EA036780B1 - Плазмидная днк, кодирующая бета-эндорфин, бактериальный продуцент, анальгетическое средство - Google Patents
Плазмидная днк, кодирующая бета-эндорфин, бактериальный продуцент, анальгетическое средство Download PDFInfo
- Publication number
- EA036780B1 EA036780B1 EA201792364A EA201792364A EA036780B1 EA 036780 B1 EA036780 B1 EA 036780B1 EA 201792364 A EA201792364 A EA 201792364A EA 201792364 A EA201792364 A EA 201792364A EA 036780 B1 EA036780 B1 EA 036780B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- plasmid dna
- endorphin
- beta
- expression
- seq
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 143
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 title claims abstract description 52
- WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N beta-endorphin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N 0.000 title claims abstract description 50
- 101800005049 Beta-endorphin Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 25
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 129
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000010415 tropism Effects 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 claims 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 abstract description 22
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 abstract description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 40
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 108010069820 Pro-Opiomelanocortin Proteins 0.000 description 7
- 239000000683 Pro-Opiomelanocortin Substances 0.000 description 7
- 102000008235 Toll-Like Receptor 9 Human genes 0.000 description 7
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 7
- 208000005298 acute pain Diseases 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 5
- 108010049140 Endorphins Proteins 0.000 description 5
- 102000009025 Endorphins Human genes 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 229960005195 morphine hydrochloride Drugs 0.000 description 4
- XELXKCKNPPSFNN-BJWPBXOKSA-N morphine hydrochloride trihydrate Chemical compound O.O.O.Cl.O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O XELXKCKNPPSFNN-BJWPBXOKSA-N 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- DJGAAPFSPWAYTJ-UHFFFAOYSA-M metamizole sodium Chemical compound [Na+].O=C1C(N(CS([O-])(=O)=O)C)=C(C)N(C)N1C1=CC=CC=C1 DJGAAPFSPWAYTJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 3
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 208000022371 chronic pain syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 2
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000008533 pain sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010006002 Bone pain Diseases 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- -1 CMV Proteins 0.000 description 1
- 102000004657 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010003721 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- 241000255930 Chironomidae Species 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 1
- 208000023890 Complex Regional Pain Syndromes Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 101000979249 Homo sapiens Neuromodulin Proteins 0.000 description 1
- 108700020134 Human immunodeficiency virus 1 nef Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000079 Kainic Acid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010069902 Kainic Acid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 208000008930 Low Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 206010028347 Muscle twitching Diseases 0.000 description 1
- 206010028391 Musculoskeletal Pain Diseases 0.000 description 1
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010029174 Nerve compression Diseases 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 102100023206 Neuromodulin Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 229920012196 Polyoxymethylene Copolymer Polymers 0.000 description 1
- 206010036376 Postherpetic Neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000020764 Sensation disease Diseases 0.000 description 1
- 206010040642 Sickle cell anaemia with crisis Diseases 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 102300063576 Tissue-type plasminogen activator isoform 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003502 anti-nociceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009956 central mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000009191 jumping Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940005483 opioid analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003429 pore cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003685 thermal hair damage Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 206010044652 trigeminal neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 208000009935 visceral pain Diseases 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/675—Beta-endorphins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/35—Animals modified by environmental factors, e.g. temperature, O2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, фармакологии, биотехнологии, молекулярной биологии, генной инженерии и может быть использовано для анальгезии. Предложена плазмидная ДНК для транзиентной экспрессии полинуклеотида в клетках млекопитающих, содержащая прокариотические и эукариотические элементы, фрагмент, обеспечивающий усиленный захват плазмидной ДНК клетками, и полинуклеотид, кодирующий модифицированный для увеличения тропности к рецепторам бета-эндорфин, который оптимизирован по кодонному составу для экспрессии в клетках млекопитающих. Также предложена бактериальная клетка, продуцирующая заявленную плазмидную ДНК, и средство, обладающее анальгезирующим действием, для применения у млекопитающих, содержащее заявленную плазмидную ДНК. Технический результат от использования разработанной плазмидной ДНК и анальгетика на ее основе заключается в увеличении контролируемости синтеза именно бета-эндорфина, в увеличении эффективности плазмидной ДНК, с которой синтезируется бета-эндорфин, и в уменьшении ее количества для достижения анальгезии, в увеличении длительности анальгезии и в расширении спектра анальгетических средств.
Description
Изобретение относится к области медицины, фармакологии, биотехнологии, молекулярной биологии, генной инженерии и может быть использовано для анальгезии.
Важно признать, что боль является не просто индикатором основного заболевания или процесса повреждения, а самостоятельной проблемой, наносящей большой урон отдельным людям и обществу в целом. Для улучшения качества жизни облегчение боли как таковой должно стать терапевтической целью.
Показано, что изменение концентрации бета-эндорфина в плазме крови находится в прямой зависимости от вида болевого синдрома, его интенсивности и эффективности анальгезии [Бета-эндорфин маркер эффективности обезболивания при острой боли и хроническом болевом синдроме у онкологических больных / З.В. Павлова и др. // Проблемы клинической медицины. - 2007. - № 1. - С. 36-40. - ISSN 1817-8359]. Данный эндогенный опиоид способен уменьшать боль. Однако введение эндогенных опиоидов либо молекул на их основе может быть осложнено формированием антител на них, что может привести к побочным эффектам.
Известны рекомбинантные вирусы, несущие ген предшественника эндорфина либо эндорфина.
Известен вектор pRetro-Off-POMC на основе ретровируса, кодирующий проопиомеланокортин (РОМС), предшественника бета-эндорфина, для осуществления синтеза бета-эндорфина в отсутствие доксициклина [https://doi.org/10.1016/S1525-0016(16)40805-1].
Однако доставка гена в организм с использованием вирусного вектора имеет ряд существенных недостатков, связанных с рисками инфицирования и специфичных реакций на сам вектор такой природы, например, может возникнуть воспалительная реакция, что исключает повторное введение вектора. Получение несет риски попадания в организм веществ, которые могут вызвать различные нежелательные эффекты, либо является сложным и экономически не выгодным. Также вирусные векторы обладают способностью реплицироваться, что снижает степень контроля над экспрессией целевого белка, что, в свою очередь, не всегда желательно и применимо, в особенности в отношении анальгезии.
Плазмидные ДНК являются более безопасным средством доставки целевого гена в организм. Показано, что плазмиды поддерживаются в виде эписомы и не интегрируют в геном, с них синтезируется и затем секретируется из клетки белок, в результате осуществляется неиммуногенное, безопасное использование данного белка для анальгезии. Синтезируемый в организме с плазмидной ДНК белок подвергается естественному посттрансляционному процессингу, а также обеспечивается правильный фолдинг белка за счет клеточных шаперонов. Данные модификации труднодостижимы при производстве белков, что может драматически сказаться на ряде их функций. Используются природные механизмы метаболизма и катаболизма действующего вещества, без образования токсичных продуктов, благодаря естественной природе плазмидной конструкции и кодируемого ею белка. Плазмидная ДНК не реплицируется после введения в организм млекопитающего, что позволяет осуществлять контроль над количеством синтезируемого белка и соответственно над анальгезией.
Следует также отметить, что производство, очистка и хранение ДНК препаратов экономически выгоднее, чем белковых, так как первые более стабильны, их можно нарабатывать в больших количествах и с меньшими затратами.
Известны следующие плазмидные ДНК, кодирующие бета-эндорфин.
Для осуществления контролируемой антиноцицептивной генной терапии вводят систему из трех плазмид, индуцируемую тетрациклином, кодирующих бета-эндорфин, тетрациклиновый активатор транскрипции и тетрациклиновый сайленсер транскрипции (PMID: 18064731). Введение плазмид электропереносом осуществлялось в спинной мозг. Доксициклин для регуляции экспрессии эндорфина вводили внутрибрюшинно. Экспрессия эндорфина осуществлялась только при введении доксициклина. Предлагают также вводить систему из трех плазмид в полость позвоночного канала для облегчения боли в конечностях, вызванной сдавливанием седалищного нерва. Однако следует отметить, что синтез эндорфина в данном случае контролируется синтезом активатора транскрипции, который, в свою очередь, синтезируется под воздействием доксициклина, - данная система является сложно регулируемой. Также хотелось бы осуществлять введение более безопасным способом. Меньшее количество вариантов вводимых плазмид также является предпочтительным, поскольку снижает иммуногенность вводимого препарата ДНК и уменьшает риск, что какой-то компонент системы не будет работать.
Известна система из двух плазмид, кодирующих РОМС и сайленсер, контролируемая доксициклином, также вводимая в спинной мозг электропереносом [PMID: 15116065]. Однако недостатки те же, что и у описанной выше системы.
Известно средство для уменьшения или супрессии боли у высших животных, в том числе человека, на основе в одном из вариантов экспрессионных конструктов, содержащих CMV промотор; ген, кодирующий РОМС, либо РОМС, в котором фрагменты, кодирующие АКТГ и P-MSH, заменены на бетаэндорфин; сайт полиаденилирования [ЕР 1363658 А2]. Конструкты могут быть кольцевыми или линейными. MIDGES дополнительно содержат интрон [cf. ЕР 0941318В1]. Известны и векторы для получения таких экспрессионных конструктов - плазмиды pMOK и pNOK, содержащие в одном из вариантов ген, кодирующий бета-эндорфин в различных вариантах. Однако для введения животному используются конструкты, содержащие последовательность, кодирующую РОМС, как описано выше, не бета-эндорфин непосредственно. Введение осуществляется локально инъекционно.
- 1 036780
В более поздней статье показано, что MIDGE (Non-viral, non-plasmid minimalistic, immunologically defined gene expression vectors), несущий ген, кодирующий РОМС, не продемонстрировал анальгетический эффект [PMID:20003437].
Заявителями предложена плазмидная ДНК, несущая нуклеотидную последовательность, кодирующую непосредственно бета-эндорфин, с введенными мутациями для большей тропности к рецепторам, оптимизированную по кодонному составу для экспрессии в клетках млекопитающих, с введенной гетерологичной секреторной последовательностью, а также фрагмент, обеспечивающий сильное связывание с Toll-like рецептором 9 (TLR9) для большей трансформации клеток плазмидной ДНК. Такую плазмидную ДНК, анальгетик на ее основе можно вводить инъекционно локально либо системно.
Технический результат от использования разработанной плазмидной ДНК и анальгетика на ее основе заключается в увеличении контролируемости синтеза именно бета-эндорфина за счет того, что вводится вектор, несущий последовательность непосредственно бета-эндорфина, не предшественника, который в разных тканях процессируется по-разному.
Технический результат заключается и в увеличении эффективности плазмидной ДНК, с которой синтезируется бета-эндорфин, и уменьшении ее количества для достижения анальгезии. Данные технические результаты достигаются за счет большей тропности синтезируемого бета-эндорфина к рецептору благодаря введенным специфичным мутациям в ген, его кодирующий. Также они достигаются за счет более эффективной трансформации клеток благодаря наличию в плазмидной ДНК фрагмента, обеспечивающего сильное связывание с TLR. Данные технические результаты достигаются и за счет оптимизации по кодонному составу для экспрессии в клетках млекопитающих нуклеотидной последовательности, кодирующей бета-эндорфин, а также за счет того, что плазмидная ДНК содержит элементы, обуславливающие стабильность мРНК и, соответственно, увеличивающие время полужизни мРНК, в результате синтез белка с одной молекулы мРНК осуществляется большее количество раз, а также в результате увеличивается количество синтезируемого белка; благодаря чему синтез белка идет интенсивнее.
Кроме того, технический результат заключается в увеличении длительности анальгезии и достигается тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая бета-эндорфин, содержит элементы, обусловливающие стабильность мРНК и соответственно увеличивающие время полужизни мРНК, в результате синтез белка с одной молекулы мРНК осуществляется большее количество раз, а также в результате увеличивается количество синтезируемого белка; а также тем, что нуклеотидная последовательность бета-эндорфина оптимизирована по кодонному составу для экспрессии в клетках млекопитающих, в результате синтез белка идет интенсивнее.
При внедрении в практику это позволит существенно снизить количество вводимой плазмидной ДНК (в 10-50 раз) по сравнению с дозами, используемыми в настоящее время в отечественной и мировой практике при генной терапии.
Технический результат выражается также в расширении спектра анальгетических средств. При плохой переносимости или непереносимости аналогов предложенный анальгетик позволит осуществить анальгезию, за счет чего пациент получит возможность осуществить действия, которые не мог либо не хотел осуществить без анальгезии, например решиться на требуемую процедуру, а также улучшит качество жизни, например, получит меньше неприятных ощущений, чем без использования анальгетика, либо сможет облегчить острую либо хроническую боль. Указанный технический результат достигается тем, что используют анальгетик по настоящему изобретению.
Технический результат от использования продуцента разработанной плазмидной ДНК заключается в получении такой плазмидной ДНК.
По временным характеристикам можно выделить два типа боли:
острую боль - новую, недавнюю боль, неразрывно связанную с вызвавшим ее повреждением и, как правило, являющуюся симптомом какого-либо заболевания, исчезает при устранении повреждения [Eddy N.B., Leimbach D.J. // Pharmacol. Exp. Ther. - Mar; 107(3):385-93. - 1953] (в том числе пред- и послеоперационная, посттравматическая, при ожогах, острая боль во время рождения ребенка, боль, вызванная травмой спинного мозга, острая головная боль, боль при ВИЧ/СПИДе, кризисе серповидных клеток, при невралгии тройничного нерва, панкреатите и других болях в ЖКТ, при инфаркте миокарда и других крупных сердечных событиях, интервенционная боль (при диагностических и терапевтических процедурах), острая при хронической боли [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007], которая длится до 2-3 месяцев, причем может иррадиировать; и хроническую боль - продолжающуюся длительный период времени (свыше 2-3 месяцев) даже после устранения причины, ее вызвавшей, часто приобретает статус самостоятельной болезни, например воспалительного процесса [Eddy N.B., Leimbach D.J. // Pharmacol. Exp. Ther. - Mar; 107(3):385-93. - 1953], причем наблюдается снижение эффективности анальгетиков. К хронической боли можно отнести хроническую боль при злокачественной болезни (включая боль у больных раком, ВИЧ/СПИД, при боковом амиотрофическом склерозе (ALS), рассеянном склерозе, при конечной стадии отказа органа, расширенной хронической обструктивной болезни легких, расширенной застойной сердечной недостаточности, паркинсонизме) и хроническую боль, не связанную со злокачественной болезнью (хронические скелетно-мышечные боли, такие как спинная боль или боли в пояснице, при хроническом дегенеративном арт
- 2 036780 рите, остеоартрите, ревматоидном артрите, миофасциальная и ревматическая боли, хроническая головная боль, мигрень, боли в костях; невропатические боли (в том числе боли при нервных сжатиях, травмах, боли после повреждения нерва и ампутации), при диабетической невропатии, сложные региональные болевые синдромы (тип I и тип II), при спазмах скелетных мышц, при постгерпетической невралгии, хронические боли после хирургических вмешательств; висцеральная боль (при растяжении полости внутренностей и коликах); и хроническая боль при серповидно-клеточной анемии [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007].
С использованием предложенного анальгетика можно облегчить и нивелировать оба описанных типа боли.
Сущность изобретения
Предложена плазмидная ДНК для транзиентной экспрессии полинуклеотида в клетках млекопитающих, содержащая прокариотические ориджин репликации и маркерный ген, эукариотические сильный промотор и лидерную последовательность мРНК, а также регуляторные последовательности для указанных элементов, от одного сайта для клонирования гена интереса и от одного сайта для посадки от одного праймера для анализа состава плазмидной ДНК, фрагмент для усиления захвата плазмидной ДНК клетками, охарактеризованный SEQ ID NO: 1, повторенный десятикратно последовательно, и полинуклеотид, представленный гетерологичной секреторной последовательностью, фрагментом, кодирующим модифицированный для увеличения тропности к рецепторам бета-эндорфин, охарактеризованный SEQ ID NO: 2, оптимизированными по кодонному составу для экспрессии в клетках млекопитающих, и терминирующей последовательностью. Фрагмент, охарактеризованный SEQ ID NO: 1, повторенный десятикратно последовательно, расположен между любыми двумя элементами плазмидной ДНК.
Также предложены бактериальная клетка, продуцирующая заявленную плазмидную ДНК и средство, обладающее анальгезирующим действием, для применения у млекопитающих, в том числе человека, содержащее заявленную плазмидную ДНК в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Подробное описание изобретения
Плазмидная ДНК содержит существенные для организмов ее поддержания и использования элементы, вкупе с соответствующими регуляторными последовательностями. Регуляторные последовательности - нуклеотидные последовательности, способные повлиять на экспрессию гена на уровне транскрипции и/или трансляции, а также на механизмы, обеспечивающие существование и поддержание функционирования плазмидной ДНК.
Плазмидную ДНК экономически наиболее выгодно нарабатывать в прокариотических клетках, преимущественно бактериальных клетках. В связи с этим плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит элементы для поддержания и амплификации, преимущественно в больших количествах, в клетках бактерий. Такими существенными элементами являются бактериальные ориджин репликации, для поддержания в клетке со средней, предпочтительно высокой, копийностью, и маркерный ген для возможности селекции штамма-продуцента. Подходящий ориджин репликации представлен pM1 (der.), ColE1 (der.) и F1, pUC и F1, но не ограничивается ими. Подходящий маркерный ген представлен репортерным геном или геном устойчивости к антибиотику, например ампициллину, преимущественно канамицину, но не ограничивается ими.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит элементы для эффективного функционирования в клетках млекопитающих.
Таким элементом является промотор с соответствующими регуляторными последовательностями из природных промоторов со своими регуляторными элементами (СаМ kinase II, CMV, nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, p-globin, GFAP, GAP43, тирозингидроксилаза, субъединица 1 каинатного рецептора и субъединица В глутаматного рецептора и другие) либо синтетических промоторов с регуляторными последовательностями для получения необходимого характера экспрессии (соотношения продолжительности и уровня экспрессии) таргетного гена на уровне транскрипции.
Промотор является важным компонентом плазмиды, который запускает экспрессию интересующего гена. Классические промоторы для плазмидных ДНК-компонентов препаратов - это CMV человека, немедленно-ранний или CMV-chicken-β actin (CAGG) промотор. Промоторы CMV используются для большинства ДНК-вакцин, так как они опосредуют высокие уровни конститутивной экспрессии в широком диапазоне тканей млекопитающих [Manthorpe M., Cornefert-Jensen F., Hartikka J., et al. Gene therapy by intramuscular injection of plasmid DNA: studies on firefly luciferase gene expression in mice. Hum. Gene Ther. 1993; 4(4):419-431] и не подавляют прочитывание downstream. Увеличение уровня экспрессии наблюдают при изменении CMV промотора, например, включением HTLV-1R-U5 downstream от промотора цитомегаловируса или при использовании химерного SV40-CMV промотора [Williams J.A., Carnes A.E., Hodgson С.Р. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009; 27(4):353-370]. Альтернативой CMV промоторам служат тканеспецифические промоторы хозяина, которые позволяют избежать конститутивной экспрессии антигенов в неподходящих тканях, что в целом приводит к снижению иммуногенности [Cazeaux N., Bennasser Y., Vidal P.L., Li Z., Paulin D., Bahraoui E. Comparative study of immune responses induced after immunization
- 3 036780 with plasmids encoding the HIV-1 Nef protein under the control of the CMV-IE or the muscle-specific desmin promoter. Vaccine. 2002; 20(27-28):3322-3331].
Возможные регуляторные последовательности по отношению к промотору:
энхансер: для увеличения уровня экспрессии через улучшение взаимодействия РНК-полимеразы и ДНК;
инсулятор: для модулировании функций энхансера;
сайленсеры либо их фрагменты: для снижения уровня транскрипции, например, для тканеспецифической экспрессии;
5' нетранслируемая область до промотора: включая интрон.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит от одной из вышеприведенных регуляторных последовательностей, в зависимости от варианта плазмидной ДНК, основанного на выборе промотора и желаемых параметрах экспрессии таргетного гена. Опираясь на существующий уровень техники, на известные и очевидные варианты таких элементов и их использования, плазмидная ДНК по настоящему изобретению может содержать любые отвечающие вышеуказанным условиям комбинации, при которых с плазмидной ДНК осуществляется синтез бета-эндорфина в клетках млекопитающих. При использовании сайленсера либо инсулятора в составе конструкции можно регулировать экспрессию таргетного гена, гена описанного бета-эндорфина, т.е. осуществляется контроль над количеством синтезируемого белка, и, в принципе, синтезом белка как таковым и, соответственно, над анальгезией: при необходимости есть возможность в быстрый срок остановить либо уменьшить экспрессию гена. В последнем варианте возможно и осуществление тканеспецифичной экспрессии при необходимости.
Иные регуляторные последовательности:
нетранслируемая область downstream от промотора, включая интрон, для повышения стабильности мРНК и увеличения экспрессии таргетного гена.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению в одном из вариантов дополнительно содержит такой регуляторный элемент.
Плазмидная ДНК по настоящему изобретению содержит и такой важный элемент, как лидерную последовательность мРНК, содержащую последовательность Козак непосредственно перед стартовым кодоном ATG, для увеличения экспрессии [Kozak M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. EMBO J. 1997; 16(9):2482-2492].
Плазмидная ДНК также содержит сайт, преимущественно сайты, разные для клонирования таргетного гена, для осуществления правильной ориентации таргетного гена в плазмидной ДНК и сайт, преимущественно сайты, для посадки праймеров для его секвенирования.
Плазмидная ДНК также содержит терминирующую последовательность, которая необходима для сохранения стабильности мРНК, надлежащего прекращения транскрипции и экспорта мРНК из ядра. На экспрессию генов можно повлиять путем изменения терминирующей последовательности, в том числе ее укорачиванием. Она содержит последовательно стоп-кодон, 3'-нетранслируемую область с сигналом и сайтом полиаденилирования, стоп-кодон, за счет которой сохраняется стабильность мРНК и осуществляется надлежащее прекращение траскрипции и экспорт мРНК из ядра.
Полиаденилирование (полиА) необходимо для стабилизации транскрипта. Изменение последовательности полиА может привести к увеличению уровня экспрессии гена [Norman J.A., Hobart P., Manthorpe M., Feigner P., Wheeler С. Development of improved vectors for DNA-based immunization and other gene therapy applications. Vaccine. 1997; 15(8):801-803]. В плазмиде pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) область терминатора бычьего гормона роста содержит область гомопурина, которая чувствительна к нуклеазе. Показано, что альтернативная полиА последовательность может значительно улучшить стабильность плазмиды к нуклеазе [Azzoni A.R., Ribeiro S.C., Monteiro G.A., Prazeres D.M.F. The impact of polyadenylation signals on plasmid nuclease-resistance and transgene expression. J. Gene Med. 2007; 9:392-402]. Введение двух стоп-кодонов позволяет увеличить эффективность терминатора транскрипции.
Терминирующая последовательность предложенной плазмидной ДНК представлена нативной, т.е. присущей таргетному гену, либо иной, более сильной, которая представлена, например, терминирующей последовательностью бычьего гормона роста (BGH), но ею не ограничивается, и во втором варианте может содержать дополнительный стоп-кодон перед 3'-нетранслируемой областью.
Опираясь на существующий уровень техники, на известные и очевидные варианты такого элемента, плазмидная ДНК по настоящему изобретению может содержать любую отвечающую вышеуказанным условиям терминирующую последовательность, при которой с плазмидной ДНК осуществляется синтез бета-эндорфина в клетках млекопитающих.
Плазмидная ДНК содержит фрагмент, охарактеризованный SEQ ID NO: 1, повторенный десятикратно последовательно, который расположен между любыми двумя элементами плазмидной ДНК, т.е. не мешая функционированию каких-либо ее элементов. Данный фрагмент обеспечивает усиленный захват плазмидной ДНК клетками за счет тропности к Toll-like Receptor 9 (TLR9).
Плазмидная ДНК также содержит гетерологичную секреторную последовательность, оптимизированную по кодонному составу для экспрессии в клетках млекопитающих. В одном варианте изобретения
- 4 036780 содержит, например, секреторную последовательность ТРА (tissue-type plasminogen activator isoform 1 preproprotein [Homo sapiens], NCBI Reference Sequence: NP000921.1), но ею не ограничивается. Преимущество использования секреторной последовательности ТРА - в обширном предшествующем клиническом опыте, а также в том, что показана ее высокая производительность в отношении экспрессии секретируемого белка с различных генов-мишеней.
Плазмидная ДНК содержит и фрагмент, кодирующий бета-эндорфин, модифицированный для увеличения тропности к рецепторам, охарактеризованный SEQ ID NO: 2, оптимизированный по кодонному составу для экспрессии в клетках млекопитающих.
Оптимизация по кодонному составу проведена для увеличения экспрессии таргетного гена за счет увеличения эффективности считывания информации с данной мРНК на рибосомах. Она может быть осуществлена вручную либо с использованием специализированного программного обеспечения, например на сайте molbiol.ru, на основе аминокислотной последовательности белка.
Плазмидная ДНК также может дополнительно содержать исходные для кДНК указанного гена элементы, обусловливающие стабильность данной мРНК, такие как терминирующую последовательность (3'-нетранслируемая область, содержащая сигнал и сайт полиаденилирования, а также сигнал терминации транскрипции - стоп-кодон). Соответственно, в данном случае в остове плазмидной ДНК отсутствуют либо не функционируют аналогичные элементы.
Плазмидная ДНК для доставки гена, обусловливающего анальгезию, сочетает в себе такие свойства ДНК-вакцины на основе плазмидной ДНК, как высокий уровень экспрессии гена интереса в клетках млекопитающих, и такие свойства вектора для генной терапии, как отсутствие иммуногенности и длительность экспрессии гена, однако, например, за счет увеличения стабильности мРНК. Такая ДНК не встраивается в геном и не реплицируется в клетках млекопитающих.
Подходящие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих представлены известными среднему специалисту в данной области и описанными в литературе [Hartikka J., Sawdey М., Cornefert-Jensen F., Margalith M., Barnhart K., Nolasco M., Vahlsing H.L., Meek J., Marquet M., Hobart P., Norman J., Manthorpe M. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum Gene Ther. 1996 Jun 20; 7(10):1205-17 и др.], а также плазмидами, которые могут быть созданы средним специалистом в данной области с использованием рекомендаций по элементам векторов [Cloning Vectors, ed. Pouwls et al., Elsevier, Amsterdam - New York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018, Williams J.A., Carnes A.E., Hodgson C.P. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol Adv. 2009 Jul-Aug; 27(4):353-70. doi: 10.1016/j.biotechadv.2009.02.003. Epub 2009 Feb 20. Review и др.]. Предпочтительными плазмидными ДНК для использования у человека являются векторы, проверенные на людях, содержащие описанные выше элементы с соответствующими регуляторными последовательностями, возможно, модифицированные для соответствия заявленным критериям, что позволяет уменьшить количество требуемых исследований для регистрации средства. Однако возможно и использование иных плазмидных ДНК, содержащих требуемые описанные элементы. Для плазмидной ДНК для применения у млекопитающих, кроме человека, требования менее строгие, в связи с чем возможно использование более широкого спектра плазмид.
Последовательность расположения описанных элементов в плазмидной ДНК понятна среднему специалисту в данной области.
Предложен продуцент плазмидной ДНК на основе бактериальной клетки (на основе клеток, преимущественно, Escherichia coli, но не ограничиваясь ими). Среднему специалисту в данной области понятно, что, используя плазмидную ДНК согласно изобретению и бактериальную клетку, например, коммерческую, но ею не ограничиваясь, можно создать продуцент плазмидной ДНК, например, стандартными методами, например трансфекцией, электропорацией или пушкой с частицами. Для уменьшения вероятности возникновения мутаций благодаря метилированию плазмидной ДНК предпочтительно использовать штамм микроорганизма, не содержащий метилазу в геноме.
Также предложено анальгетическое средство на основе охарактеризованной плазмидной ДНК в эффективном количестве, также содержащее фармацевтически приемлемый эксципиент, для применения у млекопитающих, в частности человека. Фармацевтически приемлемые носители или буферные растворы известны из уровня техники и включают те, которые описаны в различных текстах, таких как, например, Remington's Pharmaceutical Sciences.
Данная фармацевтическая композиция предназначена для лечения, облегчения и/или профилактики боли, в частности острой или хронической боли, нарушений чувствительности.
Возможно и использование иных технологий доставки плазмидной ДНК в клетки различных тканей, например безыгольного шприца, позволяющего осуществить доставку в клетки различных тканей живых животных [Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, (1992)].
Показано, что в норме мышечные волокна не экспрессируют антигены МНС, однако при воспалении, связанном с инфекцией, или в присутствии интерферона гамма мышечные волокна способны продуцировать антигены в составе комплекса с МНС первого классалибо даже второго класса Meckert, P.C., Hontebeyrie-Joskowicz, М., Chambo, J., Levin, M., and Laguens, R.P. (1991). Trypanosoma cruzi: Aberrant expression of class II major histocompatibility complex molecules in skeletal and heart muscle
- 5 036780 cells of chronically infected mice. Exp. Parasitol. 72, 8-14; Hohlfeld and ENGEL, A.G. (1984), The immunobiology of muscle. Immunol. Today 15, 269-274.; Mantegazza, R., and Bernasconi, P. (1994). Cellular aspects of myositis. Curr. Opin. Rheumatol. 6, 568-574, Hartikka J., Sawdey M., Cornefert-Jensen F., Margalith M., Barnhart K., Nolasco M., Vahlsing H.L., Meek J., Marquet M., Hobart P., Norman J., Manthorpe M. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum Gene Ther. 1996 Jun 20; 7(10):1205-17], в связи с чем предпочтительным является введение плазмидной ДНК, при котором травмирование мышечной ткани минимизировано.
Авторами настоящего изобретения проведены лабораторные исследования, подтверждающие возможность реализации группы охарактеризованных изобретений. Полученные результаты исследований проиллюстрированы примерами 1-3.
Пример 1. Получение плазмидных ДНК, кодирующих модифицированный бета-эндорфин.
1.1. Рассчитывали последовательность нуклеотидов гена, коллинеарную последовательности аминокислот кодируемого им бета-эндорфина, модифицированного для большей тропности к рецепторам, охарактеризованного SEQ ID NO: 2, с фланкированием целевого гена сайтами рестрикции, а также с добавлением последовательности Козак перед старт-кодоном для инициации трансляции, после старт кодона - сигнальной последовательности, например, ТРА (MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS), либо представленной а.о. MLLLLLLLLLLALALA, для секреции синтезируемого белка из эукариотической клетки, с одновременной оптимизацией по кодонному составу для экспрессии в клетках человека, использован инструмент на сайте molbiol.ru.
Рассчитанную нуклеотидную последовательность синтезировали химическим методом с помощью синтезатора ДНК ASM-800 (БИОССЕТ, Россия).
1.2. Осуществляли химический синтез ДНК, охарактеризованной SEQ ID NO: 1, десятикратно повторенной последовательно, с фланкированием такой ДНК сайтами рестрикции для клонирования в плазмидной ДНК.
1.3. Осуществляли клонирование синтезированных фрагментов ДНК в плазмиды pVAX1 (Invitrogen), pVR1012 (Vical), pcDNA3.1+ (Invitrogen). Также получили вектор pcDNA3.1+, неспособный к экспрессии неомицина, за счет рестрикции данного вектора рестриктазой NsiI, в области SV40 промотора (-71 п.о.). В полученном векторе также клонировали полученные фрагменты. Фрагмент, обусловливающий тропность к TLR9, помещали между разными элементами плазмидной ДНК.
1.4. На реакцию лигирования брали 3 мкл раствора синтезированной ДНК, 1 мкл раствора готового вектора, 5 мкл буфера для лигирования х2 и 1 мкл Т4-лигазы. Реакцию проводили при 20°С в течение 2 ч.
После этого смесь прогревали при 95°С в течение 10 мин и очищали от солей диализом на нитроцелюлозных фильтрах с диаметром пор 0,025 мкм (Millipore, США). Диализ проводили против раствора, содержащего 0,5 мМ ЭДТА в 10% глицерине, в течение 10 мин.
1.5. Затем трансформировали клетки E.coli штамма DH10B/R (F-mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80dlacZΔM 15, ΔlacX74, deoR, recAl, endAl, araD139, Δ(ara, leu)769, galU, galKλ,-, rpsL, nupG) либо XL1-Blue (recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacIqZAM15 Tn10 (Tetr)) полученными плазмидными ДНК методом электропорации с использованием электропоратора MicroPulser (BioRad). Данный штамм не содержит метилазу, что позволяет минимизировать возможность возникновения мутаций в ДНК, в том числе в клонированном в плазмиде, поддерживаемой в данном штамме, гене. К 12 мкл компетентных клеток добавляли 1 мкл диализованной лигазной смеси, помещали между электродами порационной ячейки и обрабатывали импульсом тока.
После трансформации клетки помещали в 1мл SOC-среды (2% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) и инкубировали в течение 40 мин при 37°С.
1.6. Проводили выявление клонов клеток E.coli, содержащих полученную плазмидную ДНК, на селективной среде, содержащей LB-агар, 50 мкг/мл канамицина либо ампициллина (для плазмидных ДНК на основе pcDNA3.1+).
Из выросших клонов выделяли плазмидную ДНК. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора Wizard Minipreps DNA Purification System (Promega, США). Очищенную рекомбинантную плазмидную ДНК проверяли с помощью секвенирования.
1.7. Секвенирование клонированных фрагментов проводили по методу Сэнджера с использованием набора Applied Biosystems BigDye® Terminator (BDT) v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) по прилагающейся к нему инструкции. Для мечения продуктов реакции использовали меченные флуоресцентным красителем ddNTP, причем каждому ddNTP соответствовал свой краситель. Для секвенирования использовали немеченные специфические для плазмид праймеры. Проводили ПЦР-реакцию, затем реакционную смесь очищали от свободных меченых ddNTP по инструкции к набору BigDye X-Terminator Purification Kit (Applied Biosystems, США) и разделяли продукты реакции секвенирования с использованием капиллярного секвенатора Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) и реактива 3500/3500xL Genetic Analyzer Polymer POP-6™ (Applied Biosystems,
- 6 036780
США).
Результаты разделения продуктов реакции секвенирования регистрировались путем сканирования лазером и детекции четырех флуоресцентных красителей, включенных во все типы ddNTP.
1.8. Компьютерный анализ последовательностей ДНК проводили с помощью персонального компьютера с использованием программ Chromas и BioEdit. Нуклеотидные последовательности исследованных фрагментов ДНК были выровнены относительно рассчитанных, была продемонстрирована идентичность синтезированных фрагментов рассчитанным. В результате были отобраны клоны клеток E.coli, содержащие полноразмерные последовательности таргетных генов в составе плазмид.
Пример 2. Наработка плазмидных ДНК, кодирующих модифицированный бета-эндорфин, для проведения исследования на лабораторных животных.
Отдельную колонию клеток штамма E.coli - продуцента плазмидной ДНК, выращенную на LB-агаре в чашке Петри с добавлением канамицина (либо ампициллина), помещали в 10 мл селективной среды. Клетки растили в течение ночи при 37°С в условиях постоянного перемешивания (250 об/мин). Полученные клетки собирали центрифугированием при 4000g. Дальнейшее выделение и очистку плазмидной ДНК осуществляли с использованием набора EndoFree Plasmid Mega Kit (Qiagen), позволяющего получить апирогенную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК анализировали электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле, измеряли ее концентрацию с помощью флуориметрии.
В качестве контрольного раствора использовали воду без добавления тестируемого препарата. В ячейку для измерения оптической плотности объемом 2 мл вносили 1,950 мл воды и 0,05 мл тестируемого раствора, перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 260 нм. Определение концентрации ДНК проводили по формуле
С(мкг/мл)=4ОА2боК, где А260-оптическая плотность препарата, измеренная при длине волны 260 нм;
К (мкг/мл)- для ДНК 50 мкг/мл (50 мкг/мл двухцепочечной ДНК в воде);
- разведение тестируемого препарата.
В итоге определили, что получили плазмидные ДНК с концентрацией 3-5 мг/мл. Выход плазмидной ДНК составил от 3,5 до 5 мг из 1 л питательной среды.
О чистоте полученного препарата плазмидной ДНК судили по отношению оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 260 нм, к оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 280 нм (А260/А280), и отношению оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 260 нм к оптической плотности препарата, измеренной при длине волны 230 нм (А260/А230). Измерения проводили в водном растворе, в качестве контрольного раствора использовали воду без добавления тестируемого препарата.
Для чистых препаратов ДНК характерно А260/А280>1,80 и А260/А230>1,80. Определенные в эксперименте значения соответствовали значениям отношений А260/А280 и А260/А230 для чистых препаратов, для всех полученных препаратов плазмидной ДНК.
Также проводили количественное определение примесей белка в полученных препаратах плазмидных ДНК с помощью microBCA assay [Smith, P.K., et al., Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analyt. Biochem. 150, 76-85 (1985)], измеряя оптическую плотность образующихся окрашенных белковых комплексов с медью и бицинхониновой кислотой при длине волны 562 нм. Чувствительность метода microBCA assay составляет 0.5-20 мкг/мл белка. Концентрация тотального белка ни в одном из исследуемых препаратов плазмидной ДНК не превышала норму.
Определяли и содержание бактериального липополисахарида в препаратах плазмидных ДНК с использованием гель-тромб варианта ЛАЛ-теста, с чувствительностью >0,25 EU/мл (ToxinSensor, GenScript, США). ЛАЛ-реагентом служил лизат амебоцитов подковообразного краба Limulus polyphemus. ЛАЛ-реактив специфически реагирует с бактериальными эндотоксинами, в результате ферментативной реакции происходит изменение реакционной смеси, пропорциональное концентрации эндотоксина. Результаты оценивали по наличию или отсутствию плотного тромба на дне пробирки путем переворачивания пробирки. Гель-тромб не образовался при исследовании образца, разведенного в 10 раз, для препаратов всех полученных плазмидных ДНК, т.е. при чувствительности метода 2,5 EU/мл, что, учитывая концентрацию плазмидной ДНК в образце, говорит о допустимом показателе очистки от эндотоксинов.
Пример 3. Определение анальгетического эффекта плазмидной ДНК, кодирующей модифицированный бета-эндорфин.
3.1. Тест Горячая пластина.
Проводили исследование анальгетической активности плазмидных ДНК, кодирующих модифицированный бета-эндорфин, с использованием теста Горячая пластина (hot plate).
Тест Горячая пластина (Hot plate) проводили для измерения порога острой болевой чувствительности и потенциального анальгезирующего эффекта изучаемых препаратов плазмидной ДНК [Вальдман А.В., Игнатов Ю.Д. Центральные механизмы боли. - Л.: Наука. - 1976]. Тест является базисным для исследования анальгетической активности, его используют для выявления анальгетически ак
- 7 036780 тивных соединений.
При помещении на горячую поверхность с достижением порога болевой чувствительности со стороны животного наблюдаются двигательные реакции беспокойства: одергивание лап, облизывание подушечек лап и подпрыгивание. В данном тесте учитывали латентное время с момента помещения животного на горячую поверхность до первого облизывания лап. Данная методика позволяет определять показатели: анальгетическая активность тестируемого объекта, пиковое время анальгезии, длительность анальгезии.
В исследовании использовали мышей линии BALB/C, самок, массой 15-22 г, возраста 18 недель. В опыте были сформированы экспериментальные и контрольные группы животных, в каждой группе по 3 мыши. В качестве положительного контроля использовали анальгин (50 мг/кг), морфин гидрохлорид (10 мг/кг), а также плазмидную ДНК pcDNA3.1+, кодирующую нативный бета-эндорфин (YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAYKKGE), с секреторной последовательностью ТРА, без оптимизации по ко донному составу для экспрессии в клетках мелкопитающих.
Вводили по 5 мг/кг плазмидных ДНК.
Использовали прибор Hot plate-метр (Hotplate Analgesia Meter, Columbus Instruments, USA).
До начала испытания в течение 10 мин давали тест-системам акклиматизироваться в комнате для проведения исследования. Животных использовали однократно, так как повторное помещение животного на термостатируемую пластину вызывает незамедлительную реакцию на касание поверхности. Устанавливали температуру термостата 55°С. После инъекции исследуемого вещества животное аккуратно помещали на нагревательную пластину и в тот же момент нажимали кнопку старт на панели прибора. Отмечали латентное время облизывания передних и задних лап (с момента помещения животного на поверхность прибора до первого облизывания). После этого нажимали на кнопку стоп и убирали животное с горячей поверхности. Иные поведенческие реакции игнорировали. Для уменьшения вероятности теплового повреждения подушечек лап максимальное время эксперимента не превышало 60 с. Для определения пикового времени анальгетического действия препарата измеряли латентное время облизывания передних и задних лап у контрольной группы (физраствор) (точка 0) и через 2, 12 и 24 ч после введения препарата у тестируемых групп. Поверхность прибора протирали салфеткой, смоченной дезинфектантом (0,5% хлоргексидин-биглюконат на 70% этаноле), перед помещением на нее очередного животного [Методические рекомендации для обучаемых. Фармацевтический факультет ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава. - Москва. - 2006].
Проводили анализ данных определения анальгетической активности препарата. Для плазмидной ДНК, показавшей наилучший результат, определяли ED50, т.е. дозу, необходимую для проявления 50%-ной анальгетической активности препарата.
Препараты всех исследуемых плазмидных ДНК, кодирующих модифицированный бета-эндорфин, проявляют выраженное анальгезирущее действие, не уступающее по эффективности морфину и превышающее анальгетическую активность анальгина, а также плазмидной ДНК, кодирующей нативный бетаэндорфин. В среднем, наблюдали небольшую степень анальгезии через 2 ч после введения плазмид, затем анальгезия усиливалась, и через 12 и 24 ч наблюдали одинаковый высокий уровень анальгезии, что говорит о поддержании эффекта.
В эксперименте с применением различных доз плазмидной ДНК, показавшей наилучший результат в предыдущем опыте (pVAX1, со вторым использованным вариантом секреторной последовательности и фрагментом, опосредующим связывание с TLR9, помещенным рядом с ориджином репликации), продемонстрирован дозозависимый характер анальгезии в интервале от 0,2 до 10 мг/кг. При этом по прошествии 12 ч показатели при использовании такой плазмидной ДНК в минимальной концентрации 0,2 мг/кг были практически идентичны показателям в группе использования морфина гидрохлорида 10 мг/кг. Через 24 ч показатель в группе плазмидной ДНК в минимальной концентрации превысил таковой группы использования морфина гидрохлорида 10 мг/кг, практически в 2,5 раза. Действие анальгина наблюдали только по прошествии 2 ч после введения анальгетика, ответ через 12 и 24 ч был аналогичен таковому в контрольной группе. При использовании указанной выше плазмидной ДНК в концентрации 5 и 10 мг/кг наблюдали значительное увеличение латентного периода по сравнению с группой с минимальной концентрацией плазмидной ДНК, при этом различие между этими двумя группами было небольшое.
3.2. Исследование концентрации бета-эндорфина в сыворотке мышей.
Поскольку изменение концентрации бета-эндорфина в плазме крови может служить критерием оценки эффективности обезболивания [Бета-эндорфин - маркер эффективности обезболивания при острой боли и хроническом болевом синдроме у онкологических больных / З.В. Павлова и др. // Проблемы клинической медицины. - 2007. - № 1. - С. 36-40. - ISSN 1817-8359], проводили исследование концентрации бета-эндорфина в сыворотке исследуемых мышей после введения разработанных плазмидных ДНК, с использованием набора ELISA Kit for Beta-Endorphin (bEP) Mus musculus (Mouse) CEA806Mu (Life science Inc.).
Уровень бета-эндорфина значительно поднимался при введении разработанных плазмидных ДНК, при том что при введении плазмидной ДНК без вставки таргетного гена и в контрольной группе значительное увеличение уровня бета-эндорфина не наблюдали, на протяжении всего эксперимента. В группе,
- 8 036780 где использовали плазмидную ДНК, кодирующую нативный бета-эндорфин, уровень бета-эндорфина был ниже, чем в экспериментальных группах.
Таким образом, продемонстрированы возможность создания различных вариантов плазмидной ДНК, кодирующей модифицированный бета-эндорфин, их получения с использованием бактериального продуцента, а также анальгетическое действие такой плазмидной ДНК, в любом из вариантов, соответствующих указанным критериям, причем даже в минимальной концентрации 0,2 мг/кг (меньше во много раз, чем морфина гидрохлорида). Показан и больший уровень синтеза бета-эндорфина, а также большая эффективность, чем у плазмидной ДНК, кодирующей нативный бета-эндорфин и не содержащей фрагмент, обусловливающий связывание с TLR9. Также продемонстрирована безопасность применения таких плазмидных ДНК: животные не погибли, побочные эффекты не наблюдали.
Claims (6)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Плазмидная ДНК для транзиентной экспрессии полинуклеотида в клетках млекопитающих, содержащая прокариотические ориджин репликации и маркерный ген, эукариотические сильный промотор и лидерную последовательность мРНК, а также регуляторные последовательности для указанных элементов, от одного сайта для клонирования гена интереса и от одного сайта для посадки от одного праймера для анализа состава плазмидной ДНК, фрагмент для усиления захвата плазмидной ДНК клетками, охарактеризованный SEQ ID NO:1, повторенный десятикратно последовательно, и полинуклеотид, представленный гетерологичной секреторной последовательностью, соединенной с фрагментом, кодирующим модифицированный для увеличения тропности к рецепторам бета-эндорфин, охарактеризованный SEQ ID NO:2, оптимизированными по кодонному составу для экспрессии в клетках млекопитающих, и терминирующей последовательностью.
- 2. Плазмидная ДНК по п.1, отличающаяся тем, что представляет собой плазмидную ДНК из pcDNA3.1(+), pVAX1, VR1012, несущую описанные в п.1 повторенный десятикратно последовательно фрагмент, охарактеризованный SEQ ID NO: 1, и оптимизированную по кодонному составу для экспрессии в клетках человека гетерологичную секреторную последовательность, соединенную с фрагментом, кодирующим бета-эндорфин, охарактеризованный SEQ ID NO: 2.
- 3. Плазмидная ДНК по п.2, отличающаяся тем, что секреторная последовательность представляет собой таковую ТРА, оптимизированную по кодонному составу для экспрессии в клетках человека.
- 4. Бактериальная клетка, продуцирующая плазмидную ДНК по любому из пп.1-3, кодирующую модифицированный для увеличения тропности к рецепторам бета-эндорфин.
- 5. Бактериальная клетка по п.4, отличающаяся тем, что представлена штаммом бактерий Escherichia coli DH10B/R, содержащим плазмидную ДНК pcDNA3.1(+), которая несет описанные в п.1 повторенный десятикратно последовательно фрагмент, охарактеризованный SEQ ID NO: 1, и оптимизированную по кодонному составу для экспрессии в клетках человека секреторную последовательность ТРА, соединенную с фрагментом, кодирующим бета-эндорфин, охарактеризованный SEQ ID NO: 2.
- 6. Средство, обладающее анальгезирующим действием, для применения у млекопитающих, содержащее плазмидную ДНК по любому из пп.1-3 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201792364A EA036780B1 (ru) | 2017-11-26 | 2017-11-26 | Плазмидная днк, кодирующая бета-эндорфин, бактериальный продуцент, анальгетическое средство |
| AU2018370765A AU2018370765A1 (en) | 2017-11-26 | 2018-10-17 | Plasmid DNA encoding beta-endorphin, bacterial producer, analgesic agent |
| PCT/RU2018/050128 WO2019103659A1 (en) | 2017-11-26 | 2018-10-17 | Plasmid dna encoding beta-endorphin, bacterial producer, analgesic agent |
| US16/766,836 US20210077583A1 (en) | 2017-11-26 | 2018-10-17 | Plasmid dna encoding beta-endorphin, bacterial producer, analgesic agent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201792364A EA036780B1 (ru) | 2017-11-26 | 2017-11-26 | Плазмидная днк, кодирующая бета-эндорфин, бактериальный продуцент, анальгетическое средство |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201792364A1 EA201792364A1 (ru) | 2019-05-31 |
| EA036780B1 true EA036780B1 (ru) | 2020-12-21 |
Family
ID=66630779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201792364A EA036780B1 (ru) | 2017-11-26 | 2017-11-26 | Плазмидная днк, кодирующая бета-эндорфин, бактериальный продуцент, анальгетическое средство |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210077583A1 (ru) |
| AU (1) | AU2018370765A1 (ru) |
| EA (1) | EA036780B1 (ru) |
| WO (1) | WO2019103659A1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1363658A2 (de) * | 2001-02-24 | 2003-11-26 | Mologen Forschungs-, Entwicklungs- und Vertriebs GmbH | Beta-endorphin / crf - gentherapie zur lokalen schmerzbekämpfung |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000016799A1 (en) * | 1998-09-23 | 2000-03-30 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of treating chronic pain |
| RU2597789C2 (ru) * | 2014-11-10 | 2016-09-20 | Илья Владимирович Духовлинов | Анальгетическое средство на основе плазмидной днк, кодирующей hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3 (варианты) |
-
2017
- 2017-11-26 EA EA201792364A patent/EA036780B1/ru unknown
-
2018
- 2018-10-17 US US16/766,836 patent/US20210077583A1/en active Pending
- 2018-10-17 AU AU2018370765A patent/AU2018370765A1/en not_active Abandoned
- 2018-10-17 WO PCT/RU2018/050128 patent/WO2019103659A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1363658A2 (de) * | 2001-02-24 | 2003-11-26 | Mologen Forschungs-, Entwicklungs- und Vertriebs GmbH | Beta-endorphin / crf - gentherapie zur lokalen schmerzbekämpfung |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHEN K.H. et al. Intrathecal coelectrotransfer of a tetracycline-inducible, three-plasmid-based system to achieve tightly regulated antinociceptive gene therapy for mononeuro-pathic rats. J. Gene Med., 2008, 10(2), p. 208-2016 (реферат) [онлайн] [найдено 04.09.2018], Найдено из PubMed, PMID: 18064731 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201792364A1 (ru) | 2019-05-31 |
| WO2019103659A1 (en) | 2019-05-31 |
| AU2018370765A1 (en) | 2020-07-16 |
| US20210077583A1 (en) | 2021-03-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230346914A1 (en) | Sars-cov-2 mrna domain vaccines | |
| WO2021159130A2 (en) | Coronavirus rna vaccines and methods of use | |
| US11351242B1 (en) | HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition | |
| CN115175698A (zh) | 冠状病毒rna疫苗 | |
| WO2021211343A1 (en) | Zika virus mrna vaccines | |
| US20200038499A1 (en) | Rna bacterial vaccines | |
| CA3169664A1 (en) | Respiratory virus immunizing compositions | |
| EP4217371A1 (en) | Multi-proline-substituted coronavirus spike protein vaccines | |
| EP4322997A1 (en) | Epstein-barr virus mrna vaccines | |
| WO2022221336A1 (en) | Respiratory syncytial virus mrna vaccines | |
| EA027315B1 (ru) | Молекула нуклеиновой кислоты и белок для индукции иммунного ответа против антигена рака предстательной железы, плазмида, вектор экспрессии, способ лечения и фармацевтическая композиция | |
| WO2021206581A1 (en) | Genetic construct-based vaccine against coronavirus infection | |
| CN110684798A (zh) | 肌肉靶向的微环dna基因治疗 | |
| AU2022237382A1 (en) | Therapeutic use of sars-cov-2 mrna domain vaccines | |
| JPS61502095A (ja) | 第９因子を発現するベクタ−、該ベクタ−により変換された細胞及び第９因子の製造方法 | |
| EA036780B1 (ru) | Плазмидная днк, кодирующая бета-эндорфин, бактериальный продуцент, анальгетическое средство | |
| EP3219798B1 (en) | Dna plasmid, coding hnp-1, or hnp-2, or hnp-3, bacterial producer, analgesic agent (variants) | |
| CN115322247A (zh) | 一种新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原及应用 | |
| US20240207392A1 (en) | Epstein-barr virus mrna vaccines | |
| WO2022119481A1 (ru) | Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции | |
| TW202217000A (zh) | Ｓａｒｓ—ｃｏｖ—２ ｍｒｎａ結構域疫苗 | |
| KR20230117177A (ko) | 진행성 골화성 섬유이형성증을 위한 신규 유전자 치료제의개발 | |
| CN117305328A (zh) | 圆环病毒2型环状rna分子、疫苗的制备及应用 | |
| EA042907B1 (ru) | Вакцина на основе гибридного белка и плазмидной днк для профилактики или лечения туберкулеза |