CN117683143A - 一种编码血管内皮生长因子A融合蛋白的mRNA分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种编码血管内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A，VEGF‑A)融合蛋白的mRNA分子及其应用。所述编码VEGF‑A融合蛋白的mRNA分子由VEGF‑A的编码序列和人IgG抗体Fc片段的编码序列连接而成，此连接后的mRNA分子编码VEGF‑A和人IgG抗体Fc的融合蛋白。所述编码血管内皮生长因子A融合蛋白的完整mRNA分子还包括5’非翻译区(5’UTR)、Kozak序列(Kozak consensus sequence)、3’非翻译区(3’UTR)和多聚腺苷尾巴(Poly A tail)。所述编码血管内皮生长因子A融合蛋白的完整mRNA分子转染哺乳动物细胞或注射/灌注到动物体内后，能够表达、分泌VEGF‑A和人IgG抗体Fc片段的融合蛋白，此融合蛋白除保留了VEGF–A的生物学活性外，还增强了VEGF‑A在动物体内的稳定性和延长了体内半衰期。

Description

一种编码血管内皮生长因子A融合蛋白的mRNA分子及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种核酸药物，具体涉及一种编码血管内皮生长因子A融合蛋白的mRNA药物及其应用。

背景技术

一、VEGF-A与心血管疾病

血管内皮生长因子(Vascular Endothelia lGrowth Factor，VEGF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。血管内皮生长因子是一个家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PGF)。

VEGF-A可促进新生血管形成和使血管通透性增加。其生物学功能包括：⑴促进内皮细胞增生。VEGF-A是一种血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体外可促进血管内皮细胞的生长，在体内可诱导血管增生。尤其是在低氧环境下，VEGF-A与内皮细胞膜上VEGF-A受体结合，引起受体的自身磷酸化，从而激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，实现VEGF-A的有丝分裂原特性，诱导内皮细胞增生。⑵促进血管增生。在低氧环境下，VEGF-A通过提高血浆酶原活化因子(PA)和血浆酶原活化因子抑制因子-l(PAI-1)的mRNA表达，来提高血浆酶原活化因子的活性，促进细胞外蛋白水解，进而促进新生毛细血管的形成。⑶增加血管通透性。VEGF-A是最强的可增加血管通透性的物质之一，是通过细胞小囊泡器来实现的。其特点是作用迅速、持续时间短。⑷改变细胞外基质在低氧环境下，VEGF-A可以诱导血浆蛋白溶酶原激活物和血浆溶酶原激活物抑制剂-1，以及基质胶原酶、诱导组织因子等在内皮细胞的表达，激发V3因子的释放，从而改变细胞外基质，使其更易于血管生长。

缺血性心脏病(IHD)是世界范围内主要的死亡原因。全世界每年有死于IHD的人数占总人口的16％。心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是IHD的主要表现之一，可在短时间内诱发心肌坏死或凋亡，导致心衰，且预后不良。它被列为IHD的主要死亡原因。尽管目前临床血运重建和药物治疗等方法已应用于改善MI患者缺血心肌区域内的冠状动脉灌注，但仍有相当一部分患者不适合经皮或外科手术的血运重建。近年来，治疗性血管新生被提出作为治疗MI的新策略，血管生成是心脏的核心修复方式，促进梗死部位的血管修复对MI治疗具有重要的理论和临床应用价值。血管内皮生长因子A(VEGF-A)因其在促血管生成、干细胞募集、归巢、降低凋亡、增加血管扩张和自主反应的调节等方面的突出作用，在MI治疗中表现优异，已有研究包括直接给药VEGF-A(蛋白质疗法)，促进VEGF-A基因在体内的表达(基因治疗)，输送干细胞(细胞治疗)或外泌体(无细胞治疗)等多种治疗形式，VEGF-A在心血管医学中的潜在有益作用受到广泛关注，

冠心病(coronaryheartdisease,CHD)是威胁人类安全的主要疾病之一，全球高危人群中冠心病的中位发病率为19.34％。中国冠心病患者已达1100万，且发病率仍在持续上升。冠心病的病理基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)，脂质代谢紊乱、血管内皮细胞损伤、炎症和免疫功能障碍可促进AS的发生和发展，进而导致冠心病。研究证实，VEGF家族具有调节炎症反应、促进血管生成、抗氧化应激等功能，具有调节动脉硬化进展及防治冠心病的潜在作用，且近期有研究发现VEGF在心肌成纤维细胞中表达，提示其在心肌梗死后组织修复和重塑中可能也发挥着重要作用

二、基于mRNA分子的生物药

新冠病毒(COVID-19)mRNA疫苗的巨大成功提升了mRNA分子作为治疗性生物药的可行性。mRNA分子具有组织特异性强、安全、快速、表达持续时间长等优势，从非免疫原性的、优化的mRNA分子转录产生的VEGF-A蛋白表达可解决现有的弊端，充分发挥VEGF-A对心脑血管疾病、糖尿病并发症、肾损伤、组织器官损伤等的治疗功能。

mRNA(messenger RNA、信使RNA)是在基因转录过程中以DNA为模板而生成的一种单链核苷酸序列，携带有编码蛋白质序列的信息，将生命的遗传信息从DNA转移到核糖体，在那里，遗传信息被翻译成蛋白质，进而执行生命功能。通过递送表达传染病、癌症抗原、基因编辑组分或疾病相关治疗性蛋白质的mRNA，可以实现包括疫苗、基因编辑，以及蛋白质治疗等各种临床应用。mRNA药物本质上属于广义的基因治疗范畴。基因治疗通过对DNA基因进行编辑，敲低、修正、或者增加，最终通过mRNA而作用。mRNA可以直接翻译，无需象DNA一样需要先进入细胞核转录。

成熟mRNA分子的主体序列是编码区序列，在其上游5’端和下游的3’端都有非编码区序列。真核生物mRNA分子两端还有5’帽子和3’多聚腺苷尾部结构。

成熟mRNA的帽子结构是反向的7-甲基鸟苷三磷酸，它与mRNA原来的5’端核苷酸通过5’ppp5’连接，形成m7GpppN。帽子结构对稳定mRNA及其翻译具有重要意义，它将5’端封闭起来以免核酸外切酶的水解；还可作为蛋白合成系统的辨认信号，促使mRNA与核糖体小亚基结合，进而启动翻译过程。

5’非翻译区(5’untranslatedregion,5’UTR)是帽子与编码区起始密码子之间的一段较短的序列，其中包括标志翻译起始的序列，如原核生物的SD序列。5’UTR是翻译起始的高度敏感区，其长度、二级结构以及AUG的数量都会影响翻译起始的效率。5’UTR的长度一般是100～200个核苷酸，少于20个碱基时会错过翻译起始密码AUG，称为遗漏扫描(Leakyscanning)。过长的5’UTR容易形成过多二级结构，不利于翻译起始。5’UTR的长度也与基因类型有关，比如与信号转导相关的基因往往具有较长的5’UTR。

编码区由起始密码子AUG开始，到终止密码子(UAG、UGA、UAA)截止，编码一种蛋白质的一级结构。其中每三个碱基构成一个密码子，编码一个氨基酸。编码区的二级结构和密码子选择都可能影响翻译效率。过多的二级结构和稀有密码子都会降低翻译速度，所以基因工程表达蛋白时会根据宿主的密码子偏好性进行优化。

3’非翻译区是终止密码子以后的转录序列，其中含有加尾信号，包括核心序列AAUAAA，以及下游10-30碱基处的一段富含GU的辅助序列。3’非翻译区也参与翻译调控。

mRNA的尾部是一段多聚A序列。成熟的mRNA一般在它的3’端都加上了长度为20-200碱基的多聚A尾，可以防止外切酶降解，也可以作为核膜孔转运系统的标志，与成熟的mRNA通过核膜孔被运到胞浆有关。

三、研制编码血管内皮生长因子A融合蛋白的mRNA分子的意义

VEGF-A在医学中的应用受到广泛关注，目前研究较多的是基因工程重组的VEGF-A治疗性蛋白药物和以病毒或质粒(DNA)为载体的基因治疗药物，但这两种给药方式在临床试验中存在着较差的药代动力学、，较低的基因转染效率、随机基因整合风险等问题。这些问题阻碍了VEGF-A的实际临床应用。

而基于mRNA分子的药物具有组织特异性强、安全、快速的特点，可以解决VEGF-A在医学应用中存在的上述问题。VEGF-A mRNA在动物试验和临床试验中证实了其安全性和有效性，但单独的VEGF-A蛋白分子在人体内循环的半衰期仅有90分钟，发挥治疗功能的时间窗口过短而需要频繁用药，增加患者和医疗负担，因此有必要改造VEGF-A的结构，研制长效制剂以满足临床需求。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种编码血管内皮生长因子A融合蛋白的mRNA分子，此mRNA分子在体内进入细胞后，既能在细胞内高效表达VEGF-A融合蛋白分子，也能够将VEGF-A融合蛋白分子分泌至细胞外环境中，以发挥VEGF-A的生物学功能；同时，此融合蛋白分子在细胞外环境中具有更高的稳定性和更长的体内半衰期。此有效解决了过往VEGF-A临床应用中存在的较差药代动力学，较低基因转染效率、随机基因整合风险、体内半衰期短等问题。

本发明通过下述技术方案实现：

本发明的第一个目的是提供一种编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子包括X-L-Y的mRNA片段，所述X为编码VEGF-A的mRNA序列或编码VEGF-A同源异构体的mRNA序列，L为编码连接子的mRNA序列，Y为编码人抗体IgG的Fc片段的mRNA序列。

进一步的，所述VEGF-A同源异构体为VEGF-A165。

在某个特殊的实施例中，编码人VEGF-A165的mRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示(其中，SEQ ID NO.11的1-78位核苷酸序列编码信号肽，79-573位核苷酸序列编码VEGF-A165)。

此序列中的胸腺嘧啶(T)变换为尿嘧啶(U)即为ID No.11所示的mRNA核苷酸序列ATGAACTTCCTCTTGAGTTGGGTCCATTGGAGCTTGGCCCTTCTGTTGTACCTGCACCACGCAAAGTGGAGTCAAGCGGCTCCGATGGCTGAGGGAGGAGGGCAAAATCACCATGAGGTTGTCAAATTCATGGACGTCTACCAAAGATCTTACTGCCACCCCATAGAAACCCTGGTAGATATTTTCCAAGAATATCCGGACGAAATCGAGTATATTTTTAAACCATCTTGTGTCCCTCTGATGCGCTGTGGTGGCTGCTGTAACGATGAAGGTCTTGAATGTGTGCCGACCGAAGAGTCAAACATAACAATGCAAATAATGCGCATTAAGCCCCATCAAGGGCAGCATATTGGTGAAATGAGTTTCCTTCAGCATAATAAATGCGAATGTCGGCCCAAGAAAGATCGGGCTAGACAAGAGAACCCCTGTGGACCATGCAGCGAGAGGAGGAAGCACCTCTTTGTTCAAGACCCGCAGACATGTAAATGTTCATGTAAGAACACGGATTCAAGGTGTAAGGCTCGACAATTGGAGCTTAACGAACGCACGTGCCGGTGCGATAAGCCCCGACGG

同源异构体(isoform)是由来自同一基因的mRNA前体因选择性剪接而产生多种mRNA，并翻译出的多种蛋白，这些蛋白即为同源异构体。作为VEGF-A的一种同源异构体，A165是一种糖基化的有丝分裂原，能够特异地作用于内皮细胞，增强血管的渗透性、促进内皮细胞生长、血管再生(angiogenesis)和新血管生成(vasculogenesis)和抑制细胞凋亡(apoptosis)等。

进一步的，所述连接子的氨基酸序列为1-3组GGGGS，优选的，所述连接子为3组GGGGS。其中G为甘氨酸(Glycine)，S为丝氨酸(Serine)，即连接子可以是GGGGS、GGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS，优化地，连接子选取SEQ ID NO.5所示的GGGGSGGGGSGGGGS。

在编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子中，连接子的mRNA核苷酸序列由相应的密码子组成。

在某个特殊的实施例中，所述连接子的mRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

此序列中的胸腺嘧啶(T)变换为尿嘧啶(U)即为ID No.12所示的mRNA核苷酸序列：

GGAGGTGGGGGATCAGGCGGTGGAGGGTCAGGCGGAGGGGGTAGT

进一步的，所述人抗体IgG选自IgG2或IgG4亚类。人IgG抗体分为4种亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。不同亚类具有不同的免疫功能，如抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC，例如IgG1和IgG3)、抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，以及补体依赖细胞毒性(CDC，例如IgG1、IgG3)。此类免疫功能的同种型特异性结合是基于对不同免疫细胞上Fc受体的选择性以及结合C1q和活化膜攻击复合物(MAC)装配的能力。在各种同种型中，Fcγ受体对IgG1和IgG3的相对亲和力较高，然而对IgG2和IgG4的亲和力较低。

在某个特殊的实施例中，编码人IgG4抗体Fc片段的mRNA核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示。

此序列中的胸腺嘧啶(T)变换为尿嘧啶(U)即为ID No.13所示的mRNA核苷酸序列。

GAGAGCAAGTATGGACCACCCTGTCCGCCTTGTCCAGCTCCAGAGGCCGCGGGTGGCCCGTCAGTCTTCCTGTTTCCGCCGAAGCCAAAGGACACACTCATGATCTCAAGGACCCCAGAAGTCACCTGTGTAGTAGTTGATGTAAGCCAAGAGGACCCAGAGGTGCAATTCAATTGGTATGTTGATGGTGTTGAGGTCCACAATGCAAAAACGAAACCCAGAGAAGAGCAATTCAACAGCACCTACAGAGTGGTATCAGTTCTCACAGTCTTGCACCAGGATTGGCTCAACGGAAAAGAATATAAATGCAAGGTATCAAACAAGGGGCTTCCCAGTTCAATCGAGAAGACGATATCAAAGGCAAAAGGACAGCCCCGGGAACCTCAAGTGTACACACTGCCACCTTCCCAAGAAGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCATTGACGTGTCTTGTTAAGGGGTTTTATCCCTCTGACATTGCTGTGGAGTGGGAGTCAAATGGGCAGCCAGAGAACAACTATAAGACGACACCACCGGTGCTCGATTCTGATGGTTCTTTTTTTTTGTATTCTCGACTTACCGTAGATAAGTCACGGTGGCAGGAGGGGAACGTCTTCTCCTGTTCCGTTATGCACGAAGCGCTGCATAATCACTATACCCAAAAGAGTCTCAGCCTGTCTCTGGGTAAGTGA

将编码VEGF-AA165、连接子(GGGGSGGGGSGGGGS)和人抗体IgG Fc片段的核苷酸序列连接后，获得编码VEGF-A和Fc融合蛋白的核苷酸序列，进而按人类(Homo sapiens)氨基酸密码子偏性进行密码子调整，获得优化的VEGF-A和Fc融合蛋白编码序列。

进一步的，为增强编码VEGF-A和Fc融合蛋白的mRNA分子的稳定性、提高蛋白翻译效率，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子还包括5’端非翻译区和3’端非翻译区(Untranslated Region,UTR)序列；优选的，所述非翻译区选自人的天然mRNA分子、改造的mRNA非翻译区，人工设计的非天然核苷酸序列；进一步优选的，所述非翻译区为人血红蛋白β亚单位mRNA的非翻译区。

进一步提高完整mRNA分子的稳定性，并减少免疫原性，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子还采用以下化学修饰等技术：

进一步的，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子还包括5’端添加mRNA帽结构。

进一步的，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子还包括3’端添加多聚腺苷和/或类核苷酸尾巴，优选的，所述多聚腺苷聚合度为100～300。

进一步的，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子5’至3’端依次连接mRNA帽结构-5’端非翻译区-(X-L-Y)片段-3’端非翻译区-多聚腺苷和/或类核苷酸尾巴。

进一步的，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子序列如SEQ ID NO.14所示(其中，SEQ ID NO.14的1-78位核苷酸序列编码信号肽，79-573位核苷酸序列编码VEGF-A165，574-618位核苷酸序列编码连接子，619-1305位核苷酸序列编码Fc片段)。

此序列中的胸腺嘧啶(T)变换为尿嘧啶(U)即为ID No.14所示的mRNA核苷酸序列：ATGAACTTCCTCTTGAGTTGGGTCCATTGGAGCTTGGCCCTTCTGTTGTACCTGCACCACGCAAAGTGGAGTCAAGCGGCTCCGATGGCTGAGGGAGGAGGGCAAAATCACCATGAGGTTGTCAAATTCATGGACGTCTACCAAAGATCTTACTGCCACCCCATAGAAACCCTGGTAGATATTTTCCAAGAATATCCGGACGAAATCGAGTATATTTTTAAACCATCTTGTGTCCCTCTGATGCGCTGTGGTGGCTGCTGTAACGATGAAGGTCTTGAATGTGTGCCGACCGAAGAGTCAAACATAACAATGCAAATAATGCGCATTAAGCCCCATCAAGGGCAGCATATTGGTGAAATGAGTTTCCTTCAGCATAATAAATGCGAATGTCGGCCCAAGAAAGATCGGGCTAGACAAGAGAACCCCTGTGGACCATGCAGCGAGAGGAGGAAGCACCTCTTTGTTCAAGACCCGCAGACATGTAAATGTTCATGTAAGAACACGGATTCAAGGTGTAAGGCTCGACAATTGGAGCTTAACGAACGCACGTGCCGGTGCGATAAGCCCCGACGGGGAGGTGGGGGATCAGGCGGTGGAGGGTCAGGCGGAGGGGGTAGTGAGAGCAAGTATGGACCACCCTGTCCGCCTTGTCCAGCTCCAGAGGCCGCGGGTGGCCCGTCAGTCTTCCTGTTTCCGCCGAAGCCAAAGGACACACTCATGATCTCAAGGACCCCAGAAGTCACCTGTGTAGTAGTTGATGTAAGCCAAGAGGACCCAGAGGTGCAATTCAATTGGTATGTTGATGGTGTTGAGGTCCACAATGCAAAAACGAAACCCAGAGAAGAGCAATTCAACAGCACCTACAGAGTGGTATCAGTTCTCACAGTCTTGCACCAGGATTGGCTCAACGGAAAAGAATATAAATGCAAGGTATCAAACAAGGGGCTTCCCAGTTCAATCGAGAAGACGATATCAAAGGCAAAAGGACAGCCCCGGGAACCTCAAGTGTACACACTGCCACCTTCCCAAGAAGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCATTGACGTGTCTTGTTAAGGGGTTTTATCCCTCTGACATTGCTGTGGAGTGGGAGTCAAATGGGCAGCCAGAGAACAACTATAAGACGACACCACCGGTGCTCGATTCTGATGGTTCTTTTTTTTTGTATTCTCGACTTACCGTAGATAAGTCACGGTGGCAGGAGGGGAACGTCTTCTCCTGTTCCGTTATGCACGAAGCGCTGCATAATCACTATACCCAAAAGAGTCTCAGCCTGTCTCTGGGTAAGTGA

上述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子翻译得到的VEGF-A融合蛋白，所述编码VEGF-A融合蛋白包括X-L-Y的氨基酸片段，所述X为VEGF-A或VEGF-A同源异构体的氨基酸序列，L为连接子的氨基酸序列，Y为人抗体IgG的Fc片段氨基酸序列，所述人抗体IgG选自IgG2或IgG4亚类。

进一步的，所述X的氨基酸片段如SEQ ID NO.1所示：

MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIE

TLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGE

MSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR(其中，SEQ ID NO.1的1-26位氨基酸序列为信号肽序列，27-191位氨基酸序列为VEGF-A165序列)。

所述L的氨基酸片段如SEQ ID NO.5所示：GGGGSGGGGSGGGGS。

所述Y的氨基酸片段如SEQ ID NO.3：

VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHN

AKTKPREEQYASTYRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQ

VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(所述人抗体IgG选自IgG2)或SEQ ID NO.4：

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDG

VEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ

PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(所述人抗体IgG选自IgG4)所示。

在某个特殊的实施例中，所述编码VEGF-A融合蛋白的氨基酸片段如SEQ ID NO.10所示：MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRRGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(其中，SEQ IDNO.10的1-26位氨基酸序列为信号肽序列，27-191位氨基酸序列为VEGF-A165序列，192-206位氨基酸为连接子，207-435位氨基酸为Fc片段)。

编码上述的mRNA分子的DNA序列，其中，编码人VEGF-A165的DNA核苷酸序列如SEQID NO.2所示：

ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATG

CCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGT

GGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGA

CATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTG

ATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTC

CAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGAT

GAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAA

GAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCA

GACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTT GCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA(其中，SEQ ID NO.2的1-78位核苷酸序列编码信号肽，79-573位核苷酸序列编码VEGF-A165)。

5’端非编码区序列如SEQ ID NO.8所示：

ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAG。

3’端非编码区序列如SEQ ID NO.9所示：

GCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACT

GGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTC ATTGC。

T7启动子序列如SEQ ID NO.6所示：TAATACGACTCACTATAG。

位于5’端非编码区和起始密码子之间的Kozak序列如SEQ ID NO.7所示：GCCACCATG。

本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包括前述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子。

进一步的，所述药物组合物还包括酸碱度维持剂、离子浓度调节剂、稳定剂、赋形剂、脂质体中的一种或多种的组合。

本发明的第三个目的是提供前述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子或前述的药物组合物在制备以VEGF-A蛋白或VEGF-AmRNA为有效成分的药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供前述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子或前述的药物组合物在制备预防和/或治疗血管相关疾病中的应用。

进一步的，所述血管相关疾病为缺血性心脏病、心肌梗死、冠心病、动脉粥样硬化。

在本发明的另一实施例中，采用全基因合成或寡核苷酸引物聚合的方法，获得完整编码VEGF-A和Fc融合蛋白mRNA分子的DNA模板。进一步地，所述DNA模板的5’端包含T7启动子序列(5’-TAATACGACTCACTATAG-3’)。T7启动子是T7 RNA聚合酶的特异识别序列，是采用T7 RNA聚合酶体外合成mRNA分子所必需的识别和启动序列。

进一步地，所述DNA模板片段克隆至合适的质粒中，转化至大肠杆菌后，可以大量制备含DNA模板的质粒，为mRNA的体外合成提供必需的模板。

在本发明的另一实施例中，以所述编码VEGF-A和Fc融合蛋白的线性化DNA片段作为模板，体外转录合成(In vitro transcribed，IVT)了完整的mRNA分子，所述完整的mRNA分子包括5’非翻译区、优化的VEGF-A和Fc融合蛋白编码序列、3’非翻译区和多聚腺苷尾巴。除DNA模板外，IVT反应体系还包括T7 RNA聚合酶、NTPs、修饰的核苷类似物。

在本发明的另一实施例中，建立了体外转录合成的mRNA分子的纯化方法，以上述所制备的线性化重组载体为IVT模板，采用T7 RNA聚合酶系统转录合成VEGF和VEGFFc mRNA分子。

在本发明的另一实施例中，所述纯化的mRNA分子转染哺乳动物细胞后，在细胞的培养上清液中检测到VEGF-A和人IgG Fc片段，表明所述mRNA分子在哺乳动物细胞中成功表达翻译、并分泌至细胞外。

在本发明的另一实施例中，所述纯化的mRNA分子皮下注射至小鼠体内，24小时后在小鼠血液中检测到VEGF-A蛋白，实验结果提示VEGFFc mRNA分子在小鼠体内具有更长的表达期或更长的体内半衰期，致使其保持更长的效应时间。

本申请技术方案相对于现有技术具有以下有益效果：

本发明设计并验证了编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子(VEGFFc mRNA)，此分子具有两方面的优势：①能够在哺乳动物细胞内高效表达VEGF-A融合蛋白，并能够从细胞内分泌至细胞外而发挥VEGF-A的生物学功能；②此mRNA融合分子所表达、分泌的融合蛋白分子在细胞外环境中具有更长的表达期或半衰期，可解决单独VEGF-A分子半衰期短的劣势，致使其保持更长的效应时间。

附图说明

图1成熟真核细胞mRNA分子结构示意图；

图2编码VEGF-A165与人IgG Fc融合蛋白的mRNA分子结构示意图；

图3pUC19质粒图谱；

图4VEGFFc mRNA在HEK293细胞的分泌表达(人VEGF-A蛋白检测)；

图5VEGFFc mRNA在HEK293细胞的分泌表达(人IgG抗体Fc片段检测)；

图6小鼠注射VEGFFc mRNA后VEGF A的分泌表达。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例一：编码血管内皮生长因子A融合蛋白的mRNA分子的设计

典型的成熟真核细胞mRNA分子依次由5’帽结构、5’非翻译区(UTR)、氨基酸的编码序列、3’非翻译区(UTR)和多聚腺苷尾巴(Poly Atail)组成(图1)，其中氨基酸的编码序列起于起始密码子(ATG)。

基于此，发明人首先设计了一种编码VEGF-A融合蛋白的编码序列，此编码序列由3段核酸片段组成，其顺序为X-L-Y，其中X为编码VEGF-A的mRNA序列、L为编码连接子接子的mRNA序列、Y为编码人抗体IgG Fc片段的mRNA序列。

本发明所述VEGF-A融合蛋白的VEGF-A片段为VEGF-A的同源异构体(isoform)A165。同源异构体(isoform)是由来自同一基因的mRNA前体因选择性剪接而产生多种mRNA，并翻译出的多种蛋白，这些蛋白即为同源异构体。作为VEGF-A的一种同源异构体，A165是一种糖基化的有丝分裂原，能够特异地作用于内皮细胞，增强血管的渗透性、促进内皮细胞生长、血管再生(angiogenesis)和新血管生成(,vasculogenesis)和抑制细胞凋亡(apoptosis)等。

进一步地，所述VEGF-A融合蛋白的连接子氨基酸序列为1-3组GGGGS，其中G为甘氨酸(Glycine)，S为丝氨酸(Serine)，即连接子可以是GGGGS、GGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS，优化地，连接子选取GGGGSGGGGSGGGGS。在mRNA分子中，连接子的编码序列由相应的密码子组成。

进一步地，所述VEGF-A融合蛋白的人抗体IgG Fc片段选择自IgG2或IgG4亚类。人IgG抗体分为4种亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。不同亚类具有不同的免疫功能，如抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC，例如IgG1和IgG3)、抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，以及补体依赖细胞毒性(CDC，例如IgG1、IgG3)。此类免疫功能的同种型特异性结合是基于对不同免疫细胞上Fc受体的选择性以及结合C1q和活化膜攻击复合物(MAC)装配的能力。在各种同种型中，Fcγ受体对IgG1和IgG3的相对亲和力较高，然而对IgG2和IgG4的亲和力较低。

将编码VEGF-AA165、连接子(GGGGSGGGGSGGGGS)和人抗体IgG Fc片段的核苷酸序列连接后，获得编码VEGF-A和Fc融合蛋白的核苷酸序列，进而按人类(Homo sapiens)氨基酸密码子偏性进行密码子调整，获得优化的VEGF-A和Fc融合蛋白编码序列。

为增强编码VEGF-A和Fc融合蛋白的mRNA分子的稳定性、提高蛋白翻译效率，在VEGF-A和Fc融合蛋白编码序列的5’和3’端分别添加一段非翻译区(Untranslated Region,UTR)序列，UTR可以选取自人的天然mRNA分子、改造的mRNA非翻译区，也可是人工设计的非天然核苷酸序列。本发明的实施例中采用人血红蛋白β亚单位(Hemoglobin beta,HBB)mRNA的非翻译区。

进一步地，编码VEGF-A和Fc融合蛋白的mRNA分子可以通过5’添加mRNA帽结构、3’端添加多聚腺苷(130A)和类核苷酸化学修饰等技术，进一步提高完整mRNA分子的稳定性，并减少免疫原性。

所设计的编码VEGF A165与人IgG Fc融合蛋白的mRNA分子结构如图2所示，其中X为VEGF A165编码序列、L为连接子编码序列、Y为人IgG Fc片段编码序列，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子序列如SEQ ID NO.14所示。

进一步地，设计了按图1所示典型的成熟真核细胞mRNA分子结构作为对照，该对照名称为VEGF-AmRNA，图1所示典型的成熟真核细胞mRNA分子全长核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，此序列中的胸腺嘧啶(T)变换为尿嘧啶(U)即为ID No.16所示的mRNA核苷酸序列。：

ATGAACTTCCTCTTGAGTTGGGTCCATTGGAGCTTGGCCCTTCTGTTGTACCTGCACCACGCAAAGTGGAGTCAAGCGGCTCCGATGGCTGAGGGAGGAGGGCAAAATCACCATGAGGTTGTCAAATTCATGGACGTCTACCAAAGATCTTACTGCCACCCCATAGAAACCCTGGTAGATATTTTCCAAGAATATCCGGACGAAATCGAGTATATTTTTAAACCATCTTGTGTCCCTCTGATGCGCTGTGGTGGCTGCTGTAACGATGAAGGTCTTGAATGTGTGCCGACCGAAGAGTCAAACATAACAATGCAAATAATGCGCATTAAGCCCCATCAAGGGCAGCATATTGGTGAAATGAGTTTCCTTCAGCATAATAAATGCGAATGTCGGCCCAAGAAAGATCGGGCTAGACAAGAGAACCCCTGTGGACCATGCAGCGAGAGGAGGAAGCACCTCTTTGTTCAAGACCCGCAGACATGTAAATGTTCATGTAAGAACACGGATTCAAGGTGTAAGGCTCGACAATTGGAGCTTAACGAACGCACGTGCCGGTGCGATAAGCCCCGACGG(其中，SEQ ID NO.16的1-78位核苷酸序列编码信号肽，79-573位核苷酸序列编码VEGF-A165)。与编码VEGF A165与人IgG Fc融合蛋白的mRNA分子相比，所述VEGF A165的mRNA分子去除了接头和人抗体IgG Fc片段的编码序列。

实施例二：DNA模板的合成及重组载体制备

1、为制备VEGFFc mRNA体外转录合成所需要的模板，首先人工合成了本发明VEGFFc的相应DNA序列片段，如SEQ ID NO.15所示：

ATGAACTTCCTCTTGAGTTGGGTCCATTGGAGCTTGGCCCTTCTGTTGTACCTGCACCACGCAAAGTGGAGTCAAGCGGCTCCGATGGCTGAGGGAGGAGGGCAAAATCACCATGAGGTTGTCAAATTCATGGACGTCTACCAAAGATCTTACTGCCACCCCATAGAAACCCTGGTAGATATTTTCCAAGAATATCCGGACGAAATCGAGTATATTTTTAAACCATCTTGTGTCCCTCTGATGCGCTGTGGTGGCTGCTGTAACGATGAAGGTCTTGAATGTGTGCCGACCGAAGAGTCAAACATAACAATGCAAATAATGCGCATTAAGCCCCATCAAGGGCAGCATATTGGTGAAATGAGTTTCCTTCAGCATAATAAATGCGAATGTCGGCCCAAGAAAGATCGGGCTAGACAAGAGAACCCCTGTGGACCATGCAGCGAGAGGAGGAAGCACCTCTTTGTTCAAGACCCGCAGACATGTAAATGTTCATGTAAGAACACGGATTCAAGGTGTAAGGCTCGACAATTGGAGCTTAACGAACGCACGTGCCGGTGCGATAAGCCCCGACGGGGAGGTGGGGGATCAGGCGGTGGAGGGTCAGGCGGAGGGGGTAGTGAGAGCAAGTATGGACCACCCTGTCCGCCTTGTCCAGCTCCAGAGGCCGCGGGTGGCCCGTCAGTCTTCCTGTTTCCGCCGAAGCCAAAGGACACACT

CATGATCTCAAGGACCCCAGAAGTCACCTGTGTAGTAGTTGATGTAAGCCAAGAGGACCC

AGAGGTGCAATTCAATTGGTATGTTGATGGTGTTGAGGTCCACAATGCAAAAACGAAACC

CAGAGAAGAGCAATTCAACAGCACCTACAGAGTGGTATCAGTTCTCACAGTCTTGCACC

AGGATTGGCTCAACGGAAAAGAATATAAATGCAAGGTATCAAACAAGGGGCTTCCCAGT

TCAATCGAGAAGACGATATCAAAGGCAAAAGGACAGCCCCGGGAACCTCAAGTGTACAC

ACTGCCACCTTCCCAAGAAGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCATTGACGTGTCTTGTTAA

GGGGTTTTATCCCTCTGACATTGCTGTGGAGTGGGAGTCAAATGGGCAGCCAGAGAACA

ACTATAAGACGACACCACCGGTGCTCGATTCTGATGGTTCTTTTTTTTTGTATTCTCGACTT

ACCGTAGATAAGTCACGGTGGCAGGAGGGGAACGTCTTCTCCTGTTCCGTTATGCACGAAGCGCTGCATAATCACTATACCCAAAAGAGTCTCAGCCTGTCTCTGGGTAAGTGA，其中，SEQ ID NO.15的1-78位核苷酸序列编码信号肽，79-573位核苷酸序列编码VEGF-A165，574-618位核苷酸序列编码连接子，619-1305位核苷酸序列编码Fc片段，并在其5’添加了T7启动子序列5’-TAATACGACTCACTATAG-3’，并在其两端分别添加E coRI(GAATTC)和BamHI(GGATCC)酶切位点。

同样地，合成了SEQ ID NO.17所示编码VEGF-AmRNA相应DNA序列片段作为对照：ATGAACTTCCTCTTGAGTTGGGTCCATTGGAGCTTGGCCCTTCTGTTGTACCTGCACCACGCAAAGTGGAGTCAAGCGGCTCCGATGGCTGAGGGAGGAGGGCAAAATCACCATGAGGTTGTCAAATTCATGGACGTCTACCAAAGATCTTACTGCCACCCCATAGAAACCCTGGTAGATATTTTCCAAGAATATCCGGACGAAATCGAGTATATTTTTAAACCATCTTGTGTCCCTCTGATGCGCTGTGGTGGCTGCTGTAACGATGAAGGTCTTGAATGTGTGCCGACCGAAGAGTCAAACATAACAATGCAAATAATGCGCATTAAGCCCCATCAAGGGCAGCATATTGGTGAAATGAGTTTCCTTCAGCATAATAAATGCGAATGTCGGCCCAAGAAAGATCGGGCTAGACAAGAGAACCCCTGTGGACCATGCAGCGAGAGGAGGAAGCACCTCTTTGTTCAAGACCCGCAGACATGTAAATGTTCATGTAAGAACACGGATTCAAGGTGTAAGGCTCGACAATTGGAGCTTAACGAACGCACGTGCCGGTGCGATAAGCCCCGACGG：(其中，SEQ ID NO.17的1-78位核苷酸序列编码信号肽，79-573位核苷酸序列编码VEGF-A165)。

2、VEGF-A和VEGFFc DNA模板重组克隆载体的制备

按常规的分子克隆技术构建VEGF-A和VEGFFc DNA模板重组克隆载体。将合成的VEGF-A和VEGFFc DNA片段经E coRI和BamHI双酶切后，用T4连接酶分别连接到pUC19质粒(图3)的相应酶切位点之间；转化大肠杆菌DH5α后，经酶切和DNA测序，获得含VEGF-A和VEGFFc DNA片段的重组克隆载体，将此2个载体分别命名为作为对照的“pUCVEGF”和本专利所述的“pUC VEGFFc”。

3、pUCVEGF和pUC VEGFFc载体的制备与线性化

按常规技术提取pUCVEGF和pUC VEGFFc载体质粒，经BamHI酶切后，纯化回收线性化的pUCVEGF和pUC VEGFFc载体，此即为下一步体外转录合成mRNA的模板。

实施例三：体外转录合成(IVT)

以上述所制备的线性化pUCVEGF和pUC VEGFFc载体为IVT模板，采用T7RNA聚合酶系统转录合成VEGF-A和VEGFFc mRNA分子。以100μl反应体积为例，具体合成步骤如下：

1、在1.5ml无菌离心管内，按下表依次加入所需试剂：

2、37℃孵育1小时。

3、加入10μl的DNase I(2u/μl)溶液，37℃孵育20分钟以降解模板DNA。

4、加入50μl的7.5M氯化锂(LiCl)溶液，-20℃冷冻30分钟。

5、在4℃下13000rpm离心15分钟，小心吸弃上清，留下沉淀。

6、加入1ml的预冷70％乙醇，轻摇洗涤沉淀，然后在4℃下13000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，留下沉淀。

7、室温干燥沉淀10分钟，用50μl纯水溶解沉淀。此即为IVT并经氯化锂沉淀法纯化的VEGF-A和VEGFFc mRNA。

实施例四：mRNA在哺乳动物细胞中的分泌表达(一)VEGF-A和VEGFFc mRNA转染哺乳动物细胞

理论上，所设计的作为对照的VEGF-A mRNA和本专利所述的编码VEGF-A融合蛋白的VEGFFc mRNA进入哺乳动物细胞后，能够利用细胞的内在蛋白合成系统，按VEGF-A的编码序列，自动合成相应的VEGF或VEGFFc融合蛋白。在合成的VEGF-A或VEGFFc融合蛋白氨基端(N端)含有VEGF-A的天然信号肽，所合成的氨基酸链经翻译后加工处理而切除信号肽，成熟的VEGF-A或VEGFFc融合蛋白释放至细胞外，因此，在转染后细胞的培养液上清中，可以检测到VEGF A165蛋白和/或人IgG抗体的Fc片段。

转染哺乳动物细胞转染步骤如下：

1、以HEK293细胞系作为VEGF-A和VEGFFc mRNA转染的宿主细胞。HEK293是一种贴壁生长的人胚胎肾细胞系，广泛用于细胞转染、重组蛋白表达等生物医药的研究。

2、活化的HEK293细胞经胰酶(Trypsin)消化后，按1x10⁶/孔转种至6孔细胞培养板，37℃、5％CO₂培养过夜。

3、转染试剂采用lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)，按操作说明书，每孔使用7.5μl的转染试剂和25pmol的mRNA，混合后室温孵育5分钟，然后滴加至细胞孔中，摇匀后37℃、5％CO₂继续培养。

(二)VEGF-A和VEGFFc mRNA在哺乳动物细胞中的表达与检测

VEGF-A和VEGFFc mRNA转染的HEK293细胞经过24小时培养后，收集上清，采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)分别检测VEGF-A蛋白和人IgG抗体Fc片段。

ELISA步骤如下：

1、收集VEGF-A和VEGFFc mRNA转染的HEK293细胞培养液，在4℃、13000rpm离心10分钟，取上清用PBS缓冲液倍比稀释，待测。

2、采用人VEGF-AELISA(Human VEGF-A ELISAKit)和人IgG Fc片段ELISA(HumanIgG Fc fragment ELISA Kit(Colorimetric))两种试剂盒，按各自的试剂盒说明书操作，显色后在酶联仪上读取OD₄₅₀吸光值。

ELISA结果显示，HEK293细胞分别转染VEGF-A和VEGFFc mRNA后24小时，在两者的培养液上清中都检测到了VEGF-A蛋白，而仅在转染VEGFFc mRNA的细胞上清中检测到人IgG抗体Fc片段，提示转染VEGF-AmRNA的HEK293细胞仅表达并分泌了VEGF-A蛋白，而转染VEGFFc mRNA的HEK293细胞表达并分泌的蛋白含有VEGF-A和人IgG抗体Fc片段(图4、图5)

实施例五：mRNA在实验动物体内的表达与检测

为检测VEGF-A和VEGFFc mRNA在动物体内的生物学活性，纯化的VEGF-A和VEGFFcmRNA制备成脂质纳米颗粒(LNP)后注射到小鼠体内，其后在不同的时间点检测小鼠血浆中VEGF-A的含量。

试验流程如下：

1、mRNA脂质纳米颗粒(LNP)的制备

采用挤出法制备LNP纳米颗粒。

1)将实施例三制备的100μg VEGF-A和100μg VEGFFc mRNA分别溶解于375uL乙酸纳缓冲液(50mM、pH5.0)。

2)LNP合成试剂盒Lipid Nanoparticle(LNP-MC3)Exploration Kit(CaymanChemical)。

按下列配方配制脂质溶液：

3)将上述375uL的mRNA溶液加入到125uL的脂质溶液中，混匀后室温静置10分钟。

4)采用挤出机(Extruder Set With Holder/Heating Block(Avanti))制备mRNA-LNP颗粒，温度为65℃。

5)转移mRNA-LNP到透析管，用1000mL PBS缓冲液4℃透析过夜。

6)动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)分析所制备的mRNA-LNP颗粒直径。调整上述所制备的mRNA终浓度为200ng/μl

2、选取8周龄、体重18-23克的BALB/c作为受试动物。实验分为3组，每组6只小鼠，一组注射VEGFFc mRNA、一组注射VEGF-AmRNA(无人IgG抗体Fc片段)、一组注射无mRNA的脂质体作为空白对照。

3、按50μl/只的注射量，经尾静脉将样品注射到小鼠体内。

4、注射后第二天起，每日经静脉采取血样0.1ml，分离血浆后，检测血浆中VEGF-A含量水平。共检测7天。

ELISA结果显示，样品注射后第一天，在2个实验组(VEGFFc mRNA和VEGF-A mRNA)小鼠血样中都检测到了VEGF-A注射后第三天达到高峰，注射VEGF-A mRNA组从第五天起VEGF-A含量明显下降，而注射本发明所述VEGFFc mRNA组的高峰保持到实验结束的第七天，提示VEGFFc mRNA在小鼠体内具有更长的表达期或更长的体内半衰期，致使其保持更长的效应时间(图6)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子，其特征在于，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子包括X-L-Y的mRNA片段，所述X为编码VEGF-A或VEGF-A同源异构体的mRNA序列，L为编码连接子的mRNA序列，Y为编码人抗体IgG的Fc片段的mRNA序列。

2.根据权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子，其特征在于，所述VEGF-A同源异构体为VEGF-A165，优选的，编码人VEGF-A165的mRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

3.根据权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子，其特征在于，连接子的氨基酸序列为1-3组GGGGS，所述连接子的mRNA核苷酸序列由相应的密码子组成；优选的，所述连接子为3组GGGGS，所述连接子的mRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.根据权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子，其特征在于，所述人抗体IgG选自IgG2或IgG4亚类，优选的，编码人IgG4抗体Fc片段的mRNA核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示。

5.根据权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子，其特征在于，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子还包括5’端非翻译区和3’端非翻译区序列；优选的，所述非翻译区选自人的天然mRNA分子、改造的mRNA非翻译区，人工设计的非天然核苷酸序列；进一步优选的，所述非翻译区为人血红蛋白β亚单位mRNA的非翻译区。

6.根据权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子，其特征在于，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子还包括5’端添加mRNA帽结构。

7.根据权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子，其特征在于，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子还包括3’端添加多聚腺苷和/或类核苷酸尾巴，优选的，所述多聚腺苷聚合度为100～300。

8.根据权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子，其特征在于，编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子5’至3’端依次连接mRNA帽结构-5’端非翻译区-(X-L-Y)片段-3’端非翻译区-多聚腺苷和/或类核苷酸尾巴。

9.根据权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子，其特征在于，所述编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子序列如SEQ ID NO.14所示。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子。

11.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括酸碱度维持剂、离子浓度调节剂、稳定剂、赋形剂、脂质体中的一种或多种的组合。

12.权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子或权利要求8所述的药物组合物在制备以VEGF-A蛋白或VEGF-AmRNA为有效成分的药物中的应用。

13.权利要求1所述的编码VEGF-A融合蛋白的mRNA分子或权利要求8所述的药物组合物在制备预防和/或治疗血管相关疾病中的应用。

14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述血管相关疾病为缺血性心脏病、心肌梗死、冠心病、动脉粥样硬化。