JPS62122590A - 組替えＤＮＡ分子、これにより形質転換された宿主、およびＩＦＮ−α型ポリペプチドをコ−ドするＤＮＡ配列 - Google Patents
組替えＤＮＡ分子、これにより形質転換された宿主、およびＩＦＮ−α型ポリペプチドをコ−ドするＤＮＡ配列Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
（発明の要約）
組替えＤＮＡ分子、それらにより形質転換されかつひと
インターフェロンの生物学的もしくは免疫学的活性を示
すポリペプチドを生産する宿主およびこれらポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列につき開示する。ＤＮＡ配列
は、ひとインターフェロンの生物学的もしくは免疫学的
活性を示すポリペプチドをコードすることを特徴とする
。適当な宿主において、これらのＤＮＡ配列および組替
えＤＮＡ分子は、ひとインターフェロンの生物学的もし
くは免疫学的活性を示す遺伝子およびポリペプチドの生
産および同定を可能にすると共に、抗ウィルスおよび抗
腫瘍もしくは抗癌剤におけるその使用を可能にする。 ・本発明は、ＤＮＡ配列、組替えＤＮＡ分子ならびにイ
ンターフェロンおよびインターフェロン様ポリペプチド
を産生ずるよう形質転換された宿主に関するものである
。本明細書中に開示する組替えＤＮＡ分子は、ひと白血
球インターフェロンの免疫学的もしくは生物学的活性を
有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を特徴とす
る。以下の記載から明らかになるように、本発明のＤＮ
Ａ配列、組替えＤＮＡ分子およびその製造方法は、抗ウ
ィルス剤および抗ｌｌｆｆ１瘍もしくは抗癌剤ならびに
その製造方法に有用なポリペプチドを製造するのに使用
することができる。 本出願においては、ネイチャー誌第２８６巻、第２４２
１頁（１９８０年７月ｌＯ日）に発表されたインターフ
ェロンという名称を使用する。 この名称により、本出願の優先権となる原出願において
使用された名称を置き換える。たとえば、ＩＰはここで
はＩＦＮで表わされ、白血球インターフェロンはここで
はＩＦＮ−αで表わされる、 インターフェロン（“ＩＦＮ″）は２種類存在すること
が知られている。ｆｕｌｌのインターフェロンは小さい
酸安定性の（グリコ）−一蛋白質であって、細胞をウィ
ルス感染耐性にするものである〔ニー・イサークスおよ
びジェー・リンデンマン「ウィルス干渉１．インターフ
ェロン」、プロシーディング・ロイヤル・ソサイエティ
・シリーズＢ、第１４７巻、第２５８〜２６７頁（１９
５７）およびダブりニー・イー・スチュアート・「、
［ザ・インターフェロン・システム」、スブリンガー
出版（１９７９）（以下、「ザ・インターフェロン・シ
ステム」と云う）〕。ＩＦＮは、成る程度、細胞特異性
である（ザ・インターフェロン・システム第１３５〜１
４５頁）が、ウィルス特異性でない。 寧ろ、ＩＦＮは広範囲のウィルスに対して細胞を保護す
る。 ひとインターフェロン（“ＨｕＩＦＮ’″）は３つの群
α、βおよびγに分類されている。 ＨｕｒＦＮ−αすなわち白血球インターフェロンはひと
白血球中において、リンパ芽球細胞中の少量のＨｕＩＦ
Ｎ−β（繊維芽細胞インターフェロン）と共に生産され
る。ＨｕｌＦＮ−αは均質になるまで精製されかつ特性
化されている〔たとえば、エム・ルーベンスタイン等、
「ひと白血球インターフェロン：生産、均質までの精製
および初期特性化」、プロシーディング・ナショナル・
アカデミ−・サイエンスＵＳＡ。 第７６巻、第６４０〜６４４頁（１９７９）〕、これは
、恐らく炭水化物成分のため、寸法に関しては不均質で
ある。２種の成分が記載されており、その一方は２１．
０００〜２２，０００の分子量を有し、他方はｉｓ、ｏ
ｏｏ〜１Ｂ、０００の分子量を有する。 低分子量の方の成分は非グリコジル化型を示すことが報
告されている。また、より小さいＨｕＩＦＮ−αの型が
Ｈｕ Ｉ ＦＮ−α活性の大部分または全てを保持する
ことも報告されている〔ダブリニー・イー・スチェアー
ト・■等、「ひと白血球インターフェロンの生産および
性質に対するグリコジル化抑制剤の効果」、ピロロジー
、第９７巻、第４７３〜４７６頁（１９７９） 〕、リ
ンパ芽球細胞からの）（ｕ ｒ ＦＮ−αのアミノ酸配
列の一部およびそのアミノ酸組成も報告されている〔ケ
ー・シー・ズーン等、「ひとりシバ芽球細胞インターフ
ェロンの主成分のアミノ末端配列」、サイエンス、第２
０７巻、第５２７〜５２８頁（１９８０）ならびにエム
・バンカピラーおよびエル・フード、私的通信（１９８
０） 〕、さらに、）（ｕｌＦＮ−αは幾つかの異なる
型として存在することも報告されている（たとえば、英
国特許出願第２，０３７，２９６ Ａ号〕、これらの型
は、構造的におよび生理学的に互いに異なっていると思
われる。Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αのこれら型に関し、まだ認
められた名称は採用されていない。したがって、本出願
においては、各型を、−ｉ的なＨｕ Ｉ ＦＮ−αの名
称の後に数字を付して、すなわちＨｕｒＦＮ−αｌまた
はＨｕ ｒ ＦＮ−α３のように記載する。 ）（ｕ Ｉ ＦＮ−αは、多（のひと蛋白質と同様に、
多形質である。したがって、特定個人の細胞はより一般
的なｌ（ｕ Ｉ ＦＮ−α群内におけるＨｕｒＦＮ−α
種を生成することができ、或いはその群内において生理
学的には同じであるがその群とはもしくはその一部であ
る形態とは構造上僅かに異なる形態を生成することがで
きる。 したがって、１（ｕｌＦＮ−αの蛋白質構造は一般的に
は良く規定されているが、特定個人はそれと僅かに異な
るＨｕ Ｔ ＦＮ−αを生成することができ、この対立
形質的変化は恐ら（Ｈｕ ｒ ＦＮ−αの種々の形態間
における相違はど大きいものでない。 ＨｕＩＦＮは、通常、正常もしくは健全な細胞には検出
されない（ザ・インターフェロン・システム、第５５〜
５７頁〕、寧ろ、細胞をＩＦＮ誘発誘発−す結果、蛋白
質が生成される。ＩＦＮ誘発誘発一般にウィルスである
が、性質上非ウィルス性のもの、たとえば天然もしくは
合成の二重鎖ＲＮＡ、Ｉｌｌｌｌ機内微生物生物生成物
および各種の化学薬剤とすることもできる。ひと細胞を
ウィルス感染耐性にすべく、これら非ウィルス性誘発体
を利用する多くの試みがなされている〔ニス・バロンお
よびエフ・ジアンザニ編、テキサス・レポート・オン・
バイオロジー・アンド・メディスン、第３５号（「テキ
サスレポート」）、第５２８〜５４０頁（１９７７））
これらの試みは大して成功を収めていない。寧ろ、現在
では外来性ＨｕｌＦＮの使用が好まれている。 ウィルスおよび腫瘍もしくは癌に対するインターフェロ
ン治療が、種々異なる投与量にてかつ幾つかの投与様式
にて行なわれている〔ザ・インターフェロン・システム
、第３０７〜３１９〕。たとえば、インターフェロンは
、経口的に或いは接種（静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮肉
および皮下）により、或いは点眼薬、軟膏および噴霧剤
の形態で効果的に投与されている。通常１０４〜１０７
単位の投与量で毎日１〜３回投与される。治療程度は、
患者および処置すべき状態に依存する。たとえば、ウィ
ルス感染は通常数日間乃至２週間にわたり毎日もしくは
１０２回投与することにより処置され、腫瘍および癌は
通常数ケ月乃至数年間にわたり毎日または１日多数回投
与することにより処置される。 勿論、成る患者に対し最も有効な治療は、投与。様式お
よび投与量を選択するにあたり、たとえば病気、従前の
治療およびインターフェロンに対する患者の反応など周
知の因子を考慮する担当医師により決定されねばならな
い。 抗ウィルス剤として、ＨｕＩＦＮは次の病気を処置する
ために使用されている：呼吸器感染症（テキサスレポー
ト、第４８６〜４９６頁）、単純庖疹性角膜炎（テキサ
スレポート、第４９７〜５００頁）、急性出血性結膜炎
（テキサスレポート、第５０１〜５１０頁）、水痘性帯
状庖疹（テキサスレポート、第５１１〜５１５頁）、巨
大ウィルス感染症（テキサスレポート、第５２３〜５２
７頁）、およびＢ型肝炎（テキサスレポート、第５１６
〜５２２頁〕、ザ・インターフェロン・システム、第３
０７〜３１９頁も参照できる。しかしながら、抗ウィル
ス剤としてのｒＦＮの大規模な使用は、従来入手し得る
よりも多量のＩＦＮを必要とする。 ＨｕＩＦＮは、その抗ウィルス作用に加えて、池の効果
をも有する。たとえば、これはコロニー刺戟因子の効果
に措抗し、造血性コロニー形成細胞の成長を抑制し、か
つまた顆粒球および大食法先駆体の正常分化を阻害する
（テキサスレポート、第３４３〜３４９頁〕、さらに、
これはＤＭＳＯ処理されたフレンド白血病細胞における
赤血球分化を抑制する（テキサスレポート、第４２０〜
４２８頁〕、また、ＨｕｌＦＮは、免疫反応の調整に役
割を演する。抗原に対する施用の量と時間とに応じて、
ＨｕｌＦＮ−αは生体内および試験管内において免疫促
進的にも或いは免疫抑制的にもなりうる（テキサスレポ
ート、第３５７〜３６９頁〕、さらに、特異的に感応さ
れたリンパ芽細胞は、抗原に接触すると、Ｈｕ Ｉ Ｆ
Ｎ−αを生成することが観察された。したがって、この
種の抗原誘発されたＨｕＩＦＮ−αは免疫反応の調節体
となり、循環抗原レベルと細胞免疫性の発現との両者に
作用することができる（テキサスレポート、第３７０〜
３７４頁〕、さらに、Ｈｕ Ｉ ＦＮはキラーリンパ球
の活性および抗体依存性の細胞媒介される細胞毒性を高
めることも知られている〔 アール・アール・ハーバ−
マン等、「ひと天然および抗体依存性細胞媒介細胞毒性
のインターフェロンによる促進」、ネイチャー誌、第２
７７巻、第２２１〜２２３頁（１９７９）；ピー・ビバ
リーおよびディー・ナイト、「死亡は自然に起こる」、
ネイチャー誌、第２７８巻、第１１９〜１２０頁（１９
７９）；テキサスレポート、第３７０〜３７４頁〕。こ
れらの両種類は恐らく、腫瘍細胞に対する免疫学的攻撃
に含まれる。 したがって、ひと抗ウィルス剤としての使用に加え、Ｈ
ｕＩＦＮ！：ｌ！抗腫瘍および抗癌治療において有力な
用途を有する（ザ・インターフェロン・システム、第３
１９〜３２１頁〕、’ＥＪＡ在、ＩＦＮは多くの動物に
おける多くの種類のｌ１ｆｆｉ瘍 ゛の成長に影響を
与えることが知られている（ザ・インターフェロン・シ
ステム、１２９２〜３０４頁〕、それらは、他の抗腫瘍
剤と同様、小腫瘍に対して使用された場合、特に効果的
であると思われる。動物ＩＦＮの抗腫瘍効果は投与量と
時間とに左右されるが、これは毒性レベル以下の濃度で
示されたものである。したがって、ＩＦＮの抗腫瘍およ
び抗癌性につき多くの研究および臨床試験が過去に行な
われ、現在も行なわれ続けている。これらには、たとえ
ば骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫およびホジ
キンス病のような幾つかの悪性疾患の処置が包含される
（テキサスレポート、第４２９〜４３５頁〕、さらに、
ＨｕＩＦＮは、黒腫症および胸部癌に侵された患者にお
ける皮下腫瘍結節に注射すると、局部腫瘍退化をもたら
すことが最近示された〔ティー・ネモト等、「黒腫症お
よび胸部癌のひとインターフェロンおよび内部治療」、
アメリカン・アソシエーション・フォー・カンサー・リ
サーチ、アブストラクト、第９９４号、第２４６頁（１
９７９）〕、これら臨床試験の結果は好ましいものであ
ったが、ＩＦＨの抗腫瘍および抗癌用途は、精製ＩＦＮ
の充分な供給が得られないため、著しく妨げられている
。 今日、Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αは、組織培養で増殖させたひ
と細胞を介して、或いは供血者から集めたひと白血球を
介して生産される。２．６Ｘ１０’ＩＵの粗製ＨｕＩＦ
Ｎ−ｔｘが８００βの培養ナマルバ（ｌＪａＢａｌｖａ
）細胞から得られることが報告されている（ピー・ジ
ェー・ブリッジエン等、上記〕、極めて大きな血液セン
ター、たとえばフィンランド国ヘルシンキ在のフィンラ
ンド赤十字センターでは、その生産能力は年間的１０１
１ＩＵの粗製ＨｕｌＦＮ−αである。投与量は典型的に
は１患者当り毎日３Ｘ１０’ ＩＵであるから、これ
ら供給源はＨｕ Ｔ ＦＮ−αの必要市販量をまかなう
には不充分である。したがって、他の方法によるＨｕＩ
ＦＮ−αの生産が望まれる。ＩＦＮ−αの比活性は高く
、４．０Ｘ１０”〜１０’ＴＵ／ｗの程度であるため、
一般用途に必要とされる１（ｕＩＦＮ−αの量は少なく
なる。たとえば、１００ｇの純ＨｕｌＦＮ−ｏｒは３〜
３０Ｘ１００万回の投与量をまかなうであろう。 分子生物学における最近の進歩により、特異性の非細菌
性成熟核蛋白質をコード化するＤＮＡを細菌細胞中に導
入することが可能となった。 一般に、化学合成により製造されたちの以外のＤＮＡに
よれば、この種の組替えＤＮＡ分子の製造は、所望蛋白
質に対する精製メツセンジャーＲＮＡ （、ｍＲＮＡ）
雛型の単一鎖ＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を生成させ、こ
のｃＤＮＡを二重ｌＤＮＡに変え、このＤＮＡを適当な
りローン化ベヒクルにおける適当な部位に結合させて組
替えＤＮＡ分子を形成させかつこの組替えＤＮＡ分子に
より適当な宿主を形質転換させるという過程からなって
いる。このような形質転換は、宿主が所望蛋白質を生産
するのを可能にする。 数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、大腸菌（イー・
コリ）において組替えＤＮＡ技術を用いて得られている
。これらには、ラッテプロインシュリン抗原決定因子を
示す蛋白質〔エル・ビラーカマロフ等、「プロインシュ
リンを合成する細菌クローン」、プロシーディング・ナ
ショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ。 第７５巻、第３７２７〜３７３１頁（１９７８））、ラ
ッチ成長ホルモン〔ビー・エッチ・シーブルグ等、「細
菌による成長ホルモンの合成」、ネイチャー誌、第２７
６巻、第７９５〜７９８頁（１９７Ｂ））、ねずみジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ〔ニー・シー・ワイ・チヤツプ等
、「ねずみジヒドロ葉酸レダクターゼを暗号化するＤＮ
Ａ配列の、大腸菌（イー・コリ）における発現型」、ネ
イチャー誌、第２７５巻、第６１７〜６２４ｉ（１９７
８））、ひとソマトスタチン〔ケー・イタクラ等、「ソ
マトスタチンホルモンに対する化学合成遺伝子の大腸菌
における発現」、サイエンス誌、第１９８巻、第１０５
６〜１０６３頁（１９７７）、およびヨーロッパ特許出
願第０．００１．９２９号、第０．００１，９３０号お
よび第０．００１，９３１号ならびに他国における対応
出願〕、ひとインシュリンのＡおよびＢポリペプチド鎖
〔ディー・ヴイー・ゲデル等、「ひとインシュリンに対
する化学合成遺伝子の大腸菌における発現」、プロシー
ディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳ
Ａ、第７６巻、第１０６〜１１０頁（１９７９）、なら
びにヨーロッパおよび関連特許出願明細書（上記）〕、
ひとＢ型肝炎ウィルスの抗原〔シー・ディー・バレル等
、「プラスミドｐＢＲ３２２においてクローン化された
Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡ配列−大腸菌における発現」、
ネイチャー誌、第２７９巻、第４３〜４７頁（１９７９
）ならびにエム・パセク等、「Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子
および大腸菌におけるその発現」、ネイチャー誌、第２
８２巻、第５７５〜５７９頁（１９７９））、ひと成長
ホルモン（ディー・ヴイー・ゲデル等、「ひと成長ホル
モンをコードするＤＮＡ配列の大腸菌における直接的発
現」、ネイチャー誌、第２８１巻、第５４４〜５５１頁
（１９７９））、ＳＶ４０を抗［（ティー・エム・ロバ
ーツ等、「大腸菌における猿ウィルス４０を抗原の合成
」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイ
エンス・ＵＳＡ、第７６巻、第５５９６〜５６００頁（
１９７９））、ならびにひと繊維芽細胞インターフェロ
ン（ＨｕｌＦＮ−β）〔ティー・タニグチ等、「ひと繊
維芽細胞インターフェロン遺伝子配列を含有する細菌プ
ラスミドの製造および同定」、プロシーディング・ジャ
パン・アカデミ−１第５５巻Ｂ号、第４６４〜４６９頁
（１９７９）および私的通信（１９８０） ）が包含さ
れる。 しかしながら、これら組替えＤＮＡ法のいずれも、本発
明におけるように、Ｉ−１ｕ Ｉ Ｆ Ｎ−αの合成に
向けられていない。これが、本発明の目標とする課題で
ある。この解決は、合成遺伝子（たとえばソマトスフチ
ン）を調製するのに必要とされる配列情報を入手するこ
とによる、或いは特定ＤＮＡ配列の豊富な細胞型もしく
はウィルス（たとえば肝炎ウィルス抗原）または所望ヒ
ブリドＤＮＡを含有する細菌クローンの調製および同定
を可能にするｍＲＮＡ種（たとえばラッテインシュリン
）を入手することによる、或いは所望蛋白質（たとえば
ねずみジヒドロ葉酸レダクターゼ）を発現する大腸菌宿
主の選択を可能にする系を入手することによる上記の組
替えＤＮＡ系におけるようには簡単でない。 さらに、卵母細胞においてＨｕｌＦＮ−β活性（たとえ
ば、繊維芽細胞インターフェロン）をもたらすｍＲＮＡ
にポリ（Ａ） ＲＮ Ａからヒブリド化するようなりＮ
Ａ配列を含有すると云われるプラスミドの報告は、何ら
役に立たない。また、本発明の解決法は、純粋もしくは
ほぼ純粋なＨｕ ｒ ＦＮ−αｍＲＮＡをＨｕｌＦＮ−
ｃｘ遺伝子のクローン化前に調製するための研究報告第
１８３０９号、第３６１〜３６２頁（１９７９）におｉ
する示唆とは異なる目的を有する。 最後に、ＤＮＡ配列の選択または卵母細胞においてＨｕ
ＩＦＮ活性をもたらすようなｍＲＮＡにポリ（Ａ＞ Ｒ
Ｎ Ａからヒブリド化する組替えＤＮＡ分子の調製は、
ＤＮＡ配列または組替えＤＮＡ分子のヒブリド挿入物が
Ｈｕ Ｉ ＦＮに相当することを示すには充分でないこ
とを認めるべきである。寧ろ、１（ｕｌＦＮの免疫学的
もしくは生物学的活性を示すポリペプチドの生成によっ
てのみ、選択ＤＮＡ配列もしくは構成組替えＤＮＡ分子
がＨｕ Ｉ ＦＮに相当することが実際に示される。さ
らに重要なことは、ＨｕＩＦＮ作用の後にのみＤＮＡ配
列、組替えＤＮＡ分子またはそれに関連する配列を用い
て本発明の）（ｕｌＦＮに対応する他の配列を選択しう
ろことが示される点である。 したがって、組替えＤＮＡ技術を使用、してＨｕｌＦＮ
−αを生産する問題は上記した方法のいずれとも極めて
異なることが、上記から判るであろう。ここでは、未知
構造の特定ＤＮＡ配列（適当な宿主においてＨｕＩＦＮ
−αの発現をコードする）を、極めて複雑なりＮＡ配列
の混合物において見出しかつそこから分離してこれをＨ
ｕｌＦＮ−αの生産に使用する。さらに、この位置決定
および分離の問題は、複合混合物において所望ＤＮＡ配
列の著しい低濃度が予想されること、および所望配列を
選択しかつ分離するため混合物の多くのＤＮＡ配列を迅
速分析する有効手段がないことにより悪化される。 本発明は、適当な宿主においてＨｕＩＦＮ−αの発現を
コードするＤＮＡ配列を決定しかつ分離しそれによりＤ
ＮＡ配列と、組替えＤＮＡ分子と、宿主を形質転換させ
てひと白血球インターフェロンの免疫学的もしくは生物
学的活性を示すポリペプチドを生産する方法とを提供す
ることにより、上記の問題を解決する。 本発明により、抗ウィルス剤、抗腫瘍または抗癌剤およ
び方法に使用するための、ＨｕｌＦＮ’−αの免疫学的
もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを得ることが
できる。本発明は、従来不可能であった量および方法で
これらポリペプチドの生産を可能にする。 以下の開示から判るように、本発明のＤＮＡ配列および
組替えＤＮＡ分子は、Ｈｕ Ｔ Ｆ Ｎ −αの免疫学
的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドの、適当な
宿主における生産を方向付けることができる。適当な宿
主におけるこれらＤＮＡ配列と組替えＤＮＡ分子との複
製は、これらポリペプチドをコードする遺伝子を多量に
生産することを可能にする。これらポリペプチドおよび
遺伝子の分子構造および性質は、容易に決定することが
できる。ポリペプチドおよび遺伝子は、宿主で生産され
たまま或いは適当な誘導化もしくは改変の後、組成物中
におよびこれら生成物自身の生産を検知かつ改善する方
法に使用することができ、かつ抗ウィルス剤および抗腫
瘍もしくは抗癌剤および方法に使用することができる。 したがって、この方法は、上記の従来方法とは異なり、
ＤＮＡ配列とＨｕ Ｉ ＦＮ−αの免疫学的もしくは生
物学的活性を示す少なくとも一種のポリペプチドをコー
ドする適当なりＮＡ配列を含んだ組替えＤＮＡ分子との
調製および選択を含む点において、上記従来方法と区別
できる。 上記から判るように、本発明の基本的局面は、Ｈｕ Ｉ
Ｆ Ｎの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペ
プチドをコードすることを特徴としかつＺ−ｐＢＲ３２
２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−４ｃＸＺ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓｔ）／ＨｃＩＦ−２ｈ、Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ
）／Ｈｃ ＩＦ−ＳＮ３５、Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ４２、Ｚ−ｐＫ７２８７ （Ｐ
ｓ ｔ）／Ｈｃ Ｉ Ｆ−２ｈ−ＡＨ６のＤＮＡ挿入物
と、これらＤＮＡ挿入物のいずれかにヒブリド化するＤ
ＮＡ配列と、これらＤＮＡ配列もしくは挿入物のいずれ
かに対し単一もしくは多重のベース置換、欠失、挿入お
よび転位を含め突然変異に関連して得られる天然、合成
もしくは半合成の供給源を包含するあらゆる供給源から
のＤＮＡ配列と、前記ＤＮＡ配列および挿入物のいずれ
かのコドンの発現においてコードされるポリペプチドに
類似した免疫学的もしくは生物学的活性を発現において
コードするコドンの配列からなるＤＮＡ配列とよりなる
群から選択されるＤＮＡ配列を提供することであり、こ
れらの配列は宿主においてインターフェロンおよびイン
ターフェロン様ポリペプチドの生産を可能にする。 ここに記載した本発明をより充分に理解するため、以下
詳細に説明する。 本明細書中において、次の用語を使用する。 ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸塩と含窒素
複素環塩基とからなるＤＮＡもしくはＲＮＡの単量体単
位。塩基は、グルコシド炭朱（ペントースの１′炭素）
を介して糖成分に結合される。塩基と糖との結合体はヌ
クレオシドと呼ばれる。各ヌクレオチドはその塩基を特
徴とする。４種のＤＮＡ塩基はアデニン（“Ａ”）、ク
アニン（“Ｇ”）、シトシン（“Ｃ”）およびチミン（
“Ｔ″）である。４種のＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよび
・ウラシル（Ｕ”）である。 ＤＮＡ配列：隣接ペントースの３′炭素と５′炭素との
間のホスホジエステル結合により互いに結合されたヌク
レオチドの線状列。 コドン：ｍＲＮＡを介してアミノ酸と翻訳開始信号と翻
訳終了信号とをコードする３種のヌクレオチド（トリプ
レット）のＤＮＡ配列。たとえばヌクレオチドトリプレ
ットＴＴＡＳＴＴＧ。 ＣＴＴ、ＣＴＣＳＣＴＡおよびＣＴＣはアミノ酸ロイシ
ン（”Ｌｅｕ″）をコードし、ＴＡＧ。 ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であり、ＡＴＧは翻
訳開始信号である。 解読枠ニアミノ酸配列までｍ ＲＮ Ａを翻訳する際の
コドンのグループ化。翻訳の際、通切な解読枠を維持せ
ねばならない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡ
Ｇは３つの解読枠（すなわち相）において翻訳すること
ができ、その各々は異なるアミノ酸配列 ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ−−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ −Ｖａ Ｉ −Ｖａ Ｉ ＧＣＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −−Ｔ
ｒｐ−Ｌｅｕ−（停止） を与える。 ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカル
ボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合され
たアミノ酸の線状列。 ゲノム：細胞もしくはウィルスの全Ｄ Ｎ Ａ。 これは、特に物質のポリペプチドをコードする構造遣１
云子、ならびにオペレータ、プロモータおよびリポソー
ム結合ならびにたとえばシャインーダルガーノ配列のよ
うな配列を含めて相互作用配列を包含する。 構造遺伝子：雛型もしくはメツセンジャー・ＲＮＡ （
“ｍＲＮＡ”）を介して、特定ポリペプチドに特徴的な
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。 転写：構造遺伝子からｍＲＮＡを生成する過程。 ６１１訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成する過程。 発現：ポリペプチドを生成するため構造遺伝子により受
ける過程。これは、転写と翻訳との紹合せである。 プラスミド：完全「レプリコン」からなる非りロモソー
ムニ重［ＤＮＡ配列であり、これによりプラスミドは宿
主細胞内で複製される。プラスミドを単細胞微生物に入
れると、その生物の特性がプラスミドのＤＮＡ挿入の結
果として変化または形質転換する。たとえば、テトラサ
イクリン耐性（ＴｅｔＲ）についての遺伝子を担持する
プラスミドは従前テトラサイタリンに感受性であった細
胞をこれに対し抵抗性の細胞に形質転換させる。プラス
ミドにより形質転換された細胞を「（形質転換体）」と
呼ぶ。 ファージまたはバクテリオファージ：細菌性ウィルスで
あり、その多くは蛋白質エンベロブもしくは被覆（「カ
プシド」）中にカプセル化されたＤＮＡ配列からなって
いる。 クローン化ベヒクル（ｃ１０ｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅ
） ：宿主細胞中で複製しうるプラスミド、ファー
ジＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であり、これは１個
または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、
この部位においてこのＤＮＡ配列はＤＮＡの本質的な生
物学的機能（たとえば再現性）、被覆蛋白質の生成の喪
失またはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴わずに
決定可能に切断され、またこの部位は形質転換細胞の同
定（たとえばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン
耐性）に使用するのに適する標識を有する。クローン化
ベヒクルはしばしばベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれ
る。 クローン化：微生物またはＤＮＡ配列の増殖を得る過程
であって、無性増殖によりこの種の一種の微生物または
配列から得られる。 組替えＤＮＡ分子すなわちヒブリドＤＮＡ？生体細胞の
外部で末端−末端結合されかつ宿主細胞に感染してそこ
に維持される能力を有する、異なるゲノムからのＤＮＡ
断片よりなる分子。 発現制御配列：構造遺伝子と作用結合した場合これら遺
伝子の発現を制御および調整するヌクレオチドの配列。 それらには、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ファージλの主要オ
ペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白質の制
御領域ならびに原核もしくは真核細胞およびウィルスの
遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配列が
包含される。 第１図について述べれば、これは組替えＤＮＡ分子の混
合物の製造方法における一実施態様の概略図であり、こ
こで組替えＤＮＡ分子の幾つかはひと白血球インターフ
ェロンの免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペ
プチドをコードする挿入ＤＮＡ配列を特徴とする。 センダイ （Ｓｅｎｄａｉ）ウィルスを用いてひと白血
球を３７℃で５時間誘発させ、次いで抽出してひと白血
球インターフェロンｍＲＮＡ （’ＨｕＩＦＮ−αｍＲ
ＮＡ”）を含有するポリ（Ａ） ＲＮ Ａ混合物を得た
。誘発はカンチル法によって行なった〔ザ・インターフ
ェロン・システム、第１３０〜１３１頁およびそこに挙
げられた引用文献〕。ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ 混合物を
、その実際の割合とは無関係に第１図に示す。誘発白血
球を収量し、１０’Ｍ［Ｉのｍ胞を水１１中ＮａＣｌ８
ｇとＭＣＩ ０．２ｇとＮａ２ ＨＰＯ４−２Ｈ２０
１，１５ｇ 、！： Ｋ Ｈ２Ｐ Ｏや０．２ ｇとを
熔解含有する溶液（ＰＢＰ″）１１に再懸濁させ、これ
を激しく既拌しながら５０１分液濾斗中の２０ｍＭトリ
ス−ＨＣ１（ｐＨ７，５＞と１ｍＭ ＥＤＴＡ（“Ｔ
Ｅ緩衝液″）と２％ドデシル硫酸ナトリウム（“ＳＤＳ
”）の１７４２に加えた。自己消化したプロナーゼ（カ
ルビオケム社）を２００μｇ／ｍｌまで加え、そしてこ
の溶液を室温で１時間攪拌した。１０６カウント／分（
“ｃｐｍ”）の１１２５−グロビンｍＲＮＡを、ポリ（
Ａ） ＲＮ Ａを回収しかつ次工程におけるｍＲＮＡ分
解を管理するための標識として加えた。全容量の１／２
０に等しい量（“１／２０容量”）の２Ｍ）リス−Ｉ（
ＣＩ （ｐＨ９）を加え、そして混合物を１５２の再
蒸留フェノールにより激しく攪拌しながら１０分間抽出
した。３Ｉｌのクロロホルムを加えて混合物を５分間攪
拌した。３０分間相分離させた後、水相を除去して再び
フェノールとクロロホルムとで抽出した。得られた水相
は全部で１９．Ｈ！であり、これを６０ｇのＳＤＳと合
した。この水相から、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐｎｓ、ｓ ）と２容量のエタノールとによって核
酸を沈澱させた。 一２０℃で一晩保存した後、プラスチック製篩を通して
の濾過により繊維状の核酸沈澱を取出した。次いでこの
物質を、０．５％ＳＯ３を含有する２００ｍ１のＴＮＥ
（５０ｍＭ）リス−ＩＴＣＩ （ｐＨ７，５）、１
００ｍＭ ＮａＣ１，５ｍＭ ＥＤＴＡ）と共に攪
拌した。次いでこれを、さらにこの溶液３５０ｍ１の添
加により熔解させた。非繊維状沈澱を、ツルバールＲＣ
−３型遠心分離器において１１ツルバール瓶中に５００
Ｏｒｐｍにて１５分間遠心分離することにより集め、
０．５％ＳＤＳを含有するＴＮＥ３５０ｍｌ中に熔解さ
せた。２つのＴＨＥ溶液を合し、そして１容量のフェノ
ールで３回、１／２容歪のエーテルで３回および１容量
のエーテルで３回それぞれ抽出した。水相からのＲＮ
Ａ回収は、２６０ ｎｍでの吸光度により測定して全部
で７７５■であった。 ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ混合物の単離は、オリゴ（ｄＴ）
セルロース（タイプ７、Ｐ−Ｌビオケミカル社）に対す
る反復バッチ吸着により行なった。２．７ｇのオリゴ（
ｄＴ）セルロースを、５００ｍ１すなわち上記のＲＮＡ
含有溶液の約半量に加えた。 室温で１時間攪拌してポリ（Ａ） ＲＮ Ａをオリゴ（
ｄＴ）セルロースに吸着させた後、セルロースとこれに
結合されたｍＲＮＡの混合物とを遠心分離によって集め
、５０ｍ１のＴＨＥで１回、次いで１５ｍ１のＴＮＥで
１回洗浄した。次いで、結合したポリ（Ａ） ＲＮ Ａ
を、Ｈ２０２ｍｌテア７） ５回連続洗浄によって溶出
させた。収量は、光学密一度で測定してポリ（Ａ＞ＲＮ
Ａ８６０μｇであった（調製物Ａ〕、第一吸着から得た
上：／ＲＲＮＡ熔液を、正確に上記と同様にしてさらに
２回の吸着サイクルにかけた。第二および第三吸着は、
それぞれ６００μｇおよび１７０μｇのＲＮＡを与え、
これらを合した（調製物Ｂ〕、Ｔ？ＮＡをクセノプス・
レビ、ス（Ｘｅｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉｓ）の卵母細胞
に注入してＨｕＩＦＮ−αｍＲＮＡにつき分析した（ザ
・インターフェロン・システム、第９３〜９５頁’）、
ＲＮＡを１５ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７，５） 、８
８ｍＭ Ｎａ Ｃ１（“ＴＮＫ緩衝液”）に溶解させ
て約１ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。この溶液５０ｎｊ２を
各５０ｆＩｌの卵母細胞中に注入した。これら卵母細胞
をパース（Ｂａｒｔｈ ）培地において室温で一晩培養
した〔ゴートン、ジャーナル・エムブリオール・アンド
・エキスベリメンタル・モーホロジー、第２０巻、第４
０１〜４１４頁（１９６Ｂ）および同第７巻、第２１０
〜２２２頁（１９５９）〕、次いで、培養卵母細胞を洗
浄し、パッスールビペノトを用い１．５ ｍｌエッペン
ドルフ遠心分離管中で０．５ ｍｌの５２ｍＭ）リスグ
リシン＞１ 街？皮（ｐＨ８，９）中においてホモジナ
イズした。混合物をエッペンドルフ遠心分離器にて２分
間遠心分離し、上澄液を抜き取りそして一２０℃で凍結
させて分析した。ＩＦＮ−α活性はプラーク減少分析に
よって測定した〔エッチ・ストランダ−およびケー・カ
ンチル、「試験管中におけるひと白血球によるインター
フェロンの生産」、Ａｎｎ、Ｍｅｄ、ｅｘｐ、Ｆｅｎｎ
、 、−第４４巻、第２６５〜２７３頁（１９６６）〕
、１単位のＩＦＮ−αはウィルスプラークを５０％減少
させる。ＩＦＮ−α調製物の活性は、ひと基準Ｈｕ Ｉ
ＦＮ−α６９／１９に関して表わす〔インターフェロ
ンおよびインターフェロン誘発剤の基準化に関する国際
シンポジュウム、１９６９）、代案として、分析は主と
して次の文献に記載された細胞病理学的効果の減少に基
づいて行ない〔ダブリュー・イー・スチェアート・■お
よびニス・イー・スルキン、「ラビースウイルスを実験
的に感染させたハムスターにおけるインターフェロン生
産」、プロシーディング・ソサイエティ・エキスペリメ
ンタル・バイオロジカル・メディスン、第１２３１＝、
！６５０〜６５３頁（１９６６））、ただしこの場合ひ
とＣＣＬ−２３Ｉｌｔ胞を使用しかつメンゴウイルスを
用いて実験した。卵母細胞抽出物は、注入ＲＮＡの１μ
ｇ当り３００１ＵのＩ ＦＮ−α活性を有した。後者の
分析においては、注入卵母細胞の培養を４８時間行ない
、大部分のインターフェロンが卵母細胞により分泌され
るため、培養培地のみを分析した〔ニー・コールマンお
よびリュー・モルサー、「キセノブス・レビスの卵母細
胞からの蛋白質の分泌」、セル化、第１７巻、第５１７
〜５２６頁（１９７９）〕、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａをさ
らに精製するため、充分量の０．５Ｍエチレンジアミン
テトラ酢酸（ＥＤＴＡをポリ（Ａ） ＲＮ Ａ ｉ慰物
Ａに加えて濃度を５ｍＭＥＤＴＡにした。得られた溶液
を等容量のＴＮＥ−飽和フェノールで２回および等容量
のエーテルで５回抽出した。次いで、これを０．１ｍｌ
のチェレックス−１００ビオ−ラドカラム（Ｃｈｅｌｅ
ｘ −１００Ｂｉｏ −Ｒａｄ ｃｏｌｕｍｎ）に通し
、１００℃にて９０秒間加熱し、そして５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）と１ｍＭ ＥＤＴＡと０
．２Ｍ ＮａＣ１とを含有する１３ｍ１の５〜２３％
蔗糖濃度勾配に曝した。制限酵素Ｈｉｎｄ■とＰｓｔｌ
とによりｐＢＲ３２２を同時切断して生成させた５′
−末端ｐ３２ラベルしたＤ Ｎ Ａ ｌｌｆｒ片にュー
イングランドビオラブス社）の１０． ＯＯＯｃｐｍを
サイズ標識として加えた。５Ｗ４０型ロータで１０℃か
つ３５．００Ｏｒｐｍにて１６時間遠心分離した。フラ
クション（０，６ｍｌづつ）をｌ５ＣＯグラジエントコ
レクターにより１ｍｌ／ａｋｉｎ、の速度で集めた。こ
れらのフラクションを上記したように、ＨｕＩＦＮ−α
ｍＲＮＡ活性）につき分析し、Ｐ” ２−ＤＮＡ標識に
対するそれらあ位置を、後の参考のため記録した。後の
遠心分離において、Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αｍＲＮＡ含有フ
ラクションを標識と比較して同定した。 ＨｕｌＦＮ−αｍＲＮＡ活性を有するフラクションは８
０μｇのポリ（Ａ） ＲＮ Ａを含有した。これらを、
０．５％ＳＤＳおよび０．０２％ポリビニルサルフェー
ト（１＆の調製においてはポリビニルサルフェートを省
略した）を含有する２容量のＴＨＥと混合し、５０μｌ
のオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに加えた。上記した
ようにカラムを洗浄した後、ＲＮＡ混杏物４０μｇを０
．６ｍｌの無菌蒸留水で４回洗浄して溶出させた。エタ
ノール沈澱させた後、ＲＮＡを０．５ｍＭのＦ、ＤＴＡ
中にＩｍｇ／ｍｌとなるようン容解させた。 Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ −ｅｘ ｍ ＲＮ Ａ活性の分析を
、上記したように、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ沈澱の一部に
ついて行なった。これは、注入ＲＮＡＩμｇ当り３６０
０ＩＵのインターフェロンの比活性を有した。したがっ
て、蔗糖濃度勾配は、ポリ（Ａ） ＲＮ ＡをＨｕ Ｉ
ＦＮ−αｍＲＮＡに関し約１０倍濃化させた。次の同
様な調製において、約４０倍の濃化が得られた。調製物
Ｂを同様に精製し、そしてこれは調製物Ａと同様な比活
性を有したので、両者をプールした。 この時点において、蔗糖濃度勾配処理から得られたポリ
（〜ＲＮＡ生成物でさえ極めて多数の異なるｍＲＮＡを
含有することを認めるべきである。ＩＦＮ−αに対して
特異的なｍＲＮＡを除き、他のｍＲＮＡは望ましくない
汚染物である（第１図〕、不都合なことに、これら汚染
ＲＮＡは、本発明の残余のクローン化過程全体において
Ｈｕ Ｔ ＦＮ−αｍＲＮＡと同様に挙動する。したが
って、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ中にそれらが存在すると、
ＩＦＮ−α以外のポリペプチドをコードする遺伝子を含
有する多数の望ましくない細菌クローンの最終的調製物
が生ずる。この汚染は、所望のＩＦＮ−αヒブリドクロ
ーンの単離において複雑な選別問題を提起する。ＩＦＮ
−αの場合、この選別問題は、所望クローンを同定する
ための選別比較試料として作用するＨｕＩＦＮ−αｍＲ
ＮＡまたはＤＮＡもしくはその一部の精製試料が充分存
在しないためさらに悪化する。したがって、ＩＦＮ−α
クローンの選別過程は極、めて時間がかかりかつ困難と
なる。さらに、極めて少割合のＩＦＮ−αクローンしか
住物学的活性型または免疫学的活性型においてＩＦＮ−
αを発現することが期待されないので、活性クローンの
単離はわら山から針を探すような選別過程になる。 有利なことに、本発明は組・替えＤＮＡ技術を用いて、
Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−ｃｒｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしく
はその一部の精製試料を得ることができる。この精製ｍ
ＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用して極めて多数の細菌クロ
ーンを迅速に選別しかつそれにより活性型でＩＦＮ−α
を発現するクローンを単離する確率が著しく増大する。 Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αｃＤＮＡを するｃＤＮＡ混合物
の合成 ＩＦＮ−αｍＲＮＡが濃化されたポリ（Ａ） ＲＮ Ａ
調製物（Ａ＋Ｂ）を雛型として使用して、単一鎖の相補
ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）を調製した（第１図）〔ニー・エ
フストラチアジス等、［グロビンおよびコリオンｍＲＮ
Ａの全体的および個々の部分的な逆転写」；セル誌、第
４巻、第３６７〜３７８頁（１９７５）およびそこに引
用されている文献〕。８００μｌの反応混合物は４０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）と、３０ｍＭの
ＮａＣｌと、５ｍＭのＭｇＣ１□と、０．５ ｍ、Ｍの
ＤＴＴ （カルビオケム社）と、２０μｇ／ｍｌのオリ
ゴ（ｄＴ）１２〜１８（Ｐ＆Ｌビオケミカルス社）と、
５ｍＭのｄＧＴＰ （シュワルツ社） 、ｄＣＴＰ （
レボサン社）およびｄＴＴＰ（シグマ社）と、５ｍＭの
Ｐ” −ｄＡＴＰ（ＮＥＮ、比活性１００．０００ ｃ
ｐｓ ／ ｎ ％７Ｌ／）と、６０μｇ／鵡１のポリ（
Ａ） ＲＮ Ａと、２８０単位の鳥類骨髄芽球症ウィル
ス（ＡＭＶ）逆転写酵素〔フロリダ州セントピータース
ブルグ在うイフサイエンス社から寄贈〕とを含有した。 ３７℃゛で１時間培養した後、０．５Ｍ（７）ＥＤＴＡ
と２０％のＳＤＳ （再結晶したもの）を１０ｍＭのＥ
ＤＴＡおよび０．１％のＳＤＳまで加えた。この混合物
を１容量のフェノール（蒸留物）で抽出した。フェノー
ル相を２００μ戸の２００ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７
，５）と１ｍＭ ＥＤＴＡと０．１％ＳＤＳとで洗浄
し、水相を合した。これらを等容量のエーテル（フルカ
社、プロアナル）で抽出し、ＴＮＥ中５ｍｌのセファデ
ックスｃ−ｔｏｏカラムにてクロマトグラフにかけた。 ０．１ ｍｌづつのフラクションを０．３ ｍｌ／ ｍ
ｉｎ 、の速度で集めた。放射能（セレンコツ放射線に
より測定）を示すフラクションを合し、３Ｍの酢酸ナト
リウムを０．３ Ｍまで加えた。この核酸を２．５容量
のエタノールで沈澱させた。−２０℃で一晩保存した後
、試料を遠心分離しそして上澄液を捨てた。この沈澱を
１８０μｌの蒸留水中に熔解させ、シリコーンライニン
グしたエフペンドルフ管に移した。２０μｌの５Ｍ
ＮａＯＨを加え、混合物を室温で４０分間保った。２０
μｌの５Ｍ酢酸ナトリウムと１００μｌの蒸留水と５０
０μｌのエタノールとを加えた。−２０℃にて一晩冷却
した後、生じた沈澱を重力の１０．０００倍（１０，０
００ｘ ｇ ）に相当する力で０℃にて２０分間遠心分
離することにより、回収した。 単一鎖ｃＤＮＡの収量は１０μｇであった。 ここでも、上記のように調製した単一鎖ｃ ＤＮＡ生成
物は実際的に、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ混合物中に存在す
る対応のｍＲＮＡから転写された多数の異なるｃＤＮＡ
の複合混合物であることを理解すべきである（第１図〕
、これらｃＤＮＡのうち極めて少量のみがＩＦＮ−α関
連性、すなわちＨｕｌＦＮ−αｃＤＮＡである。他の要
因も作用してｃＤＮＡ混合物を複雑化させ、ポリ（Ａ）
ＲＮＡ混合物の各ｍＲＮＡ種は通常完全には転写されな
い。寧ろ、各ｍＲＮＡ種に関し、転写過程はｍＲＮＡの
末端に達する前に停止することがある。したがって、各
ｍＲＮＡ種から多種類のｃＤＮＡが生成されうる（第１
図に示さず〕、各種類は後のクローン化過程において多
かれ少なかれ同様に挙動し、したがって特定蛋白質に関
する遺伝子の断片のみを有する組替えＤＮＡ分子を含有
した細菌クローンが生産されるであろう。これら断片含
有クローンの存在は、さらに最終的なりローン選別過程
を複雑化させる。 各種の単一鎖ｃＤＮＡの寸法は、少量をアルカリ性２％
アガロースゲル上に、電解質として３０ｍＭのＮａＯＨ
と２ｍＭのＥＤＴＡとを使用して電気泳動させることに
より測定した〔エム・ダブりニー・マクドネル等、ｒＴ
７ＤＮＡの制限断片の分析ならびに中性およびアルカリ
性ゲルにおける電気泳動による分子量の測定」、ジャー
ナル・モレキュラー・バイオロジー、第１１０巻、第１
１９〜１４６頁（１９７７）〕、Ｐ”−ｃＤＮＡは、サ
イズ標識として使用した単一鎖グロビンｃＤＮＡおよび
ｐ ３２−標識したＤＮＡ断片に比べ、６００〜１００
０ヌクレオチドの長さを有した。 二重鎖ｃＤＮＡの調製 単一鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼＩで処理して二
重鎖にすることができる〔ティー・マニアチス等、「試
験管中で合成したβ−グロ ゛ビン遺伝子の拡大および
特性化」、セル誌、第８巻、第１６３〜１８２頁（１９
７６））、上記からの沈澱した単一鎖ｃＤＮＡを２００
μｌのＨ，Ｏ中に熔解させ、１００℃にて２分間加熱し
、そして５００μｌの０．ＩＭ熱変性燐酸カリウム緩ｊ
近液（ｐｉ冒６．９）と１０ｍＭのＭｇＣｌ２と１０ｍ
ＭのＤＴＴ （カルビオケム社）と各１ｍＭのｄＡＴＰ
（メルク社）、ｄＧＴＰ（シュワルツ社）およびｄＣＴ
Ｐ （レボサン社）と１ｍ Ｍ （７） Ｈ″−ｄＴＴ
Ｐ （ＮＥＮ、比活性１００，０００ｃｐｍ／ｎモル）
と１５０単位／ｍｌのイー・ＩすＤＮＡポリメラーゼＩ
（ベーリンガー・マンハイム社）とにおいて培養した
。１５℃にて６．５時間の後、０．５ＭのＥＤＴＡと２
０％のＳＤＳを１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％のＳ
ＤＳまで加えた。次いで混合物を５００μｌのフェノー
ルで抽出し、フェノール相を２５０μｍ０）２０ｍＭト
リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５） と５ｍＭ ＥＤＴＡ（
“ＴＥ緩衝液”）とで再抽出した。２つの水田を合し、
前記したと同じ条件下で５ｍｌのセファデックスＧ−１
００カラム上でクロマトグラフにかけた。酢酸ナトリウ
ム（３Ｍ）を０．３Ｍまで加え、２．５容量のエタノー
ルを混合してＤＮＡを沈澱させた。全部で１３μｇのＤ
ＮＡう（回収された。 ＤＮＡをヌクレアーゼＳ、で処理した〔このヌクレアー
ゼＳ１は、アール・シー・ビーガント等、「アスペルギ
ルス・オリイーからの８１ヌクレアーゼの特異性」、ジ
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５０巻
、第８８４１〜８８５５頁（１９７５）の方法によりＩ
Ｉ製した〕沈澱したＤＮＡを２５０μｌのＳ、緩衝液（
０，２ＭのＮａＣ１，５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐ１
１４．５） 、１０ｍＭの硫酸亜鉛）に熔解させ、３７
℃にて３０分間加温した。１．５μｉのＳ、酵素（１１
単位／μｌ）を加え、混合物を３７℃で３０分間培養し
た。ＳＤＳとＥＤＴＡとを０．１％ＳＤＳおよび５ｍＭ
ＥＤＴＡまで加え、そして混合物を２５０μｌのフ
ェノールで抽出した。フェノール相を１００μ１ＯＴＥ
ｆｆｌｆＥ液で洗浄した。水相を合し、ＴＮＥにおいて
セファデックスＧ−１００（ファーマシア社）カラム上
でクロマトグラフにかけ、０．１ ｍｌづつのフラクシ
ョンを０．３ ｍｌ／ｍｉｎ 、の速度で集めそして各
フラクションのセレンコツ放射線を測定した。 上記したようにエタノールと酢酸ナトリウムとで沈澱さ
せた後、８μｇの二重鎖ｃＤＮＡを回収した。 ここでも、上記で生産した二重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａは１多
数のＣＤＮＡとその断片との混合物であり、。その掻く
少数のみがＨｕ Ｉ ＦＮ−αｃＤＮＡもしくはその断
片であることを認めねばならない（第１図〕、 二重鎖ＤＮＡのクローン化 多種類の宿主／クローン化ベヒクルの組合せ物を使用し
て、上記のように調製された二重鎖ｃＤＮＡをクローン
化させた。たとえば、有用なりローン化ベヒクルは染色
体、非染色体および合成りＮＡ配列の断片、たとえば各
種公知の細菌プラスミド、たとえばｃｏ ＩＥＩ、ｐｃ
Ｒｌ。 ｐＢＲ３２２およびそれらの誘導体を含む大腸菌（イー
・コリ）からのプラスミド、広範囲の宿主の１ラスミド
、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばファージ
λの多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９、ならびにプラ
スミドとファージＤＮＡとの組合せから生じたベクター
、たとえばファージＤＮＡもしくは他の発現制御配列を
用いて改変させたプラスミドまたは酵母プラスミド、た
とえば２μプラスミドもしくはその誘導体から構成する
ことができる。有用な宿主は細菌藩主、たとえば大腸菌
の菌株、たとえばイー・コリＨＢ１０１、イー・コリＸ
１７フイー・コリＸ２２６２、イー・コリＭＲＣＩおよ
びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ） 、枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ口ｉＳ）、高熱菌（
Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）およびその他バチルスの菌株、酵母およびその
他の真菌類、動物もしくは植物宿主、たとえば動物（人
間を含む）もしくは培養した植物細胞またはその他の宿
主を包含する。勿論、必らずしも全ての宿主／ベクター
組合せ物が同等に有効ではない。宿主／クローン化ベヒ
クル組合せの特定の選択は、示した原理を適当に考慮し
て当業者により、本発明の範囲を逸脱することなく行な
うことができる。 さらに、各特定クローン化ベヒクル内において、種々の
部位を選択して二重鎖ＤＮＡを挿入することもできる。 これらの部位は通常、これらを切断する制限エンドヌク
レアーゼにより命名することができる。たとえば、ｐＢ
Ｒ３２２においてＰｓｔ１部位は、β−ラクタマーゼ用
の遺伝子において、その蛋白質のアミノ酸１８１６・お
よび１８２をコードするヌクレオチドトリブレットの間
に位置する。この部位は、ラッチのプロインシュリン抗
原決定因子を示す蛋白質の合成において、ビラーカマロ
フ’！ （上記）によって用いられた。２つのＨｉｎｄ
ＩＩエンドヌクレアーゼ認識部位の一方はアミノ酸１０
１および１０２をコードするトリブレンドの間に存在。 し、また数個のＴａｑ部位の一つはｐＢＲ３２２におけ
るβ−ラクタマーゼのアミノ酸４５をコードするトリプ
レットに存在する。同様に、このプラスミドにおけるＥ
ｃ ｏＲ１部位およびＰｖｕｌＩ部位は、コード化域の
外部に存在し、ＥＣｏＲ１部位はそれぞれテトラサイク
リンおよびアンピシリン耐性をコードする遺伝子の間に
位置する。この部位は、イタクラ等およびゲデル等によ
り、組替え合成法（上記）において使用された。これら
の部位は当業者により充分認識されている。勿論、本発
明に有用なりローン化ベヒクルは、選択ＤＮＡを挿入す
るための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要のな
いことを理解すべきである。寧ろ、ベヒクルは別の手段
により断片に結合させうるであろう。 ベクター、すなわちクローン化ベヒクル、特に選択ＤＮ
Ａ断片を結合させて組替えＤＮＡ分子を生成させるため
そこに選択される部位は、種々の要因たとえば特定制限
酵素に対し感受性部位の数、発現すべき蛋白質の大きさ
、宿主細胞酵素により蛋白質分解を受ける所望蛋白質の
感受性、精製の際除去困難な宿主細胞蛋白質により発現
すべき蛋白質の汚染、たとえばベクター配列に関する開
始および停止コドンの位置のような発現特性ならびに当
業者により認められるその他の要因のような各種の要因
により決定される。ベクターおよび特定遺伝子用の挿入
部位は、これら要因のバランスにより決定され、必らず
しも全ての選択が一定の場合に対し同等に有効であると
は限らない。 外来ＤＮＡをクローン化ベヒクルすなわちベクター中に
挿入して組替えＤＮＡ分子を生成させるには幾つかの方
法が当分野で知られているが、本発明による第一の構成
に好ましい方法はビラーカマロフ等（上記）により記載
され、第１図に示されている。この方法は、プラスミド
（特にｐＢＲ３２２）を挿入用に選択された部位（特に
Ｐｓ ｔ Ｉ）に特異的な制限酵素により切断し、そし
てｄＧＭＰ末端を末端トランスフェラーゼにより末端付
加させることを特徴とする。ｄＧＭＰ末端は切断プラス
ミドの５′末端に付加されて、ＰｓｔＩ部位を再生する
と共に、相補的末端を有するｃＤＮＡ断片への結合を可
能にする。同様に、二重鎖ｃＤＮＡは、ｄＣＭＰ末端を
処理プラスミドに対する結合を可能にする３′末端に付
加させて伸長される。次いで処理プラスミドとｃＤＮＡ
とをアニールして、プラスミドの適当な部位にｃＤＮＡ
を挿入すると共にヒブリドＤＮＡを環化させ、末端の相
補的性質はそれらの凝集を可能にする（第１図〕、かく
して、生じた６組替えＤＮＡ分子は、選択制限部位に遺
伝子を有する（第１図〕、 勿論、ＤＮＡ配列をクローン化ベヒクル中に挿入して組
替えＤＮＡ分子を生成させるその他の公知方法も、同等
に本発明において有用である。これらは、たとえば直接
的結合、合成リンカ−、エキソヌクレアーゼおよびポリ
メラーゼ結合修復反応に続く結合、或いはＤＮＡポリメ
ラーゼと適当な単−鏡開型とによるＤＮＡ鎖の伸長に続
く結合を包含する。 勿論、クローン化ベヒクルの選択位置に挿入されたヌク
レオチド配列またはｃＤＮＡ断片は、所望ポリペプチド
用の実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチドも包含
することができ、或いは所望蛋白質用の完全構造遺伝子
の断片のみも包含することができることを了解すべきで
ある。何らかのＤＮＡ配列が挿入されて形質転換した宿
主がＨｕ Ｔ ＦＮ−αの生物学的もしくは免疫学的活
性を有するポリペプチドを生産すること、或いはＨｕｌ
ＦＮ−αの免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリ
ペプチドの生産に有用なりＮＡ配列を含んだクローンを
選択するためＤＮＡ配列自身がヒブリド化試料として使
用できることのみが必要とされる。 外来遺伝子を含有するクローン化ベヒクルすなわちベク
ターを使用して、ヒブリドＤＮＡによりコードされる蛋
白質またはその一部を宿主が発現しうるようこの宿主を
形質転換させる。 適当な宿主の選択も、当分野で知られた多くの要因によ
り管理される。これら要因には、たとえば選択ベクター
との適合性、ヒブリドプラスミドによりコードされる蛋
白質の毒性、所望蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生
物安全性および価格が包含される。これら要因をバラン
スさ、せるには、必らずしも全ての宿主が特定の組替え
ＤＮＡ分子を発現するのに同等に有効でないと云う理解
を考慮せねばならない。 この合成において、好適な初期クローン化ベヒクルは細
菌性プラスミドｐＢＲ３２２であり、好適な初期制限エ
ンドヌクレアーゼ部位はＰｓｔ■部泣である（第１図〕
、このプラスミドは、抗生物質アンピシリン（Ａｍｐ）
およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）に対する耐性遺伝子
を有する小型（分子量約２．６メガダルトン）のプラス
ミドである。プラスミドは完全に特性化されている〔エ
フ・ポリバール等、「新規クローン化ベヒクル■の構成
および特性化。多目的クローン化システム」、ジーン誌
、第９５〜１１３頁（１９７７）；ジェー・ジー・サツ
トクリソフ、ｒＤＮＡ配列から生ずるｐＢＲ３２２制限
地図。４３６１ヌクレオチド対の長さまでの正確なりＮ
Ａサイズ標識」、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、
第５巻、第２７２１〜２７２８頁（１９７８）〕、この
部位におけるＤＮＡ生産物の挿入は多数の細菌クローン
を与え、その各々は予め調製されたＤＮＡ生産物に存在
するＤＮＡ遺伝子もしくはその断片の一つを含有する。 ここでも、これらクローンの掻く少数のみがＩＦＮ−α
もしくはその断片用の遺伝子を含有する（第１図〕、本
発明における初期クローン化用の好適宿主はイー・コリ
ＨＢ１０１である。イー・コリＸ１７７６を用いて他の
実験を行なったが、この宿主は英国特許第１．５１６，
４５８号に記載されており、アメリカ合衆国、メリーラ
ンド州ロックビル在のアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション〔ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ番号
第３１２４４号が付与されている。 プラスミドｐＢＲ３２２（２０μｇ）を２１単位のＰｓ
ｔＩエンドヌクレアーゼ（ＭＲＥポートンダウンス社ま
たはニューイングランド・ビオラプス社）により、１５
０μ！の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）と
６ｍＭのＭｇＣｌ２と５０ｍＭのＮａＣ１と６ｍＭの２
−メルカプトエタノールと２００ｍｒ／μｌの牛血清ア
ルブミン（“ＢＳＡ″）（カルビオケム社）との中で切
断した。３７℃にて２時間の後、混合物を１容（ｆのフ
ェノール−クロロホルム（１： １）と１容量のエーテ
ルとで抽出しそしてエタノールにより沈澱させた。 末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（Ｔｄ
Ｔ）（エフ・ジェー・ボルム、「子牛胸腺からのデオキ
シヌクレオチド重合酵素」、メソッド・イン・エンチモ
ロジ−（エル・グロスマンおよびケー・モルデーブ編）
、アカデミツク・プレス社、ニューヨーク、第１２Ｅｌ
、第５９１〜６１１頁（１９６８）により精製〕による
単独重合ｄＧＭＰ末端の付加（第１図）を、１００ｍＭ
のカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７，２）と１０ｍＭのＮ
ａＨ２ＰＯ，と５ｍＭのＭｇＣｌ２と１ｍＭのｄＧＴＰ
と５０ｐｇ／ｐｉのＢＳＡと３〜６単位のＴｄＴ （上
記のように精製）とをＤＮＡ遺伝子当りに含有する３２
８μｌの反応容量にて行なった。培養を３７℃にて２０
分間行なった。ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加えそして混合
物を上記のように抽出し、ＴＮＦ−’！２１１液に対し
２日間透析した。 ２、ｄＣＭＰ伸長させたＤＮＡの調製 二ｉｉｄ！ｌｌＤＮＡを標準法（たとえば、ビラーカマ
ロフ等、上記）によりｄＣＭＰ残基で陣長させた。上記
の二重鎖ｅＤＮＡ１５０ｎｇを、１００ｍＭのカコジル
酸ナトリウム（ｐＨ７，２）と２．５ｍＭのＣｏｃ！、
と５０ｔｔｇ／ｌｔｌのＢＳＡとＤＮＡ１μｇ当り３〜
６単位の精製ＴｄＴを含む０．１ｍＭのｄＣＴＰとの８
ｐＨ中で２７℃にて８分間培養し、次いで一２０℃にて
凍結させた。前記と同様、ｄＣＭＰ伸長させたＤＮＡは
種々異なる種類の混合物であり、そのうち極く少数のみ
がＩＦＮ関連性であった（第１図〕、 ３、Ｃａ”処理されたイー・コリＸ１７７６の調製 イー・コリＸ１７７６の単一コロニーを、１００μｇ／
ｍｌのジアミノピメリン酸（コツホライト・ラボラドリ
ース社）と１０μｇ／ｍｌのナリジキシン酸（カルビオ
ケム社）と１０μｇ／ｍ１のテトラサイクリン（アクロ
マイシン■、アメリカンシアナミド社）とが加えられた
１００ｍ１のトリプトン培地中に接種した〔シー・ワイ
スマンおよびダブりニー・ポル、「組替えプラスミドＤ
ＮＡのＩＩＭにおける起こりうる害の減少」、ネイチャ
ー誌、第２６１巻、第４２８〜４２９頁（１９７６）〕
、培養物を、６５０ｎｍ（ＯＤ６５Ｑ）にて０．６の見
掛は光学密度（ベックマンＤＢ型分光光度計にて測定）
まで３７℃にて生育させ、水中で３０分間冷却させた。 次いで、培養物をツルバールＨ４型スウィングバゲソト
ロータにて４００ Ｏｒｐｍで沈降させ、細胞を５Ｏｎ
＋１の１０ｍＭ ＮａＣ１で洗浄し、遠心分離によっ
て分ｇ！除去しそして２０ｍ１の１００ｍＭ ＣａＣ
ｌ２中に再懸濁させた。懸濁物を水中で３０分間冷却し
、遠心分離により粒状化させて４ｍｌの１００ｍＭ
ＣａＣｌ２中に再懸濁させ、そして氷上で一晩放置した
後使用した。 形質転換用としてイー・コリＨＢ １０１をエム・マン
デルおよびニー・ヒガの方法〔「カルシウム依存性バク
テリオファージＤＮＡ感染」、ジャーナル・モレキュラ
ー・バイオロジー、第５３巻、第１５９〜１６２頁（１
９７０））により調製した。一部（０，５ｍｌ）を−７
０℃で凍結状態に保ち、少なくとも３ケ月間その活性を
保持した。 末端Ｐｓｔｌ−開裂ｐＢＲ３２２と末端ｃＤＮＡとのア
ニール化を文献〔ジェー・ファン・デン・ベルブ等、「
２つの同族対のイントロンの強力な多様性を示すクロー
ン化された兎とねずみとのβ−グロビン遺伝子の比較」
、ネイチャー誌、第２７６巻、第３７〜４４頁（１９７
８））に記載されているように行なった。８ ｎ ｇ
（７） ｄ ＣＭ Ｐ伸長されたＤＮＡ生成物を２２ｎ
ｇのｄＧＭＰ伸長されたＰｓｔＩ−開裂ｐＢＲ３２２と
、ＴＮＥ緩衡液５０μＪ中で混合した。培養を６５℃、
４６℃、３７℃および２０℃にて順次に４段階で１時間
づつ行なった。１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ （ｐＨ
７，５）と１００ｍＭのＣａ Ｃｌ ２と１００ｍＭの
ＭｇＣｌ２と５０μｌのＴＮＥ緩街液とを含有する２０
μｌを加えそして混合物を水中で２０分間冷却した。 勿論、生成物は種々異なる組替えＤＮＡ分子と、挿入Ｄ
ＮＡ配列のない若干のクローン化ベヒクルとの混合物で
ある。しかしながら、各組替えＤＮＡ分子はＰｓｔ１部
位にｃ Ｄ Ｎ Ａ断片を含有する。この種のｃＤＮＡ
の各々は遺伝子またはその断片からなることができる。 ｃ ＤＮＡ断片の極く少数のみがＩＦＮまたはその部分
をコードする（第１図〕、大多数は他の蛋白質またはそ
の部分の一種をコードし、それらのｍＲ，ＮＡは本発明
の方法に使用されるポリ（Ａ） ＲＮ Ａの一部であっ
た（第１図〕、 組替えＤＮＡ分子の混合物によるイー・コリＸ１７７６
の形質転換はジェー・ファン・デン・ベルブ等（上記）
により記載されているように行なった。Ｐ３封鎖手段を
用いて形質転換過程と全ての次工程とを行ない、そこに
おいて得られた形質転換細菌を処理した。アニールした
ｐＢＲ３２２組替えＤＮＡ分子を１００μｌの予め調製
されたＣａ＋１処理したイー・コリＸ１７７６に加え、
混合物を水中で２０分間冷却し、２０℃にて１０分間加
熱し、そして０．６ ｍｌのトリプトン培地を加えた。 混合物を、上記のように添加された２枚のトリプトン培
地寒天板に接種した。形質転換効率はアニールｐＢＲ３
２２の１μｇ当り３．３ ｘ １０斗１固のコロニーで
、あり、原ｐＢＲ３２２はｌμｇ当り３Ｘ１０’個のコ
ロニーを与えた。 プラスミドｐＢＲ３２２はテトラサイクリン耐性に関す
る遺伝子を含むので、その完全遺伝子を有するプラスミ
ドで形質転換させたイー・コリ宿主は、そのように形質
転換させてないｆｉｌｌ菌を除き、その抗生物質を含有
する培養物において増殖するであろう。したがって、テ
トラサイタリン含有培養物における増殖は、組替えＤＮ
Ａ分子または再使用ベクターにより形質転換させた宿主
の選択を可能にする。 ３７℃にて４８時間の後、個々のコロニーを採取してこ
れらをミクロヨリ定板（ダイナチク社）の穴部における
１００μβのトリプトン培地（上記のように添加したも
の）に懸濁させた。 ３７°Ｃにて一晩培養した後、１００μｌの４０％グリ
セリンを各穴中に混入した。測定板を一２０℃に保存し
、そして形質転換イー・コリＸ１７７６の１００，００
０個の個々のクローンを調製した。 これら１００，０００個のクローンは、ＩＦＮ生成性白
血球からのポリ（Ａ）ＲＮＡ調製物においてｍＲＮＡの
混合物の完全もしくは部分的コピーを示す各種の組替え
ＤＮＡ分子を含有する（第２図〕、これらの大多数は単
一の組替えＤＮＡ分子のみを含有するであろう。これら
組替えＤＮＡ分子の極く少数のみがＩＦＮに関連する。 したがって、クローンを選別してＩＦＮ関連クローンを
他のものから分離せねばならない。 ＨｕＩＦＮ−αｃＤＮＡを含有するクローンの選別 ひと白血球インターフェロンｃ ＤＮＡ（“Ｈｕ ＩＦ
Ｎ−αｃＤＮＡ″）を含有する細菌クローンを選別する
ための幾つかの方法がある。 これらには、たとえばＲＮＡ選択ヒブリド化〔アルウィ
ン等、（下記）〕、差別ヒブリド化〔ティー・ビー・セ
ントジョーンおよびアール・ダラ゛リュー・デービス、
「差別プラークフィルターヒブリド化によるサツカロミ
セス・セレビシェからのガラクトース誘発ＤＮＡ配列の
単離」、セル誌、第１６巻、第４４３〜４５２頁（１９
７９″）；ヘージメーカース等、下記〕、合成試料によ
るヒブリド化〔ビー・ノイエス等、「オリゴデオキシヌ
クレオチド試料を使用するガストリンｍＲＮＡの検出お
よび部分的配列分析」、プロシーディング・ナショナル
・アカデミ−・サイエンス・’ＵＳＡ、第７６巻、第１
７７０〜１７７４頁（１９７９））または免疫学分析（
エル・ビラーカマロフ等、上記）もしくは生物学的分析
（ニー・シー・ワイ・チャング等、上記）による所望蛋
白質を生成するクローンの選別が包含される。本発明は
、ＩＦＮ−αｃ ＤＮＡを含有するクローンの第一次選
別のための最も便利かつ有望な方法としてＲＮＡ選択ヒ
ブリド化を選択した。 次に第２図について述べれば、組替えＤＮＡを、上記ク
ローン貯蔵物（第２図に示した２クローンの２つの混合
物）における５１２個のクローンの混合物の培養物から
単離した（工程Ａ〕、このバッチサイズを選別する理由
を以下に説明する。組替えＤＮＡ分子を開裂させ、変性
させそして前記したように調製したＩＦＮ−αｍＲＮＡ
を含有する白血球ポリ（Ａ） ＲＮ Ａまでヒブリド化
させた（工程Ｂ〕、全ての組替えＤＮＡ分子−ポリ（Ａ
） ＲＮ Ａヒブリドを非ヒブリド化ポリ（Ａ’ｌ Ｒ
Ｎ Ａから分離した（工程Ｃ〕、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ
をヒブリドから回収しかつ精製した（工程Ｄ〕、回収し
たＲＮＡを上記のようにＩＦＮ−αｍＲＮＡ活性につき
分析した（工程Ｅ〕、もしも組替えＤＮＡ分子の混合物
が厳格なヒブリド化条件の下でポリ（Ａ） ＲＮ Ａ中
のＩＦＮ−ｍＲＮＡにヒブリド化しうる挿入ヌクレオチ
ド配列を持った組替えＤＮＡ分子を含有するならば、そ
のヒブリドから遊離されたｍ ＲＮ Ａは卵母細胞中に
おいてＩＦＮ−αの生成をもたらすであろう。何故なら
、その他の如何なる組替えＤＮＡ分子−ポリ（Ａ） Ｒ
Ｎ Ａヒブリドから遊離されたｍＲＮＡもＩＦＮ−α関
連性でないからである。５１２個のクローンの群が正の
反応を示せば、これらクローンを６４個づつの８０ツト
に再紙分けして、各ロフトにつき上記のように分析した
。この処理を、この分析に応答する単一のクローンが同
定されるまで続けた。 形質転換されかつこのように同定された組替えＤＮＡ分
子および細菌クローンがＩＦＮ−αの完全なＩＦＮ−α
ｃＤＮＡ配列を含有したり、或いはＤＮＡ配列が実際に
ＩＦＮ−αをコードする保証はない。しかしながら、組
替えＤＮＡ分子はＩＦＮ−αｍＲＮＡコード配列に相補
的な広汎なヌクレオチド配列を確実に含有する。 したがうて、組替えＤＮＡ分子は、他の組替えＤＮＡ分
子およびそれにより形質転換されたクローンを迅速選別
するための試料の供給源として使用することにより、標
準的および完全なＩＦＮ−αヌクレオチドコード配列を
含有しうる別の群のクローンを同定することができる。 ２、理論的考察 ヒブリド化（工程Ｂ）の条件は臨界的である。 組替えＤＮＡ分子とポリ（Ａ） ＲＮ Ａとの絶対濃度
および比は、反応速度と化学量論とを考慮して選択せね
ばならない。適正な選択は、ポリ（Ａ）ＲＮＡにおける
ＩＦＮ−αｍＲＮＡの割合が未知であるため、困難であ
る。制御されかつ充分な速度を確保するため、組替えＤ
ＮＡ分子からのＤＮＡ配列の濃度が推定ＩＦＮ−αｍＲ
ＮＡ濃度に比較して過剰となる条件の下で行なった。 ５１２＋１１の可能な種々異なる組替えＤＮＡ分子の混
合物において、ＩＦＮ−α関連ＤＮＡ配列（＠ＩＦＮ−
αＲＤＮＡ″）は全く生じない（負の分析値を与える）
か、或いは組替えＤＮＡ分子の少なくとも約１１５１２
を構成する。組替えＤＮＡ分子混合物の濃度およびした
がってＩＦＮ−αＲＤＮＡの濃度をヒブリド化工程で鋼
製して、充分なヒブリド化割合を確保することができる
。さらに、反応混合物中のＩＦＮ−αＲＤＮＡの量は、
ポリ＜Ａ） ＲＮ Ａからの充分な量のＩＦＮ−αｍＲ
ＮＡを結合して、組替えＤＮＡ分子−ポリ（Ａ） ＲＮ
Ａヒブリドから回収されたｍＲＮＡを卵母細胞に注入
した後にＩＦＮ−αの検出を可能にするのに足る量でな
ければならない。 用いうる分析によりＩＦＮ−αを検出するには、その濃
度は１００ＩＵ／ｍｌもしくはそれ以、ヒにしなければ
ならない。反復測定のためには０．５ ｍｌづつを必要
とするので、５０ ＩＵを卵母細胞中に発生させるべき
である。前記で使用した誘発白血球からのポリ（Ａ）
ＲＮ Ａは、その１μｇを卵母細胞中に注入すると、約
５００１ＵのＩＦＮ−αを発生する。したがって、必要
とする５０ｆＵを発生させるには、少なくとも０．１μ
ｇのポリ（Ａ） ＲＮ Ａを注入せねばならない、兎グ
ロビンｍＲＮＡと兎β−グロビンＣＤＮＡクローンとを
用いたモデル実験は、ヒブリド化ミックスに加えたＩ
−グロビンｍＲＮＡに対し卵母細胞中の■ −グロビン
ｍＲＮＡの全回収率が約１０％であり、かつｍＲＮＡ活
性の回収率が約５％であることを示した。したがって、
ヒブリド化分析用には少なくとも０．１１０．０５＝２
μｇの白血球ポリ（Ａ） ＲＮ Ａを使用すべきである
。充分安全な限界を確保するには、１回の分析当り１２
μｇのポリ（〜ＲＮＡを使用した。 １２μｇのポリ（釣ＲＮ Ａ中のＩＦＮ−αｍＲＮＡを
結合させるには、組替えＤＮＡ分子からのどの程度のＤ
ＮＡが必要とされるかを計算するため、ポリ（Ａ＞ Ｒ
Ｎ ＡのｒＦＮ−ａｍＲＮＡ含有量を推定した。１μｇ
のポリ（Ａ’） ＲＮ Ａは５００ＩＵのＩＦを発生さ
せる。ＩＦＮ−αの比活性は２ＸＩＯ”〜１０’ｌＵ／
■蛋白質である。したがって、５００１ＵのＩＦＮ−α
は５００／２ｘｔｏ’−２，５Ｘ１０−’ｗ（２，５ｎ
ｇ）〜５００／１０’−５Ｘ１０−’ｍｇ（０，５ｎｇ
）のインターフェロンに対応する。 卵母細胞中に注入したＩＦＮ−αｍＲＮＡの量と生成さ
れたＩＦＮ−αの量との間の関係は未知である。β−グ
ロビンｍＲＮＡの場合、ｍＲＮＡ１分子当り約３０分子
の蛋白質が１時間当りに生成され、この値はβ−グロビ
ンに対し約６である〔ジェー・ビー・グルトン等、「注
入フロッグ卵母細胞における伝達安定性：長寿命の哺乳
動物およびβ−グロビン伝達」、ジャーナル・モレキュ
ラー・バイオロジー、第８０巻、第５３９〜５５１頁（
１９７３）〕、ＩＦＮ−αに関し平均値が２０であり、
ＩＦＮ−αに関し分子量が１８．０００でありかつＩ
ＦＮ−αｍＲＮＡに関し分子量が３３０．０００である
と仮定すれば、２６ ｍｇ （１８，０００／３３０，
０００ ｘ ２０ｘ ２４）のＩ ＦＮ−Ｑ’が注入Ｉ
ＦＮ−αｍＲＮＡ １＋ｎｒ当りに２４時間で生成さ
れる筈である。もしＩＦＮ−αの比活性が２Ｘ１０”／
■（２Ｘ１０２１Ｕ／ ｎ ｇ ）であるとすれば、ｌ
ｎｇのＩＦＮ−ｃｘｍＲＮＡは２６Ｘ２Ｘ１０２＝５．
２Ｘ１０３ＩＵのＩＦＮ−αを生成するであろう。比活
性が１０″’ ／ｍｇ （１０３１Ｕ／ｎ ｇ）である
とすれば、生成するＩＦＮ−αの量は２．６Ｘ１０’ｌ
Ｕとなるであろう。１μｇの白血球ポリ（Ａ） ＲＮ
Ａ・は上記の仮定条件の下で５００１ＵのＩ ＦＮ−α
を生成するので、１μｇのポリ（Ａ） ＲＮ Ａ中のＩ
ＦＮ−αｍＲＮＡの濃度はＱ、ｌ ｎ ｇ 〜０．０２
ｎ ｇに低下し、白血球ポリ（Ａ） ＲＮ Ａにおける
ＩＦＮ−ｔｘ ｍ ＲＮ Ａの割合は１ ： １０，０
００〜１ ： ５０．０００となるであろう。したがっ
て、１２μｇのポリ（Ａ） ＲＮ Ａは約１．２ ｎ
ｇ 〜０．２ ｎ ｇのＩＦＮ−ｅｘｍ ＲＮ Ａを含
有する。 卵母細胞中のＩＦＮ−αｍＲＮＡの翻訳比がグロビンｍ
ＲＮＡに対する平均値よりも大きさの次数（ｏｒｄｅｒ
ｏｆ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）だけ低ければ、ポリ（Ａ
） ＲＮ ＡのＩ ＦＮ−ｃｒｍＲＮＡ含量は、上記計
算値よりも１０倍高くなるか、或いは約１＝１０００〜
１ ： ５０００となるであろう。その場合、１２μｇ
のポリ（Ａ＞ ＲＮ Ａは約１２μｇ〜２ｎｇのＩＦＮ
−αｍＲＮＡを含有するであろう、他方、卵母細胞中の
ＩＦＮ−αｍＲＮＡの翻訳比がグロビンｍＲＮＡの平均
値よりも大きさの次数だけ高ければ、ポリ（Ａ＞ ＲＮ
ＡのＩＦＮ−αｍＲＮＡ含量は上記計算値よりも１０
倍低くなるか、或いは約１ ： １００．０００〜１
： ５００，０００となるであろう、その場合、１２μ
ｇのポリ（釣ＲＮＡは０．１ ｎ ｇ 〜０．０２ｎ
ｇのＩ ＦＮ−αｍＲＮＡを含有するであろう。 プラスミドｐＢＲ３２２は４３６ ｌ ｂ、ｐ、を有す
る。ＩＦＮ−αｍＲＮＡの完全ｃＤＮＡは、全部で約５
２００〜５４００ ｂ、ｐ、となるようｐＢＲ３２２−
ＩＦＮ−αｃＤＮＡの生成の際、ｐＢＲ３２２に対し約
８００〜１０００ ｂ、ｐ、を付加するであろう、した
がって、その分子量はＩＦＮ −αｍＲＮＡ単独のそれ
の約１２倍（２Ｘ ５２００／８００）となるであろう
。したがって、上記に計算したＩＦＮ−αｍＲＮＡを結
合して分析に必要な１２μｇのポリ（Ａ＞ ＲＮ Ａ中
に存在させるには、ＩＦＮ−７ｍ ＲＮ Ａの口の１２
倍に等しい組替えＤＮＡ分子の量が必要となるであろう
（化学量論量〕、 組替えＤＮＡ分子を調製するのに使用されるポリ（Ａ）
ＲＮ ＡのＩＦＮ−αｍＲＮＡ含量は粗ポリ（Ａ）
ＲＮ Ａのそれよりも１０〜４０倍増大したので、５１
２個のクローンの群は、上記から計算したよりも１０〜
４０倍多い所望ＩＦＮ−αｍ ＲＮ Ａ含有のクローン
を有する筈である。 ＩＦＮ−ｃｘｍＲＮＡが１０００の粗ポリ（Ａ）ＲＮＡ
のうち１部であれば、１２μｇのポリ（Ａ）Ｒ’ＮＡは
１２μｇのＩＦＮ−αｍＲＮＡを含有しかつ化学量論量
のＩＦＮ−αｃＤＮＡプラスミドは１４４ｎｇである。 ５１２個のクローンの群は少なくとも５個のＩＦＮ−α
ｃＤＮＡ挿入物を含有するので、必要とされる全ヒダリ
ドプラスミドＤＮＡは１４．８μｇ （１４４ｘ５１
２１５ＸＩＯ−”）である、夏ＦＮ−ａｍＲＮＡが１０
．０００のうち１部であれば、１２μｇのポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡは１．２μｇのＩＦＮ−ａｍＲＮＡを含有しかつ必
要とされるＩＦＮ−αｃＤＮＡの量は１４．４ｒｌ ｇ
である。５１２１固のクローンの群は０もしくは１個の
ＩＦＮ−αｃＤＮＡ挿入物を含有し、したがって必要と
される全ヒダリドプラスミドＤＮＡの量は７．４μｇ
（１４，４Ｘ ５１２ Ｘｌ ０− ’ ）である、
ＩＦＮ−αｍＲＮＡが１００．０００のうち１部であれ
ば、必要とされる全ヒダリドプラスミドＤＮＡの量は０
．７４μｇ （１，４４ｘ ５１２ＸＩＯ−”）であ
る、ヒブリド化反応がＤＮＡ過剰条件下（すなわち、ポ
リ（Ａ） ＲＮ Ａに比較して過剰の組替えＤＮＡ）で
進行するよう確保するため、２０μｇの混合物（約１．
４〜３０倍過剰）を分析用に選択した。 ヒブリド化は、（ａｌポリ（Ａ＞ ＲＮ Ａのヒブリド
化された部分が完全かつ生物学的活性の型で回収される
こと、（ｂ）非特異的なりＮＡ−ｍＲＮＡ結合が防止さ
れることおよび（Ｃｌｌヒソド化反応が少なくとも７５
％完結まで進行することを確保するような条件下で行な
わねばならない。これ゛らの条件は、特に８０％ホルム
アミド、０．４ＭＮａＣｌ中におけるヒブリド化により
満たされると思われる〔ジエー・カセイおよびエフ・ダ
ビドソン、「高濃度のホルムアミドにおけるＲＮＡ ：
ＤＮＡおよびＤＮＡ ： ＤＮＡ複合体の生成速度お
よび熱安定性」、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、
第４巻、第１５３９〜１５５２頁（１９７７）〕、この
溶液において、ヒブリド化は約４０℃で行なうことがで
きる（ホルムアミドを省略すると、６０〜７０℃が必要
とされる〕、ポリ＜Ａ＞ ＲＮ Ａに対する損害を最小
にするには、より低温度が好適である。本発明は５６℃
のヒブリド化温度を選択する。これはＴＶ２１より約３
℃低く 〔ジェー・カセイおよびエフ・ダビドソン、上
記〕かつＴ’／２ ａより約１０〜１３℃低い〔ハマグ
チおよびガイヅシエク、ジャーナル・アメリカン・ケミ
カル・ソサイエティ、第８４巻、第１３２９頁〕。した
かって、この温度は約８７％以下のホモロジーをもって
、配列をヒブリド化させない筈である。 何故なら、１％の差はＴ１／２ｄを１℃だけ低下させる
からである〔ティー・エフ・ボナー等、 。 「配列多様化によるＤＮＡ再結合の速度低下」、ジャー
ナル・モレキュラー・バイオロジー、第８１巻、第１２
３〜１３５頁（１９７３）〕、このヒブリド化において
、ＤＮＡの自己ヒブリド化は主たる問題でない。何故な
ら、使用されるＤＮＡの混合物は同じベクター（ｐＢＲ
３２２）および各種のｃＤＮＡ挿入物よりなるからであ
る。したがって、大抵のＤＮＡ配列はへテロ複合体とな
り、ここで挿入物はポリ（Ａ） ＲＮ Ａにヒブリド化
させるのに使用することができる。 異なる複合体の一部を形成する相補的ｃ ＤＮＡ挿入物
は、トポロジー的拘束により殆んど相互作用することが
ない。いずれにせよ、ＤＮＡ ：ＤＮＡ再結合は、使用
反応条件下で最小化される（ジエー・カセイおよびエフ
・ダビドソン、上記〕、 少なくとも７５％反応を確保するのに必要とされるヒブ
リド化時間を決定するため、２次速
インターフェロンの生物学的もしくは免疫学的活性を示
すポリペプチドを生産する宿主およびこれらポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列につき開示する。ＤＮＡ配列
は、ひとインターフェロンの生物学的もしくは免疫学的
活性を示すポリペプチドをコードすることを特徴とする
。適当な宿主において、これらのＤＮＡ配列および組替
えＤＮＡ分子は、ひとインターフェロンの生物学的もし
くは免疫学的活性を示す遺伝子およびポリペプチドの生
産および同定を可能にすると共に、抗ウィルスおよび抗
腫瘍もしくは抗癌剤におけるその使用を可能にする。 ・本発明は、ＤＮＡ配列、組替えＤＮＡ分子ならびにイ
ンターフェロンおよびインターフェロン様ポリペプチド
を産生ずるよう形質転換された宿主に関するものである
。本明細書中に開示する組替えＤＮＡ分子は、ひと白血
球インターフェロンの免疫学的もしくは生物学的活性を
有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を特徴とす
る。以下の記載から明らかになるように、本発明のＤＮ
Ａ配列、組替えＤＮＡ分子およびその製造方法は、抗ウ
ィルス剤および抗ｌｌｆｆ１瘍もしくは抗癌剤ならびに
その製造方法に有用なポリペプチドを製造するのに使用
することができる。 本出願においては、ネイチャー誌第２８６巻、第２４２
１頁（１９８０年７月ｌＯ日）に発表されたインターフ
ェロンという名称を使用する。 この名称により、本出願の優先権となる原出願において
使用された名称を置き換える。たとえば、ＩＰはここで
はＩＦＮで表わされ、白血球インターフェロンはここで
はＩＦＮ−αで表わされる、 インターフェロン（“ＩＦＮ″）は２種類存在すること
が知られている。ｆｕｌｌのインターフェロンは小さい
酸安定性の（グリコ）−一蛋白質であって、細胞をウィ
ルス感染耐性にするものである〔ニー・イサークスおよ
びジェー・リンデンマン「ウィルス干渉１．インターフ
ェロン」、プロシーディング・ロイヤル・ソサイエティ
・シリーズＢ、第１４７巻、第２５８〜２６７頁（１９
５７）およびダブりニー・イー・スチュアート・「、
［ザ・インターフェロン・システム」、スブリンガー
出版（１９７９）（以下、「ザ・インターフェロン・シ
ステム」と云う）〕。ＩＦＮは、成る程度、細胞特異性
である（ザ・インターフェロン・システム第１３５〜１
４５頁）が、ウィルス特異性でない。 寧ろ、ＩＦＮは広範囲のウィルスに対して細胞を保護す
る。 ひとインターフェロン（“ＨｕＩＦＮ’″）は３つの群
α、βおよびγに分類されている。 ＨｕｒＦＮ−αすなわち白血球インターフェロンはひと
白血球中において、リンパ芽球細胞中の少量のＨｕＩＦ
Ｎ−β（繊維芽細胞インターフェロン）と共に生産され
る。ＨｕｌＦＮ−αは均質になるまで精製されかつ特性
化されている〔たとえば、エム・ルーベンスタイン等、
「ひと白血球インターフェロン：生産、均質までの精製
および初期特性化」、プロシーディング・ナショナル・
アカデミ−・サイエンスＵＳＡ。 第７６巻、第６４０〜６４４頁（１９７９）〕、これは
、恐らく炭水化物成分のため、寸法に関しては不均質で
ある。２種の成分が記載されており、その一方は２１．
０００〜２２，０００の分子量を有し、他方はｉｓ、ｏ
ｏｏ〜１Ｂ、０００の分子量を有する。 低分子量の方の成分は非グリコジル化型を示すことが報
告されている。また、より小さいＨｕＩＦＮ−αの型が
Ｈｕ Ｉ ＦＮ−α活性の大部分または全てを保持する
ことも報告されている〔ダブリニー・イー・スチェアー
ト・■等、「ひと白血球インターフェロンの生産および
性質に対するグリコジル化抑制剤の効果」、ピロロジー
、第９７巻、第４７３〜４７６頁（１９７９） 〕、リ
ンパ芽球細胞からの）（ｕ ｒ ＦＮ−αのアミノ酸配
列の一部およびそのアミノ酸組成も報告されている〔ケ
ー・シー・ズーン等、「ひとりシバ芽球細胞インターフ
ェロンの主成分のアミノ末端配列」、サイエンス、第２
０７巻、第５２７〜５２８頁（１９８０）ならびにエム
・バンカピラーおよびエル・フード、私的通信（１９８
０） 〕、さらに、）（ｕｌＦＮ−αは幾つかの異なる
型として存在することも報告されている（たとえば、英
国特許出願第２，０３７，２９６ Ａ号〕、これらの型
は、構造的におよび生理学的に互いに異なっていると思
われる。Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αのこれら型に関し、まだ認
められた名称は採用されていない。したがって、本出願
においては、各型を、−ｉ的なＨｕ Ｉ ＦＮ−αの名
称の後に数字を付して、すなわちＨｕｒＦＮ−αｌまた
はＨｕ ｒ ＦＮ−α３のように記載する。 ）（ｕ Ｉ ＦＮ−αは、多（のひと蛋白質と同様に、
多形質である。したがって、特定個人の細胞はより一般
的なｌ（ｕ Ｉ ＦＮ−α群内におけるＨｕｒＦＮ−α
種を生成することができ、或いはその群内において生理
学的には同じであるがその群とはもしくはその一部であ
る形態とは構造上僅かに異なる形態を生成することがで
きる。 したがって、１（ｕｌＦＮ−αの蛋白質構造は一般的に
は良く規定されているが、特定個人はそれと僅かに異な
るＨｕ Ｔ ＦＮ−αを生成することができ、この対立
形質的変化は恐ら（Ｈｕ ｒ ＦＮ−αの種々の形態間
における相違はど大きいものでない。 ＨｕＩＦＮは、通常、正常もしくは健全な細胞には検出
されない（ザ・インターフェロン・システム、第５５〜
５７頁〕、寧ろ、細胞をＩＦＮ誘発誘発−す結果、蛋白
質が生成される。ＩＦＮ誘発誘発一般にウィルスである
が、性質上非ウィルス性のもの、たとえば天然もしくは
合成の二重鎖ＲＮＡ、Ｉｌｌｌｌ機内微生物生物生成物
および各種の化学薬剤とすることもできる。ひと細胞を
ウィルス感染耐性にすべく、これら非ウィルス性誘発体
を利用する多くの試みがなされている〔ニス・バロンお
よびエフ・ジアンザニ編、テキサス・レポート・オン・
バイオロジー・アンド・メディスン、第３５号（「テキ
サスレポート」）、第５２８〜５４０頁（１９７７））
これらの試みは大して成功を収めていない。寧ろ、現在
では外来性ＨｕｌＦＮの使用が好まれている。 ウィルスおよび腫瘍もしくは癌に対するインターフェロ
ン治療が、種々異なる投与量にてかつ幾つかの投与様式
にて行なわれている〔ザ・インターフェロン・システム
、第３０７〜３１９〕。たとえば、インターフェロンは
、経口的に或いは接種（静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮肉
および皮下）により、或いは点眼薬、軟膏および噴霧剤
の形態で効果的に投与されている。通常１０４〜１０７
単位の投与量で毎日１〜３回投与される。治療程度は、
患者および処置すべき状態に依存する。たとえば、ウィ
ルス感染は通常数日間乃至２週間にわたり毎日もしくは
１０２回投与することにより処置され、腫瘍および癌は
通常数ケ月乃至数年間にわたり毎日または１日多数回投
与することにより処置される。 勿論、成る患者に対し最も有効な治療は、投与。様式お
よび投与量を選択するにあたり、たとえば病気、従前の
治療およびインターフェロンに対する患者の反応など周
知の因子を考慮する担当医師により決定されねばならな
い。 抗ウィルス剤として、ＨｕＩＦＮは次の病気を処置する
ために使用されている：呼吸器感染症（テキサスレポー
ト、第４８６〜４９６頁）、単純庖疹性角膜炎（テキサ
スレポート、第４９７〜５００頁）、急性出血性結膜炎
（テキサスレポート、第５０１〜５１０頁）、水痘性帯
状庖疹（テキサスレポート、第５１１〜５１５頁）、巨
大ウィルス感染症（テキサスレポート、第５２３〜５２
７頁）、およびＢ型肝炎（テキサスレポート、第５１６
〜５２２頁〕、ザ・インターフェロン・システム、第３
０７〜３１９頁も参照できる。しかしながら、抗ウィル
ス剤としてのｒＦＮの大規模な使用は、従来入手し得る
よりも多量のＩＦＮを必要とする。 ＨｕＩＦＮは、その抗ウィルス作用に加えて、池の効果
をも有する。たとえば、これはコロニー刺戟因子の効果
に措抗し、造血性コロニー形成細胞の成長を抑制し、か
つまた顆粒球および大食法先駆体の正常分化を阻害する
（テキサスレポート、第３４３〜３４９頁〕、さらに、
これはＤＭＳＯ処理されたフレンド白血病細胞における
赤血球分化を抑制する（テキサスレポート、第４２０〜
４２８頁〕、また、ＨｕｌＦＮは、免疫反応の調整に役
割を演する。抗原に対する施用の量と時間とに応じて、
ＨｕｌＦＮ−αは生体内および試験管内において免疫促
進的にも或いは免疫抑制的にもなりうる（テキサスレポ
ート、第３５７〜３６９頁〕、さらに、特異的に感応さ
れたリンパ芽細胞は、抗原に接触すると、Ｈｕ Ｉ Ｆ
Ｎ−αを生成することが観察された。したがって、この
種の抗原誘発されたＨｕＩＦＮ−αは免疫反応の調節体
となり、循環抗原レベルと細胞免疫性の発現との両者に
作用することができる（テキサスレポート、第３７０〜
３７４頁〕、さらに、Ｈｕ Ｉ ＦＮはキラーリンパ球
の活性および抗体依存性の細胞媒介される細胞毒性を高
めることも知られている〔 アール・アール・ハーバ−
マン等、「ひと天然および抗体依存性細胞媒介細胞毒性
のインターフェロンによる促進」、ネイチャー誌、第２
７７巻、第２２１〜２２３頁（１９７９）；ピー・ビバ
リーおよびディー・ナイト、「死亡は自然に起こる」、
ネイチャー誌、第２７８巻、第１１９〜１２０頁（１９
７９）；テキサスレポート、第３７０〜３７４頁〕。こ
れらの両種類は恐らく、腫瘍細胞に対する免疫学的攻撃
に含まれる。 したがって、ひと抗ウィルス剤としての使用に加え、Ｈ
ｕＩＦＮ！：ｌ！抗腫瘍および抗癌治療において有力な
用途を有する（ザ・インターフェロン・システム、第３
１９〜３２１頁〕、’ＥＪＡ在、ＩＦＮは多くの動物に
おける多くの種類のｌ１ｆｆｉ瘍 ゛の成長に影響を
与えることが知られている（ザ・インターフェロン・シ
ステム、１２９２〜３０４頁〕、それらは、他の抗腫瘍
剤と同様、小腫瘍に対して使用された場合、特に効果的
であると思われる。動物ＩＦＮの抗腫瘍効果は投与量と
時間とに左右されるが、これは毒性レベル以下の濃度で
示されたものである。したがって、ＩＦＮの抗腫瘍およ
び抗癌性につき多くの研究および臨床試験が過去に行な
われ、現在も行なわれ続けている。これらには、たとえ
ば骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫およびホジ
キンス病のような幾つかの悪性疾患の処置が包含される
（テキサスレポート、第４２９〜４３５頁〕、さらに、
ＨｕＩＦＮは、黒腫症および胸部癌に侵された患者にお
ける皮下腫瘍結節に注射すると、局部腫瘍退化をもたら
すことが最近示された〔ティー・ネモト等、「黒腫症お
よび胸部癌のひとインターフェロンおよび内部治療」、
アメリカン・アソシエーション・フォー・カンサー・リ
サーチ、アブストラクト、第９９４号、第２４６頁（１
９７９）〕、これら臨床試験の結果は好ましいものであ
ったが、ＩＦＨの抗腫瘍および抗癌用途は、精製ＩＦＮ
の充分な供給が得られないため、著しく妨げられている
。 今日、Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αは、組織培養で増殖させたひ
と細胞を介して、或いは供血者から集めたひと白血球を
介して生産される。２．６Ｘ１０’ＩＵの粗製ＨｕＩＦ
Ｎ−ｔｘが８００βの培養ナマルバ（ｌＪａＢａｌｖａ
）細胞から得られることが報告されている（ピー・ジ
ェー・ブリッジエン等、上記〕、極めて大きな血液セン
ター、たとえばフィンランド国ヘルシンキ在のフィンラ
ンド赤十字センターでは、その生産能力は年間的１０１
１ＩＵの粗製ＨｕｌＦＮ−αである。投与量は典型的に
は１患者当り毎日３Ｘ１０’ ＩＵであるから、これ
ら供給源はＨｕ Ｔ ＦＮ−αの必要市販量をまかなう
には不充分である。したがって、他の方法によるＨｕＩ
ＦＮ−αの生産が望まれる。ＩＦＮ−αの比活性は高く
、４．０Ｘ１０”〜１０’ＴＵ／ｗの程度であるため、
一般用途に必要とされる１（ｕＩＦＮ−αの量は少なく
なる。たとえば、１００ｇの純ＨｕｌＦＮ−ｏｒは３〜
３０Ｘ１００万回の投与量をまかなうであろう。 分子生物学における最近の進歩により、特異性の非細菌
性成熟核蛋白質をコード化するＤＮＡを細菌細胞中に導
入することが可能となった。 一般に、化学合成により製造されたちの以外のＤＮＡに
よれば、この種の組替えＤＮＡ分子の製造は、所望蛋白
質に対する精製メツセンジャーＲＮＡ （、ｍＲＮＡ）
雛型の単一鎖ＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を生成させ、こ
のｃＤＮＡを二重ｌＤＮＡに変え、このＤＮＡを適当な
りローン化ベヒクルにおける適当な部位に結合させて組
替えＤＮＡ分子を形成させかつこの組替えＤＮＡ分子に
より適当な宿主を形質転換させるという過程からなって
いる。このような形質転換は、宿主が所望蛋白質を生産
するのを可能にする。 数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、大腸菌（イー・
コリ）において組替えＤＮＡ技術を用いて得られている
。これらには、ラッテプロインシュリン抗原決定因子を
示す蛋白質〔エル・ビラーカマロフ等、「プロインシュ
リンを合成する細菌クローン」、プロシーディング・ナ
ショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ。 第７５巻、第３７２７〜３７３１頁（１９７８））、ラ
ッチ成長ホルモン〔ビー・エッチ・シーブルグ等、「細
菌による成長ホルモンの合成」、ネイチャー誌、第２７
６巻、第７９５〜７９８頁（１９７Ｂ））、ねずみジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ〔ニー・シー・ワイ・チヤツプ等
、「ねずみジヒドロ葉酸レダクターゼを暗号化するＤＮ
Ａ配列の、大腸菌（イー・コリ）における発現型」、ネ
イチャー誌、第２７５巻、第６１７〜６２４ｉ（１９７
８））、ひとソマトスタチン〔ケー・イタクラ等、「ソ
マトスタチンホルモンに対する化学合成遺伝子の大腸菌
における発現」、サイエンス誌、第１９８巻、第１０５
６〜１０６３頁（１９７７）、およびヨーロッパ特許出
願第０．００１．９２９号、第０．００１，９３０号お
よび第０．００１，９３１号ならびに他国における対応
出願〕、ひとインシュリンのＡおよびＢポリペプチド鎖
〔ディー・ヴイー・ゲデル等、「ひとインシュリンに対
する化学合成遺伝子の大腸菌における発現」、プロシー
ディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳ
Ａ、第７６巻、第１０６〜１１０頁（１９７９）、なら
びにヨーロッパおよび関連特許出願明細書（上記）〕、
ひとＢ型肝炎ウィルスの抗原〔シー・ディー・バレル等
、「プラスミドｐＢＲ３２２においてクローン化された
Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡ配列−大腸菌における発現」、
ネイチャー誌、第２７９巻、第４３〜４７頁（１９７９
）ならびにエム・パセク等、「Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子
および大腸菌におけるその発現」、ネイチャー誌、第２
８２巻、第５７５〜５７９頁（１９７９））、ひと成長
ホルモン（ディー・ヴイー・ゲデル等、「ひと成長ホル
モンをコードするＤＮＡ配列の大腸菌における直接的発
現」、ネイチャー誌、第２８１巻、第５４４〜５５１頁
（１９７９））、ＳＶ４０を抗［（ティー・エム・ロバ
ーツ等、「大腸菌における猿ウィルス４０を抗原の合成
」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイ
エンス・ＵＳＡ、第７６巻、第５５９６〜５６００頁（
１９７９））、ならびにひと繊維芽細胞インターフェロ
ン（ＨｕｌＦＮ−β）〔ティー・タニグチ等、「ひと繊
維芽細胞インターフェロン遺伝子配列を含有する細菌プ
ラスミドの製造および同定」、プロシーディング・ジャ
パン・アカデミ−１第５５巻Ｂ号、第４６４〜４６９頁
（１９７９）および私的通信（１９８０） ）が包含さ
れる。 しかしながら、これら組替えＤＮＡ法のいずれも、本発
明におけるように、Ｉ−１ｕ Ｉ Ｆ Ｎ−αの合成に
向けられていない。これが、本発明の目標とする課題で
ある。この解決は、合成遺伝子（たとえばソマトスフチ
ン）を調製するのに必要とされる配列情報を入手するこ
とによる、或いは特定ＤＮＡ配列の豊富な細胞型もしく
はウィルス（たとえば肝炎ウィルス抗原）または所望ヒ
ブリドＤＮＡを含有する細菌クローンの調製および同定
を可能にするｍＲＮＡ種（たとえばラッテインシュリン
）を入手することによる、或いは所望蛋白質（たとえば
ねずみジヒドロ葉酸レダクターゼ）を発現する大腸菌宿
主の選択を可能にする系を入手することによる上記の組
替えＤＮＡ系におけるようには簡単でない。 さらに、卵母細胞においてＨｕｌＦＮ−β活性（たとえ
ば、繊維芽細胞インターフェロン）をもたらすｍＲＮＡ
にポリ（Ａ） ＲＮ Ａからヒブリド化するようなりＮ
Ａ配列を含有すると云われるプラスミドの報告は、何ら
役に立たない。また、本発明の解決法は、純粋もしくは
ほぼ純粋なＨｕ ｒ ＦＮ−αｍＲＮＡをＨｕｌＦＮ−
ｃｘ遺伝子のクローン化前に調製するための研究報告第
１８３０９号、第３６１〜３６２頁（１９７９）におｉ
する示唆とは異なる目的を有する。 最後に、ＤＮＡ配列の選択または卵母細胞においてＨｕ
ＩＦＮ活性をもたらすようなｍＲＮＡにポリ（Ａ＞ Ｒ
Ｎ Ａからヒブリド化する組替えＤＮＡ分子の調製は、
ＤＮＡ配列または組替えＤＮＡ分子のヒブリド挿入物が
Ｈｕ Ｉ ＦＮに相当することを示すには充分でないこ
とを認めるべきである。寧ろ、１（ｕｌＦＮの免疫学的
もしくは生物学的活性を示すポリペプチドの生成によっ
てのみ、選択ＤＮＡ配列もしくは構成組替えＤＮＡ分子
がＨｕ Ｉ ＦＮに相当することが実際に示される。さ
らに重要なことは、ＨｕＩＦＮ作用の後にのみＤＮＡ配
列、組替えＤＮＡ分子またはそれに関連する配列を用い
て本発明の）（ｕｌＦＮに対応する他の配列を選択しう
ろことが示される点である。 したがって、組替えＤＮＡ技術を使用、してＨｕｌＦＮ
−αを生産する問題は上記した方法のいずれとも極めて
異なることが、上記から判るであろう。ここでは、未知
構造の特定ＤＮＡ配列（適当な宿主においてＨｕＩＦＮ
−αの発現をコードする）を、極めて複雑なりＮＡ配列
の混合物において見出しかつそこから分離してこれをＨ
ｕｌＦＮ−αの生産に使用する。さらに、この位置決定
および分離の問題は、複合混合物において所望ＤＮＡ配
列の著しい低濃度が予想されること、および所望配列を
選択しかつ分離するため混合物の多くのＤＮＡ配列を迅
速分析する有効手段がないことにより悪化される。 本発明は、適当な宿主においてＨｕＩＦＮ−αの発現を
コードするＤＮＡ配列を決定しかつ分離しそれによりＤ
ＮＡ配列と、組替えＤＮＡ分子と、宿主を形質転換させ
てひと白血球インターフェロンの免疫学的もしくは生物
学的活性を示すポリペプチドを生産する方法とを提供す
ることにより、上記の問題を解決する。 本発明により、抗ウィルス剤、抗腫瘍または抗癌剤およ
び方法に使用するための、ＨｕｌＦＮ’−αの免疫学的
もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを得ることが
できる。本発明は、従来不可能であった量および方法で
これらポリペプチドの生産を可能にする。 以下の開示から判るように、本発明のＤＮＡ配列および
組替えＤＮＡ分子は、Ｈｕ Ｔ Ｆ Ｎ −αの免疫学
的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドの、適当な
宿主における生産を方向付けることができる。適当な宿
主におけるこれらＤＮＡ配列と組替えＤＮＡ分子との複
製は、これらポリペプチドをコードする遺伝子を多量に
生産することを可能にする。これらポリペプチドおよび
遺伝子の分子構造および性質は、容易に決定することが
できる。ポリペプチドおよび遺伝子は、宿主で生産され
たまま或いは適当な誘導化もしくは改変の後、組成物中
におよびこれら生成物自身の生産を検知かつ改善する方
法に使用することができ、かつ抗ウィルス剤および抗腫
瘍もしくは抗癌剤および方法に使用することができる。 したがって、この方法は、上記の従来方法とは異なり、
ＤＮＡ配列とＨｕ Ｉ ＦＮ−αの免疫学的もしくは生
物学的活性を示す少なくとも一種のポリペプチドをコー
ドする適当なりＮＡ配列を含んだ組替えＤＮＡ分子との
調製および選択を含む点において、上記従来方法と区別
できる。 上記から判るように、本発明の基本的局面は、Ｈｕ Ｉ
Ｆ Ｎの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペ
プチドをコードすることを特徴としかつＺ−ｐＢＲ３２
２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−４ｃＸＺ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓｔ）／ＨｃＩＦ−２ｈ、Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ
）／Ｈｃ ＩＦ−ＳＮ３５、Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ４２、Ｚ−ｐＫ７２８７ （Ｐ
ｓ ｔ）／Ｈｃ Ｉ Ｆ−２ｈ−ＡＨ６のＤＮＡ挿入物
と、これらＤＮＡ挿入物のいずれかにヒブリド化するＤ
ＮＡ配列と、これらＤＮＡ配列もしくは挿入物のいずれ
かに対し単一もしくは多重のベース置換、欠失、挿入お
よび転位を含め突然変異に関連して得られる天然、合成
もしくは半合成の供給源を包含するあらゆる供給源から
のＤＮＡ配列と、前記ＤＮＡ配列および挿入物のいずれ
かのコドンの発現においてコードされるポリペプチドに
類似した免疫学的もしくは生物学的活性を発現において
コードするコドンの配列からなるＤＮＡ配列とよりなる
群から選択されるＤＮＡ配列を提供することであり、こ
れらの配列は宿主においてインターフェロンおよびイン
ターフェロン様ポリペプチドの生産を可能にする。 ここに記載した本発明をより充分に理解するため、以下
詳細に説明する。 本明細書中において、次の用語を使用する。 ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸塩と含窒素
複素環塩基とからなるＤＮＡもしくはＲＮＡの単量体単
位。塩基は、グルコシド炭朱（ペントースの１′炭素）
を介して糖成分に結合される。塩基と糖との結合体はヌ
クレオシドと呼ばれる。各ヌクレオチドはその塩基を特
徴とする。４種のＤＮＡ塩基はアデニン（“Ａ”）、ク
アニン（“Ｇ”）、シトシン（“Ｃ”）およびチミン（
“Ｔ″）である。４種のＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよび
・ウラシル（Ｕ”）である。 ＤＮＡ配列：隣接ペントースの３′炭素と５′炭素との
間のホスホジエステル結合により互いに結合されたヌク
レオチドの線状列。 コドン：ｍＲＮＡを介してアミノ酸と翻訳開始信号と翻
訳終了信号とをコードする３種のヌクレオチド（トリプ
レット）のＤＮＡ配列。たとえばヌクレオチドトリプレ
ットＴＴＡＳＴＴＧ。 ＣＴＴ、ＣＴＣＳＣＴＡおよびＣＴＣはアミノ酸ロイシ
ン（”Ｌｅｕ″）をコードし、ＴＡＧ。 ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であり、ＡＴＧは翻
訳開始信号である。 解読枠ニアミノ酸配列までｍ ＲＮ Ａを翻訳する際の
コドンのグループ化。翻訳の際、通切な解読枠を維持せ
ねばならない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡ
Ｇは３つの解読枠（すなわち相）において翻訳すること
ができ、その各々は異なるアミノ酸配列 ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ−−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ −Ｖａ Ｉ −Ｖａ Ｉ ＧＣＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −−Ｔ
ｒｐ−Ｌｅｕ−（停止） を与える。 ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカル
ボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合され
たアミノ酸の線状列。 ゲノム：細胞もしくはウィルスの全Ｄ Ｎ Ａ。 これは、特に物質のポリペプチドをコードする構造遣１
云子、ならびにオペレータ、プロモータおよびリポソー
ム結合ならびにたとえばシャインーダルガーノ配列のよ
うな配列を含めて相互作用配列を包含する。 構造遺伝子：雛型もしくはメツセンジャー・ＲＮＡ （
“ｍＲＮＡ”）を介して、特定ポリペプチドに特徴的な
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。 転写：構造遺伝子からｍＲＮＡを生成する過程。 ６１１訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成する過程。 発現：ポリペプチドを生成するため構造遺伝子により受
ける過程。これは、転写と翻訳との紹合せである。 プラスミド：完全「レプリコン」からなる非りロモソー
ムニ重［ＤＮＡ配列であり、これによりプラスミドは宿
主細胞内で複製される。プラスミドを単細胞微生物に入
れると、その生物の特性がプラスミドのＤＮＡ挿入の結
果として変化または形質転換する。たとえば、テトラサ
イクリン耐性（ＴｅｔＲ）についての遺伝子を担持する
プラスミドは従前テトラサイタリンに感受性であった細
胞をこれに対し抵抗性の細胞に形質転換させる。プラス
ミドにより形質転換された細胞を「（形質転換体）」と
呼ぶ。 ファージまたはバクテリオファージ：細菌性ウィルスで
あり、その多くは蛋白質エンベロブもしくは被覆（「カ
プシド」）中にカプセル化されたＤＮＡ配列からなって
いる。 クローン化ベヒクル（ｃ１０ｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅ
） ：宿主細胞中で複製しうるプラスミド、ファー
ジＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であり、これは１個
または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、
この部位においてこのＤＮＡ配列はＤＮＡの本質的な生
物学的機能（たとえば再現性）、被覆蛋白質の生成の喪
失またはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴わずに
決定可能に切断され、またこの部位は形質転換細胞の同
定（たとえばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン
耐性）に使用するのに適する標識を有する。クローン化
ベヒクルはしばしばベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれ
る。 クローン化：微生物またはＤＮＡ配列の増殖を得る過程
であって、無性増殖によりこの種の一種の微生物または
配列から得られる。 組替えＤＮＡ分子すなわちヒブリドＤＮＡ？生体細胞の
外部で末端−末端結合されかつ宿主細胞に感染してそこ
に維持される能力を有する、異なるゲノムからのＤＮＡ
断片よりなる分子。 発現制御配列：構造遺伝子と作用結合した場合これら遺
伝子の発現を制御および調整するヌクレオチドの配列。 それらには、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ファージλの主要オ
ペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白質の制
御領域ならびに原核もしくは真核細胞およびウィルスの
遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配列が
包含される。 第１図について述べれば、これは組替えＤＮＡ分子の混
合物の製造方法における一実施態様の概略図であり、こ
こで組替えＤＮＡ分子の幾つかはひと白血球インターフ
ェロンの免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペ
プチドをコードする挿入ＤＮＡ配列を特徴とする。 センダイ （Ｓｅｎｄａｉ）ウィルスを用いてひと白血
球を３７℃で５時間誘発させ、次いで抽出してひと白血
球インターフェロンｍＲＮＡ （’ＨｕＩＦＮ−αｍＲ
ＮＡ”）を含有するポリ（Ａ） ＲＮ Ａ混合物を得た
。誘発はカンチル法によって行なった〔ザ・インターフ
ェロン・システム、第１３０〜１３１頁およびそこに挙
げられた引用文献〕。ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ 混合物を
、その実際の割合とは無関係に第１図に示す。誘発白血
球を収量し、１０’Ｍ［Ｉのｍ胞を水１１中ＮａＣｌ８
ｇとＭＣＩ ０．２ｇとＮａ２ ＨＰＯ４−２Ｈ２０
１，１５ｇ 、！： Ｋ Ｈ２Ｐ Ｏや０．２ ｇとを
熔解含有する溶液（ＰＢＰ″）１１に再懸濁させ、これ
を激しく既拌しながら５０１分液濾斗中の２０ｍＭトリ
ス−ＨＣ１（ｐＨ７，５＞と１ｍＭ ＥＤＴＡ（“Ｔ
Ｅ緩衝液″）と２％ドデシル硫酸ナトリウム（“ＳＤＳ
”）の１７４２に加えた。自己消化したプロナーゼ（カ
ルビオケム社）を２００μｇ／ｍｌまで加え、そしてこ
の溶液を室温で１時間攪拌した。１０６カウント／分（
“ｃｐｍ”）の１１２５−グロビンｍＲＮＡを、ポリ（
Ａ） ＲＮ Ａを回収しかつ次工程におけるｍＲＮＡ分
解を管理するための標識として加えた。全容量の１／２
０に等しい量（“１／２０容量”）の２Ｍ）リス−Ｉ（
ＣＩ （ｐＨ９）を加え、そして混合物を１５２の再
蒸留フェノールにより激しく攪拌しながら１０分間抽出
した。３Ｉｌのクロロホルムを加えて混合物を５分間攪
拌した。３０分間相分離させた後、水相を除去して再び
フェノールとクロロホルムとで抽出した。得られた水相
は全部で１９．Ｈ！であり、これを６０ｇのＳＤＳと合
した。この水相から、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐｎｓ、ｓ ）と２容量のエタノールとによって核
酸を沈澱させた。 一２０℃で一晩保存した後、プラスチック製篩を通して
の濾過により繊維状の核酸沈澱を取出した。次いでこの
物質を、０．５％ＳＯ３を含有する２００ｍ１のＴＮＥ
（５０ｍＭ）リス−ＩＴＣＩ （ｐＨ７，５）、１
００ｍＭ ＮａＣ１，５ｍＭ ＥＤＴＡ）と共に攪
拌した。次いでこれを、さらにこの溶液３５０ｍ１の添
加により熔解させた。非繊維状沈澱を、ツルバールＲＣ
−３型遠心分離器において１１ツルバール瓶中に５００
Ｏｒｐｍにて１５分間遠心分離することにより集め、
０．５％ＳＤＳを含有するＴＮＥ３５０ｍｌ中に熔解さ
せた。２つのＴＨＥ溶液を合し、そして１容量のフェノ
ールで３回、１／２容歪のエーテルで３回および１容量
のエーテルで３回それぞれ抽出した。水相からのＲＮ
Ａ回収は、２６０ ｎｍでの吸光度により測定して全部
で７７５■であった。 ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ混合物の単離は、オリゴ（ｄＴ）
セルロース（タイプ７、Ｐ−Ｌビオケミカル社）に対す
る反復バッチ吸着により行なった。２．７ｇのオリゴ（
ｄＴ）セルロースを、５００ｍ１すなわち上記のＲＮＡ
含有溶液の約半量に加えた。 室温で１時間攪拌してポリ（Ａ） ＲＮ Ａをオリゴ（
ｄＴ）セルロースに吸着させた後、セルロースとこれに
結合されたｍＲＮＡの混合物とを遠心分離によって集め
、５０ｍ１のＴＨＥで１回、次いで１５ｍ１のＴＮＥで
１回洗浄した。次いで、結合したポリ（Ａ） ＲＮ Ａ
を、Ｈ２０２ｍｌテア７） ５回連続洗浄によって溶出
させた。収量は、光学密一度で測定してポリ（Ａ＞ＲＮ
Ａ８６０μｇであった（調製物Ａ〕、第一吸着から得た
上：／ＲＲＮＡ熔液を、正確に上記と同様にしてさらに
２回の吸着サイクルにかけた。第二および第三吸着は、
それぞれ６００μｇおよび１７０μｇのＲＮＡを与え、
これらを合した（調製物Ｂ〕、Ｔ？ＮＡをクセノプス・
レビ、ス（Ｘｅｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉｓ）の卵母細胞
に注入してＨｕＩＦＮ−αｍＲＮＡにつき分析した（ザ
・インターフェロン・システム、第９３〜９５頁’）、
ＲＮＡを１５ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７，５） 、８
８ｍＭ Ｎａ Ｃ１（“ＴＮＫ緩衝液”）に溶解させ
て約１ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。この溶液５０ｎｊ２を
各５０ｆＩｌの卵母細胞中に注入した。これら卵母細胞
をパース（Ｂａｒｔｈ ）培地において室温で一晩培養
した〔ゴートン、ジャーナル・エムブリオール・アンド
・エキスベリメンタル・モーホロジー、第２０巻、第４
０１〜４１４頁（１９６Ｂ）および同第７巻、第２１０
〜２２２頁（１９５９）〕、次いで、培養卵母細胞を洗
浄し、パッスールビペノトを用い１．５ ｍｌエッペン
ドルフ遠心分離管中で０．５ ｍｌの５２ｍＭ）リスグ
リシン＞１ 街？皮（ｐＨ８，９）中においてホモジナ
イズした。混合物をエッペンドルフ遠心分離器にて２分
間遠心分離し、上澄液を抜き取りそして一２０℃で凍結
させて分析した。ＩＦＮ−α活性はプラーク減少分析に
よって測定した〔エッチ・ストランダ−およびケー・カ
ンチル、「試験管中におけるひと白血球によるインター
フェロンの生産」、Ａｎｎ、Ｍｅｄ、ｅｘｐ、Ｆｅｎｎ
、 、−第４４巻、第２６５〜２７３頁（１９６６）〕
、１単位のＩＦＮ−αはウィルスプラークを５０％減少
させる。ＩＦＮ−α調製物の活性は、ひと基準Ｈｕ Ｉ
ＦＮ−α６９／１９に関して表わす〔インターフェロ
ンおよびインターフェロン誘発剤の基準化に関する国際
シンポジュウム、１９６９）、代案として、分析は主と
して次の文献に記載された細胞病理学的効果の減少に基
づいて行ない〔ダブリュー・イー・スチェアート・■お
よびニス・イー・スルキン、「ラビースウイルスを実験
的に感染させたハムスターにおけるインターフェロン生
産」、プロシーディング・ソサイエティ・エキスペリメ
ンタル・バイオロジカル・メディスン、第１２３１＝、
！６５０〜６５３頁（１９６６））、ただしこの場合ひ
とＣＣＬ−２３Ｉｌｔ胞を使用しかつメンゴウイルスを
用いて実験した。卵母細胞抽出物は、注入ＲＮＡの１μ
ｇ当り３００１ＵのＩ ＦＮ−α活性を有した。後者の
分析においては、注入卵母細胞の培養を４８時間行ない
、大部分のインターフェロンが卵母細胞により分泌され
るため、培養培地のみを分析した〔ニー・コールマンお
よびリュー・モルサー、「キセノブス・レビスの卵母細
胞からの蛋白質の分泌」、セル化、第１７巻、第５１７
〜５２６頁（１９７９）〕、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａをさ
らに精製するため、充分量の０．５Ｍエチレンジアミン
テトラ酢酸（ＥＤＴＡをポリ（Ａ） ＲＮ Ａ ｉ慰物
Ａに加えて濃度を５ｍＭＥＤＴＡにした。得られた溶液
を等容量のＴＮＥ−飽和フェノールで２回および等容量
のエーテルで５回抽出した。次いで、これを０．１ｍｌ
のチェレックス−１００ビオ−ラドカラム（Ｃｈｅｌｅ
ｘ −１００Ｂｉｏ −Ｒａｄ ｃｏｌｕｍｎ）に通し
、１００℃にて９０秒間加熱し、そして５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）と１ｍＭ ＥＤＴＡと０
．２Ｍ ＮａＣ１とを含有する１３ｍ１の５〜２３％
蔗糖濃度勾配に曝した。制限酵素Ｈｉｎｄ■とＰｓｔｌ
とによりｐＢＲ３２２を同時切断して生成させた５′
−末端ｐ３２ラベルしたＤ Ｎ Ａ ｌｌｆｒ片にュー
イングランドビオラブス社）の１０． ＯＯＯｃｐｍを
サイズ標識として加えた。５Ｗ４０型ロータで１０℃か
つ３５．００Ｏｒｐｍにて１６時間遠心分離した。フラ
クション（０，６ｍｌづつ）をｌ５ＣＯグラジエントコ
レクターにより１ｍｌ／ａｋｉｎ、の速度で集めた。こ
れらのフラクションを上記したように、ＨｕＩＦＮ−α
ｍＲＮＡ活性）につき分析し、Ｐ” ２−ＤＮＡ標識に
対するそれらあ位置を、後の参考のため記録した。後の
遠心分離において、Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αｍＲＮＡ含有フ
ラクションを標識と比較して同定した。 ＨｕｌＦＮ−αｍＲＮＡ活性を有するフラクションは８
０μｇのポリ（Ａ） ＲＮ Ａを含有した。これらを、
０．５％ＳＤＳおよび０．０２％ポリビニルサルフェー
ト（１＆の調製においてはポリビニルサルフェートを省
略した）を含有する２容量のＴＨＥと混合し、５０μｌ
のオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに加えた。上記した
ようにカラムを洗浄した後、ＲＮＡ混杏物４０μｇを０
．６ｍｌの無菌蒸留水で４回洗浄して溶出させた。エタ
ノール沈澱させた後、ＲＮＡを０．５ｍＭのＦ、ＤＴＡ
中にＩｍｇ／ｍｌとなるようン容解させた。 Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ −ｅｘ ｍ ＲＮ Ａ活性の分析を
、上記したように、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ沈澱の一部に
ついて行なった。これは、注入ＲＮＡＩμｇ当り３６０
０ＩＵのインターフェロンの比活性を有した。したがっ
て、蔗糖濃度勾配は、ポリ（Ａ） ＲＮ ＡをＨｕ Ｉ
ＦＮ−αｍＲＮＡに関し約１０倍濃化させた。次の同
様な調製において、約４０倍の濃化が得られた。調製物
Ｂを同様に精製し、そしてこれは調製物Ａと同様な比活
性を有したので、両者をプールした。 この時点において、蔗糖濃度勾配処理から得られたポリ
（〜ＲＮＡ生成物でさえ極めて多数の異なるｍＲＮＡを
含有することを認めるべきである。ＩＦＮ−αに対して
特異的なｍＲＮＡを除き、他のｍＲＮＡは望ましくない
汚染物である（第１図〕、不都合なことに、これら汚染
ＲＮＡは、本発明の残余のクローン化過程全体において
Ｈｕ Ｔ ＦＮ−αｍＲＮＡと同様に挙動する。したが
って、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ中にそれらが存在すると、
ＩＦＮ−α以外のポリペプチドをコードする遺伝子を含
有する多数の望ましくない細菌クローンの最終的調製物
が生ずる。この汚染は、所望のＩＦＮ−αヒブリドクロ
ーンの単離において複雑な選別問題を提起する。ＩＦＮ
−αの場合、この選別問題は、所望クローンを同定する
ための選別比較試料として作用するＨｕＩＦＮ−αｍＲ
ＮＡまたはＤＮＡもしくはその一部の精製試料が充分存
在しないためさらに悪化する。したがって、ＩＦＮ−α
クローンの選別過程は極、めて時間がかかりかつ困難と
なる。さらに、極めて少割合のＩＦＮ−αクローンしか
住物学的活性型または免疫学的活性型においてＩＦＮ−
αを発現することが期待されないので、活性クローンの
単離はわら山から針を探すような選別過程になる。 有利なことに、本発明は組・替えＤＮＡ技術を用いて、
Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−ｃｒｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしく
はその一部の精製試料を得ることができる。この精製ｍ
ＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用して極めて多数の細菌クロ
ーンを迅速に選別しかつそれにより活性型でＩＦＮ−α
を発現するクローンを単離する確率が著しく増大する。 Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αｃＤＮＡを するｃＤＮＡ混合物
の合成 ＩＦＮ−αｍＲＮＡが濃化されたポリ（Ａ） ＲＮ Ａ
調製物（Ａ＋Ｂ）を雛型として使用して、単一鎖の相補
ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）を調製した（第１図）〔ニー・エ
フストラチアジス等、［グロビンおよびコリオンｍＲＮ
Ａの全体的および個々の部分的な逆転写」；セル誌、第
４巻、第３６７〜３７８頁（１９７５）およびそこに引
用されている文献〕。８００μｌの反応混合物は４０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）と、３０ｍＭの
ＮａＣｌと、５ｍＭのＭｇＣ１□と、０．５ ｍ、Ｍの
ＤＴＴ （カルビオケム社）と、２０μｇ／ｍｌのオリ
ゴ（ｄＴ）１２〜１８（Ｐ＆Ｌビオケミカルス社）と、
５ｍＭのｄＧＴＰ （シュワルツ社） 、ｄＣＴＰ （
レボサン社）およびｄＴＴＰ（シグマ社）と、５ｍＭの
Ｐ” −ｄＡＴＰ（ＮＥＮ、比活性１００．０００ ｃ
ｐｓ ／ ｎ ％７Ｌ／）と、６０μｇ／鵡１のポリ（
Ａ） ＲＮ Ａと、２８０単位の鳥類骨髄芽球症ウィル
ス（ＡＭＶ）逆転写酵素〔フロリダ州セントピータース
ブルグ在うイフサイエンス社から寄贈〕とを含有した。 ３７℃゛で１時間培養した後、０．５Ｍ（７）ＥＤＴＡ
と２０％のＳＤＳ （再結晶したもの）を１０ｍＭのＥ
ＤＴＡおよび０．１％のＳＤＳまで加えた。この混合物
を１容量のフェノール（蒸留物）で抽出した。フェノー
ル相を２００μ戸の２００ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７
，５）と１ｍＭ ＥＤＴＡと０．１％ＳＤＳとで洗浄
し、水相を合した。これらを等容量のエーテル（フルカ
社、プロアナル）で抽出し、ＴＮＥ中５ｍｌのセファデ
ックスｃ−ｔｏｏカラムにてクロマトグラフにかけた。 ０．１ ｍｌづつのフラクションを０．３ ｍｌ／ ｍ
ｉｎ 、の速度で集めた。放射能（セレンコツ放射線に
より測定）を示すフラクションを合し、３Ｍの酢酸ナト
リウムを０．３ Ｍまで加えた。この核酸を２．５容量
のエタノールで沈澱させた。−２０℃で一晩保存した後
、試料を遠心分離しそして上澄液を捨てた。この沈澱を
１８０μｌの蒸留水中に熔解させ、シリコーンライニン
グしたエフペンドルフ管に移した。２０μｌの５Ｍ
ＮａＯＨを加え、混合物を室温で４０分間保った。２０
μｌの５Ｍ酢酸ナトリウムと１００μｌの蒸留水と５０
０μｌのエタノールとを加えた。−２０℃にて一晩冷却
した後、生じた沈澱を重力の１０．０００倍（１０，０
００ｘ ｇ ）に相当する力で０℃にて２０分間遠心分
離することにより、回収した。 単一鎖ｃＤＮＡの収量は１０μｇであった。 ここでも、上記のように調製した単一鎖ｃ ＤＮＡ生成
物は実際的に、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ混合物中に存在す
る対応のｍＲＮＡから転写された多数の異なるｃＤＮＡ
の複合混合物であることを理解すべきである（第１図〕
、これらｃＤＮＡのうち極めて少量のみがＩＦＮ−α関
連性、すなわちＨｕｌＦＮ−αｃＤＮＡである。他の要
因も作用してｃＤＮＡ混合物を複雑化させ、ポリ（Ａ）
ＲＮＡ混合物の各ｍＲＮＡ種は通常完全には転写されな
い。寧ろ、各ｍＲＮＡ種に関し、転写過程はｍＲＮＡの
末端に達する前に停止することがある。したがって、各
ｍＲＮＡ種から多種類のｃＤＮＡが生成されうる（第１
図に示さず〕、各種類は後のクローン化過程において多
かれ少なかれ同様に挙動し、したがって特定蛋白質に関
する遺伝子の断片のみを有する組替えＤＮＡ分子を含有
した細菌クローンが生産されるであろう。これら断片含
有クローンの存在は、さらに最終的なりローン選別過程
を複雑化させる。 各種の単一鎖ｃＤＮＡの寸法は、少量をアルカリ性２％
アガロースゲル上に、電解質として３０ｍＭのＮａＯＨ
と２ｍＭのＥＤＴＡとを使用して電気泳動させることに
より測定した〔エム・ダブりニー・マクドネル等、ｒＴ
７ＤＮＡの制限断片の分析ならびに中性およびアルカリ
性ゲルにおける電気泳動による分子量の測定」、ジャー
ナル・モレキュラー・バイオロジー、第１１０巻、第１
１９〜１４６頁（１９７７）〕、Ｐ”−ｃＤＮＡは、サ
イズ標識として使用した単一鎖グロビンｃＤＮＡおよび
ｐ ３２−標識したＤＮＡ断片に比べ、６００〜１００
０ヌクレオチドの長さを有した。 二重鎖ｃＤＮＡの調製 単一鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼＩで処理して二
重鎖にすることができる〔ティー・マニアチス等、「試
験管中で合成したβ−グロ ゛ビン遺伝子の拡大および
特性化」、セル誌、第８巻、第１６３〜１８２頁（１９
７６））、上記からの沈澱した単一鎖ｃＤＮＡを２００
μｌのＨ，Ｏ中に熔解させ、１００℃にて２分間加熱し
、そして５００μｌの０．ＩＭ熱変性燐酸カリウム緩ｊ
近液（ｐｉ冒６．９）と１０ｍＭのＭｇＣｌ２と１０ｍ
ＭのＤＴＴ （カルビオケム社）と各１ｍＭのｄＡＴＰ
（メルク社）、ｄＧＴＰ（シュワルツ社）およびｄＣＴ
Ｐ （レボサン社）と１ｍ Ｍ （７） Ｈ″−ｄＴＴ
Ｐ （ＮＥＮ、比活性１００，０００ｃｐｍ／ｎモル）
と１５０単位／ｍｌのイー・ＩすＤＮＡポリメラーゼＩ
（ベーリンガー・マンハイム社）とにおいて培養した
。１５℃にて６．５時間の後、０．５ＭのＥＤＴＡと２
０％のＳＤＳを１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％のＳ
ＤＳまで加えた。次いで混合物を５００μｌのフェノー
ルで抽出し、フェノール相を２５０μｍ０）２０ｍＭト
リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５） と５ｍＭ ＥＤＴＡ（
“ＴＥ緩衝液”）とで再抽出した。２つの水田を合し、
前記したと同じ条件下で５ｍｌのセファデックスＧ−１
００カラム上でクロマトグラフにかけた。酢酸ナトリウ
ム（３Ｍ）を０．３Ｍまで加え、２．５容量のエタノー
ルを混合してＤＮＡを沈澱させた。全部で１３μｇのＤ
ＮＡう（回収された。 ＤＮＡをヌクレアーゼＳ、で処理した〔このヌクレアー
ゼＳ１は、アール・シー・ビーガント等、「アスペルギ
ルス・オリイーからの８１ヌクレアーゼの特異性」、ジ
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５０巻
、第８８４１〜８８５５頁（１９７５）の方法によりＩ
Ｉ製した〕沈澱したＤＮＡを２５０μｌのＳ、緩衝液（
０，２ＭのＮａＣ１，５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐ１
１４．５） 、１０ｍＭの硫酸亜鉛）に熔解させ、３７
℃にて３０分間加温した。１．５μｉのＳ、酵素（１１
単位／μｌ）を加え、混合物を３７℃で３０分間培養し
た。ＳＤＳとＥＤＴＡとを０．１％ＳＤＳおよび５ｍＭ
ＥＤＴＡまで加え、そして混合物を２５０μｌのフ
ェノールで抽出した。フェノール相を１００μ１ＯＴＥ
ｆｆｌｆＥ液で洗浄した。水相を合し、ＴＮＥにおいて
セファデックスＧ−１００（ファーマシア社）カラム上
でクロマトグラフにかけ、０．１ ｍｌづつのフラクシ
ョンを０．３ ｍｌ／ｍｉｎ 、の速度で集めそして各
フラクションのセレンコツ放射線を測定した。 上記したようにエタノールと酢酸ナトリウムとで沈澱さ
せた後、８μｇの二重鎖ｃＤＮＡを回収した。 ここでも、上記で生産した二重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａは１多
数のＣＤＮＡとその断片との混合物であり、。その掻く
少数のみがＨｕ Ｉ ＦＮ−αｃＤＮＡもしくはその断
片であることを認めねばならない（第１図〕、 二重鎖ＤＮＡのクローン化 多種類の宿主／クローン化ベヒクルの組合せ物を使用し
て、上記のように調製された二重鎖ｃＤＮＡをクローン
化させた。たとえば、有用なりローン化ベヒクルは染色
体、非染色体および合成りＮＡ配列の断片、たとえば各
種公知の細菌プラスミド、たとえばｃｏ ＩＥＩ、ｐｃ
Ｒｌ。 ｐＢＲ３２２およびそれらの誘導体を含む大腸菌（イー
・コリ）からのプラスミド、広範囲の宿主の１ラスミド
、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばファージ
λの多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９、ならびにプラ
スミドとファージＤＮＡとの組合せから生じたベクター
、たとえばファージＤＮＡもしくは他の発現制御配列を
用いて改変させたプラスミドまたは酵母プラスミド、た
とえば２μプラスミドもしくはその誘導体から構成する
ことができる。有用な宿主は細菌藩主、たとえば大腸菌
の菌株、たとえばイー・コリＨＢ１０１、イー・コリＸ
１７フイー・コリＸ２２６２、イー・コリＭＲＣＩおよ
びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ） 、枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ口ｉＳ）、高熱菌（
Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）およびその他バチルスの菌株、酵母およびその
他の真菌類、動物もしくは植物宿主、たとえば動物（人
間を含む）もしくは培養した植物細胞またはその他の宿
主を包含する。勿論、必らずしも全ての宿主／ベクター
組合せ物が同等に有効ではない。宿主／クローン化ベヒ
クル組合せの特定の選択は、示した原理を適当に考慮し
て当業者により、本発明の範囲を逸脱することなく行な
うことができる。 さらに、各特定クローン化ベヒクル内において、種々の
部位を選択して二重鎖ＤＮＡを挿入することもできる。 これらの部位は通常、これらを切断する制限エンドヌク
レアーゼにより命名することができる。たとえば、ｐＢ
Ｒ３２２においてＰｓｔ１部位は、β−ラクタマーゼ用
の遺伝子において、その蛋白質のアミノ酸１８１６・お
よび１８２をコードするヌクレオチドトリブレットの間
に位置する。この部位は、ラッチのプロインシュリン抗
原決定因子を示す蛋白質の合成において、ビラーカマロ
フ’！ （上記）によって用いられた。２つのＨｉｎｄ
ＩＩエンドヌクレアーゼ認識部位の一方はアミノ酸１０
１および１０２をコードするトリブレンドの間に存在。 し、また数個のＴａｑ部位の一つはｐＢＲ３２２におけ
るβ−ラクタマーゼのアミノ酸４５をコードするトリプ
レットに存在する。同様に、このプラスミドにおけるＥ
ｃ ｏＲ１部位およびＰｖｕｌＩ部位は、コード化域の
外部に存在し、ＥＣｏＲ１部位はそれぞれテトラサイク
リンおよびアンピシリン耐性をコードする遺伝子の間に
位置する。この部位は、イタクラ等およびゲデル等によ
り、組替え合成法（上記）において使用された。これら
の部位は当業者により充分認識されている。勿論、本発
明に有用なりローン化ベヒクルは、選択ＤＮＡを挿入す
るための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要のな
いことを理解すべきである。寧ろ、ベヒクルは別の手段
により断片に結合させうるであろう。 ベクター、すなわちクローン化ベヒクル、特に選択ＤＮ
Ａ断片を結合させて組替えＤＮＡ分子を生成させるため
そこに選択される部位は、種々の要因たとえば特定制限
酵素に対し感受性部位の数、発現すべき蛋白質の大きさ
、宿主細胞酵素により蛋白質分解を受ける所望蛋白質の
感受性、精製の際除去困難な宿主細胞蛋白質により発現
すべき蛋白質の汚染、たとえばベクター配列に関する開
始および停止コドンの位置のような発現特性ならびに当
業者により認められるその他の要因のような各種の要因
により決定される。ベクターおよび特定遺伝子用の挿入
部位は、これら要因のバランスにより決定され、必らず
しも全ての選択が一定の場合に対し同等に有効であると
は限らない。 外来ＤＮＡをクローン化ベヒクルすなわちベクター中に
挿入して組替えＤＮＡ分子を生成させるには幾つかの方
法が当分野で知られているが、本発明による第一の構成
に好ましい方法はビラーカマロフ等（上記）により記載
され、第１図に示されている。この方法は、プラスミド
（特にｐＢＲ３２２）を挿入用に選択された部位（特に
Ｐｓ ｔ Ｉ）に特異的な制限酵素により切断し、そし
てｄＧＭＰ末端を末端トランスフェラーゼにより末端付
加させることを特徴とする。ｄＧＭＰ末端は切断プラス
ミドの５′末端に付加されて、ＰｓｔＩ部位を再生する
と共に、相補的末端を有するｃＤＮＡ断片への結合を可
能にする。同様に、二重鎖ｃＤＮＡは、ｄＣＭＰ末端を
処理プラスミドに対する結合を可能にする３′末端に付
加させて伸長される。次いで処理プラスミドとｃＤＮＡ
とをアニールして、プラスミドの適当な部位にｃＤＮＡ
を挿入すると共にヒブリドＤＮＡを環化させ、末端の相
補的性質はそれらの凝集を可能にする（第１図〕、かく
して、生じた６組替えＤＮＡ分子は、選択制限部位に遺
伝子を有する（第１図〕、 勿論、ＤＮＡ配列をクローン化ベヒクル中に挿入して組
替えＤＮＡ分子を生成させるその他の公知方法も、同等
に本発明において有用である。これらは、たとえば直接
的結合、合成リンカ−、エキソヌクレアーゼおよびポリ
メラーゼ結合修復反応に続く結合、或いはＤＮＡポリメ
ラーゼと適当な単−鏡開型とによるＤＮＡ鎖の伸長に続
く結合を包含する。 勿論、クローン化ベヒクルの選択位置に挿入されたヌク
レオチド配列またはｃＤＮＡ断片は、所望ポリペプチド
用の実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチドも包含
することができ、或いは所望蛋白質用の完全構造遺伝子
の断片のみも包含することができることを了解すべきで
ある。何らかのＤＮＡ配列が挿入されて形質転換した宿
主がＨｕ Ｔ ＦＮ−αの生物学的もしくは免疫学的活
性を有するポリペプチドを生産すること、或いはＨｕｌ
ＦＮ−αの免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリ
ペプチドの生産に有用なりＮＡ配列を含んだクローンを
選択するためＤＮＡ配列自身がヒブリド化試料として使
用できることのみが必要とされる。 外来遺伝子を含有するクローン化ベヒクルすなわちベク
ターを使用して、ヒブリドＤＮＡによりコードされる蛋
白質またはその一部を宿主が発現しうるようこの宿主を
形質転換させる。 適当な宿主の選択も、当分野で知られた多くの要因によ
り管理される。これら要因には、たとえば選択ベクター
との適合性、ヒブリドプラスミドによりコードされる蛋
白質の毒性、所望蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生
物安全性および価格が包含される。これら要因をバラン
スさ、せるには、必らずしも全ての宿主が特定の組替え
ＤＮＡ分子を発現するのに同等に有効でないと云う理解
を考慮せねばならない。 この合成において、好適な初期クローン化ベヒクルは細
菌性プラスミドｐＢＲ３２２であり、好適な初期制限エ
ンドヌクレアーゼ部位はＰｓｔ■部泣である（第１図〕
、このプラスミドは、抗生物質アンピシリン（Ａｍｐ）
およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）に対する耐性遺伝子
を有する小型（分子量約２．６メガダルトン）のプラス
ミドである。プラスミドは完全に特性化されている〔エ
フ・ポリバール等、「新規クローン化ベヒクル■の構成
および特性化。多目的クローン化システム」、ジーン誌
、第９５〜１１３頁（１９７７）；ジェー・ジー・サツ
トクリソフ、ｒＤＮＡ配列から生ずるｐＢＲ３２２制限
地図。４３６１ヌクレオチド対の長さまでの正確なりＮ
Ａサイズ標識」、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、
第５巻、第２７２１〜２７２８頁（１９７８）〕、この
部位におけるＤＮＡ生産物の挿入は多数の細菌クローン
を与え、その各々は予め調製されたＤＮＡ生産物に存在
するＤＮＡ遺伝子もしくはその断片の一つを含有する。 ここでも、これらクローンの掻く少数のみがＩＦＮ−α
もしくはその断片用の遺伝子を含有する（第１図〕、本
発明における初期クローン化用の好適宿主はイー・コリ
ＨＢ１０１である。イー・コリＸ１７７６を用いて他の
実験を行なったが、この宿主は英国特許第１．５１６，
４５８号に記載されており、アメリカ合衆国、メリーラ
ンド州ロックビル在のアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション〔ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ番号
第３１２４４号が付与されている。 プラスミドｐＢＲ３２２（２０μｇ）を２１単位のＰｓ
ｔＩエンドヌクレアーゼ（ＭＲＥポートンダウンス社ま
たはニューイングランド・ビオラプス社）により、１５
０μ！の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）と
６ｍＭのＭｇＣｌ２と５０ｍＭのＮａＣ１と６ｍＭの２
−メルカプトエタノールと２００ｍｒ／μｌの牛血清ア
ルブミン（“ＢＳＡ″）（カルビオケム社）との中で切
断した。３７℃にて２時間の後、混合物を１容（ｆのフ
ェノール−クロロホルム（１： １）と１容量のエーテ
ルとで抽出しそしてエタノールにより沈澱させた。 末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（Ｔｄ
Ｔ）（エフ・ジェー・ボルム、「子牛胸腺からのデオキ
シヌクレオチド重合酵素」、メソッド・イン・エンチモ
ロジ−（エル・グロスマンおよびケー・モルデーブ編）
、アカデミツク・プレス社、ニューヨーク、第１２Ｅｌ
、第５９１〜６１１頁（１９６８）により精製〕による
単独重合ｄＧＭＰ末端の付加（第１図）を、１００ｍＭ
のカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７，２）と１０ｍＭのＮ
ａＨ２ＰＯ，と５ｍＭのＭｇＣｌ２と１ｍＭのｄＧＴＰ
と５０ｐｇ／ｐｉのＢＳＡと３〜６単位のＴｄＴ （上
記のように精製）とをＤＮＡ遺伝子当りに含有する３２
８μｌの反応容量にて行なった。培養を３７℃にて２０
分間行なった。ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加えそして混合
物を上記のように抽出し、ＴＮＦ−’！２１１液に対し
２日間透析した。 ２、ｄＣＭＰ伸長させたＤＮＡの調製 二ｉｉｄ！ｌｌＤＮＡを標準法（たとえば、ビラーカマ
ロフ等、上記）によりｄＣＭＰ残基で陣長させた。上記
の二重鎖ｅＤＮＡ１５０ｎｇを、１００ｍＭのカコジル
酸ナトリウム（ｐＨ７，２）と２．５ｍＭのＣｏｃ！、
と５０ｔｔｇ／ｌｔｌのＢＳＡとＤＮＡ１μｇ当り３〜
６単位の精製ＴｄＴを含む０．１ｍＭのｄＣＴＰとの８
ｐＨ中で２７℃にて８分間培養し、次いで一２０℃にて
凍結させた。前記と同様、ｄＣＭＰ伸長させたＤＮＡは
種々異なる種類の混合物であり、そのうち極く少数のみ
がＩＦＮ関連性であった（第１図〕、 ３、Ｃａ”処理されたイー・コリＸ１７７６の調製 イー・コリＸ１７７６の単一コロニーを、１００μｇ／
ｍｌのジアミノピメリン酸（コツホライト・ラボラドリ
ース社）と１０μｇ／ｍｌのナリジキシン酸（カルビオ
ケム社）と１０μｇ／ｍ１のテトラサイクリン（アクロ
マイシン■、アメリカンシアナミド社）とが加えられた
１００ｍ１のトリプトン培地中に接種した〔シー・ワイ
スマンおよびダブりニー・ポル、「組替えプラスミドＤ
ＮＡのＩＩＭにおける起こりうる害の減少」、ネイチャ
ー誌、第２６１巻、第４２８〜４２９頁（１９７６）〕
、培養物を、６５０ｎｍ（ＯＤ６５Ｑ）にて０．６の見
掛は光学密度（ベックマンＤＢ型分光光度計にて測定）
まで３７℃にて生育させ、水中で３０分間冷却させた。 次いで、培養物をツルバールＨ４型スウィングバゲソト
ロータにて４００ Ｏｒｐｍで沈降させ、細胞を５Ｏｎ
＋１の１０ｍＭ ＮａＣ１で洗浄し、遠心分離によっ
て分ｇ！除去しそして２０ｍ１の１００ｍＭ ＣａＣ
ｌ２中に再懸濁させた。懸濁物を水中で３０分間冷却し
、遠心分離により粒状化させて４ｍｌの１００ｍＭ
ＣａＣｌ２中に再懸濁させ、そして氷上で一晩放置した
後使用した。 形質転換用としてイー・コリＨＢ １０１をエム・マン
デルおよびニー・ヒガの方法〔「カルシウム依存性バク
テリオファージＤＮＡ感染」、ジャーナル・モレキュラ
ー・バイオロジー、第５３巻、第１５９〜１６２頁（１
９７０））により調製した。一部（０，５ｍｌ）を−７
０℃で凍結状態に保ち、少なくとも３ケ月間その活性を
保持した。 末端Ｐｓｔｌ−開裂ｐＢＲ３２２と末端ｃＤＮＡとのア
ニール化を文献〔ジェー・ファン・デン・ベルブ等、「
２つの同族対のイントロンの強力な多様性を示すクロー
ン化された兎とねずみとのβ−グロビン遺伝子の比較」
、ネイチャー誌、第２７６巻、第３７〜４４頁（１９７
８））に記載されているように行なった。８ ｎ ｇ
（７） ｄ ＣＭ Ｐ伸長されたＤＮＡ生成物を２２ｎ
ｇのｄＧＭＰ伸長されたＰｓｔＩ−開裂ｐＢＲ３２２と
、ＴＮＥ緩衡液５０μＪ中で混合した。培養を６５℃、
４６℃、３７℃および２０℃にて順次に４段階で１時間
づつ行なった。１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ （ｐＨ
７，５）と１００ｍＭのＣａ Ｃｌ ２と１００ｍＭの
ＭｇＣｌ２と５０μｌのＴＮＥ緩街液とを含有する２０
μｌを加えそして混合物を水中で２０分間冷却した。 勿論、生成物は種々異なる組替えＤＮＡ分子と、挿入Ｄ
ＮＡ配列のない若干のクローン化ベヒクルとの混合物で
ある。しかしながら、各組替えＤＮＡ分子はＰｓｔ１部
位にｃ Ｄ Ｎ Ａ断片を含有する。この種のｃＤＮＡ
の各々は遺伝子またはその断片からなることができる。 ｃ ＤＮＡ断片の極く少数のみがＩＦＮまたはその部分
をコードする（第１図〕、大多数は他の蛋白質またはそ
の部分の一種をコードし、それらのｍＲ，ＮＡは本発明
の方法に使用されるポリ（Ａ） ＲＮ Ａの一部であっ
た（第１図〕、 組替えＤＮＡ分子の混合物によるイー・コリＸ１７７６
の形質転換はジェー・ファン・デン・ベルブ等（上記）
により記載されているように行なった。Ｐ３封鎖手段を
用いて形質転換過程と全ての次工程とを行ない、そこに
おいて得られた形質転換細菌を処理した。アニールした
ｐＢＲ３２２組替えＤＮＡ分子を１００μｌの予め調製
されたＣａ＋１処理したイー・コリＸ１７７６に加え、
混合物を水中で２０分間冷却し、２０℃にて１０分間加
熱し、そして０．６ ｍｌのトリプトン培地を加えた。 混合物を、上記のように添加された２枚のトリプトン培
地寒天板に接種した。形質転換効率はアニールｐＢＲ３
２２の１μｇ当り３．３ ｘ １０斗１固のコロニーで
、あり、原ｐＢＲ３２２はｌμｇ当り３Ｘ１０’個のコ
ロニーを与えた。 プラスミドｐＢＲ３２２はテトラサイクリン耐性に関す
る遺伝子を含むので、その完全遺伝子を有するプラスミ
ドで形質転換させたイー・コリ宿主は、そのように形質
転換させてないｆｉｌｌ菌を除き、その抗生物質を含有
する培養物において増殖するであろう。したがって、テ
トラサイタリン含有培養物における増殖は、組替えＤＮ
Ａ分子または再使用ベクターにより形質転換させた宿主
の選択を可能にする。 ３７℃にて４８時間の後、個々のコロニーを採取してこ
れらをミクロヨリ定板（ダイナチク社）の穴部における
１００μβのトリプトン培地（上記のように添加したも
の）に懸濁させた。 ３７°Ｃにて一晩培養した後、１００μｌの４０％グリ
セリンを各穴中に混入した。測定板を一２０℃に保存し
、そして形質転換イー・コリＸ１７７６の１００，００
０個の個々のクローンを調製した。 これら１００，０００個のクローンは、ＩＦＮ生成性白
血球からのポリ（Ａ）ＲＮＡ調製物においてｍＲＮＡの
混合物の完全もしくは部分的コピーを示す各種の組替え
ＤＮＡ分子を含有する（第２図〕、これらの大多数は単
一の組替えＤＮＡ分子のみを含有するであろう。これら
組替えＤＮＡ分子の極く少数のみがＩＦＮに関連する。 したがって、クローンを選別してＩＦＮ関連クローンを
他のものから分離せねばならない。 ＨｕＩＦＮ−αｃＤＮＡを含有するクローンの選別 ひと白血球インターフェロンｃ ＤＮＡ（“Ｈｕ ＩＦ
Ｎ−αｃＤＮＡ″）を含有する細菌クローンを選別する
ための幾つかの方法がある。 これらには、たとえばＲＮＡ選択ヒブリド化〔アルウィ
ン等、（下記）〕、差別ヒブリド化〔ティー・ビー・セ
ントジョーンおよびアール・ダラ゛リュー・デービス、
「差別プラークフィルターヒブリド化によるサツカロミ
セス・セレビシェからのガラクトース誘発ＤＮＡ配列の
単離」、セル誌、第１６巻、第４４３〜４５２頁（１９
７９″）；ヘージメーカース等、下記〕、合成試料によ
るヒブリド化〔ビー・ノイエス等、「オリゴデオキシヌ
クレオチド試料を使用するガストリンｍＲＮＡの検出お
よび部分的配列分析」、プロシーディング・ナショナル
・アカデミ−・サイエンス・’ＵＳＡ、第７６巻、第１
７７０〜１７７４頁（１９７９））または免疫学分析（
エル・ビラーカマロフ等、上記）もしくは生物学的分析
（ニー・シー・ワイ・チャング等、上記）による所望蛋
白質を生成するクローンの選別が包含される。本発明は
、ＩＦＮ−αｃ ＤＮＡを含有するクローンの第一次選
別のための最も便利かつ有望な方法としてＲＮＡ選択ヒ
ブリド化を選択した。 次に第２図について述べれば、組替えＤＮＡを、上記ク
ローン貯蔵物（第２図に示した２クローンの２つの混合
物）における５１２個のクローンの混合物の培養物から
単離した（工程Ａ〕、このバッチサイズを選別する理由
を以下に説明する。組替えＤＮＡ分子を開裂させ、変性
させそして前記したように調製したＩＦＮ−αｍＲＮＡ
を含有する白血球ポリ（Ａ） ＲＮ Ａまでヒブリド化
させた（工程Ｂ〕、全ての組替えＤＮＡ分子−ポリ（Ａ
） ＲＮ Ａヒブリドを非ヒブリド化ポリ（Ａ’ｌ Ｒ
Ｎ Ａから分離した（工程Ｃ〕、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ
をヒブリドから回収しかつ精製した（工程Ｄ〕、回収し
たＲＮＡを上記のようにＩＦＮ−αｍＲＮＡ活性につき
分析した（工程Ｅ〕、もしも組替えＤＮＡ分子の混合物
が厳格なヒブリド化条件の下でポリ（Ａ） ＲＮ Ａ中
のＩＦＮ−ｍＲＮＡにヒブリド化しうる挿入ヌクレオチ
ド配列を持った組替えＤＮＡ分子を含有するならば、そ
のヒブリドから遊離されたｍ ＲＮ Ａは卵母細胞中に
おいてＩＦＮ−αの生成をもたらすであろう。何故なら
、その他の如何なる組替えＤＮＡ分子−ポリ（Ａ） Ｒ
Ｎ Ａヒブリドから遊離されたｍＲＮＡもＩＦＮ−α関
連性でないからである。５１２個のクローンの群が正の
反応を示せば、これらクローンを６４個づつの８０ツト
に再紙分けして、各ロフトにつき上記のように分析した
。この処理を、この分析に応答する単一のクローンが同
定されるまで続けた。 形質転換されかつこのように同定された組替えＤＮＡ分
子および細菌クローンがＩＦＮ−αの完全なＩＦＮ−α
ｃＤＮＡ配列を含有したり、或いはＤＮＡ配列が実際に
ＩＦＮ−αをコードする保証はない。しかしながら、組
替えＤＮＡ分子はＩＦＮ−αｍＲＮＡコード配列に相補
的な広汎なヌクレオチド配列を確実に含有する。 したがうて、組替えＤＮＡ分子は、他の組替えＤＮＡ分
子およびそれにより形質転換されたクローンを迅速選別
するための試料の供給源として使用することにより、標
準的および完全なＩＦＮ−αヌクレオチドコード配列を
含有しうる別の群のクローンを同定することができる。 ２、理論的考察 ヒブリド化（工程Ｂ）の条件は臨界的である。 組替えＤＮＡ分子とポリ（Ａ） ＲＮ Ａとの絶対濃度
および比は、反応速度と化学量論とを考慮して選択せね
ばならない。適正な選択は、ポリ（Ａ）ＲＮＡにおける
ＩＦＮ−αｍＲＮＡの割合が未知であるため、困難であ
る。制御されかつ充分な速度を確保するため、組替えＤ
ＮＡ分子からのＤＮＡ配列の濃度が推定ＩＦＮ−αｍＲ
ＮＡ濃度に比較して過剰となる条件の下で行なった。 ５１２＋１１の可能な種々異なる組替えＤＮＡ分子の混
合物において、ＩＦＮ−α関連ＤＮＡ配列（＠ＩＦＮ−
αＲＤＮＡ″）は全く生じない（負の分析値を与える）
か、或いは組替えＤＮＡ分子の少なくとも約１１５１２
を構成する。組替えＤＮＡ分子混合物の濃度およびした
がってＩＦＮ−αＲＤＮＡの濃度をヒブリド化工程で鋼
製して、充分なヒブリド化割合を確保することができる
。さらに、反応混合物中のＩＦＮ−αＲＤＮＡの量は、
ポリ＜Ａ） ＲＮ Ａからの充分な量のＩＦＮ−αｍＲ
ＮＡを結合して、組替えＤＮＡ分子−ポリ（Ａ） ＲＮ
Ａヒブリドから回収されたｍＲＮＡを卵母細胞に注入
した後にＩＦＮ−αの検出を可能にするのに足る量でな
ければならない。 用いうる分析によりＩＦＮ−αを検出するには、その濃
度は１００ＩＵ／ｍｌもしくはそれ以、ヒにしなければ
ならない。反復測定のためには０．５ ｍｌづつを必要
とするので、５０ ＩＵを卵母細胞中に発生させるべき
である。前記で使用した誘発白血球からのポリ（Ａ）
ＲＮ Ａは、その１μｇを卵母細胞中に注入すると、約
５００１ＵのＩＦＮ−αを発生する。したがって、必要
とする５０ｆＵを発生させるには、少なくとも０．１μ
ｇのポリ（Ａ） ＲＮ Ａを注入せねばならない、兎グ
ロビンｍＲＮＡと兎β−グロビンＣＤＮＡクローンとを
用いたモデル実験は、ヒブリド化ミックスに加えたＩ
−グロビンｍＲＮＡに対し卵母細胞中の■ −グロビン
ｍＲＮＡの全回収率が約１０％であり、かつｍＲＮＡ活
性の回収率が約５％であることを示した。したがって、
ヒブリド化分析用には少なくとも０．１１０．０５＝２
μｇの白血球ポリ（Ａ） ＲＮ Ａを使用すべきである
。充分安全な限界を確保するには、１回の分析当り１２
μｇのポリ（〜ＲＮＡを使用した。 １２μｇのポリ（釣ＲＮ Ａ中のＩＦＮ−αｍＲＮＡを
結合させるには、組替えＤＮＡ分子からのどの程度のＤ
ＮＡが必要とされるかを計算するため、ポリ（Ａ＞ Ｒ
Ｎ ＡのｒＦＮ−ａｍＲＮＡ含有量を推定した。１μｇ
のポリ（Ａ’） ＲＮ Ａは５００ＩＵのＩＦを発生さ
せる。ＩＦＮ−αの比活性は２ＸＩＯ”〜１０’ｌＵ／
■蛋白質である。したがって、５００１ＵのＩＦＮ−α
は５００／２ｘｔｏ’−２，５Ｘ１０−’ｗ（２，５ｎ
ｇ）〜５００／１０’−５Ｘ１０−’ｍｇ（０，５ｎｇ
）のインターフェロンに対応する。 卵母細胞中に注入したＩＦＮ−αｍＲＮＡの量と生成さ
れたＩＦＮ−αの量との間の関係は未知である。β−グ
ロビンｍＲＮＡの場合、ｍＲＮＡ１分子当り約３０分子
の蛋白質が１時間当りに生成され、この値はβ−グロビ
ンに対し約６である〔ジェー・ビー・グルトン等、「注
入フロッグ卵母細胞における伝達安定性：長寿命の哺乳
動物およびβ−グロビン伝達」、ジャーナル・モレキュ
ラー・バイオロジー、第８０巻、第５３９〜５５１頁（
１９７３）〕、ＩＦＮ−αに関し平均値が２０であり、
ＩＦＮ−αに関し分子量が１８．０００でありかつＩ
ＦＮ−αｍＲＮＡに関し分子量が３３０．０００である
と仮定すれば、２６ ｍｇ （１８，０００／３３０，
０００ ｘ ２０ｘ ２４）のＩ ＦＮ−Ｑ’が注入Ｉ
ＦＮ−αｍＲＮＡ １＋ｎｒ当りに２４時間で生成さ
れる筈である。もしＩＦＮ−αの比活性が２Ｘ１０”／
■（２Ｘ１０２１Ｕ／ ｎ ｇ ）であるとすれば、ｌ
ｎｇのＩＦＮ−ｃｘｍＲＮＡは２６Ｘ２Ｘ１０２＝５．
２Ｘ１０３ＩＵのＩＦＮ−αを生成するであろう。比活
性が１０″’ ／ｍｇ （１０３１Ｕ／ｎ ｇ）である
とすれば、生成するＩＦＮ−αの量は２．６Ｘ１０’ｌ
Ｕとなるであろう。１μｇの白血球ポリ（Ａ） ＲＮ
Ａ・は上記の仮定条件の下で５００１ＵのＩ ＦＮ−α
を生成するので、１μｇのポリ（Ａ） ＲＮ Ａ中のＩ
ＦＮ−αｍＲＮＡの濃度はＱ、ｌ ｎ ｇ 〜０．０２
ｎ ｇに低下し、白血球ポリ（Ａ） ＲＮ Ａにおける
ＩＦＮ−ｔｘ ｍ ＲＮ Ａの割合は１ ： １０，０
００〜１ ： ５０．０００となるであろう。したがっ
て、１２μｇのポリ（Ａ） ＲＮ Ａは約１．２ ｎ
ｇ 〜０．２ ｎ ｇのＩＦＮ−ｅｘｍ ＲＮ Ａを含
有する。 卵母細胞中のＩＦＮ−αｍＲＮＡの翻訳比がグロビンｍ
ＲＮＡに対する平均値よりも大きさの次数（ｏｒｄｅｒ
ｏｆ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）だけ低ければ、ポリ（Ａ
） ＲＮ ＡのＩ ＦＮ−ｃｒｍＲＮＡ含量は、上記計
算値よりも１０倍高くなるか、或いは約１＝１０００〜
１ ： ５０００となるであろう。その場合、１２μｇ
のポリ（Ａ＞ ＲＮ Ａは約１２μｇ〜２ｎｇのＩＦＮ
−αｍＲＮＡを含有するであろう、他方、卵母細胞中の
ＩＦＮ−αｍＲＮＡの翻訳比がグロビンｍＲＮＡの平均
値よりも大きさの次数だけ高ければ、ポリ（Ａ＞ ＲＮ
ＡのＩＦＮ−αｍＲＮＡ含量は上記計算値よりも１０
倍低くなるか、或いは約１ ： １００．０００〜１
： ５００，０００となるであろう、その場合、１２μ
ｇのポリ（釣ＲＮＡは０．１ ｎ ｇ 〜０．０２ｎ
ｇのＩ ＦＮ−αｍＲＮＡを含有するであろう。 プラスミドｐＢＲ３２２は４３６ ｌ ｂ、ｐ、を有す
る。ＩＦＮ−αｍＲＮＡの完全ｃＤＮＡは、全部で約５
２００〜５４００ ｂ、ｐ、となるようｐＢＲ３２２−
ＩＦＮ−αｃＤＮＡの生成の際、ｐＢＲ３２２に対し約
８００〜１０００ ｂ、ｐ、を付加するであろう、した
がって、その分子量はＩＦＮ −αｍＲＮＡ単独のそれ
の約１２倍（２Ｘ ５２００／８００）となるであろう
。したがって、上記に計算したＩＦＮ−αｍＲＮＡを結
合して分析に必要な１２μｇのポリ（Ａ＞ ＲＮ Ａ中
に存在させるには、ＩＦＮ−７ｍ ＲＮ Ａの口の１２
倍に等しい組替えＤＮＡ分子の量が必要となるであろう
（化学量論量〕、 組替えＤＮＡ分子を調製するのに使用されるポリ（Ａ）
ＲＮ ＡのＩＦＮ−αｍＲＮＡ含量は粗ポリ（Ａ）
ＲＮ Ａのそれよりも１０〜４０倍増大したので、５１
２個のクローンの群は、上記から計算したよりも１０〜
４０倍多い所望ＩＦＮ−αｍ ＲＮ Ａ含有のクローン
を有する筈である。 ＩＦＮ−ｃｘｍＲＮＡが１０００の粗ポリ（Ａ）ＲＮＡ
のうち１部であれば、１２μｇのポリ（Ａ）Ｒ’ＮＡは
１２μｇのＩＦＮ−αｍＲＮＡを含有しかつ化学量論量
のＩＦＮ−αｃＤＮＡプラスミドは１４４ｎｇである。 ５１２個のクローンの群は少なくとも５個のＩＦＮ−α
ｃＤＮＡ挿入物を含有するので、必要とされる全ヒダリ
ドプラスミドＤＮＡは１４．８μｇ （１４４ｘ５１
２１５ＸＩＯ−”）である、夏ＦＮ−ａｍＲＮＡが１０
．０００のうち１部であれば、１２μｇのポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡは１．２μｇのＩＦＮ−ａｍＲＮＡを含有しかつ必
要とされるＩＦＮ−αｃＤＮＡの量は１４．４ｒｌ ｇ
である。５１２１固のクローンの群は０もしくは１個の
ＩＦＮ−αｃＤＮＡ挿入物を含有し、したがって必要と
される全ヒダリドプラスミドＤＮＡの量は７．４μｇ
（１４，４Ｘ ５１２ Ｘｌ ０− ’ ）である、
ＩＦＮ−αｍＲＮＡが１００．０００のうち１部であれ
ば、必要とされる全ヒダリドプラスミドＤＮＡの量は０
．７４μｇ （１，４４ｘ ５１２ＸＩＯ−”）であ
る、ヒブリド化反応がＤＮＡ過剰条件下（すなわち、ポ
リ（Ａ） ＲＮ Ａに比較して過剰の組替えＤＮＡ）で
進行するよう確保するため、２０μｇの混合物（約１．
４〜３０倍過剰）を分析用に選択した。 ヒブリド化は、（ａｌポリ（Ａ＞ ＲＮ Ａのヒブリド
化された部分が完全かつ生物学的活性の型で回収される
こと、（ｂ）非特異的なりＮＡ−ｍＲＮＡ結合が防止さ
れることおよび（Ｃｌｌヒソド化反応が少なくとも７５
％完結まで進行することを確保するような条件下で行な
わねばならない。これ゛らの条件は、特に８０％ホルム
アミド、０．４ＭＮａＣｌ中におけるヒブリド化により
満たされると思われる〔ジエー・カセイおよびエフ・ダ
ビドソン、「高濃度のホルムアミドにおけるＲＮＡ ：
ＤＮＡおよびＤＮＡ ： ＤＮＡ複合体の生成速度お
よび熱安定性」、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、
第４巻、第１５３９〜１５５２頁（１９７７）〕、この
溶液において、ヒブリド化は約４０℃で行なうことがで
きる（ホルムアミドを省略すると、６０〜７０℃が必要
とされる〕、ポリ＜Ａ＞ ＲＮ Ａに対する損害を最小
にするには、より低温度が好適である。本発明は５６℃
のヒブリド化温度を選択する。これはＴＶ２１より約３
℃低く 〔ジェー・カセイおよびエフ・ダビドソン、上
記〕かつＴ’／２ ａより約１０〜１３℃低い〔ハマグ
チおよびガイヅシエク、ジャーナル・アメリカン・ケミ
カル・ソサイエティ、第８４巻、第１３２９頁〕。した
かって、この温度は約８７％以下のホモロジーをもって
、配列をヒブリド化させない筈である。 何故なら、１％の差はＴ１／２ｄを１℃だけ低下させる
からである〔ティー・エフ・ボナー等、 。 「配列多様化によるＤＮＡ再結合の速度低下」、ジャー
ナル・モレキュラー・バイオロジー、第８１巻、第１２
３〜１３５頁（１９７３）〕、このヒブリド化において
、ＤＮＡの自己ヒブリド化は主たる問題でない。何故な
ら、使用されるＤＮＡの混合物は同じベクター（ｐＢＲ
３２２）および各種のｃＤＮＡ挿入物よりなるからであ
る。したがって、大抵のＤＮＡ配列はへテロ複合体とな
り、ここで挿入物はポリ（Ａ） ＲＮ Ａにヒブリド化
させるのに使用することができる。 異なる複合体の一部を形成する相補的ｃ ＤＮＡ挿入物
は、トポロジー的拘束により殆んど相互作用することが
ない。いずれにせよ、ＤＮＡ ：ＤＮＡ再結合は、使用
反応条件下で最小化される（ジエー・カセイおよびエフ
・ダビドソン、上記〕、 少なくとも７５％反応を確保するのに必要とされるヒブ
リド化時間を決定するため、２次速
【 式中、
Ｒ＝ヒブリド化ＲＮＡのヌクレオチドモル濃度、
Ｃｏ＝ヒブリド化すべき初期ＤＮＡのヌクレオチドモル
濃度、 Ｒｏ＝ヒブリド化すべき初期ＲＮＡのヌクレオチドモル
濃度、 ＫＲ＝ＲＮＡ−ＤＮＡヒブリド化に関する速度恒数、 ｔ ＝時間（秒）、 Ｒ／Ｒｏ ＝０．７５ （７５％反応完結）、ＫＲ＝４
７２ （ＫＲ＝１／１２Ｋｄ （ジエー・カセイおよび
エフ・ダビドソン、上 記）であり、ここで Ｋ ｄ−ヒブリド化の選択条件下におけるＤＮＡの２次
速度恒数、かつ Ｋｄ＝１．７ ＸＩＯ’ ＸＬ７２ＸＮ−１〔ジェー・
アール・ハソトンおよ びジエー・ジー・ウエトムア、 「バクテリオファージＸ１７４ ＤＮＡ−ＲＮＡヒブリドの変性： ＲＮＡ長さ効果および核化速度恒 数」、ジャーナル・モレキュラー ・バイオロジー、第７７巻、第 ４９５〜５００頁（１９７３））、 Ｌ−９００（ｂ、ｐ、における鎖長：約９００は完全Ｉ
ＦＮ−αｃＤＮＡ 挿入物中に存在する〕 Ｎ＝９００（ヒブリド鎖のす、ｐ、における複合度；こ
こで複合度が９００ である理由は、ＩＦＮ−αｍＲＮＡ の９００個のヌクレオチドがＩＦＮ −αｃＤＮＡ挿入物の９００個の 相補的ヌクレオチドと結合するか らである〕 Ｃｏ ＝２．５ ｘｘｏ−’ （分析に使用すべき予
め測定された２０μｇの組替えＤＮＡ 分子を含有する４０μｌの溶液に 基づいており、ここでもＩ ＦＮ− αｃＤＮＡ挿入物は組替えＤＮＡ 分子の１／１２でありかつ５１２ 個のクローンの少なくとも１個に 生ずると仮定し、一つのＤＮＡ塩 基対の平均分子量として６６２を 与える〕 Ｒｏ＝８．７Ｘ１０−” （分析に使用すべき予め測
定された１２μｇのポリ（Ａ） ＲＮ Ａを含有する４
０μｌの溶液に基づ いており、ここでもポリ（Ａ） ＲＮ Ａは１ ： １
０．０００部のＩＦＮ−αｍＲＮＡを含有すると仮定し
く大過剰のＤＮＡ を与えれば異なる比率はヒブリド 化の割合に対し殆んど影響を与え ない）かつＲＮＡの１個のりボヌ クレオチドの平均分子量として ３４３を与える〕 である 】。 ３、初期分析の実施 工程Ａ：組替えＤＮＡ分子混合物の調製および開裂 所望数の細菌クローンを、上記のように添加されたトリ
プトン培地寒天板の上に接種し、これは機械用具を使用
して各ミクロ測定穴から一部を寒天板上に移して行なっ
た。３７℃で培養した後、各クローンは直径数ｌのコロ
ニーを形成した。全てのコロニーを寒天板から洗い取っ
て保存し、これを接種物として使用して上記のように添
加されたトリプトン培地１１に三角フラスコ２ａ中にて
接種した。この培養物を３７℃にて約０．８の見掛け０
Ｄ６５ｏ（肉眼推定）まで振とうした。１容量の添加ト
リプトン培地と１７０部ｇ／＋ａｌまでのクロラムフェ
ニコールを培養物に加え、これをさらに３７℃にて１６
時間振とうした。２０ｍ１のクロロホルムを加え、培養
物を３７℃にてさらに１０分間振とうすることにより細
菌を殺した（シー・ワイスマンおよびダブりニー・ポル
、上記〕、培養物をクロロポルＪ２からデカントしそし
て細胞を６００ Ｏｒｐｍか。 ゛つ４℃にて１５分間遠心分Ｍ（ツルバールＧＳ３型ロ
ータ）して集めた。各１１の調製物につき約１〜２ｇの
細胞が得られた。細胞を３０ｍ１の２０ｍＭ）リス−Ｈ
Ｃ１（ｐＨ７，５）中に懸濁させ、５０００ ｒｐｍか
つ４℃にて２０分間遠心分離しくツルバールＳＷ型ロー
タ）、そして３０ａ＋１の５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐ
）１７．５ ）中に再懸濁させた。０．２５容量のりゾ
チーム溶液〔５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５
）中１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、０℃にて１０分間冷却し
た後０．３３容量（初期５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ培養物
懸濁液の容量に対し）の０．５ Ｍ ＥＤＴＡ （ｐ
Ｈ８，０）を振とうなじに静かに混入させた。０℃でさ
らに１０分間の後、１／１６容Ｍ（初期容量に対し）の
２％トリトンＸ−１００を加えた。６０分後、試料をツ
ルバールＳＷ型ロータにて１０．００Ｏｒｐｍかつ０℃
で６０分間遠心分離した。上澄液を磁気攪拌機を備えた
ビーカー中に移し、３ＭのＮ ａ ＯＨを攪拌下に加え
てＰＨ１２，５に到らしめた〔ガラス電極と、オリオン
リサーチ６０１型ｐｌ＋計とを使用し、ベックマンｐｎ
ｔｏ炭酸塩緩ｆｉｉ液（Ｎ１３５０５）にて較正し、２
０℃にて測定した〕。２０℃にて１０分間攪拌した後、
ｐＨを８．５に調整した。さらに３分間攪拌した後、１
／９容量の５Ｍ ＮａＣ１と１容量のフェノール（蒸
留しかつ９．５ Ｍ Ｎ ａ Ｃ１で平衡化させたも
の）とを加えて激しく攪拌を５分間続けた。 １（Ｌ ０００ｒｐｎ＋かつ０℃にて１０分間遠心分離
（ツルバールＧＳＡ型ロータ）して相分離させた。 型■のＤＮＡ （環状二重鎖ＤＮＡ）を含有する上澄液
を中間相（単一鎖ＤＮＡを含有する）から注意して取り
出し、クロロホルムで３回抽出した（フェノールは大部
分がこの工程で除去された〕、型■のＤＮＡフラクショ
ンは、分析用に選択された５１２個のクローンの一部を
構成するような宿主細胞を形質転換させるのに最初に使
用した組替えＤＮＡ分子（ｐＢＲ３２２−ｃＤＮＡ挿入
物）を含をするであろう。 パンクレアチンＲＮＡアーゼＡ（５ｍｇ／ｍｌ。 ８５℃にて１０分間予備加熱）を型■のＤＮＡ。 に２０μｇ／ｍｌの濃度まで加え、混合物を３７℃にて
６０分間培養した。１１５容量の５ＭＮａＣ１を加え、
この混合物を３０％ポリエチレングリコール６０００
（ユニオンカーバイド社、１２０″Ｃにて２０分間オー
トクレーブにかけたもの）により最終濃度７．５％ＰＥ
Ｇまで調整した。−１０℃にて２〜１６時間の後、沈澱
を８ Ｑ ＯＯｒｐｍかつ０℃にて２０分分間ツルバー
ルＳ型ロータで遠心分離して集め、０．０７５ ＭのＮ
ａＣｌと０．００７５Ｍのクエン酸ナトリウムとの中に
吸光度２０ （２６０ｎｍにて）まで溶解させ、そして
０．５％ＳＤＳに調整した。この溶液をプロナーゼ０．
５ ｔａｉｒ／ ｎ＋１ （２０ｒｕｓｔ／ ｍｌにて
３７℃で２時間自己消化させたもの）と共に３７℃にて
３０分間培養し、１容量の蒸留フェノールで３回および
１容量％のクロロホルムで２回抽出した。試料（１に／
ｍ１ＤＮＡ溶液の２ｍｌまで）を５０ｍＭ）リス−ＨＣ
１（ｐＨ７，５） 、ｌ ｍＭＥＤＴＡ中の５〜２３％
蔗糖濃度勾配にて、ヘック７７ＳＷ２７型ロータにより
２１．ＯＯＯｒｐｍかつ１５℃で１５時間遠心分離した
。フラクションを集めてｏＤ２６ｃｆｒ−測定した。Ｄ
ＮＡ含有フラクションを集め、ＤＮＡを酢酸ナトリウム
とエタノールとにより沈澱させた。遠心分離により２０
〜１００μｇの型ＩのＤＮＡ混合物が回収された。 ２０μｇ（７）精製された型Ｔｆ７）ＤＮＡを、１５０
ｐｉの１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５） 、６ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ２−
メルカプトエタノール、２００μｇ／ｍ１１３ＳＡもし
くはゼラチン、および２０単位のＨｉｎｄｎ［にューイ
ングランド・ビオラブ社）の中で切断した。この）Ｉｉ
ｎｄＩ［Ｉ制限酵素はｐＢＲ３２２成分内の部位におい
て型■のＤＮＡを開裂させる（ｃＤＮＡ成分も開裂され
るとは思われず、もしそうならば分析は実質的に影響を
受けない筈である〕、３７℃で２時間の後、一部（１％
）を５０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７，８）、２ｍＭ
ＥＤＴＡ中の１％アガロースゲルにより５０ｍＡで１時
間電気泳動して分析し、切断が完結したかどうか確認し
た。切断が未完結であれば、さらにＨｉｎｄＩＩＩを加
えて培養を２時間続けた。型・■のＤＮＡが完全に線状
分子まで変換されたら、プロナーゼ（カルビオヶム社）
とＥＤＴＡとＳＤＳとをそれぞれ０．５ ■／ｍｌ。 １０ｍＭおよび０．５％となるまで加えた。３７℃で３
０分間の後、溶液を３０μｌフェノール−クロロホルム
（１： １）にて抽出した。有機相を５０ｔｔ１１の２
０ｍＭ）リス−）ＩＣＩ（ｐＨ７，５）、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡで洗浄し、そして合した水相をエーテルで３回抽
出し、０．１ ｍｌチェレックスカラムを通して濾過し
、ＥＤＴＡ−煮沸したパイレックスチューブに集めて、
１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量のエタ
ノールとにより再沈澱させた。−２０’Ｃにて一晩静置
した後、ＤＮＡを遠心分離により集めた。 工程Ｂ：ポリ（Ａ） ＲＮ ＡによるＤＮＡのヒブリド
化 ２種のヒブリド化混合物を鋼製した。混合物。 ■は、４μｌの１０倍濃度のヒブリド化緩衝液（４Ｍ
Ｎａ Ｃｌ、 ０．１パイブス（ｐＨ６，４，１，４
ピペラジンージエタンスルホン酸、シグマ社）と、５０
ｍＭ ＥＤＴＡと、０．５ ｐ １の約５ｎｇの■１
２５−グロビンｍＲＮＡ （５０００ｃｐｍ ）、６μ
ｌの誘発白血球ポリ（Ａ）ＲＮＡ（２μｇ／μｍ）とを
、卵母細胞中に注入した場合、６０００ＩＵの！ＦＮを
発生するに足る量で含有した。混合物■は、１０μｌの
上記からの１（ｉｎｄＩ［［で切断された型■のＤＮＡ
と、０．１μｇのＰｓｔｌ−切断されたＺ−ｐＢＲ３２
２（Ｈ３）／ＲｃβＧ ４．１３（ＨｉｎｄＩＩ［部
位にβ−ダグｌ：ヒン配列を含有するｐＢＲ３２２誘導
体）〔マンティ等、「クローン化した兎β−グロビン染
色体ＤＮＡにより形質転換させたねずみＬ８１胞におけ
る兎β−グロビンｍＲＮＡの生産」、ネイチャー誌、第
２８１巻、第４０〜４６頁（１９７９） ）とを含有し
た。混合物１における１１２５−グロビンｍ ＲＮ Ａ
および混合物Ｈにおけるβ−グロビンＤＮＡは、ヒブリ
ド化分析に対する内部陽性比較として作用する。再混合
物を窒素ガス流中にて乾燥した。４０μｌの８０％ホル
ムアミドを混合物Ｈの残部に加え、溶液を１００℃にて
１０分間変性させて、水中にて迅速に冷却した。変性溶
液を使用して混合物Ｉの残部を熔解させ、得られた溶液
を５６℃にて４時間培養した。 工程Ｃ：非ヒブリド化ポリ（Ａ） ＲＮ Ａからのヒブ
リド化ポリ（ハ）ＲＮＡ−ＤＮＡの分離 １ｍｌを冷０．９Ｍ ＮａＣ１と０．０９Ｍクエン酸
ナトリウムとホルムアミド（１００％）とで４％（容量
で）まで希釈した後、溶液をミリポアフィルタ−（０，
４５ｐｍ孔径）にて０．５ ｍｌ／ ａｋｉｎ 。 の速度で濾過し、フィルターを先ずＲＮＡ−ＤＮＡヒブ
リドを保持する能力について試験した。何故なら、製造
業者から得られたフィルターは必ずしも全てが同等に効
果的でないからである。 工程Ｄ：ヒブリド化ポリ（Ａ） ＲＮ Ａの精製ポリ（
Ａ） ＲＮ Ａヒブリドを付着した上記のフィルターを
１ｍｌの０．１５Ｍ Ｎ ａ ＣＩ 、０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳに３７℃にて１
０分間浸漬し、５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）
、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．２ｍＭＣａ ＣＩ ２で洗
浄しそして０．６ ｍｌの新たな緩衝液中に入れた。５
μｌのヨード酢酸処理したＤＮＡアーゼ（５■／ｍｌ）
を添加した後〔ニス・ビー・チンメルマンおよびジー・
サンディーン、アナリティカル・バイオケミストリー、
第１４巻、第２６９頁（１９６６）、ビー・ニー・プラ
イス等、「牛膵臓デオキシリボヌクレアーゼの活性部位
におけるヒスチジン残基のアルキル化」、ジャーナル・
バイオロジカル・ケミストリー、第２４４巻、第９２４
〜９３２頁（１９６９））、フィルターを３７℃にて１
０分間培養した。 フィルターを除去し、溶液を１容量のフェノールと１容
量のエーテルとで抽出しそして０．１ｍｌｍｌチェレッ
クスカラムした。５μｇのキャリヤＲＮＡ （精製酵母
ＲＮＡ）を溶液に加え、。 ＲＮＡを酢酸ナトリウムとエタノールとで沈澱させた。 １０．０ＯＯｘ ｇでの遠心分離により沈澱を集め、
１００μｍの１ｍＭ ＥＤＴＡ中に熔解させ、１００
℃にて９０秒間加熱し、Ｔ、ＮＥとＳＤＳとを２ｘＴＮ
Ｅおよび０．５％ＳＤＳ！、：なるまで加えた。ＲＮＡ
を１００μｌのオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着
させζ０．３ ｍｌの蒸留水で４回洗浄して溶出させ、
酢酸ナトリウムとエタノールとで沈澱させた。−２０”
Ｃで１６時間の後、沈澱したＲＮＡを遠心分離により分
離し、２μｌのＴＮＫ緩衝液中に熔解させた。 工程Ｅ ： Ｉ ＦＮ−αｍＲＮＡ活性の測定上記から
のポリ（Ａ） ＲＮ Ａ ｍ液を４０個の卵母細胞中に
注入した（卵母細胞１個当り約５０ｎｊり卵母＄１［１
胞を２３℃にて２４〜４８時間培養し、ホモジナイズし
そして遠心分離しくまたは培養培地を回収し）、前記し
たようにＩＦＮ−αにつき分析した。 ４．１１を分析：フィルター結合したＤＮＡに対するヒ
ブリド化 単−クローンからの組替えＤＮＡ分子の後分析は大部分
、ＤＢＭもしくはＤＰＴ紙結合したＤＮＡについて行な
った。何故なら、分析条件はもはや臨界的でなくかつ分
析がより便利となるからである。ＤＰＴ紙はより低い誤
差を与え、したがって優先的に使用した。Ｄ Ｂ Ｍ紙
は文献〔ジェー・シー・アルウィン等、「ジアゾベンジ
ルオキシメチル紙への移行によるアガロースゲルにおけ
る特定ＲＮＡの検出およびＤＮＡ試料によるヒブリド化
の方法」、プロシーディング−ナショナル・アカデミ−
・サイエンス・ＵＳＡ、 、第１４巻、第５３５０〜５
３５４頁（１９７７））に記載されているように調製し
ψた。ＡＰＴ紙はビー・シード（ペルス・コミューニケ
ーション）の方法により調製した；ワットマン５４０の
紙片（２０ｇ）を７０ｍ１の０．５ＭＮａＯＨ１２ｑ／
ｍｌ Ｎ ａ Ｂ Ｈ＊および３０ｍ１の１．４−ブ
タンジオールジグリシジルエーテルの混合物と共に２０
℃にて１６時間攪拌した。 次いで、この紙をアセトン４０ｍ１中の２”−アミノチ
オフェノール１０ｍ１の溶液に移し、１０時間攪拌した
。紙をアセトン、０．１Ｎ ＨＣＩ。 Ｈ２Ｏ，０，Ｉ Ｎ ＨＣｌ５Ｈ２０で徹底的に洗浄
しそして乾燥させた。ＡＰＴ紙を、ＡＢＭ紙からＤＢＭ
紙への変換について記載されていると同様に、ＤＰＴ紙
に対しジアゾ化させた〔アルウィン等、上記〕。 ＤＮＡ （１５μｇまで）を５０Ｗ２のジアゾ化ＡＢＭ
（ＤＢＭ）またはジアゾ化ＡＰＴ（Ｄ Ｐ Ｔ）紙に
結合させ〔ジェー・エッチ・ジェー、ペイジメーカー等
、「トリパノソマ・プルセイの表面グリコ蛋白変種のた
めのメツセン。 ジャーＲＮＡに相補的なりＮＡを含有するプラスミドの
単離」、ジーン誌、印刷中（１９８０））これを下記に
示す。 ヒブリドブラスミドＤＮＡをエンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉで切１折し、１ｍｌ当り５００μｇのプロナーゼと０
．５％のＳＤＳと１０ｍＭのＥＤＴＡとで３７℃にて３
０分間処理し、フェノールとエーテルとで抽出し、０．
１ ｍｌのチェレックスカラムに通しそしてエタノール
で沈澱させた。熱変性したＤＮＡ （５μｇまで、少量
のＰ”−ＤＮＡをトレーサーとして加えた）をｌｃｄの
ＤＢＭもしくはＤＰＴ紙と共に２００μｌの２５ｍＭ燐
酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，５）中で０℃にて一晩培養
した。濾紙を、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐｌ（６
，５） 、 １％グリシンにて室温で５分間３回および
９９％再結晶化ホルムアミドで３回洗浄した。９９％ホ
ルムアミドと共に６８℃にて２分間さらに培養した後、
５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，５）中で２０℃
にて３回および０．４Ｍ ＮａＯＨ中で３７℃にて１
０分間２回洗浄した。約４０〜６０％の放、射能がフィ
ルター上に保持された。フィルターを、１％グリシンを
添加した予備ヒブリド化培地Ａ中で３８℃にて３時間培
養し、この場合フィルクー１ ｆｌＭ当り３３０μｌを
使用した。培地Ａは、５０％ホルムアミドと、５ｘＳＳ
Ｃと０．０４％ポリビニルピロリドンと０．０４％フィ
コール（ファーマシア社）と０．１％ＳＤＳと２５μｇ
ポリ（Ａ）（ピー・アンド・エル社）と１００μｇ酵母
ＲＮＡ （ＢＤＨ、フェノールで６回抽出し、エタノー
ルで沈澱させたもの）とを含有する。 フィルターを培地Ａ中で２回洗浄し、次いで培地Ａ中に
てパラフィン油の下で上記したようにポリ（Ａ） ＲＮ
Ａにより（通常５〜８μｇ）３８℃にて１６時間ヒブ
リド化させた。ＲＮＡは次のようにして付加させた。一
枚の濡れたＤＮＡフィルターを吸水させ、無菌ペトリ皿
中に入れ、このフィルター上に２０〜４０μｌのＲＮＡ
溶液をピペットで載置し、第二のＤＮＡフィルター（再
現または比較）をその上に載せ、そしてこのサンドイン
チを無菌パラフィン油で覆った。 ヒブリド化の後、フィルターを順次に培地Ａ（２回）、
１ｘＳＳＣと０．２ ％ Ｓ Ｄ Ｓと１ｍＭＥＤＴＡ
とを含有する溶液（それぞれ２０”Ｃで１０分間３回）
、培地Ａ（３８℃で２時間）および５０％ホルムアミド
、５ｘＳＳＣＳＯ，１％ＳＤＳ （２０℃で１０分間３
回）で洗浄した。 ヒブリド化したＲＮＡを、２００μ／の１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ （ｐＨ７，４） 、１ｍＭ ＥＤＴＡお
よび０．１％ＳＤＳ中で１００℃にて１分間加熱するこ
とにより溶出させた。溶出工程を２回反復し、溶出液を
合し、そしてＲＮＡを２μｇの酵母ＲＮＡ （上記のよ
うに精製したもの）の添加の後、エタノールにて沈澱さ
せた。洗浄したベレットを減圧乾燥し、３μｌのＨ２Ｏ
中に熔解させそして卵母細胞中に注入した。ｆＦＮ−α
活性を上記のように分析した。 ５、ＲＮＡ選択選択リプリド化分析果 ５１２個のクローンの８群（すなわち、群Ｔ１Ｙ＜ Ｊ
、、に、 ・、０１εおよびπ）の分析は陰性であっ
た。５１２個のクローンの４群（すなわち、■、δ、Ｎ
およびλ）の分析は陽性であり、ただし同一でなかった
。陽性分析は次のように記録される：ポリ（Ａ） ＲＮ
Ａ −Ｄ Ｎ Ａヒブリドから遊離されたＲＮＡによ
り生成されたＩＦＮ−αのＩＵ／ｍ１（Ｚ−ｐＢＲ３２
２（Ｈ３）／ＲｃβＧ−４，１３（上記）を使用する比
較ヒダリド１ヒの分析〕 ；ここで実験結果が比較より
も高い分析値には下線を施こした。 亙 ＩＵ／ｍ１ １ ＜６０（＜６０） ；１１０ （＜２０）
；＜１１０（＜１１０） ｉ＜１１０ （＜１１
０） 、＜３５（＜３５） δ ２０ （＜ ２０） Ｎ ３５（＜２０） ；＜１１０ （＜１１０）
；２００（＜１１０） λ ＜６０（＜６０） ；旦喝（＜２０） ；＜１
１０ （＜１１０） ；＜１１０ （＜１１０） 群λを６４個のクローンの８つのサブグループに分割し
、ヒブリド化させ、そして前記のように分析した。サブ
グループは上記と同様に表わして、次の結果を与えた： ザブグループ ＩＵ／ｍｌ λ−Ｉ ＜３５（＜３５） ；＜３５（＜３５）λ
−■ 工（＜ ３０） ｉ ＜ ４５ （＜ ４５）
λ−■ 恣！５ （＜３５） ；匪（＜３０）；並
（＜３０）ｉｙ度（＜ ３０） ； ＜ ２０ （＜
２０）λ−■ 益（＜ ３５） ； ＜ ２５ （
＜ ２５）λ−ｖ ＜３５（＜３５） λ−Ｖｌ ＜３５（＜３５） λ−■ ＜ ３５ （＜ ３５） λ−■ ＜３５（＜３５） サブグループλ−■を８個のクローンの８紐に分割し、
ヒブリド化させそして分析した。 ！ｊＬＩＵ／ｍｌ λ−１１１−１ ＜２０（＜２０） 、＜２０（６
０） ；３５（＜３０）λ−ｍ−２ ＜３５ （＜
３５） ； ＜３０ （＜３０） ； １５０（＜
２０）、甜狙 （＜３５）；ユ（６ｏ）λ−ｍ−３
＜２５（＜２５） ：＜３０（＜３０＞λ−ｍ−４
３０ （＜３０） ： ＜２０ （＜２０） ；
＜２０ （６０）λ−ＩＩＩ−５ ３０（？） （＜
３５） ；＜２０（＜２０） ；＜３５（６０） λ−１１１Ｆ−６＜３０（＜３０） 、＜２０（＜２
０）λ−ｍ−１ ＜３０（＜２０） λ−１１１−８ ＜３０（＜２０） 第一の陽性結果は組λ−ｍ−４により達成されたので、
この組の個々のコロニー（Ａ−Ｈと云う）をヒブリド化
させかつ分斤した。 λ−Ｉ１１−４−８ ＜３５＊ （＜３５） ；＜
２０（６０）Ａ −ｍ−４−ｃ ３５ （６０）
Ｈ６０＊ （＜３５） ； １１１ ＊（＜１１）
； １１＊（＜１１） ；２０（＜２０）Ｉ Ｄ
ＢＭ紙をこの分析に使用した。 したがって、クローンλ−Ｉ１１−４−Ｃは、ＩＦＮ−
αｍＲＮＡをヒブリド化しう名紙替えＤＮＡ分子を含有
する。 このクローンにおける組替えＤＮＡ分子は次の通りであ
る： Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ） ／ＨｃＩＦ−４
Ｃ（“Ｈｉ ｆ−４Ｃ”）およびこれを含有する細菌菌
株：イー・コリＸ１７７６（Ｚ−ｐＢＲ３２，２（Ｐｓ
ｔ、）／ＨｃＩＦ ４Ｃ）（“イー・コリＨｉｆ−４
Ｇ”〕、この名称は、組替えＤＮＡ分子がチューリッヒ
（Ｚ）に起源しかつＰ ｓ ｔ ｒ部位にＨｒ ＦＮ−
ｃｔｃ ＤＮＡ（“ＨｃｌＦ”）を含有するプラスミド
ｐＢＲ３２２であることを示し、特定の組替えＤＮＡ分
子はクローンλ−Ｉ［ｒ−４−Ｃ（“４Ｃ”）に由来す
る。 形質転換細胞の第一次クローンはしばしば２種以上の組
替えＤＮＡ分子を含有するので〔エフストラチアジス等
、「クローン化ＤＮＡから決定された兎β−グロビンｍ
ＲＮＡの第一次構造」、セル誌、第１０巻、第５７１〜
５８５頁（１９７７））、Ｈｉｆ−４Ｃをイー・コリＸ
１７７６ （Ｈｉｆ−４Ｃ）クローンから単離して上
記のように精製した。Ｈｉｆ−４ＣおよびｐＢＲ３２２
の試料をＰｓｔＩで切断し、１％アガロースゲル上での
電気泳動により分析した。 Ｈｉｆ−４Ｇは２つのバンドを与え、１つはＰｓｔ−開
裂ｐＢＲ３２２の移動度を有し、他方は約３２０ ｂ、
ｐ、に相当する移動度を有した。 イー・コリＨＢ ｌ ０１を上記のように単離１１ｉｆ
−４Ｇにより形質転換させた。テトラサイタリン耐性か
つ形質転換した細菌の６個のクローンを採取し、小培養
物をａ！ｔ！Ｌ、型ＩのＤＮＡを精製しそしてＰｓｔｌ
開裂およびアガロースゲル電気泳動により前記と同様に
分析した。全ての試料は、Ｈｉｆ−４Ｃと同一の開裂様
式を示した。これらの再クローン化した組替えＤＮＡ分
子の１つはＺ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／ＨｃＴＦ−
４ｃ （Ｈｉｔ−４ｃ”）と呼ばれ、後の実験用に使用
した。小文字“Ｃ”は再クローン化したＤＮＡ分子を意
味する。 ＩＦＮ−αｍＲＮＡにヒブリド化するＨｉｆ−４ｃおよ
びそのｃＤＮＡ挿入物の能力を測定するため、Ｈｉｆ−
４ｃ （１１５μｇ）を１２５単位のｐｓｔＩにより完
結するまで切断し、フェノールとクロロホルムとで抽出
しそして上記したようにエタノールで沈澱させた。１部
（１′０μｇ）を５′末端標識した（後の工程における
トレーサーとして役立つ）が、これは１００μｌの５０
ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７，５’）中に１部を溶解さ
せ、これを０．１ ｍｌのチェレックス１００型カラム
に通しそしてこれを０．６ 学位の細菌性アルカリホス
ファターゼにより６５°Ｃで１時間処理して行なった。 １０倍濃度のＴＮＥ（４０μＮ）を加え、この溶液を１
容量のフェノールで３回および１容Ｉのクロロホルムで
３回抽出した。ＤＮＡを２容量のエタノールで一２０℃
にて一晩沈澱させ、遠心分離によって回収した。 さらに精製するため、０．５ ｍｌＴ Ｎ Ａ中の試料
を０．２５ｍ１のＤＥＡＥセルロース（ワットマンＤＥ
５２．２ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣ１，５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５） 、２ｍＭ ＥＤＴＡ
にて予備洗浄）（“ＮＥＴ−緩衝液”）に吸着させ、２
ａ＋ＩのＮＥＴ緩衝液で洗浄し、０．４ ｍｌの１．５
Ｍ ＮａＣ１，２０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５
） 、２ｍＭ ＥＤＴＡにて溶出させそして上記のよ
うにエタノールで沈澱させた。 Ｄ、ＮＡをｒ−Ｐ” −ＡＴＰ （比活性約５０００Ｃ
ｉ／ミリモル）およびポリヌクレオチドキナーゼと共に
培養し〔ニー・エム・マクサムおよびダブリュー・ギル
バート、ｒＤＮＡの新規な配列決定方法」、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ
、 第７４巻、第５６０〜５６４頁（１９７７））、そ
してＴＮＥ中３ｍｌのセファデックス−０５０カラムで
クロマトグラフにかけて精製しＦ、溶出させたフラツジ
ぢンを集め、Ｐ３２−ＤＮＡを上記のようにエタノール
で沈澱させた。収量は約１０７６ρｍであった。 未標識Ｐｓｔｔ−開裂Ｈｉｆ−４ｃＤＮＡ（９０μｇ）
を上記からの６Ｘ１０’ｄｐｍのｐ３２−標Ａ６Ｐｓｔ
ｌ−開裂Ｈｉｆ−４ｃＤＮＡと混合し、５０ｍＭトリス
−酢酸緩衝液（ｐＨ７，８）中の１０Ｘ２０Ｘ０．７１
の２％水平アガロースゲルに２．５ ｃｍスロットによ
り通して電気泳動させた。Ｘ線フィルムをゲルに露出さ
せ、３２０ｂｐ断片の位置を決定した。放射能バンドを
有するゲル片（１，３Ｘ １０５ｄｐｍ ）を切り取り
、プラスチック製２ｍｌ注射器で圧砕し、ゲル容禎の１
０倍量のＮＥＴ緩衝液と共に攪拌することにより４℃で
一晩抽出した。ＤＮＡを０．１ ｍｌのヒドロキシアパ
タイトカラム（１ｍｌのＮＥＴｉ街液で予備洗浄）に吸
着させた。カラムを１ｍｌの０．１Ｍｍ酸カジカリウム
緩衝液Ｈ７，５）で洗浄し、ＤＮＡを０．２ ｍｌのＩ
ＭＲ酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で溶出させた。溶
出液を滅菌蒸留水で１０倍に希釈し、ＤＮＡをＤＥＡＥ
に吸着させかつそこから溶出させそして上記したように
エタノールで沈澱させた。このＤＮＡを″Ｈｉｆ−４ｃ
断片”と呼ぶ。 Ｈｉ ｒ −４ｃ断片（１２０ｎｇ）をＤＰＴ紙（０，
５Ｘ Ｏ，５Ｃ１１）に上記のようにして結合させ
□た。比較としては、１２０ｎｇのβ−グロビンｃ
ＤＮＡ断片をヒブリドブラスミドＺ−ｐＢＲ３２２（Ｈ
３）ＲｃβＧ −４，１３から）（ｉｎｄｎ［により切
断し〔エフ・マイヤー等、［ベクトルからベクトルへの
、ＡＴ結合したクローン化ＤＮＡの転位」、エキスペリ
メンチア、第３５巻、第９７２頁（１９７９）；エフ・
マンティ等、上記〕、そして同様に処理した。ポリ（Ａ
＞ＲＮＡ（２０μβ）に対する複製フィルターのヒブリ
ド化と、フィルターの洗浄と、フィルターからのＲＮＡ
の回収とは上記と同様にして行なった。卵母細胞中に注
入した後、次のＩＦＮ−α活性が検出された。 白血球ポ ヒブリド ＩＦＮ−α活 ＤＮＡ断片 リ（Ａ）ＲＮＡ＊ 化時間 性（ＩＵ
／ｍｌ） ＊Ｈｉｆ−４ｃ ２．５ １６ｈ
２５０；１００β−グロビン ２．５ １６
ｈ ４；１ ＤＮＡ Ｈｉｆ−４ｃ ７．５ １６ｈ ３０００
；１０００β−グロビン ７．５ １６ｈ
４；３０ＤＮＡ Ｈｊ ｆ −４ｃ ７．５ ５ｈ １０
００ ｉ １０００β−グロビン ７，５ ５
ｈ １０；１ＤＮＡ ＊ このＲＮＡ １Ｍｇは４６００１Ｕ／ｍｌを与
えた。 ＊＊ ４８時間培養後の卵母細胞上澄液、細胞病理学効
果の減少により分析〔ダブリュー・イー・スチュアート
・ｎおよびニス・イー・スルキン、上記〕 かくして、Ｈｉ ｆ −４ｃはＩＦＮ−αｍＲＮＡにヒ
ブリド化しうる挿入物を含有する。 組替えＤＮＡ分子Ｈｉｆ −４ｃ ニおけるｃＤＮＡ揮
入物は僅か約３２０ ｂ、ｐ、であったか、またはＩＦ
Ｎ−αｍＲＮＡの第三の推定寸法であったので、上記の
精製Ｈｉｆ−４ｃ断片を試料として使用し、関連ヒダリ
ドＤＮＡ挿入物を有する組替えＤＮＡ分子を含有する細
菌クローンを選別した。 上記したサブグループλ−■を構成する６４個の細菌ク
ローンをミリボア膜（直径８ｃｍ）上にスタンプし、寒
天板（ジアミノピメリン酸、ナリジキシン酸およびテト
ラサイクリンを上記のように添加）上にｉｔしそして３
７℃で２４時間培養した。フィルターを０ 、７５ｍ
Ｉ液滴の０．５ＭＮａＯＨ上に載せ、２〜３分間後に紙
タオル上に移して過剰の液体を除去し、工程を反復した
。ＩＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）を用いてフィ
ルターを中和し、上記と同様にして１．５ＭＮａＣ１−
０，５Ｍ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，４）で洗浄し、そし
て風乾させた。フィルターを０．３ＭＮａＣ１中に浸漬
し、風乾し、そして８０℃にて減圧下に２時間加熱した
。 Ｈｉｆ−４ｃ Ｐｓｔ断片（３０ｎ ｇ）を、β−Ｐ
” ２−ｄＡＴＰとα−Ｐ” ２−ｄＣＴＰ（それぞれ
、比活性４０ Ｃｉ ／ ミリモル）とを用いてニック
翻訳〔ニー・リュー・ジエフリーおよび一アール・ニー
・フラベル、「兎β−グロビン遺伝子はコード配列中に
大きな挿入物を含有する」、セル誌、第１２巻、第１０
９７〜１１０８頁（１９７７））によりｐ３２−標識し
た。λ−■コロニーを有するフィルターを４セツト〔セ
ットは０．１５Ｍ Ｎａ ＣＬ ３０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ （ｐＨ８，０） 、１ｍＭ ＥＤＴＡである
〕と０．１％（Ｗ ／ Ｖ ）フィコールと、０．１％
ポリビニルピロリジン（！：０．１％（ｗ／Ｖ）ＢＳＡ
と、０．５％ＳＯ３と２００βｇ／ｍｌ変性断片化鮭精
子ＤＮＡとにおいて６８℃で７時間予備ヒブリド化させ
、次いで４セントと０．０２％（Ｗ／Ｖ）フィコールと
０．０２％ポリビニルピロリジンと０．０２％（Ｗ／Ｖ
）ＢＳＡと０．５％ＳＤＳと２００βｇ／ｍｌ変性鮭精
子ＤＮＡとにおいて２Ｘ１０’ｃｐｍのｐｆｆ２−標識
Ｈｉｆ−４ｃ断片゛にて６８℃で１６時間ヒダブド化さ
せた。このフィルターをセット−０，５％ＳＤＳにより
室温で洗浄し、２セント−０，５％ＳＤＳにて６８℃で
５時間洗浄し、溶液を１回交換し、３ｍＭトリズマベー
スにより室温で４時間洗浄し、溶液を１回交換した。フ
ィルターを乾燥した後、Ｘ線フィルムをスクリーンによ
りフィルターに８０時間露出させた。３つのコロニー、
すなわちλ−Ｉ［１−７Ｄ、λ−ＩＩＩ−２Ｈおよびλ
−■−４０は強力な陽性反応を示し、そして２つのコロ
ニー、すなわちλ−ｍ−ｉＥおよびλ−■−３Ｄは弱い
反応を示した。 Ｈｉ ｒ −４ｃ関連クローンから小培養物を調製し、
型ＩのＤＮＡを精製し、ＰｓｔＩで開裂させそして上記
のようにアガロースゲル電気泳動により分析した。全て
の型ＩのＤＮＡは大きな断片（プラスミドｐＢＲ３２２
成分）と小さい断片（ヒブリド挿入物）とを生じた。λ
−■−２Ｈからの組替えＤＮＡ分子は、最大の挿入物、
すなわち約９００ ｂ、ｐ、を遊離した。この組替えＤ
Ｎ Ａ分子をＺ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／ＩＴｃ
ＩＦ−２Ｈ（’Ｈｉ ｆ−２Ｈ’″）と名付け、その
挿入物を“Ｈｉｆ−２Ｈ断片”と名付ける。 Ｈｉ ｆ−２Ｈを、そのＩＦＮ−αｍＲＮＡを結合する
能力につき試験し、これは全て上記したようにＤＰＴ紙
（４μｇ／１００ｍ２）に結合させてポリ（Ａ）ＲＮＡ
（０，３μｇ／μｌ）に１６時間ヒダブド化させ、そ
してＩＦＮ−αｍＲＮＡ活性を測定することにより行な
った。 ＤＮＡ試料 ＩＦＮ−α活性Ｔ（ｉ ｆ −
２Ｈ２５０±５０ （４回測定の平均値） Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｈ３） ３０／ＲｃβＧ−
４，１３（２回測定の平均値）ｐＢＲ３２２２０ ＊ 細胞病理学的効果の減少により分析Ｈｉ ｆ−２Ｈ
を、）（ｉｆ−４Ｃについて記載したと同様に再クロー
ン化させ、これをＨｉｆ−２ｈと名付ける。 別の実験において、組替えＤＮＡ分子を含有するさらに
一組の大腸菌クローンを調製し、標１Ｈｉｆ−４ｃ断片
にダブリド化するコロニーを同定した。長ｃＤＮＡ挿入
物を有するプラスミドの高収量を確保するため、白血球
ポリ（Ａ＞’ＲＮＡから酵素的に調製した二重鎖ｐ１２
−標識白血球ｃＤＮＡの１部を、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ
の遠心分離について記載したと同じ手順で蔗糖濃度勾配
により遠心分離して寸法的に分別した。 ６００ ｂ、ｐ、ＤＮＡ断片もしくはそれ以上に対応し
た沈降速度を有するｃＤＮＡを含有するフラクションを
集め、エタノール沈澱の後にｃ ＤＮＡを回収した。ｃ
ＤＮＡをｄＣＭＰ残部により伸長させ、ｄＧＭＰ伸長し
たＰｓｔｌ開裂ｐＢＲ３２２にダブリド化させそしてこ
のダブリドＤＮＡを使用して前記のように大腸菌を形質
転換させ、この場合大腸菌としてイー・コリＨＢ１０１
を使用した。細菌を直径３ ｃｍのミリポアフィルタ−
上に分布させ、トリプトン培地寒天板（１０μｇ／ｍｌ
のテトラサイクリンを含有する）の上に載置しそして小
コロニーが出現するまで生育させた。新たな濡れたミリ
ポアフィルタ−をコロニー保持フィルターの上に押圧さ
せ、剥離し、その面を上に向けて４．４％グリセリン含
有の寒天板の上に載置しそして小コロニーが出現するま
で培養することにより、複製フィルターを調製した。こ
のコロニー保持フィルターをさらにミリポアフィルタ−
で覆い、−５５℃にて凍結させて貯蔵した〔ディー・ハ
ナハンおよびエム・メセルソン、「高密度プラスミド選
別に関する記録」、１９７８年９月私的通信〕。 全部で約５０００個のコロニーを保持する１５枚のフィ
ルターを調製した。各フィルターの一複製物を用いて、
上記したと正確に同様に、ｐ ３２−標識Ｐｓｔｌ−切
断Ｈｉｆ−４ｃＤＮＡ断片にダブリド化させた。約１８
５１１１の陽性コロニーが放射能写真上で同定され、ミ
リポアフ・イルター上で再クローン化させそしてヒブリ
ド化により再度同定した。最強のダブリド化反応を示す
９５１固のクローンをＺ−ｐＢＲ３２２（ＰＳｔ）／Ｈ
ｃ ＩＦ−ＳＮＩ乃至５Ｎ９５と名付け、後の研究に使
用した。 勿論、ＨｕｌＦＮの免疫学的もしくは生物学的活性（下
記）を示すポリペプチドを生産する能力がＨｉｆ−２ｈ
に与えれているので、このＨｉｆ−２ｈおよびその他の
これに関連するＤＮＡ配列、たとえばＨｉｆ−４ｃをこ
のクローン選別法に使用することができ、さらに組替え
ＤＮＡ技術、合成、天然源もしくはそれらの組合せから
生ずるＤＮＡ配列を含有する池のクローン、或いは単一
もしくは多重のペース置換、挿入、転位もし゛くは欠失
を含む突然変異により他のＤＮＡ配列を選別するよう上
記ＤＮＡ配列のいずれかに関連するクローンおよびＨｕ
ｌＦＮをコードするクローンについても全く同様に使用
できることが明らかである。したがって、この種のＤＮ
Ａ配列およびそれらの同定も本発明の範囲内である（た
とえば下記〕、また、上記ＤＮＡ配列により選別されず
、しかもそれらのヌクレオチド配列の結果、上記ＤＮＡ
配列の発現によりコードされたポリペプチドを発現にお
いてコードするようなりＮＡ配列も本発明の範囲内であ
る。 Ｈｌｆ−２ｈＤＮＡ挿入物の他の特性化上記したように
組替えＤＮＡ分子Ｈｉｆ−２ｈは約９００ ｂ、ｐ、の
挿入物を含有し、ひと白血球インターフェロンｍＲＮＡ
にヒブリド化する。 下記の付加的特性をさらに決定した。 １、ダブリド抑制翻訳 ｍ ＲＮ Ａをクローン化された相補的ｃ ＤＮＡにダ
ブリドｊヒさせれば、ｍＲＮＡの翻訳は抑制されるが、
ダブリドの熱変性は翻訳可能なｍＲＮＡヲ＞Ｍ 離する
〔ビー・エム・パターソン’Ｊ、ｒＤＮＡ−ｍＲＮＡヒ
ブリダブ抑制された無細胞翻訳による構造遺伝子同定お
よび地図化」、プロシーディング・ナショナル・アカデ
ミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻、第４３７０〜４
３７４頁（２９７７） ：ｌ 、 ２．２ ｐｇのＰｓ
ｔＩ−切断Ｔ（ｉ ｆ −２ｈおよび比較として２ｐｇ
のＨｉｎｄ■−切断Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｈ３）／Ｒｅβ
Ｇ−４，１３（ＲｃβＧ″）を、１０μｌの８０％（Ｖ
／Ｖ）脱イオン化ホルムアミド−２０ｍＭパイブスｔｆ
＆ｔＥ液（ｐ１１６．４）において８０℃で１０分間変
性させた。溶液をエフペンドルフ管に加え、ここには予
め白血球ポリ（Ａ）ＲＮＡ（５μｇ）とＮａＣ１（４＃
モル）とＥＤＴＡ（１０ｎモル）とを乾燥させておいた
。混合物をパラフィン油層の下で４８℃にて７時間加熱
し、冷却しそして２００μｌのＨ２Ｏで希釈した。２つ
の試料を竿部に分割し、それぞれの一方を１００℃にて
３０秒間加熱した。核酸をエタノールにより沈澱させ、
３μｌのＨ２Ｏ中に熔解させそＥｃｏＲＴ ２０
９．６７６．７４８ 、 ７４８．３６１１＋Ｐｓｔ
Ｉ ３６１１ Ｆｉｓｐ Ｔ ９２１ 、 ５８７．５４０、
５８７．５４０．５０４．４５７．４３４ 、 ５０
４．４５７．２ｘ２３１ 、 ４３４
．２６７、＋１４断片 ＋１４断片 ２００ｂｐ ２００ｂｐＭｂｏ Ｕ
１６１６．８８４ 行なわずおよびその
他 ＊＊ 内部的に一致しているが、これら断片の絶対寸法
は第８〜１０図を参照して最も良く示される。 ＊＊＊サソトクリフ（上記）から。 さらに、５′末端ｐ３２−標識ＰｓｔＩ切所Ｈｉｆ−２
ｈを数種の制限酵素で開裂させ、組替えＤＮＡ分子中の
ｃＤＮＡ挿入物から生じた放射性断片の寸法を測定した
。 ＥｃｏＲＩ ６７６．２０９ Ｈｉ ｎ ｄ ［［ｒ 開裂せずＢｓｐｌ
７９９．８６ １−！ ｐ ａ ＩＩ 開裂せずＨｈａ ｒ
開裂せず ｎ ａ ｍ ＨＩ 開裂せず Ｈｉｎｆ ２１０．６２ ６ｇｌＵ ５４５．３４０ ＊ 内部的に一致しているが、これら断片の絶対寸法は
第８〜１０図を参照して最も良く示される。 これらのデータから、Ｈｉｆ−２ｈの制限地図を推定し
た（第４図）、この地図は部位の絶対位置に関し決定的
でなく、挿入物内のＭｂ。 ■部位に関し不完全であろう。挿入物に最も近い部位の
みがｐＢＲ３２２成分内に示されている。矢印はＩＦＮ
−αｃＤＮＡコードストランドの方向性を示している。 本発明のクローンにおけるＨｉｆ−２ｈ断片もしくはそ
の他挿入物の実際的構造またはそれからコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列もしくは構造は本発明を実施
する上で当業者に必要とされないが、上記データおよび
制限地図を本願出願時における断片構造に関し最も良く
利用しうる清報として本出願中に含ませる。爾来、期待
されるように（上記）、Ｈｉｆ−２ｈ断片に関するこれ
らデータおよび制限地図は、ヌクレオチド配列決定およ
び制限分析の周知技術を用いて精選されている〔たとえ
ば、ニー・エム・マクサムおよびダブりニー・ギルバー
ト、ｒＤＮＡの新規な配列決定方法」、プロシーディン
グ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第
７４巻、第５６０〜５６４頁（１９７７）〕、プラスミ
ドＤＮＡをウィルキーの論文第８６１〜８６２頁に記載
された方法Ｂにより調製し〔エフ・エム・ウィルキー等
、「単純庖疹ウィルスＩの活性チミジンキナーゼ遺伝子
を含有するダブリドプラスミド」、ヌクレイツク・アシ
ッド・リサーチ、第７巻、第８５９〜８７７頁（１９７
９））、業者により推奨されるように各種制限酵素で制
限化し、ただし２００μｇ／ｍｌのゼラチンを牛血清ア
ルブミンの代りに酵素緩衝液中に使用した。［ＥｃｏＲ
Ｉはダブリュー・ポルから寄贈され、Ｂｓｐｌはニー・
キスから寄贈され、その他の酵素はニューイングランド
・ビオラブ社から得られた］。 制限ＤＮＡ（２０Ｍｇ）をフェノールで抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、０．０５Ｍ ）リス−ＭＣＩ（ｐＨ８
）中に溶解させそしてチェレックス１００の小カラムに
通した。フラッシュ（ｆｌｕｓｈ）もしくは５゛−結合
末端を有する断片を、２００μｌの０．０５Ｍ ）リス
−ＨＣＩ（ｐｉ（８）中においてＤＮＡ５’末端ｐモル
当り０．２単位の子牛腸アルカリホスファターゼ（ベー
リンガー社）により３７℃で６０分間処理して脱燐酸化
させた。酵素を６５℃で６０分間加熱することにより失
活させた。３゛結合末端を有するＤＮＡ断片については
、細菌性アルカリホスファターゼ（ワーシングトン社）
を文献〔ニー・エム・マキサムおよびダブりニー・ギル
バート、上記〕に記載されているように使用し、た。 だし培養は６５℃にて３０分間行なった。脱燐酸化ＤＮ
ＡはＤＥＡＥ−セルロースに吸着およびン容出させて楕
製し〔ダフ゛リエー・ミエーラー等、ｒＤＮＡにおける
部位指向性変異ニアミノ酸１２１〜１２３に対応する位
置におけるクローン化β−グロビン相補ＤＮＡのポイン
ト変異の発生」、ジャーナル・モレキュラー・）くイオ
ロジー、第１２４巻、第３４３〜３５８頁（１９７Ｂ）
）、或いはこれを必要に応じポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけた（下記参照〕、ポリアクリルアミド（も
しくはアガロース）ゲルから０．１５Ｍ Ｎ ａ Ｃ
１，０，０５Ｍ ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ８）中に回
収した断片を０．１ ｍｌのヒドロキシアパタイト（ビ
オラドＨＴ Ｐ社）カラムに吸着さ一亡、０．１Ｍ燐酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌで４回洗浄しそして０
．３ ｍｌの１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で溶出
させた。この溶液を１０倍希釈し、ＤＮＡをＤＥＡＥ−
セルロースに吸着させ、上記のように回収した〔ダブり
ニー・ミューラー等、上記〕。 エタノール沈澱の後、ＤＮＡを〔γ−Ｐ３２〕ＡＴＰ
（ＤＮＡ５″末端ｐモル当り１２〜３４μＣｉ）および
ポリヌクレオチドキナーゼ（二ニー−イングランド・ビ
オラブ社またはＰ−Ｌビオケミカルス社）にて、実質的
にニー・エム・マキサムおよびダブりニー・ギルバート
（上記）により記載されているように５′末端標識した
が、ただしキナーゼ反応の前にＤＮＡを変性させなかっ
た。ＤＮＡ５’末＠ｐモル当り１〜１．５μＣ１（Ｐ”
）ホスフェートの比活性が得られた。 配列決定のため、標識断片を第二の制限酵素で開裂させ
、そして生成物をトリス−ＷＲ＠−ＥＤＴＡ緩衝液にお
ける５％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動ｑより分
離した。所望の断片をこのゲルから抽出して精製した〔
ミューラー等、上記〕。配列決定用の各種断片を次のよ
うにして調製したｃ数は、ベース対における名目断片鎖
長を示し、標識部位は星印により示される〕。 （１）ＢｓｐｌによるＨｌｆ−２ｈの開裂ならびに、レ
ーニングｋＷ ｆＥ液における５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によるＢｓｐｌ−Ｂｓｐｌ−２３２および
ＢｓｐＩ−ＢｓｐＴ−９４９の単離〔ニー・イー・レー
ニング、「ポリアクリルアミドゲル電気泳動による高分
子量リボ核酸の分別」、ジャーナル・バイオケミストリ
ー、第１０２頁（１９６７））、 （２１ＢｓｐＩによるＨｉｆ−２ｈの開裂、標識化、ｐ
ｓｔｌによる開裂ならびにＢｓｐｌ＊−Ｐｓｔｌ−８３
およびＢｓｐＩ＊−ＰｓｔＩ−８２７の単離、 （３）ＢｇｌＩ［によるＨｉｆ−２ｈの開裂、標識化、
ｐｓｔＩによる開裂ならびにＢｇｌｌｌ＊−ＰｓｔＩ−
３３６およびＢｇ Ｉ Ｕ＊−Ｐｓ ｔ ｌ−５７０の
単離、 （４）ＭｂｏＩ［によるＨｉｆ−２ｈの開裂、標識化、
Ｐｓｔｌおよび）（ｉｎｄｌＩによる切断（阻害性３５
０ｂｐ ｐＢＲ３２２断片を開裂させる）、ならびに
Ｍ ｂ ｏ■＊−Ｐｓｔｌ−５１９およびＭ ｂ ｏ
ＩＩ ＊ Ｐ ｓ ｔ Ｉ −３５１の単離、（５）
ＥｃｏＲＩによるＨｉｔ−２ｈの開裂、標識化、ｐｓｔ
ｌによる開裂、ならびにＥＣＤＲＩ＊−Ｐｓｔｌ−７０
８およびＥｃｏＲ１＊−Ｐｓ ｔ １−１９８の単離、 （６）ＰｓｔＩによるＨ ｉ ｒ −２ｈの開裂、標識
化、ＢｇｌＩＩによる開裂ならびにｐｓｔｌ＊−Ｂｇｌ
ｌＩ−５７０およびＰｓｔｌ＊−シ已■−３３６の単離
、 （７）ＡｖａｌｌによるＨ ｉ ｆ −２ｈの開裂、標
識Ｕ＊−ＢｇｌＩＩ−１４７の単離、 （８）ＰｖｕＩ［によるＩ（ｉ ｆ −２ｈの開裂、標
識化、Ｐｓ ｔ Ｉ＃よびＢｇｌｌ［による開裂ならび
にＰｖｕＩ［＊−ＰｓｔＩ−４８６の単離。 断片を、ニー・エム・マキサムおよびダブりニー・ギル
バート（上記）の方法により減成させたが、この場合同
著者により１９７８年９月に示された報告の変法を用い
た。生成物を、５０ｍＭトリス−硼酸、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐｉｆ８．３）中で０．１ｘ２５ｘ３６Ｇの１２
％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド／ビスアク
リルアミド−１８／１）により分別化させ、その際７０
０ボルトで６時間の予備処理の後、９００ボルトで２．
８． １８および２６時間処理した。 最良の結果は、ゲルを使用前２〜３日間にわたり室温に
維持した場合に得られた。 各長さのｃＤＮＡ挿入物を両ストランドから配列決定し
、標識末端として役立つ各制限部位を緊張させた断片に
より配列決定した。かく得られたヌクレオチド配列を第
８〜１０図に示す。 予期されるように、この挿入物における各制限部位の位
置は、制限酵素開裂のみにより測定される位置よりも完
全に位置決定され、これを第４図に示す。 第８〜１０図について見ると、挿入物のへテロ重合部分
は５″末端における２３Ｇ残基および７Ａ残基（恐ら（
ｍ Ｒ’Ｎ Ａのポリ（Ａ）末端を反映する）により、
ならびに３′末端における１５Ｃ残基により示される。 参考のため、挿入物は、ｄＧ末端に続く第一ヌクレオチ
ドからポリ（〜残基の前の最終ヌクレオチドまで番号が
付けられる。位置５７〜５９におけるＡＴＧ開始トリブ
レットおよび位置６２４〜６２６におけるＴ Ａ 、Ａ
停止トリプレットは、ナンセンスコドンにより中断され
ない解読枠を規定する。挿入物におけるこの領域内の２
つの他の解読枠はそれぞれ１８ｆＩＩおよび１２゛１固
のナンセンスコドンを有する。 さらに異なる解読枠におけるＡＴＧもしくはＧＴＧおよ
び停止信号により示されて２５個以上のアミノ酸のポリ
ペプチドをコードする他の配列は、それぞれヌクレオチ
ド２２６と３０４との間、６４０と７７８との間および
６８３と７４３との間に存在する。したがって、ヌクレ
オチド５７と６２６との間の領域は、恐らく本発明にお
けるＩＦＮ−αの生物学的もしくは免疫学的活性を示す
ポリペプチドをコードするようなＨｉｆ−２ｈ断片のヌ
クレオチド配列を含むと思われる。 勿論、通常の方法〔ニー・エフストラチアジス等、上記
〕によるポリ（Ａ’） ＲＮ Ａからのクローン化ｃＤ
ＮＡは５′末端ヌクレオチドを欠失しかつ人工的配列さ
え含みうろことを了解すべきである〔アール・アイ・リ
チャード等、「成鶏β−グロビンｃＤＮＡの分子クロー
ン化および配列分析」、ヌクレイツク・アシッド・リサ
ーチ、第７巻、第１１３７〜１１４６頁（１９７９）
） 、 したがって、ヌクレオチド５７〜５９に位置す
るＡＴＧが標準ｍＲＮＡの最初のＡＴＧであるとは限ら
ない、しかしながら、以下の説明の目的で、ヌクレオチ
ド５７〜５９におけるＡＴＧが標準ｍＲＮＡの最初のＡ
ＴＧであると仮定する。 挿入物のこの領域によりコードされるポリペプチドを標
準ひとリンパ芽球細胞インターフェロンの３５個末端ア
ミノ酸、すなわち、−−Ａｓｐ−−（ケー・シー・ズー
ン等（上記〕およびエム・フンカピラーおよびエル・フ
ード（上記）により決定〕と比較すれば、選択解読枠は
適正であり、ヌクレオチド５７〜１２４は「成熟」ポリ
プチドをコードするヌクレオチド配列に先立つ信号配列
をコードしうるちのと思われる。何故なら、公表された
配列と決定された配列とを並べて見ると（第２４ｅ目以
降のアミノ酸）、顕著な一致性を示すからである（すな
わち２６〜３５アミノ酸〕、 成熟液ｍ ＲＮ Ａにおいて、５′末端からの第−ＡＵ
Ｇトリプレットは通常、蛋白合成に対する開始部位であ
る〔エム・コザソク、「成熟核リポソームはどのように
してメツセンジャーＲＮＡにおける開始域を選択するか
」、セル誌、第１５巻、第１１０９〜１１２５頁（１９
７８）〕、リンパ芽球細胞インターフェロンの第一アミ
ノ酸に対応するＨｉｆ−２ｈ断片中のコドンは第−ＡＵ
Ｇからの２２（ＩＩのコドン（および第二ＡＵＧからの
１４１囚のコドン）であり、これはインターフェロンを
コードする配列に先立って、２３個（もしくはそれ以下
の恐らく１５個）のアミノ酸の信号ペプチドを決定する
配列があることを示している。長い方の推定信等配列は
１１個の疎水性アミノ酸の非中断系列を含有し、短い方
のものは６個の疎水性アミノ酸のものを含有する。疎水
性歿基のこの蓄積が信号配列の特徴である〔ビー・ディ
ー・デビスおよびピー・シー・タイ、「膜を透過する蛋
白質分泌のメカニズム」、ネイチャー誌、第２８３巻、
第４３３〜４３８頁（１９８０）〕、 「成熟ＪＩＦＮ−αポリペプチドに明らかに対応するヌ
クレオチド配列は４９８個のヌクレオチドからなり、１
６６個のアミノ酸をコードする。カルボキシ末端処理が
ないと仮定すれば、イ’／ター７エロンポリペプチドの
分子量は１９．３８８である。コード配列の基本組成は
５０％ＧＣである。インターフェロンコード配列内のコ
ドン使用は、一般に補乳類ｍ ＲＮ Ａに対して示され
たものとよく一致する〔アール・グランタム等、「コド
ンカタログ使用およびゲノム仮説」、ヌクレイツク・ア
シッド・リサーチ、第８巻、第４９〜６２頁（１９８０
）〕、観察される全ての変（ヒは、関与する少数に起因
する。 勿論、ＩＩ ｉ ｆ −２ｈ断片につき第８〜１０図に
示されたポリペプチドのｔＲ造は、生体内酵素との相互
作用、たとえばグリコツレ−ジョン（ｇｌｙｃｏｓｏｌ
ａｔｉｏｎ ）によりもたらされたポリペプチドに対す
る変更を何も考慮に入れていない。 したがって、この構造は生体内で生産されるＩＦＮ−α
とは同一でないが、たとえ同一でないにしろ極めてｇ慎
した生物学的および免疫学的性質を有すると理解せねば
ならない。さらに、この構造は、たとえば単一もしくは
多重のペース置換、欠失、挿入もしくは転位を含む突然
変異またはこの構造の化学的誘導化のような他の変化が
ＩＦＮ−α活性をも示す化合物を生成させうろことを示
唆する。 ３、挿入ＩＦＮ−αｃＤＮＡのプラスストランドの決定 ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖をプラスストラン
ドと名付け、その相補体をマイナスストランドと名付け
る。ＩＦＮ−αｃＤＮＡ挿入物のプラスストランドは第
５図に示すように同定された。Ｈｉｔ−２ｈＤＮＡを制
限酵素ＢｇｌＩＩによって開裂させ、末端をｐ３２−燐
酸によって標識しくｐｓｔＴ−開裂末端について記載し
たように）そしてＤＮＡをＰｓｔＩにより切断して、よ
り長い（５４５ｂ、ｐ、 （上記した精度のより大きい
分析法により測定して５７〔ｂ、ｐ、） ）放射性断片
と、より短い（３４０ｂ、ｐ。 （上記した精度のより大きい分析により測定して３３６
ｂ、ｐ、） ）ものとを生成させた。これら断片を変
性させそして誘発白血球からのポリ（Ａ’） Ｆに対し
８０％ホルムアミド、０．４Ｍ ＮａＣ１中において
、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ再結合が生じないような条件
（上記）の下でヒブリド化させた。核酸をヌクレアーゼ
Ｓ１で切断し、これは全ての単一鎖核酸、特に非ヒブリ
ド化Ｐ３２−ＤＮＡを減成し、そして生成物をポリアク
リルアミドゲルで分離した〔アール・エフ・ライ−バー
およびシー・ワイスマン、「バーク−シャープ法の変法
によるＲＮＡの地図化」、ヌクレ・インク・アシッド・
リサーチ、第７巻、第１１１７５〜１１９３頁（１９７
９）〕、放射能写真は、短い方のヌクレオチド断片のみ
がヒブリド化されかつポリ＜Ａ’） ＲＮ Ａにより保
護されていることを示し、この５″−１％短ヌクレオチ
ド鎖をマイナスストランドと同定した。プラスストラン
ドの方向性は、したがって、第４図および第５図（右手
側）に示される通りである。 ・ＮＡ例 前節に記載したと同じ実験を行なったが、ポリ（Ａ＞
ＲＮ Ａは、センダイウィルス誘発白血球の場合と同じ
手順により調製した非誘発ひと白血球からのものとした
。検出しろる量の標ｆｉＤＮＡは保護されなか９た。前
節の結果と比較して、非誘発細胞からのポリ（Ａ） Ｒ
Ｎ Ａは、誘発細胞からのポリ（Ａ”） ＲＮ Ａにお
けるよりも約１／２０以下の量の、Ｈｉ ｆ −２ｈに
ダブリド化しうるｍＲＮＡを含有する。 Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／Ｉｎｃ ＩＦ −
ｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位は、β−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）遺伝子内に存在する。 したがって、コードＤＮＡ断片（たとえば、遺伝子の全
部または一″部からなるｃＤＮＡ）を適正方向および適
正解読枠における位置に結合すれば、融合蛋白質が得ら
れる。この蛋白質は、β−ラクタマーゼのアミノ末端部
分がらなり、それに続いて挿入ＤＮＡ配列がコードする
アミノ酸配列が存在する（エル・ビラーカマロフ等、上
記）、挿入ＤＮＡ断片がそれ自身の開始信号を含むＤＮ
Ａ配列からなりかっβ−ラクタマーゼ配列と一致する停
止信号を備えた配列を有すれば、停止および再開始が第
二開始信号において起こり、非融合活性蛋白質が生ずる
であろう（ニー・シー・ワイ・チャング等、上記〕、）
（ｉｆ−４ｃに関連したＤＮＡ挿入物が適正解読枠中に
挿入されてβ−ラクタマーゼ遺伝子内で発現するのを確
保するため、−組のｐＢＲ３２２の誘導体、すなわちｐ
ＫＴ２７９、ｐＫＴ２８０およびｐＫＴ２８７（ケー・
タルマッシ等、［信号配列コード化領域における独特な
ＰｓｔＩクローン化部位を有するプラスミドベクターの
作成」、ジーン誌、第１２巻、第２３５〜２４１頁（１
９８０）に記載された手法により作成〕を使用した。こ
れら誘導体の各々はｐｓ ｔ Ｔ部位を有し、その位置
はその部位に結合されたＤＮＡ挿入物が他の誘導体のＰ
ｓｔ１部位における挿入物からの異なる解読枠中に存在
するような位置である。すなわち、第６図から判るよう
に、ｐＫＴ２７９はプラスミドのプレペニシリナーゼ遺
伝子のヌクレオチド７４に位置するＰｓｔ１部位を有し
、ｐＫ７２８０はヌクレオチド７５に、またｐＫ７２８
７はヌクレオチド８２にそれぞれＰｓｔＩ部位を有する
。 各プラスミドの残余の配列はｐＢＲ３２２における周知
配列である。したがって、この組みは、全ての３つの解
読枠におけるβ−ラクタマーゼ遺伝子中へのＤＮＡの挿
入を可能にする。Ｈｉｆ−２ｈからのＰｓｔｌ切断挿入
物を、Ｈｉｔ−４ｃ断片について記載したように調製し
た。Ｈｌｆ−２ｈＰｓ ｔ Ｉ断片（１０ｎｇ）を、２
０，１７１の１０ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）
、６ ｍＭＭｇＣＩ２．１００ｍＭ ＮａＣ１，６ｍ
Ｍβ−メルカプトエタノ・−ル、２００μｓ／ｍｌゼラ
チンおよびＱ、１ｍＭ ＡＴＰの中でＰｓｔ■開裂ｐ
ＢＲ３２２、ｐＫＴ２７９、ｐＫＴ２８０またはｐＫＴ
２８７（それぞれ１０ｎｇ）と混合し、０．１単位のＴ
、ＤＮＡリガーゼにニーイングランド・ビオラブ社）と
共に１０℃にて１６時間培養した。得られた組替えＤＮ
Ａ分子をＺ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−
２ｈＳＺ−ｐＫＴ２７９ （Ｐ ｓ ｔ） ／Ｈｃ Ｉ
Ｆ−−２ｈＳＺ−ｐＫ７２８０ （Ｐｓｔ）／ＨｃＩ
Ｆ−２ｈおよびＺ−ｐＫＴ２８７ （Ｐｓ ｔ）／Ｈｃ
ＩＦ−２ｈと名付ける。イー・コリＴ（Ｂ１０１をこれ
ら組替えＤＮＡ分子のそれぞれにより形質転換させ、そ
して形質転換したコロニーを前記したようにテトラサイ
クリン含有寒天板の上で選択した。形質転換細菌のテト
ラサイクリン耐性クローンは循環ベクターを含有するの
で、各組の細菌コロニーをミリポアフィルタ−上で生育
させ、そしてｐ３２−標識Ｈｉｆ−４ｃ断片にダブリド
化するコロニーを上記のように同定しかつ選択した。こ
れらの菌株は次のように名付けられた： イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔ）／Ｈｃ Ｉ Ｆ−２ｈ−ＡＨＩ）乃至（−ＡＨ３）
； イー・コリ）ＩＢ １０１ （Ｚ−ｐＫＴ２７９（Ｐ
ｓｔ）／ＨｃＩＦ−２ｈ−ＡＨｌｌ乃至（−ＡＨ８）’
ｉ イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＫ７２８０（Ｐ、ｓ
ｔ） ／Ｈｃ Ｉ Ｆ−２ｈ−ＡＨＩ）乃至（−ＡＨ
８）； イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＫ７２８７（Ｐｓ
ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−２ｈ−ＡＨＩ）乃至（−ＡＨ８） 上記菌株の規程かならびに菌株Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−ＳＮＩ〜９５（７）規程かの抽出
物を、ＩＦＮ−α活性につき試験した。細菌をトリプト
ン培地において固定相で増殖させ、回収し、１／２Ｏｆ
！量（培養物の容量に対し）の５０ｍＭトリス−ＨＣＩ
（ｐＨ８）、３０ｍＭ ＮａＣ１で洗浄しそして凍結
させた。 解凍後、♀■胞を下記容量の前記緩衝液に再懸濁させそ
してリゾチームを１■／ｍｌまで加えた。 ０℃にて６０分間の後、懸濁物を凍結させ（エタノール
−ドライアイス浴）、５回解凍させ（３７℃にて）、ツ
ルバールＧ Ｓ Ａ 型ロータで１２００ Ｏｒｐｍに
て１０分間遠心分離した。成る場合には上澄液（Ｓ ３
０）の一部をさらにスピンコロ５型ロータで１００．０
００ ｘ ｇにて遠心分離し、上澄液（３１００）を回
収した。このような上澄液を、細胞病理学的効果減少分
析によりＩＦＮ−α活性について選別した（実験１〕、
実験ｌにおいて陽性反応を示すコロニーならびに上記の
組Ｚ−ｐＢＲ３２２／Ｈｃ Ｉ Ｆ−ＳＮ１〜５Ｎ９５
からのクローンを、より低希釈にて再分析した（実験２
〕、 抽出物源： イー・コリＨＢ１０１（下記により形質転換）Ｚ−ｐＢ
Ｒ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ ３０ ？
／ １（ｃｌＦ−２ｈ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
？／ ＨｃｌＦ−２ｈ−ＡＨ−１ｔｏ ３Ｚ−ｐ
ＫＴ２７９ （Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
？／ＨｃＩＦ−２ｈ−ＡＩ−１ｔｏ ７ Ｚ−ｐＫＴ２７９ （Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
陽性／ ＨｃｌＦ−２ｈ−ＡＨ−８ Ｚ−ｐＫＴ２８０ （Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
？／ ＨｃＩＦ−２ｈ−ＡＩ−２，６，７Ｚ−
ｐＫ７２８０ （Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
陽性／ ＨｃｌＦ−２ｈ−ＡＨ−１，３，４，５Ｚ−ｐ
Ｈ↑２８７（Ｐｓｔ） Ｓ３０ ？／
１ｌｃｌＦ−２ｈ−八Ｉ＋−１，２，３，４，５，８
Ｚ−ｐＫＴ２８７ （Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
陽性／ＨｃＩＦ−２ｈ−＾トロ、７抽 出物源： イー・コリＨＢ１０１（下記により形質転換）実験２＊
＊ 調製物 ＩＦＮ−α活性（ＩＵ／ｍ１） Ｚ−ｐＫＴ２７９／ ＨｃＩＦ Ｓ３０および
３００−２ｈ−Ａｌｌ−８８１００ Ｚ−ｐＫＴ２８０／ ＨｃｌＦ Ｓ３０および
３００−２ｈ−ＡＩ−１，３，４，５５ＩＯＱＺ−ｐ
ＫＴ２８７／ ＨｃｌＦ Ｓ３０および ３ｏ
。 −２ｈ−ＡＨ−６および７ ５１００Ｚ−ｐＢＲ３２
２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０ 陰性／ ｌ
１ｃｌＦ−ＳＮ−４’、 ５．７．
（＜ １０）９．１０．１１．１３乃至１６ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０
陰性／ １ｃＩＦ−ＳＮ−１８乃至
（＜１０）２２．２４，２５．２７．３０ 乃至３４ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０
陰性／ ＨｃｌＦ−ＳＮ−３８乃至
（＜１０）４１．４３．乃至４８ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０
１０／ ＨｃｌＦ−ＳＮ−１乃至 ３．６，８．１２．１７．２３．２６ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０
１０／ ｔｌｃｌＦ−ＳＮ−２８，２９゜ ３６．３７．４９ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０
２００／ ＨｃｌＦ−ＳＮ−３５，４２ ＊ 実験１： １：１５０の最終希釈にて抽出物を分
析 ＊＊実験２： １：６の最終希釈にて抽出物を分析 上記からの、より活性の大きいものの幾つかをさらに詳
細に検査した。培養物を対数相の後期まで増殖させ（見
掛けｏＤ６５０は約０．９）＊、細胞を１１５０の培養
物容量にて上記のように溶菌させた。若干活性を有する
が陰性比較（Ｓ３０；５１００：０；Ｏ）としてＺ−ｐ
ＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／Ｈｃ ＴＦ−ＳＮ３２を用い
れば、次の結果が得られる： 。 抽出物源 イー・コリＨＢ１０１ 調製物 ＩＦＮ−α活性
＊＊（下記により形質 （ＩＯ／ｍ１）
Ｚ−ｐＫＴ２７９ （Ｐｓｔ ） Ｓ３０，５１００
１００； ３００／ ＨｃＩＦ−２ｈ−Ａｌ８ Ｚ−ｐＫ７２８０ （Ｐｓｔ ） Ｓ３０．５１００
１０００； １０００／ ＩＩｃＩＦ−２ｈ−Ａｔ
（３ Ｚ−ｐＫ７２８７（Ｐｓｔ） Ｓ３０，５１００
２００；２００／ ＨｃｌＦ−２ｈ−Ａｌ１６ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） ５３０，５１００
１０００； １０００／ ＨｄＦ−ＳＮ３５ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０．５１００
３００； １００／ ＨｃｌＦ−ＳＮ４２ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０，５１００
Ｏ； ０（比較として活性し ／ １ＩｃＴＦ−ＳＮ３２ ベルを０
とする）＊ ３００１！もしくはそれ以上のＩＦＮ
−αの培養物を、何らＩＦＮ−α活性 の損失なしに生育させることができる。 ＊＊ 上記発現は、ペニシリナーゼ発現制御配列の管理
下における遺伝子によるイ ンターフェロン生産を反映すると理解 することができる。 これら菌株により生産された実際の蛋白質は、ＴＦＨに
無関係にアミノ酸に融合してまたはＩＦＮの信号配列の
全部もしくは一部を含んで生産されたかどうか決定する
よう構造的に分析しなかったことを了解すべきである。 しかしながら、少な（とも蛋白質が生成されれば、これ
はＩＦＨの免疫学的もしくは生物学的活性を示す。した
がって、この発現した蛋白質は有用である。この蛋白質
をコードするＤＮＡ配列が１（ｕ Ｉ Ｆ Ｎ−αに関
連するＤＮＡ配列であることを蛋白質の活性が示すこと
は特に重要である。 かくして、例示したようなりＮＡ配列を使用して他の同
様なＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−α関連ＤＮＡ配列を選択するこ
と、および成熟インターフェロンもしくはその変種を発
現し或いは特定の発現蛋白質の収量を向上させるような
他の構成に対し基礎を与えることは当業者の範囲内にあ
る。 蛋白質の生産レベルは２つの要因により支配される：す
なわち、細胞内の遺伝子のコピー数とそれら遺伝子コピ
ーが転写されかつ翻訳される効率とである。転写および
翻訳（これらは共同して発現となる）の効率は次いでヌ
クレオチド配列に依存し、これは通常所望のコード配列
の前方に位置する。これらのヌクレオチド配列すなわぢ
発現制御配列は、特にＲＮＡポリメラーゼが相互作用し
て転写を開始させる（プロモータ配列）と共にリポソー
ムがｍＲＮＡ （転写の生成物）と結合し、かつ相互作
用して翻訳を開始させる位置を規定する。必ずしもこの
種の全ての発現制御配列が同等の効率をもって作用する
とは躍らない。したがって、所望蛋白質に対する特異的
コード配列をその隣接するヌクレオチド配列から分離し
、これらを寧ろ他の公知の発現制御配列に融合させてよ
り高レベルの発現に好適とするのが有利である。これも
達成されるが、新たに処理されたＤＮＡ断片を多重コピ
ープラスミドまたはバクテリオファージ誘導体に挿入し
て細胞内の遺伝子コピーの数を増加させ、それによりさ
らに発現蛋白質の収量を向上させることもできる。 幾つかの発現制御配列を上記のように使用することがで
きる。これらには、イー・コリのラクトースオペロンの
オペレータ、プロモータおよびリポソーム結合かつ相互
作用配列（たとえばシャインーダルガルノ配列のような
配列を含ム）（“ｌａｃ系”）、イー・コリのトリプト
ファン合成酵素系の対応配列（“ｔｒｐ系”）、ファー
ジλの主要なオペレータおよびプロモーフ域（ＯｌＰＬ
および０ＲＰＲ１）、ファージｆｄコート蛋白の制御
域、或いは原子核（原核）もしくは成熟核（真核）細胞
およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御するその他の
配列が包含される。したがって、適当な宿主において特
定ポリペプチドの生産を向上させるには、そのポリペプ
チドをコードする遺伝子を前記のように′Ａ製し、これ
を含有する組替えＤＮＡ分子から取出して、前記発現制
御配列に一層近接して或いは上記発現制御配列の一つを
管理しながら組替えＤＮＡ分子中に再挿入する。この種
の方法は当分野で公知である。 所望生成物の細胞収量の増加は、細胞中で使用しうる遺
伝子数の増加に依存する。これは、たとえば組替えＤＮ
Ａ分子を前記したように中庸のバクテリオファージλ（
ＮＭ９８９） 中に挿入することにより、特に簡単には
制限酵素でプラスミドを切断することにより達成され、
それにより線状分子を生成させて、これを次いで制限フ
ァージスクローン化ベヒクル〔たとえばエフ・イー・ム
レイ等、「試験管内組替え遺伝子の回収を簡単にするλ
ファージ」、モレキュラー・ジーン・ゲネチックス、第
１５０巻、第５３〜６１頁（１９７７）およびエフ・イ
ー・ムレイ等、「バクテリオファージＴ４からのＤＮＡ
リガーゼ遺伝子の分子クローン化」、ジャーナル・モレ
キュラー・バイオロジー、第１３２巻、第４９３〜５０
５頁（１９７９）に記載されている種類〕と混合し、そ
してＤＮＡリガーゼと共に培養して組替えＤＮＡ分子を
生成させる。次いで、所望の組替えファージを前記のよ
うに選択しかつ使用して宿主菌株の大腸菌を溶菌させる
。 特に有用なλクローン化ベヒクルは、抑圧遺伝子三」に
おける感温性突然変異と遺伝子王における抑圧性突然変
異とを含み、その生成物は宿主細胞の溶菌に必要であり
かつ遺伝子Ｅ、すなわちその生成物はウィルスの主要な
カプシド蛋白質である。この系を用いて、溶菌細胞を３
２℃で生育させ、次いで４５℃まで加熱してプロファー
ジの切断を誘導させる。３７℃における長期生育は高レ
ベルの蛋白質生産をもたらし、これらは細胞内に保持さ
れる。何故なら、これらは通常の方法でファージ遺伝子
生成物によって溶菌されずかつファージ遺伝子挿入物は
カプセル化されていないで転写用に利用され続けるから
である。次いで、細胞の人工的溶菌は所望生成物を高収
量で遊離する。 上記した過程によりＺ ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｈ
ｃＩＦ−ＳＮ３５で形質転換させた宿主から生産されて
ひと白血球インターフェロンの生物学的もしくは免疫学
的活性を示すようなポリペプチドの収量を増加させる初
期の試みにおいて、ヒゲリド中のＤＮＡ挿入物の制限地
図を決定した。この地図は、Ｈｉｆ−２ｈと比較して、
Ｈｉｆ−ＳＮ３５が配列の３′末端を示すＰｓｔ１部位
を欠失しており、信号配列の一部が欠失しており（コド
ン７まで）かつ信号配列におけるＡｖａｆ１部位がＢｓ
ｐｒ部位により交換されていることを示した。したがっ
て、Ｈｉ ｆ−ＳＮ３５はＨｉｆ−２ｈの多形的もしく
は対立的変種であると思われる。 プラスミドｌ４ｉｆ−ＳＮ３５をＰｓｔｌにより開裂さ
せ、得られたＤＮＡ鎖を標準法により両端部で復帰（ｃ
ｈｅｓｎ ｂａｃｋ ）させ、そしてそこにＬＡＣ−Ａ
ｌｕ断片（下記）を挿入してプラスミドを再び閉環させ
た。Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ３５
−ＡＨＬ６と同定された変型プラスミドの実際の構造お
よび大腸菌中に生産された蛋白質のアミノ末端における
アミノ酸配列を決定した。この構造のヌクレオチド配列
は、ＬＡＣ−Ａｌｕ断片がＩＦＮ−α１ （ＳＮ３５
）の第一アミノ酸から離れた１（１ｍのアミノ酸を結合
したことを示している。 大腸菌で発現された蛋白質のアミノ末端部のアミノ酸配
列は、ＩＦＮ−α１ （ＳＮ３５）配列に融合した６
個のアミノ酸を有する融合蛋白質が生産されたことを示
している。しかしながら、変型プラスミドにより形質転
換された宿主は、未改変Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／
ＨｃＩＦ−ＳＮ３５により形質転換された宿主と比較し
て、ひと白血球インターフェロンの生物学的もしくは免
疫学的活性を示す約１００倍多いポリペプチドを生産す
る。 第２５図を参照すれば、Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）
／Ｈｃ Ｉ Ｆ−ＳＮ３５ （第２５図における５Ｎ
３５）で形質転換させた宿主により生産されて、ひと白
血球・インターフェロンの免疫学的もしくは生物学的活
性を示すようなポリペプチドの収量を向上させる他の試
みが図示されている。Ｂｓｐｌ （キツス博士より寄
！！１）により標準法を用いてダブリドプラスミドを開
裂させた。なお、このＢｓｐｌは当業界で既知の容易に
入手しうる制限酵素であって、たとえばＡ、キツス等「
バチルス・スファエリクスからの新配列−特異性エンド
ヌクレアーゼ（Ｂｓｐ）Ｊジーン誌、第１巻、第３２３
〜３２９頁（１９７７）の論文に詳述されている。この
ＢｓｐＴは、第８図に示すように、ＤＮＡを配列ＧＧＣ
Ｃにて切断する。制限酵素を熱失活（６５℃、３０分）
させた後、混合物を５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８）
に調製して加熱した（３７℃、３０分〕、フェノールと
エタノールとで抽出した後、最大のα１ｃＤＮＡ断片を
低温ゲル化アガロース（０，８％）上で単離しそしてＨ
ｉ ｎ ｄ ＩＩＩリンカ−を結合させた。次いで、こ
の変型断片をＨｉｎｄＩ［［−開裂プラスミドｌｌ５−
ｐ１３Ｒ３２２（Ｅｃｏ）／１２ａｃＵＶ５−１５０
（“Ｌａｃ−１５０”）＊ （エッチ・シャーシー
により寄贈）に結合させたが、これは断片含有ゲル片（
それぞれ約２０μｍ）を６５℃にて溶融させ、３７℃ま
で冷却しかつ１μｌ当り２０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを
加えて行なった
濃度、 Ｒｏ＝ヒブリド化すべき初期ＲＮＡのヌクレオチドモル
濃度、 ＫＲ＝ＲＮＡ−ＤＮＡヒブリド化に関する速度恒数、 ｔ ＝時間（秒）、 Ｒ／Ｒｏ ＝０．７５ （７５％反応完結）、ＫＲ＝４
７２ （ＫＲ＝１／１２Ｋｄ （ジエー・カセイおよび
エフ・ダビドソン、上 記）であり、ここで Ｋ ｄ−ヒブリド化の選択条件下におけるＤＮＡの２次
速度恒数、かつ Ｋｄ＝１．７ ＸＩＯ’ ＸＬ７２ＸＮ−１〔ジェー・
アール・ハソトンおよ びジエー・ジー・ウエトムア、 「バクテリオファージＸ１７４ ＤＮＡ−ＲＮＡヒブリドの変性： ＲＮＡ長さ効果および核化速度恒 数」、ジャーナル・モレキュラー ・バイオロジー、第７７巻、第 ４９５〜５００頁（１９７３））、 Ｌ−９００（ｂ、ｐ、における鎖長：約９００は完全Ｉ
ＦＮ−αｃＤＮＡ 挿入物中に存在する〕 Ｎ＝９００（ヒブリド鎖のす、ｐ、における複合度；こ
こで複合度が９００ である理由は、ＩＦＮ−αｍＲＮＡ の９００個のヌクレオチドがＩＦＮ −αｃＤＮＡ挿入物の９００個の 相補的ヌクレオチドと結合するか らである〕 Ｃｏ ＝２．５ ｘｘｏ−’ （分析に使用すべき予
め測定された２０μｇの組替えＤＮＡ 分子を含有する４０μｌの溶液に 基づいており、ここでもＩ ＦＮ− αｃＤＮＡ挿入物は組替えＤＮＡ 分子の１／１２でありかつ５１２ 個のクローンの少なくとも１個に 生ずると仮定し、一つのＤＮＡ塩 基対の平均分子量として６６２を 与える〕 Ｒｏ＝８．７Ｘ１０−” （分析に使用すべき予め測
定された１２μｇのポリ（Ａ） ＲＮ Ａを含有する４
０μｌの溶液に基づ いており、ここでもポリ（Ａ） ＲＮ Ａは１ ： １
０．０００部のＩＦＮ−αｍＲＮＡを含有すると仮定し
く大過剰のＤＮＡ を与えれば異なる比率はヒブリド 化の割合に対し殆んど影響を与え ない）かつＲＮＡの１個のりボヌ クレオチドの平均分子量として ３４３を与える〕 である 】。 ３、初期分析の実施 工程Ａ：組替えＤＮＡ分子混合物の調製および開裂 所望数の細菌クローンを、上記のように添加されたトリ
プトン培地寒天板の上に接種し、これは機械用具を使用
して各ミクロ測定穴から一部を寒天板上に移して行なっ
た。３７℃で培養した後、各クローンは直径数ｌのコロ
ニーを形成した。全てのコロニーを寒天板から洗い取っ
て保存し、これを接種物として使用して上記のように添
加されたトリプトン培地１１に三角フラスコ２ａ中にて
接種した。この培養物を３７℃にて約０．８の見掛け０
Ｄ６５ｏ（肉眼推定）まで振とうした。１容量の添加ト
リプトン培地と１７０部ｇ／＋ａｌまでのクロラムフェ
ニコールを培養物に加え、これをさらに３７℃にて１６
時間振とうした。２０ｍ１のクロロホルムを加え、培養
物を３７℃にてさらに１０分間振とうすることにより細
菌を殺した（シー・ワイスマンおよびダブりニー・ポル
、上記〕、培養物をクロロポルＪ２からデカントしそし
て細胞を６００ Ｏｒｐｍか。 ゛つ４℃にて１５分間遠心分Ｍ（ツルバールＧＳ３型ロ
ータ）して集めた。各１１の調製物につき約１〜２ｇの
細胞が得られた。細胞を３０ｍ１の２０ｍＭ）リス−Ｈ
Ｃ１（ｐＨ７，５）中に懸濁させ、５０００ ｒｐｍか
つ４℃にて２０分間遠心分離しくツルバールＳＷ型ロー
タ）、そして３０ａ＋１の５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐ
）１７．５ ）中に再懸濁させた。０．２５容量のりゾ
チーム溶液〔５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５
）中１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、０℃にて１０分間冷却し
た後０．３３容量（初期５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ培養物
懸濁液の容量に対し）の０．５ Ｍ ＥＤＴＡ （ｐ
Ｈ８，０）を振とうなじに静かに混入させた。０℃でさ
らに１０分間の後、１／１６容Ｍ（初期容量に対し）の
２％トリトンＸ−１００を加えた。６０分後、試料をツ
ルバールＳＷ型ロータにて１０．００Ｏｒｐｍかつ０℃
で６０分間遠心分離した。上澄液を磁気攪拌機を備えた
ビーカー中に移し、３ＭのＮ ａ ＯＨを攪拌下に加え
てＰＨ１２，５に到らしめた〔ガラス電極と、オリオン
リサーチ６０１型ｐｌ＋計とを使用し、ベックマンｐｎ
ｔｏ炭酸塩緩ｆｉｉ液（Ｎ１３５０５）にて較正し、２
０℃にて測定した〕。２０℃にて１０分間攪拌した後、
ｐＨを８．５に調整した。さらに３分間攪拌した後、１
／９容量の５Ｍ ＮａＣ１と１容量のフェノール（蒸
留しかつ９．５ Ｍ Ｎ ａ Ｃ１で平衡化させたも
の）とを加えて激しく攪拌を５分間続けた。 １（Ｌ ０００ｒｐｎ＋かつ０℃にて１０分間遠心分離
（ツルバールＧＳＡ型ロータ）して相分離させた。 型■のＤＮＡ （環状二重鎖ＤＮＡ）を含有する上澄液
を中間相（単一鎖ＤＮＡを含有する）から注意して取り
出し、クロロホルムで３回抽出した（フェノールは大部
分がこの工程で除去された〕、型■のＤＮＡフラクショ
ンは、分析用に選択された５１２個のクローンの一部を
構成するような宿主細胞を形質転換させるのに最初に使
用した組替えＤＮＡ分子（ｐＢＲ３２２−ｃＤＮＡ挿入
物）を含をするであろう。 パンクレアチンＲＮＡアーゼＡ（５ｍｇ／ｍｌ。 ８５℃にて１０分間予備加熱）を型■のＤＮＡ。 に２０μｇ／ｍｌの濃度まで加え、混合物を３７℃にて
６０分間培養した。１１５容量の５ＭＮａＣ１を加え、
この混合物を３０％ポリエチレングリコール６０００
（ユニオンカーバイド社、１２０″Ｃにて２０分間オー
トクレーブにかけたもの）により最終濃度７．５％ＰＥ
Ｇまで調整した。−１０℃にて２〜１６時間の後、沈澱
を８ Ｑ ＯＯｒｐｍかつ０℃にて２０分分間ツルバー
ルＳ型ロータで遠心分離して集め、０．０７５ ＭのＮ
ａＣｌと０．００７５Ｍのクエン酸ナトリウムとの中に
吸光度２０ （２６０ｎｍにて）まで溶解させ、そして
０．５％ＳＤＳに調整した。この溶液をプロナーゼ０．
５ ｔａｉｒ／ ｎ＋１ （２０ｒｕｓｔ／ ｍｌにて
３７℃で２時間自己消化させたもの）と共に３７℃にて
３０分間培養し、１容量の蒸留フェノールで３回および
１容量％のクロロホルムで２回抽出した。試料（１に／
ｍ１ＤＮＡ溶液の２ｍｌまで）を５０ｍＭ）リス−ＨＣ
１（ｐＨ７，５） 、ｌ ｍＭＥＤＴＡ中の５〜２３％
蔗糖濃度勾配にて、ヘック７７ＳＷ２７型ロータにより
２１．ＯＯＯｒｐｍかつ１５℃で１５時間遠心分離した
。フラクションを集めてｏＤ２６ｃｆｒ−測定した。Ｄ
ＮＡ含有フラクションを集め、ＤＮＡを酢酸ナトリウム
とエタノールとにより沈澱させた。遠心分離により２０
〜１００μｇの型ＩのＤＮＡ混合物が回収された。 ２０μｇ（７）精製された型Ｔｆ７）ＤＮＡを、１５０
ｐｉの１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５） 、６ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ２−
メルカプトエタノール、２００μｇ／ｍ１１３ＳＡもし
くはゼラチン、および２０単位のＨｉｎｄｎ［にューイ
ングランド・ビオラブ社）の中で切断した。この）Ｉｉ
ｎｄＩ［Ｉ制限酵素はｐＢＲ３２２成分内の部位におい
て型■のＤＮＡを開裂させる（ｃＤＮＡ成分も開裂され
るとは思われず、もしそうならば分析は実質的に影響を
受けない筈である〕、３７℃で２時間の後、一部（１％
）を５０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７，８）、２ｍＭ
ＥＤＴＡ中の１％アガロースゲルにより５０ｍＡで１時
間電気泳動して分析し、切断が完結したかどうか確認し
た。切断が未完結であれば、さらにＨｉｎｄＩＩＩを加
えて培養を２時間続けた。型・■のＤＮＡが完全に線状
分子まで変換されたら、プロナーゼ（カルビオヶム社）
とＥＤＴＡとＳＤＳとをそれぞれ０．５ ■／ｍｌ。 １０ｍＭおよび０．５％となるまで加えた。３７℃で３
０分間の後、溶液を３０μｌフェノール−クロロホルム
（１： １）にて抽出した。有機相を５０ｔｔ１１の２
０ｍＭ）リス−）ＩＣＩ（ｐＨ７，５）、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡで洗浄し、そして合した水相をエーテルで３回抽
出し、０．１ ｍｌチェレックスカラムを通して濾過し
、ＥＤＴＡ−煮沸したパイレックスチューブに集めて、
１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量のエタ
ノールとにより再沈澱させた。−２０’Ｃにて一晩静置
した後、ＤＮＡを遠心分離により集めた。 工程Ｂ：ポリ（Ａ） ＲＮ ＡによるＤＮＡのヒブリド
化 ２種のヒブリド化混合物を鋼製した。混合物。 ■は、４μｌの１０倍濃度のヒブリド化緩衝液（４Ｍ
Ｎａ Ｃｌ、 ０．１パイブス（ｐＨ６，４，１，４
ピペラジンージエタンスルホン酸、シグマ社）と、５０
ｍＭ ＥＤＴＡと、０．５ ｐ １の約５ｎｇの■１
２５−グロビンｍＲＮＡ （５０００ｃｐｍ ）、６μ
ｌの誘発白血球ポリ（Ａ）ＲＮＡ（２μｇ／μｍ）とを
、卵母細胞中に注入した場合、６０００ＩＵの！ＦＮを
発生するに足る量で含有した。混合物■は、１０μｌの
上記からの１（ｉｎｄＩ［［で切断された型■のＤＮＡ
と、０．１μｇのＰｓｔｌ−切断されたＺ−ｐＢＲ３２
２（Ｈ３）／ＲｃβＧ ４．１３（ＨｉｎｄＩＩ［部
位にβ−ダグｌ：ヒン配列を含有するｐＢＲ３２２誘導
体）〔マンティ等、「クローン化した兎β−グロビン染
色体ＤＮＡにより形質転換させたねずみＬ８１胞におけ
る兎β−グロビンｍＲＮＡの生産」、ネイチャー誌、第
２８１巻、第４０〜４６頁（１９７９） ）とを含有し
た。混合物１における１１２５−グロビンｍ ＲＮ Ａ
および混合物Ｈにおけるβ−グロビンＤＮＡは、ヒブリ
ド化分析に対する内部陽性比較として作用する。再混合
物を窒素ガス流中にて乾燥した。４０μｌの８０％ホル
ムアミドを混合物Ｈの残部に加え、溶液を１００℃にて
１０分間変性させて、水中にて迅速に冷却した。変性溶
液を使用して混合物Ｉの残部を熔解させ、得られた溶液
を５６℃にて４時間培養した。 工程Ｃ：非ヒブリド化ポリ（Ａ） ＲＮ Ａからのヒブ
リド化ポリ（ハ）ＲＮＡ−ＤＮＡの分離 １ｍｌを冷０．９Ｍ ＮａＣ１と０．０９Ｍクエン酸
ナトリウムとホルムアミド（１００％）とで４％（容量
で）まで希釈した後、溶液をミリポアフィルタ−（０，
４５ｐｍ孔径）にて０．５ ｍｌ／ ａｋｉｎ 。 の速度で濾過し、フィルターを先ずＲＮＡ−ＤＮＡヒブ
リドを保持する能力について試験した。何故なら、製造
業者から得られたフィルターは必ずしも全てが同等に効
果的でないからである。 工程Ｄ：ヒブリド化ポリ（Ａ） ＲＮ Ａの精製ポリ（
Ａ） ＲＮ Ａヒブリドを付着した上記のフィルターを
１ｍｌの０．１５Ｍ Ｎ ａ ＣＩ 、０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳに３７℃にて１
０分間浸漬し、５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）
、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．２ｍＭＣａ ＣＩ ２で洗
浄しそして０．６ ｍｌの新たな緩衝液中に入れた。５
μｌのヨード酢酸処理したＤＮＡアーゼ（５■／ｍｌ）
を添加した後〔ニス・ビー・チンメルマンおよびジー・
サンディーン、アナリティカル・バイオケミストリー、
第１４巻、第２６９頁（１９６６）、ビー・ニー・プラ
イス等、「牛膵臓デオキシリボヌクレアーゼの活性部位
におけるヒスチジン残基のアルキル化」、ジャーナル・
バイオロジカル・ケミストリー、第２４４巻、第９２４
〜９３２頁（１９６９））、フィルターを３７℃にて１
０分間培養した。 フィルターを除去し、溶液を１容量のフェノールと１容
量のエーテルとで抽出しそして０．１ｍｌｍｌチェレッ
クスカラムした。５μｇのキャリヤＲＮＡ （精製酵母
ＲＮＡ）を溶液に加え、。 ＲＮＡを酢酸ナトリウムとエタノールとで沈澱させた。 １０．０ＯＯｘ ｇでの遠心分離により沈澱を集め、
１００μｍの１ｍＭ ＥＤＴＡ中に熔解させ、１００
℃にて９０秒間加熱し、Ｔ、ＮＥとＳＤＳとを２ｘＴＮ
Ｅおよび０．５％ＳＤＳ！、：なるまで加えた。ＲＮＡ
を１００μｌのオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着
させζ０．３ ｍｌの蒸留水で４回洗浄して溶出させ、
酢酸ナトリウムとエタノールとで沈澱させた。−２０”
Ｃで１６時間の後、沈澱したＲＮＡを遠心分離により分
離し、２μｌのＴＮＫ緩衝液中に熔解させた。 工程Ｅ ： Ｉ ＦＮ−αｍＲＮＡ活性の測定上記から
のポリ（Ａ） ＲＮ Ａ ｍ液を４０個の卵母細胞中に
注入した（卵母細胞１個当り約５０ｎｊり卵母＄１［１
胞を２３℃にて２４〜４８時間培養し、ホモジナイズし
そして遠心分離しくまたは培養培地を回収し）、前記し
たようにＩＦＮ−αにつき分析した。 ４．１１を分析：フィルター結合したＤＮＡに対するヒ
ブリド化 単−クローンからの組替えＤＮＡ分子の後分析は大部分
、ＤＢＭもしくはＤＰＴ紙結合したＤＮＡについて行な
った。何故なら、分析条件はもはや臨界的でなくかつ分
析がより便利となるからである。ＤＰＴ紙はより低い誤
差を与え、したがって優先的に使用した。Ｄ Ｂ Ｍ紙
は文献〔ジェー・シー・アルウィン等、「ジアゾベンジ
ルオキシメチル紙への移行によるアガロースゲルにおけ
る特定ＲＮＡの検出およびＤＮＡ試料によるヒブリド化
の方法」、プロシーディング−ナショナル・アカデミ−
・サイエンス・ＵＳＡ、 、第１４巻、第５３５０〜５
３５４頁（１９７７））に記載されているように調製し
ψた。ＡＰＴ紙はビー・シード（ペルス・コミューニケ
ーション）の方法により調製した；ワットマン５４０の
紙片（２０ｇ）を７０ｍ１の０．５ＭＮａＯＨ１２ｑ／
ｍｌ Ｎ ａ Ｂ Ｈ＊および３０ｍ１の１．４−ブ
タンジオールジグリシジルエーテルの混合物と共に２０
℃にて１６時間攪拌した。 次いで、この紙をアセトン４０ｍ１中の２”−アミノチ
オフェノール１０ｍ１の溶液に移し、１０時間攪拌した
。紙をアセトン、０．１Ｎ ＨＣＩ。 Ｈ２Ｏ，０，Ｉ Ｎ ＨＣｌ５Ｈ２０で徹底的に洗浄
しそして乾燥させた。ＡＰＴ紙を、ＡＢＭ紙からＤＢＭ
紙への変換について記載されていると同様に、ＤＰＴ紙
に対しジアゾ化させた〔アルウィン等、上記〕。 ＤＮＡ （１５μｇまで）を５０Ｗ２のジアゾ化ＡＢＭ
（ＤＢＭ）またはジアゾ化ＡＰＴ（Ｄ Ｐ Ｔ）紙に
結合させ〔ジェー・エッチ・ジェー、ペイジメーカー等
、「トリパノソマ・プルセイの表面グリコ蛋白変種のた
めのメツセン。 ジャーＲＮＡに相補的なりＮＡを含有するプラスミドの
単離」、ジーン誌、印刷中（１９８０））これを下記に
示す。 ヒブリドブラスミドＤＮＡをエンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉで切１折し、１ｍｌ当り５００μｇのプロナーゼと０
．５％のＳＤＳと１０ｍＭのＥＤＴＡとで３７℃にて３
０分間処理し、フェノールとエーテルとで抽出し、０．
１ ｍｌのチェレックスカラムに通しそしてエタノール
で沈澱させた。熱変性したＤＮＡ （５μｇまで、少量
のＰ”−ＤＮＡをトレーサーとして加えた）をｌｃｄの
ＤＢＭもしくはＤＰＴ紙と共に２００μｌの２５ｍＭ燐
酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，５）中で０℃にて一晩培養
した。濾紙を、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐｌ（６
，５） 、 １％グリシンにて室温で５分間３回および
９９％再結晶化ホルムアミドで３回洗浄した。９９％ホ
ルムアミドと共に６８℃にて２分間さらに培養した後、
５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，５）中で２０℃
にて３回および０．４Ｍ ＮａＯＨ中で３７℃にて１
０分間２回洗浄した。約４０〜６０％の放、射能がフィ
ルター上に保持された。フィルターを、１％グリシンを
添加した予備ヒブリド化培地Ａ中で３８℃にて３時間培
養し、この場合フィルクー１ ｆｌＭ当り３３０μｌを
使用した。培地Ａは、５０％ホルムアミドと、５ｘＳＳ
Ｃと０．０４％ポリビニルピロリドンと０．０４％フィ
コール（ファーマシア社）と０．１％ＳＤＳと２５μｇ
ポリ（Ａ）（ピー・アンド・エル社）と１００μｇ酵母
ＲＮＡ （ＢＤＨ、フェノールで６回抽出し、エタノー
ルで沈澱させたもの）とを含有する。 フィルターを培地Ａ中で２回洗浄し、次いで培地Ａ中に
てパラフィン油の下で上記したようにポリ（Ａ） ＲＮ
Ａにより（通常５〜８μｇ）３８℃にて１６時間ヒブ
リド化させた。ＲＮＡは次のようにして付加させた。一
枚の濡れたＤＮＡフィルターを吸水させ、無菌ペトリ皿
中に入れ、このフィルター上に２０〜４０μｌのＲＮＡ
溶液をピペットで載置し、第二のＤＮＡフィルター（再
現または比較）をその上に載せ、そしてこのサンドイン
チを無菌パラフィン油で覆った。 ヒブリド化の後、フィルターを順次に培地Ａ（２回）、
１ｘＳＳＣと０．２ ％ Ｓ Ｄ Ｓと１ｍＭＥＤＴＡ
とを含有する溶液（それぞれ２０”Ｃで１０分間３回）
、培地Ａ（３８℃で２時間）および５０％ホルムアミド
、５ｘＳＳＣＳＯ，１％ＳＤＳ （２０℃で１０分間３
回）で洗浄した。 ヒブリド化したＲＮＡを、２００μ／の１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ （ｐＨ７，４） 、１ｍＭ ＥＤＴＡお
よび０．１％ＳＤＳ中で１００℃にて１分間加熱するこ
とにより溶出させた。溶出工程を２回反復し、溶出液を
合し、そしてＲＮＡを２μｇの酵母ＲＮＡ （上記のよ
うに精製したもの）の添加の後、エタノールにて沈澱さ
せた。洗浄したベレットを減圧乾燥し、３μｌのＨ２Ｏ
中に熔解させそして卵母細胞中に注入した。ｆＦＮ−α
活性を上記のように分析した。 ５、ＲＮＡ選択選択リプリド化分析果 ５１２個のクローンの８群（すなわち、群Ｔ１Ｙ＜ Ｊ
、、に、 ・、０１εおよびπ）の分析は陰性であっ
た。５１２個のクローンの４群（すなわち、■、δ、Ｎ
およびλ）の分析は陽性であり、ただし同一でなかった
。陽性分析は次のように記録される：ポリ（Ａ） ＲＮ
Ａ −Ｄ Ｎ Ａヒブリドから遊離されたＲＮＡによ
り生成されたＩＦＮ−αのＩＵ／ｍ１（Ｚ−ｐＢＲ３２
２（Ｈ３）／ＲｃβＧ−４，１３（上記）を使用する比
較ヒダリド１ヒの分析〕 ；ここで実験結果が比較より
も高い分析値には下線を施こした。 亙 ＩＵ／ｍ１ １ ＜６０（＜６０） ；１１０ （＜２０）
；＜１１０（＜１１０） ｉ＜１１０ （＜１１
０） 、＜３５（＜３５） δ ２０ （＜ ２０） Ｎ ３５（＜２０） ；＜１１０ （＜１１０）
；２００（＜１１０） λ ＜６０（＜６０） ；旦喝（＜２０） ；＜１
１０ （＜１１０） ；＜１１０ （＜１１０） 群λを６４個のクローンの８つのサブグループに分割し
、ヒブリド化させ、そして前記のように分析した。サブ
グループは上記と同様に表わして、次の結果を与えた： ザブグループ ＩＵ／ｍｌ λ−Ｉ ＜３５（＜３５） ；＜３５（＜３５）λ
−■ 工（＜ ３０） ｉ ＜ ４５ （＜ ４５）
λ−■ 恣！５ （＜３５） ；匪（＜３０）；並
（＜３０）ｉｙ度（＜ ３０） ； ＜ ２０ （＜
２０）λ−■ 益（＜ ３５） ； ＜ ２５ （
＜ ２５）λ−ｖ ＜３５（＜３５） λ−Ｖｌ ＜３５（＜３５） λ−■ ＜ ３５ （＜ ３５） λ−■ ＜３５（＜３５） サブグループλ−■を８個のクローンの８紐に分割し、
ヒブリド化させそして分析した。 ！ｊＬＩＵ／ｍｌ λ−１１１−１ ＜２０（＜２０） 、＜２０（６
０） ；３５（＜３０）λ−ｍ−２ ＜３５ （＜
３５） ； ＜３０ （＜３０） ； １５０（＜
２０）、甜狙 （＜３５）；ユ（６ｏ）λ−ｍ−３
＜２５（＜２５） ：＜３０（＜３０＞λ−ｍ−４
３０ （＜３０） ： ＜２０ （＜２０） ；
＜２０ （６０）λ−ＩＩＩ−５ ３０（？） （＜
３５） ；＜２０（＜２０） ；＜３５（６０） λ−１１１Ｆ−６＜３０（＜３０） 、＜２０（＜２
０）λ−ｍ−１ ＜３０（＜２０） λ−１１１−８ ＜３０（＜２０） 第一の陽性結果は組λ−ｍ−４により達成されたので、
この組の個々のコロニー（Ａ−Ｈと云う）をヒブリド化
させかつ分斤した。 λ−Ｉ１１−４−８ ＜３５＊ （＜３５） ；＜
２０（６０）Ａ −ｍ−４−ｃ ３５ （６０）
Ｈ６０＊ （＜３５） ； １１１ ＊（＜１１）
； １１＊（＜１１） ；２０（＜２０）Ｉ Ｄ
ＢＭ紙をこの分析に使用した。 したがって、クローンλ−Ｉ１１−４−Ｃは、ＩＦＮ−
αｍＲＮＡをヒブリド化しう名紙替えＤＮＡ分子を含有
する。 このクローンにおける組替えＤＮＡ分子は次の通りであ
る： Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ） ／ＨｃＩＦ−４
Ｃ（“Ｈｉ ｆ−４Ｃ”）およびこれを含有する細菌菌
株：イー・コリＸ１７７６（Ｚ−ｐＢＲ３２，２（Ｐｓ
ｔ、）／ＨｃＩＦ ４Ｃ）（“イー・コリＨｉｆ−４
Ｇ”〕、この名称は、組替えＤＮＡ分子がチューリッヒ
（Ｚ）に起源しかつＰ ｓ ｔ ｒ部位にＨｒ ＦＮ−
ｃｔｃ ＤＮＡ（“ＨｃｌＦ”）を含有するプラスミド
ｐＢＲ３２２であることを示し、特定の組替えＤＮＡ分
子はクローンλ−Ｉ［ｒ−４−Ｃ（“４Ｃ”）に由来す
る。 形質転換細胞の第一次クローンはしばしば２種以上の組
替えＤＮＡ分子を含有するので〔エフストラチアジス等
、「クローン化ＤＮＡから決定された兎β−グロビンｍ
ＲＮＡの第一次構造」、セル誌、第１０巻、第５７１〜
５８５頁（１９７７））、Ｈｉｆ−４Ｃをイー・コリＸ
１７７６ （Ｈｉｆ−４Ｃ）クローンから単離して上
記のように精製した。Ｈｉｆ−４ＣおよびｐＢＲ３２２
の試料をＰｓｔＩで切断し、１％アガロースゲル上での
電気泳動により分析した。 Ｈｉｆ−４Ｇは２つのバンドを与え、１つはＰｓｔ−開
裂ｐＢＲ３２２の移動度を有し、他方は約３２０ ｂ、
ｐ、に相当する移動度を有した。 イー・コリＨＢ ｌ ０１を上記のように単離１１ｉｆ
−４Ｇにより形質転換させた。テトラサイタリン耐性か
つ形質転換した細菌の６個のクローンを採取し、小培養
物をａ！ｔ！Ｌ、型ＩのＤＮＡを精製しそしてＰｓｔｌ
開裂およびアガロースゲル電気泳動により前記と同様に
分析した。全ての試料は、Ｈｉｆ−４Ｃと同一の開裂様
式を示した。これらの再クローン化した組替えＤＮＡ分
子の１つはＺ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／ＨｃＴＦ−
４ｃ （Ｈｉｔ−４ｃ”）と呼ばれ、後の実験用に使用
した。小文字“Ｃ”は再クローン化したＤＮＡ分子を意
味する。 ＩＦＮ−αｍＲＮＡにヒブリド化するＨｉｆ−４ｃおよ
びそのｃＤＮＡ挿入物の能力を測定するため、Ｈｉｆ−
４ｃ （１１５μｇ）を１２５単位のｐｓｔＩにより完
結するまで切断し、フェノールとクロロホルムとで抽出
しそして上記したようにエタノールで沈澱させた。１部
（１′０μｇ）を５′末端標識した（後の工程における
トレーサーとして役立つ）が、これは１００μｌの５０
ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７，５’）中に１部を溶解さ
せ、これを０．１ ｍｌのチェレックス１００型カラム
に通しそしてこれを０．６ 学位の細菌性アルカリホス
ファターゼにより６５°Ｃで１時間処理して行なった。 １０倍濃度のＴＮＥ（４０μＮ）を加え、この溶液を１
容量のフェノールで３回および１容Ｉのクロロホルムで
３回抽出した。ＤＮＡを２容量のエタノールで一２０℃
にて一晩沈澱させ、遠心分離によって回収した。 さらに精製するため、０．５ ｍｌＴ Ｎ Ａ中の試料
を０．２５ｍ１のＤＥＡＥセルロース（ワットマンＤＥ
５２．２ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣ１，５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５） 、２ｍＭ ＥＤＴＡ
にて予備洗浄）（“ＮＥＴ−緩衝液”）に吸着させ、２
ａ＋ＩのＮＥＴ緩衝液で洗浄し、０．４ ｍｌの１．５
Ｍ ＮａＣ１，２０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５
） 、２ｍＭ ＥＤＴＡにて溶出させそして上記のよ
うにエタノールで沈澱させた。 Ｄ、ＮＡをｒ−Ｐ” −ＡＴＰ （比活性約５０００Ｃ
ｉ／ミリモル）およびポリヌクレオチドキナーゼと共に
培養し〔ニー・エム・マクサムおよびダブリュー・ギル
バート、ｒＤＮＡの新規な配列決定方法」、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ
、 第７４巻、第５６０〜５６４頁（１９７７））、そ
してＴＮＥ中３ｍｌのセファデックス−０５０カラムで
クロマトグラフにかけて精製しＦ、溶出させたフラツジ
ぢンを集め、Ｐ３２−ＤＮＡを上記のようにエタノール
で沈澱させた。収量は約１０７６ρｍであった。 未標識Ｐｓｔｔ−開裂Ｈｉｆ−４ｃＤＮＡ（９０μｇ）
を上記からの６Ｘ１０’ｄｐｍのｐ３２−標Ａ６Ｐｓｔ
ｌ−開裂Ｈｉｆ−４ｃＤＮＡと混合し、５０ｍＭトリス
−酢酸緩衝液（ｐＨ７，８）中の１０Ｘ２０Ｘ０．７１
の２％水平アガロースゲルに２．５ ｃｍスロットによ
り通して電気泳動させた。Ｘ線フィルムをゲルに露出さ
せ、３２０ｂｐ断片の位置を決定した。放射能バンドを
有するゲル片（１，３Ｘ １０５ｄｐｍ ）を切り取り
、プラスチック製２ｍｌ注射器で圧砕し、ゲル容禎の１
０倍量のＮＥＴ緩衝液と共に攪拌することにより４℃で
一晩抽出した。ＤＮＡを０．１ ｍｌのヒドロキシアパ
タイトカラム（１ｍｌのＮＥＴｉ街液で予備洗浄）に吸
着させた。カラムを１ｍｌの０．１Ｍｍ酸カジカリウム
緩衝液Ｈ７，５）で洗浄し、ＤＮＡを０．２ ｍｌのＩ
ＭＲ酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で溶出させた。溶
出液を滅菌蒸留水で１０倍に希釈し、ＤＮＡをＤＥＡＥ
に吸着させかつそこから溶出させそして上記したように
エタノールで沈澱させた。このＤＮＡを″Ｈｉｆ−４ｃ
断片”と呼ぶ。 Ｈｉ ｒ −４ｃ断片（１２０ｎｇ）をＤＰＴ紙（０，
５Ｘ Ｏ，５Ｃ１１）に上記のようにして結合させ
□た。比較としては、１２０ｎｇのβ−グロビンｃ
ＤＮＡ断片をヒブリドブラスミドＺ−ｐＢＲ３２２（Ｈ
３）ＲｃβＧ −４，１３から）（ｉｎｄｎ［により切
断し〔エフ・マイヤー等、［ベクトルからベクトルへの
、ＡＴ結合したクローン化ＤＮＡの転位」、エキスペリ
メンチア、第３５巻、第９７２頁（１９７９）；エフ・
マンティ等、上記〕、そして同様に処理した。ポリ（Ａ
＞ＲＮＡ（２０μβ）に対する複製フィルターのヒブリ
ド化と、フィルターの洗浄と、フィルターからのＲＮＡ
の回収とは上記と同様にして行なった。卵母細胞中に注
入した後、次のＩＦＮ−α活性が検出された。 白血球ポ ヒブリド ＩＦＮ−α活 ＤＮＡ断片 リ（Ａ）ＲＮＡ＊ 化時間 性（ＩＵ
／ｍｌ） ＊Ｈｉｆ−４ｃ ２．５ １６ｈ
２５０；１００β−グロビン ２．５ １６
ｈ ４；１ ＤＮＡ Ｈｉｆ−４ｃ ７．５ １６ｈ ３０００
；１０００β−グロビン ７．５ １６ｈ
４；３０ＤＮＡ Ｈｊ ｆ −４ｃ ７．５ ５ｈ １０
００ ｉ １０００β−グロビン ７，５ ５
ｈ １０；１ＤＮＡ ＊ このＲＮＡ １Ｍｇは４６００１Ｕ／ｍｌを与
えた。 ＊＊ ４８時間培養後の卵母細胞上澄液、細胞病理学効
果の減少により分析〔ダブリュー・イー・スチュアート
・ｎおよびニス・イー・スルキン、上記〕 かくして、Ｈｉ ｆ −４ｃはＩＦＮ−αｍＲＮＡにヒ
ブリド化しうる挿入物を含有する。 組替えＤＮＡ分子Ｈｉｆ −４ｃ ニおけるｃＤＮＡ揮
入物は僅か約３２０ ｂ、ｐ、であったか、またはＩＦ
Ｎ−αｍＲＮＡの第三の推定寸法であったので、上記の
精製Ｈｉｆ−４ｃ断片を試料として使用し、関連ヒダリ
ドＤＮＡ挿入物を有する組替えＤＮＡ分子を含有する細
菌クローンを選別した。 上記したサブグループλ−■を構成する６４個の細菌ク
ローンをミリボア膜（直径８ｃｍ）上にスタンプし、寒
天板（ジアミノピメリン酸、ナリジキシン酸およびテト
ラサイクリンを上記のように添加）上にｉｔしそして３
７℃で２４時間培養した。フィルターを０ 、７５ｍ
Ｉ液滴の０．５ＭＮａＯＨ上に載せ、２〜３分間後に紙
タオル上に移して過剰の液体を除去し、工程を反復した
。ＩＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）を用いてフィ
ルターを中和し、上記と同様にして１．５ＭＮａＣ１−
０，５Ｍ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，４）で洗浄し、そし
て風乾させた。フィルターを０．３ＭＮａＣ１中に浸漬
し、風乾し、そして８０℃にて減圧下に２時間加熱した
。 Ｈｉｆ−４ｃ Ｐｓｔ断片（３０ｎ ｇ）を、β−Ｐ
” ２−ｄＡＴＰとα−Ｐ” ２−ｄＣＴＰ（それぞれ
、比活性４０ Ｃｉ ／ ミリモル）とを用いてニック
翻訳〔ニー・リュー・ジエフリーおよび一アール・ニー
・フラベル、「兎β−グロビン遺伝子はコード配列中に
大きな挿入物を含有する」、セル誌、第１２巻、第１０
９７〜１１０８頁（１９７７））によりｐ３２−標識し
た。λ−■コロニーを有するフィルターを４セツト〔セ
ットは０．１５Ｍ Ｎａ ＣＬ ３０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ （ｐＨ８，０） 、１ｍＭ ＥＤＴＡである
〕と０．１％（Ｗ ／ Ｖ ）フィコールと、０．１％
ポリビニルピロリジン（！：０．１％（ｗ／Ｖ）ＢＳＡ
と、０．５％ＳＯ３と２００βｇ／ｍｌ変性断片化鮭精
子ＤＮＡとにおいて６８℃で７時間予備ヒブリド化させ
、次いで４セントと０．０２％（Ｗ／Ｖ）フィコールと
０．０２％ポリビニルピロリジンと０．０２％（Ｗ／Ｖ
）ＢＳＡと０．５％ＳＤＳと２００βｇ／ｍｌ変性鮭精
子ＤＮＡとにおいて２Ｘ１０’ｃｐｍのｐｆｆ２−標識
Ｈｉｆ−４ｃ断片゛にて６８℃で１６時間ヒダブド化さ
せた。このフィルターをセット−０，５％ＳＤＳにより
室温で洗浄し、２セント−０，５％ＳＤＳにて６８℃で
５時間洗浄し、溶液を１回交換し、３ｍＭトリズマベー
スにより室温で４時間洗浄し、溶液を１回交換した。フ
ィルターを乾燥した後、Ｘ線フィルムをスクリーンによ
りフィルターに８０時間露出させた。３つのコロニー、
すなわちλ−Ｉ［１−７Ｄ、λ−ＩＩＩ−２Ｈおよびλ
−■−４０は強力な陽性反応を示し、そして２つのコロ
ニー、すなわちλ−ｍ−ｉＥおよびλ−■−３Ｄは弱い
反応を示した。 Ｈｉ ｒ −４ｃ関連クローンから小培養物を調製し、
型ＩのＤＮＡを精製し、ＰｓｔＩで開裂させそして上記
のようにアガロースゲル電気泳動により分析した。全て
の型ＩのＤＮＡは大きな断片（プラスミドｐＢＲ３２２
成分）と小さい断片（ヒブリド挿入物）とを生じた。λ
−■−２Ｈからの組替えＤＮＡ分子は、最大の挿入物、
すなわち約９００ ｂ、ｐ、を遊離した。この組替えＤ
Ｎ Ａ分子をＺ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／ＩＴｃ
ＩＦ−２Ｈ（’Ｈｉ ｆ−２Ｈ’″）と名付け、その
挿入物を“Ｈｉｆ−２Ｈ断片”と名付ける。 Ｈｉ ｆ−２Ｈを、そのＩＦＮ−αｍＲＮＡを結合する
能力につき試験し、これは全て上記したようにＤＰＴ紙
（４μｇ／１００ｍ２）に結合させてポリ（Ａ）ＲＮＡ
（０，３μｇ／μｌ）に１６時間ヒダブド化させ、そ
してＩＦＮ−αｍＲＮＡ活性を測定することにより行な
った。 ＤＮＡ試料 ＩＦＮ−α活性Ｔ（ｉ ｆ −
２Ｈ２５０±５０ （４回測定の平均値） Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｈ３） ３０／ＲｃβＧ−
４，１３（２回測定の平均値）ｐＢＲ３２２２０ ＊ 細胞病理学的効果の減少により分析Ｈｉ ｆ−２Ｈ
を、）（ｉｆ−４Ｃについて記載したと同様に再クロー
ン化させ、これをＨｉｆ−２ｈと名付ける。 別の実験において、組替えＤＮＡ分子を含有するさらに
一組の大腸菌クローンを調製し、標１Ｈｉｆ−４ｃ断片
にダブリド化するコロニーを同定した。長ｃＤＮＡ挿入
物を有するプラスミドの高収量を確保するため、白血球
ポリ（Ａ＞’ＲＮＡから酵素的に調製した二重鎖ｐ１２
−標識白血球ｃＤＮＡの１部を、ポリ（Ａ） ＲＮ Ａ
の遠心分離について記載したと同じ手順で蔗糖濃度勾配
により遠心分離して寸法的に分別した。 ６００ ｂ、ｐ、ＤＮＡ断片もしくはそれ以上に対応し
た沈降速度を有するｃＤＮＡを含有するフラクションを
集め、エタノール沈澱の後にｃ ＤＮＡを回収した。ｃ
ＤＮＡをｄＣＭＰ残部により伸長させ、ｄＧＭＰ伸長し
たＰｓｔｌ開裂ｐＢＲ３２２にダブリド化させそしてこ
のダブリドＤＮＡを使用して前記のように大腸菌を形質
転換させ、この場合大腸菌としてイー・コリＨＢ１０１
を使用した。細菌を直径３ ｃｍのミリポアフィルタ−
上に分布させ、トリプトン培地寒天板（１０μｇ／ｍｌ
のテトラサイクリンを含有する）の上に載置しそして小
コロニーが出現するまで生育させた。新たな濡れたミリ
ポアフィルタ−をコロニー保持フィルターの上に押圧さ
せ、剥離し、その面を上に向けて４．４％グリセリン含
有の寒天板の上に載置しそして小コロニーが出現するま
で培養することにより、複製フィルターを調製した。こ
のコロニー保持フィルターをさらにミリポアフィルタ−
で覆い、−５５℃にて凍結させて貯蔵した〔ディー・ハ
ナハンおよびエム・メセルソン、「高密度プラスミド選
別に関する記録」、１９７８年９月私的通信〕。 全部で約５０００個のコロニーを保持する１５枚のフィ
ルターを調製した。各フィルターの一複製物を用いて、
上記したと正確に同様に、ｐ ３２−標識Ｐｓｔｌ−切
断Ｈｉｆ−４ｃＤＮＡ断片にダブリド化させた。約１８
５１１１の陽性コロニーが放射能写真上で同定され、ミ
リポアフ・イルター上で再クローン化させそしてヒブリ
ド化により再度同定した。最強のダブリド化反応を示す
９５１固のクローンをＺ−ｐＢＲ３２２（ＰＳｔ）／Ｈ
ｃ ＩＦ−ＳＮＩ乃至５Ｎ９５と名付け、後の研究に使
用した。 勿論、ＨｕｌＦＮの免疫学的もしくは生物学的活性（下
記）を示すポリペプチドを生産する能力がＨｉｆ−２ｈ
に与えれているので、このＨｉｆ−２ｈおよびその他の
これに関連するＤＮＡ配列、たとえばＨｉｆ−４ｃをこ
のクローン選別法に使用することができ、さらに組替え
ＤＮＡ技術、合成、天然源もしくはそれらの組合せから
生ずるＤＮＡ配列を含有する池のクローン、或いは単一
もしくは多重のペース置換、挿入、転位もし゛くは欠失
を含む突然変異により他のＤＮＡ配列を選別するよう上
記ＤＮＡ配列のいずれかに関連するクローンおよびＨｕ
ｌＦＮをコードするクローンについても全く同様に使用
できることが明らかである。したがって、この種のＤＮ
Ａ配列およびそれらの同定も本発明の範囲内である（た
とえば下記〕、また、上記ＤＮＡ配列により選別されず
、しかもそれらのヌクレオチド配列の結果、上記ＤＮＡ
配列の発現によりコードされたポリペプチドを発現にお
いてコードするようなりＮＡ配列も本発明の範囲内であ
る。 Ｈｌｆ−２ｈＤＮＡ挿入物の他の特性化上記したように
組替えＤＮＡ分子Ｈｉｆ−２ｈは約９００ ｂ、ｐ、の
挿入物を含有し、ひと白血球インターフェロンｍＲＮＡ
にヒブリド化する。 下記の付加的特性をさらに決定した。 １、ダブリド抑制翻訳 ｍ ＲＮ Ａをクローン化された相補的ｃ ＤＮＡにダ
ブリドｊヒさせれば、ｍＲＮＡの翻訳は抑制されるが、
ダブリドの熱変性は翻訳可能なｍＲＮＡヲ＞Ｍ 離する
〔ビー・エム・パターソン’Ｊ、ｒＤＮＡ−ｍＲＮＡヒ
ブリダブ抑制された無細胞翻訳による構造遺伝子同定お
よび地図化」、プロシーディング・ナショナル・アカデ
ミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻、第４３７０〜４
３７４頁（２９７７） ：ｌ 、 ２．２ ｐｇのＰｓ
ｔＩ−切断Ｔ（ｉ ｆ −２ｈおよび比較として２ｐｇ
のＨｉｎｄ■−切断Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｈ３）／Ｒｅβ
Ｇ−４，１３（ＲｃβＧ″）を、１０μｌの８０％（Ｖ
／Ｖ）脱イオン化ホルムアミド−２０ｍＭパイブスｔｆ
＆ｔＥ液（ｐ１１６．４）において８０℃で１０分間変
性させた。溶液をエフペンドルフ管に加え、ここには予
め白血球ポリ（Ａ）ＲＮＡ（５μｇ）とＮａＣ１（４＃
モル）とＥＤＴＡ（１０ｎモル）とを乾燥させておいた
。混合物をパラフィン油層の下で４８℃にて７時間加熱
し、冷却しそして２００μｌのＨ２Ｏで希釈した。２つ
の試料を竿部に分割し、それぞれの一方を１００℃にて
３０秒間加熱した。核酸をエタノールにより沈澱させ、
３μｌのＨ２Ｏ中に熔解させそＥｃｏＲＴ ２０
９．６７６．７４８ 、 ７４８．３６１１＋Ｐｓｔ
Ｉ ３６１１ Ｆｉｓｐ Ｔ ９２１ 、 ５８７．５４０、
５８７．５４０．５０４．４５７．４３４ 、 ５０
４．４５７．２ｘ２３１ 、 ４３４
．２６７、＋１４断片 ＋１４断片 ２００ｂｐ ２００ｂｐＭｂｏ Ｕ
１６１６．８８４ 行なわずおよびその
他 ＊＊ 内部的に一致しているが、これら断片の絶対寸法
は第８〜１０図を参照して最も良く示される。 ＊＊＊サソトクリフ（上記）から。 さらに、５′末端ｐ３２−標識ＰｓｔＩ切所Ｈｉｆ−２
ｈを数種の制限酵素で開裂させ、組替えＤＮＡ分子中の
ｃＤＮＡ挿入物から生じた放射性断片の寸法を測定した
。 ＥｃｏＲＩ ６７６．２０９ Ｈｉ ｎ ｄ ［［ｒ 開裂せずＢｓｐｌ
７９９．８６ １−！ ｐ ａ ＩＩ 開裂せずＨｈａ ｒ
開裂せず ｎ ａ ｍ ＨＩ 開裂せず Ｈｉｎｆ ２１０．６２ ６ｇｌＵ ５４５．３４０ ＊ 内部的に一致しているが、これら断片の絶対寸法は
第８〜１０図を参照して最も良く示される。 これらのデータから、Ｈｉｆ−２ｈの制限地図を推定し
た（第４図）、この地図は部位の絶対位置に関し決定的
でなく、挿入物内のＭｂ。 ■部位に関し不完全であろう。挿入物に最も近い部位の
みがｐＢＲ３２２成分内に示されている。矢印はＩＦＮ
−αｃＤＮＡコードストランドの方向性を示している。 本発明のクローンにおけるＨｉｆ−２ｈ断片もしくはそ
の他挿入物の実際的構造またはそれからコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列もしくは構造は本発明を実施
する上で当業者に必要とされないが、上記データおよび
制限地図を本願出願時における断片構造に関し最も良く
利用しうる清報として本出願中に含ませる。爾来、期待
されるように（上記）、Ｈｉｆ−２ｈ断片に関するこれ
らデータおよび制限地図は、ヌクレオチド配列決定およ
び制限分析の周知技術を用いて精選されている〔たとえ
ば、ニー・エム・マクサムおよびダブりニー・ギルバー
ト、ｒＤＮＡの新規な配列決定方法」、プロシーディン
グ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第
７４巻、第５６０〜５６４頁（１９７７）〕、プラスミ
ドＤＮＡをウィルキーの論文第８６１〜８６２頁に記載
された方法Ｂにより調製し〔エフ・エム・ウィルキー等
、「単純庖疹ウィルスＩの活性チミジンキナーゼ遺伝子
を含有するダブリドプラスミド」、ヌクレイツク・アシ
ッド・リサーチ、第７巻、第８５９〜８７７頁（１９７
９））、業者により推奨されるように各種制限酵素で制
限化し、ただし２００μｇ／ｍｌのゼラチンを牛血清ア
ルブミンの代りに酵素緩衝液中に使用した。［ＥｃｏＲ
Ｉはダブリュー・ポルから寄贈され、Ｂｓｐｌはニー・
キスから寄贈され、その他の酵素はニューイングランド
・ビオラブ社から得られた］。 制限ＤＮＡ（２０Ｍｇ）をフェノールで抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、０．０５Ｍ ）リス−ＭＣＩ（ｐＨ８
）中に溶解させそしてチェレックス１００の小カラムに
通した。フラッシュ（ｆｌｕｓｈ）もしくは５゛−結合
末端を有する断片を、２００μｌの０．０５Ｍ ）リス
−ＨＣＩ（ｐｉ（８）中においてＤＮＡ５’末端ｐモル
当り０．２単位の子牛腸アルカリホスファターゼ（ベー
リンガー社）により３７℃で６０分間処理して脱燐酸化
させた。酵素を６５℃で６０分間加熱することにより失
活させた。３゛結合末端を有するＤＮＡ断片については
、細菌性アルカリホスファターゼ（ワーシングトン社）
を文献〔ニー・エム・マキサムおよびダブりニー・ギル
バート、上記〕に記載されているように使用し、た。 だし培養は６５℃にて３０分間行なった。脱燐酸化ＤＮ
ＡはＤＥＡＥ−セルロースに吸着およびン容出させて楕
製し〔ダフ゛リエー・ミエーラー等、ｒＤＮＡにおける
部位指向性変異ニアミノ酸１２１〜１２３に対応する位
置におけるクローン化β−グロビン相補ＤＮＡのポイン
ト変異の発生」、ジャーナル・モレキュラー・）くイオ
ロジー、第１２４巻、第３４３〜３５８頁（１９７Ｂ）
）、或いはこれを必要に応じポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけた（下記参照〕、ポリアクリルアミド（も
しくはアガロース）ゲルから０．１５Ｍ Ｎ ａ Ｃ
１，０，０５Ｍ ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ８）中に回
収した断片を０．１ ｍｌのヒドロキシアパタイト（ビ
オラドＨＴ Ｐ社）カラムに吸着さ一亡、０．１Ｍ燐酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌで４回洗浄しそして０
．３ ｍｌの１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で溶出
させた。この溶液を１０倍希釈し、ＤＮＡをＤＥＡＥ−
セルロースに吸着させ、上記のように回収した〔ダブり
ニー・ミューラー等、上記〕。 エタノール沈澱の後、ＤＮＡを〔γ−Ｐ３２〕ＡＴＰ
（ＤＮＡ５″末端ｐモル当り１２〜３４μＣｉ）および
ポリヌクレオチドキナーゼ（二ニー−イングランド・ビ
オラブ社またはＰ−Ｌビオケミカルス社）にて、実質的
にニー・エム・マキサムおよびダブりニー・ギルバート
（上記）により記載されているように５′末端標識した
が、ただしキナーゼ反応の前にＤＮＡを変性させなかっ
た。ＤＮＡ５’末＠ｐモル当り１〜１．５μＣ１（Ｐ”
）ホスフェートの比活性が得られた。 配列決定のため、標識断片を第二の制限酵素で開裂させ
、そして生成物をトリス−ＷＲ＠−ＥＤＴＡ緩衝液にお
ける５％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動ｑより分
離した。所望の断片をこのゲルから抽出して精製した〔
ミューラー等、上記〕。配列決定用の各種断片を次のよ
うにして調製したｃ数は、ベース対における名目断片鎖
長を示し、標識部位は星印により示される〕。 （１）ＢｓｐｌによるＨｌｆ−２ｈの開裂ならびに、レ
ーニングｋＷ ｆＥ液における５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によるＢｓｐｌ−Ｂｓｐｌ−２３２および
ＢｓｐＩ−ＢｓｐＴ−９４９の単離〔ニー・イー・レー
ニング、「ポリアクリルアミドゲル電気泳動による高分
子量リボ核酸の分別」、ジャーナル・バイオケミストリ
ー、第１０２頁（１９６７））、 （２１ＢｓｐＩによるＨｉｆ−２ｈの開裂、標識化、ｐ
ｓｔｌによる開裂ならびにＢｓｐｌ＊−Ｐｓｔｌ−８３
およびＢｓｐＩ＊−ＰｓｔＩ−８２７の単離、 （３）ＢｇｌＩ［によるＨｉｆ−２ｈの開裂、標識化、
ｐｓｔＩによる開裂ならびにＢｇｌｌｌ＊−ＰｓｔＩ−
３３６およびＢｇ Ｉ Ｕ＊−Ｐｓ ｔ ｌ−５７０の
単離、 （４）ＭｂｏＩ［によるＨｉｆ−２ｈの開裂、標識化、
Ｐｓｔｌおよび）（ｉｎｄｌＩによる切断（阻害性３５
０ｂｐ ｐＢＲ３２２断片を開裂させる）、ならびに
Ｍ ｂ ｏ■＊−Ｐｓｔｌ−５１９およびＭ ｂ ｏ
ＩＩ ＊ Ｐ ｓ ｔ Ｉ −３５１の単離、（５）
ＥｃｏＲＩによるＨｉｔ−２ｈの開裂、標識化、ｐｓｔ
ｌによる開裂、ならびにＥＣＤＲＩ＊−Ｐｓｔｌ−７０
８およびＥｃｏＲ１＊−Ｐｓ ｔ １−１９８の単離、 （６）ＰｓｔＩによるＨ ｉ ｒ −２ｈの開裂、標識
化、ＢｇｌＩＩによる開裂ならびにｐｓｔｌ＊−Ｂｇｌ
ｌＩ−５７０およびＰｓｔｌ＊−シ已■−３３６の単離
、 （７）ＡｖａｌｌによるＨ ｉ ｆ −２ｈの開裂、標
識Ｕ＊−ＢｇｌＩＩ−１４７の単離、 （８）ＰｖｕＩ［によるＩ（ｉ ｆ −２ｈの開裂、標
識化、Ｐｓ ｔ Ｉ＃よびＢｇｌｌ［による開裂ならび
にＰｖｕＩ［＊−ＰｓｔＩ−４８６の単離。 断片を、ニー・エム・マキサムおよびダブりニー・ギル
バート（上記）の方法により減成させたが、この場合同
著者により１９７８年９月に示された報告の変法を用い
た。生成物を、５０ｍＭトリス−硼酸、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐｉｆ８．３）中で０．１ｘ２５ｘ３６Ｇの１２
％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド／ビスアク
リルアミド−１８／１）により分別化させ、その際７０
０ボルトで６時間の予備処理の後、９００ボルトで２．
８． １８および２６時間処理した。 最良の結果は、ゲルを使用前２〜３日間にわたり室温に
維持した場合に得られた。 各長さのｃＤＮＡ挿入物を両ストランドから配列決定し
、標識末端として役立つ各制限部位を緊張させた断片に
より配列決定した。かく得られたヌクレオチド配列を第
８〜１０図に示す。 予期されるように、この挿入物における各制限部位の位
置は、制限酵素開裂のみにより測定される位置よりも完
全に位置決定され、これを第４図に示す。 第８〜１０図について見ると、挿入物のへテロ重合部分
は５″末端における２３Ｇ残基および７Ａ残基（恐ら（
ｍ Ｒ’Ｎ Ａのポリ（Ａ）末端を反映する）により、
ならびに３′末端における１５Ｃ残基により示される。 参考のため、挿入物は、ｄＧ末端に続く第一ヌクレオチ
ドからポリ（〜残基の前の最終ヌクレオチドまで番号が
付けられる。位置５７〜５９におけるＡＴＧ開始トリブ
レットおよび位置６２４〜６２６におけるＴ Ａ 、Ａ
停止トリプレットは、ナンセンスコドンにより中断され
ない解読枠を規定する。挿入物におけるこの領域内の２
つの他の解読枠はそれぞれ１８ｆＩＩおよび１２゛１固
のナンセンスコドンを有する。 さらに異なる解読枠におけるＡＴＧもしくはＧＴＧおよ
び停止信号により示されて２５個以上のアミノ酸のポリ
ペプチドをコードする他の配列は、それぞれヌクレオチ
ド２２６と３０４との間、６４０と７７８との間および
６８３と７４３との間に存在する。したがって、ヌクレ
オチド５７と６２６との間の領域は、恐らく本発明にお
けるＩＦＮ−αの生物学的もしくは免疫学的活性を示す
ポリペプチドをコードするようなＨｉｆ−２ｈ断片のヌ
クレオチド配列を含むと思われる。 勿論、通常の方法〔ニー・エフストラチアジス等、上記
〕によるポリ（Ａ’） ＲＮ Ａからのクローン化ｃＤ
ＮＡは５′末端ヌクレオチドを欠失しかつ人工的配列さ
え含みうろことを了解すべきである〔アール・アイ・リ
チャード等、「成鶏β−グロビンｃＤＮＡの分子クロー
ン化および配列分析」、ヌクレイツク・アシッド・リサ
ーチ、第７巻、第１１３７〜１１４６頁（１９７９）
） 、 したがって、ヌクレオチド５７〜５９に位置す
るＡＴＧが標準ｍＲＮＡの最初のＡＴＧであるとは限ら
ない、しかしながら、以下の説明の目的で、ヌクレオチ
ド５７〜５９におけるＡＴＧが標準ｍＲＮＡの最初のＡ
ＴＧであると仮定する。 挿入物のこの領域によりコードされるポリペプチドを標
準ひとリンパ芽球細胞インターフェロンの３５個末端ア
ミノ酸、すなわち、−−Ａｓｐ−−（ケー・シー・ズー
ン等（上記〕およびエム・フンカピラーおよびエル・フ
ード（上記）により決定〕と比較すれば、選択解読枠は
適正であり、ヌクレオチド５７〜１２４は「成熟」ポリ
プチドをコードするヌクレオチド配列に先立つ信号配列
をコードしうるちのと思われる。何故なら、公表された
配列と決定された配列とを並べて見ると（第２４ｅ目以
降のアミノ酸）、顕著な一致性を示すからである（すな
わち２６〜３５アミノ酸〕、 成熟液ｍ ＲＮ Ａにおいて、５′末端からの第−ＡＵ
Ｇトリプレットは通常、蛋白合成に対する開始部位であ
る〔エム・コザソク、「成熟核リポソームはどのように
してメツセンジャーＲＮＡにおける開始域を選択するか
」、セル誌、第１５巻、第１１０９〜１１２５頁（１９
７８）〕、リンパ芽球細胞インターフェロンの第一アミ
ノ酸に対応するＨｉｆ−２ｈ断片中のコドンは第−ＡＵ
Ｇからの２２（ＩＩのコドン（および第二ＡＵＧからの
１４１囚のコドン）であり、これはインターフェロンを
コードする配列に先立って、２３個（もしくはそれ以下
の恐らく１５個）のアミノ酸の信号ペプチドを決定する
配列があることを示している。長い方の推定信等配列は
１１個の疎水性アミノ酸の非中断系列を含有し、短い方
のものは６個の疎水性アミノ酸のものを含有する。疎水
性歿基のこの蓄積が信号配列の特徴である〔ビー・ディ
ー・デビスおよびピー・シー・タイ、「膜を透過する蛋
白質分泌のメカニズム」、ネイチャー誌、第２８３巻、
第４３３〜４３８頁（１９８０）〕、 「成熟ＪＩＦＮ−αポリペプチドに明らかに対応するヌ
クレオチド配列は４９８個のヌクレオチドからなり、１
６６個のアミノ酸をコードする。カルボキシ末端処理が
ないと仮定すれば、イ’／ター７エロンポリペプチドの
分子量は１９．３８８である。コード配列の基本組成は
５０％ＧＣである。インターフェロンコード配列内のコ
ドン使用は、一般に補乳類ｍ ＲＮ Ａに対して示され
たものとよく一致する〔アール・グランタム等、「コド
ンカタログ使用およびゲノム仮説」、ヌクレイツク・ア
シッド・リサーチ、第８巻、第４９〜６２頁（１９８０
）〕、観察される全ての変（ヒは、関与する少数に起因
する。 勿論、ＩＩ ｉ ｆ −２ｈ断片につき第８〜１０図に
示されたポリペプチドのｔＲ造は、生体内酵素との相互
作用、たとえばグリコツレ−ジョン（ｇｌｙｃｏｓｏｌ
ａｔｉｏｎ ）によりもたらされたポリペプチドに対す
る変更を何も考慮に入れていない。 したがって、この構造は生体内で生産されるＩＦＮ−α
とは同一でないが、たとえ同一でないにしろ極めてｇ慎
した生物学的および免疫学的性質を有すると理解せねば
ならない。さらに、この構造は、たとえば単一もしくは
多重のペース置換、欠失、挿入もしくは転位を含む突然
変異またはこの構造の化学的誘導化のような他の変化が
ＩＦＮ−α活性をも示す化合物を生成させうろことを示
唆する。 ３、挿入ＩＦＮ−αｃＤＮＡのプラスストランドの決定 ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖をプラスストラン
ドと名付け、その相補体をマイナスストランドと名付け
る。ＩＦＮ−αｃＤＮＡ挿入物のプラスストランドは第
５図に示すように同定された。Ｈｉｔ−２ｈＤＮＡを制
限酵素ＢｇｌＩＩによって開裂させ、末端をｐ３２−燐
酸によって標識しくｐｓｔＴ−開裂末端について記載し
たように）そしてＤＮＡをＰｓｔＩにより切断して、よ
り長い（５４５ｂ、ｐ、 （上記した精度のより大きい
分析法により測定して５７〔ｂ、ｐ、） ）放射性断片
と、より短い（３４０ｂ、ｐ。 （上記した精度のより大きい分析により測定して３３６
ｂ、ｐ、） ）ものとを生成させた。これら断片を変
性させそして誘発白血球からのポリ（Ａ’） Ｆに対し
８０％ホルムアミド、０．４Ｍ ＮａＣ１中において
、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ再結合が生じないような条件
（上記）の下でヒブリド化させた。核酸をヌクレアーゼ
Ｓ１で切断し、これは全ての単一鎖核酸、特に非ヒブリ
ド化Ｐ３２−ＤＮＡを減成し、そして生成物をポリアク
リルアミドゲルで分離した〔アール・エフ・ライ−バー
およびシー・ワイスマン、「バーク−シャープ法の変法
によるＲＮＡの地図化」、ヌクレ・インク・アシッド・
リサーチ、第７巻、第１１１７５〜１１９３頁（１９７
９）〕、放射能写真は、短い方のヌクレオチド断片のみ
がヒブリド化されかつポリ＜Ａ’） ＲＮ Ａにより保
護されていることを示し、この５″−１％短ヌクレオチ
ド鎖をマイナスストランドと同定した。プラスストラン
ドの方向性は、したがって、第４図および第５図（右手
側）に示される通りである。 ・ＮＡ例 前節に記載したと同じ実験を行なったが、ポリ（Ａ＞
ＲＮ Ａは、センダイウィルス誘発白血球の場合と同じ
手順により調製した非誘発ひと白血球からのものとした
。検出しろる量の標ｆｉＤＮＡは保護されなか９た。前
節の結果と比較して、非誘発細胞からのポリ（Ａ） Ｒ
Ｎ Ａは、誘発細胞からのポリ（Ａ”） ＲＮ Ａにお
けるよりも約１／２０以下の量の、Ｈｉ ｆ −２ｈに
ダブリド化しうるｍＲＮＡを含有する。 Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／Ｉｎｃ ＩＦ −
ｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位は、β−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）遺伝子内に存在する。 したがって、コードＤＮＡ断片（たとえば、遺伝子の全
部または一″部からなるｃＤＮＡ）を適正方向および適
正解読枠における位置に結合すれば、融合蛋白質が得ら
れる。この蛋白質は、β−ラクタマーゼのアミノ末端部
分がらなり、それに続いて挿入ＤＮＡ配列がコードする
アミノ酸配列が存在する（エル・ビラーカマロフ等、上
記）、挿入ＤＮＡ断片がそれ自身の開始信号を含むＤＮ
Ａ配列からなりかっβ−ラクタマーゼ配列と一致する停
止信号を備えた配列を有すれば、停止および再開始が第
二開始信号において起こり、非融合活性蛋白質が生ずる
であろう（ニー・シー・ワイ・チャング等、上記〕、）
（ｉｆ−４ｃに関連したＤＮＡ挿入物が適正解読枠中に
挿入されてβ−ラクタマーゼ遺伝子内で発現するのを確
保するため、−組のｐＢＲ３２２の誘導体、すなわちｐ
ＫＴ２７９、ｐＫＴ２８０およびｐＫＴ２８７（ケー・
タルマッシ等、［信号配列コード化領域における独特な
ＰｓｔＩクローン化部位を有するプラスミドベクターの
作成」、ジーン誌、第１２巻、第２３５〜２４１頁（１
９８０）に記載された手法により作成〕を使用した。こ
れら誘導体の各々はｐｓ ｔ Ｔ部位を有し、その位置
はその部位に結合されたＤＮＡ挿入物が他の誘導体のＰ
ｓｔ１部位における挿入物からの異なる解読枠中に存在
するような位置である。すなわち、第６図から判るよう
に、ｐＫＴ２７９はプラスミドのプレペニシリナーゼ遺
伝子のヌクレオチド７４に位置するＰｓｔ１部位を有し
、ｐＫ７２８０はヌクレオチド７５に、またｐＫ７２８
７はヌクレオチド８２にそれぞれＰｓｔＩ部位を有する
。 各プラスミドの残余の配列はｐＢＲ３２２における周知
配列である。したがって、この組みは、全ての３つの解
読枠におけるβ−ラクタマーゼ遺伝子中へのＤＮＡの挿
入を可能にする。Ｈｉｆ−２ｈからのＰｓｔｌ切断挿入
物を、Ｈｉｔ−４ｃ断片について記載したように調製し
た。Ｈｌｆ−２ｈＰｓ ｔ Ｉ断片（１０ｎｇ）を、２
０，１７１の１０ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）
、６ ｍＭＭｇＣＩ２．１００ｍＭ ＮａＣ１，６ｍ
Ｍβ−メルカプトエタノ・−ル、２００μｓ／ｍｌゼラ
チンおよびＱ、１ｍＭ ＡＴＰの中でＰｓｔ■開裂ｐ
ＢＲ３２２、ｐＫＴ２７９、ｐＫＴ２８０またはｐＫＴ
２８７（それぞれ１０ｎｇ）と混合し、０．１単位のＴ
、ＤＮＡリガーゼにニーイングランド・ビオラブ社）と
共に１０℃にて１６時間培養した。得られた組替えＤＮ
Ａ分子をＺ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−
２ｈＳＺ−ｐＫＴ２７９ （Ｐ ｓ ｔ） ／Ｈｃ Ｉ
Ｆ−−２ｈＳＺ−ｐＫ７２８０ （Ｐｓｔ）／ＨｃＩ
Ｆ−２ｈおよびＺ−ｐＫＴ２８７ （Ｐｓ ｔ）／Ｈｃ
ＩＦ−２ｈと名付ける。イー・コリＴ（Ｂ１０１をこれ
ら組替えＤＮＡ分子のそれぞれにより形質転換させ、そ
して形質転換したコロニーを前記したようにテトラサイ
クリン含有寒天板の上で選択した。形質転換細菌のテト
ラサイクリン耐性クローンは循環ベクターを含有するの
で、各組の細菌コロニーをミリポアフィルタ−上で生育
させ、そしてｐ３２−標識Ｈｉｆ−４ｃ断片にダブリド
化するコロニーを上記のように同定しかつ選択した。こ
れらの菌株は次のように名付けられた： イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔ）／Ｈｃ Ｉ Ｆ−２ｈ−ＡＨＩ）乃至（−ＡＨ３）
； イー・コリ）ＩＢ １０１ （Ｚ−ｐＫＴ２７９（Ｐ
ｓｔ）／ＨｃＩＦ−２ｈ−ＡＨｌｌ乃至（−ＡＨ８）’
ｉ イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＫ７２８０（Ｐ、ｓ
ｔ） ／Ｈｃ Ｉ Ｆ−２ｈ−ＡＨＩ）乃至（−ＡＨ
８）； イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＫ７２８７（Ｐｓ
ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−２ｈ−ＡＨＩ）乃至（−ＡＨ８） 上記菌株の規程かならびに菌株Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−ＳＮＩ〜９５（７）規程かの抽出
物を、ＩＦＮ−α活性につき試験した。細菌をトリプト
ン培地において固定相で増殖させ、回収し、１／２Ｏｆ
！量（培養物の容量に対し）の５０ｍＭトリス−ＨＣＩ
（ｐＨ８）、３０ｍＭ ＮａＣ１で洗浄しそして凍結
させた。 解凍後、♀■胞を下記容量の前記緩衝液に再懸濁させそ
してリゾチームを１■／ｍｌまで加えた。 ０℃にて６０分間の後、懸濁物を凍結させ（エタノール
−ドライアイス浴）、５回解凍させ（３７℃にて）、ツ
ルバールＧ Ｓ Ａ 型ロータで１２００ Ｏｒｐｍに
て１０分間遠心分離した。成る場合には上澄液（Ｓ ３
０）の一部をさらにスピンコロ５型ロータで１００．０
００ ｘ ｇにて遠心分離し、上澄液（３１００）を回
収した。このような上澄液を、細胞病理学的効果減少分
析によりＩＦＮ−α活性について選別した（実験１〕、
実験ｌにおいて陽性反応を示すコロニーならびに上記の
組Ｚ−ｐＢＲ３２２／Ｈｃ Ｉ Ｆ−ＳＮ１〜５Ｎ９５
からのクローンを、より低希釈にて再分析した（実験２
〕、 抽出物源： イー・コリＨＢ１０１（下記により形質転換）Ｚ−ｐＢ
Ｒ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ ３０ ？
／ １（ｃｌＦ−２ｈ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
？／ ＨｃｌＦ−２ｈ−ＡＨ−１ｔｏ ３Ｚ−ｐ
ＫＴ２７９ （Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
？／ＨｃＩＦ−２ｈ−ＡＩ−１ｔｏ ７ Ｚ−ｐＫＴ２７９ （Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
陽性／ ＨｃｌＦ−２ｈ−ＡＨ−８ Ｚ−ｐＫＴ２８０ （Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
？／ ＨｃＩＦ−２ｈ−ＡＩ−２，６，７Ｚ−
ｐＫ７２８０ （Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
陽性／ ＨｃｌＦ−２ｈ−ＡＨ−１，３，４，５Ｚ−ｐ
Ｈ↑２８７（Ｐｓｔ） Ｓ３０ ？／
１ｌｃｌＦ−２ｈ−八Ｉ＋−１，２，３，４，５，８
Ｚ−ｐＫＴ２８７ （Ｐｓｔ ） Ｓ ３０
陽性／ＨｃＩＦ−２ｈ−＾トロ、７抽 出物源： イー・コリＨＢ１０１（下記により形質転換）実験２＊
＊ 調製物 ＩＦＮ−α活性（ＩＵ／ｍ１） Ｚ−ｐＫＴ２７９／ ＨｃＩＦ Ｓ３０および
３００−２ｈ−Ａｌｌ−８８１００ Ｚ−ｐＫＴ２８０／ ＨｃｌＦ Ｓ３０および
３００−２ｈ−ＡＩ−１，３，４，５５ＩＯＱＺ−ｐ
ＫＴ２８７／ ＨｃｌＦ Ｓ３０および ３ｏ
。 −２ｈ−ＡＨ−６および７ ５１００Ｚ−ｐＢＲ３２
２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０ 陰性／ ｌ
１ｃｌＦ−ＳＮ−４’、 ５．７．
（＜ １０）９．１０．１１．１３乃至１６ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０
陰性／ １ｃＩＦ−ＳＮ−１８乃至
（＜１０）２２．２４，２５．２７．３０ 乃至３４ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０
陰性／ ＨｃｌＦ−ＳＮ−３８乃至
（＜１０）４１．４３．乃至４８ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０
１０／ ＨｃｌＦ−ＳＮ−１乃至 ３．６，８．１２．１７．２３．２６ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０
１０／ ｔｌｃｌＦ−ＳＮ−２８，２９゜ ３６．３７．４９ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０
２００／ ＨｃｌＦ−ＳＮ−３５，４２ ＊ 実験１： １：１５０の最終希釈にて抽出物を分
析 ＊＊実験２： １：６の最終希釈にて抽出物を分析 上記からの、より活性の大きいものの幾つかをさらに詳
細に検査した。培養物を対数相の後期まで増殖させ（見
掛けｏＤ６５０は約０．９）＊、細胞を１１５０の培養
物容量にて上記のように溶菌させた。若干活性を有する
が陰性比較（Ｓ３０；５１００：０；Ｏ）としてＺ−ｐ
ＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／Ｈｃ ＴＦ−ＳＮ３２を用い
れば、次の結果が得られる： 。 抽出物源 イー・コリＨＢ１０１ 調製物 ＩＦＮ−α活性
＊＊（下記により形質 （ＩＯ／ｍ１）
Ｚ−ｐＫＴ２７９ （Ｐｓｔ ） Ｓ３０，５１００
１００； ３００／ ＨｃＩＦ−２ｈ−Ａｌ８ Ｚ−ｐＫ７２８０ （Ｐｓｔ ） Ｓ３０．５１００
１０００； １０００／ ＩＩｃＩＦ−２ｈ−Ａｔ
（３ Ｚ−ｐＫ７２８７（Ｐｓｔ） Ｓ３０，５１００
２００；２００／ ＨｃｌＦ−２ｈ−Ａｌ１６ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） ５３０，５１００
１０００； １０００／ ＨｄＦ−ＳＮ３５ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０．５１００
３００； １００／ ＨｃｌＦ−ＳＮ４２ Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ ） Ｓ３０，５１００
Ｏ； ０（比較として活性し ／ １ＩｃＴＦ−ＳＮ３２ ベルを０
とする）＊ ３００１！もしくはそれ以上のＩＦＮ
−αの培養物を、何らＩＦＮ−α活性 の損失なしに生育させることができる。 ＊＊ 上記発現は、ペニシリナーゼ発現制御配列の管理
下における遺伝子によるイ ンターフェロン生産を反映すると理解 することができる。 これら菌株により生産された実際の蛋白質は、ＴＦＨに
無関係にアミノ酸に融合してまたはＩＦＮの信号配列の
全部もしくは一部を含んで生産されたかどうか決定する
よう構造的に分析しなかったことを了解すべきである。 しかしながら、少な（とも蛋白質が生成されれば、これ
はＩＦＨの免疫学的もしくは生物学的活性を示す。した
がって、この発現した蛋白質は有用である。この蛋白質
をコードするＤＮＡ配列が１（ｕ Ｉ Ｆ Ｎ−αに関
連するＤＮＡ配列であることを蛋白質の活性が示すこと
は特に重要である。 かくして、例示したようなりＮＡ配列を使用して他の同
様なＨｕ Ｉ Ｆ Ｎ−α関連ＤＮＡ配列を選択するこ
と、および成熟インターフェロンもしくはその変種を発
現し或いは特定の発現蛋白質の収量を向上させるような
他の構成に対し基礎を与えることは当業者の範囲内にあ
る。 蛋白質の生産レベルは２つの要因により支配される：す
なわち、細胞内の遺伝子のコピー数とそれら遺伝子コピ
ーが転写されかつ翻訳される効率とである。転写および
翻訳（これらは共同して発現となる）の効率は次いでヌ
クレオチド配列に依存し、これは通常所望のコード配列
の前方に位置する。これらのヌクレオチド配列すなわぢ
発現制御配列は、特にＲＮＡポリメラーゼが相互作用し
て転写を開始させる（プロモータ配列）と共にリポソー
ムがｍＲＮＡ （転写の生成物）と結合し、かつ相互作
用して翻訳を開始させる位置を規定する。必ずしもこの
種の全ての発現制御配列が同等の効率をもって作用する
とは躍らない。したがって、所望蛋白質に対する特異的
コード配列をその隣接するヌクレオチド配列から分離し
、これらを寧ろ他の公知の発現制御配列に融合させてよ
り高レベルの発現に好適とするのが有利である。これも
達成されるが、新たに処理されたＤＮＡ断片を多重コピ
ープラスミドまたはバクテリオファージ誘導体に挿入し
て細胞内の遺伝子コピーの数を増加させ、それによりさ
らに発現蛋白質の収量を向上させることもできる。 幾つかの発現制御配列を上記のように使用することがで
きる。これらには、イー・コリのラクトースオペロンの
オペレータ、プロモータおよびリポソーム結合かつ相互
作用配列（たとえばシャインーダルガルノ配列のような
配列を含ム）（“ｌａｃ系”）、イー・コリのトリプト
ファン合成酵素系の対応配列（“ｔｒｐ系”）、ファー
ジλの主要なオペレータおよびプロモーフ域（ＯｌＰＬ
および０ＲＰＲ１）、ファージｆｄコート蛋白の制御
域、或いは原子核（原核）もしくは成熟核（真核）細胞
およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御するその他の
配列が包含される。したがって、適当な宿主において特
定ポリペプチドの生産を向上させるには、そのポリペプ
チドをコードする遺伝子を前記のように′Ａ製し、これ
を含有する組替えＤＮＡ分子から取出して、前記発現制
御配列に一層近接して或いは上記発現制御配列の一つを
管理しながら組替えＤＮＡ分子中に再挿入する。この種
の方法は当分野で公知である。 所望生成物の細胞収量の増加は、細胞中で使用しうる遺
伝子数の増加に依存する。これは、たとえば組替えＤＮ
Ａ分子を前記したように中庸のバクテリオファージλ（
ＮＭ９８９） 中に挿入することにより、特に簡単には
制限酵素でプラスミドを切断することにより達成され、
それにより線状分子を生成させて、これを次いで制限フ
ァージスクローン化ベヒクル〔たとえばエフ・イー・ム
レイ等、「試験管内組替え遺伝子の回収を簡単にするλ
ファージ」、モレキュラー・ジーン・ゲネチックス、第
１５０巻、第５３〜６１頁（１９７７）およびエフ・イ
ー・ムレイ等、「バクテリオファージＴ４からのＤＮＡ
リガーゼ遺伝子の分子クローン化」、ジャーナル・モレ
キュラー・バイオロジー、第１３２巻、第４９３〜５０
５頁（１９７９）に記載されている種類〕と混合し、そ
してＤＮＡリガーゼと共に培養して組替えＤＮＡ分子を
生成させる。次いで、所望の組替えファージを前記のよ
うに選択しかつ使用して宿主菌株の大腸菌を溶菌させる
。 特に有用なλクローン化ベヒクルは、抑圧遺伝子三」に
おける感温性突然変異と遺伝子王における抑圧性突然変
異とを含み、その生成物は宿主細胞の溶菌に必要であり
かつ遺伝子Ｅ、すなわちその生成物はウィルスの主要な
カプシド蛋白質である。この系を用いて、溶菌細胞を３
２℃で生育させ、次いで４５℃まで加熱してプロファー
ジの切断を誘導させる。３７℃における長期生育は高レ
ベルの蛋白質生産をもたらし、これらは細胞内に保持さ
れる。何故なら、これらは通常の方法でファージ遺伝子
生成物によって溶菌されずかつファージ遺伝子挿入物は
カプセル化されていないで転写用に利用され続けるから
である。次いで、細胞の人工的溶菌は所望生成物を高収
量で遊離する。 上記した過程によりＺ ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｈ
ｃＩＦ−ＳＮ３５で形質転換させた宿主から生産されて
ひと白血球インターフェロンの生物学的もしくは免疫学
的活性を示すようなポリペプチドの収量を増加させる初
期の試みにおいて、ヒゲリド中のＤＮＡ挿入物の制限地
図を決定した。この地図は、Ｈｉｆ−２ｈと比較して、
Ｈｉｆ−ＳＮ３５が配列の３′末端を示すＰｓｔ１部位
を欠失しており、信号配列の一部が欠失しており（コド
ン７まで）かつ信号配列におけるＡｖａｆ１部位がＢｓ
ｐｒ部位により交換されていることを示した。したがっ
て、Ｈｉ ｆ−ＳＮ３５はＨｉｆ−２ｈの多形的もしく
は対立的変種であると思われる。 プラスミドｌ４ｉｆ−ＳＮ３５をＰｓｔｌにより開裂さ
せ、得られたＤＮＡ鎖を標準法により両端部で復帰（ｃ
ｈｅｓｎ ｂａｃｋ ）させ、そしてそこにＬＡＣ−Ａ
ｌｕ断片（下記）を挿入してプラスミドを再び閉環させ
た。Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ３５
−ＡＨＬ６と同定された変型プラスミドの実際の構造お
よび大腸菌中に生産された蛋白質のアミノ末端における
アミノ酸配列を決定した。この構造のヌクレオチド配列
は、ＬＡＣ−Ａｌｕ断片がＩＦＮ−α１ （ＳＮ３５
）の第一アミノ酸から離れた１（１ｍのアミノ酸を結合
したことを示している。 大腸菌で発現された蛋白質のアミノ末端部のアミノ酸配
列は、ＩＦＮ−α１ （ＳＮ３５）配列に融合した６
個のアミノ酸を有する融合蛋白質が生産されたことを示
している。しかしながら、変型プラスミドにより形質転
換された宿主は、未改変Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／
ＨｃＩＦ−ＳＮ３５により形質転換された宿主と比較し
て、ひと白血球インターフェロンの生物学的もしくは免
疫学的活性を示す約１００倍多いポリペプチドを生産す
る。 第２５図を参照すれば、Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）
／Ｈｃ Ｉ Ｆ−ＳＮ３５ （第２５図における５Ｎ
３５）で形質転換させた宿主により生産されて、ひと白
血球・インターフェロンの免疫学的もしくは生物学的活
性を示すようなポリペプチドの収量を向上させる他の試
みが図示されている。Ｂｓｐｌ （キツス博士より寄
！！１）により標準法を用いてダブリドプラスミドを開
裂させた。なお、このＢｓｐｌは当業界で既知の容易に
入手しうる制限酵素であって、たとえばＡ、キツス等「
バチルス・スファエリクスからの新配列−特異性エンド
ヌクレアーゼ（Ｂｓｐ）Ｊジーン誌、第１巻、第３２３
〜３２９頁（１９７７）の論文に詳述されている。この
ＢｓｐＴは、第８図に示すように、ＤＮＡを配列ＧＧＣ
Ｃにて切断する。制限酵素を熱失活（６５℃、３０分）
させた後、混合物を５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８）
に調製して加熱した（３７℃、３０分〕、フェノールと
エタノールとで抽出した後、最大のα１ｃＤＮＡ断片を
低温ゲル化アガロース（０，８％）上で単離しそしてＨ
ｉ ｎ ｄ ＩＩＩリンカ−を結合させた。次いで、こ
の変型断片をＨｉｎｄＩ［［−開裂プラスミドｌｌ５−
ｐ１３Ｒ３２２（Ｅｃｏ）／１２ａｃＵＶ５−１５０
（“Ｌａｃ−１５０”）＊ （エッチ・シャーシー
により寄贈）に結合させたが、これは断片含有ゲル片（
それぞれ約２０μｍ）を６５℃にて溶融させ、３７℃ま
で冷却しかつ１μｌ当り２０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを
加えて行なった
【 ＊このプラスミドはｌａｃプロモー
タＨａ ｅｍ−２０２ｂ、ｐ、断片を含有し〔ダプリュ
ートギルバート等、ｒＬａｃ抑圧剤のラクトースオペレ
ータ配列および作用」、蛋白質リガンド相互作用、エッ
チ・スンドおよびジー・ブラウアー編（ベルリン、ワル
ター・デ・グルイタ−）、第１９３〜２０６頁およびケ
ー・バックマン等、「試験管内において組替え処理を使
用するプラスミドに対する遺伝子発現の最大化」、セル
誌、第１３巻、第６５〜７１頁（１９７８））、その３
′末端にてＥＣＯＲＩリンカにより示される 】。１５
℃にて１６時間の後、固化ゲルにおいて結合が生じた〔
エッチ・レーラソハ、私的通信、１９８０〕、 １／１０容量の１００ｍＭ）リス−）ＩＣＩ（ｐｌ＋７
．５）、１００ｍＭ ＣａＣｌ２．１００ｍＭＭｇＣ
ｌ、を試料に加え、これを６５℃にて５分間加熱し、３
７℃まで冷却した。次いで、この試料を使用してＣａ″
″“処理イー・コリＨＢ１０１を形質転換させ、０℃に
て２０分間培養し、４２℃にて１分間および２０℃にて
１０分間加熱した。１モルのトリプトン培地を加えた後
、試料を３７℃にて６０分間培養しそしてアンピシリン
を含有する寒天板上に接種した。プラスミドＤＮＡをこ
れら培養物から前記のように分離しそしてＬＡＣ断片に
隣接する５′末端を持ったＩＦＮ−α１挿入物を含有す
るダブリドプラスミドを制限分析により同定した。次い
で、プラスミドを常法によりＥｃｏＲＩで開裂させかつ
エンドヌクレアーゼＢＡＬ−３１で切断させ（０，０６
０／ｍｌ、３０℃で２〜４分間）、ＬＡＣ断片の結合Ｅ
ｃｏＲＴ末端を除去しかつβ−ガラクトシダーゼコード
部分を短縮させた。 処理プラスミドが完全なＩＦＮ−α１コ一ド配列を含有
するのを確実にするため、次いでプラスミドを常法によ
りＢｇｌＩＩで開裂させ、上記のように後処理しそして
最大断片をアガロースゲル（０，８％）上で分離した。 次いで、この断片をＺ ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｈ
ｃＩＦ−ＳＮ３５からのＢｓｐｌ−ＢｇｌＩＩ断片と合
し、得られたヒブリドプラス、ミドを使用して上記のよ
うにイー・コリＨＢ１０１を形質転換させた。この形質
転換したコロニーをＩＦＮ活性につき選別し、高レベル
のＩＦＮ活性を有する１つのクローンを選択した。この
クローンをイー・コリＨＢ１０１ （Ｃ８−ＩＦＮ−α
１）およびそのダブリドプラスミドＣ３−ＩＦＮ−α１
と名付けた。 Ｃ３−ＩＦＮ−α１のＤＮＡ配列分析は、開始トリプレ
ットの後のコード配列がβ−ガラクトシダーゼの最初の
７ （ＩＩのアミノ酸と、融合により生成したＰｒｏ残
基と、ＩＦＮ−α１信号配列およびＩＦＮ−α１ （
ＳＮ３５）配列のアミノ酸１６〜２３とを決定したこと
を示している。ダブリドプラスミドＣ３−ＩＦＮ−α１
で形質転換させたイー・コリミニセル菌ｔ−（ＤＳ４１
０）は、未改変Ｚ ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｈｉｆ
−ＳＮ３５で形質転換させたミニセルと比較し、）ｌｕ
Ｉ ＦＨの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリ
ペプチドを１ｉ当り約５００万単位すなわち約２５００
倍多く生産する。プラスミドＣＢ−ＩＦＮ−α１により
生産されたポリペプチドのアミノ酸配列は、生産物がβ
−ガラクトシダーゼからの７個のアミノ酸と融合により
生じた１１１Ｉのアミノ酸とＩＦＮ−αｌに融合された
ＩＦＮ−α１信号配列のアミノ酸１６〜２３とを有する
融合蛋白質であることを確認させた。 さらに、本発明により蛋白質収量を向上させる種々の構
成の例を、他の型のＩＦＮ−αに関連して検討した（下
記〕、 ダブリドプラスミドで形質転換させた大腸の性質 １、トリプシンに対するＩＦＮ−α活性の感受性 標準１（ｕｒＦＮ−α（比活性、１，２ｘｌＯ’Ｕ／■
、５０Ｕ）ならびにイー・コリＨＢ１０１（Ｚ−ｐＫ７
２８７ （Ｐｓｔ）／ＨｃＴＦ−２０ｈ−ＡＨ６）の
５１００抽出９Ｊ （“Ｈｉｒ−２８７−６抽出物”）
（２００Ｕ／ｍｌ、ｌ０Ｕ）およびイー・コリＨＢ１０
１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ） ／Ｈｃ Ｉ
Ｆ−ＳＮ３５）の８１００抽出物（“）（ｉｆ−３５抽
出物”）（１０００Ｕ／ｍｌ、５０Ｕ）の試料５０μｌ
を、下記のように種々な量のトリプシンと共に、３７℃
にて３０分間培養した。５１００抽出物は高蛋白質含量
を有する一方、Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αはそうでないので、
ＨｕｌＦＮ−αと比較５１００抽出物Ｈｉｆ−３２との
混合物を並行的に試験した。 ｒＦＮ−α トリプシン ＩＦＮ−α１１ｕＩＦＮ
−α （５０，ｃｒｆ ０ ５０
の１ｌｉｆ−３２５１００抽 ０．１ ５０
出物中５０単位） １ ５０１１ｉｆ
−２８７−６５１００抽 ０ １５出物
（１０単位） ０．１ １５５０
Ｇ したがって、抽出物のＩＦＮ−αは、トリプシンおよび
したがって蛋白質に対し感受性である。 ｌ１ｉｆ−３５５１００抽出′ ０ ３０
物（５０単位’） ０．１ ２０２、
セファデックスｃ−ｔｏｏ上のクロマト抽出物Ｈｉ ｆ
−３５（１ｍｌ）およびイー・コリＨＢ１０１ （Ｚ
ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ Ｈｃ Ｔ Ｆ −３反
３２）の８１００抽出物（″Ｈｉｆ−３２抽出物”）を
３２ｍ１のセファデックスＧ−１００カラム上で、５０
ｍ Ｍ ｍ酸カリウム緩市液（ｐＨ７，４）にて４℃
でクロマトグラフにかけた。チトクロームｃ （０，２
■）を内部標識として加えた。流速を２ｍｌ／ｈｒとし
、１、Ｏｎｉｌづつのフラクションを集めた。２８０Ｉ
ｍおよび４０５Ｉｍ（チトクロームＣ）における吸光度
とＩＦＮ−α活性とを測定した。第７図に示すように、
Ｈｉｆ−３５抽出物のＩＦＮ〜α活性は、チトクローム
Ｃの前に、約０．４５のＫＤ値をもって溶出された。し
たがって、この物質の見掛は分子量は約２０，０００〜
３０．０００ （ヌクレオチド配列決定により、カルボ
キシ末端処理なしと仮定して測定した分子量は１９．３
８８）であり、比較抽出物）（ｉｆ−３２のフラクショ
ンには活性が検出されなかった。 遭− ＨｕｌＦＮ−ｏｒＣ比活性１．２Ｘ１０６１Ｕ／■）と
Ｈｉｆ−３５／Ｈｉｆ−２８７６の８１００抽出物とを
、１０％子牛血清を含む１００Ｉ！、ｉ？の改変イーグ
ル培地（Ｍ Ｅ Ｍ）中において、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−
α〔ケー・カンチル、１９７６年２月２４日に調製、比
活性４５０．０００弔位／ｍｌ）に対する羊抗血清の種
々な希釈により３７℃で３０分間培養し、４５μｌを細
胞病理学的効果減少分析によりＩＦＮ−α活性につき分
析した〔抗体自身は細胞病理学的効果を起こさなかった
〕。 ＩＦＮ−α調製 抗−白血球イン 双音ＩＦＮｒＦＮ−
α（１０） ０ ５０．１８
〜０．５ ９ ＜０．１ ４５０ ＜０．１ ７（ｉｆ −３５抽出 ０１５物 （２５
） ０．１８ １５９
＜０．１ ４５０ ＜ ０．１ Ｈｉｆ −２８７−６０１５ 抽出物（２５） ０．１８ １５９
＜０．１ ４５０ ＜０．１ なし Ｏ＜ ０．１ ４５０ ＜０．１ 抗体の作用が、たとえば蛋白質分解のような非特異的作
用に基づくものでないことを示すため、ねずみインター
フェロン系を用いて同様な実験を行なった。 ＩＦＮａ製 抗−白血球イン ＩＦＮ活性ねずみ調
製物 ４５００ １００（１００単位
） ９０ １００かくして、特にＨ
ｕＩＦＮ−αに向けられた抗体は、ＨｃＩＦ−２ｈ
ＤＮＡ配列を含有する成る種の組替えＤＮＡ分子により
形質転換させた大腸菌で生産されるポリペプチドのＩＦ
Ｎ−α活性を阻害する。大腸菌で生産されたＩＦＮ−α
に対する抗体の明らかな低親和性は、これと天然Ｈｕ
Ｉ ＦＮ−αとの間の構造上の相違を反映し、たとえば
内水化物成分の不存在、信号配列の存在またはβ−ラク
タマーゼ配列の一部に対する融合を反映する。 ひとｃｃＬ２３ｆｌｌ胞またはねずみＬ９２９に■胞を
イー・コリ抽出物、ＨｕｌＦＮ−α〔ケー・カンチルの
方法により調製、比活性１．２ｘ１ｏｓ’ｌｉ位／ｍｇ
Ｅ マタハネｆミＩ Ｆ （Ｎ、 Ｉ 、 ＩＩ、
ｉｌＪ準）で処理し、これにつ・イルスを接種しくひと
細胞の場合はメンゴウィルスを用い、ねずみ細胞の場合
はＶＳＶを用いた）、そしてＩ ＦＮ＝α活性を細胞病
理学的効果減少分析によって測定した。 。 ねずみ−インターフェ １２０ロン（１
２０１！を位／慴１） ）１ ｉ ｆ −３５抽出物 １００ １３
１（ｉ ｆ −２８７−６抽出物 ３０４Ｈｕ
夏 ＦＮ −ｏｒ １００
４（１００単位／ｍ１） １１ｕｌＦＮ−ｔ！ １０００ ４０
（１０００単位／ＩＷｌ） これらの結果は、１（ｉｆ ３５およびＨｉｆ−２８
７−６抽出物がひと細胞に対し保護作用を有しかつねず
み細胞に対し圃く僅かの効果（〜１０％）しか持たない
ことを示しており、これはひとインターフェロンに対し
典型的なことである。 ５、幾つかの細胞機能に対する効果 イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ
）／Ｈｉｆ ５Ｎ３５ ＡＨＬ６）からの抽出物を
、幾つかの細胞機能に対する効果につき、標準ＩＦＮと
比較した。イー・コリ製のＩＦＮ−αは、天然ＩＦＮ−
αの次の性質を示した：（１）ひとリンパ球の自然致死
活性を高め、（２）抗体依存性の細胞媒介される細胞毒
性を高め、（３）抗原−およびミトゲン−誘発される白
血球移動阻害を抑制し、１かつ！４） Ｉ Ｆ Ｎ−感
受性バーキソト（Ｂｕｒｋｉ Ｌｔ ）リンパ腫細胞の
成長を抑制する。これら性質は、ひと腫瘍および癌に対
する大腸菌合成されたＩＦＮ−α１活性を示唆する。 アミン末＆ｊＪ配列のないＩＦＮ−αもまた大腸菌で作
られ、ＩＦＮ活性と一致する活性を有することが示され
た。 適当な組替えＤＮＡ分子を作成するため、プラスミドＨ
ｉｆ−２ｈ（上記）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによ
り部分的に切断し、そしてＩＦＮ−α１コ一ド配列を含
有する断片をアガロースゲルで分離し、Ｈｉｆ−２ｈ（
上記）と比較してダブリド挿入物の３′末端に隣接した
ＰｓｔＩ部位を欠失するプラスミドＨｉ ｆ−ＳＮ３５
のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限から得られた非−ＩＦＮ
−α１コ一ド配列と混合した。次いで、得られたプラス
ミドをＰｓｔＩ／Ｂｇ１■により処理してＩＦＮ−α１
コ一ド配列のアミノ末端部分を除去した。その個所に、
ｐｖｕ■によるプラスミドＨｉｆ−２ｈの切断と、Ｂａ
ｌエンドヌクレアーゼによる処理と、Ｐｓｔ■リンカ−
の結合と、Ｂｇｌｎによる制限とにより調製された一連
のＩＦＮ−α１断片を挿入した。このようにして得られ
たプラスミドは、そのアミノ末端配列の種々な部分を欠
失した一連のＩＦＮ−α１コ一ド配列を含有していた。 これらの１種（プラスミド２Ｈ−Ｍ８）を旦ユ」■で切
断して、そのヌクレオチド配列を決定した。この配列は
、プラスミド２ Ｈ−Ｍ ８がＰｓｔ部位とＩＦＮ−α
１の第一コトン（ＣＹＳ）との間に数四のヌクレオチド
を有することを示し、た。したがって、ＰｓｔＩ切断さ
れたプラスミド２Ｈ−Ｍ８をＴ４ポリヌクレアーゼ／ｄ
ＡＴＰ。 Ｓ１エキソヌクレアーゼで処理しそして５ａｌＩにより
切断させた。この過程は一連の断片を形成し、そのＩＦ
Ｎ−α１コ一ド配列はアミノ末端部分を欠失していた。 次いで、これらの断片を、Ｅｃ ｏＲＩによる切断とエ
キソヌクレアーゼＳ１による処理と５ａｌＩによる切断
とで ゛プラスミドＬａｃ３Ｖ８から調製したＧＵＡ−
ＬＡＣ断片に作用結合させることにより、ＬＡＣ制御下
に置いた。かく得られた一連のプラスミドは、ＬＡＣプ
ロモータを含有する断片にＡＵＧを介して反時計方向に
結合したアミノ末端の種々な部分を欠失するＩＦＮ−α
１コ一ド配列を有した。 これらプラスミドの幾つかを配列決定した。 一つはＩＦＮ−αｌの第５番目のアミノ酸から開始し、
一つはＩＦＮ−α１の第１０番目のアミノ酸から開始し
た。イー・コリ・ミニセル（ＤＳ４１０）において、こ
れらプラスミドの両者はＩＦＮ活性を示すポリペプチド
を生産した。したがって、必ずしも全てのＩＦＮ−α１
蛋白質がＩＦＮ活性のため必要とされるとは限らない。 配列は次のように作成した： （１） Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ ｓ ｔ） ／Ｈｅ
Ｉ Ｆ−２ｈ（プラスミド Ｈｉｔ−２ｈ）をＥｃｏＲ
ＩおよびＢ ａ ｍ ＨＩで部分制限した。これにより
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位からＤＮＡ断片を作成し
く第１図）、これはＩＦＮ−α信号を介して延びかつプ
ラスミドＨｉｆ−２ｈの配列をコードすると共にプラス
ミドＨｉ ｒ −２ｈの■Ｆｉ−α挿入物における３′
非コード化領域に位置するＥＣｏＲＩ部位で終端する（
第４図および第１０図のヌクレオチド６８５−６９０を
参照〕、 （２）次いで、この１ＩＩｒ片をプラスミドＨ’＋ｆ−
ＳＮ３５のＥ ｃ ｏ ＲＩ ／ Ｂ ａ ｍ ＨＩ断
片と結合させた。このＥ ｃ ｏ ＲＩ ／ Ｂ ａ
ｍ ＨＩ断片は最初の断片の逆であって、ＩＦＮ−αの
３′非コード領域におけるＥｃｏＲ１部位から初期のｐ
ＢＲ３２２を介してｐＢＲ３２２の１土！ＨＩ部位まで
延在する。プラスミドＨｉｆ−２ｈからの断片と結合さ
せれば、得られるプラスミド（Ｈｉ ｆ−ＳＮ３５）は
Ｉ ＦＮ−α配列の３′末端におけるＰｓｔ１部位を欠
失し、Ｈｉｆ−２ｈのＩＦＮ−α信号配列に対する完全
なコード配列を有する。 （３）次いで、得られたプラスミドをＰｓｔ Ｉおよ
びＢｇｌＩＩで制限してＩＦＮ−αコード領域における
Ｂｇ１１１部位（第４図および第９図のヌクレオチド３
１３−３１８を参照）からｐＢＲ３２２由来の配列を介
してＬ土」■部位まで延びる断片を作成した。かくして
この配列は、ＩＦＮ−αの５′非コード領域とＩＦＮ−
αの信号配列をコードする領域とＩＦＮ−αの５′コー
ド領域の１部とを欠失する。 （４１１ＦＮ−αのアミノ末端をコードする配列の１部
を欠失したＤＮＡ配列を作成するには、上記（３）で作
成した配列をアミン末端コード領域の１部を欠失するよ
う作成した一連の配列と組合せる必要がある。 これを行うため本発明は巳ヱユ■でＨｉｆ−２ｈを開裂
させ、このエンドヌクレアーゼはプラスミドをＩＦＮ−
αの信号配列をコードする領域の中間で開裂する（第８
図のヌクレオチド９７−１０３を参照〕、次いで、この
配列をＢａｌエキソヌクレアーゼによって処理した。こ
の処理により一連のＤＮＡ配列が生ずると思われ、その
幾つかはＩＦＮ−αコード配列のアミノ末端領域におけ
る種々の部位から開始する。これはＰｖｕｆｆ部位とｒ
ＦＮ−αコード領域の開始部位との間に位置子る信号配
列の２５個以上のヌクレオチドを切断する必要がある（
第８図を参照〕、このＢａｌ切断の結果につき分析する
ため、切断配列の両末端に対しｐｓＬＩリンカを最初に
付着させ、次いでＢｇｔ■で制限した。 この結果、この１見ユ切断の際に除去されなかったＩＦ
Ｎ−α配列の第１ヌクレオチドにＰ Ｓ ｔ Ｔ １３
ンカが接続した小型のＤＮＡ配列が生じ、この配列はＩ
ＦＮ−αコード領域からＢｇｌｎ部位まで存在する。要
するに、これらの断片を上記（３）の配列に結合させる
と、ＩＦＮ−α配列がＢｇｌｎ部位で再構成され、Ｐｓ
ｔｌリンカは前記小型断片の他端部を上記（３）のＤＮ
Ａ配列のＰｓｔｌ制限断片に結合させる。その結果、Ｈ
ｉｆ−２ｈと比較して、Ｐｖｕ１１部位からＩＦＮ−α
のコード領域まで存在するヌクレオチドの幾つかを欠失
する（Ｐ、ａ＋切断のため）プラスミドが作成される。 （５） このように作成されたプラスミドの１種（２
Ｈ−Ｍ８）を分析用に選択した。しかしながら、このプ
ラスミドにおいてはＢａｌ切断が充分に行われておらず
、信号配列の幾つかのヌクレオチドがまだ残存していた
。従って、これをｐｓｔｒで開裂させかつ再び切断して
信号配列に残存する全てのヌクレオチドとＩＦＮ−αの
アミノ末端部分をコードする少な（とも幾つかのヌクレ
オチドとを除去した。この切断には、Ｓ１エキソヌクレ
アーゼを使用した。次いで、得られた切断断片をＬａｃ
３Ｖｇからの発現制御配列の制御下において発現させた
。 の同定 標準リンパ芽球細胞インターフェロン〔ズーン等（上記
）ならびにエム・フンカピラーおよびエル・フード（上
記）〕と）（ｉｆ−２ｈｌ析片から推定された配列との
最初の３５（ＩＭのアミノ酸を比較すると９ ｆ［！ｉ
ｔの相違が示される。全ての場合、相違するアミノ酸に
対するコドンは、ワンベース（ｏｎｅ−ｂａｓｅ）変化
により関連さ廿うるであろう。一方の標準リンパ芽球細
胞インターフェロンについて直接に決定されたアミノ酸
組成と、他方のＨｉｆ−２ｈ断片の配列から推定される
ものとでは、それらの０１７ ％ Ｐ ｒ ｏ 。 ＣｙｓおよびＭｅｔの含有量に関して顕著な相違を示す
、これらの相違は多形現象では説明し得ない程大きい、
寧ろ、それらは、少なくとも２つの非対立遺伝子の存在
を反映していると思われる。何故なら、これら２種の蛋
白質の相違程度（２６％差）は、たとえばひとと羊との
間のβ−グロビンのそれ（２３％差）に近似する。 したがって、前記に同定された（上記）断片ＩＴ ｉ
ｆ −４ｃに対する弱いダブリド化を示したクローンを
検査し、クローン・イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐ
ＢＲ３２２（Ｐ３ ｔ） ／Ｈｃ Ｉ Ｆ−ＩＩ −２
０６）を同定した。 このクローンのダブリドブラスミドＺ−ｐＢＲ３２２（
Ｐｓ ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−ＩＩ−２０６（Ｈｃ ＩＦ−
ＩＩ−２０６’″）およびそのＤＮＡ挿入物（“Ｈｉｆ
−ＩＩ−２０６断片”）は、Ｈｉ ｆ −４ＣおよびＨ
ｉｆ−２ｈ断片に弱くヒブリド化している。プラスミド
Ｈｉｆ−１−２０６で形質転換させた大腸菌（イー・コ
リ）はＨｕｌＦＮ−αの生物学的もしくは免疫学的活性
を示すポリペプチドを生産する。Ｈｉｆ−Ｉ［−２０６
断片は、Ｈｉｆ−２ｈ断片について決定されたものとは
異なる制限地図を有する。 これら２ｒｉの制限地図の比較を第１１図に示す。 ここでも、Ｈｉｆ−ｍ−２０６ＷＴ片における制限部位
の絶対的位置は、制限地図化だけでは決定されない。し
かしながら、上記した標準法を用いる、この挿入物のヌ
クレオチド配列に関する配列決定は、これら位置の−Ｎ
絶対的な決定を可能にする。しかしながら、Ｈｉｆ−２
ｈ断片と比較してＨｉｆ−ＩＩ−２０６断片の制限地図
には差があるので、これら２ ｆ！：の挿入物のインタ
ーフェロン遺伝子は異なるヌクレオチド配列を有するこ
とが明らかである。 第１２〜１６図を参照すれば、培養物ＨｃｌＦ−Ｇの挿
入ＤＮＡ配列（Ｈｉｆ−ＩＩ−２０６断片）と培養物Ｈ
ｃＩＦ−Ｅ（下記）の挿入ＤＮＡ配列（Ｈｉｆ−２ｈ断
片）との上記で決定されたヌクレオチド配列ならびにこ
れらヌクレオチド配列によりコードされた蛋白質の対応
アミノ酸配列が示されている。Ｈｉｆ−ＩＩ−２０６断
片、すなわち文献〔エフ・エム・ウィルキー等、ヌクレ
イツク・アシッド・リサーチ、第７＠、第８５９〜８７
７頁（１９７９））に記載された方法Ｂの手順を使用し
て培養物ＨｃｌＦ−Ｇから単離したプラスミドＤＮＡの
Ｐｓｔｌ断片（７９０ｂｐ）のヌクレオチド配列を、ニ
ー・エム・マキサムおよびダブりニー・ギルバートの標
準法（上記）を用いて決定した。用いた配列決定法を第
１７図に示す。 制限ＤＮＡ （通常約１０μｇ）を、文献〔エフ・マン
ティ等、ジーン誌、第１０巻、第１〜１０頁（１９８０
））により記載されているように５′末端標通した。標
識断片を第二の制限酵素で開裂させ、生成物をトリス−
硼酸−ＥＤＴＡ緩衝液における５％ポリアクリルアミド
ゲルにより電気泳動にかけて分離し〔ニー・シー・ピー
コックおよびシー・ダブりニー・ジングマン、バイオケ
ミストリー、第６巻、第１８１８〜。 １８２７頁（１９６７））、ゲルから抽出しそして文献
〔ダブリュー・ミエーラー等、ジャーナル・モレキュラ
ー□・バイオロジー、第１２４巻、第３４３〜３５８頁
（１９７Ｂ））に記載されているように精製した。 第１７図を参照して、配列決定用の各種断片を次のよう
に調製した： ２５および２６−−ＰｓｔｌによるＨｉｆ−Ｕ−２０６
の開裂、標識化、ＢｇｌｌＩによる開裂、ならびにＰｓ
ｔｌ＊−Ｂｇｌｌ［断片（２５７ｂｐ）（“２５”）と
Ｐｓｔｌ＊−Ｂｇｌ■断片（２７９ｂｐ’）（“２６１
）との単離：２１．２２および２３−−ＰｖｕＩＩによ
るＩＩ ｉ ｆ −１１−２０６の開裂、標識化、Ｂｇ
ｌＩＩによる開裂、ならびにＰｖｕｌＩ＊−Ｂｇ ｌ
Ｉｒ断片（８８ｂｐ）（“２１”）とＰｖｕＩＩ＊−Ｂ
ｇＩＩ［断片（１７６ｂｐ）じ２２′）とＰｖｕｌ＊−
Ｂｇｌｌｌ断片（２１４ｂｐ）（“２３”）との単離； １１Ｓ１２．１３および１４−−ＢｇｌＩＩによるＨｉ
ｆ−ＩＩ ２０６の開裂、標識化、シ」Ｉによる開裂
ならびにＢｇ Ｉ Ｉ［＊−Ｐｓ ｔ Ｉ断片（２７９
ｂｐ）（“１４′″）および乱盈ユ■＊−Ｐ３ｔＩ断片
とＢｇ Ｉ ｌｌｌ一旦１」■＊断片との実移動性混合
物の単離、ＰｖｕＩＩによるこの混合物の開裂ならびに
Ｂｇｌ■＊−ｐｓｔＩ断片（２５７ｂｐ）（“１３”）
とＢｇ ｌ ＩＩ＊−ＰｖｕＩ［断片（１７６ｂｐ）（
“１２”）とＢｇ １１１＊−ＰｖｕＩ［断片（８８ｂ
ｐ）（１１”）との単離； ２７Ｌ、２７Ｕ、４１．４３．４４および４５−−Ｈｉ
ｎｆｌによるｌ１ｆ−ＩＩ−２０６の開裂、標識化なら
びに先駆体断片： Ｈｉ ｎ ｆ ［＊−Ｈｌｎｆ ｒ
＊（１１３ｂｐ）（”２７Ｐ”）、１１ｉｎｆ ｒ＊−
Ｉ（ｉｎｒ ｌ＊ （１４６１１１））（″ ２８ Ｐ
″ ） 、 ■（ｉｎｒ Ｔ＊−Ｈｌｎｒ Ｉ
：ｈ（１５９ｂｐ）（”３０Ｐ”） 、Ｈｉｎｆ ｌ＋
ｌ＜−Ｈｌｎｆ Ｉ＊ （３９７ｂｐ）（”３ＩＰ”）
、およびＨｉｎｆ Ｉ＊−Ｈｌｎｆ Ｉ＊ （１５２２
ｂｐ）（３２Ｐ”）の単離。Ｍ ｂ ｏ Ｕによる２８
Ｐの開裂ならびに断片ＨｉｎｆＩ＊−Ｍｂ。 ｎ （１１２ｂｐ）（”４１″）の単離。Ｍ ｂ 。 ■による３０Ｐの開裂ならびに断片Ｈｉ ｎ ｆ Ｉ
＊−ＭｂｏＩＩ （１２６ｂｐ） （“４３”）の
単離。 Ｐｓｔｌによる３１Ｐの開裂ならびに断片Ｈｉｎｆ１＊
−ＰｓｔＩ （１５１ｂｐ） （“４４”）の単離。ｐ
ｓｔｌによる３２Ｐの開裂ならびに断片Ｈｉｎｆ ｒ＊
−Ｐｓ ｔ Ｉ （１３９ｂｐ）（４５”）の単離。２
種のストランド （“２７Ｕ”および２７Ｌ”）を得るための２７Ｐのス
トランド分離。 ２７Ｕおよび２７Ｌ以外の全ての断片を、両ストランド
に関し配列決定し、しかも位置１８５におけるＢｇ１１
１部位以外につき配列決定用の起源として役立つ制限部
位にわたって決定した。 ２種の挿入物によりコードされたアミノ酸配列を比較す
れば明らかなように、Ｈｉｆ−ｆｆ−２０６断片はＨｉ
ｒ −２ｈ断片におけるよりもアミノ酸の１個少ない
インターフェロン状蛋白質をコードする（Ｈｉｆ−２ｈ
に存在するアミノ酸４４ （Ａｓｐ） が）Ｔｉｆ−Ｉ
Ｉ−２０６には欠如している〕、さらに、２種の断片に
おけるヌクレオチド位置の１０％と誘導アミノ酸残基の
１７％とが異なる。 さらに、リンパ芽球細胞インターフェロンのアミノ末端
につき決定された３５個のアミノ酸〔ケー・シー・ズー
ン等、サイエンス、第２０７巻、第５２７〜５２８頁（
１９８０））と比較して、挿入物Ｈ４ｆ−ＩＩ−２０６
はズーン等（上記）により決定された３５（Ｉｌのアミ
ノ酸残基とは５個の残基において異なる蛋白質をコード
する。したがって、白血球型（α型）の少なくとも３種
の異なるＩＦＮ遺伝子、すなわぢＨｉｆ−２ｈ断片とＨ
ｉｆ−ＩＩ−２０６断片とズーン等のＩＦＨに対する遺
伝子被覆とが存在する筈である。インターフェロンの新
たに提案された命名法によれば、以下、これら遺伝子に
よりコードされる蛋白質を次のように同定する：ＩＦＮ
遺伝子源 蛋白質 Ｈｉ ｆ−２ｈ Ｔ ＦＮ−αＩＩ（ｉ
ｆ−Ｕ ２０６ ＩＦＮ−α２リンパ芽球細
胞からの ｔＦＮ−α３ＩＦＮ（ズーン等、上記） ＩＦＮ−α１とＩＦＮ−α２との間の差は、ひとＣＣＬ
２３と牛脂生腎（ＢＥＫ）細胞とに対すみそれらの異な
る活性にも反映される。 Ｈｉ ｆ−ｎ ２０６ １．７ １．０ １
．７： １（［ＦＮ−α２） Ｈｉ ｆ −ＳＮ３５＊ ＊ ０．０５ １．０
１ ： ２０（ＩＦＮ−α１） ＊ ヒブリドプラスミドを含有する・イー・コリＨ［３
１０１を、トリプトン培地において振とうしながら約１
〜２のＯＤ６５０まで増殖させた。細胞を収量し、秤量
し、初期培養容量の１／１００もしくは１／２０に再懸
濁させそしてリゾチーム−凍結−解凍法により溶菌させ
た〔ニス・ナガタ等、ネイチャー誌、第２８４巻、第３
１６〜３２０頁（１９８０）〕、ミクロ測定板における
ｃｐｇ減少分析法により５−３０上澄液を試験した。比
較細胞からの抽出物は陰性であった（＜１ １０／ｍｌ
〕、ひとＣＣＬ２３細胞と牛脂生腎（ＢＥＫ）１ｍ胞（
フロー）とをＭＥＭ−１０％胎生牛血清中で生育させた
。ＩＦＮ含有抽出物に対する露出を２４時間行なった。 ｓｉｔ胞をメンゴウイルスの適当な希釈物によって処
理し、２４時間後に染色した。数値を、既知測定値の部
分精製された白血球ＩＦＮ（３１製物ＰＩＦ、ケー・カ
ンチルにより寄！！ｌ）と比較して肉眼的に推定した。 この調製物は生細胞に対するよりもひと細胞に対し約３
倍活性が大であった。 ＊＊Ｈｉｆ−ＳＮ３５とＨｉｆ−２ｈとの制限地図を比
較すれば、それらが相互の多形質変種であることが示唆
される（上記〕、したがって、ＩＦＮ−Ｃ１はＩＦＮ−
Ｃ２よりも、ひと細胞に対して約３０倍低い活性を有す
る。しかしながら、これら両者は共に、生細胞に対しほ
ぼ同等の活性を有する。したがって、ＩＦＮは、ひとに
おける抗ウィルス剤および抗腫瘍もしくは抗癌剤として
の使用に加え、牛におけるこれらの病状を処置するにも
有用である。 たとえば、Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αの調製物は、牛における
ＦＭＤＶおよびその他周知のウィルス感染を処置する際
、標準法（上記）で使用することができるであろう。こ
のことは特にＩＦＮ−Ｃ１について云えることである。 何故なら、生細胞に対するその活性がひと細胞に対する
活性よりも約２０倍高いからである。 次に、第２８図を参照して、プラスミドＣＢ−ｒＦＮ−
α２を高収率で作成する手順を示す。 構成Ｃ８（上記）を有するＩＦＮ−Ｃ１の場合改善され
た収量が得られたので、ＩＦＮ−Ｃ２についても同様な
構成を作成した。Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｈｉｆ
−ＩＩ−２０６をＢｓｐ■により完全にかつｐｖｕＩ
［により部分的に（Ｐｉにて）開裂させ（第２８図）、
８６７ｂｐの断片を６％ポリアクリルアミドゲルで単離
し２５９０ｂｐの断片に結合させた。得られたヒブリド
プラスミド（ＣＢ−ＩＦＮ−Ｃ２）を使用してイー・コ
リＨＢ１０１を形質転換させ、クローンをＩＦＮ活性に
つき選別し、た。高活性を示す１つのクローンを選択し
、イー・コリＨＢ１０１ （Ｃ８−ＩＦＮ−Ｃ２）と名
付けた。 ヒブリドプラスミドＣＢ−ＩＦＮ−α２のＤＮＡ配列決
定は、このプラスミドがＣ３−ＩＦＮ−Ｃ１と同様に開
始コドンに続いてβ−ガラクトシダーゼの最初の７個の
アミノ酸と２個のＤＮＡ断片の融合により生じたＰｒｏ
残基とＩＦＮ−Ｃ２信号配列のアミノ＠１６〜２３をコ
ードするＤＮＡ配列とに関するＤＮＡ配列を有すること
を示した。したがうて、ここでもＩＦＮ−Ｃ２を含有す
る融合蛋白質が発現されると思われる。この事実は、こ
のプラスミドで形質転換された宿主により発現されるＩ
ＦＮ−αが融合蛋白であることを示唆する。 このプラスミドにより形質転換されたミニセルはＩＦＨ
の１１当り１００〜２００Ｘ１００万単位を与え、或い
は未改変Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｈｉｆ−ＩＩ
２０６により形質転′換されたミニセルよりも２０．
０００〜４０．０００倍高いＩＦＮ−Ｃ２の収量を与え
る。 Ｃ３−ＩＦＮ−Ｃ１（５０Ｘ１０’単位／１）とＣ３−
ＩＦＮ−Ｃ２（１００〜２００Ｘ１００万単位／ｌ）と
の相対的収量を比較すると、先ず驚くことに、ＩＦＮ−
Ｃ２はひと細胞（上記）に対しＩＦＮ−Ｃ１よりも約３
０倍高い活性を示した。しかしながら、これら２種の０
８プラスミドで形質転換させたミニセルにより生産され
る２種の蛋白質の量の定量分析は、ＣＢ−ＩＦＮ−α１
においてはＣＢ−ＩＦＮ−α２におけるよりも約５〜６
倍多い蛋白質が生産されてい・ることを示した。したが
って、ＩＦＮ活性を基準として測定した収量は、ＣＢ−
ＩＦＮ−α１の場合生産された蛋白質がずっと多い量だ
けずれていた。 次に第２６図を参照して、ＩＦＮ−α２の収量を向上さ
せる試みの他の構成を記載する。先ず、公知ｌａｃプロ
モータをＡｌｕｌで制限しかつ第２７図に示したような
断片（１つの末端につき）をＥｃ ｏＲＩリンカ−（共
同研究により調製）で伸長させることにより、ＬＡＣＡ
ｌｕ断片を含有する発現プラスミドを調製した。次いで
伸長した断片をｐＢＲ３２２のＥｃ。 ＲＩ部位に挿入し、そしてＥｃｏＲＩ−Ｅｃ。 Ｒ１断片を構造から削除した。第２６図に４０４として
示された得られたプラスミドをＨｉｎｄｍおよびＰ Ｖ
１１■で開裂させてＩＦＮ−α２含有断片を挿入した
。このＩＦＮ−α２断片は、Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔ）／Ｉ（ｃ ＴＦ−Ｕ−−２０６（第２６図における
“２０６”）の部分的Ｓ ａ ｕ ３ Ａ制限と、）ｌ
ｉ ｎｄＴＩＴリンカ−による５ａｕ３Ａ断片の伸長
く第２７図）と、ＢＳｐＩでの開裂とにより鋼製した。 この断片をＨｉｎｄｍ−ＰｖｕｌＩ開裂されたプラスミ
ド４０４に挿入した後、得られたプラスミドをＨｉｎｄ
’ｌ［ＩとＥｃ ｏＲＩとで制限し、Ｓ１ヌクレアーゼ
で処理してＬＡＣプロモータをＩＦＮ−α２遺伝子に近
接させかつ再結合させた。この構造は、ＬＡＣプロモー
タの制御下においてＩＦＮ−α２ＤＮＡ配列を有する。 さらに、ＩＦＮ−α２配列は、そのプロモータの開始Ａ
ＵＧコドンの直後となる（第２７図参照〕、したがって
、これらプラスミドにより生産されたＩＦＮの少なくと
も一部は成熟ＩＦＮ、たとえば信号配列からの如何なる
アミノ酸をも含まないＩＦＮである。 ミニセルにおいて、これらプラスミドの１種であるＬＡ
Ｃ−ＡＵＧ （α２）により得られたＩＦＮ−α２の収
量はＩＩ当り５〜１０ｘ１００万単位であった。 同様な結合原理に基づいて池のｒＦＮ−α２構造をも作
成した。ここでは、ｐＢＲ３２２のペニシリナーゼ発現
制御配列は、ＡＵＧ開始コドンを介してＨｉ ｆ−ＩＩ
−２０６＊からのＩＦＮ−α２遺伝子に結合されている
。 ＊ この構造は、ＭｂｏＩ［によるｐＢＲ３２２の部分
的切断と８１での処理と上記したようなＥｃ ｏＲＩリ
ンカ−の結合とｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に対する
断片の再挿入と１つのＥＣｏＲＩ部位の削除とにより最
も効果的に作成できる。次いで、得られたプラスミド（
“β−ｌａｃ−ＡＵＧプラスミド”）を、前記したよう
な２０６のＳ１処理（緩和に）されたＨ ｉ ｎ ｄ
ｍリンカ−−ＢｓｐｌＬｆｒ片と組合せることができる
。ＥＣ□ＲＩで開裂させかつＳｌとホスファターゼとで
処理した後、発現プラスミドβ−ｌａｃ−ＡＵＧ（α２
）を単離する。 他の遺伝子による構成は、単に構成β−１２ａ ｃ−Ａ
ＵＧプラスミドを使用して他の遺伝子もしくは構造を挿
入させることにより、或いはより好ましくはプラスミド
β−７ａｃ−ＡＵＧ （α２）自身に５ａｕ３Ａ部位を
使用することにより、同様に行なうことができる。 このプラスミドは、β−ｊ！ａｃ−ＡＵＧ（α２）と名
付けられ、宿主細胞を形質転換させるため使用すると、
他の蛋白質配列に融合することなくＩＦＮ−α２の生産
をもたらす。ミニセルにおいて、１ｉ当り５０〜１００
ＸＩＯＱ万単位の収量が観察された。このプラスミドは
、本発明により使用するのに最も好適なプラスミドであ
る。これはまた、本明細書中に記載した他のＩＦＮ−α
遺伝子と共に使用するにも好適である。本発明において
好適な宿主は、イー・コリＤ Ｓ ４１０ （ａｒａ
ａｚｉｄｅ ＴｏｎＡ ｌａｃ ｙ Ｔｓｘｓｉｎ ａ
ｗｉｎ ｂ ｇａｌλ ｘｙｌ ５ｔｅｐＲ）である
。この菌株は、好適プラスミドβ−／ｌａｃ−ＡＵＧ（
α２）の例と共にＨｃｌＦ−にとして寄託されている。 各種の１０モ一タ配列と、リポソーム結合部位と、シャ
・インーダルガルノ配列と、プロモータとＡＵ（１，開
始コドンと間のＤＮＡ配列とを使用しかつ本明細書中に
記載した各種のＩＦＮ−α遺伝子とを使用する他の構成
をも、同様の方法と原理とにより作成できる。勿論、こ
れらの構成も本発明により実現され、本発明の範囲内で
ある。 ＩＦＮ−α１およびＩＦＮ−α２のダブリド分子 ＩＦＮ−α１およびＩＦＮ−α２の多数のダブリド分子
を作成した。驚くことに、これらダブリド構造体は、そ
れらの親であるＩＦＮ−α１またはＩＦＮ−α２のいず
れかと比較して、定量的に異なる性質と活性とを有する
。 第２８図を参照すれば、４種のこれらダブリド分子の構
造の略図が示されている。便宜上、これらダブリド分子
をプラスミド■、■、■および■と名付ける。これらの
溝造体において、制限酵素（Ｂｓｐｌはキツス博士から
寄贈され、その池のものはビオラブ社から得られた）に
よる切［折を、供給者により推奨されているように行な
った。部分的ＤＮＡ開裂は酵素量を減少させて行なった
。制限酵素を熱失活（６５℃、３０分間）させた後、試
料を５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８＞にてｇ製し、必
要に応じ子牛腸アルカリホスファターゼ（ベーリンゲン
社）（ＤＮＡ１μｇ当り１容量）を加えた。３７°Ｃで
３０分間の後、試料をフェノールとエタノールとで抽出
した。大抵の場合、ＤＮＡ断片を低温度ゲル化アガロー
ス（０，８％）にて分離させた。結合のため、断片含有
のゲル片（それぞれ約２０μｌ）を６５℃で熔融させ、
３７°Ｃに冷却しそして１μｌ当り２０ＵのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを加えた。 混合物を１５℃にて１６時間保ち、固化ゲルにおいて結
合を生ぜしめた〔エッチ・レーラソハ、私的通信（１９
８０）〕、１／１０容量の１００ｍＭｌ−リス−〇 Ｃ
１（ｐｌ＋７．５ ）と１００ｍＭのＣａｃＩ２と１０
０ｍＭのＭｇＣ＋２とを加え、試料を６５℃にて５分間
加熱しそして３７℃まで冷却した。次いで試料をＣａ“
処理されたミニセルに加え、０℃にて２０分間培養し、
４２℃にて１分間および２０℃にて１０分間加熱し、そ
して１ｍｌのトリプトン培地を加えた。３７℃にて６０
分間培養した後、適当な抗生物質を含有する寒天板の上
に培養物を載置した。全てのプラスミドをＩＦＮ配列に
おける接合部にわたりヌクレオチド配列を分析して特性
化した。 ダブリド分子Ｉ、すなわちα−１（Ｐ ｖ ｕ ＩＩ）
α−２ヒブリドをＰｖｕｎによるＣ３−ＩＦＮ−α１
（上記）（第２８図におけるＣ８−α１）の部分的開裂
により作成し、脱燐酸化させ、ＰＳｔｌにより開裂させ
そしてＰｓ ｔ Ｉ−ＰｖｕＩＩ （Ｐ２）１３４６ｂ
ｐの断片を単離した。この断片を１、ｐｖｕｎでのＣ３
−ＩＦＮ−ａ２（上記）（第２８図におけるＣ８−α２
）の完全開裂とＰｓｔｌでの部分開裂とにより調製され
た２１３５ｂｐのＰｓ ｔ Ｉ （ａ） −ＰｖｕＩ
Ｉ（Ｐ２）断片に結合させた。 ヒブリド分子■、すなわちα−１（ＢｇｌＵ）α−２ヒ
ブリドは、ヒブリド分子ＩをＢｇｌＩＩにより開裂させ
て作成した。脱燐酸化の後、大きなりｇｌＩＩ断片を単
離してこれをＣ３ｉＦＮ−α２の小さな旦エユ■断片に
結合させた。クローン化の後、正しい方向性にて小さな
りｇｌ■断片を有するヒブリドブラスミドを制限分析に
より同定した。 ヒブリド分子■、すなわちα−２（Ｐ ｖ ｕ Ｉ［）
α−１ヒブリドは、Ｃ３−ＩＦＮ−α１をＰｖｕｎで部
分開裂させ、脱燐酸化し、ＡｖａＩで開裂させ、次いで
１６８６ｂｐのＰｖｕＵ（Ｐ２）−Ａｖａｌ断片と３２
３３ｂｐのＰｖｕｌｌ （Ｐｔ ）−Ａｖａｌ断片とを
単離することにより作成した０次いでこれら断片をＨｃ
ｌＦ−ＩＩ−２０６（上記）（第２８図におけるＳＮ２
０６）の３ｏｏｂｐのＰｖｕｎ（Ｐ、） −Ｐｖｕｌｌ
（Ｐ２ ）断片に結合させ、そして小さなＰｖｕｌｌ
断片を含有するプラスミドを形質転換大腸菌菌株のＩＦ
Ｎ−α活性を分析して同定した。 ダブリド分子■、すなわちα−２（ＢｇｌＩＩ）α−１
ヒブリドは、ＢｇｌｎおよびＡｖａ■でのＣ３−ＩＦＮ
−αｌの開裂によって作成し、そして１７７６ｂｐの断
片を単離した。次いで、この断片をダブリド分子■の３
５４３ｂｐのＢｇ ＩＩＩ−Ａｖａ Ｉ断片に結合させ
た。 互いに異なるインターフェロン種類の生物学的活性をも
測定した。各種のプラスミドで形質転換させたミニセル
（ＤＳ４１０）の培ｉ物を増殖させ、細菌を遠心分離に
より収穫し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁させ（初
期容量の約１／２０）、１■／ｍｌのリゾチームおよび
１０ｍＭのＥＤＴＡと共に０℃で６０分間培養し、４回
凍結・解凍を反復し、注射器中に５回通して剪断しそし
て遠心分離により開裂させた。 ひと、ねずみ、モルモットおよび牛の細胞に対する活性
は次の通りであった： 相対ＩＦＮ活性 蛋白質源 ひと 牛 ねずみ モルモＣ３−ＩＦ
Ｎ−α２ １ １ ０．０１ ０．０３Ｃ８
−ＩＦＮ−α１ ０．０３ １ ０．３ ０．０
３ヒブＩＪ ）’ Ｉ Ｏ，００！ １
０．００３− ０．００３−０．００８ ０．０１ 上ゾリＦ ｎ ｏ、ｏｏｉ ｉ Ｏ，００
１ｏ、ｏｉヒダブド１１１１ １１０．３ ヒブＩＪＦＩＶ Ｏ，１１２０，１−０，００５ 陰性比較 驚くことに、全てのインターフェロンは生細胞に対しほ
ぼ同じ活性を示したが、ＩＦＮ−α１とＩＦＮ−α１の
アミノ末端成分を有する２つのダブリドＩＦＮ（Ｉおよ
び■）とは、ＩＦＮ−α２およびＩＦＮ−α２のアミノ
末端成分を有する２つのダブリドＩＦＮ（Ｉ［Ｉおよび
■）よりも、ひと細胞に対し約１０〜１０００倍低い活
性を示す、さらに驚くことに、ＩＦＮ−α１のアミノ末
端部を有する２つのダブリドＩＦＮ（■および■）は、
ＩＦＮ−αｌ自身よりも１０倍以上低い活性をひと細胞
に対して示す。しかしながら、ＩＦＮ−α２のアミノ末
端部を有する１つのダブリド（ＩＩＩ）は、ひと細胞に
対しＩＦＮ−α２とほぼ同じ活性を示す。 生成させかつＥＣＯＲＩリンカ−によりλチャロン４Ａ
アームに結合させたひと胎児染色体ＤＮＡの断片から得
られたダブリドファージの集団をアール・エム・ローン
等、セル誌、第１５巻、第１１５７〜１１７４頁（１９
７８）に従って調製した。この遺伝子集団を、ｐＢＲ３
２２（Ｐｓｔ）／Ｈｉｆ−２ｈから切断されたｐ３２−
標識ＩＦＮ−α１ｃＤＮＡ挿入物を試料として使用する
「現場」での方法により選別した〔ダブりニー・ディー
・ベントンおよびアール・ダブリュー・デビス、サイエ
ンス、第１９６巻、第１８０−１８２頁、（１９７７）
；ティー・マニアチス、セル誌、第１５巻、第６８７〜
７０１頁（１９７８）〕、反復プラーク精製により２４
０，０００１ＶＡのプラークがら１６（固のヒフ゛リド
化陽性ファージクローンを単離した〔ティー・マニアチ
ス等、上記〕。１０種のヒダリドファージＤＮＡ調製物
をそれぞれＨｉｎｄｌｌＩ、Ｔａｃｌ、Ｈｈａｌ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌｌｌによって開裂させ
、そしてアガロースゲル上での電気泳動により断片を分
離してこれをミリポア膜に移し〔イー・エム・サウザー
ン、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第９８
巻、第５０３〜５１７頁（１９７５） ）、そしてｐ３
２−標識Ｈｉｆ−２ｈｃＤＮＡ挿入物でダブリド化させ
た。第１８図は、部分制限地図および種々の表として結
果を要約している。 そこに示されているように、各ダブリドファージＤＮＡ
ａ製物については、少なくともユニの特徴的制限部位が
確立され、さらにＩＦＮ−α１遺伝子試料にダブリド化
する領域が描写されている（黒矢印）＊。 ＊ 第１８および２４図におけるｃｈｒ１６上の陰影区
域は、Ｈｉｆ−２ｈｃＤＮＡに弱くダブリド化するがＲ
−ループ化を示さなかった配列を示す。 次に第１８図および第２４図を参照すれば、クローンｃ
ｈｒ−３およびｃｈｒ−２６は、幾つかのＥｃｏＲＩお
よびＨｉｎｄ［ＩＩの断片を共有するので、それらの長
さの多くにわたって重複するＤＮＡ断片を示しうろこと
が判るであろう。さらに、ｃｈｒ−１のダブリド化部分
とｃｈｒ−１０のダブリド化部分の１つは、Ｈｉｆ長さ
くそれぞれ３．２ ｋ ｂおよび０．９５ｋ ｂ ）を
有するので同じになるであろう。また、ｃｈｒ−１６の
「右手側」のヒブリド化部分（第１８図において“ｒ”
と標識する）はｃｈｒ−３５のダブリド化部分と同一で
あると思われるが、これら２つのクローンの各々はＨｉ
ｆ−２ｈｃＤＮＡとをもたらすので反対方向に配向する
。したがって、恐ら（ｃｈｒ−１６とｃｈｒ−３５との
挿入物は重なるであろう。 したがって、１１個のダブリド染色体ＤＮＡの１３個の
ダブリド化部分は１０Ｍ類以上、すなわちｃｈｒ−１、
ｃｈｒ−３、ｃｈｒ−１２、ｃｈｒ−１３、ｃｈｒ−１
６（左手側、第１８図において“ｌ”と標識する）、ｃ
ｈｒ−２６、ｃｈｒ−３０、ｃｈｒ−３５、ｃｈｒ−１
９およびｃｈｒ−２７になると思われる。 次に第２４図を参照すれば、ｃｈｒ−１とｃｈｒ−３と
ｃｈｒ−１０とｃｈｒ−２６との重複およびｃｈｒ−１
６とｃｈｒ−３５との重複が示されている。 上記のデータが示唆するところでは、個々のひとのゲノ
ムはＨｉｆ−２ｈにクロスヒブリド化する１０種以上の
異なるＤＮＡ配列を含有する。この結論は、クローン集
団中に検出された断片Ｈｉｆ−２ｈ関連の配列の割合が
約１６．０００中１であるという事実により裏付けられ
る。半数体ひとゲノムに対しａｘｔｏ”ｂｐＯ値を仮定
すれば、１６ｋｂ（検査されたクローンの平均値）とい
う平均ＤＮＡ断片寸法を有する単一遺伝子コピーに対す
る予測値は約１ ： １９０，０００である。したがっ
て、Ｈｉｆ−２ｈ関速断片の頻度は単一遺伝子に対する
予測値よりも１２倍高いものである。 これらデータと比較して、ローン等（上記）がβ−グロ
ビンｃＤＮＡ試料につき同じ遺伝子集団から３００．０
００個のプラークを選別した際、僅か２つの陽性クロー
ンのみが同定され、この場合予測値は１．６ ： ３０
０，０００であった。したがって、ひとゲノムには、Ｈ
ｉｆ−２ｈ断片もしくはｒＦＮ−α１ｃＤＮＡにクロス
ダブリド化する１０〜１５個の明確な染色体ＤＮＡ断片
が存在するであろう。 ）１ｉｆ−ｃｈｒ３５の別の特性化 説明の目的として、ｃｈｒ−３５のダブリド化配列（“
Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５”）をさらに特性化した。前記した
染色体ダブリドファージのダブリド化部分は同様に特性
化されかつ本発明の範囲を逸脱することなく取扱いうろ
ことを了解すべきである。 ｃｈｒ−３５のダブリド化部分（“Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５
”）（Ｈｉｆ−ｃｈｒ１６の右手断片と恐らく同一であ
る、上記）は、ＢｇｌｌＩ部位を有する唯一のダブリド
化染色体ＤＮＡ部分である。ｒＦＮ−α１およびＩＦＮ
−α２のｃＤＮＡはそれらのコード配列内にそれぞれ１
個および２個のＢｇｌ［［部位を有するので、恐ら＜Ｈ
ｉｆ−ｃｈｒ３５は２つの予めクローン化したインター
フェロン遺伝子の１つの相手方になると思われる。３′
末端Ｈｉｆ−２ｈｃＤＮＡ断片（３′非コード域のみを
含有する）へのＨｉｆ−ｃｈｒ３５の強力なヒブリド化
は、この試料に対する他の染色体ＤＮＡの弱いダブリド
化と比較して、Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５とＨｉｔ−２ｈとの
対応性を裏付けている〔エフ・カファトス等、プロシー
ディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳ
Ａ、第７４巻、第５６１８〜５６２２頁（１９７７）〕
、Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５断片をさらに分析するため、Ｈｉ
ｎｄｌＩ［−ＢａｍＨＩ断片をｃｈｒ３５から切除した
。この断片（３，４ｋｂ）は、ｃｈｒ−３５のダブリド
化部分（Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５”）を含有する。この断片
を、周知のｄＣ−ｄＧ末端化方法（エル・ビラーカマロ
フ等、上記）を用いてｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位にク
ローン化させ、そしてイー・コリＨＢ１０１を得られた
組替えＤＮＡ分子により周知方法〔たとえばニス・ナガ
タ等、ネイチャー誌、第２８４巻、第３１６〜３２０頁
（１９８０））を用いて形質転換させた。 これら形質転換体のクローンをその場でのコロニーダブ
リド化〔ディー・ハナハンおよびエム・メセルソン、ジ
ーン誌、第１０巻、第６３〜６７頁（１９８０））によ
りｐ３２−標識Ｈｉｆ−２ｈ断片（上記）で選別し、プ
ラスミドＤＮＡ、すなわちＺ ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ
）／Ｈｃ ｈ ｒ Ｉ Ｆ−３５ＨＢ （“ＨｃｈｒＩ
Ｆ−３５ＨＢ″）を陽性クローンから分離した〔エフ・
エム・ウィルキー等、ヌクレイツク・アシッド・リサー
チ、第７巻、第８５９〜８７７頁（１９７９）、方法Ｂ
〕。ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子に関しプラ
スミド中のダブリド挿入物“Ｈｃｈｒ ＩＦ−３５ＨＢ
断片”の方向性を、Ｅｃ ｏＲＩ開裂および得られた断
片の寸法決定により決定した。β−ラクタマーゼのそれ
と一致するよう配向した挿入物をαと呼び、反対の配向
をβと呼ぶ。 これら陽性クローンの培養物を見掛けＯＩ）ａｓ。 ＝０．８になるまで増殖させ、そして細菌を収穫しかつ
ニス・ナガタ等（上記）に記載されたりゾチームー凍結
−解凍方法により熔暉させた。 検査した１０種のクローンのうち７種が７５〜５００単
位／細胞ｇのＩＦＮ−α活性を示した（細胞病理学的効
果減少分析〕、 これら７種のＩＦＮ生産性クローンのうちの１つのＤＮ
Ａ挿入物、すなわちイー・コリＩ（Ｂ１０１ （Ｚ
ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃｈｒＩＦ−３５ＨＢα〕
を、制限分析およびヌクレオチド配列決定によりさらに
特性化した。プラスミドＤＮＡ （Ｈｃ ｈ ｒ Ｉ
Ｆ−３５ＨＢα）を前記したようにクローンから調製し
、制限部位をスミスービルンスチールの地図化により決
定した〔エッチ・オー・スミスおよびエム・エル・ビル
ンスチール、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第３
巻、第２３８７〜２３９８頁（１９７６））、Ｈｃｈｒ
ｌＦ−３５ＨＢαをＥｃ ｏ、ＲＩで切断し、５′末端
を標識しそしてＢｇｌＩＩで切断した〔かつｐｓｔｌに
より約１ｋｂの望ましくない断片を開裂させた〕。１．
０４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ （３’近位）断片
と０．９６ｋ ｂのＥＣ０ＲＩ一旦１ユ■（５′近位）
断片とを、文献〔ニー・シー・ピーコックおよびシー・
ダブりニー“・ディングマン、バイオケミストリー、第
６巻、第１８１８〜１８２７頁（１９６７））に記載さ
れているようなアガロースゲル電気泳動により単離した
。両断片を）ｉｉｎｆ Ｉ、ＢｓｐｌおよびＭ ｂ ｏ
ＩＩによりそれぞれ部分開裂し、生成物を１μｇ／ｍ
ｌの臭化エチジウムを含有するトリス−酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，８）における１％アガロースゲルにて分離した。 染色後、放射能バンドを放射能写真により位も、１．０
４ｋ ｂ （３’近位）断片について同様に決定した。 分析の結果を第１９図に示す。 ヌクレオチド配列決定のため、ＨｃｈｒｌＦ−３５ＨＢ
αを種々の制限酵素で開裂させ、生成物をトリス−硼酸
−ＥＤＴＡ緩衝液における５％ポリアクリルアミドゲル
による電気泳動により分離しくニー・シー・ピーコック
およびシー・ダブリュー・ディングマン、上記）、そし
てゲルから抽出し、ダブりニー・ミューシー等、ジャー
ナル・モレキュラー・バイオロジー、第１２４巻、第３
４３〜３５８頁（１９７８）に記載されているように精
製した。 使用した配列決定方法を第１９図に示し、下記に説明す
る。 １および２：ＢｇｌＵによるＨ、ｃｈｒｌＦ−３５ＨＢ
αの開裂、標識化、ＥＣＯＲＩおよびＰｓｔｌによる開
裂ならびにＢｇｌＵ＊−臣！」Ｒ１断片（９４０ｂｐ）
（“１″）およびＢｇｌ［＊−ＥＣＯＲＩ断片（３６０
ｂｐ）（“２”）の単離； ３および４：ＥｃｏＲｒによるＨｃｈｒｆＦ３５ＨＢα
の開裂、標識化、Ｂｓｐｌによる開裂ならびにＥｃｏＲ
Ｉ＊−Ｂｓｐ ｒ断片（６８０ｂｌ））（＠３”）およ
びＥｃｏＲＩ＊−Ｂｓｐｌ断片（８８０ｂｐ）（“４”
）の単離ヨ ５．６．７および８ ’： Ｐ ｖ ｕ ＫによるＨｃ
ｈｒＩＦ−３５ＨＢαの開裂、標識化、ＢｇｌＩ［およ
びＥｃ ｏＲＩによる開裂ならびにＰｖｕ■＊−Ｅｃｏ
ＲＩ断片（７８０ｂｐ）（”５”）、ＰｖｕＩＩ＊−且
エユ■断片（２１５ｂｐ）（＠６”） 、Ｐｖｕｌｌ＊
−ＢｇｌｌＩ断片（９０ｂｐ）（１７″）およびｐｖｕ
Ｉ［＊−ＥｃｏＲＩ断片（２９０ｂ １）） （“８
”）のＲ離； 。 ９および１０：ＥｃｏＲＩによるＨｃｈｒｌＦ−３５Ｈ
Ｂαの開裂、１３００ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
断片のトリス−硼酸ＥＤＴＡ緩衝液における１％アガロ
ースゲル電気泳動によるｆｆｉ離、さらにＨｉｎｆｌに
よる開裂ならびにＨｉｎｆ ［−Ｈｌｎｆ Ｉ断片（４
５０ｂｐ）およびＨｉｎｆ ｌ−Ｈｌｎｆ Ｉ断片（１
８０ｂｐ）の単離、より大きなＨｉｎｆ ｌ−Ｈｌｎｆ
Ｉ断片の標識化とＭｂｏＩＩによる開裂とはＨｉｎｆ
ｌ ＊ −Ｍ ｂ ｏ■（１９０ｂｐ） じ９″）の
単離を可能にした。より短いＨｉｎｆ ｌ−Ｈ１ｎｆＩ
断片の標識化とＡｖａＩＩによる開裂とはＨｉｎｆ１＊
−ＡｖａＩＩ断片（１５０ｂｐ）（’″１０”）のＲ離
を可能にした； １１：Ｍｂｏ［によるＨｃ ｈ ｒ Ｉ Ｆ−３５ＨＢ
αの開裂、標識化、ＢｇｌＩ［による開裂ならびにＭｂ
ｏｌＩ＊−ＢｇｌｌＩ断片（４６５ｂｐ）（“１１’″
）の単離： １２．１３および１４：ＢｓｐｌおよびＢｇｌＵによる
ＨｃｈｒｌＦ−３５ＨＢα（７）開裂、上記のように１
２００ｂｐ Ｂｓｐｌ−Ｂｇｌｌｌ断片のアガロース
電気泳動にょる単離、ならびに（ａｌＨｇｉＡＩによる
開裂、標識化、Ｍ ｂ ｏ ＩＩによる開裂およびＨｇ
１ＡＩ＊−ＭｂｏＩＩ断片（３００ｂｐ） じ１２”
）とＨｇ１Ａｉ＊−Ｍｂｏｌ？断片（３６０ｂｐ）
（“１３”）との単離または（ｂ） Ｂ王ユＮｌによる
開裂、標識化、ＥｃｏＲＩによる開裂および１王ｔＮＩ
）ｋ−ＥｃｏＲＩ断片（３８０ｂｐ）（”１４”）の単
離。 マキサム−ギルバート法（上記）により、各種の断片を
配列決定した。全ての断片を両ストランドに関しかつ配
列決定用の原点として役立つ制限部位にわたって配列決
定した。 Ｈｃｈｒ ＩＦ−３５ＨＢαにおけるコード域のヌクレ
オチド配列とＨｉｆ−２ｈにおけるそれ（コード域）と
の比較（第８〜１０図と第２０〜２３図との比較）は、
それらが同一であることを示す。特に、驚くことに、Ｈ
ｃｈｒｌＦ−３５ＨＢα断片のコード配列内、すなわち
５′非コード域におけるＨｉｎｆ １部位と３″非コー
ド域におけるＥｃｏＲ１部位との間には、イントロンの
存在が示されない。したがって、成熟ＩＦＮ−αｍＲＮ
Ａに対応する染色体配列にはイントロンを検出すること
ができなかった。 Ｈｉｆ−ｃｈｒ２６および）（ｉｆ−ｃｈｒ３の特性化 ｃｈｒ−３およびｃｈｒ−２６の遺伝子含有断片は、ヘ
テロデュプレックス分析により同一と思われるが少なく
とも１つのＢｇｌｎ制限部位において異なり、これらを
ヌクレオチド配列決定により検査した。７２５ベース対
における５つのヌクレオチドの相違が見出された。これ
らのうち２つのみがコード配列にあると思われる。遺伝
子だけでなくそれらに先立つ少なくとも３．５ Ｋ ｂ
Ｉ）とそれらに続＜ ６．ＯＫ ｂ ｐとは完全なヘ
テロデュプレックスを形成しかつ僅か２つのアミノ酸変
化を伴う比較的少ない配列差しかないので、Ｈｉｆ−ｃ
ｈｒ３とＨｉｆ−ｃｈｒ２６とは同一遺伝子の対立形態
であると思われる。これらはＩＦＮ−ｃｒ４ａ （Ｈ
ｉ ｆ−ｃｈｒ３）およびＩＦＮ−α４ｂ （Ｈｉ ｆ
−ｃｈｒ２６）と名付けられる。前記した慣用の配列決
定技術により決定されたＩＦＮ−α４ｂのヌクレオチド
配列と対応アミノ酸配列とを第２９〜３２図に示す。 第２９〜３２図を第８〜１０図、第１２〜１６図および
第２０〜２３図と比較すれば、各配列によりコードさ、
れる蛋白質はそれらの残基の約１５％において互いに相
違することが示される。 この相違は、２０００〜９０００万年前に分化した非対
立遺伝子の生成物に対して典型的である。 ねずみ細胞における）（ｉｆ−ｃｈｒ３５の発現 ねずみ細胞において発現させるため、・Ｈｉｆ−ｃｈｒ
３５断片の供給源としてプラスミドＺ−ｐＢＲ３２２（
Ｐｓ ｔ）／Ｈｃｈｒ ＩＦ−３５ＨＢα（上記）を使
用した。プラスミドをＰｓｔ■で制限しかつ５′エキソ
ヌクレアーゼで処理して５’ ｄＧ末端を除去した。次
いで、この断片を、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ、Ｂ ａ
ｍ Ｈ１断片とポリオーマＤＮＡとの結合により調製
されたプラスミドの５’ ｄＣ，−末端化ＫｐｎＩ断片
に挿入した。得られたベクトルを使用してねずみ３Ｔ３
細胞を形質転換させ、この場合燐酸カルシウム技術を使
用した〔エフ・マンティ等、ネイチャー誌、第２８１巻
、第４０〜４６頁（１９７９）〕、これら形質転換細胞
は便宜上ねずみ３Ｔ３（ポリオーマ−）１ｉｆ−ｃｈｒ
３５）と名付けられる。２０〜４０時間後、分析はひと
細胞に対し３００単位／ＩＦＮ−α１ｍｌのＩＦＮ−α
活性を示し、生細胞に対しては約３０００単位／ＩＦＮ
−ｃｒ１ｍｌの活性を示した。 勿論、第８〜１０図、第１２〜１６図、第２０〜２３図
および第２９〜３２図に示したヌクレオチド配列は、ヌ
クレオチド配列に対し、たとえば既に起こったまたは続
いて用いうる単一もしくは多重のベース置換、挿入、転
位もしくは欠失を含む突然変異のような如何なる変化を
も考慮に入れてないことを了解すべきである。さらに、
この配列はこれら図面に示されたコドンと同じアミノ酸
をコードする他のコドンの可能な置換をも考慮に入れて
ない。したがって、ＩＦＮ−αの免疫学的もしくは生物
学的活性を示すポリペプチドをコードするような改変配
列も本発明の範囲内にあることを了解すべきである。 さらに、第８〜１０図、第１２〜１６図、第２０〜２３
図および第２９〜３２図に示されたアミノ酸配列は、生
体内もしくは試験管内試剤、たとえば生体内グリコジル
化酵素との相互作用により惹起されるポリペプチドに対
し如何なる変化をも考慮に入れてないことを了解すべき
である。したがって、ＩＦＮ−αの免疫学的もしくは生
物学的活性を示すこれらポリペプチドの断片および誘導
体も本発明の一部であることを了解せねばならない。 チドの産生 細胞病理学的効果減少分析〔ダブりニー・イー・スチュ
アート・■およびニス・イー・スルキン、Ｓ、Ｅ、Ｐｒ
ｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ 、第１２３
巻、第６５０〜６５３頁（１９６６））は少量のＩＦＮ
Ｃｍ菌細胞１個当り１個以下の活性分子）を検出しうる
ので、上記した１０種のヒゲリドλフアージで感染させ
たイー・コリＨＢ１０１の溶菌物をＩＦＮの存在につき
分析した。 １１種のファージのうち７種（ｃｈｒ−１０、ｃｈｒ−
１２、ｃｈｒ−１９およびｃｈｒ−２７を除く全て）は
、３部５単位／ｍｌの範囲のＩＦＮ活性を有する溶菌物
を与えた。ｃｈｒ−１０およびｃｈｒ−１２の場合、前
記したようにｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位ニサブクロー
ン化させたダブリド化（Ｈｉｆ−２ｈに対する）Ｈｉｎ
ｄｌｌｒ−ＨｉｎｄＩＩＩもしくはＥｃ ｏＲＩ −Ｅ
ＣＯＲＩ断片は大腸菌においてＩＦＮ−α活性を表わし
た。大腸菌はｍＲＮＡをスプライスし得ないと思われる
ので〔オー・メルセローープイジャロンおよびピー・ク
ーリルスキー、ネイチャー誌、第２７９巻、第６４７〜
６４９頁（１９７９））、これらＩＦＮ−α染色体遺伝
子は恐らくそれらのコード領域中にイントロンを含有し
ないと思われる。 最終結論 本発明によりポリ（Ａ＞ ＲＮ Ａから調製されたｃＤ
ＮＡを含有する一部の組替えＤＮＡ分子がセンダイウィ
ルス処理（誘発）されたひと白血球から単離され、その
代表的なものは次の性質を有している： （１）誘発されたひと白血球からのポリ（Ａ） ＲＮ
Ａにはダブリド化するが、非誘発のものからのポリ（Ａ
） ＲＮ Ａにはヒブリド化しない、（２１ＲＮＡの混
合物からＩＦＮ−αｍＲＮＡを選択する能力によりおよ
びダブリド抑制翻訳分析においてインターフェロンｍＲ
ＮＡの翻訳を抑制（可逆的に）する能力により示される
ように、ＩＦＮ−αｍＲＮＡにダブリド化する、 （３） この群の成る種のものを含有する大腸菌は、
次の性質を有する化合物を生産する＝ （ａ）トリプシンに対し感受性であり、（ｂｌ ひと
細胞系においてＩＦＮ−α活性を示すが、ねずみ細胞系
においてはほんの僅かの活性しか示さず、 ＴＣｌ ２０．０００〜３０．０００の分子量を有し
く第８〜１０９のヌクレオチド配列に基づけば１９．３
８８である）、 （ｄｌｌＦＮ−α活性は、ひと白血球インターフェロン
に対する抗体により特異性に抑制される、 （４） 本発明のダブリドブラスミドのＤＮＡ挿入物
は、Ｉ ＦＮ−αｍＲＮＡをＲＮＡ混合物から選択する
能力に加え、ＩＦＮ−αＤＮＡをｃＤＮＡを包含する各
種供給源の混合物からおよび染色体ＤＮＡのダブリドフ
ァージ遺伝子集団から選択することができる、 ＋５）ＩＦＮ−αに対する多数の異なる染色体遺伝子が
存在し、しかもこれら遺伝子がイントロンを欠失すると
共に適当な宿主におけるインターフェロンおよびインタ
ーフェロン様ポリペプチドの直接的発現を可能にするこ
とは予想外である、 （６） これら組替えＤＮＡ分子のＤＮＡ挿入物にお
ける少なくとも３種のヌクレオチド配列が異なっており
、これはＩＦＮ−αに関し少なくとも３種の非対立遺伝
子が存在することを示唆している、 （７） これら３種のヌクレオチド配列によりコード
される蛋白質は標準リンパ芽球細胞インターフェロンか
ら決定された３５個のアミノ酸とは異なっている、 （８１１ＦＮ−α遺伝子断片の各種組合せ物に対し調製
されたダブリド蛋白質は、相互にまたはそれらの親とは
定量的に異なる性質を示し、さらにＩＦＮ−αに融合し
た付加的アミノ酸を有する蛋白質またはアミノ末端配列
の一部を含まないＩＦＮ−αからなる蛋白質はＩＦＮ活
性を示す。 これらの性質は、本発明により示された組替えＤＮＡ分
子がひと白血球インターフェロンに関するコード配列の
少なくとも１部を含有しかつこれらプラスミドの幾つか
がひと白血球インターフェロンの免疫学的もしくは生物
学的活性を有するポリペプチドの大腸菌における発現を
もたらすことを示している。また明らかなように、本明
細書に示したポリペプチドは蛋白質技術分野で周知され
ているように、本発明の範囲を逸脱することなく断片化
、改変もしくは誘導体化させることもできる。 本明細書に記載した方法により調製される微生物および
組替えＤＮＡ分子は、西ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン
所在のドイツチェ・ザンムルンク・フォノ・ミクロオル
ガニスメンに１９８０年１月７日に寄託した培養物を例
とし、ＨｃＩＦＡ−Ｅとして次のように同定されている
： Ａ：イ−・１すＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓ ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−４ｃ） Ｂ：イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓ ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−２ｈ） Ｃ：イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ３５） Ｄ：イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓ ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−ＳＮ４２）Ｅ：イー・コリ
ＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＫＴ２８７（Ｐｓ ｔ）／Ｈ
ｃ ＴＦ−２ｈ−ＡＨ６）これらの培養物はそれぞれ
寄託番号ＤＳＭ１６９９〜１７０３が付与されている。 さらに、本明細書に記載した方法により調製された微生
物およびＤＮＡ分子は、アメリカ合衆国メリーランド州
、ロックビル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに１９８０年３月２７日に寄託された培養
物を例としＨｃｌＦ−Ｇ−Ｈとして同定され、それぞれ
ＡＴＣＣ寄託番号３１６３３〜３１６３４が付与されて
いる： Ｇ：イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓｔ）／ＨｃＩＦ−■−２０６） Ｈ：イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓ ｔ） ／Ｈｃ Ｉ Ｆ−ＳＮ３５−ＡＨＬ本明細書
中に゛記載した方法によりｉｌｌ製したその他の微生物
は、西ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン所在のドイツチェ
・ザンムルンク・フォノ・ミクロオルガニスメンに１９
８０年１０月１日に寄託した培養物を例とし、）（ｃｈ
ｒＩＦ−Ａ−Ｊとして同定されかつ寄託番号ＤＳＭ１９
１４〜１９２３が付与されている二人。イー・コ・すＨ
Ｂ１０１におけるｃｈｒ３のサブクローン化Ｈｉｎｄ［
［断片； Ｂ、イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ１２のサブク
ローン化Ｅｃ ｏＲＩ断片； Ｃ，イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ１２のサブク
ローン化Ｈｉｎｄｌｌ［断片；Ｄ、イー・コリＨＢ１０
１におけるｃｈｒ１３のサブクローン化」ＬユＲ１断片
； Ｅ、イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ２３のサブク
ローン化ＥＣ０ＲＩ断片； Ｆ、イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ２３のサブク
ローン化ＨｉｎｄＩＩＩ断片；Ｇ、イー・コリＨＢ１０
１におけるｃｈｒ２６のサブクローン化ＥｃｏＲＩ断片
； Ｈ，イー・コリＨＢ １０１におけるｃｈｒ２６のサブ
クローン化ＨｉｎｄＩＩＩ断片；■、イー・コリＨＢ１
０１におけるｃｈｒ３５のサブクローン化ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片； Ｊ、イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ３５のサブク
ローン化ＢａｍＨＩ断片。 最後に、本明細書中に記載した方法により調製された微
生物は、アメリカ合衆国メリーランド州、ロックビル所
在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
１９８０年１２月１５日に寄託され、ＨｃｈｒｌＦ−に
−ＨｃｈｒＩＦ−ＱおよびＨｃｌＦ−１〜ＨｃｌＦ−に
として同定されかつそれぞれＡＴＣＣ寄託番号３１７６
０ＨｃｈｒｌＦ−に、３１７６１ＨｃｈｒＩＦ−Ｌ、３
１７６２ＨｃｈｒｌＦ −Ｍ、３１７６３ＨｃｈｒｌＦ
−Ｎ、３１７６４ＨｃｈｒｌＦ−０，３１７６５Ｈｃｈ
ｒＩＦ−Ｐ、３１７６６ＨｃｈｒｌＦ−Ｑ、３１７６７
ＨｃＩＦ−Ｉ、３１７６８ＨｃｌＦ−Ｊ。 ３１７６９ＨｃＩＦ−Ｋが付与されている：Ｋ、イー・
コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ２３のサブクローン化Ｔ
ａｃ−Ｔａｃ断片；Ｌ、イー・コリＨＢ１０１における
ｃｈｒｌＱｌのサブクローン化ＢｇｌＩｒ一旦」」、■
断片； Ｍ、イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒｌＱｒのサブ
クローン化Ｈｉｎｄｌｌ［−Ｈ１ｎｄ■断片； Ｎ、イー・コリＨＢ １０１におけるｃｈｒ２６のサブ
クローン化Ｂｇｌｎ−Ｂｇｌｎ断片：Ｏ，イー・コリＨ
Ｂ１０１におけるｃｈｒ３０のサブクローン化Ｈｉｎｄ
Ｉ［ｌ−ＨｌｎｄＩ［［断片； Ｐ、イー・コ、すＨＢ１０１におけるｃｈｒ１３のサブ
クローン化ＢｇｌＴ１−Ｔａｃ断片；Ｑ、イー・コリＨ
Ｂ １０１におけるｃｈｒ １６１のサブクローン化Ｂ
ｇｌＵ−Ｔａｃ断片；ＨｃＩＦ−１：イー・コリＤＳ４
１０ （Ｃ８−ＩＦＮ−α２） ＨｃｌＦ−Ｊ：イー・コリＤＳ４１０ （ＬＡＣ−ＡＵ
Ｇ （α２）） ＨＣＩＦ−に：イー・コリＤＳ４１０（β−Ｌａ ｃ
−ＡＵＧ （α２）） 以上、本発明を多くの具体例につき説明したが、この基
本的構成を変化させて、本発明の方法および組成物を利
用する他の具体例を提供しうろことが明白である。した
がって、本発明の範囲は例をもって前記した特定具体例
でなく、寧ろ特許請求の範囲により規定さるべきである
ことが了解されよう。
タＨａ ｅｍ−２０２ｂ、ｐ、断片を含有し〔ダプリュ
ートギルバート等、ｒＬａｃ抑圧剤のラクトースオペレ
ータ配列および作用」、蛋白質リガンド相互作用、エッ
チ・スンドおよびジー・ブラウアー編（ベルリン、ワル
ター・デ・グルイタ−）、第１９３〜２０６頁およびケ
ー・バックマン等、「試験管内において組替え処理を使
用するプラスミドに対する遺伝子発現の最大化」、セル
誌、第１３巻、第６５〜７１頁（１９７８））、その３
′末端にてＥＣＯＲＩリンカにより示される 】。１５
℃にて１６時間の後、固化ゲルにおいて結合が生じた〔
エッチ・レーラソハ、私的通信、１９８０〕、 １／１０容量の１００ｍＭ）リス−）ＩＣＩ（ｐｌ＋７
．５）、１００ｍＭ ＣａＣｌ２．１００ｍＭＭｇＣ
ｌ、を試料に加え、これを６５℃にて５分間加熱し、３
７℃まで冷却した。次いで、この試料を使用してＣａ″
″“処理イー・コリＨＢ１０１を形質転換させ、０℃に
て２０分間培養し、４２℃にて１分間および２０℃にて
１０分間加熱した。１モルのトリプトン培地を加えた後
、試料を３７℃にて６０分間培養しそしてアンピシリン
を含有する寒天板上に接種した。プラスミドＤＮＡをこ
れら培養物から前記のように分離しそしてＬＡＣ断片に
隣接する５′末端を持ったＩＦＮ−α１挿入物を含有す
るダブリドプラスミドを制限分析により同定した。次い
で、プラスミドを常法によりＥｃｏＲＩで開裂させかつ
エンドヌクレアーゼＢＡＬ−３１で切断させ（０，０６
０／ｍｌ、３０℃で２〜４分間）、ＬＡＣ断片の結合Ｅ
ｃｏＲＴ末端を除去しかつβ−ガラクトシダーゼコード
部分を短縮させた。 処理プラスミドが完全なＩＦＮ−α１コ一ド配列を含有
するのを確実にするため、次いでプラスミドを常法によ
りＢｇｌＩＩで開裂させ、上記のように後処理しそして
最大断片をアガロースゲル（０，８％）上で分離した。 次いで、この断片をＺ ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｈ
ｃＩＦ−ＳＮ３５からのＢｓｐｌ−ＢｇｌＩＩ断片と合
し、得られたヒブリドプラス、ミドを使用して上記のよ
うにイー・コリＨＢ１０１を形質転換させた。この形質
転換したコロニーをＩＦＮ活性につき選別し、高レベル
のＩＦＮ活性を有する１つのクローンを選択した。この
クローンをイー・コリＨＢ１０１ （Ｃ８−ＩＦＮ−α
１）およびそのダブリドプラスミドＣ３−ＩＦＮ−α１
と名付けた。 Ｃ３−ＩＦＮ−α１のＤＮＡ配列分析は、開始トリプレ
ットの後のコード配列がβ−ガラクトシダーゼの最初の
７ （ＩＩのアミノ酸と、融合により生成したＰｒｏ残
基と、ＩＦＮ−α１信号配列およびＩＦＮ−α１ （
ＳＮ３５）配列のアミノ酸１６〜２３とを決定したこと
を示している。ダブリドプラスミドＣ３−ＩＦＮ−α１
で形質転換させたイー・コリミニセル菌ｔ−（ＤＳ４１
０）は、未改変Ｚ ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｈｉｆ
−ＳＮ３５で形質転換させたミニセルと比較し、）ｌｕ
Ｉ ＦＨの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリ
ペプチドを１ｉ当り約５００万単位すなわち約２５００
倍多く生産する。プラスミドＣＢ−ＩＦＮ−α１により
生産されたポリペプチドのアミノ酸配列は、生産物がβ
−ガラクトシダーゼからの７個のアミノ酸と融合により
生じた１１１Ｉのアミノ酸とＩＦＮ−αｌに融合された
ＩＦＮ−α１信号配列のアミノ酸１６〜２３とを有する
融合蛋白質であることを確認させた。 さらに、本発明により蛋白質収量を向上させる種々の構
成の例を、他の型のＩＦＮ−αに関連して検討した（下
記〕、 ダブリドプラスミドで形質転換させた大腸の性質 １、トリプシンに対するＩＦＮ−α活性の感受性 標準１（ｕｒＦＮ−α（比活性、１，２ｘｌＯ’Ｕ／■
、５０Ｕ）ならびにイー・コリＨＢ１０１（Ｚ−ｐＫ７
２８７ （Ｐｓｔ）／ＨｃＴＦ−２０ｈ−ＡＨ６）の
５１００抽出９Ｊ （“Ｈｉｒ−２８７−６抽出物”）
（２００Ｕ／ｍｌ、ｌ０Ｕ）およびイー・コリＨＢ１０
１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ） ／Ｈｃ Ｉ
Ｆ−ＳＮ３５）の８１００抽出物（“）（ｉｆ−３５抽
出物”）（１０００Ｕ／ｍｌ、５０Ｕ）の試料５０μｌ
を、下記のように種々な量のトリプシンと共に、３７℃
にて３０分間培養した。５１００抽出物は高蛋白質含量
を有する一方、Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αはそうでないので、
ＨｕｌＦＮ−αと比較５１００抽出物Ｈｉｆ−３２との
混合物を並行的に試験した。 ｒＦＮ−α トリプシン ＩＦＮ−α１１ｕＩＦＮ
−α （５０，ｃｒｆ ０ ５０
の１ｌｉｆ−３２５１００抽 ０．１ ５０
出物中５０単位） １ ５０１１ｉｆ
−２８７−６５１００抽 ０ １５出物
（１０単位） ０．１ １５５０
Ｇ したがって、抽出物のＩＦＮ−αは、トリプシンおよび
したがって蛋白質に対し感受性である。 ｌ１ｉｆ−３５５１００抽出′ ０ ３０
物（５０単位’） ０．１ ２０２、
セファデックスｃ−ｔｏｏ上のクロマト抽出物Ｈｉ ｆ
−３５（１ｍｌ）およびイー・コリＨＢ１０１ （Ｚ
ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ Ｈｃ Ｔ Ｆ −３反
３２）の８１００抽出物（″Ｈｉｆ−３２抽出物”）を
３２ｍ１のセファデックスＧ−１００カラム上で、５０
ｍ Ｍ ｍ酸カリウム緩市液（ｐＨ７，４）にて４℃
でクロマトグラフにかけた。チトクロームｃ （０，２
■）を内部標識として加えた。流速を２ｍｌ／ｈｒとし
、１、Ｏｎｉｌづつのフラクションを集めた。２８０Ｉ
ｍおよび４０５Ｉｍ（チトクロームＣ）における吸光度
とＩＦＮ−α活性とを測定した。第７図に示すように、
Ｈｉｆ−３５抽出物のＩＦＮ〜α活性は、チトクローム
Ｃの前に、約０．４５のＫＤ値をもって溶出された。し
たがって、この物質の見掛は分子量は約２０，０００〜
３０．０００ （ヌクレオチド配列決定により、カルボ
キシ末端処理なしと仮定して測定した分子量は１９．３
８８）であり、比較抽出物）（ｉｆ−３２のフラクショ
ンには活性が検出されなかった。 遭− ＨｕｌＦＮ−ｏｒＣ比活性１．２Ｘ１０６１Ｕ／■）と
Ｈｉｆ−３５／Ｈｉｆ−２８７６の８１００抽出物とを
、１０％子牛血清を含む１００Ｉ！、ｉ？の改変イーグ
ル培地（Ｍ Ｅ Ｍ）中において、Ｈｕ Ｉ Ｆ Ｎ−
α〔ケー・カンチル、１９７６年２月２４日に調製、比
活性４５０．０００弔位／ｍｌ）に対する羊抗血清の種
々な希釈により３７℃で３０分間培養し、４５μｌを細
胞病理学的効果減少分析によりＩＦＮ−α活性につき分
析した〔抗体自身は細胞病理学的効果を起こさなかった
〕。 ＩＦＮ−α調製 抗−白血球イン 双音ＩＦＮｒＦＮ−
α（１０） ０ ５０．１８
〜０．５ ９ ＜０．１ ４５０ ＜０．１ ７（ｉｆ −３５抽出 ０１５物 （２５
） ０．１８ １５９
＜０．１ ４５０ ＜ ０．１ Ｈｉｆ −２８７−６０１５ 抽出物（２５） ０．１８ １５９
＜０．１ ４５０ ＜０．１ なし Ｏ＜ ０．１ ４５０ ＜０．１ 抗体の作用が、たとえば蛋白質分解のような非特異的作
用に基づくものでないことを示すため、ねずみインター
フェロン系を用いて同様な実験を行なった。 ＩＦＮａ製 抗−白血球イン ＩＦＮ活性ねずみ調
製物 ４５００ １００（１００単位
） ９０ １００かくして、特にＨ
ｕＩＦＮ−αに向けられた抗体は、ＨｃＩＦ−２ｈ
ＤＮＡ配列を含有する成る種の組替えＤＮＡ分子により
形質転換させた大腸菌で生産されるポリペプチドのＩＦ
Ｎ−α活性を阻害する。大腸菌で生産されたＩＦＮ−α
に対する抗体の明らかな低親和性は、これと天然Ｈｕ
Ｉ ＦＮ−αとの間の構造上の相違を反映し、たとえば
内水化物成分の不存在、信号配列の存在またはβ−ラク
タマーゼ配列の一部に対する融合を反映する。 ひとｃｃＬ２３ｆｌｌ胞またはねずみＬ９２９に■胞を
イー・コリ抽出物、ＨｕｌＦＮ−α〔ケー・カンチルの
方法により調製、比活性１．２ｘ１ｏｓ’ｌｉ位／ｍｇ
Ｅ マタハネｆミＩ Ｆ （Ｎ、 Ｉ 、 ＩＩ、
ｉｌＪ準）で処理し、これにつ・イルスを接種しくひと
細胞の場合はメンゴウィルスを用い、ねずみ細胞の場合
はＶＳＶを用いた）、そしてＩ ＦＮ＝α活性を細胞病
理学的効果減少分析によって測定した。 。 ねずみ−インターフェ １２０ロン（１
２０１！を位／慴１） ）１ ｉ ｆ −３５抽出物 １００ １３
１（ｉ ｆ −２８７−６抽出物 ３０４Ｈｕ
夏 ＦＮ −ｏｒ １００
４（１００単位／ｍ１） １１ｕｌＦＮ−ｔ！ １０００ ４０
（１０００単位／ＩＷｌ） これらの結果は、１（ｉｆ ３５およびＨｉｆ−２８
７−６抽出物がひと細胞に対し保護作用を有しかつねず
み細胞に対し圃く僅かの効果（〜１０％）しか持たない
ことを示しており、これはひとインターフェロンに対し
典型的なことである。 ５、幾つかの細胞機能に対する効果 イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ
）／Ｈｉｆ ５Ｎ３５ ＡＨＬ６）からの抽出物を
、幾つかの細胞機能に対する効果につき、標準ＩＦＮと
比較した。イー・コリ製のＩＦＮ−αは、天然ＩＦＮ−
αの次の性質を示した：（１）ひとリンパ球の自然致死
活性を高め、（２）抗体依存性の細胞媒介される細胞毒
性を高め、（３）抗原−およびミトゲン−誘発される白
血球移動阻害を抑制し、１かつ！４） Ｉ Ｆ Ｎ−感
受性バーキソト（Ｂｕｒｋｉ Ｌｔ ）リンパ腫細胞の
成長を抑制する。これら性質は、ひと腫瘍および癌に対
する大腸菌合成されたＩＦＮ−α１活性を示唆する。 アミン末＆ｊＪ配列のないＩＦＮ−αもまた大腸菌で作
られ、ＩＦＮ活性と一致する活性を有することが示され
た。 適当な組替えＤＮＡ分子を作成するため、プラスミドＨ
ｉｆ−２ｈ（上記）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによ
り部分的に切断し、そしてＩＦＮ−α１コ一ド配列を含
有する断片をアガロースゲルで分離し、Ｈｉｆ−２ｈ（
上記）と比較してダブリド挿入物の３′末端に隣接した
ＰｓｔＩ部位を欠失するプラスミドＨｉ ｆ−ＳＮ３５
のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限から得られた非−ＩＦＮ
−α１コ一ド配列と混合した。次いで、得られたプラス
ミドをＰｓｔＩ／Ｂｇ１■により処理してＩＦＮ−α１
コ一ド配列のアミノ末端部分を除去した。その個所に、
ｐｖｕ■によるプラスミドＨｉｆ−２ｈの切断と、Ｂａ
ｌエンドヌクレアーゼによる処理と、Ｐｓｔ■リンカ−
の結合と、Ｂｇｌｎによる制限とにより調製された一連
のＩＦＮ−α１断片を挿入した。このようにして得られ
たプラスミドは、そのアミノ末端配列の種々な部分を欠
失した一連のＩＦＮ−α１コ一ド配列を含有していた。 これらの１種（プラスミド２Ｈ−Ｍ８）を旦ユ」■で切
断して、そのヌクレオチド配列を決定した。この配列は
、プラスミド２ Ｈ−Ｍ ８がＰｓｔ部位とＩＦＮ−α
１の第一コトン（ＣＹＳ）との間に数四のヌクレオチド
を有することを示し、た。したがって、ＰｓｔＩ切断さ
れたプラスミド２Ｈ−Ｍ８をＴ４ポリヌクレアーゼ／ｄ
ＡＴＰ。 Ｓ１エキソヌクレアーゼで処理しそして５ａｌＩにより
切断させた。この過程は一連の断片を形成し、そのＩＦ
Ｎ−α１コ一ド配列はアミノ末端部分を欠失していた。 次いで、これらの断片を、Ｅｃ ｏＲＩによる切断とエ
キソヌクレアーゼＳ１による処理と５ａｌＩによる切断
とで ゛プラスミドＬａｃ３Ｖ８から調製したＧＵＡ−
ＬＡＣ断片に作用結合させることにより、ＬＡＣ制御下
に置いた。かく得られた一連のプラスミドは、ＬＡＣプ
ロモータを含有する断片にＡＵＧを介して反時計方向に
結合したアミノ末端の種々な部分を欠失するＩＦＮ−α
１コ一ド配列を有した。 これらプラスミドの幾つかを配列決定した。 一つはＩＦＮ−αｌの第５番目のアミノ酸から開始し、
一つはＩＦＮ−α１の第１０番目のアミノ酸から開始し
た。イー・コリ・ミニセル（ＤＳ４１０）において、こ
れらプラスミドの両者はＩＦＮ活性を示すポリペプチド
を生産した。したがって、必ずしも全てのＩＦＮ−α１
蛋白質がＩＦＮ活性のため必要とされるとは限らない。 配列は次のように作成した： （１） Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ ｓ ｔ） ／Ｈｅ
Ｉ Ｆ−２ｈ（プラスミド Ｈｉｔ−２ｈ）をＥｃｏＲ
ＩおよびＢ ａ ｍ ＨＩで部分制限した。これにより
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位からＤＮＡ断片を作成し
く第１図）、これはＩＦＮ−α信号を介して延びかつプ
ラスミドＨｉｆ−２ｈの配列をコードすると共にプラス
ミドＨｉ ｒ −２ｈの■Ｆｉ−α挿入物における３′
非コード化領域に位置するＥＣｏＲＩ部位で終端する（
第４図および第１０図のヌクレオチド６８５−６９０を
参照〕、 （２）次いで、この１ＩＩｒ片をプラスミドＨ’＋ｆ−
ＳＮ３５のＥ ｃ ｏ ＲＩ ／ Ｂ ａ ｍ ＨＩ断
片と結合させた。このＥ ｃ ｏ ＲＩ ／ Ｂ ａ
ｍ ＨＩ断片は最初の断片の逆であって、ＩＦＮ−αの
３′非コード領域におけるＥｃｏＲ１部位から初期のｐ
ＢＲ３２２を介してｐＢＲ３２２の１土！ＨＩ部位まで
延在する。プラスミドＨｉｆ−２ｈからの断片と結合さ
せれば、得られるプラスミド（Ｈｉ ｆ−ＳＮ３５）は
Ｉ ＦＮ−α配列の３′末端におけるＰｓｔ１部位を欠
失し、Ｈｉｆ−２ｈのＩＦＮ−α信号配列に対する完全
なコード配列を有する。 （３）次いで、得られたプラスミドをＰｓｔ Ｉおよ
びＢｇｌＩＩで制限してＩＦＮ−αコード領域における
Ｂｇ１１１部位（第４図および第９図のヌクレオチド３
１３−３１８を参照）からｐＢＲ３２２由来の配列を介
してＬ土」■部位まで延びる断片を作成した。かくして
この配列は、ＩＦＮ−αの５′非コード領域とＩＦＮ−
αの信号配列をコードする領域とＩＦＮ−αの５′コー
ド領域の１部とを欠失する。 （４１１ＦＮ−αのアミノ末端をコードする配列の１部
を欠失したＤＮＡ配列を作成するには、上記（３）で作
成した配列をアミン末端コード領域の１部を欠失するよ
う作成した一連の配列と組合せる必要がある。 これを行うため本発明は巳ヱユ■でＨｉｆ−２ｈを開裂
させ、このエンドヌクレアーゼはプラスミドをＩＦＮ−
αの信号配列をコードする領域の中間で開裂する（第８
図のヌクレオチド９７−１０３を参照〕、次いで、この
配列をＢａｌエキソヌクレアーゼによって処理した。こ
の処理により一連のＤＮＡ配列が生ずると思われ、その
幾つかはＩＦＮ−αコード配列のアミノ末端領域におけ
る種々の部位から開始する。これはＰｖｕｆｆ部位とｒ
ＦＮ−αコード領域の開始部位との間に位置子る信号配
列の２５個以上のヌクレオチドを切断する必要がある（
第８図を参照〕、このＢａｌ切断の結果につき分析する
ため、切断配列の両末端に対しｐｓＬＩリンカを最初に
付着させ、次いでＢｇｔ■で制限した。 この結果、この１見ユ切断の際に除去されなかったＩＦ
Ｎ−α配列の第１ヌクレオチドにＰ Ｓ ｔ Ｔ １３
ンカが接続した小型のＤＮＡ配列が生じ、この配列はＩ
ＦＮ−αコード領域からＢｇｌｎ部位まで存在する。要
するに、これらの断片を上記（３）の配列に結合させる
と、ＩＦＮ−α配列がＢｇｌｎ部位で再構成され、Ｐｓ
ｔｌリンカは前記小型断片の他端部を上記（３）のＤＮ
Ａ配列のＰｓｔｌ制限断片に結合させる。その結果、Ｈ
ｉｆ−２ｈと比較して、Ｐｖｕ１１部位からＩＦＮ−α
のコード領域まで存在するヌクレオチドの幾つかを欠失
する（Ｐ、ａ＋切断のため）プラスミドが作成される。 （５） このように作成されたプラスミドの１種（２
Ｈ−Ｍ８）を分析用に選択した。しかしながら、このプ
ラスミドにおいてはＢａｌ切断が充分に行われておらず
、信号配列の幾つかのヌクレオチドがまだ残存していた
。従って、これをｐｓｔｒで開裂させかつ再び切断して
信号配列に残存する全てのヌクレオチドとＩＦＮ−αの
アミノ末端部分をコードする少な（とも幾つかのヌクレ
オチドとを除去した。この切断には、Ｓ１エキソヌクレ
アーゼを使用した。次いで、得られた切断断片をＬａｃ
３Ｖｇからの発現制御配列の制御下において発現させた
。 の同定 標準リンパ芽球細胞インターフェロン〔ズーン等（上記
）ならびにエム・フンカピラーおよびエル・フード（上
記）〕と）（ｉｆ−２ｈｌ析片から推定された配列との
最初の３５（ＩＭのアミノ酸を比較すると９ ｆ［！ｉ
ｔの相違が示される。全ての場合、相違するアミノ酸に
対するコドンは、ワンベース（ｏｎｅ−ｂａｓｅ）変化
により関連さ廿うるであろう。一方の標準リンパ芽球細
胞インターフェロンについて直接に決定されたアミノ酸
組成と、他方のＨｉｆ−２ｈ断片の配列から推定される
ものとでは、それらの０１７ ％ Ｐ ｒ ｏ 。 ＣｙｓおよびＭｅｔの含有量に関して顕著な相違を示す
、これらの相違は多形現象では説明し得ない程大きい、
寧ろ、それらは、少なくとも２つの非対立遺伝子の存在
を反映していると思われる。何故なら、これら２種の蛋
白質の相違程度（２６％差）は、たとえばひとと羊との
間のβ−グロビンのそれ（２３％差）に近似する。 したがって、前記に同定された（上記）断片ＩＴ ｉ
ｆ −４ｃに対する弱いダブリド化を示したクローンを
検査し、クローン・イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐ
ＢＲ３２２（Ｐ３ ｔ） ／Ｈｃ Ｉ Ｆ−ＩＩ −２
０６）を同定した。 このクローンのダブリドブラスミドＺ−ｐＢＲ３２２（
Ｐｓ ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−ＩＩ−２０６（Ｈｃ ＩＦ−
ＩＩ−２０６’″）およびそのＤＮＡ挿入物（“Ｈｉｆ
−ＩＩ−２０６断片”）は、Ｈｉ ｆ −４ＣおよびＨ
ｉｆ−２ｈ断片に弱くヒブリド化している。プラスミド
Ｈｉｆ−１−２０６で形質転換させた大腸菌（イー・コ
リ）はＨｕｌＦＮ−αの生物学的もしくは免疫学的活性
を示すポリペプチドを生産する。Ｈｉｆ−Ｉ［−２０６
断片は、Ｈｉｆ−２ｈ断片について決定されたものとは
異なる制限地図を有する。 これら２ｒｉの制限地図の比較を第１１図に示す。 ここでも、Ｈｉｆ−ｍ−２０６ＷＴ片における制限部位
の絶対的位置は、制限地図化だけでは決定されない。し
かしながら、上記した標準法を用いる、この挿入物のヌ
クレオチド配列に関する配列決定は、これら位置の−Ｎ
絶対的な決定を可能にする。しかしながら、Ｈｉｆ−２
ｈ断片と比較してＨｉｆ−ＩＩ−２０６断片の制限地図
には差があるので、これら２ ｆ！：の挿入物のインタ
ーフェロン遺伝子は異なるヌクレオチド配列を有するこ
とが明らかである。 第１２〜１６図を参照すれば、培養物ＨｃｌＦ−Ｇの挿
入ＤＮＡ配列（Ｈｉｆ−ＩＩ−２０６断片）と培養物Ｈ
ｃＩＦ−Ｅ（下記）の挿入ＤＮＡ配列（Ｈｉｆ−２ｈ断
片）との上記で決定されたヌクレオチド配列ならびにこ
れらヌクレオチド配列によりコードされた蛋白質の対応
アミノ酸配列が示されている。Ｈｉｆ−ＩＩ−２０６断
片、すなわち文献〔エフ・エム・ウィルキー等、ヌクレ
イツク・アシッド・リサーチ、第７＠、第８５９〜８７
７頁（１９７９））に記載された方法Ｂの手順を使用し
て培養物ＨｃｌＦ−Ｇから単離したプラスミドＤＮＡの
Ｐｓｔｌ断片（７９０ｂｐ）のヌクレオチド配列を、ニ
ー・エム・マキサムおよびダブりニー・ギルバートの標
準法（上記）を用いて決定した。用いた配列決定法を第
１７図に示す。 制限ＤＮＡ （通常約１０μｇ）を、文献〔エフ・マン
ティ等、ジーン誌、第１０巻、第１〜１０頁（１９８０
））により記載されているように５′末端標通した。標
識断片を第二の制限酵素で開裂させ、生成物をトリス−
硼酸−ＥＤＴＡ緩衝液における５％ポリアクリルアミド
ゲルにより電気泳動にかけて分離し〔ニー・シー・ピー
コックおよびシー・ダブりニー・ジングマン、バイオケ
ミストリー、第６巻、第１８１８〜。 １８２７頁（１９６７））、ゲルから抽出しそして文献
〔ダブリュー・ミエーラー等、ジャーナル・モレキュラ
ー□・バイオロジー、第１２４巻、第３４３〜３５８頁
（１９７Ｂ））に記載されているように精製した。 第１７図を参照して、配列決定用の各種断片を次のよう
に調製した： ２５および２６−−ＰｓｔｌによるＨｉｆ−Ｕ−２０６
の開裂、標識化、ＢｇｌｌＩによる開裂、ならびにＰｓ
ｔｌ＊−Ｂｇｌｌ［断片（２５７ｂｐ）（“２５”）と
Ｐｓｔｌ＊−Ｂｇｌ■断片（２７９ｂｐ’）（“２６１
）との単離：２１．２２および２３−−ＰｖｕＩＩによ
るＩＩ ｉ ｆ −１１−２０６の開裂、標識化、Ｂｇ
ｌＩＩによる開裂、ならびにＰｖｕｌＩ＊−Ｂｇ ｌ
Ｉｒ断片（８８ｂｐ）（“２１”）とＰｖｕＩＩ＊−Ｂ
ｇＩＩ［断片（１７６ｂｐ）じ２２′）とＰｖｕｌ＊−
Ｂｇｌｌｌ断片（２１４ｂｐ）（“２３”）との単離； １１Ｓ１２．１３および１４−−ＢｇｌＩＩによるＨｉ
ｆ−ＩＩ ２０６の開裂、標識化、シ」Ｉによる開裂
ならびにＢｇ Ｉ Ｉ［＊−Ｐｓ ｔ Ｉ断片（２７９
ｂｐ）（“１４′″）および乱盈ユ■＊−Ｐ３ｔＩ断片
とＢｇ Ｉ ｌｌｌ一旦１」■＊断片との実移動性混合
物の単離、ＰｖｕＩＩによるこの混合物の開裂ならびに
Ｂｇｌ■＊−ｐｓｔＩ断片（２５７ｂｐ）（“１３”）
とＢｇ ｌ ＩＩ＊−ＰｖｕＩ［断片（１７６ｂｐ）（
“１２”）とＢｇ １１１＊−ＰｖｕＩ［断片（８８ｂ
ｐ）（１１”）との単離； ２７Ｌ、２７Ｕ、４１．４３．４４および４５−−Ｈｉ
ｎｆｌによるｌ１ｆ−ＩＩ−２０６の開裂、標識化なら
びに先駆体断片： Ｈｉ ｎ ｆ ［＊−Ｈｌｎｆ ｒ
＊（１１３ｂｐ）（”２７Ｐ”）、１１ｉｎｆ ｒ＊−
Ｉ（ｉｎｒ ｌ＊ （１４６１１１））（″ ２８ Ｐ
″ ） 、 ■（ｉｎｒ Ｔ＊−Ｈｌｎｒ Ｉ
：ｈ（１５９ｂｐ）（”３０Ｐ”） 、Ｈｉｎｆ ｌ＋
ｌ＜−Ｈｌｎｆ Ｉ＊ （３９７ｂｐ）（”３ＩＰ”）
、およびＨｉｎｆ Ｉ＊−Ｈｌｎｆ Ｉ＊ （１５２２
ｂｐ）（３２Ｐ”）の単離。Ｍ ｂ ｏ Ｕによる２８
Ｐの開裂ならびに断片ＨｉｎｆＩ＊−Ｍｂ。 ｎ （１１２ｂｐ）（”４１″）の単離。Ｍ ｂ 。 ■による３０Ｐの開裂ならびに断片Ｈｉ ｎ ｆ Ｉ
＊−ＭｂｏＩＩ （１２６ｂｐ） （“４３”）の
単離。 Ｐｓｔｌによる３１Ｐの開裂ならびに断片Ｈｉｎｆ１＊
−ＰｓｔＩ （１５１ｂｐ） （“４４”）の単離。ｐ
ｓｔｌによる３２Ｐの開裂ならびに断片Ｈｉｎｆ ｒ＊
−Ｐｓ ｔ Ｉ （１３９ｂｐ）（４５”）の単離。２
種のストランド （“２７Ｕ”および２７Ｌ”）を得るための２７Ｐのス
トランド分離。 ２７Ｕおよび２７Ｌ以外の全ての断片を、両ストランド
に関し配列決定し、しかも位置１８５におけるＢｇ１１
１部位以外につき配列決定用の起源として役立つ制限部
位にわたって決定した。 ２種の挿入物によりコードされたアミノ酸配列を比較す
れば明らかなように、Ｈｉｆ−ｆｆ−２０６断片はＨｉ
ｒ −２ｈ断片におけるよりもアミノ酸の１個少ない
インターフェロン状蛋白質をコードする（Ｈｉｆ−２ｈ
に存在するアミノ酸４４ （Ａｓｐ） が）Ｔｉｆ−Ｉ
Ｉ−２０６には欠如している〕、さらに、２種の断片に
おけるヌクレオチド位置の１０％と誘導アミノ酸残基の
１７％とが異なる。 さらに、リンパ芽球細胞インターフェロンのアミノ末端
につき決定された３５個のアミノ酸〔ケー・シー・ズー
ン等、サイエンス、第２０７巻、第５２７〜５２８頁（
１９８０））と比較して、挿入物Ｈ４ｆ−ＩＩ−２０６
はズーン等（上記）により決定された３５（Ｉｌのアミ
ノ酸残基とは５個の残基において異なる蛋白質をコード
する。したがって、白血球型（α型）の少なくとも３種
の異なるＩＦＮ遺伝子、すなわぢＨｉｆ−２ｈ断片とＨ
ｉｆ−ＩＩ−２０６断片とズーン等のＩＦＨに対する遺
伝子被覆とが存在する筈である。インターフェロンの新
たに提案された命名法によれば、以下、これら遺伝子に
よりコードされる蛋白質を次のように同定する：ＩＦＮ
遺伝子源 蛋白質 Ｈｉ ｆ−２ｈ Ｔ ＦＮ−αＩＩ（ｉ
ｆ−Ｕ ２０６ ＩＦＮ−α２リンパ芽球細
胞からの ｔＦＮ−α３ＩＦＮ（ズーン等、上記） ＩＦＮ−α１とＩＦＮ−α２との間の差は、ひとＣＣＬ
２３と牛脂生腎（ＢＥＫ）細胞とに対すみそれらの異な
る活性にも反映される。 Ｈｉ ｆ−ｎ ２０６ １．７ １．０ １
．７： １（［ＦＮ−α２） Ｈｉ ｆ −ＳＮ３５＊ ＊ ０．０５ １．０
１ ： ２０（ＩＦＮ−α１） ＊ ヒブリドプラスミドを含有する・イー・コリＨ［３
１０１を、トリプトン培地において振とうしながら約１
〜２のＯＤ６５０まで増殖させた。細胞を収量し、秤量
し、初期培養容量の１／１００もしくは１／２０に再懸
濁させそしてリゾチーム−凍結−解凍法により溶菌させ
た〔ニス・ナガタ等、ネイチャー誌、第２８４巻、第３
１６〜３２０頁（１９８０）〕、ミクロ測定板における
ｃｐｇ減少分析法により５−３０上澄液を試験した。比
較細胞からの抽出物は陰性であった（＜１ １０／ｍｌ
〕、ひとＣＣＬ２３細胞と牛脂生腎（ＢＥＫ）１ｍ胞（
フロー）とをＭＥＭ−１０％胎生牛血清中で生育させた
。ＩＦＮ含有抽出物に対する露出を２４時間行なった。 ｓｉｔ胞をメンゴウイルスの適当な希釈物によって処
理し、２４時間後に染色した。数値を、既知測定値の部
分精製された白血球ＩＦＮ（３１製物ＰＩＦ、ケー・カ
ンチルにより寄！！ｌ）と比較して肉眼的に推定した。 この調製物は生細胞に対するよりもひと細胞に対し約３
倍活性が大であった。 ＊＊Ｈｉｆ−ＳＮ３５とＨｉｆ−２ｈとの制限地図を比
較すれば、それらが相互の多形質変種であることが示唆
される（上記〕、したがって、ＩＦＮ−Ｃ１はＩＦＮ−
Ｃ２よりも、ひと細胞に対して約３０倍低い活性を有す
る。しかしながら、これら両者は共に、生細胞に対しほ
ぼ同等の活性を有する。したがって、ＩＦＮは、ひとに
おける抗ウィルス剤および抗腫瘍もしくは抗癌剤として
の使用に加え、牛におけるこれらの病状を処置するにも
有用である。 たとえば、Ｈｕ Ｉ ＦＮ−αの調製物は、牛における
ＦＭＤＶおよびその他周知のウィルス感染を処置する際
、標準法（上記）で使用することができるであろう。こ
のことは特にＩＦＮ−Ｃ１について云えることである。 何故なら、生細胞に対するその活性がひと細胞に対する
活性よりも約２０倍高いからである。 次に、第２８図を参照して、プラスミドＣＢ−ｒＦＮ−
α２を高収率で作成する手順を示す。 構成Ｃ８（上記）を有するＩＦＮ−Ｃ１の場合改善され
た収量が得られたので、ＩＦＮ−Ｃ２についても同様な
構成を作成した。Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｈｉｆ
−ＩＩ−２０６をＢｓｐ■により完全にかつｐｖｕＩ
［により部分的に（Ｐｉにて）開裂させ（第２８図）、
８６７ｂｐの断片を６％ポリアクリルアミドゲルで単離
し２５９０ｂｐの断片に結合させた。得られたヒブリド
プラスミド（ＣＢ−ＩＦＮ−Ｃ２）を使用してイー・コ
リＨＢ１０１を形質転換させ、クローンをＩＦＮ活性に
つき選別し、た。高活性を示す１つのクローンを選択し
、イー・コリＨＢ１０１ （Ｃ８−ＩＦＮ−Ｃ２）と名
付けた。 ヒブリドプラスミドＣＢ−ＩＦＮ−α２のＤＮＡ配列決
定は、このプラスミドがＣ３−ＩＦＮ−Ｃ１と同様に開
始コドンに続いてβ−ガラクトシダーゼの最初の７個の
アミノ酸と２個のＤＮＡ断片の融合により生じたＰｒｏ
残基とＩＦＮ−Ｃ２信号配列のアミノ＠１６〜２３をコ
ードするＤＮＡ配列とに関するＤＮＡ配列を有すること
を示した。したがうて、ここでもＩＦＮ−Ｃ２を含有す
る融合蛋白質が発現されると思われる。この事実は、こ
のプラスミドで形質転換された宿主により発現されるＩ
ＦＮ−αが融合蛋白であることを示唆する。 このプラスミドにより形質転換されたミニセルはＩＦＨ
の１１当り１００〜２００Ｘ１００万単位を与え、或い
は未改変Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｈｉｆ−ＩＩ
２０６により形質転′換されたミニセルよりも２０．
０００〜４０．０００倍高いＩＦＮ−Ｃ２の収量を与え
る。 Ｃ３−ＩＦＮ−Ｃ１（５０Ｘ１０’単位／１）とＣ３−
ＩＦＮ−Ｃ２（１００〜２００Ｘ１００万単位／ｌ）と
の相対的収量を比較すると、先ず驚くことに、ＩＦＮ−
Ｃ２はひと細胞（上記）に対しＩＦＮ−Ｃ１よりも約３
０倍高い活性を示した。しかしながら、これら２種の０
８プラスミドで形質転換させたミニセルにより生産され
る２種の蛋白質の量の定量分析は、ＣＢ−ＩＦＮ−α１
においてはＣＢ−ＩＦＮ−α２におけるよりも約５〜６
倍多い蛋白質が生産されてい・ることを示した。したが
って、ＩＦＮ活性を基準として測定した収量は、ＣＢ−
ＩＦＮ−α１の場合生産された蛋白質がずっと多い量だ
けずれていた。 次に第２６図を参照して、ＩＦＮ−α２の収量を向上さ
せる試みの他の構成を記載する。先ず、公知ｌａｃプロ
モータをＡｌｕｌで制限しかつ第２７図に示したような
断片（１つの末端につき）をＥｃ ｏＲＩリンカ−（共
同研究により調製）で伸長させることにより、ＬＡＣＡ
ｌｕ断片を含有する発現プラスミドを調製した。次いで
伸長した断片をｐＢＲ３２２のＥｃ。 ＲＩ部位に挿入し、そしてＥｃｏＲＩ−Ｅｃ。 Ｒ１断片を構造から削除した。第２６図に４０４として
示された得られたプラスミドをＨｉｎｄｍおよびＰ Ｖ
１１■で開裂させてＩＦＮ−α２含有断片を挿入した
。このＩＦＮ−α２断片は、Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔ）／Ｉ（ｃ ＴＦ−Ｕ−−２０６（第２６図における
“２０６”）の部分的Ｓ ａ ｕ ３ Ａ制限と、）ｌ
ｉ ｎｄＴＩＴリンカ−による５ａｕ３Ａ断片の伸長
く第２７図）と、ＢＳｐＩでの開裂とにより鋼製した。 この断片をＨｉｎｄｍ−ＰｖｕｌＩ開裂されたプラスミ
ド４０４に挿入した後、得られたプラスミドをＨｉｎｄ
’ｌ［ＩとＥｃ ｏＲＩとで制限し、Ｓ１ヌクレアーゼ
で処理してＬＡＣプロモータをＩＦＮ−α２遺伝子に近
接させかつ再結合させた。この構造は、ＬＡＣプロモー
タの制御下においてＩＦＮ−α２ＤＮＡ配列を有する。 さらに、ＩＦＮ−α２配列は、そのプロモータの開始Ａ
ＵＧコドンの直後となる（第２７図参照〕、したがって
、これらプラスミドにより生産されたＩＦＮの少なくと
も一部は成熟ＩＦＮ、たとえば信号配列からの如何なる
アミノ酸をも含まないＩＦＮである。 ミニセルにおいて、これらプラスミドの１種であるＬＡ
Ｃ−ＡＵＧ （α２）により得られたＩＦＮ−α２の収
量はＩＩ当り５〜１０ｘ１００万単位であった。 同様な結合原理に基づいて池のｒＦＮ−α２構造をも作
成した。ここでは、ｐＢＲ３２２のペニシリナーゼ発現
制御配列は、ＡＵＧ開始コドンを介してＨｉ ｆ−ＩＩ
−２０６＊からのＩＦＮ−α２遺伝子に結合されている
。 ＊ この構造は、ＭｂｏＩ［によるｐＢＲ３２２の部分
的切断と８１での処理と上記したようなＥｃ ｏＲＩリ
ンカ−の結合とｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に対する
断片の再挿入と１つのＥＣｏＲＩ部位の削除とにより最
も効果的に作成できる。次いで、得られたプラスミド（
“β−ｌａｃ−ＡＵＧプラスミド”）を、前記したよう
な２０６のＳ１処理（緩和に）されたＨ ｉ ｎ ｄ
ｍリンカ−−ＢｓｐｌＬｆｒ片と組合せることができる
。ＥＣ□ＲＩで開裂させかつＳｌとホスファターゼとで
処理した後、発現プラスミドβ−ｌａｃ−ＡＵＧ（α２
）を単離する。 他の遺伝子による構成は、単に構成β−１２ａ ｃ−Ａ
ＵＧプラスミドを使用して他の遺伝子もしくは構造を挿
入させることにより、或いはより好ましくはプラスミド
β−７ａｃ−ＡＵＧ （α２）自身に５ａｕ３Ａ部位を
使用することにより、同様に行なうことができる。 このプラスミドは、β−ｊ！ａｃ−ＡＵＧ（α２）と名
付けられ、宿主細胞を形質転換させるため使用すると、
他の蛋白質配列に融合することなくＩＦＮ−α２の生産
をもたらす。ミニセルにおいて、１ｉ当り５０〜１００
ＸＩＯＱ万単位の収量が観察された。このプラスミドは
、本発明により使用するのに最も好適なプラスミドであ
る。これはまた、本明細書中に記載した他のＩＦＮ−α
遺伝子と共に使用するにも好適である。本発明において
好適な宿主は、イー・コリＤ Ｓ ４１０ （ａｒａ
ａｚｉｄｅ ＴｏｎＡ ｌａｃ ｙ Ｔｓｘｓｉｎ ａ
ｗｉｎ ｂ ｇａｌλ ｘｙｌ ５ｔｅｐＲ）である
。この菌株は、好適プラスミドβ−／ｌａｃ−ＡＵＧ（
α２）の例と共にＨｃｌＦ−にとして寄託されている。 各種の１０モ一タ配列と、リポソーム結合部位と、シャ
・インーダルガルノ配列と、プロモータとＡＵ（１，開
始コドンと間のＤＮＡ配列とを使用しかつ本明細書中に
記載した各種のＩＦＮ−α遺伝子とを使用する他の構成
をも、同様の方法と原理とにより作成できる。勿論、こ
れらの構成も本発明により実現され、本発明の範囲内で
ある。 ＩＦＮ−α１およびＩＦＮ−α２のダブリド分子 ＩＦＮ−α１およびＩＦＮ−α２の多数のダブリド分子
を作成した。驚くことに、これらダブリド構造体は、そ
れらの親であるＩＦＮ−α１またはＩＦＮ−α２のいず
れかと比較して、定量的に異なる性質と活性とを有する
。 第２８図を参照すれば、４種のこれらダブリド分子の構
造の略図が示されている。便宜上、これらダブリド分子
をプラスミド■、■、■および■と名付ける。これらの
溝造体において、制限酵素（Ｂｓｐｌはキツス博士から
寄贈され、その池のものはビオラブ社から得られた）に
よる切［折を、供給者により推奨されているように行な
った。部分的ＤＮＡ開裂は酵素量を減少させて行なった
。制限酵素を熱失活（６５℃、３０分間）させた後、試
料を５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８＞にてｇ製し、必
要に応じ子牛腸アルカリホスファターゼ（ベーリンゲン
社）（ＤＮＡ１μｇ当り１容量）を加えた。３７°Ｃで
３０分間の後、試料をフェノールとエタノールとで抽出
した。大抵の場合、ＤＮＡ断片を低温度ゲル化アガロー
ス（０，８％）にて分離させた。結合のため、断片含有
のゲル片（それぞれ約２０μｌ）を６５℃で熔融させ、
３７°Ｃに冷却しそして１μｌ当り２０ＵのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを加えた。 混合物を１５℃にて１６時間保ち、固化ゲルにおいて結
合を生ぜしめた〔エッチ・レーラソハ、私的通信（１９
８０）〕、１／１０容量の１００ｍＭｌ−リス−〇 Ｃ
１（ｐｌ＋７．５ ）と１００ｍＭのＣａｃＩ２と１０
０ｍＭのＭｇＣ＋２とを加え、試料を６５℃にて５分間
加熱しそして３７℃まで冷却した。次いで試料をＣａ“
処理されたミニセルに加え、０℃にて２０分間培養し、
４２℃にて１分間および２０℃にて１０分間加熱し、そ
して１ｍｌのトリプトン培地を加えた。３７℃にて６０
分間培養した後、適当な抗生物質を含有する寒天板の上
に培養物を載置した。全てのプラスミドをＩＦＮ配列に
おける接合部にわたりヌクレオチド配列を分析して特性
化した。 ダブリド分子Ｉ、すなわちα−１（Ｐ ｖ ｕ ＩＩ）
α−２ヒブリドをＰｖｕｎによるＣ３−ＩＦＮ−α１
（上記）（第２８図におけるＣ８−α１）の部分的開裂
により作成し、脱燐酸化させ、ＰＳｔｌにより開裂させ
そしてＰｓ ｔ Ｉ−ＰｖｕＩＩ （Ｐ２）１３４６ｂ
ｐの断片を単離した。この断片を１、ｐｖｕｎでのＣ３
−ＩＦＮ−ａ２（上記）（第２８図におけるＣ８−α２
）の完全開裂とＰｓｔｌでの部分開裂とにより調製され
た２１３５ｂｐのＰｓ ｔ Ｉ （ａ） −ＰｖｕＩ
Ｉ（Ｐ２）断片に結合させた。 ヒブリド分子■、すなわちα−１（ＢｇｌＵ）α−２ヒ
ブリドは、ヒブリド分子ＩをＢｇｌＩＩにより開裂させ
て作成した。脱燐酸化の後、大きなりｇｌＩＩ断片を単
離してこれをＣ３ｉＦＮ−α２の小さな旦エユ■断片に
結合させた。クローン化の後、正しい方向性にて小さな
りｇｌ■断片を有するヒブリドブラスミドを制限分析に
より同定した。 ヒブリド分子■、すなわちα−２（Ｐ ｖ ｕ Ｉ［）
α−１ヒブリドは、Ｃ３−ＩＦＮ−α１をＰｖｕｎで部
分開裂させ、脱燐酸化し、ＡｖａＩで開裂させ、次いで
１６８６ｂｐのＰｖｕＵ（Ｐ２）−Ａｖａｌ断片と３２
３３ｂｐのＰｖｕｌｌ （Ｐｔ ）−Ａｖａｌ断片とを
単離することにより作成した０次いでこれら断片をＨｃ
ｌＦ−ＩＩ−２０６（上記）（第２８図におけるＳＮ２
０６）の３ｏｏｂｐのＰｖｕｎ（Ｐ、） −Ｐｖｕｌｌ
（Ｐ２ ）断片に結合させ、そして小さなＰｖｕｌｌ
断片を含有するプラスミドを形質転換大腸菌菌株のＩＦ
Ｎ−α活性を分析して同定した。 ダブリド分子■、すなわちα−２（ＢｇｌＩＩ）α−１
ヒブリドは、ＢｇｌｎおよびＡｖａ■でのＣ３−ＩＦＮ
−αｌの開裂によって作成し、そして１７７６ｂｐの断
片を単離した。次いで、この断片をダブリド分子■の３
５４３ｂｐのＢｇ ＩＩＩ−Ａｖａ Ｉ断片に結合させ
た。 互いに異なるインターフェロン種類の生物学的活性をも
測定した。各種のプラスミドで形質転換させたミニセル
（ＤＳ４１０）の培ｉ物を増殖させ、細菌を遠心分離に
より収穫し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁させ（初
期容量の約１／２０）、１■／ｍｌのリゾチームおよび
１０ｍＭのＥＤＴＡと共に０℃で６０分間培養し、４回
凍結・解凍を反復し、注射器中に５回通して剪断しそし
て遠心分離により開裂させた。 ひと、ねずみ、モルモットおよび牛の細胞に対する活性
は次の通りであった： 相対ＩＦＮ活性 蛋白質源 ひと 牛 ねずみ モルモＣ３−ＩＦ
Ｎ−α２ １ １ ０．０１ ０．０３Ｃ８
−ＩＦＮ−α１ ０．０３ １ ０．３ ０．０
３ヒブＩＪ ）’ Ｉ Ｏ，００！ １
０．００３− ０．００３−０．００８ ０．０１ 上ゾリＦ ｎ ｏ、ｏｏｉ ｉ Ｏ，００
１ｏ、ｏｉヒダブド１１１１ １１０．３ ヒブＩＪＦＩＶ Ｏ，１１２０，１−０，００５ 陰性比較 驚くことに、全てのインターフェロンは生細胞に対しほ
ぼ同じ活性を示したが、ＩＦＮ−α１とＩＦＮ−α１の
アミノ末端成分を有する２つのダブリドＩＦＮ（Ｉおよ
び■）とは、ＩＦＮ−α２およびＩＦＮ−α２のアミノ
末端成分を有する２つのダブリドＩＦＮ（Ｉ［Ｉおよび
■）よりも、ひと細胞に対し約１０〜１０００倍低い活
性を示す、さらに驚くことに、ＩＦＮ−α１のアミノ末
端部を有する２つのダブリドＩＦＮ（■および■）は、
ＩＦＮ−αｌ自身よりも１０倍以上低い活性をひと細胞
に対して示す。しかしながら、ＩＦＮ−α２のアミノ末
端部を有する１つのダブリド（ＩＩＩ）は、ひと細胞に
対しＩＦＮ−α２とほぼ同じ活性を示す。 生成させかつＥＣＯＲＩリンカ−によりλチャロン４Ａ
アームに結合させたひと胎児染色体ＤＮＡの断片から得
られたダブリドファージの集団をアール・エム・ローン
等、セル誌、第１５巻、第１１５７〜１１７４頁（１９
７８）に従って調製した。この遺伝子集団を、ｐＢＲ３
２２（Ｐｓｔ）／Ｈｉｆ−２ｈから切断されたｐ３２−
標識ＩＦＮ−α１ｃＤＮＡ挿入物を試料として使用する
「現場」での方法により選別した〔ダブりニー・ディー
・ベントンおよびアール・ダブリュー・デビス、サイエ
ンス、第１９６巻、第１８０−１８２頁、（１９７７）
；ティー・マニアチス、セル誌、第１５巻、第６８７〜
７０１頁（１９７８）〕、反復プラーク精製により２４
０，０００１ＶＡのプラークがら１６（固のヒフ゛リド
化陽性ファージクローンを単離した〔ティー・マニアチ
ス等、上記〕。１０種のヒダリドファージＤＮＡ調製物
をそれぞれＨｉｎｄｌｌＩ、Ｔａｃｌ、Ｈｈａｌ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌｌｌによって開裂させ
、そしてアガロースゲル上での電気泳動により断片を分
離してこれをミリポア膜に移し〔イー・エム・サウザー
ン、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第９８
巻、第５０３〜５１７頁（１９７５） ）、そしてｐ３
２−標識Ｈｉｆ−２ｈｃＤＮＡ挿入物でダブリド化させ
た。第１８図は、部分制限地図および種々の表として結
果を要約している。 そこに示されているように、各ダブリドファージＤＮＡ
ａ製物については、少なくともユニの特徴的制限部位が
確立され、さらにＩＦＮ−α１遺伝子試料にダブリド化
する領域が描写されている（黒矢印）＊。 ＊ 第１８および２４図におけるｃｈｒ１６上の陰影区
域は、Ｈｉｆ−２ｈｃＤＮＡに弱くダブリド化するがＲ
−ループ化を示さなかった配列を示す。 次に第１８図および第２４図を参照すれば、クローンｃ
ｈｒ−３およびｃｈｒ−２６は、幾つかのＥｃｏＲＩお
よびＨｉｎｄ［ＩＩの断片を共有するので、それらの長
さの多くにわたって重複するＤＮＡ断片を示しうろこと
が判るであろう。さらに、ｃｈｒ−１のダブリド化部分
とｃｈｒ−１０のダブリド化部分の１つは、Ｈｉｆ長さ
くそれぞれ３．２ ｋ ｂおよび０．９５ｋ ｂ ）を
有するので同じになるであろう。また、ｃｈｒ−１６の
「右手側」のヒブリド化部分（第１８図において“ｒ”
と標識する）はｃｈｒ−３５のダブリド化部分と同一で
あると思われるが、これら２つのクローンの各々はＨｉ
ｆ−２ｈｃＤＮＡとをもたらすので反対方向に配向する
。したがって、恐ら（ｃｈｒ−１６とｃｈｒ−３５との
挿入物は重なるであろう。 したがって、１１個のダブリド染色体ＤＮＡの１３個の
ダブリド化部分は１０Ｍ類以上、すなわちｃｈｒ−１、
ｃｈｒ−３、ｃｈｒ−１２、ｃｈｒ−１３、ｃｈｒ−１
６（左手側、第１８図において“ｌ”と標識する）、ｃ
ｈｒ−２６、ｃｈｒ−３０、ｃｈｒ−３５、ｃｈｒ−１
９およびｃｈｒ−２７になると思われる。 次に第２４図を参照すれば、ｃｈｒ−１とｃｈｒ−３と
ｃｈｒ−１０とｃｈｒ−２６との重複およびｃｈｒ−１
６とｃｈｒ−３５との重複が示されている。 上記のデータが示唆するところでは、個々のひとのゲノ
ムはＨｉｆ−２ｈにクロスヒブリド化する１０種以上の
異なるＤＮＡ配列を含有する。この結論は、クローン集
団中に検出された断片Ｈｉｆ−２ｈ関連の配列の割合が
約１６．０００中１であるという事実により裏付けられ
る。半数体ひとゲノムに対しａｘｔｏ”ｂｐＯ値を仮定
すれば、１６ｋｂ（検査されたクローンの平均値）とい
う平均ＤＮＡ断片寸法を有する単一遺伝子コピーに対す
る予測値は約１ ： １９０，０００である。したがっ
て、Ｈｉｆ−２ｈ関速断片の頻度は単一遺伝子に対する
予測値よりも１２倍高いものである。 これらデータと比較して、ローン等（上記）がβ−グロ
ビンｃＤＮＡ試料につき同じ遺伝子集団から３００．０
００個のプラークを選別した際、僅か２つの陽性クロー
ンのみが同定され、この場合予測値は１．６ ： ３０
０，０００であった。したがって、ひとゲノムには、Ｈ
ｉｆ−２ｈ断片もしくはｒＦＮ−α１ｃＤＮＡにクロス
ダブリド化する１０〜１５個の明確な染色体ＤＮＡ断片
が存在するであろう。 ）１ｉｆ−ｃｈｒ３５の別の特性化 説明の目的として、ｃｈｒ−３５のダブリド化配列（“
Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５”）をさらに特性化した。前記した
染色体ダブリドファージのダブリド化部分は同様に特性
化されかつ本発明の範囲を逸脱することなく取扱いうろ
ことを了解すべきである。 ｃｈｒ−３５のダブリド化部分（“Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５
”）（Ｈｉｆ−ｃｈｒ１６の右手断片と恐らく同一であ
る、上記）は、ＢｇｌｌＩ部位を有する唯一のダブリド
化染色体ＤＮＡ部分である。ｒＦＮ−α１およびＩＦＮ
−α２のｃＤＮＡはそれらのコード配列内にそれぞれ１
個および２個のＢｇｌ［［部位を有するので、恐ら＜Ｈ
ｉｆ−ｃｈｒ３５は２つの予めクローン化したインター
フェロン遺伝子の１つの相手方になると思われる。３′
末端Ｈｉｆ−２ｈｃＤＮＡ断片（３′非コード域のみを
含有する）へのＨｉｆ−ｃｈｒ３５の強力なヒブリド化
は、この試料に対する他の染色体ＤＮＡの弱いダブリド
化と比較して、Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５とＨｉｔ−２ｈとの
対応性を裏付けている〔エフ・カファトス等、プロシー
ディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳ
Ａ、第７４巻、第５６１８〜５６２２頁（１９７７）〕
、Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５断片をさらに分析するため、Ｈｉ
ｎｄｌＩ［−ＢａｍＨＩ断片をｃｈｒ３５から切除した
。この断片（３，４ｋｂ）は、ｃｈｒ−３５のダブリド
化部分（Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５”）を含有する。この断片
を、周知のｄＣ−ｄＧ末端化方法（エル・ビラーカマロ
フ等、上記）を用いてｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位にク
ローン化させ、そしてイー・コリＨＢ１０１を得られた
組替えＤＮＡ分子により周知方法〔たとえばニス・ナガ
タ等、ネイチャー誌、第２８４巻、第３１６〜３２０頁
（１９８０））を用いて形質転換させた。 これら形質転換体のクローンをその場でのコロニーダブ
リド化〔ディー・ハナハンおよびエム・メセルソン、ジ
ーン誌、第１０巻、第６３〜６７頁（１９８０））によ
りｐ３２−標識Ｈｉｆ−２ｈ断片（上記）で選別し、プ
ラスミドＤＮＡ、すなわちＺ ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ
）／Ｈｃ ｈ ｒ Ｉ Ｆ−３５ＨＢ （“ＨｃｈｒＩ
Ｆ−３５ＨＢ″）を陽性クローンから分離した〔エフ・
エム・ウィルキー等、ヌクレイツク・アシッド・リサー
チ、第７巻、第８５９〜８７７頁（１９７９）、方法Ｂ
〕。ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子に関しプラ
スミド中のダブリド挿入物“Ｈｃｈｒ ＩＦ−３５ＨＢ
断片”の方向性を、Ｅｃ ｏＲＩ開裂および得られた断
片の寸法決定により決定した。β−ラクタマーゼのそれ
と一致するよう配向した挿入物をαと呼び、反対の配向
をβと呼ぶ。 これら陽性クローンの培養物を見掛けＯＩ）ａｓ。 ＝０．８になるまで増殖させ、そして細菌を収穫しかつ
ニス・ナガタ等（上記）に記載されたりゾチームー凍結
−解凍方法により熔暉させた。 検査した１０種のクローンのうち７種が７５〜５００単
位／細胞ｇのＩＦＮ−α活性を示した（細胞病理学的効
果減少分析〕、 これら７種のＩＦＮ生産性クローンのうちの１つのＤＮ
Ａ挿入物、すなわちイー・コリＩ（Ｂ１０１ （Ｚ
ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃｈｒＩＦ−３５ＨＢα〕
を、制限分析およびヌクレオチド配列決定によりさらに
特性化した。プラスミドＤＮＡ （Ｈｃ ｈ ｒ Ｉ
Ｆ−３５ＨＢα）を前記したようにクローンから調製し
、制限部位をスミスービルンスチールの地図化により決
定した〔エッチ・オー・スミスおよびエム・エル・ビル
ンスチール、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第３
巻、第２３８７〜２３９８頁（１９７６））、Ｈｃｈｒ
ｌＦ−３５ＨＢαをＥｃ ｏ、ＲＩで切断し、５′末端
を標識しそしてＢｇｌＩＩで切断した〔かつｐｓｔｌに
より約１ｋｂの望ましくない断片を開裂させた〕。１．
０４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ （３’近位）断片
と０．９６ｋ ｂのＥＣ０ＲＩ一旦１ユ■（５′近位）
断片とを、文献〔ニー・シー・ピーコックおよびシー・
ダブりニー“・ディングマン、バイオケミストリー、第
６巻、第１８１８〜１８２７頁（１９６７））に記載さ
れているようなアガロースゲル電気泳動により単離した
。両断片を）ｉｉｎｆ Ｉ、ＢｓｐｌおよびＭ ｂ ｏ
ＩＩによりそれぞれ部分開裂し、生成物を１μｇ／ｍ
ｌの臭化エチジウムを含有するトリス−酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，８）における１％アガロースゲルにて分離した。 染色後、放射能バンドを放射能写真により位も、１．０
４ｋ ｂ （３’近位）断片について同様に決定した。 分析の結果を第１９図に示す。 ヌクレオチド配列決定のため、ＨｃｈｒｌＦ−３５ＨＢ
αを種々の制限酵素で開裂させ、生成物をトリス−硼酸
−ＥＤＴＡ緩衝液における５％ポリアクリルアミドゲル
による電気泳動により分離しくニー・シー・ピーコック
およびシー・ダブリュー・ディングマン、上記）、そし
てゲルから抽出し、ダブりニー・ミューシー等、ジャー
ナル・モレキュラー・バイオロジー、第１２４巻、第３
４３〜３５８頁（１９７８）に記載されているように精
製した。 使用した配列決定方法を第１９図に示し、下記に説明す
る。 １および２：ＢｇｌＵによるＨ、ｃｈｒｌＦ−３５ＨＢ
αの開裂、標識化、ＥＣＯＲＩおよびＰｓｔｌによる開
裂ならびにＢｇｌＵ＊−臣！」Ｒ１断片（９４０ｂｐ）
（“１″）およびＢｇｌ［＊−ＥＣＯＲＩ断片（３６０
ｂｐ）（“２”）の単離； ３および４：ＥｃｏＲｒによるＨｃｈｒｆＦ３５ＨＢα
の開裂、標識化、Ｂｓｐｌによる開裂ならびにＥｃｏＲ
Ｉ＊−Ｂｓｐ ｒ断片（６８０ｂｌ））（＠３”）およ
びＥｃｏＲＩ＊−Ｂｓｐｌ断片（８８０ｂｐ）（“４”
）の単離ヨ ５．６．７および８ ’： Ｐ ｖ ｕ ＫによるＨｃ
ｈｒＩＦ−３５ＨＢαの開裂、標識化、ＢｇｌＩ［およ
びＥｃ ｏＲＩによる開裂ならびにＰｖｕ■＊−Ｅｃｏ
ＲＩ断片（７８０ｂｐ）（”５”）、ＰｖｕＩＩ＊−且
エユ■断片（２１５ｂｐ）（＠６”） 、Ｐｖｕｌｌ＊
−ＢｇｌｌＩ断片（９０ｂｐ）（１７″）およびｐｖｕ
Ｉ［＊−ＥｃｏＲＩ断片（２９０ｂ １）） （“８
”）のＲ離； 。 ９および１０：ＥｃｏＲＩによるＨｃｈｒｌＦ−３５Ｈ
Ｂαの開裂、１３００ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
断片のトリス−硼酸ＥＤＴＡ緩衝液における１％アガロ
ースゲル電気泳動によるｆｆｉ離、さらにＨｉｎｆｌに
よる開裂ならびにＨｉｎｆ ［−Ｈｌｎｆ Ｉ断片（４
５０ｂｐ）およびＨｉｎｆ ｌ−Ｈｌｎｆ Ｉ断片（１
８０ｂｐ）の単離、より大きなＨｉｎｆ ｌ−Ｈｌｎｆ
Ｉ断片の標識化とＭｂｏＩＩによる開裂とはＨｉｎｆ
ｌ ＊ −Ｍ ｂ ｏ■（１９０ｂｐ） じ９″）の
単離を可能にした。より短いＨｉｎｆ ｌ−Ｈ１ｎｆＩ
断片の標識化とＡｖａＩＩによる開裂とはＨｉｎｆ１＊
−ＡｖａＩＩ断片（１５０ｂｐ）（’″１０”）のＲ離
を可能にした； １１：Ｍｂｏ［によるＨｃ ｈ ｒ Ｉ Ｆ−３５ＨＢ
αの開裂、標識化、ＢｇｌＩ［による開裂ならびにＭｂ
ｏｌＩ＊−ＢｇｌｌＩ断片（４６５ｂｐ）（“１１’″
）の単離： １２．１３および１４：ＢｓｐｌおよびＢｇｌＵによる
ＨｃｈｒｌＦ−３５ＨＢα（７）開裂、上記のように１
２００ｂｐ Ｂｓｐｌ−Ｂｇｌｌｌ断片のアガロース
電気泳動にょる単離、ならびに（ａｌＨｇｉＡＩによる
開裂、標識化、Ｍ ｂ ｏ ＩＩによる開裂およびＨｇ
１ＡＩ＊−ＭｂｏＩＩ断片（３００ｂｐ） じ１２”
）とＨｇ１Ａｉ＊−Ｍｂｏｌ？断片（３６０ｂｐ）
（“１３”）との単離または（ｂ） Ｂ王ユＮｌによる
開裂、標識化、ＥｃｏＲＩによる開裂および１王ｔＮＩ
）ｋ−ＥｃｏＲＩ断片（３８０ｂｐ）（”１４”）の単
離。 マキサム−ギルバート法（上記）により、各種の断片を
配列決定した。全ての断片を両ストランドに関しかつ配
列決定用の原点として役立つ制限部位にわたって配列決
定した。 Ｈｃｈｒ ＩＦ−３５ＨＢαにおけるコード域のヌクレ
オチド配列とＨｉｆ−２ｈにおけるそれ（コード域）と
の比較（第８〜１０図と第２０〜２３図との比較）は、
それらが同一であることを示す。特に、驚くことに、Ｈ
ｃｈｒｌＦ−３５ＨＢα断片のコード配列内、すなわち
５′非コード域におけるＨｉｎｆ １部位と３″非コー
ド域におけるＥｃｏＲ１部位との間には、イントロンの
存在が示されない。したがって、成熟ＩＦＮ−αｍＲＮ
Ａに対応する染色体配列にはイントロンを検出すること
ができなかった。 Ｈｉｆ−ｃｈｒ２６および）（ｉｆ−ｃｈｒ３の特性化 ｃｈｒ−３およびｃｈｒ−２６の遺伝子含有断片は、ヘ
テロデュプレックス分析により同一と思われるが少なく
とも１つのＢｇｌｎ制限部位において異なり、これらを
ヌクレオチド配列決定により検査した。７２５ベース対
における５つのヌクレオチドの相違が見出された。これ
らのうち２つのみがコード配列にあると思われる。遺伝
子だけでなくそれらに先立つ少なくとも３．５ Ｋ ｂ
Ｉ）とそれらに続＜ ６．ＯＫ ｂ ｐとは完全なヘ
テロデュプレックスを形成しかつ僅か２つのアミノ酸変
化を伴う比較的少ない配列差しかないので、Ｈｉｆ−ｃ
ｈｒ３とＨｉｆ−ｃｈｒ２６とは同一遺伝子の対立形態
であると思われる。これらはＩＦＮ−ｃｒ４ａ （Ｈ
ｉ ｆ−ｃｈｒ３）およびＩＦＮ−α４ｂ （Ｈｉ ｆ
−ｃｈｒ２６）と名付けられる。前記した慣用の配列決
定技術により決定されたＩＦＮ−α４ｂのヌクレオチド
配列と対応アミノ酸配列とを第２９〜３２図に示す。 第２９〜３２図を第８〜１０図、第１２〜１６図および
第２０〜２３図と比較すれば、各配列によりコードさ、
れる蛋白質はそれらの残基の約１５％において互いに相
違することが示される。 この相違は、２０００〜９０００万年前に分化した非対
立遺伝子の生成物に対して典型的である。 ねずみ細胞における）（ｉｆ−ｃｈｒ３５の発現 ねずみ細胞において発現させるため、・Ｈｉｆ−ｃｈｒ
３５断片の供給源としてプラスミドＺ−ｐＢＲ３２２（
Ｐｓ ｔ）／Ｈｃｈｒ ＩＦ−３５ＨＢα（上記）を使
用した。プラスミドをＰｓｔ■で制限しかつ５′エキソ
ヌクレアーゼで処理して５’ ｄＧ末端を除去した。次
いで、この断片を、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ、Ｂ ａ
ｍ Ｈ１断片とポリオーマＤＮＡとの結合により調製
されたプラスミドの５’ ｄＣ，−末端化ＫｐｎＩ断片
に挿入した。得られたベクトルを使用してねずみ３Ｔ３
細胞を形質転換させ、この場合燐酸カルシウム技術を使
用した〔エフ・マンティ等、ネイチャー誌、第２８１巻
、第４０〜４６頁（１９７９）〕、これら形質転換細胞
は便宜上ねずみ３Ｔ３（ポリオーマ−）１ｉｆ−ｃｈｒ
３５）と名付けられる。２０〜４０時間後、分析はひと
細胞に対し３００単位／ＩＦＮ−α１ｍｌのＩＦＮ−α
活性を示し、生細胞に対しては約３０００単位／ＩＦＮ
−ｃｒ１ｍｌの活性を示した。 勿論、第８〜１０図、第１２〜１６図、第２０〜２３図
および第２９〜３２図に示したヌクレオチド配列は、ヌ
クレオチド配列に対し、たとえば既に起こったまたは続
いて用いうる単一もしくは多重のベース置換、挿入、転
位もしくは欠失を含む突然変異のような如何なる変化を
も考慮に入れてないことを了解すべきである。さらに、
この配列はこれら図面に示されたコドンと同じアミノ酸
をコードする他のコドンの可能な置換をも考慮に入れて
ない。したがって、ＩＦＮ−αの免疫学的もしくは生物
学的活性を示すポリペプチドをコードするような改変配
列も本発明の範囲内にあることを了解すべきである。 さらに、第８〜１０図、第１２〜１６図、第２０〜２３
図および第２９〜３２図に示されたアミノ酸配列は、生
体内もしくは試験管内試剤、たとえば生体内グリコジル
化酵素との相互作用により惹起されるポリペプチドに対
し如何なる変化をも考慮に入れてないことを了解すべき
である。したがって、ＩＦＮ−αの免疫学的もしくは生
物学的活性を示すこれらポリペプチドの断片および誘導
体も本発明の一部であることを了解せねばならない。 チドの産生 細胞病理学的効果減少分析〔ダブりニー・イー・スチュ
アート・■およびニス・イー・スルキン、Ｓ、Ｅ、Ｐｒ
ｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ 、第１２３
巻、第６５０〜６５３頁（１９６６））は少量のＩＦＮ
Ｃｍ菌細胞１個当り１個以下の活性分子）を検出しうる
ので、上記した１０種のヒゲリドλフアージで感染させ
たイー・コリＨＢ１０１の溶菌物をＩＦＮの存在につき
分析した。 １１種のファージのうち７種（ｃｈｒ−１０、ｃｈｒ−
１２、ｃｈｒ−１９およびｃｈｒ−２７を除く全て）は
、３部５単位／ｍｌの範囲のＩＦＮ活性を有する溶菌物
を与えた。ｃｈｒ−１０およびｃｈｒ−１２の場合、前
記したようにｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位ニサブクロー
ン化させたダブリド化（Ｈｉｆ−２ｈに対する）Ｈｉｎ
ｄｌｌｒ−ＨｉｎｄＩＩＩもしくはＥｃ ｏＲＩ −Ｅ
ＣＯＲＩ断片は大腸菌においてＩＦＮ−α活性を表わし
た。大腸菌はｍＲＮＡをスプライスし得ないと思われる
ので〔オー・メルセローープイジャロンおよびピー・ク
ーリルスキー、ネイチャー誌、第２７９巻、第６４７〜
６４９頁（１９７９））、これらＩＦＮ−α染色体遺伝
子は恐らくそれらのコード領域中にイントロンを含有し
ないと思われる。 最終結論 本発明によりポリ（Ａ＞ ＲＮ Ａから調製されたｃＤ
ＮＡを含有する一部の組替えＤＮＡ分子がセンダイウィ
ルス処理（誘発）されたひと白血球から単離され、その
代表的なものは次の性質を有している： （１）誘発されたひと白血球からのポリ（Ａ） ＲＮ
Ａにはダブリド化するが、非誘発のものからのポリ（Ａ
） ＲＮ Ａにはヒブリド化しない、（２１ＲＮＡの混
合物からＩＦＮ−αｍＲＮＡを選択する能力によりおよ
びダブリド抑制翻訳分析においてインターフェロンｍＲ
ＮＡの翻訳を抑制（可逆的に）する能力により示される
ように、ＩＦＮ−αｍＲＮＡにダブリド化する、 （３） この群の成る種のものを含有する大腸菌は、
次の性質を有する化合物を生産する＝ （ａ）トリプシンに対し感受性であり、（ｂｌ ひと
細胞系においてＩＦＮ−α活性を示すが、ねずみ細胞系
においてはほんの僅かの活性しか示さず、 ＴＣｌ ２０．０００〜３０．０００の分子量を有し
く第８〜１０９のヌクレオチド配列に基づけば１９．３
８８である）、 （ｄｌｌＦＮ−α活性は、ひと白血球インターフェロン
に対する抗体により特異性に抑制される、 （４） 本発明のダブリドブラスミドのＤＮＡ挿入物
は、Ｉ ＦＮ−αｍＲＮＡをＲＮＡ混合物から選択する
能力に加え、ＩＦＮ−αＤＮＡをｃＤＮＡを包含する各
種供給源の混合物からおよび染色体ＤＮＡのダブリドフ
ァージ遺伝子集団から選択することができる、 ＋５）ＩＦＮ−αに対する多数の異なる染色体遺伝子が
存在し、しかもこれら遺伝子がイントロンを欠失すると
共に適当な宿主におけるインターフェロンおよびインタ
ーフェロン様ポリペプチドの直接的発現を可能にするこ
とは予想外である、 （６） これら組替えＤＮＡ分子のＤＮＡ挿入物にお
ける少なくとも３種のヌクレオチド配列が異なっており
、これはＩＦＮ−αに関し少なくとも３種の非対立遺伝
子が存在することを示唆している、 （７） これら３種のヌクレオチド配列によりコード
される蛋白質は標準リンパ芽球細胞インターフェロンか
ら決定された３５個のアミノ酸とは異なっている、 （８１１ＦＮ−α遺伝子断片の各種組合せ物に対し調製
されたダブリド蛋白質は、相互にまたはそれらの親とは
定量的に異なる性質を示し、さらにＩＦＮ−αに融合し
た付加的アミノ酸を有する蛋白質またはアミノ末端配列
の一部を含まないＩＦＮ−αからなる蛋白質はＩＦＮ活
性を示す。 これらの性質は、本発明により示された組替えＤＮＡ分
子がひと白血球インターフェロンに関するコード配列の
少なくとも１部を含有しかつこれらプラスミドの幾つか
がひと白血球インターフェロンの免疫学的もしくは生物
学的活性を有するポリペプチドの大腸菌における発現を
もたらすことを示している。また明らかなように、本明
細書に示したポリペプチドは蛋白質技術分野で周知され
ているように、本発明の範囲を逸脱することなく断片化
、改変もしくは誘導体化させることもできる。 本明細書に記載した方法により調製される微生物および
組替えＤＮＡ分子は、西ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン
所在のドイツチェ・ザンムルンク・フォノ・ミクロオル
ガニスメンに１９８０年１月７日に寄託した培養物を例
とし、ＨｃＩＦＡ−Ｅとして次のように同定されている
： Ａ：イ−・１すＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓ ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−４ｃ） Ｂ：イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓ ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−２ｈ） Ｃ：イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ３５） Ｄ：イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓ ｔ）／Ｈｃ ＩＦ−ＳＮ４２）Ｅ：イー・コリ
ＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＫＴ２８７（Ｐｓ ｔ）／Ｈ
ｃ ＴＦ−２ｈ−ＡＨ６）これらの培養物はそれぞれ
寄託番号ＤＳＭ１６９９〜１７０３が付与されている。 さらに、本明細書に記載した方法により調製された微生
物およびＤＮＡ分子は、アメリカ合衆国メリーランド州
、ロックビル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに１９８０年３月２７日に寄託された培養
物を例としＨｃｌＦ−Ｇ−Ｈとして同定され、それぞれ
ＡＴＣＣ寄託番号３１６３３〜３１６３４が付与されて
いる： Ｇ：イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓｔ）／ＨｃＩＦ−■−２０６） Ｈ：イー・コリＨＢ１０１ （Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓ ｔ） ／Ｈｃ Ｉ Ｆ−ＳＮ３５−ＡＨＬ本明細書
中に゛記載した方法によりｉｌｌ製したその他の微生物
は、西ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン所在のドイツチェ
・ザンムルンク・フォノ・ミクロオルガニスメンに１９
８０年１０月１日に寄託した培養物を例とし、）（ｃｈ
ｒＩＦ−Ａ−Ｊとして同定されかつ寄託番号ＤＳＭ１９
１４〜１９２３が付与されている二人。イー・コ・すＨ
Ｂ１０１におけるｃｈｒ３のサブクローン化Ｈｉｎｄ［
［断片； Ｂ、イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ１２のサブク
ローン化Ｅｃ ｏＲＩ断片； Ｃ，イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ１２のサブク
ローン化Ｈｉｎｄｌｌ［断片；Ｄ、イー・コリＨＢ１０
１におけるｃｈｒ１３のサブクローン化」ＬユＲ１断片
； Ｅ、イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ２３のサブク
ローン化ＥＣ０ＲＩ断片； Ｆ、イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ２３のサブク
ローン化ＨｉｎｄＩＩＩ断片；Ｇ、イー・コリＨＢ１０
１におけるｃｈｒ２６のサブクローン化ＥｃｏＲＩ断片
； Ｈ，イー・コリＨＢ １０１におけるｃｈｒ２６のサブ
クローン化ＨｉｎｄＩＩＩ断片；■、イー・コリＨＢ１
０１におけるｃｈｒ３５のサブクローン化ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片； Ｊ、イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ３５のサブク
ローン化ＢａｍＨＩ断片。 最後に、本明細書中に記載した方法により調製された微
生物は、アメリカ合衆国メリーランド州、ロックビル所
在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
１９８０年１２月１５日に寄託され、ＨｃｈｒｌＦ−に
−ＨｃｈｒＩＦ−ＱおよびＨｃｌＦ−１〜ＨｃｌＦ−に
として同定されかつそれぞれＡＴＣＣ寄託番号３１７６
０ＨｃｈｒｌＦ−に、３１７６１ＨｃｈｒＩＦ−Ｌ、３
１７６２ＨｃｈｒｌＦ −Ｍ、３１７６３ＨｃｈｒｌＦ
−Ｎ、３１７６４ＨｃｈｒｌＦ−０，３１７６５Ｈｃｈ
ｒＩＦ−Ｐ、３１７６６ＨｃｈｒｌＦ−Ｑ、３１７６７
ＨｃＩＦ−Ｉ、３１７６８ＨｃｌＦ−Ｊ。 ３１７６９ＨｃＩＦ−Ｋが付与されている：Ｋ、イー・
コリＨＢ１０１におけるｃｈｒ２３のサブクローン化Ｔ
ａｃ−Ｔａｃ断片；Ｌ、イー・コリＨＢ１０１における
ｃｈｒｌＱｌのサブクローン化ＢｇｌＩｒ一旦」」、■
断片； Ｍ、イー・コリＨＢ１０１におけるｃｈｒｌＱｒのサブ
クローン化Ｈｉｎｄｌｌ［−Ｈ１ｎｄ■断片； Ｎ、イー・コリＨＢ １０１におけるｃｈｒ２６のサブ
クローン化Ｂｇｌｎ−Ｂｇｌｎ断片：Ｏ，イー・コリＨ
Ｂ１０１におけるｃｈｒ３０のサブクローン化Ｈｉｎｄ
Ｉ［ｌ−ＨｌｎｄＩ［［断片； Ｐ、イー・コ、すＨＢ１０１におけるｃｈｒ１３のサブ
クローン化ＢｇｌＴ１−Ｔａｃ断片；Ｑ、イー・コリＨ
Ｂ １０１におけるｃｈｒ １６１のサブクローン化Ｂ
ｇｌＵ−Ｔａｃ断片；ＨｃＩＦ−１：イー・コリＤＳ４
１０ （Ｃ８−ＩＦＮ−α２） ＨｃｌＦ−Ｊ：イー・コリＤＳ４１０ （ＬＡＣ−ＡＵ
Ｇ （α２）） ＨＣＩＦ−に：イー・コリＤＳ４１０（β−Ｌａ ｃ
−ＡＵＧ （α２）） 以上、本発明を多くの具体例につき説明したが、この基
本的構成を変化させて、本発明の方法および組成物を利
用する他の具体例を提供しうろことが明白である。した
がって、本発明の範囲は例をもって前記した特定具体例
でなく、寧ろ特許請求の範囲により規定さるべきである
ことが了解されよう。
第１図はその幾つかが本発明のポリペプチドをコードす
る挿入ＤＮＡ配列を特徴とするような組替えＤＮＡ分子
の混合物を製造するための、本発明の方法の一実ｆｉ！
態様を示す概略図、第２図は本発明の初期クローン選別
法の概略図、第３図は本発明により調製されたＤＮＡ配
列を使用するクローン選別法の一実施態様を示す概略図
、第４図は本発明のクローンの一つの制限地図であって
、ただしこのクローンの各制限部位の絶対的位置は示さ
ず、第８〜１０図においてこれら制限部位のより絶対的
な位置を示し、第５図は本発明の一つの組替えＤＮＡ分
子におけるＤＮＡ挿入物の方向性を決定する方法の概略
図、第６図は本発明により使用しうる幾つかのクローン
化ベヒクルの部分的ヌクレオチド配列を示す図、第７図
は本発明の細菌培養から調製された上澄液のセファデッ
クスＧ−１００分別化の結果を示す図、第８〜１０図は
本発明の組替えＤＮＡ分子に対するＤＮＡ挿入物のヌク
レオチド配列を示す図であって、この配列はポリＣ５’
末端に続くヌクレオチドからポリＡ残基およびポリＣ３
’末端の前のヌクレオチドまで番号を付け、ヌクレオチ
ド５７〜１２５は信号配列を示し、かつヌクレオチド１
２６〜６２６は「成熟」インターフェロンおよび停止コ
ドンを示し、信号配列のアミノ酸配列は下部文字におい
てそのヌクレオチド配列の上方に示されかつ「成熟」イ
ンターフェロンのアミノ酸配列は上部文字においてその
ヌクレオチド配列の上方に示され、この遺伝子における
各種の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をも第８〜１０
図に示し、これら部位は第４図に示されるものよりも絶
対的に位置決定され、第１１図は本発明の組替えＤＮＡ
分子の２つのＤＮＡ挿入物の制限地図に関する略比較図
、第１２〜１６図は本発明の組替えＤＮＡ分子の２つの
ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を示す図であって、こ
の配列はポリＣ５’末端に続くヌクレオチドからポリＡ
残基およびポリＣ３’末端の前のヌクレオチドまで番号
を付け、これら挿入物の各々に対する信号配列のアミノ
酸配列は下部文字においてその各ヌクレオチド配列の上
方に示されかつ「成熟」インターフェロンのアミノ酸配
列は上部文字においてそのヌクレオチド配列の上方に示
され、第１７図はＺ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／Ｈｃ
ＩＦ−ＩＩ−２０６の部分制限地図および第１２〜１
６図に示されたＨｉｆ−Ｕ−２０６断片のヌクレオチド
配列を決定するのに使用される配列決定方法を示す図、
第１８図はＨｌｆ−２ｂ断片にダブリド化する一連のダ
ブリドファージの部分制限地図を示す図、第１９図はＺ
ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／Ｈｃｈｒ ＩＦ−３５ＨＢ
αのダブリド挿入物の部分制限地図およびそのヌクレオ
チド配列を決定するのに使用する配列決定方法を示す図
、第２０〜２３図はＨｃｈｒＩＦ−３５ＨＢα断片のヌ
クレオチド配列およびそれから生ずるアミノ酸配列を示
す図、第２４図はＨｕＩＦＮ−α関連遺伝子に対する部
分結合地図を示す図であって、矢印は誘発白血球ポリ（
Ａ） ＲＮ Ａと共にＲ−ループを形成する領域を示し
、ハツチングした枠（ｃｈｒ−１６）はプロッチング実
験から推定されたが、Ｒ−ループ地図では示されなかっ
た配列を示し、第２５図はプラスミドＣＢ−ＩＦＮ−α
１の構成の概略。 図、第２６図はプラスミドＬＡＣ−ＡＵＧ （α２）の
構成の概略図、第２７図はＬＡＣ−ＡＵＧ（α２）の構
成 、特にＡＵＧ開始信号およびＣＹＳＮ−末端アミノ
酸におけるプラスミドの構成を示す図、第２８図はプラ
スミドＣ３−ＩＦＮ−α２の構成およびダブリド分子■
、■、■および■の概略図、第２９〜３２図はヌクレオ
チド配列とそれによりＩＦＮ−α４ｂに対してコードさ
れるアミノ酸配列およびそのシグナル配列を示す図であ
る。 特許出願人 パイオゲン ナームローズベンノットジャ
ンプ
る挿入ＤＮＡ配列を特徴とするような組替えＤＮＡ分子
の混合物を製造するための、本発明の方法の一実ｆｉ！
態様を示す概略図、第２図は本発明の初期クローン選別
法の概略図、第３図は本発明により調製されたＤＮＡ配
列を使用するクローン選別法の一実施態様を示す概略図
、第４図は本発明のクローンの一つの制限地図であって
、ただしこのクローンの各制限部位の絶対的位置は示さ
ず、第８〜１０図においてこれら制限部位のより絶対的
な位置を示し、第５図は本発明の一つの組替えＤＮＡ分
子におけるＤＮＡ挿入物の方向性を決定する方法の概略
図、第６図は本発明により使用しうる幾つかのクローン
化ベヒクルの部分的ヌクレオチド配列を示す図、第７図
は本発明の細菌培養から調製された上澄液のセファデッ
クスＧ−１００分別化の結果を示す図、第８〜１０図は
本発明の組替えＤＮＡ分子に対するＤＮＡ挿入物のヌク
レオチド配列を示す図であって、この配列はポリＣ５’
末端に続くヌクレオチドからポリＡ残基およびポリＣ３
’末端の前のヌクレオチドまで番号を付け、ヌクレオチ
ド５７〜１２５は信号配列を示し、かつヌクレオチド１
２６〜６２６は「成熟」インターフェロンおよび停止コ
ドンを示し、信号配列のアミノ酸配列は下部文字におい
てそのヌクレオチド配列の上方に示されかつ「成熟」イ
ンターフェロンのアミノ酸配列は上部文字においてその
ヌクレオチド配列の上方に示され、この遺伝子における
各種の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をも第８〜１０
図に示し、これら部位は第４図に示されるものよりも絶
対的に位置決定され、第１１図は本発明の組替えＤＮＡ
分子の２つのＤＮＡ挿入物の制限地図に関する略比較図
、第１２〜１６図は本発明の組替えＤＮＡ分子の２つの
ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を示す図であって、こ
の配列はポリＣ５’末端に続くヌクレオチドからポリＡ
残基およびポリＣ３’末端の前のヌクレオチドまで番号
を付け、これら挿入物の各々に対する信号配列のアミノ
酸配列は下部文字においてその各ヌクレオチド配列の上
方に示されかつ「成熟」インターフェロンのアミノ酸配
列は上部文字においてそのヌクレオチド配列の上方に示
され、第１７図はＺ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／Ｈｃ
ＩＦ−ＩＩ−２０６の部分制限地図および第１２〜１
６図に示されたＨｉｆ−Ｕ−２０６断片のヌクレオチド
配列を決定するのに使用される配列決定方法を示す図、
第１８図はＨｌｆ−２ｂ断片にダブリド化する一連のダ
ブリドファージの部分制限地図を示す図、第１９図はＺ
ｐＢＲ３２２（Ｐｓ ｔ）／Ｈｃｈｒ ＩＦ−３５ＨＢ
αのダブリド挿入物の部分制限地図およびそのヌクレオ
チド配列を決定するのに使用する配列決定方法を示す図
、第２０〜２３図はＨｃｈｒＩＦ−３５ＨＢα断片のヌ
クレオチド配列およびそれから生ずるアミノ酸配列を示
す図、第２４図はＨｕＩＦＮ−α関連遺伝子に対する部
分結合地図を示す図であって、矢印は誘発白血球ポリ（
Ａ） ＲＮ Ａと共にＲ−ループを形成する領域を示し
、ハツチングした枠（ｃｈｒ−１６）はプロッチング実
験から推定されたが、Ｒ−ループ地図では示されなかっ
た配列を示し、第２５図はプラスミドＣＢ−ＩＦＮ−α
１の構成の概略。 図、第２６図はプラスミドＬＡＣ−ＡＵＧ （α２）の
構成の概略図、第２７図はＬＡＣ−ＡＵＧ（α２）の構
成 、特にＡＵＧ開始信号およびＣＹＳＮ−末端アミノ
酸におけるプラスミドの構成を示す図、第２８図はプラ
スミドＣ３−ＩＦＮ−α２の構成およびダブリド分子■
、■、■および■の概略図、第２９〜３２図はヌクレオ
チド配列とそれによりＩＦＮ−α４ｂに対してコードさ
れるアミノ酸配列およびそのシグナル配列を示す図であ
る。 特許出願人 パイオゲン ナームローズベンノットジャ
ンプ
Claims (18)
- （１）（ａ）Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−
４ｃ〔ＤＳＭ１６９９〕Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／
ＨｃＩＦ−２ｈ〔ＤＳＭ１７００〕、Ｚ−ｐＢＲ３２２
（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ３５〔ＤＳＭ１７０１〕Ｚ
−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ４２〔ＤＳ
Ｍ１７０２〕およびＺ−ｐＫＴ２８７（Ｐｓｔ）／Ｈｃ
ＩＦ−２ｈ−ＡＨ６〔ＤＳＭ１７０３〕のＤＮＡ挿入物
、 （ｂ）前記ＤＮＡ挿入物のいずれか１つにヒブリド化し
かつＩＦＮ−α型のポリペプチド をコードするＤＮＡ配列、および （ｃ）前記（ａ）および（ｂ）に規定したＤＮＡ挿入物
および配列まで遺伝子コードの結果縮退し かつＩＦＮ−α型のポリペプチドをコード するＤＮＡ配列 よりなる群から選択され、前記ＤＮＡ配列が組替えＤＮ
Ａ分子における発現制御配列に作用結合していることを
特徴とする組替えＤＮＡ分子。 - （２）ＤＮＡ挿入物（ａ）のいずれか１つにヒブリド化
するＤＮＡ配列（ｂ）が、 （ｄ）Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−II−２
０６〔ＡＴＣＣ３１６３３〕およびＺ−ｐＢＲ３２２（
Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ３５−ＡＨＬ６〔ＡＴＣＣ３
１６３４〕のＤＮＡ挿入物、（ｅ）前記ＤＮＡ挿入物の
いずれか１つにヒブリド化しかつＩＦＮ−α型のポリペ
プチド をコードするＤＮＡ配列、および （ｆ）前記（ｄ）および（ｅ）に規定したＤＮＡ挿入物
および配列まで遺伝子コードの結果縮退し かつＩＦＮ−α型のポリペプチドをコード するＤＮＡ配列 から選択される特許請求の範囲第１項記載の組替えＤＮ
Ａ分子。 - （３）ＤＮＡ挿入物（ａ）のいずれか１つにヒブリド化
するＤＮＡ配列（ｂ）が、 （ｇ）Ｈｉｆ−ｃｈｒ３の￥Ｈｉｎｄ￥III断片〔ＤＳ
Ｍ１９１４〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ１２の￥Ｅｃｏ￥Ｒ I
断片〔ＤＳＭ１９１５〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ１２の￥Ｈｉ
ｎｄ￥III断片〔ＤＳＭ１９１６〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ１
３の￥Ｅｃｏ￥Ｒ I 断片〔ＤＳＭ１９１７〕、Ｈｉｆ
−ｃｈｒ２３の￥Ｅｃｏ￥Ｒ I 断片〔ＤＳＭ１９１８
〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ２３の￥Ｈｉｎｄ￥III断片〔ＤＳ
Ｍ１９１９〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ２６の￥Ｅｃｏ￥Ｒ I
断片〔ＤＳＭ１９２０〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ２６の￥Ｈｉ
ｎｄ￥III断片〔ＤＳＭ１９２１〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ３
５の￥Ｈｉｎｄ￥III−ＢａｍＨ I 断片〔ＤＳＭ１９２
２〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ３５の￥Ｂａｍ￥Ｈ I 断片〔Ｄ
ＳＭ１９２３〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ２３の￥Ｔａｃ￥−￥
Ｔａｃ￥断片〔ＡＴＣＣ３７１６０〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ
１０ｌのＢｇｌII−ＢｇｌII断片〔ＡＴＣＣ３１７６１
〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ１０ｒの￥Ｈｉｎｄ￥III−Ｈｉｎ
ｄIII断片〔ＡＴＣＣ３１７６２〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ２
６の￥Ｂｇｌ￥II−￥Ｂｇｌ￥II断片〔ＡＴＣＣ３１７
６３〕、Ｈｉｆ−ｃｈｒ３０の￥Ｈｉｎｄ￥III−￥Ｈ
ｉｎｄ￥III断片〔ＡＴＣＣ３１７６４〕、Ｈｉｆ−ｃ
ｈｒ１３の￥Ｂｇｌ￥II−￥Ｔａｃ￥断片〔ＡＴＣＣ３
１７６５〕およびＨｉｆ−ｃｈｒ１６ｌの￥Ｂｇｌ￥I
I−￥Ｔａｃ￥断片〔ＡＴＣＣ３１７６６〕（ｈ）前記
ＤＮＡ挿入物のいずれか１つにヒブリド化しかつＩＦＮ
−α型のポリペプチド をコードするＤＮＡ配列、および （ｉ）前記（ｇ）および（ｈ）に規定したＤＮＡ挿入物
および配列まで遺伝子コードの結果縮退し かつＩＦＮ−α型のポリペプチドをコード するＤＮＡ配列 から選択される特許請求の範囲第１項記載の組替えＤＮ
Ａ分子。 - （４）式： 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
組替えＤＮＡ分子。 - （５）式： 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
組替えＤＮＡ分子。 - （６）式： 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組替えＤＮＡ
分子。 - （７）発現制御配列が￥ｌａｃ￥系、β−ｌａｃ系、￥
ｔｒｐ￥系、ファージλの主オペレータおよびプロモー
タ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域並びに原核もしくは
真核細胞およびそのウィルスの遺伝子の発現を制御する
その他の配列よりなる群から選択される特許請求の範囲
第１項記載の組替えＤＮＡ分子。 - （８）Ｃ８−ＩＦＮ−α１、Ｃ８−ＩＦＮ−α２、ＬＡ
Ｃ−ＡＵＧ（α２）およびβ−ｌａｃ−ＡＵＧ（α２）
から選択される特許請求の範囲第１項記載の組替えＤＮ
Ａ分子。 - （９）特許請求の範囲第１項記載の少なくとも１種の組
替えＤＮＡ分子により形質転換された宿主。 - （１０）イー・コリ、シュードモナス、バチルス・ズブ
チリス、バチルスステアロターモフィルス、その他の細
菌類、酵母、その他の真菌類、ねずみまたはその他の動
物もしくは植物宿主およびヒト組織細胞よりなる群から
選択される特許請求の範囲第９項記載の宿主。 - （１１）イー・コリＨＢ１０１（Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓｔ）／ＨｃＩＦ−４ｃ）、イー・コリＨＢ１０１（Ｚ
−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−２ｈ）、イー・
コリＨＢ１０１（Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩ
Ｆ−ｓＮ３５）、イー・コリＨＢ１０１（Ｚ−ｐＢＲ３
２２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ４２）およびイー・コ
リＨＢ１０１（Ｚ−ｐＫＴ２８７（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ
−２ｈ−ＡＨ６）から選択される特許請求の範囲第９項
記載の形質転換宿主。 - （１２）イー・コリＨＢ１０１（Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓｔ）／ＨｃＩＦ−II−２０６）およびイー・コリＨＢ
１０１（Ｚ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨｃＩＦ−ＳＮ
３５−ＡＨＬ６）から選択される特許請求の範囲第９項
記載の形質転換宿主。 - （１３）ＨｃｈｒＩＦ−Ａ、ＨｃｈｒＩＦ−Ｂ、Ｈｃｈ
ｒＩＦ−Ｃ、ＨｃｈｒＩＦ−Ｄ、ＨｃｈｒＩＦ−Ｅ、Ｈ
ｃｈｒＩＦ−Ｆ、ＨｃｈｒＩＦ−Ｇ、ＨｃｈｒＩＦ−Ｈ
、ＨｃｈｒＩＦ−ＩおよびＨｃｈｒＩＦ−Ｊから選択さ
れる特許請求の範囲第９項記載の形質転換宿主。 - （１４）イー・コリＤＳ４１０（Ｃ８−ＩＦＮ−α１）
、イー・コリＤＳ４１０（Ｃ８−ＩＦＮ−α２）、イー
・コリＤＳ４１０（ＬＡＣ−ＡＵＧ（α２））、イー・
コリＤＳ４１０ＨＢ１０１（β−ｌａｃ−ＡＵＧ（α２
））およびねずみ３Ｔ３（ｐｏｌｙ−ｏｍａ−Ｈｉｆ−
ｃｈｒ３５）から選択される特許請求の範囲第９項記載
の形質転換宿主。 - （１５）ＨｃｈｒＩＦ−Ｋ、ＨｃｈｒＩＦ−Ｌ、Ｈｃｈ
ｒＩＦ−Ｍ、ＨｃｈｒＩＦ−Ｎ、ＨｃｈｒＩＦ−Ｏ、Ｈ
ｃｈｒＩＦ−Ｐ、ＨｃｈｒＩＦ−Ｑ並びにＨｉｆ−ｃｈ
ｒ１９およびＨｉｆ−ｃｈｒ２７により形質転換された
宿主細胞から選択される特許請求の範囲第９項記載の形
質転換宿主。 - （１６）式： 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列から選択されるＩＦＮ−α型のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列。 - （１７）式： 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列から選択されるＩＦＮ−α型のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列。 - （１８）式： 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列から選択されるＩＦＮ−α型のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03111077A (ja) * | 1989-09-26 | 1991-05-10 | Nikko:Kk | 走行玩具の方向変換装置 |
Families Citing this family (186)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6835557B1 (en) * | 1980-01-08 | 2004-12-28 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides |
| ATE25985T1 (de) * | 1980-06-12 | 1987-04-15 | Japan Found Cancer | Plasmid. |
| US6610830B1 (en) | 1980-07-01 | 2003-08-26 | Hoffman-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferons |
| US4810645A (en) * | 1981-08-14 | 1989-03-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L |
| IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
| US5399684A (en) * | 1982-05-20 | 1995-03-21 | Washington Research Foundation | DNA sequences expressing mammalian alpha-1-antitrypsin |
| DE3220116A1 (de) * | 1982-05-28 | 1983-12-01 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung |
| JPS60222500A (ja) * | 1983-12-19 | 1985-11-07 | シエリング・コ−ポレ−シヨン | 新規ハイブリツドインタ−フエロン |
| US5248666A (en) * | 1984-03-23 | 1993-09-28 | Oncogen | Methods for inhibiting neoplastic cell proliferation using platelet factor 4 |
| US4710465A (en) * | 1984-04-19 | 1987-12-01 | Yale University | Junction-fragment DNA probes and probe clusters |
| SU1364343A1 (ru) * | 1984-07-13 | 1988-01-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Способ получени человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 |
| US5871956A (en) * | 1984-12-06 | 1999-02-16 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine inhibitors and DNA sequences useful for same |
| US6291662B1 (en) | 1984-12-05 | 2001-09-18 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences |
| US6132990A (en) * | 1984-12-06 | 2000-10-17 | Amgen Boulder Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences useful for same |
| US5900400A (en) * | 1984-12-06 | 1999-05-04 | Amgen Inc. | Serine protease inhibitor analogs |
| US4950646A (en) * | 1985-01-10 | 1990-08-21 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human lipocortin-like polypeptides |
| US5081019A (en) * | 1985-01-10 | 1992-01-14 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lipocortin-like polypeptides |
| US4879224A (en) * | 1985-01-10 | 1989-11-07 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor polypeptides |
| US4874743A (en) * | 1985-01-10 | 1989-10-17 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor-like polypeptides |
| WO1986004608A1 (en) | 1985-02-05 | 1986-08-14 | Synergen Biologicals, Inc. | Metalloproteinase inhibitor sequence recombinant vector system for using same and recombinant-dna method for the manufacture of same |
| JPS61185189A (ja) * | 1985-02-08 | 1986-08-18 | Green Cross Corp:The | 新規インタ−フエロン−α↓１ＤＮＡ配列、組み換えプラスミド及び形質転換体 |
| US4894332A (en) * | 1985-03-27 | 1990-01-16 | Biogen, Inc. | DNA sequences coding for Mycoplasma hypopneumoniae surface antigens, methods of use to make the corresponding proteins |
| US6774283B1 (en) | 1985-07-29 | 2004-08-10 | Calgene Llc | Molecular farming |
| US4956282A (en) * | 1985-07-29 | 1990-09-11 | Calgene, Inc. | Mammalian peptide expression in plant cells |
| US5248603A (en) * | 1985-09-03 | 1993-09-28 | Symbicom Aktiebolag | Superoxide dismutase |
| DK402785D0 (da) * | 1985-09-03 | 1985-09-03 | Syn Tek Ab | Fremgangsmaade til fremstilling af et enzym |
| US5135868A (en) * | 1985-10-25 | 1992-08-04 | Phillips Petroleum Company | Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification |
| US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
| US5028422A (en) * | 1986-05-27 | 1991-07-02 | Schering Corporation | Treatment of basal cell carcinoma intralesionally with recombinant human alpha interferon |
| US5089406A (en) * | 1987-01-07 | 1992-02-18 | Allied-Signal Inc. | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences |
| AU623589B2 (en) * | 1987-03-02 | 1992-05-21 | Bristol-Myers Squibb Company | Platelet related growth regulator |
| JPS6463395A (en) | 1987-05-04 | 1989-03-09 | Oncogen | Oncostatin m and novel composition having antitumor activity |
| US4961969A (en) * | 1987-05-11 | 1990-10-09 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interferon-β |
| US5328988A (en) * | 1987-10-26 | 1994-07-12 | Immunex Corporation | Interleukin-7 |
| US5714585A (en) * | 1987-10-26 | 1998-02-03 | Sterling Winthrop, Inc. | Antibodies that are immunoreactive with interleukin-7 |
| DE68923107T2 (de) * | 1988-02-26 | 1996-01-18 | Biogen Inc | DNA-Sequenzen, rekombinante DNA-Moleküle und Verfahren zur Herstellung von Lipocortin III, IV, V, und VI. |
| US5605815A (en) * | 1988-03-14 | 1997-02-25 | Yale University | Nucleic acids encoding and expression of parathyroid hormone-like peptide |
| WO1989009831A1 (en) * | 1988-04-15 | 1989-10-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Lak cell cytotoxin |
| DK455789D0 (da) * | 1989-09-15 | 1989-09-15 | Symbicom Ab | Polypeptid |
| US5256568A (en) * | 1990-02-12 | 1993-10-26 | Regeneron Phamaceuticals, Inc. | Vectors and transformed most cells for recombinant protein production with reduced expression of selectable markers |
| AU7682091A (en) * | 1990-04-02 | 1991-10-30 | Synergen, Inc. | Polypeptides useful in diagnosis of and treatment against mycoplasma infections in animals |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| RU2129437C1 (ru) * | 1992-02-10 | 1999-04-27 | Интерферон Сайнс Инк. | Композиция альфа-интерферона и способ ее получения из лейкоцитов крови человека |
| US5676942A (en) * | 1992-02-10 | 1997-10-14 | Interferon Sciences, Inc. | Composition containing human alpha interferon species proteins and method for use thereof |
| US5912015A (en) | 1992-03-12 | 1999-06-15 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Modulated release from biocompatible polymers |
| US5711968A (en) * | 1994-07-25 | 1998-01-27 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Composition and method for the controlled release of metal cation-stabilized interferon |
| US6869925B1 (en) * | 1992-09-09 | 2005-03-22 | Amgen Inc. | Inhibition of retrovirus infection |
| JP2649317B2 (ja) * | 1993-10-25 | 1997-09-03 | 株式会社キジマ | 手袋の製造方法 |
| US6017880A (en) * | 1994-03-09 | 2000-01-25 | Amgen Inc. | Inhibition of retrovirus infection |
| RU2370541C2 (ru) * | 1994-12-09 | 2009-10-20 | Имерджент Продакт Дивелопмент Юк Лимитед | Vgc2 днк salmonella typhimurium, мутантная бактерия, обладающая пониженной способностью к адаптации к условиям окружающей среды, и способ ее получения |
| US6387365B1 (en) | 1995-05-19 | 2002-05-14 | Schering Corporation | Combination therapy for chronic hepatitis C infection |
| AU710347B2 (en) * | 1995-08-31 | 1999-09-16 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Composition for sustained release of an agent |
| US5908621A (en) | 1995-11-02 | 1999-06-01 | Schering Corporation | Polyethylene glycol modified interferon therapy |
| EP0858343B1 (en) | 1995-11-02 | 2004-03-31 | Schering Corporation | Continuous low-dose cytokine infusion therapy |
| US6027721A (en) * | 1996-05-20 | 2000-02-22 | Cytotherapeutics, Inc. | Device and method for encapsulated gene therapy |
| GB9712370D0 (en) * | 1997-06-14 | 1997-08-13 | Aepact Ltd | Therapeutic systems |
| US6472373B1 (en) | 1997-09-21 | 2002-10-29 | Schering Corporation | Combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in antiviral treatment naive patients having chronic hepatitis C infection |
| US6172046B1 (en) * | 1997-09-21 | 2001-01-09 | Schering Corporation | Combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic Hepatitis C infection |
| CA2309766C (en) | 1997-11-20 | 2008-09-30 | Vical Incorporated | Treatment of cancer using cytokine-expressing polynucleotides and compositions therefor |
| BR9910505A (pt) | 1998-05-15 | 2001-01-02 | Schering Corp | Terapia de combinação compreendendo ribavirina e interferon alfa em pacientes cândidos de tratamento antiviral tendo infecção crÈnica por hepatite c |
| EP1108034B1 (en) * | 1998-09-04 | 2008-08-06 | Emergent Product Development UK Limited | Attenuated salmonella spi2 mutants as antigen carriers |
| US6281337B1 (en) | 1998-11-12 | 2001-08-28 | Schering Corporation | Methods for conversion of protein isoforms |
| ATE409706T1 (de) | 1998-11-12 | 2008-10-15 | Schering Corp | Verfahren zur umwandlung von interferon-isoformen und daraus hergestellte produkte |
| US6605273B2 (en) | 1999-04-08 | 2003-08-12 | Schering Corporation | Renal cell carcinoma treatment |
| US6362162B1 (en) | 1999-04-08 | 2002-03-26 | Schering Corporation | CML Therapy |
| US6923966B2 (en) | 1999-04-08 | 2005-08-02 | Schering Corporation | Melanoma therapy |
| ATE296639T1 (de) | 1999-04-08 | 2005-06-15 | Schering Corp | Melanoma therapie |
| GB9910812D0 (en) * | 1999-05-10 | 1999-07-07 | Microscience Ltd | Vaccine composition |
| GB0008419D0 (en) * | 2000-04-05 | 2000-05-24 | Bioinvent Int Ab | A method for invitro molecular evolution of antibody function |
| US6926898B2 (en) | 2000-04-12 | 2005-08-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| GB0008966D0 (en) * | 2000-04-13 | 2000-05-31 | Imp College Innovations Ltd | Vectors for gene therapy |
| DE60226853D1 (de) * | 2001-02-20 | 2008-07-10 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Zelltherapieverfahren für die behandlung von tumoren |
| US20040071671A1 (en) * | 2001-02-20 | 2004-04-15 | Leturcq Didier J. | Cell therapy method for the treatment of tumors |
| US20040136949A1 (en) | 2001-04-24 | 2004-07-15 | Matthias Grell | Combination therapy using anti-angiogenic agents and tnf alpha |
| US20080194481A1 (en) * | 2001-12-21 | 2008-08-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin Fusion Proteins |
| KR101271635B1 (ko) * | 2001-12-21 | 2013-06-12 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 | 알부민 융합 단백질 |
| GB0217033D0 (en) | 2002-07-23 | 2002-08-28 | Delta Biotechnology Ltd | Gene and polypeptide sequences |
| GB0226105D0 (en) * | 2002-11-08 | 2002-12-18 | St Georges S Entpr Ltd | Pain relief agents |
| GB0304993D0 (en) * | 2003-03-05 | 2003-04-09 | Univ Nottingham Trent | Novel screening method |
| AU2004283294B2 (en) | 2003-10-23 | 2011-03-17 | Kineta Two, Llc | Detection of mutations in a gene associated with resistance to viral infection, OAS1 |
| EP1702069A2 (en) * | 2004-01-05 | 2006-09-20 | EMD Lexigen Research Center Corp. | Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin |
| US8906676B2 (en) | 2004-02-02 | 2014-12-09 | Ambrx, Inc. | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
| GB0420091D0 (en) * | 2004-09-10 | 2004-10-13 | Univ Nottingham Trent | Medical implant materials |
| US20060193849A1 (en) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Antisoma Plc | Biological materials and uses thereof |
| GB0514661D0 (en) * | 2005-07-16 | 2005-08-24 | Medical Res Council | Methods |
| DK1806359T3 (da) | 2005-09-05 | 2010-06-14 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Tumorassocierede peptider, der bindes promiskuøst til Humant Leukocyt-Antigen (HLA) klasse II molekyler |
| DK1760089T3 (da) | 2005-09-05 | 2009-11-16 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Tumor-associeret peptides bindende til human leukocyte antigen (HLA) class I eller II molecules og relateret anti-cancer vaccine |
| WO2007035744A1 (en) | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors |
| GB0519398D0 (en) * | 2005-09-23 | 2005-11-02 | Antisoma Plc | Biological materials and uses thereof |
| GB0607354D0 (en) * | 2006-04-12 | 2006-05-24 | Bioinvent Int Ab | Agent, Composition And Method |
| GB0607798D0 (en) * | 2006-04-20 | 2006-05-31 | Alligator Bioscience Ab | Novel polypeptides and use thereof |
| EP2021791A2 (en) * | 2006-05-31 | 2009-02-11 | Unilever N.V. | Method of screening for compounds that alter skin and/or hair pigmentation |
| EP2474318A1 (en) | 2006-06-07 | 2012-07-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| PL2338907T3 (pl) | 2007-07-27 | 2016-03-31 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nowe immunogenne epitopy do immunoterapii |
| PT2660248E (pt) | 2007-07-27 | 2015-10-12 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nova imunoterapia para tumores neuronais e cerebrais |
| EP2201953A4 (en) | 2007-08-27 | 2011-08-03 | Univ Nagoya Nat Univ Corp | USE OF RIBAVIRIN IN BLOOD COAGULATION DISORDER |
| KR101383476B1 (ko) | 2007-11-01 | 2014-04-11 | 아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤 | 면역억제 폴리펩티드 및 핵산 |
| EP2215473A1 (en) * | 2007-11-27 | 2010-08-11 | Unilever Plc, A Company Registered In England And Wales under company no. 41424 of Unilever House | Screening methods |
| ES2554981T3 (es) | 2008-03-27 | 2015-12-28 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nueva inmunoterapia contra tumores neuronales y cerebrales |
| NO2119726T3 (ja) | 2008-05-14 | 2015-05-23 | ||
| WO2009158240A1 (en) | 2008-06-16 | 2009-12-30 | Emergent Product Development Uk Limited | Salmonella vectored vaccines against chlamydia and methods of use |
| EP2172211B1 (en) | 2008-10-01 | 2014-12-03 | Immatics Biotechnologies GmbH | Composition of tumor-associated peptides and related anti-cancer vaccine for the treatment of glioblastoma (GBM) and other cancers |
| CA2738928A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Cen Ter | Treatment of hepatitis c infection with metalloporphyrins |
| ES2342529B1 (es) | 2008-10-07 | 2011-05-11 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Oncostatina m como potenciador de la actividad inmunoestimuladora de celulas epiteliales humanas. |
| EP2382237A1 (en) | 2008-12-23 | 2011-11-02 | Schering Corporation | Purification of recombinantly produced interferon |
| GB0905790D0 (en) | 2009-04-03 | 2009-05-20 | Alligator Bioscience Ab | Novel polypeptides and use thereof |
| WO2010084160A1 (en) | 2009-01-21 | 2010-07-29 | Oryzon Genomics S.A. | Phenylcyclopropylamine derivatives and their medical use |
| US20120189641A1 (en) | 2009-02-25 | 2012-07-26 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Combination anti-cancer therapy |
| EP2400990A2 (en) | 2009-02-26 | 2012-01-04 | OSI Pharmaceuticals, LLC | In situ methods for monitoring the emt status of tumor cells in vivo |
| EP2401614A1 (en) | 2009-02-27 | 2012-01-04 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation |
| WO2010099138A2 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation |
| US8465912B2 (en) | 2009-02-27 | 2013-06-18 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation |
| EP2412730B1 (en) | 2009-03-27 | 2014-09-10 | JW Pharmaceutical Corporation | Interferon-alpha (ifn-alpha ) fused protein having ifn-alpha and cytoplasmic transduction peptide (ctp) |
| US20120128670A1 (en) | 2009-07-31 | 2012-05-24 | OSI Pharmaceuticals, LLC | mTOR INHIBITOR AND ANGIOGENESIS INHIBITOR COMBINATION THERAPY |
| EP2459211A1 (en) | 2009-07-31 | 2012-06-06 | Medtronic, Inc. | Continuous subcutaneous administration of interferon- to hepatitis c infected patients |
| US8859555B2 (en) | 2009-09-25 | 2014-10-14 | Oryzon Genomics S.A. | Lysine Specific Demethylase-1 inhibitors and their use |
| US8946296B2 (en) | 2009-10-09 | 2015-02-03 | Oryzon Genomics S.A. | Substituted heteroaryl- and aryl-cyclopropylamine acetamides and their use |
| WO2011046221A1 (ja) * | 2009-10-16 | 2011-04-21 | 学校法人立命館 | インターフェロン－αモジュレーター |
| EA201200650A1 (ru) | 2009-10-30 | 2012-12-28 | Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | Курсы комбинированного лечения вируса гепатита с, включающие bi201335, интерферон-альфа и рибавирин |
| ES2635316T3 (es) | 2009-12-18 | 2017-10-03 | Kancera Ab | Anticuerpos contra ROR1 que pueden inducir muerte celular de LLC |
| WO2011106106A2 (en) | 2010-02-24 | 2011-09-01 | Oryzon Genomics, S.A. | Lysine demethylase inhibitors for diseases and disorders associated with hepadnaviridae |
| WO2011106574A2 (en) | 2010-02-24 | 2011-09-01 | Oryzon Genomics, S.A. | Inhibitors for antiviral use |
| US20110275644A1 (en) | 2010-03-03 | 2011-11-10 | Buck Elizabeth A | Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors |
| GB201019331D0 (en) | 2010-03-19 | 2010-12-29 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Methods for the diagnosis and treatment of cancer based on AVL9 |
| GB201004551D0 (en) | 2010-03-19 | 2010-05-05 | Immatics Biotechnologies Gmbh | NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer |
| RS55348B1 (sr) | 2010-04-19 | 2017-03-31 | Oryzon Gnomics S A | Inhibitori lizin specifične demetilaze-1 i njihova upotreba |
| MX2013000242A (es) | 2010-06-24 | 2014-04-14 | Panmed Ltd | Tratamiento de enfermedades relacionadas con el virus de hepatitis c que usa hidroxicloroquina o una combinacion de hidroxicloroquina y un agente antiviral. |
| EP2598482B1 (en) | 2010-07-29 | 2018-04-04 | Oryzon Genomics, S.A. | Arylcyclopropylamine based demethylase inhibitors of lsd1 and their medical use |
| EP2598480B1 (en) | 2010-07-29 | 2019-04-24 | Oryzon Genomics, S.A. | Cyclopropylamine derivatives useful as lsd1 inhibitors |
| WO2012045883A1 (en) | 2010-10-08 | 2012-04-12 | Oryzon Genomics S.A. | Cyclopropylamine inhibitors of oxidases |
| WO2012072713A2 (en) | 2010-11-30 | 2012-06-07 | Oryzon Genomics, S.A. | Lysine demethylase inhibitors for diseases and disorders associated with flaviviridae |
| GB201020995D0 (en) | 2010-12-10 | 2011-01-26 | Bioinvent Int Ab | Biological materials and uses thereof |
| WO2012107498A1 (en) | 2011-02-08 | 2012-08-16 | Oryzon Genomics S.A. | Lysine demethylase inhibitors for myeloproliferative disorders |
| US20140163041A1 (en) | 2011-02-08 | 2014-06-12 | Oryzon Genomics S.A. | Lysine demethylase inhibitors for myeloproliferative or lymphoproliferative diseases or disorders |
| US20120214830A1 (en) | 2011-02-22 | 2012-08-23 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors in hepatocellular carcinoma |
| US9896730B2 (en) | 2011-04-25 | 2018-02-20 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Use of EMT gene signatures in cancer drug discovery, diagnostics, and treatment |
| GB2490655A (en) | 2011-04-28 | 2012-11-14 | Univ Aston | Modulators of tissue transglutaminase |
| GB201115280D0 (en) | 2011-09-05 | 2011-10-19 | Alligator Bioscience Ab | Antibodies, uses and methods |
| MX356344B (es) | 2011-10-20 | 2018-05-23 | Oryzon Genomics Sa | Compuestos de (hetero)arilciclopropilamina como inhibidores de lsd1. |
| IN2014CN03337A (ja) | 2011-10-20 | 2015-07-03 | Oryzon Genomics Sa | |
| CA2853495A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Gilead Pharmasset Llc | Methods and compositions for treating hepatitis c virus |
| EA027296B1 (ru) | 2011-11-29 | 2017-07-31 | Джилид Фармассет Ллс | Композиции и способы лечения вирусного гепатита c |
| WO2013137869A1 (en) | 2012-03-14 | 2013-09-19 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combination therapy for treating hcv infection in an hcv-hiv coinfected patient population |
| WO2013143581A1 (en) | 2012-03-28 | 2013-10-03 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combination therapy for treating hcv infection in specific patient subgenotype sub-population |
| WO2013152252A1 (en) | 2012-04-06 | 2013-10-10 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Combination anti-cancer therapy |
| GB201219678D0 (en) | 2012-11-01 | 2012-12-12 | Benf Ab | Ketone body inhibitors and uses thereof |
| EP3587439A3 (en) | 2013-03-01 | 2020-03-11 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Improved quantification of vaccine compositions |
| US20140357595A1 (en) | 2013-06-04 | 2014-12-04 | Gilead Pharmasset Llc | Methods of preventing and treating recurrence of a hepatitis c virus infection in a subject after the subject has received a liver transplant |
| TWI819228B (zh) | 2013-08-05 | 2023-10-21 | 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 | 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物（八） |
| GB201319446D0 (en) | 2013-11-04 | 2013-12-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors |
| ES2896404T3 (es) | 2014-04-04 | 2022-02-24 | Crown Bioscience Inc Taicang | Métodos para determinar la capacidad de respuesta a inhibidores de MEK/ERK |
| GB201408255D0 (en) | 2014-05-09 | 2014-06-25 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel immunotherapy against several tumours of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML) |
| GB201411037D0 (en) | 2014-06-20 | 2014-08-06 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemai (CLL) |
| GB201501017D0 (en) | 2014-12-23 | 2015-03-04 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers |
| DK3388075T5 (da) | 2015-03-27 | 2024-09-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Hidtil ukendte peptider og kombination af peptider til anvendelse ved immunterapi mod forskellige tumorer |
| GB201505585D0 (en) | 2015-03-31 | 2015-05-13 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers |
| GB201507030D0 (en) | 2015-04-24 | 2015-06-10 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC |
| GB201507719D0 (en) | 2015-05-06 | 2015-06-17 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers |
| PE20230321A1 (es) | 2015-07-01 | 2023-02-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nuevos peptidos y nuevas combinaciones de peptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cancer de ovario y otros tipos de cancer |
| GB201511546D0 (en) | 2015-07-01 | 2015-08-12 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers |
| CA3221001A1 (en) | 2015-07-06 | 2017-01-12 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against esophageal cancer and other cancers |
| GB201513921D0 (en) | 2015-08-05 | 2015-09-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers |
| US20180371551A1 (en) | 2015-12-03 | 2018-12-27 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Mat2a inhibitors for treating mtap null cancer |
| GB201522667D0 (en) | 2015-12-22 | 2016-02-03 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers |
| GB201602918D0 (en) | 2016-02-19 | 2016-04-06 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against NHL and other cancers |
| IL302705A (en) | 2016-03-01 | 2023-07-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides, combinations of peptides, cell-based drugs for use in immunotherapy against bladder cancer and other types of cancer |
| LT3430037T (lt) | 2016-03-16 | 2022-12-12 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Transfekuotos t ląstelės ir t ląstelių receptoriai, skirti naudoti vėžio gydymui taikant imunoterapiją |
| DK3430030T5 (da) | 2016-03-16 | 2024-09-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Transficerede t-celler og t-cellereceptorer til anvendelse i immunoterapi mod cancer |
| BR112018070067A2 (pt) | 2016-04-06 | 2019-02-12 | Immatics Biotechnologies Gmbh | peptídeos e combinações de peptídeos para uso em imunoterapia contra lma e outros cânceres |
| TWI796299B (zh) | 2016-08-26 | 2023-03-21 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 用於頭頸鱗狀細胞癌和其他癌症免疫治療的新型肽和支架 |
| WO2018138257A1 (en) | 2017-01-27 | 2018-08-02 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers |
| CA3059644A1 (en) | 2017-04-10 | 2018-10-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination thereof for use in the immunotherapy against cancers |
| TW201841937A (zh) | 2017-04-10 | 2018-12-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 用於白血病和其他癌症免疫治療的新穎肽和肽組合物 |
| US11427614B2 (en) | 2017-04-10 | 2022-08-30 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination thereof for use in the immunotherapy against cancers |
| EP4316597A2 (en) | 2017-07-07 | 2024-02-07 | immatics biotechnologies GmbH | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against lung cancer, including nsclc, sclc and other cancers |
| US10800823B2 (en) | 2017-07-07 | 2020-10-13 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against lung cancer, including NSCLC, SCLC and other cancers |
| DE102018107224A1 (de) | 2018-02-21 | 2019-08-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten |
| TW202016131A (zh) | 2018-05-16 | 2020-05-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 用於抗癌免疫治療的肽 |
| US10925947B2 (en) | 2018-06-29 | 2021-02-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | A*03 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods |
| TW202019955A (zh) | 2018-07-31 | 2020-06-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | B*07 限制肽和肽組合的抗癌免疫治療和相關方法 |
| US11945850B2 (en) | 2018-09-17 | 2024-04-02 | Immatics Biotechnologies Gmbh | B*44 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods |
| TW202024121A (zh) | 2018-09-18 | 2020-07-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | A*01 限制肽和肽組合物在抗癌免疫治療中的用途和相關方法 |
| TW202039535A (zh) | 2018-12-18 | 2020-11-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | B*08限制肽和肽組合物抗癌免疫治療和相關方法 |
| TW202229312A (zh) | 2020-09-29 | 2022-08-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 由非ｈｌａ－ａ*０２顯露以用於不同類型癌症之免疫治療的醯胺化肽及其脫醯胺化對應物 |
| DE102020125457A1 (de) | 2020-09-29 | 2022-03-31 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Amidierte Peptide und ihre deamidierten Gegenstücke, die durch HLA-A*02-Moleküle präsentiert werden, zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten |
| TW202241925A (zh) | 2021-01-15 | 2022-11-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 用於不同類型癌症免疫治療的ｈｌａ展示肽 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3699222A (en) * | 1958-03-11 | 1972-10-17 | Nat Res Dev | Production of viral interfering substances |
| GB1412591A (en) * | 1971-11-30 | 1975-11-05 | Beecham Group Ltd | Antiviral ds rna and compositions thereof |
| US4184917A (en) * | 1974-04-01 | 1980-01-22 | Sandoz Ltd. | Process for producing a structurally modified interferon |
| GB1521032A (en) * | 1974-08-08 | 1978-08-09 | Ici Ltd | Biological treatment |
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| US4190495A (en) * | 1976-09-27 | 1980-02-26 | Research Corporation | Modified microorganisms and method of preparing and using same |
| DE2724918A1 (de) * | 1977-06-02 | 1978-12-14 | Thomae Gmbh Dr K | Gewinnung und reinigung von humaninterferon |
| ZA782933B (en) * | 1977-09-23 | 1979-05-30 | Univ California | Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria |
| FR2422956A1 (fr) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
| JPS5519239A (en) * | 1978-07-28 | 1980-02-09 | Green Cross Corp:The | Interferon-producing attractant |
| FI792481A (fi) * | 1978-08-11 | 1980-02-12 | Univ California | Syntes av enkaroytiskt protein genom anvaendning av mikro-organismer |
| GB2033905B (en) * | 1978-08-21 | 1982-10-13 | Upjohn Co | Bacterial preparation of proteins |
| JPS5561798A (en) * | 1978-10-30 | 1980-05-09 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Preparation of novel recombination dna |
| FR2440957A1 (fr) * | 1978-11-13 | 1980-06-06 | Pasteur Institut | Vecteurs appropries a l'insertion dans leurs genomes de fragments d'adn etrangers, selon l'une quelconque des phases de traduction possibles, et moyens pour leur fabrication |
| IN150740B (ja) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
| US4241174A (en) * | 1978-11-24 | 1980-12-23 | Hoffmann-La Roche Inc. | Interferon assay |
| FR2444713A1 (fr) * | 1978-12-18 | 1980-07-18 | Pasteur Institut | Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant |
| FI77877C (fi) * | 1979-04-20 | 1989-05-10 | Technobiotic Ltd | Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein. |
| ZA802992B (en) * | 1979-06-01 | 1981-10-28 | Univ California | Human pre-growth hormone |
| US4262090A (en) * | 1979-06-04 | 1981-04-14 | Cetus Corporation | Interferon production |
-
1980
- 1980-02-04 US US06/118,084 patent/US4530901A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-02-19 IN IN116/DEL/80A patent/IN153751B/en unknown
-
1981
- 1981-01-07 ZA ZA00810103A patent/ZA81103B/xx unknown
- 1981-01-07 JP JP52181A patent/JPS56150100A/ja active Granted
- 1981-01-08 SU SU813233703A patent/SU1764515A3/ru active
- 1981-01-08 UA UA3233703A patent/UA13380A/uk unknown
-
1986
- 1986-08-04 JP JP61182054A patent/JPS62122590A/ja active Granted
-
1994
- 1994-10-17 MD MD94-0340A patent/MD431C2/ro unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03111077A (ja) * | 1989-09-26 | 1991-05-10 | Nikko:Kk | 走行玩具の方向変換装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SU1764515A3 (ru) | 1992-09-23 |
| IN153751B (ja) | 1984-08-18 |
| MD431C2 (ro) | 1996-07-31 |
| US4530901A (en) | 1985-07-23 |
| JPH0321151B2 (ja) | 1991-03-22 |
| JPH0321150B2 (ja) | 1991-03-22 |
| JPS56150100A (en) | 1981-11-20 |
| ZA81103B (en) | 1982-01-27 |
| UA13380A (uk) | 1997-02-28 |
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