EA038673B1 - Плазмидная днк, кодирующая дефенсин hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3 - Google Patents
Плазмидная днк, кодирующая дефенсин hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3 Download PDFInfo
- Publication number
- EA038673B1 EA038673B1 EA201790929A EA201790929A EA038673B1 EA 038673 B1 EA038673 B1 EA 038673B1 EA 201790929 A EA201790929 A EA 201790929A EA 201790929 A EA201790929 A EA 201790929A EA 038673 B1 EA038673 B1 EA 038673B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- plasmid dna
- hnp
- seq
- pain
- gene
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 136
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 title description 14
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 title description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 101000918983 Homo sapiens Neutrophil defensin 1 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101000830386 Homo sapiens Neutrophil defensin 3 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- GRZXCHIIZXMEPJ-HTLKCAKFSA-N neutrophil peptide-2 Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)NC(=O)[C@@H](N)CSSC[C@H](NC2=O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N3)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 GRZXCHIIZXMEPJ-HTLKCAKFSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 17
- 101800000287 Neutrophil defensin 2 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 claims abstract description 3
- 102100029494 Neutrophil defensin 1 Human genes 0.000 claims abstract 2
- 102100024761 Neutrophil defensin 3 Human genes 0.000 claims abstract 2
- 102000018475 human neutrophil peptide 2 Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 130
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 71
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 5
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 abstract description 35
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 abstract description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 82
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 60
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 57
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 102000018474 human neutrophil peptide 1 Human genes 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 17
- 102000018476 human neutrophil peptide 3 Human genes 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- JMHFFDIMOUKDCZ-NTXHZHDSSA-N 61214-51-5 Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 JMHFFDIMOUKDCZ-NTXHZHDSSA-N 0.000 description 15
- 102400001060 Neutrophil defensin 2 Human genes 0.000 description 15
- 102400000748 Beta-endorphin Human genes 0.000 description 14
- 101800005049 Beta-endorphin Proteins 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 208000005298 acute pain Diseases 0.000 description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 7
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 6
- 229960005195 morphine hydrochloride Drugs 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 5
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 208000004454 Hyperalgesia Diseases 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 102000018568 alpha-Defensin Human genes 0.000 description 4
- 108050007802 alpha-defensin Proteins 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KRJOFJHOZZPBKI-KSWODRSDSA-N α-defensin-1 Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)NC(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC2=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N3)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 KRJOFJHOZZPBKI-KSWODRSDSA-N 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 3
- -1 NaV1.8 Proteins 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 108050003126 conotoxin Proteins 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- XELXKCKNPPSFNN-BJWPBXOKSA-N morphine hydrochloride trihydrate Chemical compound O.O.O.Cl.O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O XELXKCKNPPSFNN-BJWPBXOKSA-N 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000008533 pain sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 208000009935 visceral pain Diseases 0.000 description 3
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 2
- 241001065356 Actinomadura namibiensis Species 0.000 description 2
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 2
- 102100038518 Calcitonin Human genes 0.000 description 2
- 108090000932 Calcitonin Gene-Related Peptide Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010064012 Central pain syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000023890 Complex Regional Pain Syndromes Diseases 0.000 description 2
- 102100021752 Corticoliberin Human genes 0.000 description 2
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 108010037462 Cyclooxygenase 2 Proteins 0.000 description 2
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 2
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101001034286 Homo sapiens Meteorin-like protein Proteins 0.000 description 2
- 101000764872 Homo sapiens Transient receptor potential cation channel subfamily A member 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 208000035154 Hyperesthesia Diseases 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010065390 Inflammatory pain Diseases 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 208000004550 Postoperative Pain Diseases 0.000 description 2
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102100026186 Transient receptor potential cation channel subfamily A member 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010003205 Vasoactive Intestinal Peptide Proteins 0.000 description 2
- 102400000015 Vasoactive intestinal peptide Human genes 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 206010053552 allodynia Diseases 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 208000022371 chronic pain syndrome Diseases 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 2
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 108010066405 histogranin Proteins 0.000 description 2
- PXOVBYBXCFRNAW-GDBJWOEXSA-N histogranin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 PXOVBYBXCFRNAW-GDBJWOEXSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N invicorp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- DJGAAPFSPWAYTJ-UHFFFAOYSA-M metamizole sodium Chemical compound [Na+].O=C1C(N(CS([O-])(=O)=O)C)=C(C)N(C)N1C1=CC=CC=C1 DJGAAPFSPWAYTJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 1
- UTQHLYJFMFKSGI-UBINZTMLSA-N (2s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s,3r)-3-[(2s,4r,5r,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-2-[2-[[(2s)-4-amino-2-[[(2s)-2-[[2-[[2-[[(2s)-4-carbo Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)[C@@H](C)O[C@@H]1C([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 UTQHLYJFMFKSGI-UBINZTMLSA-N 0.000 description 1
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 1
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 108010087765 Antipain Proteins 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010006002 Bone pain Diseases 0.000 description 1
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 description 1
- 229940122155 Bradykinin receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031151 C-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710149815 C-C chemokine receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 102000014468 Calcitonin Gene-Related Peptide Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010078311 Calcitonin Gene-Related Peptide Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004657 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010003721 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710205660 Calcium-transporting ATPase Proteins 0.000 description 1
- 101710134161 Calcium-transporting ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum type Proteins 0.000 description 1
- 206010058019 Cancer Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 208000001387 Causalgia Diseases 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 1
- 101710156565 Contulakin-G Proteins 0.000 description 1
- 101000594607 Conus magus Omega-conotoxin MVIIA Proteins 0.000 description 1
- 101001122068 Conus tulipa Omega-conotoxin TVIA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022152 Corticotropin-Releasing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100038019 Corticotropin-releasing factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101150081899 Crhr2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 125000000030 D-alanine group Chemical group [H]N([H])[C@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000180 D-prolyl group Chemical group N1[C@@H](C(=O)*)CCC1 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- 102100024426 Dihydropyrimidinase-related protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108050002467 Dihydropyrimidinase-related protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 108010065372 Dynorphins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108010092674 Enkephalins Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102400001370 Galanin Human genes 0.000 description 1
- 101800002068 Galanin Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000038548 Grammostola rosea Species 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000746758 Heteractis crispa Species 0.000 description 1
- 101000979249 Homo sapiens Neuromodulin Proteins 0.000 description 1
- 101000654386 Homo sapiens Sodium channel protein type 9 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 108700020134 Human immunodeficiency virus 1 nef Proteins 0.000 description 1
- 241000271565 Hydrophis hardwickii Species 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010041872 Islet Amyloid Polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 102000036770 Islet Amyloid Polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 1
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000000079 Kainic Acid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010069902 Kainic Acid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 1
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 101800001751 Melanocyte-stimulating hormone alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100039669 Meteorin-like protein Human genes 0.000 description 1
- 108010042237 Methionine Enkephalin Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 206010028347 Muscle twitching Diseases 0.000 description 1
- 206010028391 Musculoskeletal Pain Diseases 0.000 description 1
- 101710150912 Myc protein Proteins 0.000 description 1
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N N-Methyl-D-aspartic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 102000004129 N-Type Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000699 N-Type Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101150111783 NTRK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 206010029174 Nerve compression Diseases 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 102100023206 Neuromodulin Human genes 0.000 description 1
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 102400001103 Neurotensin Human genes 0.000 description 1
- 101800001814 Neurotensin Proteins 0.000 description 1
- 102000002179 Neurotensin type 2 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050009529 Neurotensin type 2 receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710111275 Non-structural 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000008092 Norepinephrine Plasma Membrane Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010049586 Norepinephrine Plasma Membrane Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 102000003840 Opioid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000137 Opioid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229940122985 Peptide agonist Drugs 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000004983 Phantom Limb Diseases 0.000 description 1
- 206010056238 Phantom pain Diseases 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010036376 Postherpetic Neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100024622 Proenkephalin-B Human genes 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241001334235 Scolopendra mutilans Species 0.000 description 1
- 101000844197 Scolopendra subspinipes Mu-scoloptoxin(03)-Ssm2a Proteins 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010040642 Sickle cell anaemia with crisis Diseases 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 description 1
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010025083 TRPV1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000239292 Theraphosidae Species 0.000 description 1
- 102300063576 Tissue-type plasminogen activator isoform 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102400000757 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003502 anti-nociceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N antipain Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007844 axonal damage Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 108010050923 calcitonin gene-related peptide (8-37) Proteins 0.000 description 1
- 230000003913 calcium metabolism Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000009956 central mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 208000014439 complex regional pain syndrome type 2 Diseases 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009191 jumping Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- SLZIZIJTGAYEKK-CIJSCKBQSA-N molport-023-220-247 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CN)[C@@H](C)O)C1=CNC=N1 SLZIZIJTGAYEKK-CIJSCKBQSA-N 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004081 narcotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N neurotensin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000003957 neurotransmitter release Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003349 osteoarthritic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003134 paneth cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001314 paroxysmal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000004963 pathophysiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000008289 pathophysiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011422 pharmacological therapy Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 210000003429 pore cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003711 snail venom Substances 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- VWDLOXMZIGUBKM-AUGXRQBFSA-N stigmasterol 3-O-beta-D-glucoside Chemical compound O([C@@H]1CC2=CC[C@H]3[C@@H]4CC[C@@H]([C@]4(CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@@H](CC)C(C)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VWDLOXMZIGUBKM-AUGXRQBFSA-N 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003685 thermal hair damage Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 206010044652 trigeminal neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 102000015533 trkA Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010064884 trkA Receptor Proteins 0.000 description 1
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002452 tumor necrosis factor alpha inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 102000038650 voltage-gated calcium channel activity Human genes 0.000 description 1
- 108091023044 voltage-gated calcium channel activity Proteins 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- BPKIMPVREBSLAJ-QTBYCLKRSA-N ziconotide Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]2C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CSSC2)C(N)=O)=O)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CSSC3)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(N1)=O)CCSC)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 BPKIMPVREBSLAJ-QTBYCLKRSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- WHNFPRLDDSXQCL-UHFFFAOYSA-N α-melanotropin Chemical compound C=1N=CNC=1CC(C(=O)NC(CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)NC(CCCCN)C(=O)N1C(CCC1)C(=O)NC(C(C)C)C(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCSC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(C)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WHNFPRLDDSXQCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- A61K38/1729—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение (варианты) относится к области медицины, фармакологии, биотехнологии, молекулярной биологии, генной инженерии и может быть использовано для анальгезии. Предложена плазмидная ДНК для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, представленная остовом, содержащим прокариотические и эукариотические элементы, и полинуклеотидом, кодирующим альфа-дефенсин человека HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3. Также предложена бактериальная клетка, продуцирующая заявленную плазмидную ДНК, и анальгетическое средство, содержащее заявленную плазмидную ДНК для применения у млекопитающих. Технический результат от использования вариантов изобретения выражается в расширении спектра анальгетических средств, в увеличении длительности анальгезии, в увеличении безопасности анальгезии, в упрощении и удешевлении производства анальгетика.
Description
Изобретение (варианты) относится к области медицины, фармакологии, биотехнологии, молекулярной биологии, генной инженерии и может быть использовано для анальгезии.
Важно признать, что боль является не просто индикатором основного заболевания или процесса повреждения, а самостоятельной проблемой, наносящей большой урон отдельным людям и обществу в целом. Для улучшения качества жизни облегчение боли как таковой должно стать терапевтической целью. Перспективный подход к лечению боли, к которому переходят в настоящее время, - выявление механизма и осуществление таргетной (нацеленной на конкретные молекулы) фармакологической терапии [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007].
Известно использование пептидных амидов [US 4459225 (А)], фенилгидразоновых производных, в качестве противовоспалительных или анальгетических агентов [ЕР 0952159 (В1)], синтетических пептидных амидов для профилактики и лечения боли [RU 2500685 С2]. Известно использование семейства пептидов, обладающих анальгетической активностью, общей формулы A-B-Tyr-Pro (DPro, dHPro, DdHPro, DLdhPro, Hyp)-C-X [WO 2008020778 (A1)], производного пептида, вводимого подкожно или орально, имеющего анальгетическую активность либо антиноцицептивную [US 2008009448 (А1)].
Недостатком химически синтезированных пептидов и их производных является возможность получения смеси искомых веществ с энантиомерами, что может привести к непредсказуемым результатам. Понятие энантиомерии играет важную роль в фармацевтике, поскольку разные энантиомеры лекарственных веществ, как правило, имеют различную биологическую активность. Использование живых систем для получения пептидных молекул позволяет получить молекулы природной структуры, гомогенную смесь.
Известна рекомбинантная плазмида для бактериальной экспрессии, содержащая гомологичный регулон или гетерологичную ДНК, последняя может кодировать полипептид с анальгетическим эффектом [SK 278170 (В6)]. Известно моносоединение индола с новой структурой, содержащее глубоководный макрогеномный кластер генов, синтезируемое в клетках Escherichia coli [CN 102477436 (А)]. Известен полипептид из актинии Heteractis crispa, обладающий выраженным анальгетическим действием [RU 2368621 C1, RU 2404245 С1], и способ его получения [RU 2415866 С1]. Известны пептиды с большим числом мостиковых связей, выделенных их ACTINOMADURA NAMIBIENSIS, для лечения невропатической боли, вызванной воспалением [RU 2498995 (С2)]. Однако в связи с тем, что такие молекулы происходят от организмов, далеких от человека, их действие должно быть изучено особо тщательно перед применением в человеке.
Известен гибридный белок на основе конотоксина (яда улитки) MV0 А и Trx, который можно использовать в подготовке обезболивающего для последних стадий рака и СПИДа, постоперационной боли, ожогов и т.д. [CN 1487085 (А)]. Известен способ получения конотоксина с использованием бакуловируса и клеток насекомых либо насекомых [CN 102876683 (А)]. Известны способы анальгезии и улучшения опиатной анальгезии введением омега-конопептидов TVIA (SNX-185) или MVIIA (SNX-111) [ЕР 0625162 (В1)], способы анальгезии с использованием альфа-конотоксинов [WO 2014023129 (A1), CN 102286079 (В), CN 103374066 (А)], конотоксина Lt7b [CN 102628048 (А)]. Известно использование омега-конопептида для производства медикамента для ингибирования прогресса нейропатической боли [ЕР 1336409 (В1)]. Известен полипептид скорпиона, обладающий анальгетическим и противоопухолевым действием [US 7592309 (В2), CN 101591668 (А)], и способ его применения [US7592309 (В2)] и получения [CN 101591668 (А)], сколопендры Scolopendra subspinipes mutilans - mu-SLPTX-Ssm6a, обладающий анальгетическим эффектом [CN 102977201 (А)]. Известны пептиды яда паука Grammostola spatulata, обладающие анальгетическим действием [US 5776896 (А)], пептид HWAP-I китайского паука-птицееда [US 6670329 (В2)]. Известны пептидные молекулы из яда змеи и их производные, гомологи, аналоги и миметики, способные индуцировать анальгезию или облегчение боли отдельно или в комбинации с другими анальгетическими молекулами [US 6613745 (B1), US 7902152 (В2)], а также укороченный нейротоксин морской змеи Lapemis hardwickii для анальгезии [US 7294697 (B2)].
Недостатком данной группы изобретений является то, что использование токсинов, даже фармацевтически чистых, все же является риском - при передозировке вплоть до смерти.
Известно использование нового полипептида - субъединицы 9.01 [CN 1345751 (А)], субъединицы 12.65 [WO 0212310 (А1)], субъединицы 9.46 [WO 0204504 (А1)], субъединицы 11.44 [CN 1352195 (А)] Gбелка человека для анальгезии. Известны полипептиды на основе рецептора G-белка HFIAO41 [US 2001016336 (A1)], HLYAZ61 [ЕР 0837128 (А2)], HUVCT36 [US 5912335 (А)], Н7ТВА62 [US 5955309 (A)], org10 [US 2003162945 (A1)], org11 [WO 0200725 (А2)] а также относящиеся к семейству IGS4 [AU 779993 (В2), US 6998255 (В1)]. Известны варианты сплайсированного рецептора G-белка, индуцированного вирусом Эпштейна-Барр EBI 3 [US 5874252 (А)].
Известны способы лечения боли, обусловленной раком кости, остеоартритом, послеоперационной боли путем введения антагониста фактора роста нервов (антитела) [RU 2389509 С2, RU 2429013 С2, RU 2338555 С2], известны партнеры специфического связывания с данной молекулой [RU 2406728 С2]. Показано, что молекулы, способные ингибировать связывание между NGF и рецептором TrkA, можно использовать в качестве анальгетиков с пролонгированным эффектом [RU 2427387 С2]. Известны и антитела против фактора роста нервов, обладающие повышенной стабильностью in vivo [RU 2011149263 А],
- 1 038673 высокой аффинностью к NGF [RU 2473564 С2], и лекарственная форма препарата гуманизированного антитела против фактора роста нервной ткани [RU 2427387 С2].
Известны способы лечения:
боли и воспаления с использованием пептида [RU 2011105280 А] разделением взаимодействия CRMP-2 и CaV2.2, в результате чего не происходит активация кальциевого канала N-типа (CaV2.2) [WO 2012009075 (А1)], а разделением взаимодействия LI-CAM, анкирина и потенциалзависимых кальциевых каналов лечат повреждение аксонов, ингибируют выброс нейромедиатора и передачу боли и блокируют кальциевую помпу в нейронах [US 7737250 (В2)], известен аналог пептидного токсина натриевых каналов Nav1.7 для анальгезии [US 2013296247 (А1)];
боли и воспаления в нейронной ткани с применением антагонистов IL-31, гуманизированного моноклонального антитела или химерного антитела [RU 2440130 С2], простатической кислой фосфатазы (РАР), ее активного варианта, фрагмента или производного [WO 2009064497 (А1)], невропатической боли с использованием антител против CCR2 [RU 2011110169 А], нейропатической боли с применением пептидов, являющихся производными просапонина [RU 2007119313 А], пептида, содержащего аминокислотную последовательность Thr-R1-Lue-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-GluIle-Leu-Tyr, где R1 является D-аланином, оказывающего воздействие на нейродегенеративное нарушение или нарушение миелинизации [RU 2266129 С2], белков с доменом цинковые пальцы, связанным с регуляторным доменом, которые способны активировать либо подавлять экспрессию целевого гена, связанного с нейропатической болью (VR1, NaV1.8, и TrkA) [US 8466267 (B2)];
невропатической или центральной сенсибилизационной боли с использованием последовательности выделенного гена, который регулируется в спинном мозге млекопитающего в ответ на механистически различные первую и вторую модели;
невропатической или центральной сенсибилизационной боли [US 2003108906 (А1), US 2003134301 (A1), US 2003138803 (A1), US 2004058326 (А1)];
хронической боли с использованием полипептидов TORC [RU 98118091 А], гистогранина и его химически стабильного аналога [СА 2219437 (А1)], линейных, циклических гистограниновых пептидов и псевдопептидов на их основе [US 6566327 (В1)], гибридного белка, содержащего IL-10 и IL-4 [WO 2013070076 (А1)], полипептидов на основе IL-10 [US 7261882 (В2)];
острой и хронической боли (различных форм боли) с использованием IL-13-связывающих белков [RU 2472807 С2], IL-12/р40-связывающих белков [RU 2012124438 A], IL-12/p41-связывающих белков [RU 2008103312 А], IL-17-связывающих белков [RU 2011140335 А], простогландин Е2-связывающих белков [RU 2011104228 А], иммуноглобулинов с двойным вариабельным доменом [RU 2515108 С2], иммуноглобулинов с двойным вариабельным доменом против простогландина Е2 [RU 2011104348 А], борьбы с хроническими или острыми приступами боли с использованием EE3-семейства белков [RU 2004114989 А], висцеральной боли с использованием полипептида, повышающего гуанилатциклазную активность рецепторов [RU 2433133 (С2)], невропатической боли, остеоартритической боли, воспалительной боли с использованием IL-1связывающих белков [RU 2012154210 А], воспалительных процессов артрита и других TNF-α опосредованных нарушений или патофизиологических механизмов, в частности различных форм боли, с применением стабильных и растворимых антител - ингибиторов TNF-α [RU 2415151 С2], боли при артрите с применением гуманизированного антитела-антагониста CGRP [RU 2467765 С2], боли, индуцированной по меньшей мере одним противораковым агентом, с применением как минимум одного ботулинического токсина или пептида на его основе [RU 2483747 С2], в том числе совместно с опиатным производным [RU 2434637 С2], боли с применением РАМ, ассоциированного с Myc белком [RU 2345785 С2], с применением подобного рецептору галанина GPCR полипептида [US 2004053244 (A1), US 2003073115 (А1), WO 0168843 (А1)], контулакина-G и его дегликозилированной формы [US 6696408 (В1), US 6525021 (В1)], с применением пептидных ингибиторов протеинкиназы С [US 7939493 (В2)], висцеральной боли путем введения антител-антагонистов, направленных против пептида, связанного с геном кальцитонина [RU 2012106468 А];
боли в животе с применением пептидов предпочтительно из Lactobacillus rhamnosus [RU 2011136454 А].
Известны способы снижения болевой чувствительности при физиологических и патофизиологических условиях (например, при аллодинии и гипералгезии), особенно восприятия боли, которая связана или опосредована механической чувствительностью через TRPA1, с использованием антагонистических антител TRPA1, предпочтительно моноклональных антител [RU 2430750 С2]. Известны противоболевые/ противовоспалительные агенты, выбранные из следующих классов антагонистов рецепторов, агонистов рецепторов и ингибиторов ферментов, каждый класс, действующий по различным молекулярным механизмам действия на боль и подавления воспаления: (4) антагонисты брадикининового рецептора (пептиды), антагонисты кальцитонин-ген опосредованного пептидного (CGRP) рецептора (альфа-CGRP-(8-37), (8) антагонисты интерлейкинового рецептора (Lys-D-Pro-Thr) [RU 2180852 С2], белка бета-целлюлина
- 2 038673 (ВТС) [JP 2000198744 (А)]. Известны способы уменьшения боли при модулируемом CRF2R расстройстве с использованием агонистов рецептора кортикотропин-рилизинг фактора (CRF 2R) [RU 2385878 С2], лечения боли с использованием пептида, обладающего свойствами амилина [RU 2385878 С2], пептидного агониста NOP [RU 2012106820 А], пептидов, содержащих два и более аминокислотных остатка фрагмента 11-28 вазоактивного интестинального пептида (VIP), доставляемых в ЦНС [WO 9104041 (А1)], производного пептида на основе кальцитонина [US 5446026A], полипептидов человека CGRP-RCF [US 5710024 (A), WO 9803534 (А1)], полипептидов -гуманизированных рецепторов CGRP, в том числе для лечения головной боли, хронической головной боли от напряжения, сильной приступообразной головной боли с периодическими рецидивами, профилактики мигреней [US 7193070 (В2)], полипептидов - новых сплайсированных вариантов 11cb человека [US 6033872 (А)], агонистов и антагонистов последнего белка [WO 9928492 (А1)], рецепторов с семью трансмембранными доменами [US 5824504 (A), US6277960 (B1), US 6277977 (В1), US 5955308 (A), US 6221627 (B1), US 2002106766 (A1), US5994098 (A), US 6174994 (В1), US 6037146 (A), US 5874243 (А)], пептида, имеющего фосфодиэстеразную активность [WO 0166716 (А1)], полипептидов - человеческих протеин-киназ hYAK3 и HOACF72 [ЕР 0870825 (В1) и US 5972606 (А) соответственно].
Известен гибридный белок на основе нейротрофического фактора головного мозга, получаемый с использованием прокариотической системы экспрессии растворимого белка [CN 1978466 (В), WO 9942480 (А1)]. Известны полипептиды на основе рецептора нейротензина типа 2 для лечения боли [US 6008050 (А)]. Известен конъюгат нейротензина или его аналогов с терапевтическим пептидом, который может быть использован для индукции гипотермии или анальгезии [WO 2010063122 (А1)]. Известны конформационно оптимизированные аналоги альфа-меланотропина, оказывающие специфическое воздействие на ЦНС [US 4649191 (А)]. Известен синтетический пептид, модулирующий выброс нейротрансмиттера, сходный со SNARE [KR 20090041066 (А)].
Известны пептиды, обладающие множеством функций, в том числе анальгезией, такие как пептиды с большим количеством мостиковых связей, выделяемые из Actinomadura namibiensis [RU 2010144778 А], пептид структуры DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD [RU 2508296 С2], пептидный модулятор пуринергических рецепторов РТ1 [RU 2422459 С1], дипептиды, содержащие на N-концевом аминокислотном остатке 2-тиоацильную группу в качестве ингибиторов вазопептидазы [RU 2298559 С2], тимусспецифический белок [RU 2398776 С2], полипептид, улучшающий метаболизм кальция [JP H03178993 (А)], а также пролекарственные композиции с высокой степенью проникновения на основе пептидов и родственных пептидам соединений [RU 2011149796 А].
Известен комбинированный подход к анальгезии с использованием синергического сочетания селективного ингибитора нейронального транспортера норадреналина и анальгезирующего средства в терапевтическом лечении позвоночных животных, включая человека, для обезболивания или для профилактики или облегчения боли [US 8188048 В2]. Известны пептиды - аналоги динорфина, которые при совместном введении с наркотическими или анальгетическими средствами усиливают действие последних, в том числе энкефалинов и аналогов бета-эндорфина [ЕР 0096592 В1].
Известны способы увеличения фармакологической активности веществ при оральном и парентеральном введении композиций с использованием пептида Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, связанного с группойпереносчиком, формирующего таким образом предшественник лекарства, используемый в том числе для лечения или облегчения боли [AU 2002228260 (B2)].
Использование одного высокоэффективного агента для анальгезии, простого и дешевого в производстве, является более выгодным вариантом.
Известно использование пептида дефенсина Hnp-1, одного или в комбинации с нейропептидом М, в качестве терапевтического агента для профилактики и/или лечения в том числе периферических сосудистых заболеваний, включая анестезию, распространяющуюся боль, каузалгию (жгучая боль) [WO 2009/043461 А1].
Использование молекул белковой природы, которые не задумывались в качестве индукторов иммунного ответа, в том числе антительного, может быть осложнено именно этими последствиями, что может привести к побочным эффектам, например, связанным с формированием аутоантител.
Известно использование малой интерферирующей РНК, а также короткой шпилечной РНК для генного нокдауна субъединицы NR1 подкожного рецептора N-метил-D-аспартата для снижения воспалительной боли или невыносимой хронической боли, в особенности клинической хронической боли и боли при ожогах [US 8372817 (В2), US 8575330 (В2), US 8361985 (В2)]. Известен РНК-интерферирующий агент для лечения хронической боли [WO 2013126963 (А1)]. Однако препараты РНК довольно быстро разрушаются вне организма, также требуются специальные условия хранения, что ставит промышленную применимость препаратов на основе РНК под вопрос.
Известен способ длительной анальгезии, по которому пациенту вводят миогенные клетки, в которых с соответствующей ДНК синтезируется пептид, активирующий опиоидный рецептор, либо опосредующий связывание субстанции Р с рецептором [US 7166279 (В2)]. Однако осуществление данного способа довольно сложное и связано со многими рисками.
Известны методы лечения депрессии и боли, агентом может быть белок, РНК или ДНК [WO
- 3 038673
2013177484 (А1)]. Известны лентивирусные векторы для лечения боли, содержащие G-белок вируса бешенства [ЕР1425403 (В1)], а также аденовирус, кодирующий IL-24 [CN 101518655 (А)], в том числе для облегчения боли при раке. Известен онкостатин М либо его гомолог, синтезирующиеся с вектора для переноса генов: лентивируса, ретровируса, вируса Сендай, аденовируса и аденоассоциированного вируса, в том числе для лечения боли [JP 4803789 (В2)]. Известно лечение аллодинии, гипералгезии, спонтанных болей и фантомных болей с использованием кометина-полипептида, который может быть доставлен как полипептид либо введением экспрессионного вектора для экспрессии кометина, клеточная линия, трансформированная либо трансфецированная данным белком, и капсула, содержащая указанные клетки [WO 2013034157 (А1)]. Вирусные векторы имеют ряд недостатков, в их числе то, что они дорогостоящи и могут вызывать воспалительную реакцию, что исключает повторное введение вектора. Также вирусные вектора обладают способностью реплицироваться, что снижает степень контроля над экспрессией таргетного белка, что, в свою очередь, не всегда желательно и применимо, в особенности в отношении анальгезии.
Известна рекомбинантная ДНК-вакцина на основе вектора pVAX1, нацеливающегося на опухоль, в том числе для лечения боли при онкологии, содержащего ген, кодирующий циклооксигеназу-2 (СОХ-2), мышиный убиквитин Mubi, а также ISS иммуностимулирующие последовательности ДНК (pVAX1mUbi-ISS-COX-2-ISS) [CN 101648011 (А)]. Однако данная конструкция нацелена вызвать иммунный ответ на нее, цитотоксический, для чего в нее введены элементы, обуславливающие и усиливающие иммуногенность. Известна в том числе фармацевтическая композиция, в которой содержится вектор, в том числе плазмидная ДНК, и фармацевтически приемлемый эксципиент, либо адъювант, для облегчения, профилактики или лечения боли, вектор содержит нуклеотидную последовательность, содержащую хотя бы одну область, модулирующую экспрессию рецептора VR1 [US 2006154886 (А1)]. В данном случае анальгезия осуществляется через блокирование рецептора, связанного с ионным каналом - неспецифическим проводником катионов. Использование плазмидной ДНК, несущей ген, с которого в клетках млекопитающих синтезируется дефенсин, в качестве средства, индуцирующего анальгезию, позволит также минимизировать возможность развития патогенов в организме: как правило, при болях любой этиологии ухудшается самочувствие и уменьшается способность организма противостоять инфекциям, в результате, после, например, оперативного вмешательства могут назначать антибиотики, а использование природного противомикробного пептида позволит объединить и анальгезию, и защитный эффект, в результате, можно отказаться от приема антибиотиков.
Близкими аналогами предлагаемого изобретения являются изобретения, описанные в патенте CN 101648011 (А) и заявке на изобретение US 2006154886 (А1), в которых раскрыты анальгетики в форме плазмидной ДНК.
Показано, что при внутримышечном введении экспрессионного ДНК вектора он поглощается мышечными клетками, и происходит экспрессия белка, закодированного в вводимом векторе [J.A. Wolff et al., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi et al., Nature 352, 815 (1991)]. Показано, что плазмиды поддерживаются в виде эписомы и не реплицируются. Постоянная экспрессия была продемонстрирована после внутримышечной инъекции также в скелетные мышцы крыс, рыб и приматов, а также сердечную мышцу крыс [Н. Lin et al, Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen et. al, FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff et al., Human Mol. Genet. 1,363 (1992)]. Возможно и использование иных технологий доставки плазмидной ДНК в клетки различных тканей, например безыгольного шприца, позволяющего осуществить доставку в клетки различных тканей живых животных [Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, (1992)].
Показано, что в норме мышечные волокна не экспрессируют антигены МНС, однако при воспалении, связанном с инфекцией, или в присутствии интерферона гамма мышечные волокна способны продуцировать антигены в составе комплекса с МНС первого класса либо даже второго класса [Meckert, P.C, Hontebeyrie-Joskowicz, М., Chambo, J., Levin, M. and Laguens, R.P. (1991). Trypanosoma cruzi: Aberrant expression of class II major histocompatibility complex molecules in skeletal and heart muscle cells of chronically infected mice. Exp. Parasitol. 72, 8-14; Hohlfeld and Engel, A.G. (1984) The immunobiology of muscle. Immunol. Today 15, 269-274; Mantegazza, R. and Bernasconi, P. (1994). Cellular aspects of myositis. Curr. Opin. Rheumatol. 6, 568-574, Hartikka J., Sawdey M., Cornefert-Jensen F., Margalith M., Barnhart K., Nolasco M., Vahlsing H.L., Meek J., Marquet M., Hobart P., Norman J., Manthorpe M. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum Gene Ther. 1996 Jun 20; 7 (10): 1205-17], в связи с чем предпочтительным является введение плазмидной ДНК, при котором травмирование мышечной ткани минимизировано.
Показано, что даже при иммуногенности в испытаниях на лабораторных животных у человека препараты на основе плазмидной ДНК не являются иммуногенными [Saade F., Petrovsky N. Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines. Expert Rev Vaccines. 2012 Feb; 11(2):189-209. doi: 10.1586/erv.11.188]. Исследователям также не удалось найти доказательства патологических изменений после повторных инъекций ДНК у мышей или кроликов [Parker S.E., Borellini F., Wenk M.L., et al. Plasmid DNA malaria vaccine: tissue distribution and safety studies in mice and rabbits. Hum. Gene Ther. 1999; 10 (5): 741-758.]. В 2007 году в руководстве FDA США по ДНК-вакцинам пришли к выводу, что доклинические исследова- 4 038673 ния не требуются для оценки эффекта в отношении аутоиммунных заболеваний.
Плазмидная ДНК должна содержать существенные для организмов ее поддержания и использования элементы, вкупе с соответствующими регуляторными последовательностями. Регуляторные последовательности - нуклеотидные последовательности, способные повлиять на экспрессию гена на уровне транскрипции и/или трансляции, а также на механизмы, обеспечивающие существование и поддержание функционирования плазмидной ДНК.
Существенными для прокариотической системы являются ориджин репликации и репортерный ген. Бактериальные элементы плазмидной ДНК не должны отрицательно влиять на экспрессию в клетках млекопитающих и обуславливать побочный эффект от применения плазмидной ДНК. В литературе имеются данные о том, что использование гена устойчивости к ампициллину может быть нежелательным в связи с развитием реакции у пациентов на ампициллин, однако авторы считают такие последствия связанными с низким качеством очистки плазмидной ДНК, но не самим элементом.
Существенными элементами плазмид для использования у млекопитающих являются промотор, лидерная последовательность мРНК, терминирующая последовательность.
Промотор является важным компонентом плазмиды, который запускает экспрессию интересующего гена. Классические промоторы для плазмидных ДНК-компонентов препаратов - это CMV человека/немедленно-ранний или CMV-chicken-β actin (CAGG) промотор. Промоторы CMV используются для большинства ДНК-вакцин, так как они опосредуют высокие уровни конститутивной экспрессии в широком диапазоне тканей млекопитающих [Manthorpe M., Cornefert-Jensen F., Hartikka J., et al. Gene therapy by intramuscular injection of plasmid DNA: studies on firefly luciferase gene expression in mice. Hum. Gene Ther. 1993; 4 (4): 419-431] и не подавляют прочитывание downstream. Увеличение уровня экспрессии наблюдают при изменении CMV промотора, например, включением HTLV-1R-U5 downstream от промотора цитомегаловируса или при использовании химерного SV40-CMV промотора [Williams J.A., Carnes A.E., Hodgson С.Р. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009; 27(4): 353-370]. Альтернативой CMV промоторам служат тканеспецифические промоторы хозяина, которые позволяют избежать конститутивной экспрессии антигенов в неподходящих тканях, что в целом приводит к снижению иммуногенности [Cazeaux N., Bennasser Y., Vidal P.L., Li Z., Paulin D., Bahraoui E. Comparative study of immune responses induced after immunization with plasmids encoding the HIV-1 Nef protein under the control of the CMV-IE or the muscle-specific desmin promoter. Vaccine. 2002; 20 (27-28): 3322-3331].
Лидерная последовательность мРНК также играет большую роль. Последовательность Козака непосредственно перед стартовым кодоном ATG позволяет увеличить экспрессию [Kozak M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position+4 but is not generally affected by the nucleotides in positions+5 and +6. EMBO J. 1997; 16 (9): 2482-2492]. Наличие интрона в плазмиде downstream от промотора может повысить стабильность мРНК и увеличить экспрессию гена.
Использование видоспецифичных кодонов позволяет увеличить экспрессию гена [Frelin L., Ahlen G., Alheim M., et al. Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis С virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther. 2004; 11 (6): 522-533].
На экспрессию генов можно повлиять путем изменения терминирующей последовательности, которая необходима для сохранения стабильности мРНК, надлежащего прекращения транскрипции и экспорта мРНК из ядра, в том числе ее укорачиванием. Во многих современных ДНК-вакцинах используют последовательность терминатора транскрипции бычьего гормона роста [Montgomery D.L., Shiver J.W., Leander K.R., et al. Heterologous and homologous protection against influenza A by DNA vaccination: optimization of DNA vectors. DNA Cell Biol. 1993; 12 (9): 777-783]. Полиаденилирование (полиА) необходимо для стабилизации транскрипта. Изменение последовательности полиА может привести к увеличению уровня экспрессии гена [Norman J.A., Hobart P., Manthorpe M., Feigner P., Wheeler С. Development of improved vectors for DNA-based immunization and other gene therapy applications. Vaccine. 1997; 15 (8): 801-803]. В плазмиде pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) область терминатора бычьего гормона роста содержит область гомопурина, которая чувствительна к нуклеазе. Показано, что альтернативная полиА последовательность может значительно улучшить стабильность плазмиды к нуклеазе [Azzoni A.R., Ribeiro S.C., Monteiro G.A., Prazeres D.M.F. The impact of polyadenylation signals on plasmid nuclease-resistance and transgene expression. J Gene Med. 2007; 9: 392-402]. Введение двух стоп-кодонов позволяет увеличить эффективность терминатора транскрипции.
Оптимальная конструкция плазмиды для осуществления назначения должна объединять бактериальные и эукариотические элементы с соответствующими регуляторными последовательностями, чтобы обеспечить высокую копийность в процессе производства и высокий уровень экспрессии у млекопитающих [Saade F., Petrovsky N. Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines. Expert Rev Vaccines. 2012 Feb; 11(2): 189-209. doi: 10.1586/erv.11.188].
Для создания анальгетического средства по настоящему изобретению можно использовать плазмидную ДНК, как минимум стандартно применяющуюся для доставки генов и их экспрессии в организме млекопитающего, в том числе человека, а также оптимизированную по вышеперечисленным параметрам, в том числе подробно описанным в статье Williams et al., 2009 [Williams J.A., Carnes A.E., Hodgson
- 5 038673
C.P. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009; 27 (4): 353-370]. В руководстве FDA (2007) заявлено, что исследования биораспределения вещества после его введения в организм могут быть отменены для ДНК-вакцин, производимых клонированием нового гена в плазмидный вектор, в отношении которого ранее документально установлено приемлемые биораспределение и профиль интеграции. В руководстве ВОЗ (2007) заявлено, что исследования биологического распределения и сохранения требуются, если еще не имеется значительный опыт работы с почти идентичным или аналогичным продуктом. В руководстве ЕМЕА (2006) заявлено, что опыт работы с векторной системой позволит оптимизировать и сфокусироваться на доклинических исследованиях. Исследования по безопасности с использованием ДНК-векторов с различными клонированными генами продемонстрировали аналогичное биораспределение [Sheets R.L., Stein J., Manetz T.S., Duffy C., Nason M., Andrews C., Kong W.P., Nabel G.J., Gomez P.L. Biodistribution of DNA plasmid vaccines against HIV-1, Ebola, Severe Acute Respiratory Syndrome, or West Nile virus is similar, without integration, despite differing plasmid backbones or gene inserts. Sheets R.L., Stein J., Manetz T.S., Duffy C., Nason M., Andrews C., Kong W.P., Nabel G.J., Gomez P.L.Toxicol Sci. 2006 Jun; 91 (2): 610-9. Epub 2006 Mar 28.] и токсикологию [Sheets R.L., Stein J., Manetz T.S., Andrews C., Bailer R., Rathmann J., Gomez P.L. Toxicological safety evaluation of DNA plasmid vaccines against HIV-1, Ebola, Severe Acute Respiratory Syndrome, or West Nile virus is similar despite differing plasmid backbones or gene-inserts. Toxicol Sci. 2006 Jun; 91 (2): 620-30. Epub 2006 Mar 28]. Для плазмидной ДНК для применения у млекопитающих, кроме человека, требования менее строгие, в связи с чем возможно использование более широкого спектра плазмид.
Для ДНК, предназначенной для использования человеком, может быть полезно иметь конечный продукт ДНК в фармацевтически приемлемом носителе или буферном растворе. Фармацевтически приемлемые носители или буферные растворы известны из уровня техники и включают те, которые описаны в различных текстах, таких как, например, Remington's Pharmaceutical Sciences.
Прототипом вариантов изобретения является изобретение, раскрытое в заявке на изобретение WO 2009/043461 А1: применение дефенсина HNP-1 для лечения в том числе боли.
Дефенсины составляют большое семейство низкомолекулярных (3-5-кДа) цистеинбогатых катионных пептидов, стабилизированных несколькими (как правило, тремя) дисульфидными связями [Ganz, Т. 2002. Immunology: Versatile defensins. Science 298: 977-979, Lehrer, R.I. and Ganz, T. 2002. Defensins of vertebrate animals. Curr. Opin. Immunol. 14: 96-102], которые способны к киллингу широкого спектра патогенов, включая разнообразные бактерии, грибы, а также оболочечные вирусы. У человека это семейство представлено α-субсемейством (HNP) и β-субсемейством (hBD) дефенсинов. Альфа-дефенсины наиболее представлены в нейтрофилах и клетках Панета. HNP-1 и HNP-3 содержат в своем составе всего 30 аминокислотных остатков, эти пептиды идентичны друг другу, за исключением замены аланина на аспарагин в положении 1. HNP-2 - протеолитический продукт HNP-1 и HNP-3 содержит 29 аминокислотных остатков (отсутствует первая аминокислота с N-конца). Наличие дисульфидных связей обеспечивает сохранение устойчивости молекул дефенсинов к многочисленным лейкоцитарным и микробным протеиназам и сохранение антибиотических свойств в очаге воспаления и тканевой деструкции [Levy О. Antimicrobial proteins and peptides: anti-infective molecules of mammalian leukocytes. J. of Leukocyte Biology. 2004; 76: 909-926]. Получение данных молекул правильной пространственной структуры является довольно сложной задачей.
Гены, кодирующие дефенсины, образуют кластер в локусе р22-23 на 8 хромосоме. HNP 1-3 кодируются двумя генами HDEFA1 и HDEFA3. Каждый ген дефенсинов содержит несколько экзонов, которые кодируют препропептид.
Вначале дефенсины синтезируются в виде предшественников как препропептиды, длина которых составляет 94 аминокислотных остатка. Препропептиды содержат сигнальный участок (в среднем 19 аминокислотных остатков), анионный участок (в среднем 45 аминокислотных остатков) и собственно зрелый пептид. В результате протеолитического отщепления в эндоплазматическом ретикулуме от препропептида происходит удаление сигнального участка и образование продефенсина (в среднем 75 аминокислотных остатков). Последующее созревание (отщепление 45 аминокислотных) остатков происходит в зрелых гранулах нейтрофилов. α-Дефенсины обнаружены также в NK клетках, В-лимфоцитах, γδ Т-лимфоцитах, моноцитах/макрофагах и эпителиальных клетках [А.С. Будихина, Б.В. Пинегин. Дефенсины - мультифункциональные катионные пептиды человека. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2008, № 2:31-40]. Авторами настоящего изобретения впервые продемонстрировано, что введение плазмидной ДНК, несущей ген, кодирующий HNP-1/HNP-2/HNP-3, приводит к анальгезии, причем при этом наблюдали увеличение уровня бета-эндорфина в сыворотке.
Недостатки аналогов и прототипа приведены непосредственно после их описания. Заявленное изобретение (варианты) свободно от этих недостатков.
Технический результат от использования вариантов изобретения выражается, во-первых, в расширении спектра анальгетических средств. При плохой переносимости или непереносимости аналогов представитель предложенных вариантов анальгетика позволит осуществить анальгезию, за счет чего пациент получит возможность осуществить действия, которые не мог либо не хотел осуществить без
- 6 038673 анальгезии, например, решиться на требуемую процедуру, а также улучшит качество жизни, например получит меньше неприятных ощущений, чем без использования анальгетика, либо сможет облегчить острую либо хроническую боль. Указанный технический результат достигается тем, что используют анальгетик по настоящему изобретению (варианты).
Кроме того, технический результат заключается в увеличении длительности анальгезии и достигается тем, что используют плазмидную ДНК, с которой после введения в организм синтезируется альфадефенсин человека HNP-1/HNP-2/HNP-3; а также тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая дефенсин человека, содержит элементы, обуславливающие стабильность мРНК и соответственно увеличивающие время полужизни мРНК, в результате синтез белка с одной молекулы мРНК осуществляется большее количество раз, а также в результате увеличивается количество синтезируемого белка; а также тем, что нуклеотидная последовательность альфа-дефенсина человека кодонно оптимизирована для экспрессии в млекопитающих, в результате синтез белка идет интенсивнее. При внедрении в практику это позволит существенно снизить количество вводимой плазмидной ДНК (в 10-50 раз) по сравнению с дозами, используемыми в настоящее время в отечественной и мировой практике при генной терапии.
Помимо этого, технический результат заключается в увеличении безопасности анальгезии. Указанный технический результат достигается тем, что в качестве действующего вещества используется не белок, на который могут образоваться антитела, что при применении молекулы, используемой в организме ее происхождения, может вызвать серьезные побочные эффекты, а плазмидная ДНК, которая существует в виде эписомы и не интегрирует в геном, с которой синтезируется и затем секретируется из клетки белок человека, в результате осуществляется неиммуногенное, безопасное использование дефенсина человека для анальгезии. Указанный технический результат также достигается тем, что синтезируемый в организме с плазмидной ДНК белок подвергается естественному посттрансляционному процессингу, а также обеспечивается правильный фолдинг белка за счет клеточных шаперонов. Данные модификации труднодостижимы при производстве белков, что может драматически сказаться на ряде их функций. Указанный технический результат также достигается за счет того, что используются природные механизмы метаболизма и катаболизма действующего вещества без образования токсичных продуктов благодаря естественной природе плазмидной конструкции и кодируемого ею белка, а также идентичности образуемого белка эндогенному аналогу. Указанный технический результат также достигается тем, что плазмидная ДНК не реплицируется после введения в организм млекопитающего, что позволяет осуществлять контроль над количеством синтезируемого белка и соответственно над анальгезией. Указанный технический результат достигается и за счет наличия в плазмидной ДНК таких регуляторных последовательностей, как сайленсер и/или инсулятор, в одном из вариантов изобретения, благодаря чему также осуществляется контроль над количеством синтезируемого белка и, в принципе, синтезом белка, как таковым, и соответственно над анальгезией: при необходимости есть возможность в быстрый срок остановить либо уменьшить экспрессию гена. В последнем варианте возможно и осуществление тканеспецифической экспрессии при необходимости.
Технический результат также заключается в упрощении и удешевлении производства анальгетика за счет избегания сложностей производства и процессов очистки белковых препаратов in vitro благодаря тому, что синтез белка происходит in vivo. Производство, очистка и хранение ДНК препаратов экономически выгоднее, чем белковых, так как первые более стабильны, их можно нарабатывать в больших количествах и с меньшими затратами.
Показано, что изменение концентрации бета-эндорфина в плазме крови находится в прямой зависимости от вида болевого синдрома, его интенсивности и эффективности анальгезии, что может служить критерием оценки эффективности обезболивания [Бета-эндорфин - маркер эффективности обезболивания при острой боли и хроническом болевом синдроме у онкологических больных [З.В. Павлова и др.//Проблемы клинической медицины. - 2007. - N1. - С. 36-40. - ISSN 1817-8359]. При введении анальгетика по настоящему изобретению наблюдали увеличение уровня бета-эндорфина в сыворотке (фиг. 3).
По временным характеристикам можно выделить два типа боли:
острую боль - новую недавнюю боль, неразрывно связанную с вызвавшим ее повреждением и, как правило, являющуюся симптомом какого-либо заболевания, исчезает при устранении повреждения [Eddy N.B., Leimbach D.J.//Pharmacol Exp Ther. - Mar; 107 (3): 385-93. - 1953] (в том числе пред- и послеоперационная, посттравматическая, при ожогах, острая боль во время рождения ребенка, боль, вызванная травмой спинного мозга, острая головная боль, боль при ВИЧ/СПИДе, кризисе серповидных клеток, при невралгии тройничного нерва, панкреатите и других болях в ЖКТ, при инфаркте миокарда и других крупных сердечных событиях, интервенционная боль (при диагностических и терапевтических процедурах), острая при хронической боли [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007], которая длится до 2-3 месяцев, причем может иррадиировать, и хроническую боль - продолжающуюся длительный период времени (свыше 2-3 месяцев) даже после устранения причины, ее вызвавшей, часто приобретает статус самостоятельной болезни, например воспалительного процесса [Eddy N.B., Leimbach D.J.//Pharmacol Exp Ther. - Mar; 107 (3): 385-93. - 1953], причем наблюдается снижение эффективности анальгетиков. К хронической боли можно отнести хроническую боль при злокачественной болезни (включая боль у больных раком, ВИЧ/СПИД, при боковом
- 7 038673 амиотрофическом склерозе (ALS), рассеянном склерозе, при конечной стадии отказа органа, расширенной хронической обструктивной болезни легких, расширенной застойной сердечной недостаточности, паркинсонизме) и хроническую боль, не связанную со злокачественной болезнью (хронические скелетно-мышечные боли, такие как спинная боль или боли в пояснице, при хроническом дегенеративном артрите, остеоартрите, ревматоидном артрите, миофасциальная и ревматическая боли, хроническая головная боль, мигрень, боли в костях; невропатические боли (в том числе боли при нервных сжатиях, травмах, боли после повреждения нерва и ампутации), при диабетической невропатии, сложные региональные болевые синдромы (тип I и тип II), при спазмах скелетных мышц, при постгерпетической невралгии, хронические боли после хирургических вмешательств; висцеральная боль (при растяжении полости внутренностей и коликах) и хроническая боль при серповидно-клеточной анемии [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007].
С использованием настоящего анальгетика возможно облегчить и нивелировать оба описанных типа боли. Как видно из уровня техники, плазмидный анальгетик, с которого в клетках млекопитающих синтезируется альфа-дефенсин человека, неизвестен. Множественность и характер элементов плазмидной ДНК требуют уточняющих характеристик. Произведенная характеристика изобретения в части сущность изобретения, в части подробное описание изобретение поясняет формулу изобретения и включает подробное описание существенных элементов плазмидной ДНК, что позволяет осуществить изобретение во всех представленных вариантах, за счет чего достигается описанный технический результат.
Сущность изобретения
Предложена плазмидная ДНК для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, содержащая прокариотические ориджин репликации и репортерный ген или ген устойчивости к антибиотику, эукариотические сильный промотор и лидерную последовательность мРНК, а также регуляторные последовательности для указанных элементов, по меньшей мере один сайт для клонирования гена интереса и по меньшей мере один сайт для посадки по меньшей мере одного праймера для анализа состава плазмидной ДНК, полинуклеотид, представленный секреторной последовательностью, фрагментом, кодирующим альфа-дефенсин человека HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, кодонно-оптимизированными для экспрессии в клетках млекопитающих, и терминирующей последовательностью. В одном из вариантов изобретения белок, кодируемый полинуклеотидом, представлен SEQ ID NO: 1, либо SEQ ID NO: 2, либо SEQ ID NO: 7, либо SEQ ID NO: 8. В одном из вариантов изобретения полинуклеотид представлен SEQ ID NO: 3, либо SEQ ID NO: 4, либо SEQ ID NO: 5, либо SEQ ID NO: 6, либо SEQ ID NO: 9, либо SEQ ID NO: 10, либо SEQ ID NO: 11, либо SEQ ID NO: 12.
Также предложена бактериальная клетка, продуцирующая заявленную плазмидную ДНК и анальгетическое средство, содержащее заявленную плазмидную ДНК в эффективном количестве, также содержащее фармацевтически приемлемый эксципиент, для применения у млекопитающих, в частности человека.
Подробное описание изобретения
Плазмидную ДНК экономически наиболее выгодно нарабатывать в прокариотических клетках, преимущественно бактериальных клетках. В связи с этим плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит элементы для поддержания и амплификации преимущественно в больших количествах в клетках бактерий. Такими существенными элементами являются бактериальные ориджин репликации, для поддержания в клетке со средней, предпочтительно высокой копийностью, и репортерный ген или ген устойчивости к антибиотику для возможности селекции штамма-продуцента. Подходящий ориджин репликации представлен pM1 (der.), ColE1 (der.) и F1, pUC и F1, но не ограничивается ими. Подходящий ген устойчивости к антибиотику, например ампициллин, преимущественно канамицин, но не ограничивается ими.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит элементы для эффективного функционирования в клетках млекопитающих.
Таким элементом является промотор с соответствующими регуляторными последовательностями из природных промоторов со своими регуляторными элементами (СаМ kinase II, CMV, nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, p-globin, GFAP, GAP43, тирозингидроксилаза, субъединица 1 каинатного рецептора и субъединица В глутаматного рецептора и другие) либо синтетических промоторов с регуляторными последовательностями для получения необходимого характера экспрессии (соотношения продолжительности и уровня экспрессии) таргетного гена на уровне транскрипции.
Возможные регуляторные последовательности по отношению к промотору:
энхансер, для увеличения уровня экспрессии через улучшение взаимодействия РНК-полимеразы и ДНК.
инсулятор, для модулировании функций энхансера, сайленсеры либо их фрагменты, для снижения уровня транскрипции, например, для тканеспецифической экспрессии,
5' нетранслируемая область до промотора, включая интрон.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит от одной из вышеприведенных регулятор
- 8 038673 ных последовательностей в зависимости от варианта плазмидной ДНК, основанного на выборе промотора и желаемых параметрах экспрессии таргетного гена. Опираясь на существующий уровень техники, на известные и очевидные варианты таких элементов и их использования, плазмидная ДНК по настоящему изобретению может содержать любые отвечающие вышеуказанным условиям комбинации, при которых с плазмидной ДНК осуществляется синтез альфа-дефенсина HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3 в клетках млекопитающих. При использовании сайленсера либо инсулятора в составе конструкции возможно регулировать экспрессию таргетного гена, гена, описанного альфа-дефенсина человека HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3 (вариантов).
Иные регуляторные последовательности:
нетранслируемая область downstream от промотора, включая интрон, для повышения стабильности мРНК и увеличения экспрессии таргетного гена.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению в одном из вариантов дополнительно содержит такой регуляторный элемент.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит и такой важный элемент, как лидерную последовательность мРНК, содержащую последовательность Козака непосредственно перед стартовым кодоном ATG.
Плазмидная ДНК также содержит сайт, преимущественно сайты, разные, для клонирования таргетного гена, для осуществления правильной ориентации таргетного гена в плазмидной ДНК, и сайт, преимущественно сайты, для посадки праймеров для его секвенирования.
Плазмидная ДНК также содержит терминирующую последовательность, содержащую последовательно стоп-кодон, 3' нетранслируемую область с сигналом и сайтом полиаденилирования, стоп-кодон, за счет которой сохраняется стабильность мРНК и осуществляется надлежащее прекращение траскрипции и экспорт мРНК из ядра. Терминирующая последовательность представлена нативной, т.е. присущей таргетному гену, либо иной, более сильной, которая представлена, например, терминирующей последовательностью бычьего гормона роста (BGH), но ею не ограничивается, и во втором варианте может содержать дополнительный стоп-кодон перед 3' нетранслируемой областью. Опираясь на существующий уровень техники, на известные и очевидные варианты такого элемента, плазмидная ДНК по настоящему изобретению может содержать любую отвечающую вышеуказанным условиям терминирующую последовательность, при которой с плазмидной ДНК осуществляется синтез альфа-дефенсина HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3 в клетках млекопитающих.
Плазмидная ДНК также содержит нативную либо гетерологичную секреторную последовательность, кодонно-оптимизированную для млекопитающих. В одном варианте изобретения содержит, например, секреторную последовательность ТРА (tissue-type plasminogen activator isoform 1 preproprotein [Homo sapiens], NCBI Reference Sequence: NP_000921.1), но ею не ограничивается. Преимущество использования секреторной последовательности ТРА - в обширном предшествующем клиническом опыте, а также в том, что показана ее высокая производительность в отношении экспрессии секретируемого белка с различных генов-мишеней.
Плазмидная ДНК содержит и фрагмент, кодирующий альфа-дефенсин человека HNP-1, либо HNP2, либо HNP-3, кодонно-оптимизированный для экспрессии в клетках млекопитающих.
Кодонная оптимизация проведена для увеличения экспрессии таргетного гена за счет увеличения эффективности считывания информации с данной мРНК на рибосомах.
Плазмидная ДНК также может дополнительно содержать исходные для кДНК указанных генов элементы, обуславливающие стабильность данной мРНК, такие как терминирующую последовательность (3' нетранслируемая область, содержащая сигнал и сайт полиаденилирования, а также сигнал терминации транскрипции - стоп-кодон). Соответственно в данном случае в остове плазмидной ДНК отсутствуют либо не функционируют аналогичные элементы.
Плазмидная ДНК для доставки гена, обуславливающего анальгезию, сочетает в себе такие свойства ДНК-вакцины на основе плазмидной ДНК, как высокий уровень экспрессии гена интереса в клетках млекопитающих, и такие свойства вектора для генной терапии, как отсутствие иммуногенности и длительность экспрессии гена, однако, например, за счет увеличения стабильности мРНК. Такая ДНК не встраивается в геном и не реплицируется в клетках млекопитающих.
Подходящие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих представлены известными среднему специалисту в данной области и описанными в литературе [Hartikka J., Sawdey M., Cornefert-Jensen F., Margalith M., Barnhart K., Nolasco M., Vahlsing H.L., Meek J., Marquet M., Hobart P., Norman J., Manthorpe M. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum Gene Ther. 1996 Jun 20; 7 (10): 1205-17 и др.], а также плазмидами, которые могут быть созданы средним специалистом в данной области с использованием рекомендаций по элементам векторов [Cloning Vectors, ed. Pouwls et al., Elsevier, Amsterdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018, Williams J.A., Carnes A.E., Hodgson C.P. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol Adv. 2009 Jul-Aug; 27 (4): 353-70. doi: 10.1016/j.biotechadv.2009.02.003. Epub 2009 Feb 20. Review и др.]. Предпочтительными плазмидными ДНК для использования у человека являются векторы, проверенные на людях, содержащие описанные выше элементы с соответствующими регуляторными последовательно
- 9 038673 стями, возможно, модифицированные для соответствия заявленным критериям, что позволяет уменьшить количество требуемых исследований для регистрации средства. Однако возможно и использование иных плазмидных ДНК, содержащих требуемые описанные элементы.
Последовательность расположения описанных элементов в плазмидной ДНК понятна среднему специалисту в данной области.
Предложен продуцент плазмидной ДНК на основе бактериальной клетки (на основе клеток, преимущественно Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, но не ограничиваясь ими). Среднему специалисту в данной области понятно, что, используя плазмидную ДНК согласно изобретению и бактериальную клетку, например, коммерческую, но ею не ограничиваясь, можно создать продуцент плазмидной ДНК, например, стандартными методами, например, трансфекцией, электропорацией или пушкой с частицами. Для уменьшения вероятности возникновения мутаций благодаря метилированию плазмидной ДНК предпочтительно использовать штамм микроорганизма, не содержащий метилазу в геноме.
Также предложено анальгетическое средство на основе охарактеризованной плазмидной ДНК, в эффективном количестве, также содержащее фармацевтически приемлемый эксципиент, для применения у млекопитающих, в частности человека. Данная фармацевтическая композиция - для лечения, облегчения и/или профилактики боли, в частности острой или хронической боли, нарушений чувствительности.
Авторами настоящего изобретения проведены лабораторные исследования, подтверждающие возможность реализации группы охарактеризованных изобретений. Полученные результаты исследований проиллюстрированы примерами 1-3 и фиг. 1-3.
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1. Результаты теста горячая пластина. Ось абсцисс - латентное время облизывания передних и задних лап, ось ординат - время после введения исследуемого вещества. Легенда: 1 - отрицательный контроль (вводили физ. раствор), 2 - pVAX1seq3, 3 - pVR1012seq4, 4 - pVR1012seq5, 5 - pVAX1seq6, 6 pVR1012seq9, 7 - pVAX1seq10, 8 -pVAX1seq11, 9 - pVR1012seq12, 10 - pcDNA3.1+ seq11, 11 - pcDNA3.1+ (var)seq12, 12 -анальгин (50 мг/кг), 13 - морфин гидрохлорид (10 мг/кг), 14 - pVAX1, 15 - pVR1012, 16 pcDNA3.1+, 17 - pcDNA3.1+(var). Плазмидные ДНК вводили в количестве 5 мг/кг.
Фиг. 2. Результаты исследования различных доз плазмидной ДНК pVAX1seq3 в тесте горячая пластина. Ось абсцисс - латентное время облизывания передних и задних лап, ось ординат - время после введения исследуемого вещества. Легенда: 1 - отрицательный контроль (вводили физ. раствор), 2 pVAX1seq3 1 мг/кг, 3 - pVAX1seq3 5 мг/кг, 4 - pVAX1seq3 10 мг/кг, 6 - анальгин (50 мг/кг), 7 - морфин гидрохлорид (10 мг/кг).
Фиг. 3. Результаты исследования изменения концентрации бета-эндорфина в сыворотке мышей. Ось абсцисс - время после введения исследуемого вещества, ось ординат - концентрация бета-эндорфина в сыворотке. Легенда: 1 - отрицательный контроль (вводили физ. раствор), 2 - pVR1012, 3 - pVR1012seq4. Плазмидные ДНК вводили в количестве 5 мг/кг.
Пример 1. Получение плазмидных ДНК, кодирующих альфа-дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3.
1.1. Осуществляли химический синтез ДНК, охарактеризованной SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:9 - SEQ ID NO:12, дополнительно фланкированной сайтами рестрикции, с добавлением последовательности Козака. Для SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 10 использовали сайты рестрикции NheI (5'), BamHI (3'), для SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 9 использовали сайты рестрикции SalI (5'), KpnI (3'), для SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 12 использовали сайты рестрикции SalI (5'), BamHI (3'), для SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11 использовали сайты рестрикции NheI (5'), ApaI (3').
1.2. Осуществляли клонирование синтезированных генов в плазмиды pVAX1 (Invitrogen) и pVR1012 (Vical). Также осуществили клонирование последовательности SEQ ID NO:11 в вектор pcDNA3.1+ (Invitrogen) по сайтам рестрикции NheI (5'), ApaI (3'). Также получили вектор pcDNA3.1+, неспособный к экспрессии неомицина, за счет рестрикции данного вектора рестриктазой NsiI, в области SV40 промотора (-71 п.о.). В полученный вектор клонировали SEQ ID NO:12 по сайтам рестрикции NheI (5'), ApaI (3').
1.3. На реакцию лигирования брали 3 мкл раствора синтезированной ДНК, 1 мкл раствора готового вектора, 5 мкл буфера для лигирования х2 и 1 мкл Т4-лигазы. Реакцию проводили при +20°C в течение 2 ч.
После этого смесь прогревали при +95°C в течение 10 мин и очищали от солей диализом на нитроцеллюлозных фильтрах с диаметром пор 0,025 мкм (Millipore, США). Диализ проводили против раствора, содержащего 0,5 мМ ЭДТА в 10% глицерине, в течение 10 мин.
Получили следующие плазмидные ДНК: pVAX1seq3, pVR1012seq4, pVR1012seq5, pVAX1seq6, pVR1012seq9, pVAX1seq10, pVAX1seq11, pVR1012seq12, pcDNA3.1+ seq11, pcDNA3.1+ (var)seq12.
1.4. Затем трансформировали клетки E. coli штамма DH10B/R (F-mcrA, A(mrr-hsdRMS-mcrBC), ^80dlacZAM 15, AlacX74, deoR, recA1, endA1, araD139, A(ara,leu)769, galU, galKλ-, rpsL, nupG) полученными плазмидными ДНК методом электропорации с использованием электропоратора MicroPulser (BioRad). Данный штамм не содержит метилазу, что позволяет минимизировать возможность возникновения
- 10 038673 мутаций в ДНК, в том числе в клонированном в плазмиде, поддерживаемой в данном штамме, гене. К 12 мкл компетентных клеток добавляли 1 мкл диализованной лигазной смеси, помещали между электродами порационной ячейки и обрабатывали импульсом тока.
После трансформации клетки помещали в 1 мл SOC-среды (2% бактотриптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) и инкубировали в течение 40 мин при +37°C.
1.5. Проводили выявление клонов клеток E. coli, содержащих полученную плазмидную ДНК, на селективной среде, содержащей LB-агар, 50 мкг/мл канамицина, либо ампициллина (для плазмидных ДНК на основе pcDNA3.1+).
Из выросших клонов выделяли плазмидную ДНК. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора Wizard Minipreps DNA Purification System (Promega, США). Очищенную рекомбинантную плазмидную ДНК проверяли с помощью секвенирования.
1.6. Секвенирование клонированных фрагментов проводили по методу Сэнджера с использованием набора Applied Biosystems BigDye® Terminator (BDT) v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) по прилагающейся к нему инструкции. Для мечения продуктов реакции использовали меченные флуоресцентным красителем ddNTP, причем каждому ddNTP соответствовал свой краситель. Для секвенирования использовали немеченные специфические для плазмид праймеры. Проводили ПЦР-реакцию, затем реакционную смесь очищали от свободных меченых ddNTP по инструкции к набору BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США) и разделяли продукты реакции секвенирования с использованием капиллярного секвенатора Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) и реактива 3500/3500xL Genetic Analyzer Polymer POP-6™ (Applied Biosystems, США).
Результаты разделения продуктов реакции секвенирования регистрировались путем сканирования лазером и детекции четырех флуоресцентных красителей, включенных во все типы ddNTP.
1.7. Компьютерный анализ последовательностей ДНК проводили с помощью персонального компьютера с использованием программ Chromas и BioEdit. Нуклеотидные последовательности исследованных фрагментов ДНК были выровнены относительно рассчитанных, была продемонстрирована идентичность синтезированных фрагментов рассчитанным. В результате были отобраны клоны клеток E. coli, содержащие полноразмерные последовательности таргетных генов в составе плазмид последовательности ДНК, кодирующие альфа-дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3.
Пример 2. Наработка плазмидных ДНК, кодирующих альфа-дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, для проведения исследования на лабораторных животных.
Отдельную колонию E.coli, выращенную на LB-агаре в чашке Петри с добавлением канамицина (либо ампициллина), помещали в 10 мл селективной среды. Клетки растили в течение ночи при +37°C в условиях постоянного перемешивания (250 об/мин.). Полученные клетки собирали центрифугированием при 4000g. Дальнейшее выделение и очистку плазмидной ДНК осуществляли с использованием набора EndoFree Plasmid Mega Kit (Qiagen), позволяющего получить апирогенную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК анализировали электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле, измеряли ее концентрацию с помощью флуориметрии.
В качестве контрольного раствора использовали воду без добавления тестируемого препарата. В ячейку для измерения оптической плотности объемом 2 мл вносили 1,950 мл воды и 0,05 мл тестируемого раствора, перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 260 нм. Определение концентрации ДНК проводили по формуле
С(мкг/мл)=4ОА2боК, где A260-оптическая плотность препарата, измеренная при длине волны 260 нм; К (мкг/мл) - для ДНК 50 мкг/мл (50 мкг/мл двухцепочечной ДНК в воде); 40 - разведение тестируемого препарата.
В итоге определили, что получили плазмидную ДНК pVAX1seq3 с концентрацией 3,4 мг/мл, pVR1012seq4 - 3,7 мг/мл, pVR1012seq5 - 4 мг/мл, pVAX1seq6 - 3,8 мг/мл, pVR1012seq9 - 4,1 мг/мл, pVAX1seq10 - 4 мг/мл, pVAX1seq11 - 4,3 мг/мл, pVR1012seq12 - 4,5 мг/мл, pcDNA3.1+seq11 - 4,4 мг/мл, pcDNA3.1+(var)seq12 - 4,3 мг/мл. Выход плазмидной ДНК составил от 3,4 до 4,5 мг из 1 л питательной среды.
О чистоте полученного препарата плазмидной ДНК судили по отношению оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 260 нм, к оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 280 нм (А260/А280), и отношению оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 260 нм, к оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 230 нм (А260/А230). Измерения проводили в водном растворе, в качестве контрольного раствора использовали воду без добавления тестируемого препарата.
Для чистых препаратов ДНК характерно А260/А280>1,80 и А260/А230>1,80. Определенные в эксперименте значения соответствовали значениям отношений A260/A280 и А260/А230 для чистых препаратов, для всех полученных препаратов плазмидной ДНК.
Также проводили количественное определение примесей белка в полученных препаратах плазмид
- 11 038673 ных ДНК pVAX1seq3, pVR1012seq4, pVR1012seq5, pVAX1seq6, pVR1012seq9, pVAXlseqlO, pVAXlseqll, pVR1012seq12, pcDNA3.1+seq11, pcDNA3.1+(var)seq12 с помощью microBCA assay [Smith, P.K., et all, Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analyt. Biochem. 150, 76-85 (1985)], измеряя оптическую плотность образующихся окрашенных белковых комплексов с медью и бицинхониновой кислотой при длине волны 562 нм. Чувствительность метода microBCA assay составляет 0.5-20 мкг/мл белка. Концентрация тотального белка ни в одном из исследуемых препаратов плазмидной ДНК не превышала норму (от 0,5 до 12 мкг/мг плазмидной ДНК).
Определяли и содержание бактериального липополисахарида в препаратах плазмидных ДНК с использованием гель-тромб варианта ЛАЛ-теста с чувствительностью >0,25 EU/мл (ToxinSensor, GenScript, США). ЛАЛ-реагентом служил лизат амебоцитов подковообразного краба Limulus polyphemus. ЛАЛреактив специфически реагирует с бактериальными эндотоксинами, в результате ферментативной реакции происходит изменение реакционной смеси, пропорциональное концентрации эндотоксина. Результаты оценивали по наличию или отсутствию плотного тромба на дне пробирки путем переворачивания пробирки. Гель-тромб не образовался при исследовании образца, разведенного в 10 раз, для препаратов плазмидных ДНК pVAX1seq3, pVR1012seq4, pVR1012seq5, pcDNA3.1+(var)seq12 и в 5 раз для препаратов плазмидных ДНК pVAX1seq6, pVR1012seq9, pVAX1seq10, pVAX1seq11, pVR1012seq12, pcDNA3.1+seq11 т.е. при чувствительности метода 2,5 и 1,25 EU/мл соответственно, что, учитывая концентрацию плазмидной ДНК в образце, говорит о допустимом показателе очистки от эндотоксинов.
Пример 3. Определение анальгетического эффекта плазмидной ДНК, кодирующей альфа-дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3.
3.1. Тест Горячая пластина.
Проводили исследование анальгетической активности плазмидных ДНК, кодирующих альфадефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, с использованием теста Горячая пластина (hot plate).
Тест Горячая пластина (Hot plate) проводили для измерения порога острой болевой чувствительности и потенциального анальгезирующего эффекта изучаемых препаратов плазмидной ДНК [Вальдман А.В., Игнатов Ю.Д. Центральные механизмы боли. - Л.: Наука. - 1976]. Тест является базисным для исследования анальгетической активности, его используют для выявления анальгетически активных соединений.
При помещении на горячую поверхность с достижением порога болевой чувствительности со стороны животного наблюдаются двигательные реакции беспокойства: одергивание лап, облизывание подушечек лап и подпрыгивание. В данном тесте учитывали латентное время с момента помещения животного на горячую поверхность до первого облизывания лап. Данная методика позволяет определять показатели: анальгетическая активность тестируемого объекта, пиковое время анальгезии, длительность анальгезии.
В исследовании использовали мышей линии BALB/C, самок массой 15-22 г, возраста 18 недель. В опыте было сформировано 17 групп животных, включая контрольные группы, в каждой группе по 3 мыши:
- отрицательный контроль (вводили физраствор),
- pVAX1seq3,
- pVR1012seq4,
- pVR1012seq5 5 - pVAX1seq6,
- pVR1012seq9 7 - pVAX1seq10 8 - pVAX1seq11,
- pVR1012seq12 10 - pcDNA3.1+seq11,
- pcDNA3.1+(var)seq12,
- анальгин (50 мг/кг),
- морфин гидрохлорид (10 мг/кг) 14 - pVAX1,
- pVR1012,
- pcDNA3.1+,
- pcDNA3.1+(var).
Вводили по 5 мг/кг плазмидных ДНК.
Использовали прибор Hot plate-метр (Hotplate Analgesia Meter, Columbus Instruments, USA).
До начала испытания в течение 10 мин давали тест-системам акклиматизироваться в комнате для проведения исследования. Животных использовали однократно, так как повторное помещение животного на термостатируемую пластину вызывает незамедлительную реакцию на касание поверхности. Устанавливали температуру термостата 55°C. После инъекции исследуемого вещества животное аккуратно помещали на нагревательную пластину и в тот же момент нажимали кнопку старт на панели прибора. Отмечали латентное время облизывания передних и задних лап (с момента помещения животного на поверхность прибора до первого облизывания). После этого нажимали на кнопку стоп и убирали животное с горячей поверхности. Иные поведенческие реакции игнорировали. Для уменьшения вероятности теплового повреждения подушечек лап максимальное время эксперимента не превышало 60 с. Для определения пикового времени анальгетического действия препарата измеряли латентное время облизывания передних и задних лап у контрольной группы (физраствор) (точка 0) и через 2, 12, 24 ч после введения
- 12 038673 препарата у тестируемых групп. Поверхность прибора протирали салфеткой, смоченной дезинфектантом (0,5% хлоргексидин-биглюконат на 70% этаноле), перед помещением на нее очередного животного [Методические рекомендации для обучаемых. Фармацевтический факультет ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава. - Москва. - 2006].
Проводили анализ данных определения анальгетической активности препарата. Для плазмидной ДНК, показавшей наилучший результат, определяли ED50, т.е. дозу, необходимую для проявления 50%-й анальгетической активности препарата.
Результаты опыта представлены на фиг. 1. Препараты всех исследуемых плазмидных ДНК, кодирующих дефенсин HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, проявляют выраженное анальгезирущее действие, не уступающее по эффективности морфину и превышающее анальгетическую активность анальгина. Наблюдали небольшую степень анальгезии через 2 ч после введения плазмид, затем анальгезия усиливалась, и через 12 и 24 ч наблюдали одинаковый высокий уровень анальгезии, что говорит о поддержании эффекта.
В эксперименте с применением различных доз плазмидной ДНК, показавшей наилучший результат в предыдущем опыте (pVAX1seq3), продемонстрирован дозозависимый характер анальгезии в интервале от 1 до 10 мг/кг (фиг. 2). При этом по прошествии 12 ч показатели при использовании плазмидной ДНК pVAX1seq3 в минимальной концентрации 1 мг/кг были практически идентичны показателям в группе использования морфина гидрохлорида 10 мг/кг. Через 24 ч показатель в группе плазмидной ДНК в минимальной концентрации превысил таковой группы использования морфина гидрохлорида 10 мг/кг практически в 2 раза. Действие анальгина наблюдали только по прошествии 2 ч после введения анальгетика, ответ через 12 и 24 ч был аналогичен таковому в контрольной группе. При использовании плазмидной ДНК pVAX1seq3 в концентрации 5 и 10 мг/кг наблюдали значительное увеличение (до 15%) латентного периода по сравнению с группой с минимальной концентрацией плазмидной ДНК, при этом различие между этими двумя группами было небольшое.
3.2. Исследование концентрации бета-эндорфина в сыворотке мышей.
Поскольку изменение концентрации бета-эндорфина в плазме крови может служить критерием оценки эффективности обезболивания [бета-эндорфин - маркер эффективности обезболивания при острой боли и хроническом болевом синдроме у онкологических больных/3.В. Павлова [и др.]//Проблемы клинической медицины. -2007. - N1. - С. 36-40. - ISSN 1817-8359], проводили исследование концентрации бета-эндорфина в сыворотке исследуемых мышей после введения плазмидной ДНК, на примере введения плазмидной ДНК, кодирующей HNP-2, либо HNP-3 (pVR1012seq4), с использованием набора ELISA Kit for Beta-Endorphin (bEP) Mus musculus (Mouse) CEa806Mu (Life science Inc.).
Результаты исследования приведены на фиг. 3. Видно, что уровень бета-эндорфина значительно поднялся при введении плазмидной ДНК pVR1012seq4, при том, что при введении плазмидной ДНК без вставки таргетного гена и в контрольной группе значительное увеличение уровня бета-эндорфина не наблюдали на протяжении всего эксперимента.
Таким образом, продемонстрированы возможность создания различных вариантов плазмидной ДНК, кодирующей HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, их получения с использованием бактериального продуцента, а также анальгетическое действие такой плазмидной ДНК, в любом из вариантов, соответствующих указанным критериям, причем даже в минимальной концентрации 1 мг/кг (меньше в 10 раз, чем морфина гидрохлорида), а также продемонстрирована безопасность применения такой плазмидной ДНК: животные не погибли, побочные эффекты не наблюдали.
Claims (5)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Плазмидная ДНК для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, содержащая прокариотические ориджин репликации и репортерный ген или ген устойчивости к антибиотику, эукариотические сильный промотор и лидерную последовательность мРНК, а также регуляторные последовательности для указанных элементов, по меньшей мере один сайт для клонирования гена интереса и по меньшей мере один сайт для посадки по меньшей мере одного праймера для анализа состава плазмидной ДНК, полинуклеотид, представленный секреторной последовательностью, фрагментом, кодирующим альфадефенсин человека HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3, кодонно-оптимизированными для экспрессии в клетках млекопитающих, и терминирующей последовательностью.
- 2. Плазмидная ДНК по п.1, характеризующаяся тем, что белок, кодируемый полинуклеотидом, представлен SEQ ID NO: 1, либо SEQ ID NO: 2, либо SEQ ID NO: 7, либо SEQ ID NO: 8.
- 3. Плазмидная ДНК по п.1 либо 2, характеризующаяся тем, что полинуклеотид представлен SEQ IDNO: 3, либо SEQ ID NO: 4, либо SEQ ID NO: 5, либо SEQ ID NO: 6, либо SEQ ID NO: 9, либо SEQ IDNO:10, либо SEQ ID NO: 11, либо SEQ ID NO: 12.
- 4. Бактериальная клетка, продуцирующая плазмидную ДНК по любому из пп.1-3.
- 5. Анальгетическое средство, содержащее плазмидную ДНК по любому из пп.1-3 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый эксципиент, для применения у млекопитающих.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014145169/15A RU2597789C2 (ru) | 2014-11-10 | 2014-11-10 | Анальгетическое средство на основе плазмидной днк, кодирующей hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3 (варианты) |
PCT/RU2015/000756 WO2016076761A1 (ru) | 2014-11-10 | 2015-11-10 | Плазмидная днк, кодирующая hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3, бактериальный продуцент, анальгетическое средство (варианты) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201790929A1 EA201790929A1 (ru) | 2017-09-29 |
EA038673B1 true EA038673B1 (ru) | 2021-10-01 |
Family
ID=55954714
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201790929A EA038673B1 (ru) | 2014-11-10 | 2015-11-10 | Плазмидная днк, кодирующая дефенсин hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20180057837A1 (ru) |
EP (1) | EP3219798B1 (ru) |
JP (1) | JP2017535288A (ru) |
KR (1) | KR20170077252A (ru) |
CN (1) | CN107208087A (ru) |
BR (1) | BR112017009607A2 (ru) |
EA (1) | EA038673B1 (ru) |
HK (1) | HK1243732A1 (ru) |
IL (1) | IL252730B (ru) |
RU (1) | RU2597789C2 (ru) |
WO (1) | WO2016076761A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA036780B1 (ru) * | 2017-11-26 | 2020-12-21 | Илья Владимирович ДУХОВЛИНОВ | Плазмидная днк, кодирующая бета-эндорфин, бактериальный продуцент, анальгетическое средство |
US11358895B2 (en) * | 2018-11-15 | 2022-06-14 | Owens-Brockway Glass Container Inc. | Batch charger for a melting chamber |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020182703A1 (en) * | 1997-08-29 | 2002-12-05 | Genset, S.A. | Human defensin polypeptide Def-X, genomic DNA and cDNA, composition containing them and applications to diagnosis and to therapeutic treatment |
US20060036083A1 (en) * | 2002-02-19 | 2006-02-16 | Joel Moss | Modified defensins and their use |
WO2006097110A2 (en) * | 2005-03-18 | 2006-09-21 | Novozymes A/S | Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same |
WO2009043461A1 (en) * | 2007-09-11 | 2009-04-09 | Mondobiotech Laboratories Ag | Use of a hnp-1 defensin peptide, alone or in combination with neuropeptide af, as a therapeutic agent |
CN101648011A (zh) * | 2008-08-11 | 2010-02-17 | 同济大学附属上海市肺科医院 | 一种肿瘤靶向重组dna疫苗及其制备与应用 |
WO2013151668A2 (en) * | 2012-04-02 | 2013-10-10 | modeRNA Therapeutics | Modified polynucleotides for the production of secreted proteins |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002238568A (ja) * | 2001-02-14 | 2002-08-27 | Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk | アレルギー性疾患の検査方法 |
AU2005311099B2 (en) * | 2004-12-02 | 2012-02-02 | Domantis Limited | Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and GLP-1 or PYY |
CN101175770A (zh) * | 2005-03-18 | 2008-05-07 | 诺维信公司 | 具有抗微生物活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 |
CN100445371C (zh) * | 2005-10-18 | 2008-12-24 | 甘肃亚盛盐化工业集团有限责任公司 | 一种利用大肠杆菌生产人α防御素1蛋白的方法 |
CN1904036B (zh) * | 2005-10-18 | 2010-09-01 | 甘肃亚盛盐化工业集团有限责任公司 | 基因工程菌混合培养生产三种人α防御素的方法 |
FR2893619A1 (fr) * | 2005-11-21 | 2007-05-25 | Chu Nice | Proteine chimere lectine-defensine |
CN101280318B (zh) * | 2008-05-30 | 2011-05-11 | 四川大学 | 重组人hnp基因脂质体复合物、制备方法及用途 |
CN102586256A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-07-18 | 华南理工大学 | 人β-防御素3在酵母菌表达系统中的表达方法 |
RU2012114261A (ru) * | 2012-04-10 | 2013-10-20 | Илья Владимирович Духовлинов | Анальгетическое средство на основе плазмидной днк |
-
2014
- 2014-11-10 RU RU2014145169/15A patent/RU2597789C2/ru active
-
2015
- 2015-11-10 JP JP2017544270A patent/JP2017535288A/ja active Pending
- 2015-11-10 CN CN201580072724.XA patent/CN107208087A/zh active Pending
- 2015-11-10 BR BR112017009607-2A patent/BR112017009607A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-11-10 WO PCT/RU2015/000756 patent/WO2016076761A1/ru active Application Filing
- 2015-11-10 EP EP15858310.4A patent/EP3219798B1/en not_active Not-in-force
- 2015-11-10 EA EA201790929A patent/EA038673B1/ru unknown
- 2015-11-10 KR KR1020177015883A patent/KR20170077252A/ko unknown
- 2015-11-10 US US15/524,782 patent/US20180057837A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-06-06 IL IL25273017A patent/IL252730B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-03-07 HK HK18103246.6A patent/HK1243732A1/zh unknown
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020182703A1 (en) * | 1997-08-29 | 2002-12-05 | Genset, S.A. | Human defensin polypeptide Def-X, genomic DNA and cDNA, composition containing them and applications to diagnosis and to therapeutic treatment |
US20060036083A1 (en) * | 2002-02-19 | 2006-02-16 | Joel Moss | Modified defensins and their use |
WO2006097110A2 (en) * | 2005-03-18 | 2006-09-21 | Novozymes A/S | Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same |
WO2009043461A1 (en) * | 2007-09-11 | 2009-04-09 | Mondobiotech Laboratories Ag | Use of a hnp-1 defensin peptide, alone or in combination with neuropeptide af, as a therapeutic agent |
CN101648011A (zh) * | 2008-08-11 | 2010-02-17 | 同济大学附属上海市肺科医院 | 一种肿瘤靶向重组dna疫苗及其制备与应用 |
WO2013151668A2 (en) * | 2012-04-02 | 2013-10-10 | modeRNA Therapeutics | Modified polynucleotides for the production of secreted proteins |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
DAVID M. HOOVER et al. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis, Nucleic Acids Research, 2002, Vol.30, no. 10, e43, p. 1-7 * |
JAMES A. WILLIAMS et al. Plasmid DNA Vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production, Biotechnol Adv., 2009, Vol.27, no.4, pp.353-370. doi: 10.1016/j.biotechadv.2009.02.003, p.1-38 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK1243732A1 (zh) | 2018-07-20 |
JP2017535288A (ja) | 2017-11-30 |
RU2597789C2 (ru) | 2016-09-20 |
EP3219798A4 (en) | 2018-04-25 |
BR112017009607A2 (pt) | 2018-04-03 |
US20180057837A1 (en) | 2018-03-01 |
EP3219798A1 (en) | 2017-09-20 |
WO2016076761A1 (ru) | 2016-05-19 |
EP3219798B1 (en) | 2019-07-17 |
IL252730A0 (en) | 2017-08-31 |
IL252730B (en) | 2019-10-31 |
CN107208087A (zh) | 2017-09-26 |
EA201790929A1 (ru) | 2017-09-29 |
KR20170077252A (ko) | 2017-07-05 |
RU2014145169A (ru) | 2016-05-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10981964B2 (en) | Fusion protein comprising IL-4 and IL-10 | |
WO2019104092A1 (en) | Partial agonists of interleukin-2 | |
CN111132999A (zh) | 支架蛋白 | |
WO2017190684A1 (zh) | 白细胞介素组合及其用途 | |
TW201617364A (zh) | 用於治療代謝異常之組成物及方法 | |
CN103140236A (zh) | 生长激素多肽及其制备和使用方法 | |
JP2005336202A (ja) | マクロファージ炎症蛋白変種 | |
JP2017533201A (ja) | 疾患及び障害の治療のためにインターロイキン−10を使用する方法 | |
TW202400634A (zh) | 一種用於癌症、肥胖、代謝失調、及相關併發症與合併症之精胺酸消耗劑的組成物及用途 | |
WO2017134592A1 (en) | Anti-cd20/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same | |
KR20230017804A (ko) | Rhfgf21 융합 단백질, rhfgf21 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, rhfgf21 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 rhfgf21 융합 단백질의 용도 | |
EP3219798B1 (en) | Dna plasmid, coding hnp-1, or hnp-2, or hnp-3, bacterial producer, analgesic agent (variants) | |
KR20130043242A (ko) | Sparc 혈관형성 영역과 사용방법 | |
JP5819439B2 (ja) | 修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−1ポリペプチドまたはその断片及びその製造方法 | |
CN111448320A (zh) | 细胞膜穿透肽 | |
EP4151659A1 (en) | Biological macromolecular target-specific complement inhibitor, preparation method therefor, and application thereof | |
EP3385285B1 (en) | Fusion protein for á melanocyte stimulating hormone and preparation method and use thereof | |
KR101466875B1 (ko) | 항종양괴사인자 수용체 2를 발현하도록 설계된 미니서클 벡터를 이용한 자가면역질환 치료 | |
JP2013529900A (ja) | B細胞活性化因子の拮抗物質、その調製方法及び利用法 | |
CN114456274A (zh) | 抗Her-2抗体-趋化因子融合蛋白及其制法和应用 | |
JP7375163B2 (ja) | Tgf-ベータトラップ | |
US20230137756A1 (en) | Synthetic Soluble Receptor Mimics and Methods of Use for Treatment of COVID-19 | |
NL2022982B1 (en) | A fusion protein comprising IL13 | |
EP4159744A1 (en) | Novel anti-inflammatory peptide and use thereof | |
WO2019103659A1 (en) | Plasmid dna encoding beta-endorphin, bacterial producer, analgesic agent |