JPH02482A - ヒトインターロイキン３様ポリペプチドの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、ヒトインターロイキン３（以下「ｈｌＬ−３
Ｊという）の遺伝子組換えによる製造技術に関する。具
体的にはｈｌＬ−３ポリペプチドをコードする合成遺伝
子、該ＤＮＡで形質転換された大腸菌及びこれらを用い
るｈｌＬ−３様ポリペプチドの製造法、ならびにｈ　Ｉ
　Ｌ　−３＋、’ｊポリペプチド、に関する。

従来技術 ｈｌＬ−３は、造血細胞の共通幹細胞や各種白血球（顆
粒球、好酸球、マクロファージ、血小板、肥満細胞）の
前駆細胞に分化及び増殖を促す生理活性物質である。故
に、白血球減少症の治療、ＥＰＯ（エリスポエチン）と
の併用による赤血球増加、その他にｈｌＬ−３は有用と
考えられる。

ｈｌＬ−３の遺伝子組換えによる製造技術については、
既に報告（Ｙ、Ｃ，Ｙａｎｇら：Ｃｅ１ｌ、４７、Ｉ３
−１０　（１９８Ｇ）およびり、Ｄｏｒｓｓｃｒら：　
　Ｇｅｎｅ　５５、ｐＨ５〜１２４　、（１９８７））
があり、ｈｌＬ−３をコードする遺伝子の塩基配列並び
にそれによって生産されるポリペプチドのアミノ酸配列
は共に公知である。

尚、ｈ　Ｉ　Ｌ　−−３は、１５２個のアミノ酸残基が
ら成るポリペプチドを含む糖蛋白と考えられている（Ｙ
、Ｃ，Ｙａｎｇら：Ｃｃｌｌ、４７、Ｉ３〜１０（１９
８６））。

〔発明の概要〕

発明が解決しようとする問題点 一般に遺伝子組換え技術による物質生産においては、宿
主として動物細胞あるいは酵母を用いるよりも大腸菌を
用いたほうが物質生産性が高いのが普通である。ｈｌＬ
−３をコードする遺伝子の大腸菌による発現に関しては
、本発明者らの知る限り報告はない。このため、ｈｌＬ
−３活性を有するポリペプチドないし糖蛋白のより効率
的な製造技術を確立することが望まれていた。

本発明者らは、この課題を解決することを１」的として
、５′末端上流にＳ、　Ｄ、配列を含む合成りＮＡ鎖を
用いることにより、大腸菌菌体中で、ｈｌＬ−３を高発
現させることができた。

すなわち、単に化学合成した大腸菌の優先コドンを使用
したとしても、かならずしも効率発現が期待されるもの
ではないことはよく知られているが（Ｙ、Ｎａｇａｓｅ
ら：　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　
Ｓ＞＋ｇｐｏ−ＳＩＩＪＩＩ　５ｅｒｉｅｓ　Ｎｏ、Ｉ
２．　ｐ、８３−８８　（１９８３）　）　、本発明に
よって、高発現にｆイ効な合成遺伝子を見出し、大腸菌
菌体中の３０％以上のｈＴＬ−３を生産することが可能
になったといえる。本発現間は種の相違はあるにしても
、マウスＩＬ−３の２倍量に達するものである（Ｖ、Ｋ
Ｉｎｄｌｅｒら：　Ｐｒｏｅ、　Ｎａ１ｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｌ、　ＵＳ＾　８３．１００１−１０
０５　（１９８Ｂ））。

発明の要旨 本発明は上記の問題点を解決するためになされたもので
あり、ｈｌＬ−３ポリペプチド、すなわちｈｌＬ−３活
性をＨするポリペプチド、を大腸菌で効率よく製造する
ための手段を提供するものである。すなわち本発明は、
先ず、そのためのＤＮＡ鎖に関するものであるところ、
本発明によるＤＮＡ鎖は第１図または第２図に示す塩基
配列を含むものである。また、本発明はこのＤＮＡ鎖を
含むプラスミドに関するものであるところ、本発明によ
るプラスミドは、第１図または第２図に示す塩基配列を
含むＤＮＡ鎖を含むもの、である。

また、本発明はこのＤＮＡ鎖の遺伝情報をもたせた大腸
菌形質転換体に関するものであるところ、本発明による
大腸菌は、第１図または第２図に示す塩基配列を含むＤ
ＮＡ鎖をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミ
ドによって形質転換されたもの、である。

さらにまた、本発明は、このＤＮＡ鎖の遺伝情報を利用
してｈｌＬ−３を製造する方法に関するものであるとこ
ろ、本発明によるｈｌＬ−３ポリペプチドの製造法は第
１図または第２図に示ず塩基配列を含むＤＮＡ鎖を用意
し、このＤＮＡ鎖を、これをその遺伝情報が発現可能な
状態で含むプラスミドの作成、このプラスミドによる大
腸菌の形質転換および得られる形質転換体の培養から成
る工程に付して培り物中にｈｌＬ−３ポリペプチドを産
生させること、を特徴とするものである。

本発明は、また、ｈｌＬ−３様ポリペプチドにも関する
ものであって、このポリペプチドは第１図または第２図
に示すアミノ酸配列からなり、糖類を含Ｈせずしかもｈ
ｌＬ−３の生理活性をｒイするもの、である。

発明の効果 本発明のＵ本をなすＤＮＡ配列は、大腸菌での発現用に
改変しであるので（その内容の詳細は後記）、本発明に
よればｈｌＬ−３活性を有するポリペプチドを大腸菌で
効率よく製造することができる。

なお大腸菌に産生させたｈｌＬ−３ボリペブチドは、大
腸菌を宿主とするポリペプチドの遺伝子上学的生産法の
枠内のものであるから、糖鎖を持たないものであるが、
後記実験例に示されるように、そのような状態であって
もこのポリペプチドは本来は糖蛋白質であるｈｌＬ−３
の活性を持つ。

糖蛋白での糖鎖の存在は当該ｉ蛋白の生物活性にとって
必須であろうと解されることからすれば、本発明ポリペ
プチドのこの特性は思いがけなかったことといえよう。

〔発明の詳細な説明〕

本発明のＤＮＡ鎖 本発明によるＤＮＡ鎖は、第１図または第２図に示す塩
基配列を含むものである。

これらの塩基配列は、公知のｈｌＬ−３（Ｍａｔｕｒｅ
部分）のポリペプチドをコードするものであるが、大腸
菌で高発現させることができるよう、５′末端の塩基配
列を大腸菌の各種遺伝子の翻訳開始部位に共通な塩基配
列に近づけること（Ｓｅｈｅｒｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　８　　ｐ３８９
５−３９０５　（１９８０））を考慮して本発明者らが
設計したものである。

また、本発明によるＤＮＡ鎖によってコードされる上記
ポリペプチドがＴＪ１図および第２図に示されているが
、第１図のポリペプチドはＮ末端側から９番目のアミノ
酸がセリン（Ｓｃｒ）であり（以後、ｎ＝９：Ｓｃｒと
記す）、第２図のポリペプチドはこの９番目のアミノ酸
がプロリン（Ｐｒｏ）である（以後、ｎ−９：Ｐｒｏと
記す）。

尚、本発明のＤＮＡ鎖は、これを適当なベクターに結合
させて大腸菌に導入して高発現させるだめのものである
が、このＤ　Ｎ　Ａ　＃Ａの高発現を実現させるために
は、前記の塩基配列の５′末端上流側にＳ、　Ｄ、配列
を含む下記の塩基配列（Ｓｃｌ＋ｅｒｅｒ。

ｅＬ　ａｔ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｉ？ｅｓ、　
８　ｐ３８９５−３９０５　（＋９８０）　）をＨする
ことが好ましい。

ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＴ ＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＴＡＡ また本発明によるＤＮＡ鎖は、前記の塩基配列の３′末
端下流に終始コドンを２つ以上有していてもよい。更に
、この遺伝子組換操作を容易にするだめの適当な制限酵
素部位を付加しておくことが好ましい。

本発明のＤＮＡ鎖は合目的的な任意の方法で製造するこ
とができるが、その−例を示すと次の通りである。

第１図の塩基配列を含むＤＮＡ鎖の製造は、下記の通り
に行なうことができる。すなわち、ＤＮＡ鎖をたとえば
３個の１１０から１６０塩基に・１程度のブロックに分
けて合成し、各ブロックを連結し、適当なりローニング
ブラスミド（例えば、ｐＵｃ１８　。Ｃ，Ｙａｎｉｓｃ
ｌ＋−Ｐｅｒｒｏｎら：　Ｇｅｎｅ３３　ｐ１０３−１
１９　（１９８５））に挿入連結することにより目的と
するＤＮＡ鎖を得る。

各ブロックの合成は、これを２５−３５塩基対程度のオ
リゴヌクレオチドに分けて合成し、これらを会合させる
ことにより行なう。プロ、ツクをオリゴヌクレオチドに
区分けする際には、各オリゴヌクレオチドが自己会合を
起こすことがないように、１つのオリゴヌクレオチド内
に自己相補的配列が出現しないようにすることが必要で
ある。又、オリゴヌクレオチドが、目的以外のオリゴヌ
クレオチドと会合することを避ける為に、なるべくオリ
ゴヌクレオチド間の重複配列を、少なくする必要がある
。

第３図は、区分けしたオリゴヌクレオチドの塩基配列の
一例を示すものである。第４図は、これらのオリゴヌク
レオチドからの各ブロックの構成例、及びこれらのブロ
ックからの、第１図に示すＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ
二重鎖の構成を示すものである。第５図は、各ブロック
の塩基配列と制限酵素部位の一例を示すものである。

各オリゴヌクレオチドは、既知の合成法によって合成す
ることができる（例えばホスホアミダイト法によるＩｎ
合成法（Ｂｃａｕｃａｇｃら：ＴｃＬｒａｈｃｄｒｏｎ
　Ｉ、ａｌｔｅｒｓ　２２１８５９−１８６２　（＋９
８１）　）。

また、この合成法に基づく自動合成機を使用することも
可能である。各ブロックの構築は、各オリゴヌクレオチ
ドの５′末端を必要に応じてポリヌクレオチドキナーゼ
でリン酸化した後アニールし、ＤＮＡリガーゼによって
二重鎖ＤＮＡとすることにより行なう。更に、構築した
ブロックの５′末端を必要に応じてポリヌクレオチドキ
ナーゼでリン酸化した後、ＤＮＡリガーゼによって各ブ
ロックを連結し、第１図に示すＤＮＡ塩基配列及びＳ、
　　Ｄ、配列を含む本発明のＤＮＡを得る（第６図）。

このＤＮＡを、ｐＵｃ１８のＨｉｎｄｎｌ及びＢａｍＨ
Ｉによる切断片と連結させてプラスミドｐｓ１１を得て
、これで適当な宿主菌、特に大腸菌、たとえば大腸菌Ｊ
Ｍ１０９、を形質転換する。次いで、ｐｓｌｌを１ｌｔ
ｉ！ｉＬ、ダイデオキシ法によって塩Ｗ配列を確認する
。このようにして得られるｐｓｌｌを、ＨｉｎｄＩ［Ｉ
及びＢａｍＨＩにて消化することにより、第１図に示す
塩基配列及びＳ、　Ｄ、配列を含む本発明のＤＮＡ鎖（
第６図）を得ることができる。

第２図の塩基配列あるいはこの塩基配列およびＳ、　Ｄ
、配列、を含むＤＮＡ鎖の製造は、前記の第１図の塩基
配列あるいはこの塩基配列およびＳ。

Ｄ、配列、を含むＤＮＡ鎖の製造に準じた手順によって
行なうことができる。

ただしこの場合には、前記オリゴヌクレオチドＡ−２代
わりに下記のＡ−９を、Ａ−６の代わりに下記のＡ−１
０を用いる。

＾−９：＾ＡＴＧＡＣＡＣ＾＾＾ＣＴＡＣＴＣＣＴＣＴ
Ｇ＾＾＾＾ＣＴ＾−１０：　ＣＣ＾＾Ｇ＾＾ＧＴＴＴＴ
ＣＡＧＡＧＧＡＧＴＡＧＴＴＴＧＴこの様にして、第２
図に示す塩基配列およびＳ、　Ｄ、配列を含む本発明の
ＤＮＡ鎖（第７図）を得ることができる。

形質転換体の作成 上記のようにして調製される本発明ＤＮＡ鎖は、ｈｌＬ
−３蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいるので、こ
れを含むプラスミドを生物工学的手法によって大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ）に導入して形質転換し、得られる形質転
換体を培養することにより、ｈｌＬ−３様ポリペプチド
ないし蛋白をつくらせることができる。本発明による、
上記ＤＮＡ鎖を含むプラスミドは、第８図（第１図に示
す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を含むもの）および第９図（
第２図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を含むもの）に示
されている。

形質転換体の作成（およびそれによるｈｌＬ−３の生産
）のための手順ないし方法そのものは、分子生物学、生
物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用されている
ものでありうるので、本発明においても下記したところ
以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実施すれ
ばよい。大腸菌中で本発明のＤＮＡ鎖の遺伝子を発現さ
せるためには、まず大腸菌中で安定に存在するプラスミ
ドベクター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。

このプラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２″、９
合［１的的なＩＥ意のものを用いることができる。

一方、本発明のＤＮＡ鎖の遺伝子を大腸菌で発現させる
ためには、そのＤＮＡをｍＲＮＡへ転写させる必要があ
る。そのためには、転写のためのシグナルであるプロモ
ーターを本発明ＤＮＡ鎖の５′側上流（こ組込めばよい
。このプロモーターについてはでにｔ　ｒｐ、Ｉａｃ、
ＰＬ、ＯｍｐＦ等種々知られており、本発明でもこれら
のいずれをも利用することができる。

また、転写を終結させるためのターミネータ−を本発明
ＤＮＡ鎖の３′側下流に組込むことが好ましい。ターミ
ネータ−を挿入することにより、プラスミドの安定性を
高めることができる。ターミネータ−としては、ｔｒｐ
ａＳ　ｒｒｎｃ。

ｔｏｏｐ等を用いることができる。

また、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させる段階では蛋白合成の
場であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合するた
めに必要な配列（Ｓ、Ｄ、配列と呼ばれる）を、蛋白合
成の開始信号であるＡＴＧの前につける必要がある。更
に効率的に発現させる為には、このＳ、Ｄ、配列並びに
このＳ、　Ｄ。

配列と蛋白合成の開始信号であるＡＴＧとの間の塩基配
列を、大腸菌における翻訳開始部位に共通な塩基配列に
近づけることが好ましい。例えば、Ｓ、Ｄ、配列を下記
の塩基配列のものとすることが好ましい。

ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＴ ＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＴＡＡ このようにしてつくったプラスミドによる大腸菌の形質
転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されて
いる合目的的な任意の方法によって行なうことができる
。その一般的な事項については、適当な成書または総説
たとえばＭａｎｉａＬｉｓら、ｒＭｏｌｅｃｕｌｅｒ　
　Ｃｌｏｎｌｎｇ−＾　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａ
ｎｕａｌ　　ＪＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）を参照すれば
よい。

形質転換体は、本発明ＤＮＡ鎖によって導入された遺伝
情報による新しい形質（すなわちｈＩＬ３の生産能）お
よび使用１ベクター由来の形質ならびに場合によっては
、生じているかも知れない遺伝子組換時の使用ベクター
からの一部の遺伝情報の欠落を除けば、そのゼノタイブ
ないしフェノタイプあるいは菌学的性質において使用人
／ｌ！菌と同じである。

ｈｌＬ−３様ポリペプチドの生産 上記のようにして得られる１］ニ質転換体のクローンは
、これを培養すれば培養物の菌体中にｈｌＬ３様ポリペ
プチドないし蛋白を生産する。

形質転換体の培養ないし増殖条件は、使用大腸菌に対す
るそれと本質的には弯らない。また、培養物すなわち菌
体および（または）培養液からの生産蛋白の回収も合目
的的な任意の方法（例えば、後記実施例５記載の方法）
に従って行なうことができる。ｈｌＬ−３様ポリペプチ
ドは大腸菌中において凝集した形で生産されるので、こ
の蛋白を１０１収後、変性剤（例えば、塩酸グアニジン
、尿素）を用いて溶解し、ジスルフィド結合を還元剤（
例えばジチオスレイトール）を用いて切断してから常法
に従って精製することが好ましい。

ｈＩＬ−３様ポリペプチド 本発明によるｈｌＬ−３様ポリペプチドは、第１図また
は第２図に示すＤＮＡ鎖の大腸菌における発現生成物で
あり、糖鎖を釘せずしかもｈｌＬ−３の生理活性を有す
るものである。

このｈ　Ｉ　Ｌ　−３＋、１ポリペプチドは第１図また
は第２図に示すＤＮＡ鎖の発現生成物であるから、その
塩基配列は、典型的なかつ好ましい第１図または第２図
に示したものの外に、その縮重異性体、すなわち同一ア
ミノ酸をコードする他のコドン、の配列であってもよい
。

このｈｌＬ−３様ポリペプチドは糖蛋白であるｈｘＬ−
３の必須要素と解される糖鎖を持たないにもか−わらず
、ｈｌＬ−３の生理活性を有していて、天然ｈｌＬ−３
と同等の用途に用いることができる。

実施例 実施例１：　オリゴヌクレオチドの合成第３図に示すオ
リゴヌクレオチドならびに前記のオリゴヌクレオチドＡ
−９および八−１０は、ホスホアミダイト法（Ｄｅａｕ
ｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎｌ、ｅＬｔｅｒｓ
　２２１８５９−１８Ｇ２　（１９８り）を用いたＤＮ
Ａ自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製３８０
Ａ型、Ｍ、ｌ１ｕｎｋａｐｉ　Ｉ　ｆａｒら：　Ｎａｔ
ｕｒｅ　３１０，１０５−１１１（１９８４））を使用
して合成した。

合成終了後、濃アンモニア水で６０℃で５時間処理して
、塩基の保護基を除くとともに担体からの切り出しを行
なった。ｊすられたオリゴヌクレオチドを高性能液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した。すな
イ〕ち、逆相の中性軟質ポリスチレン系ゲル（ＰＲＰ　
−Ｌハミルトン社）のカラム（φ４．ｌＸ１５０＋ｎｉ
）にかけ、０．１Ｍトリエチルアミン酢酸緩衝液中（ｐ
Ｈ７，０）のアセトニトリルの直線ａ度勾配法によって
精製した。目的とするピークのものを集め、８Ｍ尿素を
含む１２％ポリアクリルアミドを用いた電気泳動にかけ
た。電気泳動後ゲルの下に螢光色素を含む薄層クロマト
グラフィーのプレートを置き、ＵＶランプを用いて目的
のバンドの存在を確認した。目的とするオリゴヌクレオ
チドを含むゲル片を、透析チューブ内に封入し、ＤＮＡ
をゲルから電気的に溶出させた。この透析チューブ内液
をセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）のゲル
シン濾過カラム（φ１．５Ｘ４３ｃｍ）Ｉこか（す、０
．０５Ｍトリエチルアミン重炭酸緩衝液（ｐＨ７，５）
にて溶出させて脱塩した。目的とするオリゴヌクレオチ
ドを含む溶出液を減圧濃縮して、純粋なオリゴヌクレオ
チドを得た。

実施例２：　オリゴヌクレオチド及び各ブロックのライ
ゲーション 化学合成したオリゴヌクレオチド２８本を第４図のブロ
ックの調製計画に従って連結（ライゲーション）した。

すなわち、先ず、各ブロックの５′末端にあるオリゴヌ
クレオチドを除く残りの２４本の各オリゴヌクレオチド
（各０．７ｎｍｏｌ）を２０μｌのリン酸化反応液（５
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４，１０ｍＭＭ
ｇＣｌ、、１（１ｍＭ　　ＤＴＴ、３０μＣｉの（γ−
３２Ｐ）ＡＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、１５ユ
ニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー
、マンハイム社））中で３７℃で３０分間反応させて、
５′末端をリン酸化してラベルした。次いで、１００ｍ
ＭＡＴＰを１μ■加え、３７℃で３０分間反応させるこ
とで完全に５′末端をリン酸化し、１００℃で５分間加
熱することで反応を停止した。

次いで、第４図のライゲーション計画に従い、各オリゴ
ヌクレオチドを混合し、９５℃で５分間加熱し、２時間
かけて常温まで戻した。これを最終容量２００μｌのラ
イゲーション反応液（５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、
ｐ）Ｉ’７．４．１０ｍＭＭｇＣ１つ、１５ｍＭ　　Ｄ
ＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰ。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼ３０ユニット（宝酒造））中で１４
℃で１４時間反応させた。一部の反応溶液を８％ポリア
クリルアミド電気泳動にかけ、ラジオオートグラフで各
ブロックがライゲーション反応の結果として得られたこ
とをそれぞれ確認した。

次に、上記反応溶液にエタノールを加えてＤＮＡを沈殿
させ、同様に８％ポリアクリルアミド電気泳動にて分離
した。各ブロックを含むゲル片を透析チューブに入れ、
泳動緩衝液中で電気泳動することによりそれぞれ溶出さ
せた。次に、各透析チューブ内液をＮＡＣＳカラム（ベ
セスダ、リサーチ２　ラボラトリ−社）にかけ、溶出液
にエタノールを加えて、ＤＮＡをそれぞれ沈殿させた。

オリゴヌクレオチドをライゲーションして得たブロック
３本を第４図のブロックの結合計画に従ってライゲーシ
ョンした。すなわち、先ず、ＡブロックＤＮＡ　（０，
５μｇ）、ＢブロックＤＮＡ（１，１μｇ）、及びＣブ
ロックＤＮＡ　（０，５μｇ）を各々２０μｌのオート
クレーブ水に溶解した。ＢブロックＤＮＡ水溶液に、３
μｌの（５００ｍＭ　　Ｔｒ　１ｓ−１（ＣＩＳｐＨ７
，４，１００ｍ　？ｖＩ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１つ）溶液、１
μｍの１．００口＋Ｍ　　ＡＴＰ、　　３μｍ（３００
ユニツト）のポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造））、
３μｍのオートクレーブ水を加えて３７℃にて１時間反
応させた後、１００℃にて５分間煮沸することで酵素を
失話させた。この溶液１０　ｕ　ｌに１０μｌのＡブロ
ック水溶液、１０　ｔｔ　ｌのＣブロック水溶液、４１
１１の（５０Ｌ１ｍＭ　　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＬｐ
Ｈ７，４，１００ｍＭ　　ＭｇＣ１２）溶液を加えた。

この溶液を６０℃にて２分間部首した後、４５分間かけ
て１５℃まで温度を下げた。更に、１μｌの１００ｍＭ
　　ＡＴＰ、ｌμｌのＬＭＤＴＴ、４μｌ　　（４ユニ
ツト）の７４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイ
ム社）を加え、１５℃にて１４時間反応させた。一部の
反応溶液を８％ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、オ
ートラジオグラフィーでＡ、Ｂ、Ｃブロックが結合して
４２６塩基ｆＪのバンドがライゲーションの結果として
得られた事を確認した。次に、上記反応溶液にエタノー
ルを加えてＤＮＡを沈殿させ、同様に８％ポリアクリル
アミド電気泳動にて分離した。ブロックを含むゲル片を
透析チューブに入れ、泳動緩衝液中で電気泳動すること
により、それぞれを溶出させた。透析チューブ内液をＮ
ＡＣＳカラム（ベセスダ、リサーチ、ラボラトリ−社）
にかけ、溶出液にエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ
た。これにより、第６図に示すＳ、　Ｄ、配列を含む本
発明のＤＮＡ鎖を調製した。

また上記と同様の手順により、第７図に示すＳ、　Ｄ、
配列を含む本発明のＤＮＡ鎖を調製した。

ただしこの場合には、オリゴヌクレオチドＡ−２の代わ
りにＡ−９を、またＡ−６の代わりにＡ１０を用いた。

実施例３：　　ｈＩＬ−３遺伝子のクローニングクロー
ニングベクターには大腸菌のプラスミドｐＵｃ１８（フ
ァルマシア社）を用いた。１μｇのｐＵＣ１８ＤＮＡを
３０μｌの反応液（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ
Ｈ７，５、ｌＱｍＭＭｇＣｌつ、１ｍＭ　　ＤＴＴ、５
０ｍＭＮ　ａ　Ｃ１、１０ユ−ットのＨｉｎｄＩ［Ｉ（
宝酒造）、１０ユニツトのＢａｍＨＩ　（宝酒造））中
、３７℃で２時間反応させた後、０．８９６アガロース
電気泳動により大フラグメントを分離した。ゲル片をチ
ューブに入れ、泳動緩衝液中で電気泳動することにより
溶出させた。溶出液にエタノールを加えて沈殿させ、２
０ｕ　ｌのＴＥ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡＳｐＨ８，０）にて溶解した。０．１μｇの実施
例２で調製した２種類の４２５塩基対のＤＮＡ　（第６
図及び第７図）を２０μｍの反応ｉｌ＆　（５０ｍＭ　
　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ５ｐＨ７，４，１０ｍ　Ｍ　
　Ｍ　ｇ　Ｇ　つ、５ｍＭ　　ＡＴＰ、１０＋−ニット
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造））中、３７
℃で１時間反応させて、リン酸化した。これらの反応液
５μｌを前記のｐＵＣｌ　８ＤＮＡ断片ＴＥ溶液（５，
ｃｚ　Ｉ）に加え、更に２　μｌの（６６０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４，５０ｍＭＭｇＣＩ２．５０ｍ
Ｍ　　ＤＴＴ）溶液、１μｌの１０ｍＭ　　ＡＴＰ、３
μｌ（３ユニツト）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ーφマンハイム社）、４μｌのオートクレーブ水を加え
、室温で６時間反応させた。

これらの反応液を用い、大腸菌ＪＭ１０９株（Ｃ，Ｙａ
ｎｉｓｃｈ−Ｐｃｒｒｏｎら：　Ｇｃｎｃ、　３３、ｐ
１０３−１１９（１９８５））　　（宝酒造）を既知の
方法（Ｄ、Ｈａｎａｈａｎ　：Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
　ｐ５５７−５８０　（１９８０）　）により形質転換
させた。その際、プレートには５０μｙ／ｍｌのアンピ
シリンを含むＬＢプレートを用いた。

ｈＩＬ−３遺伝子のＤＮＡがｐＵｃ１９のＨｉｎｄＴＥ
及びＢａｍＨＩの間に挿入された場合、挿入されたＤＮ
ＡによるユニークなＡ　ｔ　Ｉ　Ｈ７ｌ限酵素部位が存
在する。そこで、プラスミドＤＮＡをアルカリ法（Ｔ、
ＭａｎｉａＬＩｓら：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ
−＋ｎｇ　ｐ３［１８−３６９（１９８２）、Ｃ０１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ）にて大腸菌株より分
離し、ＡｆｌＩＩ（宝酒造）によって消化されることを
確認した。またｐｓｌｌおよびｐｓｌｌｏについてダイ
デオキシ法（眼部ら：Ａｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｃｎ＋、
　１５２ρ２３２−２３８　（１９８８））を用いて第
６図および第７図に示される塩基配列を各々確認した。

得られた菌株をｐｓ１１／ＪＭ１０９およびｐＡ　Ｉ　
１０／ＪＭＩ　０９とした。

実施例４：　　ｈＩＬ−３の発現用プラスミドの構築 既に提案されているヒト顆粒球マクロファージコロニー
刺激因子の発現用プラスミド（ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ）ｐｓＴ
６３１１　　（第８図およびｍ９図）（特願昭６２−１
０６１４８号明細書）を用いて、ｈｌＬ−３の発現用プ
ラスミドｐｓＴ１１およびｐｓＴｌｏｌを構築した。

ｐｓＴ６３１１はｐＢＲ３２２由来のｐＡＴ１５３（ア
マジャム・ジャパン）を基にして構築されたものであっ
て、ＥｃｏＲ］とＡｆｌＩＩの間に化学合成した大腸菌
のトリプトファンオペロンのプロモーター、オペレータ
ー及び転写開始点よりＳ、Ｄ、配列直前までの塩基配列
を、ＡｆｌＩｒとＢａｍＨＩの間に化学合成したＳ、　
Ｄ、配列及びｈＧＭ−Ｃ３Ｆの構造遺伝子を、更に、Ｂ
ａｍＨｌと５ｐｈｌの間に化学合成したｔ　ｒｐａのタ
ーミネータ−を、それぞれ含んでいる、ｈＧＭ−ＣＳＦ
発現ベクターである。

前記のｐｓｌｌおよびｐｓｌｌｏをＡｆｌｌＩ及びＢａ
ｍＨＩにて消化後、０，８％アガロース電気泳動により
、４２３塩基対のＤＮＡ断片を精製した。前記発現用ベ
クターｐｓＴ６３１１をＡｆｌｌＩ及びＢａｍＨＩによ
り消化後、上記２種類の４２３塩基対のＳ、　Ｄ、配列
を含むｈｌＬ−３逍伝子をＴ４リガーゼによりライゲー
ションして挿入し、大腸菌ＲＲＩ株（ＡＴＣＣ３１３４
３）を形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーより
プラスミドを単離し、ＥｃｏＲＩにて消化して、約４５
０塩基対のＳ、Ｄ、配列を含むｈｌＬ−３逍伝Ｔが挿入
された事を確認した。？すられた菌株を、ｐｓＴ１１／
ＲＲ１およびｐｓ”ｒｌｏｌとした（第８図および第９
図参照）。

施例５：　　ｈＩＬ−３の製造法（第１図および第２図
のＤＮＡ鎖の発現） プラスミドｐｓＴ１１／ＲＲＩおよびｐＳＴ１０１／Ｒ
Ｒ１の発現を下記の通りに行なった。

すなわち、先ず、前記のｐｓＴ１１／ＲＲＩおよびｐｓ
Ｔ１０１／ＲＲＩを各々アンピシリン含有し培地にて３
７℃で一晩振とう培養した。この培養液２０ｍ１を１０
１００ＯのＭ９培地（０，８％グルコース、０．４９６
カザミノ酸、１０．ｃｚｇ／ｍｌチアミン、５０μｇ／
ｍｌアンピシリンを含む）に加え、３７℃にて３時間振
とうした。インドールアクリル酸を最終ｌａ度２０ｕｇ
／ｍｌになるように添加した。このまま史に５時間振と
う培養した。

ｉすられた大腸菌の一部をサンプル緩衝液中で煮沸（５
分）し、煮沸液について５ＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動（ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ）を行って、ｈｌＬ’−３
の金白゛瓜を調べた。この条件においては、大腸菌細胞
蛋白質の３０？６以上であった。

このｐｓＴ１１／ＲＲＩ培養液を遠心分離して、菌体を
得た。得られた菌体を２０ｍＭ　　ＴｒｉｓＭＣＩ　　
（ｐＨ８，０）２５０ｍｌに懸濁させて、この懸濁液に
リゾチームを最終濃度１０　ｍｇ／　ｍｌになるように
添加して水中で１時間放置した後、超音波処理を水中で
行なった。この懸濁液を遠心分離した。上澄液をデカン
テーションし、残渣を０．５９６）ライドンＸに懸濁さ
せて、遠心分離した。上澄液をデカンテーションし、残
渣を、２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０
）２５０ｍｌにて懸濁させて、遠心分離した。上澄液を
デカンテーションし、残ン査を２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）１０ｍｌに懸濁させて、遠心
分離した。残渣を、６Ｍグアニジン塩酸に混合した。こ
の混合液に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度
５　ｍ　Ｍになるように添加し、放置して遠心分離した
。この上澄液を、Ｐめ８Ｍ尿素、０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，８）、５　ｍ　Ｍ　　Ｄ　Ｔ　
Ｔにて平衡化しておいた５ｅｐｈａｄｅｘＧ−１００カ
ラム（φ２．６Ｘ１００ｃｍｑファルマシア社）にかけ
、８Ｍ尿素、０．ＩＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　　（ｐＨ
７，８）　、５ｍＭＤＤＴにて溶出させた。溶出した各
フラクションについて１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析（銀
染）を行なった。ｈｌＬ−３を単一バンドとして含むフ
ラクションを集めて、リン酸緩衝生理食塩水ＬＰＢＳ）
にχ、ｔして３回透析を行なった。尚、透ｔｌ’ｉの際
に析出してきた沈殿物は、遠心分離して除去した。次い
で、この溶液をその蛋白質濃度が、０Ｄ２８ｏ−０，０
１になるようにＰＢＳで希釈した。この希釈液に、酸化
型グルタチオンを終濃度１ｍＭ、還元型グルタチオンを
終濃度１０ｍＭになるように添加し、４℃で３１１間放
置した。この溶液を限外濾過（分７’ｒ：Ｌ５０００カ
ット、ミリボア社）により１０倍に濃縮した（以後、製
造法１によるｈｌＬｌと記す）。

また、ｈｌＬ−３の製造において、ｐｓＴ１１／ＲＲＩ
およびｐｓＴ１０１／ＲＲＩの培養液からのｈｌＬ−３
の回収および精製を、下記の方法を用いて行なった。

上記の２種の培養液を遠心分離して各々菌体を１′４だ
。得られた菌体を約４℃の２０ｍＭＴｒ　ｉ　５−Ｈｃ
　１　　（ｐＨ８，０）　、１ｍＭ　　ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）２０ｍ　ｌに懸濁させた。

懸濁液をフレンチプレスにかけて、菌体を破砕した。こ
の懸濁液を遠心分離後、残渣を得た。２０ｍ１の冷水に
この残渣を懸濁させ、遠心分離後、残渣を得た。この操
作をもう一回繰り返して残渣を得、９．２ｍｌの冷水に
懸濁した。この懸濁液に０．８ｍｌのＩＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　（ｐＨ９，２）　、３０ｍ１の８Ｍ塩酸グア
ニジウムを加−え、室温にて１時間攪拌した。１２０ｍ
１の２０ｍ１　　Ｔｒｉｓ　　−ＨＣｌ　　（ｐＨ９，
２）を加え、更に３０分間攪拌した。これに９８．３ｍ
ｇの還元型グルタチオンおよび１９．６℃１ｇの酸化型
グルタチオンを加えた後、約４℃にて約２０時間静置し
た。この液につき約４℃にて２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１
（ｐＨ８，０）に対して透析を行なった。

次いで１１５０容二の１Ｍ酢酸ナトリウムを加え、ＩＮ
酢酸にてｐＨを５．４に調整した。この溶液を２０ｍＭ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，４）にて平衡化してお
いたＣＭセファロースＦＦカラム（ファルマシア社）に
かけ、２０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５，４）をこのカラムに通した後、５０ｍ
ＭＮａｃＩを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５，４）で溶離した。溶離液を限外濾過（分子１ａ５０
００カツト、ミリボア社）により１０倍に濃縮した。こ
の溶液を、予めリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６，５）に
て平衡化しておいたセファクリル８２００カラム（ファ
ルマシア社）にかけ、ピーク画分を分取し、各々約１５
０１１１ｇの精製サンプルを得た（以後、製造法２によ
るｂＩＬ−３と工己す）。

実施例：６　　ｈｌＬ−３（第１図）の活性確認実施例
５の製造法１によるｈｌＬ−３（第１図）の活性は、寒
天培地中のカニクイザル骨髄細胞由来のコロニーの成長
を促進する能力の検定により確認した。カニクイザルの
骨髄細胞をＭｃＣｏｙ　’　ｓ５Ａ培地（ギブコ社）で
希釈し、Ｆｉｃｏｌ　Ｉ−Ｐａｑｕｃ（ファルマシアｉ
上）上に重層した。室温で３０分間４００Ｘｇで遠心分
離し、中間層を集めて２０倍量のＰＢＳで洗浄した。次
に、細胞の懸濁液を室温で１０分間２５０Ｘｇで遠心し
、洗浄した。

次に、細胞を　１０９６牛脂児血清を含むＭｃＣｏｙ　
’　ｓ５Ａ培地に懸濁させ、プラスチックシャーレ中で
２時間３７℃、５９６二酸化炭素の状態で培養した。

培養後、非付着性細胞を集めて、２Ｘ１０６Ｃｅｌｌｓ
／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。

検定において、骨髄細胞は以下の組成を持つ培地に最終
濃度が２　Ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ　／ｍｌになるように
くわえた。ａ）　　１．８４ＸＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ培
地２ｍＭピルビン酸ナトリウム−〇、８ＸＭＥＭアミノ
酸（ギブコ社）−〇、０８　Ｘ　Ｍ　Ｅ　Ｍ非必須アミ
ノ酸（ギブコ社）−０，０９％重炭酸ナトリウム−〇、
８ｘＭＥＭビタミン溶液（ギブコ社）−２，４ＭＬ−グ
ルタミン−３，２ｍｇ／ｍｌＬ　−セリン−１，６８１
１１ｇ／ｍ１Ｌ−アスパラギンを含む溶液５部、および
ｂ）０．６％　Ｎｏｂ　Ｉ　ｃ寒天（Ｄｉｒｃｏ　＞ｆ
）　３部、Ｃ）　牛胎児血清１部。これに実施例５で精
製したｈｌＬ−３溶液を加えた。

培養細胞は、５９ｏ　ＣＯ２存在下で湿潤空気中３７℃
にて保温した。７日乃至１４日間の培養後、コロニーの
増殖を確認した。その結果、約５×１０６ユニツト／ｒ
ｎどの活性を有する事が判った。

実施例ニア　　ｈＩＬ−３（第１図および第２図）の活
性確認 実施例５の製造法２によるｈｌＬ−３（第１図および第
２図）の活性は、実施例６と同様の方法を用いて、ヒト
骨髄細胞由来のコロニーの成長を促進する能力の検査に
より確認した。検定において、３５ｍｍプラスチックシ
ャーレ中に１×１０５個の骨髄細胞、１．２０６メチル
セルロース（和光）、３０９６ヒト血清（Ｐｌｏｗ社）
、１％ウシ血清アルブミン（ＳｉｇＩｌａ　ｉｔ）　、
６０部Ｍメルカプトエタノール（和光）、２Ｕエリスロ
ポイエチン、および実施例６で精製した製造法２による
ｈｌＬ−３（第１図及び第２図）を各々ｉむα培地を１
ｍｌ加え、５９６　ＣＯ２存（１：下で湿潤空気中３７
℃にて保温した。１４０間の培養後、コロニーの増殖を
確認した。その結果、ｈｌＬ−３（第１図および第２図
）は、両者共８Ｘ１０７ユニツト／　ｍｇの比活性をａ
することが判った。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｈ　ＩＬ　−３（ｎ−９：Ｓｅｒ　）のアミ
ノ酸配列とこれをコードするＤＮＡ塩基配列を示す説明
図である。 第２図は、）ｘｌＬ−３（ｎ＝９：Ｐｒｏ）のアミノ酸
配列とこれをコードするＤＮＡ塩基配列を示す説明図で
ある。 第３図は、オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す説明図
である。 第４図は、各ブロックを形成するためのオリゴヌクレオ
チドのライゲーション計画及びブロックのライゲーショ
ン計画を示す説明図である。 第５図は、各ブロックの塩基配列と制限酵素部位を示す
説明図である。 第６図は、ｈｌＬ−３（ｎ−９：５ｃｒ）をコードする
塩基配列及びＳ、　Ｄ、配列を含む本発明のＤＮＡ鎖を
示す説明図である。 第７図は、ｈｌＬ−３（ｎ−９：Ｐｒｏ）をコードする
塩話配列及びＳ、　Ｄ、配列を含む本発明のＤＮＡ鎖を
示す説明図である。 第８図は、ｈｌＬ−３（ｎ−９：５ｅｒ）遺伝子のｐ　
Ｕ　Ｃ１，８へのクローニング及び発現ベクターの（＆
築を示す説明図である。 第９図は、ｈｌＬ−３（ｎ−９：Ｐｒｏ）遺ｒＴのｐＵ
ｃ１８へのクローニング及び発現ベクターの構築を示す
説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図または第２図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖
   。 ２、第１図または第２図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖
   を含むプラスミド。 ３、第１図または第２図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖
   をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミドによ
   って形質転換されたものであることを特徴とする大腸菌
   。 ４、第１図または第２図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖
   を用意し、このＤＮＡ鎖を、これをその遺伝情報が発現
   可能な状態で含むプラスミドの作成、このプラスミドに
   よる大腸菌の形質転換および得られる形質転換体の培養
   から成る工程に付して培養物中にヒトインターロイキン
   ３様ポリペプチドを産生させることを特徴とする、ヒト
   インターロイキン３様ポリペプチドの製造法。 ５、第１図または第２図に示すＤＮＡ鎖の大腸菌におけ
   る発現生成物であり、糖鎖を含有せずしかもヒトインタ
   ーロイキン３の生理活性を有するインターロイキン３様
   ポリペプチド。