JPH02195884A - 合成プラスミド、形質転換体およびネコインターフェロン遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、蛋白質の一次構造がネコの遺伝情報由来であ
るインターフェロン（以下、Ｆｅ１ＦＮと略す）を遺伝
子操作技術により量産し、以って医薬品（抗ウィルス・
ワクチン）とすることを目的とした、合成プラスミドお
よびその形質転換体、さらにＦｅＩＦＮをコードする遺
伝子に関する。

［従来の技術］ インターフェロンは、抗ウィルス作用を示すところの蛋
白質を主成分とする生理活性物質でｉＦＮと略記され、
例えば文献１のようにこれまでも多数の文献が出版され
ている。

遺伝子操作技術の進歩によりヒトのＩＦＮのみならず、
ウシ（文献２）、ウマ（文献３）、イヌ（文献３）など
動物のＩＦＮも大量生産が可能となり、その結果、ウィ
ルス病や腫瘍などの治療薬としてのＩＦＮの用途開発研
究が行なわれているものもある（文献４）。

ネコについてもα、β、γ各タイプのインターフェロン
が報告されている（文献５）。

［発明が解決しようとする課題］ しかるに、ネコのＩＦＮが遺伝子操作により大量生産が
可能となったという報告は未だない。

ネコには、ＦＴＬＶ　（文献６）、ネコ白血病、ネコウ
ィルス性鼻気管炎、ネコカリキウィルス病、ネコ伝染性
腹膜炎はじめ多数のウィルス病が知られている（文献７
）。

そこで、ヒトのαＩＦＮやウシのβＩＦＮを経口投与し
、ＦｅＬＶ感染ネコの延命を図った事例が報告されてい
る（文献８）。経口ではなく、体内注射を行なえば、よ
り顕著な効果が期待されるものの、異種ＩＦＮに対する
中和抗体の生産が起こることは容易に懸念される。同種
ＩＦＮつまりネコのＩＦＮが容易に入手可能となれば、
ネコの抗ウィルス剤、抗腫瘍剤としての用途が開かれる
と期待される。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる状況に鑑みＦｅ１ＦＮの大量生産
を目的とし、創意工夫を成し、市販のベクターを用いて
ネコのＣ−ＤＮＡライブラリーを作製し、この中からサ
ルの培養細胞をトランジェント・エクスプレジョンをさ
せ、Ｆｅ１ＦＮを生産させるプラスミドを単離すること
に成功し、更にはこのプラスミドを用いてＦｅ１ＦＮを
生産する細胞の作製に成功し、以って簡便に大量にＦｅ
ＩＦＮを製造する方法を確立し、かくして本発明を完成
させるに至った。

すなわち本発明は、サルの細胞をトランジェント・エク
スプレスさせてＦｅ１ＦＮを生産させるプラスミド、こ
のプラスミドを有する大腸菌の形質転換体、およびこの
プラスミドにより形質転換されたチャイニーズ・ハムス
ター細胞、ならびにこれらの形質転換体から得られるＦ
ｅ１ＦＮを提供するものである。さらに、本発明はＦｅ
１ＦＮをコードする遺伝子も提供する。

本発明のＦｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡを組込
んだ合成プラスミドは、例えば次のようにして製造する
ことができる。すなわち、ネコの細胞からｐ　ｏ　１　
ｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡを抽出し、いわゆる発現プラスミ
ドベクターを利用したＣ−ＤＮＡライブラリーを大腸菌
を宿主として作製し、このライブラリーの中からサルの
ＣＯＳ細胞をトランジェント・エクスプレスさせて抗ウ
ィルス活性を生産させる能力のあるプラスミドとして選
び出すことができる。このような活性を有するプラスミ
ドの１つがｐＦｅｌＦＮｌであり、これを含有する形質
転換体大腸菌がＥ、ｃｏｌｉ　　（ｐＦｅＩＦＮＩ）（
微工研条寄第１６３３号）である。

本発明の合成プラスミドにより形質転換してなるＦｅＩ
ＦＮ生産細胞は、次のようにして製造することができる
。宿主細胞が真核細胞の場合は、例えば前記のＥ、ｃｏ
ｌｉ　　（ｐＦｅＩＦＮｌ）（微工研条寄第１６３３号
）から抽出したプラスミドを、チャイニーズ働ハムスタ
ー由来のＣＨＯ株のＤＨＦＲ欠損変異株の細胞にトラン
スフ９クトさせて製造できる。また、宿主細胞が原核細
胞の場合は、例えば一般の大腸菌の発現ベクターにＦｅ
１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡを°連結し、大腸菌
を形質転換させてＦｅ１ＦＮ生産性大腸菌を製造するこ
とができる。

ＦｅＩＦＮの産生は、前記のＦｅ１ＦＮ生産細胞を培養
することにより行なう。

以下、本発明に関し逐次詳細に説明する。

遺伝子操作技術・細胞工学技術については、文献９．１
０を始めとし数多くの実験書があり、既存の技術が適用
できる。

ｃ−ＤＮＡライブラリーは大腸菌を宿主とし、ネコの細
胞から抽出したｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡを基質
とし、逆転写酵素を用いた一般的な方法で作れる。

ｐｏｌｙ（Ａ）　　ＲＮＡの供与体としてのネコの細胞
は、例えばＬＳＡ　（文献５）のような株化された培養
細胞が使用に便利ではあるが、これに限らない。培養し
た細胞からｐｏｌｙ（Ａ）　　ＲＮＡを得るときは、そ
の細胞に適したインターフェロンインデューサーを検討
し、これを用いてｐｏｌｙ（Ａ）　　ＲＮＡの増収を図
ると便利であり、例えばＬＳＡ細胞では培養時にＮ　Ｄ
　Ｖ　（Ｎｅｗ　Ｃａ５ｔＩｅ−ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｌ
ｒｕｓ）やＴ　Ｐ　Ａ　（１２−０−ｔｅｔｒａｄｃｃ
ａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ　１３−＾ｃｅｔａｔｅ）な
どを誘導剤として用いるとｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　　Ｒ
ＮＡの収量増大が図れ便利である。プラスミドベクター
は動物細胞用発現機構を備え、かつ大腸菌で複製可能な
もの、例えばファルマシア社製オカヤマ・バーブ・ベク
ター類のような市販のものを使うと便利である。宿主の
細菌は大腸菌（Ｅ、ｃｏｉ　１）Ｋ１２株を用いること
ができる。

Ｆｅ１ＦＮをコードするＣ−ＤＮＡを有するプラスミド
のクローン化は、サルの株化細胞Ｃ０８１あるいはＣ０
８７（文献１８）をトランスフェクトし、トランジェン
ト・エクスプレジョンでＣ０８１あるいはＣ０８７に抗
ウイルス活性生産能を賦与するプラスミドとして、Ｃ−
ＤＮＡライブラリーの中からスクリーニングすることに
より行なうことができる。プラスミドによるＦｅ１ＦＮ
トランジエント・エクスプレジョンは、例えば文献１４
のＤＥＡＥ−デキストラン法や文献１３のリン酸カルシ
ウム法のような一般的な（常法）方法で行なうことがで
きる。微工研条寄第１６３３号は、Ｃ０８１細胞をトラ
ンジェント・エクスプレジョンで抗ウィルス活性を生産
させることのできるプラスミドを含有する形質転換体の
一例である。抗ウィルス活性の測定は、ネコの培養細胞
とＶＳＶとを用い（文献５）、文献１２に記されたＣＰ
Ｅ法などの常法が使用できる。

真核細胞のＦｅ１ＦＮ生産細胞は、微工研条寄第１６３
３号の大腸菌形質転換体から、例えば文献１７のような
一般的な方法により抽出したプラスミドｐＦｅＩＦＮ１
を、例えばｐＡｄＤ２６ＳＶＡ（文献２０）のようなり
ＨＦＲ発現能を有するプラスミドと共に、例えば文献１
８のようなりＨＦＲ欠損変異を有するＣＨＯ−ＤＵＫ−
ＸＢ−１１株をコトランスフエクトして、ＤＨＦＲ陽性
に形質転換されたクローンの中から抗ウイルス活性生産
能を有するものとしてスクリーニングできる。

原核細胞のＦｅ１ＦＮ生産細胞は、プラスミドｐＦｅＩ
ＦＮ１からＦｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡ部分
を、例えばｔｒｐプロモーターなど、いわゆる大腸菌用
発現ベクターの発現調節部分の下流に連結するという一
般的な遺伝子操作に従って作成した合成プラスミドを用
いて、大腸菌に１２株を形質転換させてできた形質転換
体の中から抗ウイルス活性生産能を有する形質転換体と
して選び出すことにより作成することができる。

Ｆｅ１ＦＮの生産はチャイニーズ−ハムスターの形質転
換体ＣＨＯ−Ｆ　ｅ　Ｉ　ＦＮ　（微工研条寄第１６３
４号）を、株化ＣＨＯ細胞が生育する培地、好ましくは
５〜１０％ＦＢＳを含んだＭＥＭα培地（ＧＩＢＣＯＣ
ａｔ、　Ｎｏ、　４１０−２０００＞のような市販の培
地中で培養することにより行なうことができる。

また、形質転換体が大腸菌の場合は、例えばＬＢ培地、
Ｍ９培地をはじめ大腸菌が生育する通常の培地で培養し
、溶菌することによりＦｅ１ＦＮを生産することができ
る。さらに、インドールアクリル酸などの誘導剤を用い
ると生産性を上げることができる。

産生されたＦｅ１ＦＮは、通常の方法で精製することか
できる。例えばアフィニティークロマトグラフィーによ
る方法などが好ましく用いられ、特にブルー色素を結合
させた担体（以下、ブルー担体と略す）、銅をキレート
結合させた担体（以下、銅キレート担体と略す）、レッ
ド色素を結合させた担体（以下、レッド担体と略す）な
どを用いる方法が好ましく用いられる。これらの担体は
単独で用いても良いが、精製効果を上げるためには、一
種以上の担体を併用する方法が好ましい。

特に、ブルー担体を用いるクロマトグラフィー銅キレー
ト担体を用いるクロマトグラフィーおよびレッド担体を
用いるクロマトグラフィーを連続して行なう方法が好ま
しい。

ブルー担体としては、次のものが使用される。

ブルー色素は一般名をＣＩリアクティブブルー２といい
、例えばＣＩ　ＢＡ−ＧＥ　ＩＧＹ社から“シバクロン
ブルーＦ３ＧＡ”または“シバクロンブルー３ＧＡ”と
いう商品名で市販されている青色色素などが挙げられる
。実際のクロマトグラフィーに用いるブルー担体として
は、′ブルー・セファ０−スＣＬ　−６Ｂ　’　　（Ｐ
ｈａｒｎ＋ａｃｉａ社）、“マドレックスゲル・ブルー
Ａ″　（Ａｍｉｃｏｎ社）、および“アフィゲル・ブル
ー　（３１ｏｒａｄ社）などの商品名で市販されている
ブルーアガロースゲル、または“ブルー　トリスアクリ
ル−Ｍ″　（ＬＫＢ社）、“ブルーセルロースゲル“　
（チッソ社）などの商品名で市販されているブルーセル
ロースゲルなどが適当であり、容易に入手することがで
きる。

銅キレート担体としては、アガロース、セルロース、ポ
リアクリルアミドゲルなどに、例えばビスカルボキシメ
チルイミノ基（−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ）２）などのキレ
ート能を有する交換基が結合した担体を、硫酸銅などの
銅塩の溶液で処理した担体が挙げられる。好ましくは、
“キレ−ティングセファ０−ス”　（Ｐｈａｒｍａｃｌ
ａ社製）などの不溶性多糖類系担体に銅をキレートさせ
た担体が用いられる。

レッド担体としては、次のものが使用される。

レッド色素は一般名をＣＩリアクティブレッド１２０と
いい、例えばＩＣ１社から”Ｐｒｏｃｌｏｎ　Ｒｅｄｌ
ｌＢ−３Ｂ”という商品名で市販されている赤色色素な
どが挙げられる。この色素を吸着させた担体としては、
例えば“レッドセファ０−スＣＬ−６Ｂ″（Ｐｈａｒｍ
ａｅｉａ社）、“マトリックスゲルレッドＡ″（Ａｍｉ
ｃｏｎ社）、および“レッドトヨパール″　（東ソー社
）などの商品名で市販されているゲルなどが適当であり
、容易に入手することができる。

クロマトグラフィーによるＦｅ１ＦＮの精製操作は次の
ように行なう。すなわち、まずＦｅ１ＦＮを含む溶液を
上記担体に接触吸着させる。吸着は、バッチ法、カラム
法どちらでも可能であるが、カラム法の方が吸着効率が
高い。次に、吸着させたＦｅ１ＦＮを溶出剤で溶離させ
る。ブルー担体またはレッド担体からの溶離は、溶出剤
のｐＨ値、イオン強度、疎水度によって決定される。例
えば、高イオン強度下ではｐＨ６〜７でＦｅ１ＦＮは溶
出される。このイオン強度は、リン酸、酢酸、クエン酸
、ホウ酸などの緩衝液の濃度を上げたり、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウムのような中性塩の添加（０，２〜１．
０Ｍ）により増加させることができる。また、溶出剤中
にエチレングリコール、プロピレングリコールなどの疎
水的相互作用を弱める溶剤を含む場合、ｐＨ５〜７での
溶出が可能になる。

銅キレート担体からの溶離は、通常、リン酸、酢酸、ク
エン酸などの酸性緩衝液で行ない、ｐＨ５以下が好まし
い。しかし、高イオン強度下では、さらに高いｐＨでの
溶離が可能となる。

溶出剤の組成や濃度、液量は特に限定されるものではな
く、それぞれ粗Ｆｅ１ＦＮ中に含まれる夾雑タンパク質
を除去するのに有効で、ｐＨを保持するのに必要な濃度
、吸着されたＦｅＩＦＮを実質的に回収するのに必要な
量が用いられる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ （１）　　ネコのＣ−ＤＮＡライブラリーの作製ｐｏ　
１　ｙ　（Ａ）　　ＲＮＡの供与体であるネコの細胞Ｌ
ＳＡ−Ｄ４−に１７　（文献５）を２００ｍ１の１０％
ＦＢＳを含むＭＥＭ−Ｌ１５培地〔５０％イーグル（Ｅ
ａｇｌｅ）Ｍ　Ｅ　Ｍ　−５０％レイボヴイッツ（Ｌｅ
ｊｂｏｖｉ　ｔｚ）培地〕中スピナーカルチャーで増殖
させ、細胞濃度１０５〜１０６／ｍｌのところでＴ　Ｐ
　Ａ　（１２−０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏ
ｒｂｏｌ　１３−Ａｃｅｔａｔｅ　、シグマ社製）を５
μｇ／ｍｌとなるように培地中に加え、さらに２０時間
培養を続けた後、遠心分離で細胞を集めた。この細胞か
ら文献１５のグアニジウムチオシアネート法の変法によ
りｐｏｌｙ（Ａ）　　ＲＮＡを抽出した。すなわち、細
胞３〜５Ｘ１０Ｂを２０ｍ１の５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム−０，５％ザルコシルナトリウム−０，１Ｍメルカプ
トエタノール−６Ｍグアニジンチオシアネー４に懸濁し
た後、１８Ｇの注射針を１０回通すことでホモジナイズ
した。ポリアロマ遠心管にホモジネートの１／３容の０
．ＩＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）−５，７Ｍ　　Ｃ
ｓＣ１を入れた後、この」二にホモジネートを重層し、
日立ＲＰＳ４０Ｔローターで３５．ＯＯＯｒｐｍ　、２
０℃、２０時間遠心した。チューブ底部にパックされた
ＲＮＡ画分を１ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ）リス・塩酸−１
ｍＭＥＤＴＡ　　ｐＨ７，５）に溶かし、０．１ｍｌの
３Ｍ酢酸ナトリウム液と混ぜた後、２．５容の冷エタノ
ールと混ぜ一２０℃で２時間静置した。遠心分離により
生じた底部のペレットを１ｍｌのＴＥに溶かし、６５℃
、４分間インキュベートした後、水冷し１ｍｌのＴＥを
加えた後、等量の１．０ＭＮａＣ１と混ぜた。この混合
物を０．５Ｍ　　ＮａＣ１−ＴＥで平衡化した０、５ｍ
ｌのｏ　１　ｉ　ｇ。

（ｄＴ）セルロース（タイプ３）（コラボラティブ・リ
サーチ社ａ／）のカラムに通し、ｐｏｌｙ（Ａ）　＋Ｒ
ＮＡを吸着させ、１０ｍ１の０．５ＭＮａＣ１−ＴＥで
洗滌した後、５ｍｌのＴＥで溶出し、エタノール沈澱法
でベレット化したｐｏｌｙ（Ａ）　＋ＲＮＡを３０μｍ
のＴＥに溶かし一８０°Ｃで保存した。７Ｘ１０８個の
細胞から３００μｇのｐＯＩ　Ｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡが
得られた。ｐｏｌＹ　（Ａ）　　ＲＮＡのプラスミドベ
クターへの連結とＣ−ＤＮＡの合成は市販のプラスミド
プライマーとリンカ−とを用い、文献１４を参考にして
行なった。すなわち、１．５０１１容のエッペンドルフ
チューブに５ｍｇ／ｍ１のｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　　Ｒ
ＮＡを５μｍ入れ、これに水を加えて２０μｍとし、６
５℃、３分間インキュベートした後室温に戻した。

これに０．３Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）−８
０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２−０．３Ｍ　　ＫＣｌ−３ｍＭジ
チオスレイトールを４μｍ加え、これにオリゴ（ｄＴ）
ティルトｐｃＤＶ１プラスミドプライマー（ファルマシ
ア社製）を２μｇ　（３μｍ）、そしてそれぞれ２５ｍ
Ｍ濃度のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの混
合液を４μ１１そして［ａ−３２Ｐ］　ｄＣＴＰ　　１
０ｍＣ１／ｍｌを２μ１１そして水を３μｍ加えた後、
１８単位／μｍの逆転写酵素（生化学工業社製）を４μ
ｌ加え、４２℃、１時間インキュベートとして酵素反応
を行ない、４μｌの０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡと２μｌの
１０％ＳＤＳとを加え反応を停止した後、フェノールφ
クロロホルム抽出を行ない水層を取り、４０μｍの４Ｍ
酢酸アンモニウム、１６０μｍのエタノールを加え、ド
ライアイス中１５分間冷却しだｔこれを室温に戻してか
らマイクロ遠心機で１０分間遠心し、上清を除いた後、
ベレットを２０μｌの水に溶解し、２０μｍの４Ｍ酢酸
アンモニウム、８０μｌのエタノールを加え、再度エタ
ノール沈澱を行なった。ペレットをエタノールで洗滌し
乾燥させた後、１０μｌの水に溶した。

これに、２μｍの１．４Ｍカコジル酸ナトリウム−０，
３Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ６，８）−１ｍＭジチオ
スレイトール、１μｍの２００μｇ　／　ｍｌポリアデ
ニル酸（生化学工業■）、１μｌの２０ｍＭ　　ＣＯＣ
ｌ２．１．４μｌのｌｍＭｄＣＴＰ、０．５μｍの［α
　　Ｐ］ｄＣＴＰ４００Ｃｉ／ｍｍｏ　１　　（１０ｍ
Ｃｉ／ｍｌ）を順次加え、さらに水を加えて２０μｍと
した後、２７単位／μｌのターミナルヌクレオチジルト
ランスフエラーゼを０．８μｌ加え、３７℃、５分間イ
ンキュベートし、水中で酵素反応を止めた。末端付加し
たｄＣＭＰ残基数は、文献１４に従い平均１２と推算さ
れた。これからフェノール・クロロフォルム抽出法と２
回のエタノール沈澱法により核酸を回収した。

この核酸を４０μｍの１０ｍＭ）リス・塩酸（ｐＨ８，
０）−６０ｍＭ　　ＮａＣ１−１０ｍＭＭ１−１Ｏ１ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール溶液に溶解し、Ｈｉｎｄ■
制限酵素を１０単位加え、３７℃、３時間インキュベー
トした後、フェノール台クロロホルム抽出、２回のエタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収し、エタノールで洗滌・
乾燥した後、１０μｍのＴＥ緩衝液に溶解した。

これに５μｍの２ＭＮａＣ１，８１μｍのＴＥ緩衝液、
４μｍの市販の３′−オリゴ（ｄＧ）ティルトｐＬ１リ
ンカ−（ファルマシア社製）を順次加えた後、６５℃、
５分間、次に４２℃、１時間加温した後氷冷した。これ
に１００μｍの０゜２Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）−４０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２−０．１Ｍ硫酸アンモニ
ウム−ＩＭ　　ＫＣＩ、７μｍの１４ｍＭ　　β−ＮＡ
Ｄ、　５０μｌの１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン溶液
、６μｌの１ｍｇ／ｍｌ　　Ｅ、　　ｃ　ｏ　１　ｉ　
　ＤＮＡリガーゼを順次加え水を加えて１ｍｌとし、１
２℃−晩インキユベートした。

この反応液にそれぞれが２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ
、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ混合液を２μｍ、１４ｍＭ　　β
−ＮＡＤを３μｍ、３５単位／μｌのＥ、ｃｏｉｌ　　
ＤＮＡポリメラーゼＩ（宝酒造■）をＯ，，７μＬ　２
．５単位／μｍのＥ、ｃ。

ｉＩ　　ＲＮａｓｅＨ（宝酒造■）を２．４μｍ、１＋
ａｇ／ｍｌのＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡリガーゼを４μｌ
を順次加え、１２°Ｃ１１時間、次に２５°Ｃ１１時間
インキュベートした後、−２０°Ｃで保存した。

これの１００μｍを文献１５の方法でコンピテント化し
たＥ、ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０６１（文献１６）懸濁液１
ｍｌに加えて形質転換反応を行なった後、１００μｇ　
／　ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地２５０　ｍｌ
に移し、３７℃−晩培養し、このうちの１０ｍ１にＤＭ
ＳＯを０．７ｍｌ加え、Ｃ−ＤＮＡライブラリーとし一
８０℃で保存した。

（２）　　クローニング こうして作製したＣ−ＤＮＡライブラリーの菌液の一部
を、１０個の９ｃｍＬＢプレートのそれぞれにコロニー
が１０００〜２０００個生じるように撤き、３７°Ｃ−
晩培養した後、それぞれのシャーレ毎に生育したコロニ
ーをかき集め、それぞれ１０ｍ１のＬＢ培地に懸濁し、
この菌液の３ｍｌを０゜２１ｍ１のＤＭＳＯと混ぜて凍
結保存し、残りの菌液をそれぞれ１００μｇ　／　ｍｌ
のアンピシリンを含んだ１００ｍ１のＬＢ培地と混ぜ３
７℃で一晩培養した。それぞれの培養液から菌体を集め
、文献１７の方法でプラスミドを抽出・精製した。これ
らのプラスミドの３０μｇずつにつき、文献１４のＤＥ
ＡＥデキストラン・トランスフェクション法を用いて、
９ｃｍシャーレ内でコンフルエントにまで増殖したＣ０
８Ｉ細胞（文献１９）にトランジェント・エクスブレジ
ョン（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｌｏｎ）を
試み、それぞれのプラスミドＤＮＡサンプルのＦｅＩＦ
Ｎ生産能を調べた。

すなわち、９ｃｍシャーレ内でＣ０８１細胞を１０　％
Ｆ　Ｂ　Ｓを含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０　（ＧＩＢＣＯ
社製）培地２０ｍ１中でコンフルエントになるまで増殖
させた後、培地を除去して、７．５μｇ／ｍｌのプラス
ミドＤＮＡサンプル、５０ｍＭトリスφ塩酸緩新液（ｐ
Ｈ７，４）　、４００μｇ／ｍ１ＤＥＡＥデキストラン
（ファルマシア社製）を含むＲＰＭ１１６４０培地４ｍ
ｌをシ培地４内ｌ入れ、３７°Ｃ１４時間、さらに培養
を続けた。次に１５０μＭクロロキンを含むＲＰＭ１１
６４０培地４ｍｌに交培地４内ｌ℃、３時間培養した後
、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭ１１６４０培地に交
換し、３７°Ｃ１３日間培養を続け、培地中の抗ウィル
ス活性を調べた。以上のＲＰＭ１１６４０培地には、い
ずれも１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μ
ｇ　／　ｍｌのストレプトマイシンを添加して用いた。

その結果、１０種の培養液のうち、２０単位／ｍ１以」
二の抗ウィルス活性を示すものが３種あったため、該当
凍結保存菌液の中から、抗ウイルス活性生産性をＣＯＳ
１細胞に賦与するプラスミドを−ａする大腸菌を次のよ
うにして探し出した。

すなわち、当該活性を生じさせるプラスミドを有する３
種凍結保存菌液の１種を希釈し、プレート当り約６００
個のコロニーを生じるよう１０枚の１００μｇ　／　ｍ
ｌアンピシリンを含んだＬＢプレートに撤き、３７℃、
−晩培養した後、保存プレートとしてのレプリカを作っ
た後、各プレート毎に菌体をかき取り、５ｍｌのＬＢ培
地に懸濁してから１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
んだ１００ｍ１のＬＢ培地と混ぜ、３７℃−晩培養し、
菌体を集めプラスミドを抽出・精製した。これら１０種
のプラスミドをシャーレ当り２０μｇずつ用い、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法でＣ０８１によるトランジェント・
エクスプレジョンをさせ、ＦｅＩＦＮ生産能を調べた。

その結果、１０種のプラスミドサンプルのうちの１種に
該生産能が認められたため、該当する保存プレートのコ
ロニー５９３個を別のアンピシリン含′ｆＴＬＢプレー
トにつま楊子で約１００個ずつ移植し、３７°Ｃ１−晩
培養した後、各プレート毎に菌体をかき取り、１００ｍ
１のアンピシリン含有ＬＢ培地中で一晩培養し、集めた
菌体からプラスミドを抽出・精製し、トランジェント・
エクスプレジョン法により各プラスミドの該抗ウイルス
活性生産能を調べた。

その結果、１つのプラスミドサンプルに該生産能が認め
られたため、該当する保存プレート中のコロニー１００
個を各々２ｍ１ＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し
、トランジェント・エクスプレジョン法で各プラスミド
の抗ウイルス活性生産能を測定した。該生産能の最も高
いプラスミドをｐＦｅ　ＩＦＮＩ、これを含有する大腸
菌をＥ、　　ｃｏ　１　ｉ　　（ｐＦｅ　ＩＦＮＩ）と
名付け、菌は微工研に寄託した（微工研条寄第１６３３
号）。

（３）抗ウイルス活性測定法 ウィルスはＶｅｓｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ
　Ｖｉｒｕｓ、感受性細胞はネコＦＣ９（文献５）を用
い、文献１２のＣＰＥ法に従って抗ウィルス活性を測定
した。

スタンダードリフエランスとしてＮＩＨのヒトの天然型
αＩＦＮ換算したＨｕｌＦＮαを用いた。

（／Ｉ）ＣＨＯ細胞でのＦｅ１ＦＮの生産１０％ＦＢＳ
を含むＭＥＭａ培地（ＧＩＢＣＯＣａｔ。

Ｎｏ、　４１０−１９００）を用いて１２ウエルプレー
トに１／１０希釈で継代し、３０間培養したＤＨＦＲ欠
損変異株であるＣＨＯ細胞株ＤＵＫ−ＸＢ−１１（文献
１８）に、文献１３のリン酸カルシウム法を適用して、
５μｇのｐＦｅｌＦＮｌと、ＤＨＦＲ遺伝子を有するｐ
ＡｄＤ２６ｓＶＡ　（文献２０）の０．５μｇとをトラ
ンスフェクトした。培養１日後に１０％ＦＢＳを含む核
酸成分フリーのＭＥＭ　ａ　（ＧＩＢＣＯ社製、Ｃａｔ
、　Ｎｏ、４１０−２０００）の選択培地に植継ぎ、途
中２回の培地交換をし、１０口間９ｃｍシャーレ中で培
養をしたところ、１４７個のコロニーが得られた。この
うちの１６コロニーを２４ウエル・プレートに移植し、
コンフルエントになるまで３〜４日間培養し、培養液の
抗ウィルス活性を測定したところ、８培養液中に１万里
位／ｍ１以」二の活性が認められた。活性のあるクロー
ンをシングルコロニーアイソレーション法で純化し、純
化したコロニーの１つをＣＨＯ−ＦｅＩＦＮと名ずけ微
工研に寄託した（微工研条寄第１６３４号）。

（５）　　ｐ　Ｆ　ｅ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　１ｐ−Ｆ　ｅ　Ｉ
　Ｆ　Ｎ　１は４．３Ｋｂの大きさで、その制限地図は
第１図に示す。

実施例２ （１）ＦｅｌＦＮ構造遺伝子を含む断片の作製第１図に
示したプラスミドｐＦｅｌＦＮ１から、第２図に示す方
法で、Ｆｅ１ＦＮ構造遺伝子を含む断片を調製した。

すなわち、プラスミドｐＦｅＩＦＮ１　１１００ｔｔを
制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＯ１０９で完全分解し、得
られた複数のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分
け、約１ｋｂのＤＮＡ断片をエレクトロエリニーション
で取り出し、約２０μｇを回収した。

次に、このＤＮＡ断片２０μｇを制限酵素ＨｉｎｃＩＩ
で完全分解し、得られたＤＮＡ断片のうち約６３０ｂｐ
のものを同様にして約１５μｇ回収した。こうしてＦｅ
ＩＦＮ構造遺伝子のうち、Ｅｃ００１０９より下流の部
分を含むＥｃｏＯ１０９−Ｈｉ　ｎ　ｃ　Ｉｆ断片を得
た。

（２）　　プラスミドｐＭＴ１の作製 トリプトファンプロモーターの下流に翻訳制御配列であ
るＳＤ配列を配し、その下流に翻訳開始コドンＡＴＧと
５種類の制限酵素認識部位を含む合成オリゴマーをヒト
インターフェロンβ構造遺伝子の替わりに挿入したベク
ター・ｐＭＴｌを作製した。作製手順を第３図に示す。

ヒトインターフェロンβ発現プラスミド−ｐＫＭ６　（
特開昭６１−１９４８７号公報）をＢｇｌ■で切断した
後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ大断片（フレノウ）酵
素により平滑末端とした。ｐＨ１ｎｄＩＩＩリンカ−ｄ
　（ｐＣ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ）を７４ＤＮＡ
リガーゼにより連結した。Ｃ１ａＩとＨｉ　ｎ　ｄＩＩ
Ｉで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行ない大断
片を分取した。

一方、翻訳開始コドンＡＴＧを含み、５′側がＣ１ａＩ
部位、３′側がＨｉｎｄｍ部位となり、かつＫｐｎ　Ｉ
、Ｓｍａ　Ｉ、ＢａｍＨＩ部位を内部にもつように設計
し、固相法により合成した２本のオリゴマーを、６０℃
で５分間加温し、徐々に冷却してアニーリングした。大
断片と合成断片を７４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐ
ＭＴｌを得た。

（３）　　ｐＭＴｌからＣ１ａｌ−ＳｍａＩ断片の作製
第４図に示すように、プラスミドｐＭＴ１　５０μｇを
制限酵素Ｃ１ａＩとＳｍａ　Ｉで完全分解し、アガロー
スゲル電気泳動により小さなりＮＡ断片を除いて、目的
のＤＮＡ断片を約４０μｇ回収し、大腸菌の発現プロモ
ーターｔｒｐプロモーターを含むＣ１ａＩ−ＳｍａＩ断
片を得た。

＜４）　　Ｎ末端Ｃ１ａＩ−ＥｃｏＲＩ断片の作製プラ
スミドｐＦｅ　ＩＦＮＩが組み込んでいるＦｅ１ＦＮ描
造遺伝子内のＥｃｏ０１０９部位の上流のＤＮＡ塩基配
列を同定し、その結果をもとにこの部分を合成した。

すなわち、第５図に示すように、Ｎ末側に開始コドンＡ
ＴＧとその隣りにＣ１ａＩ配列を含む、ＥｃｏＯ１０９
までの４３ｍａｒと４４　ｍａｒのＤＮＡを合成し、ア
ニーリングによりＣ１ａＩ−Ｅｃｏ０１０９２本鎖ＤＮ
Ａ断片を得た。

（５）　　プラスミドｐＦｅｌＦＮ２の作製（１）、（
３）および（４）で得た３つのＤＮＡ断片を用いて、第
６図に示すように、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによるライゲ
ーションを行なった。このとき、ＳｍａＩとＨｉ　ｎｃ
ＩＩは平滑末端であるので連結することができる。この
反応液をコンピテント化したＥ、ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０
６１と混合し、形質転換反応を行なった。１００μｇ　
／　ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートに生育する
クローンを１００μｇ　／　ｍｌのアンビニリンを含む
ＬＢ培地２ｍ１で培養しく３７℃、−晩）、アルカリミ
ニスクリーン法でプラスミドを抽出し、Ｃ１ａＩとＨｉ
ｎｄ■で分解して目的の大きさのＤＮＡ断片を組み込ん
でいるクローンを得た。このうち３クローンを選び、Ｃ
ＩａＩ−Ｅｃｏ０１０９断片のを含む約１５０ｂａｓｅ
のＤＮＡのシーケンスを行なって、目的のプラスミドが
得られたことを確認した。

（０）　　プラスミドｐＦｅｌＦＮ２の発現プラスミド
ｐＦｅｌＦＮ２で形質転換したＨ８１０１株をアンピシ
リン１００μｚ　／　ｍｌを含むＬＢ培地１０ｍ１で３
０℃、８時間培養し、２　ｘ　Ｍ　９培地（０，６％Ｋ
　Ｈ２Ｐ　Ｏ４，１，２％Ｎ　ａ　２　Ｈｐｏ４．０．
２％ＮＨ４Ｃ１，０，１％ＮａＣ１，１％カザミノ酸、
１％グルコース、０．２５μｇ／ｍｌ　　ＭｇＳＯ４φ
７Ｈ２０，０，０１℃ｇ／ｍ１チアミン）５０ｍｌに５
％植菌し、２５℃、−晩好気培養し、０Ｄ５５ｏ＝８〜
１０となったところで、１％グルコースを添加し、１４
％アンモニアでｐＨ＝７．０に調整してから、インドー
ルアクリル酸を２０℃ｇ　／　ｍｌ添加し、８時間培養
後、菌体を集めた。集菌した菌体を凍結融解とりゾチー
ム処理により溶菌して、遠心で菌体を除いて、上清の抗
ウィルス活性を調べると、１．２Ｘ１０４単位／ｍ１（
培養液）のＦｅ１ＦＮが生産されていた。

実施例３ ＦｅｌＦＮのＣ−ＤＮＡの塩基配列の決定プラスミドｐ
ＦｅＩＦＮ１から分離したＢａｍＨＩ断片をシーケンシ
ング用ベクターｐＵｃ１８（宝酒造■製）に抑大し、７
−ＤＥＡＺＡシーケンスキット（宝酒造■製）を用いた
ジデオキシシーケンス法によりＦｅ１ＦＮのＣ−ＤＮＡ
の塩基配列の決定を行なった。オートラジオグラフでバ
ンドの判別が難しい部分はマクサムギルバート法により
確定した。このようにして、第８図に示すＤＮＡの塩基
配列が決定された。

実施例４ １５ｃｍシャーレ内でＣＯ３１細胞を１０％ＦＢＳを含
むＲＰＭＩ　１６４０　（ＧＩＢＣＯ社製）培地２０ｍ
１中でコンフルエントになるまで増殖させた後、培地を
除去して、実施例１で得られたプラスミドｐＦｅＩＦＮ
１　７．　５ｔ１ｇ／ｍＩ、５０ｍＭ）リス・塩酸緩衝
液（ｐＨ７，４）　、４００μｇ　／　ｍ１ＤＥＡＥ−
デキストラン（ファルマシア社製）を含むＲＰＭＩ　１
６４０培地４ｍｌをシャーレ内に入れ、３７℃、４時間
、さらに培養を続けた。次に１５０μＭクロロキンを含
むＲＰＭＩ　１６４０培地４ｍｌに交換し、３７℃、３
時間培養した後、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭ１１
６４０培地に交換し、３７℃、３日間培養を続けた。

以上のＲＰＭ１１６４０培地には、いずれも１００単位
／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレ
プトマイシンを添加して用いた。

培養後、培養液から培養上清を得た。この粗Ｆｅ１ＦＮ
溶液は２．６Ｘ１０’Ｕ／ｍｌのＦｅ１ＦＮ活性を含み
、Ｆｅ１ＦＮ比活性は２．３Ｘ１０４Ｕ／ｍｇ　ｐｒｏ
ｔｅｉｎであった。この溶液１８Ｄ、を“ブルーセファ
ロース（ファストフロータイブ）”　５００ｍ１を含む
カラムにかけ、続いてこのカラムを０゜５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）５Ｄ、
で洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）０．５αおよび１Ｍ塩化ナトリ
ウム、２０％エチレングリコールを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）１．ＯＤ、でＦｅＩＦＮを溶出し
た。溶出されたＦｅ１ＦＮは２．３Ｘ１０５Ｕ／ｍｌの
ＦｅＩＦＮ活性を含み、比活性２．８Ｘ１０６Ｕ／ｍｇ
　Ｉ）ｒｏｔｅｉｎであった。このときのＦｅ１ＦＮ活
性回収率は７５％で、比活性は１２１倍に上昇した。

次いで、このブルー担体からのＦｅ１ＦＮ溶出液１．５
αを銅をキレート結合させた“セファロース”７０ｍ１
を含むカラムに直接かけ、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含
む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３，９）で洗浄後、０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３，
６）２１０ｍｌでＦｅＩＦＮを溶出した。溶出されたＦ
ｅ１ＦＮは１　、２　Ｘ　１０６Ｕ／ｍｌのＦｅ１ＦＮ
活性を含み、比活性７．　　Ｉ　Ｘ　１０７Ｕ／ｍｇ　
ｐｒｏｔｅｉｎであった。このときのＦｅ１ＦＮ活性回
収率は７７％で、比活性は２３倍に上昇した。

次いで、この銅キレート担体からのＦｅ１ＦＮ溶出液２
１Ｏｎ＋１を“レッドセファロース（ファストフロータ
イブ）”　１５ｍ１を含むカラムにかけ、リン酸緩衝生
理食塩水（ｐＨ７，０）で２００ｍ１で洗浄後、１Ｍ塩
化ナトリウム、４０％エチレングリコールを含む５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７゜０）１５ｍｌでＦｅ１ＦＮを
溶出した。溶出されたＦｅ１ＦＮは２．０Ｘ１０７Ｕ／
ｍｌのＦｅ１ＦＮ活性を含み、比活性は５．　９　Ｘ　
１０８Ｕ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであった。このときの
Ｆｅ１ＦＮ活性回収率は９５％で、比活性は１１倍に」
二昇した。

参考文献 ■、小林茂保編：インターフェロンの科学（１９８５）
。

講談社サイエンティフィック。

２．特開昭５８−２２４６９０号公報 ３、特開昭６２−５０１４６９号公報 ４、　Ａ、Ｊ、Ｌｉｂｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ａ、Ｊ、５
ｐｉｌｉｏｔｅｓ　ｒｓｐｃｅｔｒｕｍＪＰｅｂ、１−
２１〜１−２３　（１９８７）　Ａｒｔｈｕｒ　Ｄ、　
Ｌｉｔｔｌｅ　Ｄａｃｌｓｌｏｎ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ
、ＵＳＡ。

５、　Ｊ、に、Ｙａｍａｍｏｔｏら：　Ｙｅｔ、　　１
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ｃｔｌｃｅ　１７．２４〜３０（１９８７）　。

９、　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ　（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｌｎｇ　
ｌ１ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ。

１０、日本生化学全編：続生化学実験講座第１巻。

遺伝子研究法ＩＩ　（１９８６）　、東京化学同人。

１１、日本生化学全編：続生化学実験講座第１巻。

遺伝子研究法ｍ　（１９８７）　、東京化学同人。

１２、ロ本生化学会編：続生化学実験講座第５巻。

（１９８６）、　Ｐ２５０〜２５６．東京化学同人。

Ｈ，Ｐ、Ｌ、Ｇｒａｂａｍら：　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５
４．５３６〜（１９７３）　。

１４、文献１１のＰ２２１〜２３６゜ １５、重定勝哉：細胞工学２．６１６〜Ｂ２９　（１９
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１６、　　Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａｄａｂａｎ　　ら　：　　
Ｊ、Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、　　１３８．　１７９〜２
０７　（１９８０）。

１７、文献９の１）８６〜９６６ １８、　Ｇ、ＬＩｒｌａｕｂ　＆　Ｌ、Ａ、Ｃｈａｓｌ
ｎ、　ＰｒｏＮＡＳ、　７７、４２１６〜４２２０　（
１９８０）。

１９、　　Ｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ　　　：　　Ｃｅ１ｌ、
　　２３．　１７５　〜１８２　　（１９８１）。

２０、　Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎ　ａｎｄ　Ｐ、Ａ、５
ｈａｒｐ　：　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｌｏｌ、２．
１３０４〜１３１９　（１９８２）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の合成プラスミドｐＦｅｌＦＮ１の制
限地図を示す。 第２〜６図は、本発明の大腸菌用発現プラスミドｐＦｅ
ｌＦＮ２の作製手順を示す。 第７図は、ネコインターフェロンの遺伝子配列およびア
ミノ酸配列を示す。 第８図は、ネコインターフェロン前駆体の遺伝子配列お
よびアミノ酸配列を示す。 特許出願人　　東　し　株　式　会　社ＢａｍＨＩ 第 図 第 図 第 図 Ｅｃｏ几！

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. （１）ネコインターフェロンの蛋白質をコードするＤＮ
   Ａを組込んだ合成プラスミド。
2. （２）ネコインターフェロンの蛋白質をコードするＤＮ
   Ａを組込んだ合成プラスミドにより宿主細胞を形質転換
   してなる形質転換体。
3. （３）宿主細胞が真核細胞である請求項（２）記載の形
   質転換体。
4. （４）真核細胞がＣＨＯ細胞である請求項（３）記載の
   の形質転換体。
5. （５）宿主細胞が原核細胞である請求項（２）記載の形
   質転換体。
6. （６）原核細胞が大腸菌である請求項（５）記載の形質
   転換体。
7. （７）請求項（１）記載の合成プラスミドおよび真核細
   胞を培養して得られる糖鎖を有するネコインターフェロ
   ン。
8. （８）真核細胞がＣＯＳ細胞である請求項（７）記載の
   糖鎖を有するネコインターフェロン。
9. （９）請求項（１）記載の合成プラスミドにより形質転
   換された真核細胞を培養して得られる糖鎖を有するネコ
   インターフェロン。
10. （１０）真核細胞がＣＨＯ細胞である請求項（９）記載
    の糖鎖を有するネコインターフェロン。
11. （１１）比活性が１×１０＾８Ｕ／ｍｇ蛋白質以上で、
    かつ分子量が約２４，０００である請求項（７）〜（１
    ０）のいずれか記載の糖鎖を有するネコインターフェロ
    ン。
12. （１２）請求項（１）記載の合成プラスミドにより形質
    転換された原核細胞を培養して得られるネコインターフ
    ェロン。
13. （１３）原核細胞が大腸菌である請求項（１２）記載の
    ネコインターフェロン。
14. （１４）比活性が１×１０＾８Ｕ／ｍｇ蛋白質以上で、
    かつ分子量が約２０，０００である請求項（１２）また
    は（１３）記載の糖鎖のつかないネコインターフェロン
    。
15. （１５）第７図に示すアミノ酸配列を有する蛋白質が呈
    する生物活性をもつネコインターフェロン。
16. （１６）請求項（１）記載のネコインターフェロンの蛋
    白質をコードするネコインターフェロン遺伝子。
17. （１７）第７図に示すＤＮＡ配列を含む請求項（１６）
    記載のネコインターフェロン遺伝子。
18. （１８）第７図に示すアミノ酸配列を有する蛋白質に糖
    鎖が結合してなる請求項（１５）記載のネコインターフ
    ェロン。
19. （１９）請求項（１５）記載のネコインターフェロンの
    Ｎ−末端に開裂可能なペプチドまたはシグナルペプチド
    が結合してなるネコインターフェロン前駆体。
20. （２０）第８図に示すアミノ酸配列を有する請求項（１
    ９）項記載のネコインターフェロン前駆体。
21. （２１）請求項（２０）項記載のネコインターフェロン
    前駆体をコードするネコインターフェロン前駆体遺伝子
    。
22. （２２）第８図に示すＤＮＡ配列を含む請求項（２１）
    項記載のネコインターフェロン前駆体遺伝子。