗体中五聚体的比例的影响。
2.1表达强度H链:J链=1:1的表达载体的构建
由纳米抗体融合蛋白(H链)和J链形成的IgM抗体的表达通过单载体实现。H链是序列如SEQ ID NO:1所示的纳米抗体融合蛋白R14-Fc,其编码序列为SEQ ID NO:2,J链是如SEQ ID NO:3所示的人源IgM抗体的J链,其编码序列为SEQ ID NO:4。所有DNA编码序列均合成产生。
使用pAPO双框载体,实现两个表达框的表达强度为1:1。载体元件信息如表3所示。pAPO质粒载体元件包含两个表达单元,每个表达单元包含mCMV启动子(SEQ ID NO:19)、内含子EF1a intron A(SEQ ID NO:20)和终止子BGH poly(A)signal(SEQ ID NO:21)。
首先以基因合成的方式在R14-Fc融合蛋白的编码序列SEQ ID NO:2的5’端连接H链信号肽(SEQ ID NO:9)的编码序列SEQ ID NO:10。通过酶切连接(Hind III和BamH I酶)的方式将其构建入pAPO双框载体。然后将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞Trans 5α(购自TransGene Biotech),筛选阳性克隆并提取重组质粒进行测序,得到无任何突变发生的pAPO-MR14-HC-2重组载体。
通过基因合成的方式在人源IgM抗体的J链的编码序列SEQ ID NO:4的5’端连接J链信号肽2(SEQ ID NO:11)的编码序列(SEQ ID NO:12)。通过酶切连接(EcoR I和Xba I)的方式将其构建入重组载体pAPO-MR14-HC-2中,将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞Trans5α,经阳性克隆筛选及重组质粒测序得到无任何突变发生的IgM表达载体pAPO-MR14-1。pAPO-MR14-1表达载体图谱如图4所示,包含有H链信号肽、纳米抗体融合蛋白R14-Fc、J链信号肽2及J链的编码序列。
2.2表达强度H链:J链=4-5:1的表达载体构建
使用pAPL质粒载体构建H链:J链=4-5:1的表达载体。质粒载体的元件信息如表3所示。申请人通过使用pAPL质粒载体中的两个表达单元(包含mCMV启动子和BGH poly(A)signal终止子),并通过在H链表达单元的mCMV启动子与H链表达基因之间插入EF1a intronA元件,在J链表达单元的mCMV启动子与J链表达基因之间不插入EF1aintron A元件,实现H链与J链4-5:1的表达强度。
按照1.1中所述操作,在5’端连接H链信号肽的R14-Fc融合蛋白编码序列上下游分别引入酶切位点EcoRI和XmaJI,在5’端连接J链信号肽2的J链编码序列的上下游分别引入酶切位点MunI和XbaI,将纳米抗体融合蛋白(连接有H链信号肽)和J链(连接有J链信号肽2)依次构建入pAPL载体中,经阳性克隆筛选及重组质粒测序分别获得无任何突变发生的IgM重组表达载体:pAPL-MR14-5。pAPL-MR14-5表达载体图谱如图4所示,包含H链信号肽、纳米抗体融合蛋白R14-Fc、J链信号肽2及J链的编码序列。
2.3表达强度H链:J链=8-10:1的表达载体构建
使用pAPL质粒载体构建H链:J链=8-10:1的表达载体。质粒载体的元件信息如表3所示。申请人通过使用pAPL表达载体中的三个表达单元(包含mCMV启动子和BGH poly(A)signal终止子),并通过在两个H链表达单元的mCMV启动子与H链表达基因之间插入EF1aintron A元件,在J链表达单元的mCMV启动子与J链表达基因之间不插入EF1a intron A元件,实现H链与J链8-10:1的表达强度。
按照1.1中所述操作,在5’端连接H链信号肽的R14-Fc融合蛋白编码序列上下游分别引入酶切位点Hind III和BamH I,并将其构建入1.2中获得的pAPL-MR14-5载体中,经阳性克隆筛选及重组质粒测序分别获得无任何突变发生的IgM重组表达载体:pAPL-MR14-10。pAPL-MR14-10表达载体图谱如图4所示,包含H链信号肽、纳米抗体融合蛋白R14-Fc、J链信号肽2及J链的编码序列。
本实施例构建的由纳米抗体融合蛋白和J链形成的IgM抗体的单重组表达载体的信息总结在表4中。
表3:pAPO及pAPL质粒载体元件信息
表4:单表达载体及构建信息
实施例3:用于稳定表达纳米抗体融合蛋白和J链形成的IgM抗体的细胞株构建及培养表达
依据如下方式使用CHO-K1(CHO K1,来自美国Merck公司)细胞进行稳定细胞株的转染、表达及筛选,转染方式为化学试剂PEI转染。用于细胞传代及补料批培养的EX-CELL CD CHO Fusion、EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium培养基,L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)和L-谷氨酰胺溶液均购自Sigma公司,转染用培养基Hycell TransFx-C及补料液cell boost 7a和cell boost 7b均购自HyClone公司。
3.1细胞复苏及传代
取一支冻存的CHO-K1细胞于37℃水浴锅中进行复苏,待溶解后将细胞转移到含有10ml EX-CELL CD CHO Fusion(含4mM L-谷氨酰胺)培养基的50ml细胞培养管中进行至少3次传代培养使其生长状态恢复至活率大于95%。
细胞传代策略为:每3天传代1次,接种活细胞密度为0.5×106细胞/mL,培养体积为10mL,培养条件为180RPM,振摇直径为50mm,培养箱设置为5% CO2,85%湿度。培养基为EX-CELL CD CHO Fusion(含4mM L-谷氨酰胺)培养基。
3.2稳定表达细胞池转染
待宿主细胞复苏恢复至少3代后,移取一定体积的处于对数生长期的细胞至50mL细胞培养管中,200g离心5min。弃去离心上清,将细胞沉淀用适量转染培养基HyCellTransFx-C重悬,重悬后分装在6个细胞培养管中。按照每106个细胞转染1μg质粒的量加入质粒,并按照PEI转染试剂与质粒2:1的比例加入PEI试剂,快速混匀,完成转染后将细胞培养管放入摇床中,分别命名为细胞池1-细胞池3(POOL1-POOL3)(表5)。转染后一小时补加EX-CELL CD CHO Fusion(含4mM L-谷氨酰胺)继续培养。培养条件为37℃,5% CO2,85%湿度,180rpm。
表5:稳定表达细胞池转染
细胞池 | 质粒表达载体 |
POOL1 | pAPO-MR14-1 |
POOL2 | pAPL-MR14-5 |
POOL3 | pAPL-MR14-10 |
3.3稳定表达细胞池加压筛选
转染48h后用含25μM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的EX-CELL CD CHO Fusion培养基对转染后的细胞进行压力筛选。根据细胞情况进行传代,保持细胞密度在0.5×106细胞/mL以上,加压筛选直至活率恢复到大于95%,之后撤去压力使用EX-CELL CD CHO Fusion培养基继续进行细胞池传代培养。
加压筛选传代策略为:每3天传代1次,接种活细胞密度为0.5×106细胞/mL,培养体积为10mL,培养条件为180RPM,振摇直径为50mm,培养箱设置为5% CO2,85%湿度。培养基为含25μM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的EX-CELL CD CHO Fusion培养基。
3.4稳定表达细胞的目的基因表达强度荧光定量PCR分析
荧光定量PCR相对表达定量方法中最常用的方法是2-ΔΔCT法(Livak法),利用内参进行均一化进而得到目的基因的相对表达水平的方法:通过qPCR获得目的基因和管家基因在不同样本中的CT值,以管家基因的CT值为依据对目的基因进行差值校正,最终求得相对表达水平。本实施例利用2-ΔΔCT法,对稳定表达细胞H链和J链表达强度进行qPCR分析。根据H链和J链及管家基因(human-β-actin)序列设计引物(SEQ ID NO:22-27)。所用到的HiScript III RT SuperMix for qPCR试剂盒购自Vazyme(诺唯赞),PowerUp SYBR GreenMaster Mix试剂盒购自Thermo Fisher,样本为来自POOL1和POOL2的细胞,步骤如下:
1)提取样本总RNA:采用TRIzoL法进行样本RNA提取。
2)RNA质量检测:使用ND-2000测定样本的RNA浓度和纯度。质量测定:先将RNA稀释到一定的浓度后,再通过全自动核酸电泳分析仪Bioanalyzer 2200对RNA进行质量检测,主要看RNA的RIN值来判断完整性。
3)逆转录合成cDNA:
a.将模板RNA在冰上解冻;4×gDNA wiper Mix、5×HiScript III qRT SuperMix和RNase-free ddH2O在室温(15-25℃)条件下解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀,简短离心以收集残留在管壁的液体。
b.按照下表的体系在冰浴的无核酸酶的离心管中配制混合液,并用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2min。
模板RNA | 1μg Total RNA |
4×gDNA wiper Mix | 4μl |
RNase free H2O | 补充至16μl |
c.在上述反应液的基础上继续加入下表所列的反转录组分:
上述反应液 | 16μl |
5×HiScript III qRT SuperMix | 4μl |
总体积 | 20μl |
d.将上述反应液先在37℃下孵育15min,然后85℃孵育5sec终止反应,置于冰上进行后续实验或冷冻保存。
4)Real Time PCR样本检测
a.将所有cDNA样品10倍稀释后分别配置Real Time PCR反应体系。体系配置如下:
2×Master Mix | 5μl |
Primer F | 0.2μl |
Primer R | 0.2μl |
加水至总体积为 | 9μl |
轻弹管底将溶液混合,5000rpm短暂离心。
b.加样:将9μl混合液加到384-PCR板对应的每个孔中,再加入对应的1μl cDNA,小心粘上Sealing Film封口膜,并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。
c.将上述384-PCR板置于Real Time PCR仪上进行PCR反应。设置PCR反应程序如下:
并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)。
d.各样品的目的基因和内参分别进行Real Time PCR反应,每个样本检测3个复孔。数据采用2-△△CT法进行分析。
其中,在同一个样本中:
ΔCT1=目的基因1CT-参比基因CT
ΔCT2=目的基因2CT-参比基因CT
ΔΔCT=基因1的ΔCT-基因2的ΔCT
基因1与基因2的表达强度比值=2-ΔΔCT
来自POOL1和POOL2的细胞样本中H链与J链的表达强度结果如表6所示。
表6:H:J表达强度荧光定量PCR分析结果
结果显示,POOL1细胞中H链和J链使用相同启动子和表达调控元件等进行表达,H链和J链表达强度相当(约1:1)。POOL2中H链表达单元的启动子和目的基因之间插入表达调控元件进行增强表达,J链表达单元未使用表达调控元件增强表达,实现了H链和J链的表达强度之比为约4-5:1。为进一步实现更高的H:J比例至8-10:1,可通过增加H链表达单元的拷贝数实现。
3.5稳定表达细胞池补料批培养
移取一定体积的3)中传代的细胞于50mL细胞培养管中,200g离心5min,使用EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium培养基重悬细胞,传代1次后,进行细胞池补料批接种。
将细胞通过稀释以0.5×106细胞/mL的密度接种至含EX-CELL Advanced CHOFed-batch Medium培养基的50mL摇管中,每个细胞池接种1管,分别命名为FBPOOL1-FBPOOL3,置于37℃,140rpm,5% CO2,湿度85%摇床中进行14天补料批培养。补料策略为:接种当天视为第0天,从第3天开始补料(3% V/V cell boost 7a,0.3%V/V cell boost7b补料)。
3.6稳定表达细胞池补料批培养的表达量测定
待上述各个细胞池的补料批培养结束后,取上清进行IgM抗体表达量检测(Octet分子相互作用仪检测)。具体实施方法为,取细胞池FBPOOL1-FBPOOL3的补料批培养上清各200ul,稀释50倍后,在Octet仪器上按照每孔200ul上样,并使用ProA sensor进行检测记录。
结果如表7所示,FBPOOL1-FBPOOL3的补料批培养第14天表达量分别为2.32g/L,5.73g/L,6.19g/L。申请人通过不同表达单元在单载体中构建的H链与J链的不同表达强度比例(H:J=1:1、4-5:1和8-10:1),实现了与在双载体表达中对应的H链与J链的表达强度比例相一致的IgM抗体表达量(参见表2和表7中的结果)。另外,在FBPOOL1中,H链和J链表达单元均使用EF1a intron A表达调控元件增强表达(提高表达强度4-5倍);在FBPOOL2中,仅H链表达单元使用EF1a intron A表达调控元件增强表达,J链表达单元为基础表达强度;也就是说,在FBPOOL1的基础上(H:J=1:1),进一步降低J链表达强度数倍,反而实现了IgM抗体表达量的显著提高(2倍),这是完全令人预料不到的,表明H链和J链的相对表达强度对于IgM抗体高表达量更重要,J链表达强度需要等于或者低于H链的表达强度。
实施例4:稳定表达细胞池补料批培养产生的IgM抗体五聚体和六聚体分析
待实施例3各个细胞池的补料批培养结束后,取上清通过Native-PAGE进行初步的蛋白纯度检测以及五聚体和六聚体分析。
Native-PAGE使用15孔小型蛋白预制胶(型号为NativePAGETM3-12%,Bis-Tris,1.0mm,购自ThermoFisher),样品上样量为2μg。使用220V电压电泳95min后取出凝胶。用滤纸将预制胶置于蛋白快速染色系统(金斯瑞,EStainTM L1)样品板的中央,合上样品板后迅速将样品板放入蛋白快速染色系统染脱色通道,按照染脱色仪的既定流程进行一体化染脱色。之后将预制胶置于凝胶成像仪中拍照留存。
Native-PAGE结果如图5所示,其中,SF-MR14为本发明的IgM五聚体标准品,SS-MR14为不含J链的IgM六聚体对照细胞池。可根据电泳条带的位置确定五聚体与六聚体。
表7:稳定表达细胞池补料批培养表达量
质粒名称 | 补料批细胞池编号 | 第14天IgM抗体表达量(g/L) |
pAPO-MR14-1 | FBPOOL1 | 2.32 |
pAPL-MR14-5 | FBPOOL2 | 5.73 |
pAPL-MR14-10 | FBPOOL3 | 6.19 |
结果显示(参见表7和图5),H链与J链表达强度为约1:1至约4-5:1时可几乎不产生六聚体条带;H链与J链的表达强度为约4-5:1时五聚体表达量达最高水平。令人意外地是,H链与J链的表达强度为约8-10:1时(本领域技术人员会了解,根据IgM抗体的结构,H链与J链表达强度为10:1理论上应为最优比例),IgM抗体表达量基本不再提高,但IgM六聚体的比例显著增加。
所使用的序列
SEQ ID NO:1R14-Fc
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTSYADSVKGR
FTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAATPATYYSGRYYYQCPAGGMDYWGQGTQVTVSSVIA
ELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPT
TYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLT
CLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLP
SPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVT
SAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMS
DTAGTCY
SEQ ID NO:2R14-Fc的编码序列
CAGGTGCAACTGCAGGAATCCGGCGGAGGGTTAGTCCAACCAGGCGGCAGTCTACGTCTATCGT
GCGCGGTCTCCGGTTTTACCCTAGACTATTACGCGATTGGATGGTTTCGCCAAGCACCCGGAAAG
GAACGGGAGGGCGTTTCGTGCATTAGTTCCAGTGATGGGAGCACTTCATACGCCGATAGCGTAAA
GGGCAGATTCACCATTAGCAGGGACAACGCAAAAAACACCGTGTATTTGCAAATGAACTCACTG
AAACCCGAGGACACAGCTTTGTATTACTGTGCCGCTACACCAGCCACGTATTACAGCGGAAGATA
TTACTATCAATGCCCTGCCGGTGGCATGGATTACTGGGGGCAGGGAACTCAAGTGACCGTGTCGA
GCGTCATTGCTGAACTTCCCCCCAAGGTGTCCGTCTTTGTACCGCCTCGGGACGGCTTCTTCGGT
AATCCCAGGAAATCCAAACTTATTTGCCAGGCGACCGGATTTTCTCCCCGGCAGATTCAGGTTTCT
TGGCTACGCGAGGGCAAGCAGGTAGGTAGTGGTGTCACTACCGATCAGGTGCAGGCCGAAGCTA
AAGAATCAGGGCCCACTACATATAAGGTGACATCTACACTTACTATCAAAGAGTCAGATTGGCTG
GGCCAGTCTATGTTTACGTGCCGCGTGGACCATCGGGGACTTACTTTTCAGCAGAATGCATCCTCA
ATGTGCGTACCCGATCAGGATACCGCAATACGAGTTTTCGCCATCCCTCCCAGCTTCGCCTCCATA
TTCCTTACTAAGTCTACAAAGCTGACGTGTCTCGTTACCGACCTCACAACTTACGACAGTGTCAC
CATCTCCTGGACGAGGCAGAACGGCGAGGCTGTGAAAACCCATACAAACATCTCAGAATCTCAT
CCGAACGCCACCTTCTCCGCGGTAGGAGAGGCAAGTATCTGTGAGGACGACTGGAATAGTGGAG
AGCGCTTCACTTGTACCGTCACGCACACCGACCTGCCATCTCCATTAAAACAGACAATTAGTCGT
CCAAAGGGCGTCGCTCTCCACAGACCAGACGTTTACCTTCTGCCACCCGCCCGCGAGCAGCTGA
ACTTAAGAGAGTCTGCTACCATCACATGTCTCGTAACAGGGTTCAGCCCTGCTGATGTCTTCGTAC
AGTGGATGCAGAGGGGTCAGCCACTGTCCCCTGAGAAGTACGTCACTTCAGCTCCAATGCCAGA
ACCTCAGGCACCTGGGAGATATTTCGCCCACAGCATCCTGACAGTCAGTGAGGAAGAGTGGAAC
ACTGGGGAAACATATACATGCGTTGTGGCCCATGAAGCACTGCCTAATAGGGTGACTGAGCGAAC
CGTGGATAAGAGTACTGGTAAGCCTACACTGTATAATGTGTCACTGGTGATGTCCGATACCGCAGG
CACATGTTAC
SEQ ID NO:3J链
QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKK
CDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
SEQ ID NO:4J链的编码序列
CAAGAAGATGAGCGCATAGTACTTGTAGACAACAAATGTAAATGTGCGCGAATTACGTCGCGTAT
CATCCGCTCTAGTGAAGATCCAAACGAAGATATTGTCGAAAGGAATATTAGGATTATCGTCCCTCT
GAACAATCGGGAAAATATCTCTGATCCAACATCTCCTTTGCGGACCAGATTCGTGTATCACCTCTC
CGACCTGTGTAAAAAGTGCGATCCAACCGAAGTGGAGTTGGATAACCAGATCGTGACCGCAACA
CAGAGTAACATCTGTGACGAAGACTCAGCTACTGAGACTTGCTATACCTACGACAGAAATAAGTG
CTACACAGCCGTGGTGCCTCTGGTGTACGGAGGTGAGACCAAGATGGTGGAGACTGCCCTCACT
CCCGACGCCTGCTATCCCGAC
SEQ ID NO:5pASH信号肽
MTRLTVLALLAGLLASSRA
SEQ ID NO:6pASH信号肽的编码序列
ATGACCCGTCTGACCGTGCTGGCGCTGCTGGCGGGCCTGCTGGCGAGCAGCCGTGCG
SEQ ID NO:7J链信号肽1
MKNHLLFWGVLAVFIKAVHVKA
SEQ ID NO:8J链信号肽1的编码序列
ATGAAGAATCATCTGTTATTCTGGGGAGTACTCGCAGTTTTTATCAAGGCGGTGCACGTGAAGGC
A
SEQ ID NO:9重链信号肽
MGSQVHLLSFLLLWISDTRA
SEQ ID NO:10重链信号肽的编码序列
ATGGGGAGCCAAGTGCACTTGCTCAGCTTCCTACTGTTATGGATTTCAGACACCCGGGCC
SEQ ID NO:11J链信号肽2
MCPARSLLLVATLVLLDHLSLA
SEQ ID NO:12J链信号肽2的编码序列
ATGTGCCCGGCTCGATCCCTGCTGTTAGTTGCAACTCTAGTTTTGCTCGACCATTTGAGCCTTGCT
SEQ ID NO:13R14
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTSYADSVKGR
FTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAATPATYYSGRYYYQCPAGGMDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:14R14的编码序列
CAGGTGCAACTGCAGGAATCCGGCGGAGGGTTAGTCCAACCAGGCGGCAGTCTACGTCTATCGT
GCGCGGTCTCCGGTTTTACCCTAGACTATTACGCGATTGGATGGTTTCGCCAAGCACCCGGAAAG
GAACGGGAGGGCGTTTCGTGCATTAGTTCCAGTGATGGGAGCACTTCATACGCCGATAGCGTAAA
GGGCAGATTCACCATTAGCAGGGACAACGCAAAAAACACCGTGTATTTGCAAATGAACTCACTG
AAACCCGAGGACACAGCTTTGTATTACTGTGCCGCTACACCAGCCACGTATTACAGCGGAAGATA
TTACTATCAATGCCCTGCCGGTGGCATGGATTACTGGGGGCAGGGAACTCAAGTGACCGTGTCGA
GC
SEQ ID NO:15Fc
VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKES
GPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKST
KLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHT
DLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEK
YVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLV
MSDTAGTCY
SEQ ID NO:16Fc的编码序列
GTCATTGCTGAACTTCCCCCCAAGGTGTCCGTCTTTGTACCGCCTCGGGACGGCTTCTTCGGTAAT
CCCAGGAAATCCAAACTTATTTGCCAGGCGACCGGATTTTCTCCCCGGCAGATTCAGGTTTCTTG
GCTACGCGAGGGCAAGCAGGTAGGTAGTGGTGTCACTACCGATCAGGTGCAGGCCGAAGCTAAA
GAATCAGGGCCCACTACATATAAGGTGACATCTACACTTACTATCAAAGAGTCAGATTGGCTGGG
CCAGTCTATGTTTACGTGCCGCGTGGACCATCGGGGACTTACTTTTCAGCAGAATGCATCCTCAAT
GTGCGTACCCGATCAGGATACCGCAATACGAGTTTTCGCCATCCCTCCCAGCTTCGCCTCCATATT
CCTTACTAAGTCTACAAAGCTGACGTGTCTCGTTACCGACCTCACAACTTACGACAGTGTCACCA
TCTCCTGGACGAGGCAGAACGGCGAGGCTGTGAAAACCCATACAAACATCTCAGAATCTCATCC
GAACGCCACCTTCTCCGCGGTAGGAGAGGCAAGTATCTGTGAGGACGACTGGAATAGTGGAGAG
CGCTTCACTTGTACCGTCACGCACACCGACCTGCCATCTCCATTAAAACAGACAATTAGTCGTCC
AAAGGGCGTCGCTCTCCACAGACCAGACGTTTACCTTCTGCCACCCGCCCGCGAGCAGCTGAAC
TTAAGAGAGTCTGCTACCATCACATGTCTCGTAACAGGGTTCAGCCCTGCTGATGTCTTCGTACAG
TGGATGCAGAGGGGTCAGCCACTGTCCCCTGAGAAGTACGTCACTTCAGCTCCAATGCCAGAAC
CTCAGGCACCTGGGAGATATTTCGCCCACAGCATCCTGACAGTCAGTGAGGAAGAGTGGAACAC
TGGGGAAACATATACATGCGTTGTGGCCCATGAAGCACTGCCTAATAGGGTGACTGAGCGAACCG
TGGATAAGAGTACTGGTAAGCCTACACTGTATAATGTGTCACTGGTGATGTCCGATACCGCAGGCA
CATGTTAC
SEQ ID NO:17hCMV启动子序列
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATG
GAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCC
ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATG
GGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCC
CCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGA
CTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAG
TACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGT
CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCC
CATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT
SEQ ID NO:18SV40 polyA signal
AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAA
GCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
SEQ ID NO:19mCMV启动子
TGGCACGTATACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGG
GTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGT
TTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACAT
AAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCC
ACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGC
TGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAA
AACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTG
CGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACC
GTAGAACGCAGA
SEQ ID NO:20EF1a intron A
GTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTG
AATTACTTCCACGCCCCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGG
TGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGC
CTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGAT
AAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTT
GTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGG
CCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGG
ACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCC
CGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCC
CGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTC
ACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTAC
CGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGG
GGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCT
TGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGC
CTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG
SEQ ID NO:21BGH poly(A)signal
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAG
GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTC
ATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAG
GCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
SEQ ID NO:22HC-Primer F
GAATCTCATCCGAACGCCAC
SEQ ID NO:23HC-Primer R
TACAAGTGAAGCGCTCTCCA
SEQ ID NO:24JC-Primer F
TCGTCCCTCTGAACAATCGG
SEQ ID NO:25JC-Primer R
CTTCGGTTGGATCGCACTTT
SEQ ID NO:26β-actin-Primer F
CCCTGGAGAAGAGCTACGAG
SEQ ID NO:27β-actin-Primer R
AGGTAGTTTCGTGGATGCCA
尽管已参考某些实施方案公开本发明,但显而易见的是,可以在不偏离如本文中公开和如随附权利要求书提供的本发明的精神和范围的情况下作出修改和变化。此外,应理解,虽然公开中的所有实施例说明了本发明的实施方案,但它们仅是作为非限制性实施例而提供,因此不应视为限制由此说明的本发明的各个方面。本发明意图具有由本公开、以下权利要求书的语言及其任何等效物界定的全部范围。因此,附图和详述应被视为是说明性的而不是限制性的。
Claims (10)
1.一种生产由融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的方法,所述融合蛋白包含Fc片段,所述方法包括:
1)提供用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体;
2)通过所述表达载体在细胞中表达所述融合蛋白和所述J链蛋白;和
3)产生IgM抗体的五聚体;
其中所述融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述融合蛋白选自纳米抗体融合蛋白,所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段,所述纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接;并且
优选地,所述连接基为(GGGGS)m,其中,m=0、1、2、3或4。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中所述用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体包括:分别表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的两个或更多个表达载体、表达所述融合蛋白和所述J链蛋白两者的单个表达载体、或它们的组合;
优选地,所述用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体为分别表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的两个表达载体;并且
更优选地,所述用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体为表达所述融合蛋白和所述J链蛋白两者的单个表达载体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体包括融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,所述表达单元包括启动子、目的基因、终止子和任选存在的表达调控元件;
优选地,所述表达载体包括1个融合蛋白表达单元或1个J链蛋白表达单元;或者所述表达载体包括1个融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元;或者所述表达载体包括2个融合蛋白表达单元和1个J链蛋白表达单元;
更优选地,所述融合蛋白表达单元包括表达调控元件,并且所述J链蛋白表达单元包括表达调控元件;或者所述融合蛋白表达单元包括表达调控元件,并且所述J链蛋白表达单元不包括表达调控元件;
更优选地,所述表达单元的启动子选自CMV启动子或其功能片段;和
最优选地,所述表达单元的表达调控元件选自人真核翻译延伸因子1α内含子或其功能片段。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其中,所述融合蛋白和/或所述J链蛋白的N端连接有信号肽;
优选地,所述融合蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:5或9所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO:6或10所示的核苷酸序列编码;所述J链蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:5、7或11所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6、8或12所示的核苷酸序列编码;并且
更优选地,所述融合蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列编码;并且所述J链蛋白的信号肽具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列编码。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中表达载体在细胞中表达包括稳转表达和瞬转表达;
优选地,所述细胞是哺乳动物细胞;和
更优选地,所述哺乳动物细胞是CHO细胞、HEK293细胞或Vero细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其中,所述Fc片段是人源IgM的Fc片段;并且
优选地,所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示或所述Fc片段由SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列编码。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中,所述J链蛋白是人源IgM的J链蛋白;并且
优选地,所述J链蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或所述J链蛋白由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列编码。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1、约1:1至约9:1、约1:1至约8:1、约1:1至约7:1、约1:1至约6:1、约1:1至约5:1、约1:1至约4:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1;
优选地,所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达强度之比为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1和约10:1。
10.用于权利要求1-9中任一项所述的方法的表达载体,其包含融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元,其中所述融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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