JPS63304997A - 魚類の生殖腺刺激ホルモン遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、魚類の生殖線刺激ホルモンおよびそれを用い
る魚類の生殖腺増大方法に関する。

哺乳類の生殖線刺激ホルモン〔ゴナドトロピン（Ｇｏｎ
ａｄｏｔｒｏｐｉｎ）以下ＧＴＨと略記する〕としては
、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒ
ｍｏｎｅ。

以下ＬＨと略記する）および卵胞刺激ホルモン（Ｆｏｌ
ｌｉｃｌｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ
、以下ＦＳＨと略記する）の２種類があり、脳下垂体前
葉から産生されることが明らかにされている。またそれ
らの活性ならびに構造も公知である。すなわちＬＨにつ
いては、ヒツジＬＨ（Ｉｆ、Ｐａｐｋｏｆｆら；　Ｊ、
　Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、旦、　　１５３１（１９７１
）　　）　、ヒトＬＨＣＢ、　Ｓｃｈｏｍｅら；　Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、　　Ｂｎｄｏｃｒｉｏｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ
１３６　　、６１ｇ（１９７３））　、ＦＳＨについて
は、ヒトＦ　Ｓ　Ｈ（Ｂ、　Ｓｃｈｏｍｅら；　　Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、　　Ｂｎｄｏｃｒｉｏｎｏｌ。

Ｍｅｔａｂ、、旦、　　１９９　　（１９７４））、つ
？ＦＳＨ（Ｐ。

Ｒａｔｈｎａｍ　　ら；　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、
韮、　　５３５５（１９７８）　　）などの報告がある
。魚類とくに硬骨魚における生殖線刺激ホルモンの生化
学的研究は、コイ［８゜Ｂｕｒｚａｗａ−Ｇｅｒａｒｄ
ら；Ｇｅｎ、　Ｃｏｍｐ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、
　３８゜４２１−４４０（１９７９）〕、サケ（Ｅｄｗ
ａｒｄ　Ｍ、　Ｄｏｎａｌｓｏｎら；Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ
、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、　　１８　．４６９−４
８１　（１９７２）、Ｄ、ＲｏＩｄｌｅｒ　　ら　；　
　Ｇｅｎ、　Ｃｏｍｐ、　　巳ｎｄｏｃｒｉｎｏ１．．
　４ニー。

３８４−３９１（１９８０）　〕、ヒラメ　（Ｔ、Ｂｕ
ｎ　ＮＧ　　ら；Ｇｅｎ、　　Ｃｏｍｐ、　　巳ｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌ、、　　３４　．４０８−４２０（１９７
８）　　）などが報告されている。

シロサケのＧＴＨは先に川内により単離されており、Ｇ
ＴＨ−１、ＧＴＨ−２の２種のＧＴＨが存在することお
よびその生殖線刺激活性が報告されている（特開昭６Ｏ
−６７５００）。

一般にＧＴＨ類ポリペプチドは、α鎖とβ鎖からなるサ
ブユニット構造を有することが知られている。このうち
α鎖は同−生物種内のＧＴ）！全てに共通のポリペプチ
ドで、β鎖がＧＴＨの種類ごとに異なっており、その特
異性を決定する。哺乳類ＧＴＨのα鎖およびそれぞれの
β鎖の遺伝子は既に多くの報告がある。魚類においては
、チヌークサーモンＧＴＨβ鎮遺伝子ＣＫ、　−Ｙ、　
Ｔｒｉｎｈら；Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５９　．６１９−６２４　（１
９８６））とシロサケＧＴＨα鎮遺伝子〔柚ら：特開昭
６０−１７６５８８　）が知られている。α、β両鎖両
鏡いて同一魚種より単離し、全構造を決めた例はない。

発明が解決しようとする問題点 魚類のＧＴＨは魚類の生殖腺を増大させることができ、
養殖漁業等の分野では採卵（卵の成熟促進、産卵促進）
などに有用である。しかし魚類の脳下垂体からの採取は
供給量が限られており、その安価で大量な供給法の開発
が望まれる。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、シロサケＧＴＨについて研究を重ね、シ
ロサケＧＴＨのα鎖、β鎖両方のｃ　ＤＮＡを単離し、
α、β両鎖ｃＤＮＡならびにそこにコードされるポリペ
プチドの全構造を決定した。このα、β鎖ｃＤＮＡを用
いることにより、遺伝子工学的にα、β側鎖を有するＧ
Ｔ）Ｉ　Ｃ以下ＧＴＨ（α＋β）と略称する〕を製造す
ることが可能になった。

即ちシロサケ脳下垂体からメツセンジャーＲＮＡ　（ｍ
ＲＮＡ）を抽出し、これと相補的なりＮＡ（ｃＤＮＡ）
を合成し、次いでシロサケのＧＴＨのＮ末端付近のアミ
ノ酸配列に対応するＤＮＡプローブを合成し、このＤＮ
ＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを選択することにより
、シロサケＧＴＨ遺伝子をクローン化することに成功し
た。さらにこのｃＤＮＡの全塩基配列を決定し、本発明
を完成するに至った。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は、シロサケ１ｍ、ＴＨポリペプチド、とくに式
１、式２または式３に示されたペプチド配列を有するポ
リペプチドを提供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮ
Ａ技法を用いて下記のごとく製造することができる。

即ち、シロサケＧＴＨのｍＲＮＡを鋳型として用いて該
ｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を調製し
、該ｃＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを調製す
る。さらに、該組換え体プラスミドを宿主微生物に挿入
する。該ＤＮＡおよび組換え体プラスミドは、とくにエ
ッシエリヒア・コリのような細菌中または真核細胞中シ
ロサケＧＴＨ遺伝子の増幅に使用することができる。該
組換え体プラスミドを有する微生物または真核細胞はシ
ロサケＧＴＩＩを安価に大量に製造するために有用であ
る。

従って、本発明は、シロサケのＧＴＨポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ
ならびに該組換え体ＤＮＡを含む微生物を提供する。

本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の一般的手
法で調製される。

シロサケ脳下垂体より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴ
ｄ　Ｔセルｏ　−ｘ　（ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｃｅｌｌｕ
ｌｏｓｅ）カラムを通すことによりポリアデニル酸（ポ
’ＪＡ）を有するＲＮＡ　（ポＩＪＡ”ＲＮＡ）を分離
する。

このポリＡ“ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素により二重
鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内ＤＮＡ組換え
技法を用い、大腸菌のプラスミドＤＮＡのようなベクタ
ーＤＮＡに該合成りＮＡを挿入して得られる。シロサケ
ＧＴＨｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを有する組換え体
プラスミドを選択する。

次に本発明のＤＮＡおよび組換え体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。

捕獲されたシロサケより脳下垂体を摘出し、即座に液体
窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にグアニジウム
・イソチオシアネート軸ｕａｎｉｄｉｕｍｉｓｏｔｈｉ
ｏｃｙａｎａｔｅ）を加え破砕し、可溶化する。次いで
Ｃ５Ｃｊ！溶液層に重層し、超遠心後、沈殿物とし全細
胞質ＲＮＡを得る。またグアニジウム・インチオシアネ
ート可溶化物にＬｉＣＡ’を加えてＲＮＡのみを沈殿さ
せ回収することもできる。

抽出したＲＮＡをＮａＣｊ！またはＫ（ｌの高塩濃度（
たとえば０．５Ｍ）溶液に溶解し、オリゴ（ｄＴ）セル
ロースのカラムに通塔してポＩＪ（Ａ）を有するｍＲＮ
Ａをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ）！ＪスーＨＣ
１緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ボＩＪ
（Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。

以下、オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　
）の方法〔オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ
　＆　Ｂｅｒｇ）；モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジィ（Ｍｏｌ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　　２
，１６１（１９８２）：］に従い、ｃＯＮへの合成およ
び、そのベクターへの組み込みを行う。

まずベクターブライマーを合成する。ベクターとしては
たとえばｐｃＤＶｌを適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ
（ｌ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，１０ｍＭ）、　　Ｍ
　ｇ　Ｃｌ１２（たとえば５ｍＭ）、ＮａＣβ（たとえ
ば１０ｍＭ）を含む溶液中でＫｐｎ　Ｉで処理し、ｐｃ
ＤＶｌのＫｐｎ　Ｉ部位を切断する。

このＤＮＡをトリス−ＨＣ，ｉ！緩衝液（たとえばｐ）
Ｉ６．８．３０ｍＭ）、　　カコジル酸ナトリウム（た
とえば１４０　ｍＭ）　、　Ｃｏ　ＣＣ（たとえば１ｍ
Ｍ）、ジチオスレイトール（たとえば０．１ｍＭ）およ
びｄＴＴＰ　（たとえば０．２５ｍＭ）中、ターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼとともに一
定温度（たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分
間）インキユベートシ、ベクターＤＮＡの両３′末端に
６０個前後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮ
Ａをトリス−ＨＣβ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，１０
ｍＭ）　、ＭｇＣＬ（たとえば６ｍＭ）、ＮａＣｊ！　
（たとえば１００ｍＭ）を含む溶液中ＥｃｏＲＩで切断
後、低融点アカロースゲル電気泳動〔ラルス・ライスラ
ング−（Ｌａｒｓ　Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ　）　：　ア
ナリティカル譬バイオケミストリ４　　（Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　９８゜３０
５　（１９７９）　）にて分画し、約３．１キロベース
の断片を回収する。次いで該ＤＮＡをＮａＣｊまたはＫ
（ｌの高塩濃度（たとえば０．５Ｍ）溶液に溶解し、ポ
リ　（ｄ　Ａ）セルロースカラムに通塔してポリ　（Ｔ
）を有するベクターブライマー分子のみをカラムに吸着
させる。水、ｌｏｍＭ）リスーＨＣβ緩衝液のような低
塩濃度溶液を用いて溶出し、ポリ（Ｔ）の付加したベク
ターブライマー分子のみを単離する。

次にリンカ−ＤＮＡを合成する。たとえばｐＬＩＤＮＡ
を適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣβ緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，１０ｍＭ）　、　ＭｇＣＲａ（たとえば
６ｍＭ）、ＮａＣｊ！　（たとえば５０ｍＭ）を含む溶
液中でＰｓｔｌで処理し、ｐＬｌのＰｓｔ１部位を切断
する。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰを加
える以外はベクターブライマー合成の場合と同様に処理
し、１５個前後のオリゴｄＧ鎖を付加する。該ＤＮＡを
適当な溶液たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐ
Ｈ７，５，１０ｍＭ）、ＭｇＣｊ２＊（たとえば６ｍＭ
）。

ＮａＣｊ！　（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎ
ｄｎｌにて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約０
．５キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペーパ
ーにて回収する。このようにしてリンカ−ＤＮＡを得る
。

以上のようにして得たポリ　（＾）”ＲＮＡ、ベクター
ブライマー、リンカ−ＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を行
う。ポリ　（＾）“ＲＮＡ　、ベクターブライマーＤＮ
Ａをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ８，３，５０
ｍＭ）、ＭｇＣＩｈ　　（たとえば８ｍＭ）、ＫＣｊ！
　（たとえば３０ｍＭ）、　ジチオスレイトール（たと
えば０．３ｍＭ）、ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰ　（たとえば各々２ｍＭ
）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７
℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。こう
して得たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮の３′末端に、ｄＴＴＰ
がｄＣＴＰに変わる以外はベクターブライマーにｄＴ６
．１１を付加した条件と同様の操作でオリゴｄＣ鎖を１
５個前後付加する。

このＤＮＡをトリス−ＨＣｊ２緩衝液（たとえばｐＨ７
，５，ｌ　ＯｍＭ）、ＭｇＣｌ２＜たとえば５ｍＭ）。

ＮａＣ１（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカ−
ＤＮＡを混合し、トリス−ＨＣＡ　緩衝液（たとえばｐ
Ｈ７，５，２０ｍＭ）、ＭｇＣβ２（たとえば４ｍＭ）
、　　（ＮＨ，）、ＳＯ４（たとえばｌ　ＱｍＭ）、Ｋ
ＣＩ　（たとえば０．１Ｍ）、　β−ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（β−Ｎ八〇へ（たとえば０．１
ｍＭ）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡリガーゼとともに一
定時間（たとえば１６時間）、一定温度（たとえば１２
℃）でインキュベートする。こうしてｃＤＮＡとリンカ
−ＤＮＡとの環状化が行われる。この反応液にｄＡＴＰ
、ｄＴＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各々、終濃度４０μＭとなるよう
加え、大腸菌ＤＮＡ’Ｊガーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼ１１大腸菌リボヌクレアーゼＨを加え、ＲＮＡ部分
をＤＮＡに変換することにより、完全な二重鎖ｃＤＮＡ
を含む組換えプラスミドを得る。

こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、たとえば
大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を、たとえばスコツ）（Ｓｃｏ
ｔｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学　２．６１６（１
９８３）　）により形質転換する。

上記で得た組換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性
遺伝子が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシ
リン耐性を示す。以下の手法はこれらアンピシリン耐性
（Ａｐ’）菌株からシロサケのＧＴＨｍＲＮＡに相補性
を示す遺伝子を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを保
有する菌株を選択するのに一般的に用いられる。すなわ
ち、上記で得られた形質転換株をニトロセルロースフィ
ルター上に固定し、既知のシロサケＧＴＨのアミノ酸配
列より予想されるＤＮＡ配列を有する合成りＮＡプロー
ブと会合させ、強く会合するものを選択する〔グルンス
テインーホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−）１ｏｇｎｅ
ｓｓ）の方法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、　［ＩＳＡ、、　７２．３
９６１（１９７５）〕。

プローブＤＮＡは通常のトリエステル法〔ジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、Ａｍ
、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）　、　９７．７３２７（
１９７５））で合成される。合成りＮＡプローブによる
選択はサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）らの方法〔ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ（ＪｏＭｏｌ
、　Ｂｉｏｌ、）９８、５０３　（１９７５））によっ
てさらに確実にでき、この方法でシロサケＧＴＨｍＲＮ
Ａに相補性を示す遺伝子を有する組換え体プラスミドＤ
ＮＡを同定できる。

本発明の新規組換え体プラスミドは大腸菌のような微生
物、あるいは真核細胞によるシロサケＧＴＨポリペプチ
ドの大量生産に用いられる。

たとえば前記のごとく得られた式１、式２または式３で
示されるｃＤＮＡ　（ｓＧＴＨ−Ｉα鎖、β鎖、５ＧＴ
Ｈ−Ｉ［β鎖ｃＤＮＡ）を組み込んだ細胞を培養するこ
とにより完全な型の５ＧＴＨを生産させることができる
。Ｋａｅｔｚｅｌ　　らの方法［：Ｄ、　Ｍ。

Ｋａｅｔｚｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　プロシイ−ディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳ
Ａ、８２　．７２８０−７２８３（１９８５）　：］が
利用できる。この方法はランα鎮遺伝子をＳＶ４０後期
プロモーターの下流に連結したプラスミドと、ウシＬＨ
β鎮遺伝子を５Ｖ４Ｑ初期プロモーター下流に連結した
プラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞株に導入
し、α、β鎖が会合し、生物学的活性を有するウシＬＨ
ポリペプチドを発現させている。同様の発現系において
ｓ　ＧＴＨ−ｒ、ｎを発現させることが可能である。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１．　シロサケ脳下垂体よりのポリＡ”ＲＮＡの
調製： シロサケ脳下垂体よりチオシアン酸グアニジン−塩化リ
チウム法〔カサラ（Ｃａｔｈａｌａ）ら、ディーエヌエ
イ　（ＤＮＡ）　、　２　、３２９（１９８３）　）に
従いポリ（Ａ）を有するＲＮＡを下記のごとく調製した
。

シロサケの凍結脳下垂体１ｇ（約２０個体分）を５Ｍチ
オシアン酸グアニジン、ｌ　Ｑｄ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ
）Ｕス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７）および８％（Ｖ／Ｖ）β
−メルカプトエタノールからなる溶液ＩＱｍｌ中でテフ
ロンホモゲナイザ−（５ｒｐｍ）にて破砕し可化した。

この可溶化物を遠心管に移し、４ＭＬｉＣｊ！溶液７　
Ｑｍｌを加えて撹拌した後、４℃、２０時間静置した。

旧ｔａｃｈｉ　ＲＰＲ１０ローターにて肌０００ｒｐｍ
、　９０分間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。Ｒ
ＮＡの沈殿を４Ｍ尿素および２Ｍ塩化リチウムからなる
溶液１００ｍ１に懸濁し、Ｈｉｔａｃｈｉ　　ＲＰ　Ｒ
１００−ターにて肌０００　ｒｐｍ　、　６０分間遠心
後、再びＲＮＡを沈殿として回収した。

ＲＮＡの沈殿を０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ）すｘ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ
７，５）からなる溶液２０ｆｆｌｌに溶解し、フェノー
ル−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収
した。得られたＲＮＡ約１．７ｍｇを１０ｍＭ）リス−
Ｈ（１（ｐＨ８，０）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからな
る溶液１ｍｌに溶かした。６５℃、５分間インキュベー
トし、０、ｌ　ｍ、Ｉの５Ｍ　　ＮａＣｊ！を加えた。

混合物をオリゴ（ｄ　Ｔ）セルロース・カラム〔ピー・
エル・バイオケミカル（Ｐ−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ）社製〕クロマトグラフィー（カラム体積０．５１
１１１）にかけた。吸着したポ！Ｊ　　（Ａ）を有する
ｍＲＮＡを１０ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液で溶出し
、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約８３ｇを得た。

実施例２．　ＣＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿
入： オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）の方法
〔モレキユラー・アンド・セルラー・バイオロジイ　（
Ｍａｔ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、　２．１６Ｎ１９ｇ
２）　）に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組み込んだ組
換え体プラスミドの造成を行った。

実施例１で調製したポｌｊ　（Ａ）ＲＮＡ約４■、ベク
ターブライマー約１，４■を５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　
（ｐＨ８，３）　、８ｍＭ　　ＭｇＣ１ｘ　、３０ｍＭ
ＫＣｊ！、　０．３ｍＭ　　ＤＴＴ、　２ｍＭ　　ｄＮ
ＴＰ（ｄＡＴＰ　。

ｄＴＴＰＳｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）からなる溶液２０
薦に溶解し、２５単位の逆転写酵素（生化学工業社製）
を加え、３７℃、４０分間インキュベートし、ｍＲＮＡ
に相捕的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェノール
−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡ−
ＤＮＡ二重鎮の付加したベクタープライマーＤＮＡを回
収した。

該ＤＮＡを６６μＭ　　ｄＣＴＰおよび０．２ｇポリ（
Ａ）を含むＴｄＴ緩衝液１５ｍに溶かし、１８単位のＴ
ｄＴ　（Ｐ−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を
加えて３７℃、３分間インキュベートし、ｃＤＮＡ３′
末端に１５個の（ｄＣ）　鎖を付加した。該反応物をフ
ェノール−クロロホルム抽出シ、エタノール沈殿により
（ｄＣ）　鎖の付加したｃＤＮＡ−ベクタープライマー
ＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
　（ｐＨ７，５）　、６ｍＭ　　ＭｇＣ（１２および６
０ｍＭ　　ＮａＣ１からなる液２０ｍに溶かし、１０単
位のＨｉｎｄｌＪを加え、３７℃、３時間インキュベー
トし、ＨｉｎｄＩＩＩ部位で切断した。

該反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール
沈殿してＱ、　５　ｐｍｏｌｅの（ｄＣ）鎮付加ｃＤＮ
Ａ−ベクタープライマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ０．０
８　ｐｍｏｌｅおよび前記のリンカ−ＤＮＡ　　０．１
６ｐｍｏｌｅを１０ｍＭ）リス−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，
５）、０．１Ｍ　　ＮａＣＲおよび１ｍＭ　　ＥＤＴΔ
からなる溶液４０度に溶かし、６５℃、４２℃、０℃で
それぞれ１０分、２５分、３０分間インキュベートした
。２０ｍＭ）リス−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，５）　、４
ｍＭＭ　ｇ　Ｃｆ１２、Ｉ　ＱｍＭ　　（ＮＨ４）２Ｓ
○４．０．１ＭＫ（ｌおよび０．１ｍＭ　　β−ＮＡＤ
にり組成で、全量４００ｍとなるよう反応液を調製した
。該反応液に１０単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ
　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）を加え、１１℃
−夜インキニベートした。該反応液を各４０μＭのｄＮ
ＴＰ、０．１５ｍＭ　　β−ＮＡＤとなるよう成分を追
加調製し、５単位の大腸菌ＤＮＡ！Ｊガーゼ、７単位の
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｐ　−Ｌ　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）および２単位の大腸菌リボヌ
クレアーゼＨ（Ｐ　−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
社製）を加え、１２℃、２５℃で順次１時間ずつインキ
ュベートした。

上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡの環状化と
、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎮のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換さ
れ、完全な二重鎖ＤＮＡの組換えプラスミドが生成した
。

なお参考例に具体的なベクターブライマーおよび、リン
カ−ＤＮＡの調製例を示した。

実施例３．　シロサケＧＴＨｃＤＮＡを含む組換えＤＮ
Ａの選択 実施例２で得た組換えプラスミドを用し）、大腸菌Ｃ６
００３Ｆ８株〔カメロン（Ｇａｍｅｒｏｎ）　：　プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　
Ｓｃｉ、）口ＳＡ、　７２　、３４１６　（１９７５）
　〕を３ｃｏｔｔ　らの方法〔重定勝哉：細胞工学、　
２　　、６１６（１９８３）〕に従い形質転換して得ら
れた約１０００個のコロニーをニトロセルロース上に固
定した。

シロサケＧＴＨ−１のα鎖についてはそのＮ末端から５
番目〜Ｈ番目のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡすな
わち、 （３番目の塩基はＡまたはＧ。

６番目の塩基はＴまたはＣ１ ９番目の塩基はＡ、Ｇ、Ｃ，Ｔのいずれか。

１２番目の塩基はＡまたはＧであり、 組あわせて３２通りのＤＮＡ混合物となる。ンを３２ｐ
で標識したプローブに４０℃で強く会合した４菌株を選
んだ〔グルンステイン・ホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
−Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方法、プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｚンス（Ｐｒ
ｃｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＩＩＳＡ、　　
７２　、３９６１（１９７５）　）。得られた４菌殊に
ついてはサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の方法〔ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍａ
ｔ、　Ｂｉｏｔ、　）因、５０３（１９７５）　）でも
上記プローブとの会合が確認された。

得られたプラスミドはｐｓＧＴＨＩ　αｌ−１、ｐｓＧ
ＴＨＩ　Ｃ２−１、Ｉ）ＳＧＴＨＩα３−１　、ｐｓＧ
Ｔ）ｌ　Ｉα６−１　と命名したが、いずれもシロサケ
ＧＴＨ−１のα鎖のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ
配列を有することがらＧＴＨ−１ａ鎖ｃＤＮＡを含んで
いるものと考えられた。

シロサケＧＴＨ−１のβ鎖については、そのＮ末端から
６番目〜２０番目のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡ
すなわち、 ５’−ＴＡＣＧＧＧＡＡＴＡＧＧＣＴＧＡＡＴＡＡＴＡ
ＣＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡＴ−３
’（それぞれのアミノ酸に対応する塩基をシロサケの遺
伝子中に頻繁に現れるコドンから予想したＤＮＡ配列を
有する単一プローブ）を用いＧＴＨ−１α鎮と全く同じ
方法により５５℃で強く会合した２株を選んだ。得られ
た２菌株についてはサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の方
法によっても同様にプローブとの会合が確認された。得
られたプラスミドはｐｓＧＴ）Ｉ　ＩＦ４−３　、ｐｓ
ＧＴＨＩＦ５−２と命名したが、いずれもシロザＧＴＨ
−１βｇＪｃＤＮＡを含んでいることは明らかである。

シロサケＧＴＨ−２のβ鎖についてはそのＮ末端から５
０番目〜５５番目のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡ
すなわち、 （３番目の塩基はＴまたはＣ１ ６番目の塩基はＡまたはＧ１ ９番目の塩基はＴまたはＣ１ １２番目の塩基はＡ、Ｇ５Ｃ５Ｔのいずれか、１５番目
の塩基はＴまたはＣであり、 組み合わせで６４通りの混合物となる。）を用い、ＧＴ
Ｈ−１α鎮、ＧＴＨ−１β鎮の場合と同じ方法により３
８℃で強く会合した３株を選んだ。得られた３株につい
てはサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の方法によっても同
様にプローブとの会合が確認された。得られたプラスミ
ドは、ｐｓＧＴＨＩＩβ３−１、ｐｓＧＴＨＩ［β４−
２　、ｐｓＧＴＨＩＩβ６−１　と命名したが、いずれ
もシロサケＧＴＨ−２β鎮ｃＤＮを含むことは明らかで
ある。

プラスミドｐｓＧＴＨＩαｌ−１、ｐｓＧＴ）Ｉ　ｎβ
６−２およびｐｓＧＴＨＩｎβ６−１を含む微生物はそ
れぞれＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　ＢＳＧ
Ｔｔｌ　Ｉ　αｌ１−１（ＦＢＲ０Ｐ−１３８９）、同
ＢＳＧＴＨｎβ６６−２（ＦＥＲＢＰ−１３９０）およ
び同ＥＳＱＴＩＩ　ｎβ６−１　（Ｆ日ＲＭ　０Ｐ−１
３８８）として工業技術院微生物工業技術研究所に昭和
６２年６月５日付で寄託しである。

実施例４．　プラスミドｐｓＧＴＨＩαｌ−Ｉ　５ｐｓ
ＧＴＨ１β６−２　、ｐｓＧＴＨＩβ６−１　に含まれ
るＧＴＨｃＤＮＡの塩基配列： 上記で得られたＧＴＨ−１α鎮、ＧＴＨ−１β鎖、ＧＴ
ＨＩ［β鎮のｃＤＮＡを含むプラスミドのうち、そのｃ
ＤＮＡ部分がそれぞれ最長のもの（ｐｓＧＴＨＩα１−
１　（ＧＴＨ−１α鎮）、ｐｓＧＴＨＩβ６−２（ＧＴ
）Ｉ−１β１ｉＩ）　、ｐｓＧＴＨＩｎβ６−１　（Ｇ
ＴＩＩ−２β鎮）〕について、種々の制限酵素で切断し
、ｃＤＮＡの切断地図を決定した。これらプラスミドの
制限酵素地図を第１図に示す。

次に上記３種のプラスミドについて、そのｃＤＮＡ部分
の全ヌクレオチド配列をＭ１３ファージを用いたサンガ
ー（Ｓａｎｇｅｒ）法〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら：
プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、［ＩＳ＾、　７４
　．５４６３（１９７７）：　アマ−ジャム（＾ｍｅｒ
ｓｈａｍ）社Ｍ１３　　クローニング・アンド・シーフ
ェンシング・ハンドブック（ｃｌｏｎｉｎｇａｎｃｌ　
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｈａｎｄｂｏｏｋ）　）に従っ
て決定した。

式１にｐｓＧＴｌ（Ｉα１−１０ＧＴＩ（−１α鎖、式
２にｐｓＧＴ）Ｉ　ｎβ６−２のＧＴ）ｌ−１β鎮、式
３にｐｓＧＴＨＩ［β６−１のＧＴＨ−２β鎖のそれぞ
れ塩基配列とそれから予想されるアミノ酸配列を示す。

式１中括弧内〔−２２〜−１〕はシグナル配列を、１〜
９２は成熟型ＧＴＨ−１α鎮を示す。式２中、括弧内〔
−２４〜−１〕はシグナル配列を、１〜１１３は成熟型
ＧＴＨ−１β鎮を示す。式３中、括弧内〔−２３〜−１
〕はシグナル配列を、１〜１１９は成熟型ＧＴＨ−２β
を示す。

式　　　１ 式　　　２ ＡＳｐＡｒｇｌ　１ｅ、）ｅｒＭｅｔＡＩａＩｎｒＰｒ
ｏｂｅｒＵｙｓｌ　１ｅＶａＩＡＳｎＰｒＯＬｅｕ［ｉ
ＩｕＭｅｔ式　　　３ ％式％ 式１１式２および式３に記載のＤＮＡがコードするペプ
チドと５ＧＴＨの関係については以下のことが明らかに
なった。

川内らの方法（特開昭６０−６７５００＞にて調製した
５ＧＴＨ−Ｉ、５ＧＴＨ−ｎポリペプチドより、５ＧＴ
Ｈ−１ｃｒｔＪｌ、５ＧＴＨ−Ｉβ鎖、５ＧＴＨ−■β
鎖のアミノ酸配列を決定した。５ＧＴＨ−ＩｃＸｔＮに
ついてはＮ末より２４アミノ酸、５ＧＴＨ−１β鎮につ
いてはＮ末より２０アミノ酸、５ＧＴＨ−Ｉｌｅ鎮につ
いては１１９アミノ酸全配列を決定した。この結果と５
ＧＴＨｃＤＮＡより推定されるアミノ酸配列を比較した
のが式４〜６である。咳式にはポリペプチド鎖より決定
したアミノ酸配列を示し、ｃＤＮＡより推定されるアミ
ノ酸が異なる場合のみ該アミノ酸の下に（）で示した。

５ＧＴＨ７１α鎮（式４）についてはＮ末２４アミノ酸
中、２０位のＡｓｎがｃ　ＤＮＡではＴｈｒ、２４位の
ＬｙｓがＡｓｎであった。

５ＧＴＨ−Ｉβ鎮（式５）ではＮ末２０アミノ酸中８位
のＡｓｎがＣｙｓ、１９位のＧｌｎがＧｌｕ。

２０位のＡｓｎがＡｓｐであり、また１２位のＡｓｎ、
１３位のＴｈｒの間にＭｅｔの挿入がみられた。５ＧＴ
Ｈ−Ｕβ鎮（式６）についてはポリペプチド鎖として複
数の分子種が存在するらしく、５０位がＴｙｒまたはＩ
ｌｅ、６３位がＴｈｒまたはＬｙｓというアミノ酸配列
が得られたが、ｃＤＮＡではそれぞれＴＶｒ、Ｔｈｒと
いう結果が得られ、全１１９アミノ酸中ポリペプチド鎮
とｃＤＮＡで完全に一致した。

以上のように本発明のｃＤＮＡはＳ　Ｇ　Ｔ　Ｈとして
の生物学的活性が確認されている５ＧＴＨポリペプチド
鎮と前記指摘した部分以外は完全に一致することが示さ
れた。よって該ｃＤＮＡは生物学的活性を有する５ＧＴ
Ｈポリペプチドをコードしていることが明白である。

式　　　　４ （ｓＧＴＨ−Ｉα鎮） （ｓＧＴＨ−Ｉβ鎮）　　　　　式　　　　５％式％） 参考例　ｃＤＮＡクローン化（ロｋａｙａｍａ−Ｂｅｒ
ｇ法）に用いるベクタープライマーおよび リンカ−ＤＮＡの調製： ｐｃＤＶｌ（ｏｋａｙａｍａ　　＆　　Ｂｅｒｇ　　：
　　Ｊ、　　Ｍｏｌ、　　Ｃｅ１ｌ。

Ｒｉａｌ、、　３　、２８０（１９８３））　４００■
を１０＋ｎＭ　　）リス−ＨＣｆ１　（ｐＨ７，５）　
、６ｍＭ　　ＭｇＣｊ！２および１０ｍＭ　　ＮａＣ１
からなる溶液３０ｈｌｌに加え、さらに５００単位のＫ
ｐｎｌ（宝酒造社製）を加えて、３７℃、６時間反応さ
せ、プラスミド中のＫｐｎ　１部位で切断した。フェノ
ール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿によりＤＮ
Ａを回収した。Ｋｐｎ　Ｉ切断した該ＤＮＡ約２０ｈｇ
を４０ｍ賛カコジル酸ナトリウム、３０ｄ）リス−ＨＣ
１（ｐＨ６，８）　、１ｍＭＣａＣ１，および０．１ｍ
Ｍジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）からな
る緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴＰを
０．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００戚に加え、さ
らに８１単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記する＞　　（Ｐ−Ｌ
　Ｂｉｏｃｈｅ−引ｃａｌｓ社製）を加えて、３７℃、
１１分間反応させた。

ここで、ｐｃＤＶｌのＫｐｎ　Ｉ切断部位の３′末端に
ポ１ＪｄＴ娘が約６７個付加された。該溶液からフェノ
ール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿にヨリ、ｌｄ
Ｔ＆Ｊｆｉ１７）付加したｐＣＤＶＩＤＮＡ約１００肩
を回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭ　）リス−ＨＣｊ！　
（ｐＨ７，５）　、６ｍＭ　　ＭｇＣＩｈ、１００ｍＭ
ＮａＣｊ！からなる緩衝液１５０４に加え、さらに３６
０単位のＥｃｏＲＩ　　（宝酒造社製）を加え、３７℃
、２時間反応させた。該反応物を低融点アガロースゲル
電気泳動後、約３．ｌＫｂのＤＮＡ断片を回収し、約６
０ｇのポリｄＴ鎮付加ｐｃＤＶ１を得た。

該ＤＮＡを１０ｍＭ　）リス−ＨＣＪ！　（ｐ、Ｈ８，
０＞および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液５００誠に
溶解し、６５℃、５分間インキュベート後、氷冷して５
０４の５Ｍ　　ＮａＣβを加えた。混合物をオリゴｄ＾
セルロースカラム（コラボラティブリサーチ社製）クロ
マトグラフィーにかけた。ポリｄＴ鎖長が充分なものは
カラムに吸着し、これを１０ｍＭ）リス−Ｈｃｐ　（ｐ
Ｈ８，０）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液で溶
出し、ポ’ＪｄＴ１ｍの付加したｐｃＤＶｌ（以下ベク
ターブライマーと略記する）２７肩を得た。

次にリンカ−ＤＮＡの調製を行う。

ｐ　Ｌ　１　（Ｏｋａｙａｍａ　＆　Ｂｅｒｇ　：　Ｊ
、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、　Ｒｉａｌ、。

３　、２８０（１９８３）　］約１４ｇを１０ｍＭ　）
リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、６ｍＭ　　ＭｇＣ１ｇ
および５ＱｍＭＮａＣ１からなる緩衝液２００誠に加え
、さらに５０単位のＰｓｔＩ（宝酒造社製）を加え、３
７℃、４時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中のＰｓｔＩＩＳ
位で切断させた。該反応物をフェノール−クロロホルム
抽出後、エタノール沈殿を行い、Ｐｓｔｌで切断したｐ
ＬＩＤＮＡ約１３■を回収した。該ＤＮＡ約１３■をＴ
ｄＴ＠衝液に終濃度０．２５ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液
５０ｍに加え、さらにＴｄＴ　（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ社製）５４単位を加えて３７℃、１３分間イ
ンキニベートし、ｐＬｌのＰｓｔｌ切断部位３′末端に
ｄＧ鎮を約１４個付加した。フェノール−クロロホルム
抽出後エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。該ＤＮＡ
を１００Ｊｔｔ！の１１０１ＴＩトリス−Ｈ（１（ｐＨ
７，５）　、６ｍＭ　　ＭｇＣｊ！ａおよび６０ｍＭ　
　Ｎａ（ｌからなる緩衝液１００４に加え、さらに８０
単位のＨｉｎｄＩＩ［（宝酒造社製）を加えて３７℃、
３時間インキュベートし、ｐＬＩＤＮＡのＨｉｎｄｌｌ
［部位で切断した。該反応物をアガローズゲル電気泳劾
にて分画し、約０．５ＫｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥペー
パー法（Ｄｒｅｔｚｅｎ　ら、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、旦２　．２９５（１９８１）　）に
て回収し、オリゴｄＧ！Ｊ付きのリンカ−ＤＮＡ　（以
下単にリンカ−ＤＮＡと略記する）を得た。

発明の効果 本発明によれば、シロサケＧＴＨ−１α、１β、２βポ
リペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体Ｄ
ＮＡ、組換え体ＤＮＡを含む微生物および真核細胞が得
られ、これらは１α、１βまたは１α、２βよりなる２
本鎮ＧＴＨポリペプチドの大量生産に利用することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｓＧＴＨＩ　αｌ−１、ｐｓＧＴＨＩβ６−
２、ｐｓＧＴＨＩＩβ６−１に含まれるそれぞれＧＴＨ
−１α、ＧＴＨ，１β、ＧＴＨ−２βをコードするｃＤ
ＮＡの制限酵素地図を示す。 図中、実線は非翻訳領域、斜線部分はシグナルペプチド
翻訳領域、白枠内は成熟型ＧＴＨサブユニット翻訳領域
を示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）式１、式２および式３に示したペプチド配列から
   なる群から選ばれるペプチド配列を有する魚類の生殖腺
   刺激ホルモンポリペプチド。
2. （２）魚類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチドをコード
   するＤＮＡ。
3. （３）魚類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチドが式１に
   示したペプチド配列を有する特許請求の範囲第２項のＤ
   ＮＡ。
4. （４）魚類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチドをコード
   するＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ。
5. （５）魚類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチドが式１、
   式２および式３に示したペプチド配列からなる群から選
   ばれるペプチド配列を有することを特徴とする特許請求
   の範囲第４項の組換え体ＤＮＡ。
6. （６）プラスミドｐｓＧＴＨ　 I 　α１−１、ｐｓＧ
   ＴＨ　 I 　β６−２、ｐｓＧＴＨ　II　β６−１で特
   定される特許請求の範囲第第４項の組換え体ＤＮＡ。
7. （７）魚類の生殖腺刺激ホルモンペプチドをコードする
   ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物。
8. （８）魚類の生殖線刺激ホルモンポリペプチドが式１、
   式２および式３に示したペプチド配列からなる群から選
   ばれたペプチド配列を有することを特徴とする特許請求
   の範囲第７項の微生物。
9. （９）該微生物がエッシェリヒア・コリに属する特許請
   求の範囲第７項の微生物。
10. （１０）魚類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチドをコー
    ドするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物
    または真核細胞を栄養培地に培養し、該培養物中に魚類
    の生殖腺刺激ホルモンポリペプチドを蓄積せしめ、該培
    養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする魚
    類の生殖腺刺激ホルモンポリペプチドの製造法。