JPS63269983A - ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をコードする合成dna、そのdnaを含むプラスミド、およびそのdnaで形質転換された大腸菌 - Google Patents
ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をコードする合成dna、そのdnaを含むプラスミド、およびそのdnaで形質転換された大腸菌Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の背景〕
技術分野
本発明は、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
(以下rhGM−C3FJという)の遺伝子組換えによ
る製造技術に関する。具体的にはhGM−C8Fをコー
ドする合成遺伝子、該DNAで形質転換された大腸菌及
びこれらを用いるhGM−C3Fの製造法に関する。
(以下rhGM−C3FJという)の遺伝子組換えによ
る製造技術に関する。具体的にはhGM−C8Fをコー
ドする合成遺伝子、該DNAで形質転換された大腸菌及
びこれらを用いるhGM−C3Fの製造法に関する。
従来技術
]ロニー刺激因子(以下rCSFJという)は軟寒天中
で造血幹細胞の増殖分化を刺激し、特定のタイプの血液
細胞から成るコロニー形成を促進する生理活性物質であ
る。hGM−C5Fは、顆粒球マクロファージ系の幹細
胞(CFU−GM)を刺激して、顆粒球マクロファージ
の形成を促進する因子であって、次の用途に利用するこ
とが期待されている。
で造血幹細胞の増殖分化を刺激し、特定のタイプの血液
細胞から成るコロニー形成を促進する生理活性物質であ
る。hGM−C5Fは、顆粒球マクロファージ系の幹細
胞(CFU−GM)を刺激して、顆粒球マクロファージ
の形成を促進する因子であって、次の用途に利用するこ
とが期待されている。
すなわち、癌の放射線療法あるいは化学療法による白血
球減少症の治療、骨髄移植俊速やかに白血球を増殖させ
る、その他に存用と考えられている。
球減少症の治療、骨髄移植俊速やかに白血球を増殖させ
る、その他に存用と考えられている。
hGM−C3Fの遺伝子組換えによる製造技術について
は既にいくつかの報告(PCT公開公報WO36100
639、同WO36103225、EPO公開公報01
83350その他)があり、hGM−C3Fをコードす
る遺伝子の塩基配列並びにそれによって生産されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は共に公知である。なお、hG
M−C5Fは、144ケのアミノ酸から成るポリペプチ
ドを含む糖蛋白と考えられている(PCT公開公報WO
36100639号参照)。
は既にいくつかの報告(PCT公開公報WO36100
639、同WO36103225、EPO公開公報01
83350その他)があり、hGM−C3Fをコードす
る遺伝子の塩基配列並びにそれによって生産されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は共に公知である。なお、hG
M−C5Fは、144ケのアミノ酸から成るポリペプチ
ドを含む糖蛋白と考えられている(PCT公開公報WO
36100639号参照)。
発明が解決しようとする問題点
一般に遺伝子組換え技術による物質生産においては、宿
主として動物細胞あるいは酵母を用いるよりも大腸菌を
用いたほうが物質の生産性が高いのが普通である。
主として動物細胞あるいは酵母を用いるよりも大腸菌を
用いたほうが物質の生産性が高いのが普通である。
hGM−C8Fをコードする遺伝子の大腸菌による発現
に関しては、本発明者らの知る限り二つの報告がある。
に関しては、本発明者らの知る限り二つの報告がある。
クラークらは、hGM−C8Fを構成するポリペプチド
のアナログ(hG〜1−CSFを構成するポリペプチド
とはそのアミノ酸配列が3カ所において異なりかつN末
にメチオニンを有するポリペプチド)をコードする遺伝
子を大腸菌で発現させているが(PCT公開公報WO3
6100639号参照)、このときの遺伝子の発現レベ
ルは、細胞(大腸菌)蛋白の高々5%と極めて低くかつ
その発現産物がhGM−CSF活性を有するか否かは全
く不明であった。
のアナログ(hG〜1−CSFを構成するポリペプチド
とはそのアミノ酸配列が3カ所において異なりかつN末
にメチオニンを有するポリペプチド)をコードする遺伝
子を大腸菌で発現させているが(PCT公開公報WO3
6100639号参照)、このときの遺伝子の発現レベ
ルは、細胞(大腸菌)蛋白の高々5%と極めて低くかつ
その発現産物がhGM−CSF活性を有するか否かは全
く不明であった。
また、バージニスらは、ヒト単球細胞株U937より得
たhGM−C3FをコードするcDNAを大腸菌で発現
させているが、このときの発現レベルは大腸菌蛋白の8
〜10%(Blood。
たhGM−C3FをコードするcDNAを大腸菌で発現
させているが、このときの発現レベルは大腸菌蛋白の8
〜10%(Blood。
廷、 (1) 43(1987))であって、十分なも
のではなかった。
のではなかった。
このため、hGM−C8F活性を有するポリペプチドな
いし糖蛋白のより効率的な製造技術を確立することが望
まれていた。
いし糖蛋白のより効率的な製造技術を確立することが望
まれていた。
発明の要旨
本発明は上記の問題点を解決するためになされたもので
あり、hGM−CSF活性を有するポリペプチドを大腸
菌で効率よく製造するための手段を提供するものである
。すなわち本発明は、(1) 第1図又は第2図に示す
塩基配列を含むDNA鎖。
あり、hGM−CSF活性を有するポリペプチドを大腸
菌で効率よく製造するための手段を提供するものである
。すなわち本発明は、(1) 第1図又は第2図に示す
塩基配列を含むDNA鎖。
(2) 第1図又は第2図に示す塩基配列を含むDNA
鎖をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミドに
よって形質転換されたものであることを特徴とする大腸
菌(E、coli)。
鎖をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミドに
よって形質転換されたものであることを特徴とする大腸
菌(E、coli)。
(3) 第1図又は第2図に示す塩基配列を含むDNA
鎖を用意し、このDNA鎖を、これをその遺伝情報が発
現可能な状態で含むプラスミドの作成、このプラスミド
による大腸菌 (E.coli)の形質転換および得られる形質転換体
の培養から成る工程に付して培養物中にhGM−C8F
を産生させることを特徴とする、hGM−C3Fの製造
法。
鎖を用意し、このDNA鎖を、これをその遺伝情報が発
現可能な状態で含むプラスミドの作成、このプラスミド
による大腸菌 (E.coli)の形質転換および得られる形質転換体
の培養から成る工程に付して培養物中にhGM−C8F
を産生させることを特徴とする、hGM−C3Fの製造
法。
である。
本発明のDNA鎖
本発明のDNA鎖は第1図又は第2図に示す塩基配列を
含むものである。この塩基配列は公知のh G M −
CS F (Mature部分)のアミノ酸配列のN末
にMetを付加したポリペプチドをコードするものであ
るが、大腸菌で高発現させることができるよう次の諸点
を考慮して本発明者らが設計したものである。
含むものである。この塩基配列は公知のh G M −
CS F (Mature部分)のアミノ酸配列のN末
にMetを付加したポリペプチドをコードするものであ
るが、大腸菌で高発現させることができるよう次の諸点
を考慮して本発明者らが設計したものである。
■ 大腸菌において優先的に用いられているコドンを使
用する。大腸菌において優先的に用いられているコドン
は池村によって報告されている(池村、Jpn、 J、
Gcnct、 56 p533−555 (1981)
)。
用する。大腸菌において優先的に用いられているコドン
は池村によって報告されている(池村、Jpn、 J、
Gcnct、 56 p533−555 (1981)
)。
■ 5′末端の塩基配列を大腸菌の各種遺伝子の翻訳開
始部位に共通な塩基配列に近づけた(Scherer
et al、、 Nucl、 Ac1ds、 Res、
8 p3895−3905 (1980))。
始部位に共通な塩基配列に近づけた(Scherer
et al、、 Nucl、 Ac1ds、 Res、
8 p3895−3905 (1980))。
なお、本発明のDNA鎖は、これを適当なベクターに結
合させ大腸菌に導入し高発現させるためのものであるが
、このDNA鎖の高発現を実現させるためには、前記の
塩基配列の5′末端上流側にS、 D、配列を含む TAAGGAGGTATATTの塩基配列ATTCCT
CCATATAA (Scherer、 et at、 Nucl、 Ac
1ds Res、 8 p3895−3905(198
0))を有することが好ましく、また前記の塩基配列の
3′末端下流に終止コドンを2つ以上有していてもよい
。更にこの遺伝子の5′末端及び3′末端には遺伝子組
換操作を容易にするだめの適当な制限酵素部位を付加し
ておくことが好ましい。
合させ大腸菌に導入し高発現させるためのものであるが
、このDNA鎖の高発現を実現させるためには、前記の
塩基配列の5′末端上流側にS、 D、配列を含む TAAGGAGGTATATTの塩基配列ATTCCT
CCATATAA (Scherer、 et at、 Nucl、 Ac
1ds Res、 8 p3895−3905(198
0))を有することが好ましく、また前記の塩基配列の
3′末端下流に終止コドンを2つ以上有していてもよい
。更にこの遺伝子の5′末端及び3′末端には遺伝子組
換操作を容易にするだめの適当な制限酵素部位を付加し
ておくことが好ましい。
本発明のDNA鎖の製造
本発明のDNA鎖は、合目的的な任意の方法で製造する
ことができるが、その−例を示すと次の通りである。
ことができるが、その−例を示すと次の通りである。
(1) 第1図の塩基配列を含むDNA鎖の製造DNA
鎖を3〜4個の約100塩基対程度のブロックに分けて
合成し、各ブロックを順次適当なりローニングブラスミ
ド(例えばpUc19゜MO5SingらGcna 3
3 pHo 〜115’(1985) )に挿入連結す
ることにより目的とするDNA鎖を得る。
鎖を3〜4個の約100塩基対程度のブロックに分けて
合成し、各ブロックを順次適当なりローニングブラスミ
ド(例えばpUc19゜MO5SingらGcna 3
3 pHo 〜115’(1985) )に挿入連結す
ることにより目的とするDNA鎖を得る。
各ブロックの合成は、これを25〜35塩基程度のオリ
ゴヌクレオチドに分けて合成し、これらを会合させるこ
とにより行う。ブロックをオリゴヌクレオチドに区分け
する際には、各オリゴヌクレオチドが自己会合を起こす
ことがないよう1つのオリゴヌクレオチド内に自己相補
的配列が出現しないようにすることが必要である。第3
図に区分けしたオリゴヌクレオチドの塩基配列の一例を
、また第4図にこれらのオリゴヌクレオチドからの各ブ
ロックの構成例を、また第5図に各ブロックの塩基配列
と制限酵素部位の一例を示す。
ゴヌクレオチドに分けて合成し、これらを会合させるこ
とにより行う。ブロックをオリゴヌクレオチドに区分け
する際には、各オリゴヌクレオチドが自己会合を起こす
ことがないよう1つのオリゴヌクレオチド内に自己相補
的配列が出現しないようにすることが必要である。第3
図に区分けしたオリゴヌクレオチドの塩基配列の一例を
、また第4図にこれらのオリゴヌクレオチドからの各ブ
ロックの構成例を、また第5図に各ブロックの塩基配列
と制限酵素部位の一例を示す。
各オリゴヌクレオチドは既知の合成法によって合成する
ことが出来る〔例えばホスホアミダイト法による固相合
成法(BeaucagcらTctrahedronLa
tters 221859〜18B2(1981))
、またこの合成法に基づく自動合成機を使用することも
可能である。各ブロックの構築は、各オリゴヌクレオチ
ドの5′末端を、必要に応じてポリヌクレオチドキナー
ゼでリン酸化した後アニールし、DNAリガーゼによっ
て二重鎖DNAとすることにより行う。
ことが出来る〔例えばホスホアミダイト法による固相合
成法(BeaucagcらTctrahedronLa
tters 221859〜18B2(1981))
、またこの合成法に基づく自動合成機を使用することも
可能である。各ブロックの構築は、各オリゴヌクレオチ
ドの5′末端を、必要に応じてポリヌクレオチドキナー
ゼでリン酸化した後アニールし、DNAリガーゼによっ
て二重鎖DNAとすることにより行う。
各ブロックを連結する手順は次の通りである。
第5図のCブロックを、pUc19のHind■及びP
stlによる切断片と結合させプラスミドpYC8を得
、これで大腸菌JM109を形質転換する。次いで、p
YC8を単離し、ダイデオキシ法によって塩基配列を確
認するとともに、pYC8をNhel及びAvalで消
化してからBブロックを結合させ、pSCB86を得、
これでJM109を形質転換する。pSCB86の塩基
配列を確認した後、pSCB86で大腸菌dam−株G
M33を形質転換し、pSCB86を改めて単離する。
stlによる切断片と結合させプラスミドpYC8を得
、これで大腸菌JM109を形質転換する。次いで、p
YC8を単離し、ダイデオキシ法によって塩基配列を確
認するとともに、pYC8をNhel及びAvalで消
化してからBブロックを結合させ、pSCB86を得、
これでJM109を形質転換する。pSCB86の塩基
配列を確認した後、pSCB86で大腸菌dam−株G
M33を形質転換し、pSCB86を改めて単離する。
pSCB86をBclI及び5acIで消化してからこ
れにAブロックを結合させpscBA867を得、これ
でJM109を形質転換する。同様にpSCBA867
の塩基配列を確認し、更にpSCBA867をNcoI
及びEcoRIで消化し、これにDブロックを結合させ
ることによりp 5CBAD8676を得、JM109
を形質転換し、同様にして塩基配列を確認する。
れにAブロックを結合させpscBA867を得、これ
でJM109を形質転換する。同様にpSCBA867
の塩基配列を確認し、更にpSCBA867をNcoI
及びEcoRIで消化し、これにDブロックを結合させ
ることによりp 5CBAD8676を得、JM109
を形質転換し、同様にして塩基配列を確認する。
このようにして得られるpSCBA867をXbal
(Sacl)及びBamHI (Hind■)にて消化
することにより、第1図に示した塩基配列を含む本発明
のDNA鎖を得ることができる(第6図(1))。pS
CBAD8676をC1al (EcoRI)及びBa
mHI(HindI[[)にて消化すればSD配列を含
む本発明のDNA鎖を得ることができる(第6図(2)
)。
(Sacl)及びBamHI (Hind■)にて消化
することにより、第1図に示した塩基配列を含む本発明
のDNA鎖を得ることができる(第6図(1))。pS
CBAD8676をC1al (EcoRI)及びBa
mHI(HindI[[)にて消化すればSD配列を含
む本発明のDNA鎖を得ることができる(第6図(2)
)。
(2) 第2図の塩基配列を含むDNA鎖の製造前記の
「第1図の塩基配列を含むDNA鎖の製造」に準じた手
順により製造することができる。
「第1図の塩基配列を含むDNA鎖の製造」に準じた手
順により製造することができる。
ただし、この場合には、前記のオリゴヌクレオチドC−
3の代わりに下記のC−13を、またC−9の代わりに
下記のC−14を用いる。
3の代わりに下記のC−13を、またC−9の代わりに
下記のC−14を用いる。
C−13CTACTCAGATCATCACTTTCG
AATCTTT C−14TCTTTGAAAGATTCGAAAGTG
ATGATCT このようにして得られる本発明のDNA鎖を第7図に示
す。
AATCTTT C−14TCTTTGAAAGATTCGAAAGTG
ATGATCT このようにして得られる本発明のDNA鎖を第7図に示
す。
形質転換体の作成
上記のようにして調製される本発明DNA鎖は、hGM
−CSF蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいるので
、これを生物工学的手法によって大腸菌(E、coli
)に導入して形質転換し、得られる形質転換体を培養す
ることにより、hGM−CSF蛋白をつくらせることが
できる。
−CSF蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいるので
、これを生物工学的手法によって大腸菌(E、coli
)に導入して形質転換し、得られる形質転換体を培養す
ることにより、hGM−CSF蛋白をつくらせることが
できる。
形質転換体の作成(およびそれによるhGM−C8Fの
生産)のための手順ないし方法そのものは、分子生物学
、生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用されて
いるものでありうるので、本発明においても下記したと
ころ以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実施
すればよい。
生産)のための手順ないし方法そのものは、分子生物学
、生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用されて
いるものでありうるので、本発明においても下記したと
ころ以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実施
すればよい。
大腸菌中で本発明DNA鎖の遺伝子を発現させるために
は、まず大腸菌中で安定に存在するプラスミドベクター
中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。このプラス
ミドベクターとしては、pBR322等合目的的な任意
のものを用いることができる。
は、まず大腸菌中で安定に存在するプラスミドベクター
中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。このプラス
ミドベクターとしては、pBR322等合目的的な任意
のものを用いることができる。
一方、本発明DNA鎖の遺伝子を大腸菌で発現させるた
めには、そのDNAをmRNAへ転写させる必要がある
。そのためには、転写のためのシグナルであるプロモー
ターを本発明DNA鎖の5′側上流に組込めばよい。こ
のプロモーターについてはすでにt rp、lac、P
LSOmpF等種々知られており、本発明でもこれらの
いずれをも利用することができる。
めには、そのDNAをmRNAへ転写させる必要がある
。そのためには、転写のためのシグナルであるプロモー
ターを本発明DNA鎖の5′側上流に組込めばよい。こ
のプロモーターについてはすでにt rp、lac、P
LSOmpF等種々知られており、本発明でもこれらの
いずれをも利用することができる。
また、転写を終結させるためのターミネータ−を本発明
DNA鎖の3′側下流に組込むことが好ましい。強力な
プロモーターを用いた場合、ターミネータ−を挿入する
ことにより、mRNAの安定性を高めることができる。
DNA鎖の3′側下流に組込むことが好ましい。強力な
プロモーターを用いた場合、ターミネータ−を挿入する
ことにより、mRNAの安定性を高めることができる。
ターミネータ−としては、trpa、rrncs λt
oop等を用いることができる。
oop等を用いることができる。
また、mRNAを蛋白に翻訳させる段階では蛋白合成の
場であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合するた
めに必要な配列(S、 D、配列と呼ばれる)を蛋白合
成の開始信号であるATGの前につける必要がある。更
に効率的に発現させる為には、このS、 D、配列並び
にこのS、 D、配列と蛋白合成の開始信号であるAT
Gとの間の塩基配列を、大腸菌における翻訳開始部位に
共通な塩基配列に近づけることが好ましい。例えばTA
AGGAGGTATATTとすることが好まATTCC
TCCATATAA しい。
場であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合するた
めに必要な配列(S、 D、配列と呼ばれる)を蛋白合
成の開始信号であるATGの前につける必要がある。更
に効率的に発現させる為には、このS、 D、配列並び
にこのS、 D、配列と蛋白合成の開始信号であるAT
Gとの間の塩基配列を、大腸菌における翻訳開始部位に
共通な塩基配列に近づけることが好ましい。例えばTA
AGGAGGTATATTとすることが好まATTCC
TCCATATAA しい。
このようにしてつくったプラスミドによる大腸菌の形質
転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されて
いる合目的的な任意の方法によって行なうことができる
。その一般的な事項については適当な底置または総説た
とえばManiatisら、rMolccular C
Ionl、ng−A Laboratory Manu
al J、Co1d SprIng Harbor L
aboratory (1982)を参照すればよい。
転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されて
いる合目的的な任意の方法によって行なうことができる
。その一般的な事項については適当な底置または総説た
とえばManiatisら、rMolccular C
Ionl、ng−A Laboratory Manu
al J、Co1d SprIng Harbor L
aboratory (1982)を参照すればよい。
形質転換体は、本発明DNA鎖によって導入された遺伝
情報による新しい形質(すなわちhGMCSFの生産能
)および使用ベクター由来の形質ならびに場合によって
は、生じているかも知れない遺伝子組換時の使用ベクタ
ーからの一部の遺伝情報の欠落による対応形質の欠落を
除けば、そのゼノタイプないしフェノタイプあるいは菌
学的性質において使用大腸菌と同じである。
情報による新しい形質(すなわちhGMCSFの生産能
)および使用ベクター由来の形質ならびに場合によって
は、生じているかも知れない遺伝子組換時の使用ベクタ
ーからの一部の遺伝情報の欠落による対応形質の欠落を
除けば、そのゼノタイプないしフェノタイプあるいは菌
学的性質において使用大腸菌と同じである。
hGM−C3Fの生産
上記のようにして得られる形質転換体のクローンは、こ
れを培養すれば培養物中にh G M −C3F蛋白を
生産する。
れを培養すれば培養物中にh G M −C3F蛋白を
生産する。
形質転換体の培養ないし増殖条件は、使用大腸菌に対す
るそれと本質的には変らない。また、培養物すなわち菌
体および(または)培養液からの生産蛋白の回収も合目
的的な任意の方法(例えば、後記実施例6記載の方法)
に従って行なうことができる。hGM−CSFは大腸菌
中において凝集した形で産生されるので、この蛋白を回
収後変性剤(例えば、塩酸グアニジン、尿素)を用いて
溶解し、ジスルフィド結合を還元剤(例えばジチオスレ
イトール)を用いて切断してから常法に従って精製する
ことが好ましい。
るそれと本質的には変らない。また、培養物すなわち菌
体および(または)培養液からの生産蛋白の回収も合目
的的な任意の方法(例えば、後記実施例6記載の方法)
に従って行なうことができる。hGM−CSFは大腸菌
中において凝集した形で産生されるので、この蛋白を回
収後変性剤(例えば、塩酸グアニジン、尿素)を用いて
溶解し、ジスルフィド結合を還元剤(例えばジチオスレ
イトール)を用いて切断してから常法に従って精製する
ことが好ましい。
実施例1 オリゴヌクレオチドの合成
第3図に示すオリゴヌクレオチド並びに前記のオリゴヌ
クレオチドC−13およびC−14は、ホスホアミダイ
ト法(Beaucageら、TetrahedronL
etters 221859〜19B2(1981))
を用いたDNA自動合成機(アプライドバイオシステム
ズ社製380A型、M、 l1unkapl I Ie
rら、Nature 310105〜111(1984
) )を使用して合成した。
クレオチドC−13およびC−14は、ホスホアミダイ
ト法(Beaucageら、TetrahedronL
etters 221859〜19B2(1981))
を用いたDNA自動合成機(アプライドバイオシステム
ズ社製380A型、M、 l1unkapl I Ie
rら、Nature 310105〜111(1984
) )を使用して合成した。
合成終了後、濃アンモニア水で60℃で5時間処理して
、塩基の保護基を除いた。得られたオリゴヌクレオチド
を高性能液体クロマトグラフィー(HP L C)を用
いて精製した。すなわち逆相の中性硬質ポリスチレン系
ゲル(PRP −1、ハミルトン社)のカラム(φ4、
IX150mm)にかけ、0.1Mトリエチルアミン酢
酸緩衝液中(pH7,0)のアセトニトリルの直線濃度
勾配法によって精製した。目的とするピークのものを集
め、8Mウレアを含む12%ポリアクリルアミドを用い
た電気泳動にかけた。泳動後ゲルの下に螢光色素を含む
TLCプレートを置き、UVランプを用いて目的のバン
ドの存在を確認した。目的とするオリゴヌクレオチドを
含むゲル片を、透析チューブ内に封入し、DNAをゲル
から電気的に溶出した。この透析チューブ内液をセファ
デックスG25(ファルマシア社製)のゲル濾過カラム
(φ1.5X4Bco+)にかけ0.05M)リエチル
アミン重炭酸緩衝液にて溶出し脱塩した。目的とするオ
リゴヌクレオチドを含む溶出液を減圧濃縮して、純粋な
オリゴヌクレオチドを得た。
、塩基の保護基を除いた。得られたオリゴヌクレオチド
を高性能液体クロマトグラフィー(HP L C)を用
いて精製した。すなわち逆相の中性硬質ポリスチレン系
ゲル(PRP −1、ハミルトン社)のカラム(φ4、
IX150mm)にかけ、0.1Mトリエチルアミン酢
酸緩衝液中(pH7,0)のアセトニトリルの直線濃度
勾配法によって精製した。目的とするピークのものを集
め、8Mウレアを含む12%ポリアクリルアミドを用い
た電気泳動にかけた。泳動後ゲルの下に螢光色素を含む
TLCプレートを置き、UVランプを用いて目的のバン
ドの存在を確認した。目的とするオリゴヌクレオチドを
含むゲル片を、透析チューブ内に封入し、DNAをゲル
から電気的に溶出した。この透析チューブ内液をセファ
デックスG25(ファルマシア社製)のゲル濾過カラム
(φ1.5X4Bco+)にかけ0.05M)リエチル
アミン重炭酸緩衝液にて溶出し脱塩した。目的とするオ
リゴヌクレオチドを含む溶出液を減圧濃縮して、純粋な
オリゴヌクレオチドを得た。
実施例2 オリゴヌクレオチドのライゲーション化学合
成したオリゴヌクレオチド34本を第4図のブロックの
調製計画に従ってライゲーションした。以下詳細にのべ
る。各ブロックの5′末端にあるオリゴヌクレオチドを
除く残りの26本の各オリゴヌクレオチド(各0.8μ
mol)を20μgのリン酸化反応液(50mM T
r i s −HCl、pH7,4,10m M M
g CI 2.10mM DTT、30uC1の(
a−32P”JATP (3000C110+mol)
、15ユニツトのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(ベ
ーリンガー・マンハイム社)〕中で37℃30分間反応
させて5′末端をリン酸化してラベルした。次いで10
0mM ATPを1μg加え、37℃30分間反応さ
せることで完全に5′末端をリン酸化し、100℃5分
間加熱することで反応を停止した。
成したオリゴヌクレオチド34本を第4図のブロックの
調製計画に従ってライゲーションした。以下詳細にのべ
る。各ブロックの5′末端にあるオリゴヌクレオチドを
除く残りの26本の各オリゴヌクレオチド(各0.8μ
mol)を20μgのリン酸化反応液(50mM T
r i s −HCl、pH7,4,10m M M
g CI 2.10mM DTT、30uC1の(
a−32P”JATP (3000C110+mol)
、15ユニツトのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(ベ
ーリンガー・マンハイム社)〕中で37℃30分間反応
させて5′末端をリン酸化してラベルした。次いで10
0mM ATPを1μg加え、37℃30分間反応さ
せることで完全に5′末端をリン酸化し、100℃5分
間加熱することで反応を停止した。
次いで、第4図のライゲーション計画に従い、各オリゴ
ヌクレオチドを混合し、95℃5分間加熱し2時間かけ
て常温まで戻した。これを最終容量200μgのライゲ
ーション反応液(50mMTris−HCI、pa7.
4.10mMMgC12,15mM DTT、1mM
ATP。
ヌクレオチドを混合し、95℃5分間加熱し2時間かけ
て常温まで戻した。これを最終容量200μgのライゲ
ーション反応液(50mMTris−HCI、pa7.
4.10mMMgC12,15mM DTT、1mM
ATP。
T4 DNAリガーゼ30ユニツト(ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ社)〕中にて15℃14時間反応
させた。一部の反応溶液を8%ポリアクリルアミド電気
泳動にかけ、ラジオオートグラフで各ブロックがライゲ
ーション反応の結果として得られたことをそれぞれ確認
した。次に上記反応液にエタノールを加えてDNAを沈
殿させ、同様に8%ポリアクリルアミド電気泳動にて分
離した。各ブロックを含むゲル片を透析チューブに入れ
、泳動緩衝液中で電気泳動することによりそれぞれ溶出
した。次に各透析チューブ内液をNACSカラム(ベゼ
スダ・リサーチ・ラボラトリ−社)にかけ、溶出液にエ
タノールを加えDNAをそれぞれ沈殿させた。
ーチ・ラボラトリーズ社)〕中にて15℃14時間反応
させた。一部の反応溶液を8%ポリアクリルアミド電気
泳動にかけ、ラジオオートグラフで各ブロックがライゲ
ーション反応の結果として得られたことをそれぞれ確認
した。次に上記反応液にエタノールを加えてDNAを沈
殿させ、同様に8%ポリアクリルアミド電気泳動にて分
離した。各ブロックを含むゲル片を透析チューブに入れ
、泳動緩衝液中で電気泳動することによりそれぞれ溶出
した。次に各透析チューブ内液をNACSカラム(ベゼ
スダ・リサーチ・ラボラトリ−社)にかけ、溶出液にエ
タノールを加えDNAをそれぞれ沈殿させた。
実施例3 hGM−CSF遺伝子のクローニングクロ
ーニングベクターには大腸菌のプラスミドpUc19
(ファルマシア社)を用いた。1μgのpUc19DN
Aを30Mgの反応液(10mM Trts−HCI
、pH7,5,10mM MgCl2.1mM D
TT。
ーニングベクターには大腸菌のプラスミドpUc19
(ファルマシア社)を用いた。1μgのpUc19DN
Aを30Mgの反応液(10mM Trts−HCI
、pH7,5,10mM MgCl2.1mM D
TT。
50mM NaC!、12−LニットのHindm(
宝酒造)、10ユニツトのPstI(宝酒造)〕中、3
7℃2時間反応させた後、65℃20分間処理して制限
酵素を失活させた。1μgのCブロックDNA20μ、
lJの反応液(50mMTRiS−HCI、pH7,4
,10mMM g CI 2.5mM ATP、10
ユニツトの4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造)〕中
、37℃1時間反応させ、リン酸化した。この反応2μ
gを前記のpUc19DNAとHindIn及びPst
lとの反応液7μgに加え、更に2μgの[500mM
Tris−HCI、pH7,4,100、mM
Mg C12)溶液、1u(lの100Mm DTT
、lμfの100mM ATP、2μg (2ユニツ
ト)のT4DNAリガーゼ(べ一リンガー・マンハイム
社)、15μgのオートクレーブ水を加え、14℃で1
4時間反応させた。
宝酒造)、10ユニツトのPstI(宝酒造)〕中、3
7℃2時間反応させた後、65℃20分間処理して制限
酵素を失活させた。1μgのCブロックDNA20μ、
lJの反応液(50mMTRiS−HCI、pH7,4
,10mMM g CI 2.5mM ATP、10
ユニツトの4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造)〕中
、37℃1時間反応させ、リン酸化した。この反応2μ
gを前記のpUc19DNAとHindIn及びPst
lとの反応液7μgに加え、更に2μgの[500mM
Tris−HCI、pH7,4,100、mM
Mg C12)溶液、1u(lの100Mm DTT
、lμfの100mM ATP、2μg (2ユニツ
ト)のT4DNAリガーゼ(べ一リンガー・マンハイム
社)、15μgのオートクレーブ水を加え、14℃で1
4時間反応させた。
この反応液を用い、大腸菌JM109株(C。
Yanisch−PerronらGene 33 p1
03−IL9 (In2))を既知の方法(D、 l1
anahan J、 Mo1. Blol、 p557
〜580 (1980))により形質転換させた。その
際、プレートにはLBプレートを用い、50μg/ml
のアンピシリン、0.24ff1g/mlのイソプロピ
ル−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)及び0、
04mg/ml 5−ブロモ、−4−クロロ−3−
インドリル−β−ガラクトシド(X−gal)を含んで
いた。アンピシリン耐性で無色のコロニーを選び、その
うちの1つをpYC8/JM109と命名した。
03−IL9 (In2))を既知の方法(D、 l1
anahan J、 Mo1. Blol、 p557
〜580 (1980))により形質転換させた。その
際、プレートにはLBプレートを用い、50μg/ml
のアンピシリン、0.24ff1g/mlのイソプロピ
ル−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)及び0、
04mg/ml 5−ブロモ、−4−クロロ−3−
インドリル−β−ガラクトシド(X−gal)を含んで
いた。アンピシリン耐性で無色のコロニーを選び、その
うちの1つをpYC8/JM109と命名した。
CブロックDNAがpUc19のHind■及びPst
Iの間に挿入された場合、CブロックDNAによるユニ
ークなNhel制限酵素部位が存在する。そこで、pY
C8/JM109の菌株よりプラスミドDNAをアルカ
リ法(T、Maniatisら、Mo1ecular
Cloning p368〜3B9(1982) Co
ldSpring l1arbor )にて分離し、N
h e I (−二−イングランドバイオラブズ社)
によって消化されることを確認した。またpYC8につ
いてダイデオキシ法(版部ら、Anal、 Bloch
cm、 152p232−238 (1986) )を
用いて塩基配列を確認した。
Iの間に挿入された場合、CブロックDNAによるユニ
ークなNhel制限酵素部位が存在する。そこで、pY
C8/JM109の菌株よりプラスミドDNAをアルカ
リ法(T、Maniatisら、Mo1ecular
Cloning p368〜3B9(1982) Co
ldSpring l1arbor )にて分離し、N
h e I (−二−イングランドバイオラブズ社)
によって消化されることを確認した。またpYC8につ
いてダイデオキシ法(版部ら、Anal、 Bloch
cm、 152p232−238 (1986) )を
用いて塩基配列を確認した。
pYC8をNheI及びAvaIにて消化した後、上記
と同様な方法にて、BブロックDNAをライゲーション
して挿入し、大腸菌JM109株を形質転換させた。B
ブロックが挿入されたことを、5ail制限酵素の消失
によって確認し、前記の方法にて塩基配列を確認した。
と同様な方法にて、BブロックDNAをライゲーション
して挿入し、大腸菌JM109株を形質転換させた。B
ブロックが挿入されたことを、5ail制限酵素の消失
によって確認し、前記の方法にて塩基配列を確認した。
得られた菌株をpSCB86/JM109とした。この
プラスミドpSCB86で大腸菌dam−株である0M
33株(東洋紡績■より入手)を形質転換した。
プラスミドpSCB86で大腸菌dam−株である0M
33株(東洋紡績■より入手)を形質転換した。
この菌株をpSCB86/GM33とした。
この菌株よりプラスミドを単離し、Bcll及びSac
Iにて消化後、AブロックDNAを挿入し、大腸菌J
M109株を形質転換させた。Aブロックが挿入された
ことをNcol制限酵素部位の存在で確認した。塩基配
列を前記の方法で確認した。得られた菌株をpSCBA
867/JM109とした。これにより、第6図(1)
に示す本発明のDNA鎖を調製した。
Iにて消化後、AブロックDNAを挿入し、大腸菌J
M109株を形質転換させた。Aブロックが挿入された
ことをNcol制限酵素部位の存在で確認した。塩基配
列を前記の方法で確認した。得られた菌株をpSCBA
867/JM109とした。これにより、第6図(1)
に示す本発明のDNA鎖を調製した。
更i、ms、 D、 配列を含むhGM−CSF遺伝子
を調製する為に、プラスミドpsCBA867をNco
I及びEcoRIにて消化し、DブロックDNAを挿入
し、大腸菌JM109株を形質転換させた。Aブロック
が挿入されたことをC1aI制限酵素部位の存在で確認
した。塩基配列を前記の方法で確認した。得られた菌株
をpTCBAD8676/JMI 09とした。これに
より第6図(2)に示すS、 D、配列を含む本発明の
DNA鎖を調製した。
を調製する為に、プラスミドpsCBA867をNco
I及びEcoRIにて消化し、DブロックDNAを挿入
し、大腸菌JM109株を形質転換させた。Aブロック
が挿入されたことをC1aI制限酵素部位の存在で確認
した。塩基配列を前記の方法で確認した。得られた菌株
をpTCBAD8676/JMI 09とした。これに
より第6図(2)に示すS、 D、配列を含む本発明の
DNA鎖を調製した。
以上のクローニングプロセスの概要を第8図に示した。
また前記と同様の手順により第7図(1)(2)に示す
本発明のDNA鎖を製造した。ただし、オリゴヌクレオ
チドC−3の代わりにC−13を、またC−9の代わり
にC−14を用いた。
本発明のDNA鎖を製造した。ただし、オリゴヌクレオ
チドC−3の代わりにC−13を、またC−9の代わり
にC−14を用いた。
実施例4 発現ベクターの構築
大腸菌トリプトファンオペロンのプロモーター及びオペ
レーター領域の塩基配列については既にBennett
らにより報告されている(J、 Hot、 Blol。
レーター領域の塩基配列については既にBennett
らにより報告されている(J、 Hot、 Blol。
121 pH3−p137 (1978))。転写開始
点から、5′上流−94塩基より、3′下流+21塩基
までの配列をベースとし、その転写開始点直後にC1a
IサイトをまたS、D、配列の直後にXbaIサイトを
設け、さらに5′末端にはEcoRIサイトをまた3′
末端にはHindIIIサイトを設けた131塩基対を
化学的に合成した(第9図)。この131塩基のトリプ
トファンプロモーターをpBR322のEcoRI及び
HindII[にて消化したDNAに挿入し、トリプト
ファンプロモーターを含む発現ベクターとし、pST8
と命名した。
点から、5′上流−94塩基より、3′下流+21塩基
までの配列をベースとし、その転写開始点直後にC1a
IサイトをまたS、D、配列の直後にXbaIサイトを
設け、さらに5′末端にはEcoRIサイトをまた3′
末端にはHindIIIサイトを設けた131塩基対を
化学的に合成した(第9図)。この131塩基のトリプ
トファンプロモーターをpBR322のEcoRI及び
HindII[にて消化したDNAに挿入し、トリプト
ファンプロモーターを含む発現ベクターとし、pST8
と命名した。
トリプトファンオペロンの転写終結の為のターミネータ
−は、Chrlstjeらによってその塩基配列とその
終結の強さが報告されている(Proc、 Natl。
−は、Chrlstjeらによってその塩基配列とその
終結の強さが報告されている(Proc、 Natl。
Acad、 Set、 USA 78 (7) p4
180〜4184 (1981) )。
180〜4184 (1981) )。
Trpaターミネータ−の5′末端にBamHIサイト
を、3′末端にsph Iサイトを設けたオリゴヌクレ
オチドを化学的に合成(第10図)した。このターミネ
ータ−を含むオリゴヌクレオチドを、pST8のBam
HI及び5phIにて消化したDNAに挿入して、プラ
スミドpsT81を得た。
を、3′末端にsph Iサイトを設けたオリゴヌクレ
オチドを化学的に合成(第10図)した。このターミネ
ータ−を含むオリゴヌクレオチドを、pST8のBam
HI及び5phIにて消化したDNAに挿入して、プラ
スミドpsT81を得た。
pBR322由来のプラスミドで、大腸菌におけるコピ
ー数の高いpA7153がTν1ggらにより作られて
いる(Nuture 283 p21B−p218(1
980))。
ー数の高いpA7153がTν1ggらにより作られて
いる(Nuture 283 p21B−p218(1
980))。
そこでpsT81のトリプトファンプロモータ及びTr
paターミネータ−を含むDNA断片をEcoRI及び
5phIにて消化して得、pAT153のEcoRIお
よび5phI消化断片に挿入して、プラスミドpsT8
11を得た(第11図参照)。
paターミネータ−を含むDNA断片をEcoRI及び
5phIにて消化して得、pAT153のEcoRIお
よび5phI消化断片に挿入して、プラスミドpsT8
11を得た(第11図参照)。
実施例5 hGM−CSFの発現用プラスミドの構築
(1) プラスミドpsT811による発現用プラスミ
ド 前記pSCBAD8676をC1aI及びBamHIに
て消化後、0.8%アガロース電気泳動により、423
塩基対のDNA断片を精製した。前記発現用ベクターp
sT811をC1aI及びBamHIにより消化後、上
記423塩基対のS、 D、配列を含むhGM−C3F
遺伝子(第6図(2)をT4リガーゼによりライゲーシ
ョンして挿入し、大腸菌RRI株を形質転換した。アン
ピシリン耐性のコロニーよりプラスミドを単離し、Ps
tIにて消化し、その切断パターン及び、Xbal制限
酵素部位の消失から、S、 D、配列を含むhGM−
CSF遺伝子が挿入された事を確認した。得られた菌株
をpsT6311/RRIとした(第12図(1)参照
)。
ド 前記pSCBAD8676をC1aI及びBamHIに
て消化後、0.8%アガロース電気泳動により、423
塩基対のDNA断片を精製した。前記発現用ベクターp
sT811をC1aI及びBamHIにより消化後、上
記423塩基対のS、 D、配列を含むhGM−C3F
遺伝子(第6図(2)をT4リガーゼによりライゲーシ
ョンして挿入し、大腸菌RRI株を形質転換した。アン
ピシリン耐性のコロニーよりプラスミドを単離し、Ps
tIにて消化し、その切断パターン及び、Xbal制限
酵素部位の消失から、S、 D、配列を含むhGM−
CSF遺伝子が挿入された事を確認した。得られた菌株
をpsT6311/RRIとした(第12図(1)参照
)。
(2) プラスミドp CFM526による発現用プラ
スミド λファージPLプロモーターを含む発現ベクターpCF
M526 (特表昭60−501988、PCT pu
blication WO35100829、ATC
C399B2)を用い、S、 D、配列を含むhGM−
CSF遺伝子(第6図(2))を挿入した。即ち、上記
423塩基対のS、 D、配列を含むhGM−CSF遺
伝子を、pCFM526をC1al及びBamHIにて
消化したDNAにT4リガーゼによりライゲーションし
て挿入し、λCI8.7遺伝子を含むプラスミドpMW
1(ATCCNo、39933)を有する大腸菌AM7
を形質転換した。アンピシリン及びカナマイシン耐性の
コロニーより、プラスミドを単離し、Pstlにて消化
し、その切断パターンからS。
スミド λファージPLプロモーターを含む発現ベクターpCF
M526 (特表昭60−501988、PCT pu
blication WO35100829、ATC
C399B2)を用い、S、 D、配列を含むhGM−
CSF遺伝子(第6図(2))を挿入した。即ち、上記
423塩基対のS、 D、配列を含むhGM−CSF遺
伝子を、pCFM526をC1al及びBamHIにて
消化したDNAにT4リガーゼによりライゲーションし
て挿入し、λCI8.7遺伝子を含むプラスミドpMW
1(ATCCNo、39933)を有する大腸菌AM7
を形質転換した。アンピシリン及びカナマイシン耐性の
コロニーより、プラスミドを単離し、Pstlにて消化
し、その切断パターンからS。
D、配列を含むhGM−C3F遺伝子が挿入された事を
確認した。得られた菌株をpTO614/AM7とした
(第12図(2)参照)。
確認した。得られた菌株をpTO614/AM7とした
(第12図(2)参照)。
(1) プラスミドpsT6311/RRIの発前記p
ST6311/RRIをアンピシリンを含むし培地にて
37℃にて一晩振とう培養した。
ST6311/RRIをアンピシリンを含むし培地にて
37℃にて一晩振とう培養した。
この培養液2mlを100m1のM9培地(0,8%グ
ルコース、0.4%カザミノ酸、10μg/mlチアミ
ン、50Iig/mlアンピシリンを含む)に加え、3
7℃にて3時間振とうした。インドールアクリル酸を最
終濃度40μg/mlになるように添加した。このまま
更に5時間振とう培養した。
ルコース、0.4%カザミノ酸、10μg/mlチアミ
ン、50Iig/mlアンピシリンを含む)に加え、3
7℃にて3時間振とうした。インドールアクリル酸を最
終濃度40μg/mlになるように添加した。このまま
更に5時間振とう培養した。
得られた大腸菌の一部をサンプル緩衝液中で煮沸(5分
)し、煮沸液について5DS−ポリアクリルアミド電気
泳動を行ない、ROM−C5Fの含有量を調べた。この
条件においてhGM−C8Fは、大腸菌細胞蛋白質の3
0%以上であった。
)し、煮沸液について5DS−ポリアクリルアミド電気
泳動を行ない、ROM−C5Fの含有量を調べた。この
条件においてhGM−C8Fは、大腸菌細胞蛋白質の3
0%以上であった。
(2) プラスミドpTO614/AM7の発現前記の
pTO614/AM7をアンピシリン及びカナマイシン
を含むし培地にて29°Cで一晩娠とう培養した。この
培養液10m1を500 mlのアンピシリン及びカナ
マイシンを含むし培地に加え、5連で29℃で3時間振
とう培養した。予め54℃にしておいたL培地500m
1を各培養液に加え、42℃にして更に3時間培養した
。前記と同様にしてhGM−C3Fの含有量を調べた結
果、大腸菌細胞蛋白質の30%以上であった。
pTO614/AM7をアンピシリン及びカナマイシン
を含むし培地にて29°Cで一晩娠とう培養した。この
培養液10m1を500 mlのアンピシリン及びカナ
マイシンを含むし培地に加え、5連で29℃で3時間振
とう培養した。予め54℃にしておいたL培地500m
1を各培養液に加え、42℃にして更に3時間培養した
。前記と同様にしてhGM−C3Fの含有量を調べた結
果、大腸菌細胞蛋白質の30%以上であった。
更に、培養液を遠心分離して合計的10gの菌体を得た
。蒸留水を加え、3℃にて完全に分散するまでホモジナ
イザーを用いて分散させた。この懸濁液をフレンチ・プ
レスに3回かけた。この間懸濁液は、18℃以下に保持
した、この均質液を蒸留水で125m1に希釈し、得ら
れた混合液を30℃において遠心分離した。上澄液をデ
カンテーションし、残渣は蒸留水を用いて再懸濁させて
最終容量80m1にした。得られた混合液を3℃にて遠
心分離して上澄液をデカンテーションし、残渣を蒸留水
にて懸濁させて最終容量121にした。
。蒸留水を加え、3℃にて完全に分散するまでホモジナ
イザーを用いて分散させた。この懸濁液をフレンチ・プ
レスに3回かけた。この間懸濁液は、18℃以下に保持
した、この均質液を蒸留水で125m1に希釈し、得ら
れた混合液を30℃において遠心分離した。上澄液をデ
カンテーションし、残渣は蒸留水を用いて再懸濁させて
最終容量80m1にした。得られた混合液を3℃にて遠
心分離して上澄液をデカンテーションし、残渣を蒸留水
にて懸濁させて最終容量121にした。
得られた混合液に41の1Mトリス緩衝液(pH8,5
)と64m1の10M尿素を加えた。得られた混合液を
14℃において遠心分離し、上澄液を集めた。この上澄
液に533+ngの還元型グルタチオン及び1107I
I1の酸化型グルタチオンを含む720m1の20mM
のトリス緩衝液(p)I8.5)を加えた。この混合液
を5℃にて20時間放置した。この混合液を5℃にて分
子量10,000のメンプランを通過させることで濃縮
した。この濃縮液を、5℃にて少なくとも400m1の
20mMトリス緩衝液(pH8,5)とともに、分子量
10.000のメンプランを通過させバッファー交換し
た(ミリポア社製、ベリコンラボカセットを使用)。濃
縮液のpHを50%酢酸によってpH5,3とした。こ
の混合液を3℃において遠心分離した。希釈した上澄液
をCM−セファロースカラムにかけ、45mM Na
C1−20mM酢酸ナトリウム(pH5,4)緩衝液に
て溶出した。溶出液のpHを1Mトリス緩衝液(pH8
,5)を用いてpH7,7にした。CM−セファロース
カラムからの溶出液を5℃において04カラムにかけ、
20%エタノール−50mMトリス緩衝液(pH7,7
)にて溶出し、次いで40%エタノール−50mM)リ
ス緩衝液にて溶出した。hGM−CFは、40%エタノ
ール−50mM)リス緩衝液(pH7,7)より60%
エタノール−50mM)リス緩衝液(pH7,7)まで
のグラジェントで溶出した。溶出液を集め、5°Cにて
DEAEセファロースカラムにかけ、20mM)リス緩
衝液(pH7,7) 、次いで10mMリン酸緩衝液(
pH7,5)、そして15mM NaC1−10mM
リン酸緩衝液にて溶出した。hGM−C8Fは、60m
MNaC1−10mMリン酸緩衝液(pH7,5)を用
いてカラム溶出することににより精製した。
)と64m1の10M尿素を加えた。得られた混合液を
14℃において遠心分離し、上澄液を集めた。この上澄
液に533+ngの還元型グルタチオン及び1107I
I1の酸化型グルタチオンを含む720m1の20mM
のトリス緩衝液(p)I8.5)を加えた。この混合液
を5℃にて20時間放置した。この混合液を5℃にて分
子量10,000のメンプランを通過させることで濃縮
した。この濃縮液を、5℃にて少なくとも400m1の
20mMトリス緩衝液(pH8,5)とともに、分子量
10.000のメンプランを通過させバッファー交換し
た(ミリポア社製、ベリコンラボカセットを使用)。濃
縮液のpHを50%酢酸によってpH5,3とした。こ
の混合液を3℃において遠心分離した。希釈した上澄液
をCM−セファロースカラムにかけ、45mM Na
C1−20mM酢酸ナトリウム(pH5,4)緩衝液に
て溶出した。溶出液のpHを1Mトリス緩衝液(pH8
,5)を用いてpH7,7にした。CM−セファロース
カラムからの溶出液を5℃において04カラムにかけ、
20%エタノール−50mMトリス緩衝液(pH7,7
)にて溶出し、次いで40%エタノール−50mM)リ
ス緩衝液にて溶出した。hGM−CFは、40%エタノ
ール−50mM)リス緩衝液(pH7,7)より60%
エタノール−50mM)リス緩衝液(pH7,7)まで
のグラジェントで溶出した。溶出液を集め、5°Cにて
DEAEセファロースカラムにかけ、20mM)リス緩
衝液(pH7,7) 、次いで10mMリン酸緩衝液(
pH7,5)、そして15mM NaC1−10mM
リン酸緩衝液にて溶出した。hGM−C8Fは、60m
MNaC1−10mMリン酸緩衝液(pH7,5)を用
いてカラム溶出することににより精製した。
実施例7 hGM−CSFの活性確認hGM−C3F
の活性は、寒天中のヒト骨髄コロニーの成長を促進する
能力の検定により確認した。健常人の骨髄細胞をMcC
oy’s 5A培地(ギブコ社)で希釈し、Picol
l−Plaque (ファルマシア¥r、)溶液上に
重層した。室温で20分間500×gで遠心分離し、中
間層を集めて20倍量のMcCoy’s 5A培地で洗
浄した。次に懸濁液を室温で10分間250Xgで遠心
した。次に細胞を10%牛脂児血清を含むMcCoy’
s 5A培地に懸濁し、プラスチックシャーレ中で2時
間37℃、5%二酸化炭素の状態で培養した。培養後、
上清を集め2 X 106cells /mlの細胞懸
濁液を調製し。
の活性は、寒天中のヒト骨髄コロニーの成長を促進する
能力の検定により確認した。健常人の骨髄細胞をMcC
oy’s 5A培地(ギブコ社)で希釈し、Picol
l−Plaque (ファルマシア¥r、)溶液上に
重層した。室温で20分間500×gで遠心分離し、中
間層を集めて20倍量のMcCoy’s 5A培地で洗
浄した。次に懸濁液を室温で10分間250Xgで遠心
した。次に細胞を10%牛脂児血清を含むMcCoy’
s 5A培地に懸濁し、プラスチックシャーレ中で2時
間37℃、5%二酸化炭素の状態で培養した。培養後、
上清を集め2 X 106cells /mlの細胞懸
濁液を調製し。
た。
検定において骨髄細胞は以下の組成を持つ培地に最終濃
度が2 X 105cclls /’mlになる様に加
えた。a) 1.84部McCoy’s 5A培地−
2mMピルビン酸ナトリウム−〇、8XMEMアミノ酸
(ギブコ社)−0,08部MEM非必須アミノ酸(ギブ
コ社)−0,09%重炭酸ナトリウム−0,8部MEM
ビタミン溶液(ギブコ社)−2,4mML−グルタミン
−3,2mg/mlL −セリン−1,68+++g/
m1L−アスパラギンを含む溶液5部、およびb)0.
6% Noble寒天(Dll’co社)3部、C)牛
胎児血清1部。これに実施例6(2)で精製したhGM
−CSF溶液を加えた。培養細胞は、5%C02存在下
で湿潤空気37℃にて保温した。70乃至140間の培
養後、エステラーゼ二重染色により顆粒球とマクロファ
ージの確認を行なった。その結果0.5X107ユニッ
ト/W以上の活性を有することが判った。
度が2 X 105cclls /’mlになる様に加
えた。a) 1.84部McCoy’s 5A培地−
2mMピルビン酸ナトリウム−〇、8XMEMアミノ酸
(ギブコ社)−0,08部MEM非必須アミノ酸(ギブ
コ社)−0,09%重炭酸ナトリウム−0,8部MEM
ビタミン溶液(ギブコ社)−2,4mML−グルタミン
−3,2mg/mlL −セリン−1,68+++g/
m1L−アスパラギンを含む溶液5部、およびb)0.
6% Noble寒天(Dll’co社)3部、C)牛
胎児血清1部。これに実施例6(2)で精製したhGM
−CSF溶液を加えた。培養細胞は、5%C02存在下
で湿潤空気37℃にて保温した。70乃至140間の培
養後、エステラーゼ二重染色により顆粒球とマクロファ
ージの確認を行なった。その結果0.5X107ユニッ
ト/W以上の活性を有することが判った。
2×105の骨髄細胞から得られるコロニーの平均数は
約270であるという結果を得た。なお、ユニットの定
義についてはメトカーフらの報告によった[Blood
87 (1)37〜45(198B):l。
約270であるという結果を得た。なお、ユニットの定
義についてはメトカーフらの報告によった[Blood
87 (1)37〜45(198B):l。
陽性対照実験として、ヒトOCT培養上澄液(Gibc
o社)を、前記の培地に10%になる様に加え、同様の
結果を得た。
o社)を、前記の培地に10%になる様に加え、同様の
結果を得た。
微生物の寄託
λファージPLプロモーターを含む発現ベクターpCF
M526を有する大腸菌E、coltAM7、すなわち
E、colt AM7(pCFM526) 、は米国
メリーランド州、ロックビル・パークローンΦドライブ
のアメリカン・タイプφカルチュア・コレクション(A
TCC)に国際寄託されて、ATCC39932の寄託
番号を得ている。
M526を有する大腸菌E、coltAM7、すなわち
E、colt AM7(pCFM526) 、は米国
メリーランド州、ロックビル・パークローンΦドライブ
のアメリカン・タイプφカルチュア・コレクション(A
TCC)に国際寄託されて、ATCC39932の寄託
番号を得ている。
λCI8.7遺伝子を含むプラスミドp M W 1は
、それを含むE、coli JM103、すなわちE
、co l i JM103 (pMWl) 、とじ
てATCCに国際寄託されていて、ATC03993B
の寄託番号を得ている。
、それを含むE、coli JM103、すなわちE
、co l i JM103 (pMWl) 、とじ
てATCCに国際寄託されていて、ATC03993B
の寄託番号を得ている。
第1図は、hGM−CSF (n−101、Th r)
のアミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を示す説明
図である。 第2図は、hGM−CSF (n−101,11e)の
アミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を示す説明図
である。 第3図は、オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す説明図
である。 第4図は、各ブロックを形成するためのオリゴヌクレオ
チドのライゲーション計画を示す説明図である。 第5図は、各ブロックの塩基配列と制限酵素部位を示す
説明図である。 第6図(1)はhにM−C3F (n−101、Thr
’)をコードする本発明のDNA鎖を、第6図(2)は
hGM−C3F (n−101、Th r)をコードす
るS、D、配列を含む本発明のDNA鎖を、それぞれ示
す説明図である。 第7図(1)はhGM−C3F (n−101,11e
)をコードする本発明のDNA鎖を、第7図(2)はh
GM−CSF (n−101、l1e)をコードするS
、 D、配列を含む本発明のDNA鎖を、それぞれ示す
説明図である。 第8図は、pUC19へのhGM−CSF(n−101
、Th r)遺伝子のクローニングを示す説明図である
。 第9図は、合成trpプロモーターの塩基配列と制限酵
素部位を示す説明図である。 第10図は、合成t rpaルミターミネータ塩基配列
と制限酵素部位を示す説明図である。 第11図は、発現ベクターの構築を示す説明図である。 第12図([)はpsT6311の構築を、第12図(
2)はpTO614の構築を、それぞれ示す説明図であ
る。 出願人代理人 佐 藤 −雄 鴎 1図 兜2図 A −l CTCTA GATGGCACCA
GCTCGATCACCGTCCCCA−2GTCCA
CTCAACQA TGGGAAQA−3ATG TT
AACGCAAT CCAGGAAGCT CGTC・
A−4GTCTGCTGAACCTGTCTCGTGA
TACT GCTGCA −5TGAAA TGMCG
’AAACTGTTGAAGT。 a−6GGTGATCGAacraarcc cArc
TAaAGA c、crA−7TAACATGTT C
CCATGGTTG AGTGGACCiGG GA
CA−8、acAa、i、CcAcaAacrrc c
rcaATTacc TA −9ATTTCAG CA
GCAGTATCACGAGAcAGG TTCAA
・−10QATCACTTCAACAGTTTCG T
TcB −1’CCGGGTGAT CAGCGAAA
TG TTCGATCTGCAGB−2GAACCGA
CT丁GTCTGCAA ACCCGTCTGG
AACB −3TGTACAA ACAAGGTC丁
G CGTGGTTCTCTGB−4λCTAAAC
T GAAAGGTCCG crcAcrATaATc
cs−5CGGTTCCTGCAGATCGAACA
TTTcacTaA’rcAcB−6TGTACAGT
TCCAGACGGGTTT GCAGACAAGT
B−7TTTAGTCAGA GAACCACGCA
GACCTTCTT[3−8CTAGCCATCATA
GTCAGCG GACCTTTCAG第3図(1) ACCGATC,NheI GTGAGTTGGT ACFCTTGTAC506゜ TTGTCTGCAA ACCCGTCTGGAAC
AGACGTT TGGGCAGACCllo
126 (iAAAGGTCCG CTGACTATGACT
TTCCAGGCGACTGATACTAAGCTAA
CAA CCCTTGGCCA AGTCCTTA
TT708ONCO工 CGTCCCCGTCCACTCAACGCAGGGG
CAG GTGAGTTGGT Ac第 6図 TCGAGAGAT CTACCGTGGT CGAG
CTACTACTTCCTTTG ACAACTTC
ACTAGTCGCTTCACGATGAGT CT
AGTAGTGA AAGCTTAGAAATAGC
GCAfi、GCTAACAACCCTTGGCCAA
・] AATTCATCG ATTAATTTAT TAA
AACTTAAGTAGCTAATTAAATA A
TTTTGAATTCGTCCCCGTCCACTCA
ACCA TGGGAACATGGCAGGGC;C
AG GTGA’GTTGGT ACCCTTGT
ACTGAACCTGTCTCGTGATAC丁 GC
TGCTGAAAACTTGGΔCAG AGCAC
TATGA CGACGACTTT190 ’
200 210TGTTCGAT
CT GCAGGAACCG 八CTTGTCTG
CΔCAAGCTAGA CGTCCTTGGCTG
AACAGACGTGCGTGGTTCTCTGACT
AAA CTGAA、AGGTCACGCACCAA
G AGACTGATTT GACTTTCCAG
TCAAAGAAAA CCTGAAAGAT ’
rTCCTGCTGGAGTTTC1’TTT GG
ACTTTCTA AAGGACGACCl30 AGGAATΔATA GGATCCATCCTTA
l”I’AT CCTAGGTTCG A100
110 、 120TTAACG
CAAT CCAGGAAGCT CGTCGTC
TGCAATTGCGTTA GGTCCTTCGA
GCAGCAGACGTGAACGAAACTGT
TGAAGTGAT’CAGCGA△ノ\ACTTGC
TTTG A、CAACTTCACTAGTCGCT
TTAAACCCGTCT GGAACTGTACA
AACAAGGTCTTTGGGCI〜GA CCT
TGACATG TTTGTTCCAGCGCTGAC
TAT GATGGCTAGCCATTACAAAC
GCGACTGATA CTACCGATCG G
TAATGTTTG3.10 350
360GTGCTACTCA GATCA
TCACT TTCGAATCT’rCACGATG
AGT CTAGTAGTGA AAGCTTAG
八A400 へ 410 42
0TTATCCCGTT CGATTGTTGG
GAACCGGTTCAATAGGGCAA GCT
AACAACCCTTGGCCAAG第8図(2) 第12図(1) 第12図(2) 手続補正書 昭和62年7月27日 工 事件の表示 昭和62年 特許願 第1.06148号2 発明の名
称 ヒ)−14粒球マクロファージコロニー刺激因子の製造 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 ア ム ジ エ ン 4代理人 ((上刃)1名) 8 補正の内容 1) 明細書を下記の通りに補正する。 (1) 第8頁第10行 「必要である。」と「第3図」の間に、下記を加入する
。 「また、繰返し配列が1つのオリゴヌクレオチド内に出
現しないようにすることも必要である。」(2) 第
11頁第8行 「これを」を下記の通りに補正。 「このDNA鎖をこれをその遺伝情報が発現可能な状態
で含むプラスミドとして」 (3) 第12頁第15行 r rmRNAJを「プラスミド」と補正する。 (4) 第14頁第9行 「培養物」を、「菌体」と補正する。 (5) 第15頁第11行 「除いた。」を、「除き、担体よりオリゴヌクレオチド
を切出した。」と補正する。 (6) 第16頁第7〜8行 rO,05Mトリエチルアミン重炭酸緩衝液」の後に、
r (pH7,5)Jを加入する。 (7) 第17頁第9〜10行 「戻した。これを最終容量」を、「戻してアニーリング
を行なった。これを」と補正する。 (8) 第18頁第18行 rTRIs−HCIJを、rTr i 5−HCIJと
補正する。 (9) 第18頁第19行 「の4」を、「のT4Jと補正する。 (10)第19頁第6行 rMmJを、rmMJと補正する。 (11)第19頁第7行 「T4」を「T4」と補正する。 (12)第23頁第19行 r153Jを、r153(アマジャム社)」と補正する
。 (13)第26頁第12行 rRGM−Jを、rhGM−Jと補正する。 (14)第29頁第12〜13行 「ヒト骨髄コロニー」を、「ヒト骨髄細胞由来のコロニ
ー」と補正する。 (15)第29頁第19行 「遠心した。」を「遠心し、洗浄した。」と補正する。 2) 第12図(1)および第12図(2)を、それぞ
れ別紙の通りに補正する。 第12図(1) 第12図(2)
のアミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を示す説明
図である。 第2図は、hGM−CSF (n−101,11e)の
アミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を示す説明図
である。 第3図は、オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す説明図
である。 第4図は、各ブロックを形成するためのオリゴヌクレオ
チドのライゲーション計画を示す説明図である。 第5図は、各ブロックの塩基配列と制限酵素部位を示す
説明図である。 第6図(1)はhにM−C3F (n−101、Thr
’)をコードする本発明のDNA鎖を、第6図(2)は
hGM−C3F (n−101、Th r)をコードす
るS、D、配列を含む本発明のDNA鎖を、それぞれ示
す説明図である。 第7図(1)はhGM−C3F (n−101,11e
)をコードする本発明のDNA鎖を、第7図(2)はh
GM−CSF (n−101、l1e)をコードするS
、 D、配列を含む本発明のDNA鎖を、それぞれ示す
説明図である。 第8図は、pUC19へのhGM−CSF(n−101
、Th r)遺伝子のクローニングを示す説明図である
。 第9図は、合成trpプロモーターの塩基配列と制限酵
素部位を示す説明図である。 第10図は、合成t rpaルミターミネータ塩基配列
と制限酵素部位を示す説明図である。 第11図は、発現ベクターの構築を示す説明図である。 第12図([)はpsT6311の構築を、第12図(
2)はpTO614の構築を、それぞれ示す説明図であ
る。 出願人代理人 佐 藤 −雄 鴎 1図 兜2図 A −l CTCTA GATGGCACCA
GCTCGATCACCGTCCCCA−2GTCCA
CTCAACQA TGGGAAQA−3ATG TT
AACGCAAT CCAGGAAGCT CGTC・
A−4GTCTGCTGAACCTGTCTCGTGA
TACT GCTGCA −5TGAAA TGMCG
’AAACTGTTGAAGT。 a−6GGTGATCGAacraarcc cArc
TAaAGA c、crA−7TAACATGTT C
CCATGGTTG AGTGGACCiGG GA
CA−8、acAa、i、CcAcaAacrrc c
rcaATTacc TA −9ATTTCAG CA
GCAGTATCACGAGAcAGG TTCAA
・−10QATCACTTCAACAGTTTCG T
TcB −1’CCGGGTGAT CAGCGAAA
TG TTCGATCTGCAGB−2GAACCGA
CT丁GTCTGCAA ACCCGTCTGG
AACB −3TGTACAA ACAAGGTC丁
G CGTGGTTCTCTGB−4λCTAAAC
T GAAAGGTCCG crcAcrATaATc
cs−5CGGTTCCTGCAGATCGAACA
TTTcacTaA’rcAcB−6TGTACAGT
TCCAGACGGGTTT GCAGACAAGT
B−7TTTAGTCAGA GAACCACGCA
GACCTTCTT[3−8CTAGCCATCATA
GTCAGCG GACCTTTCAG第3図(1) ACCGATC,NheI GTGAGTTGGT ACFCTTGTAC506゜ TTGTCTGCAA ACCCGTCTGGAAC
AGACGTT TGGGCAGACCllo
126 (iAAAGGTCCG CTGACTATGACT
TTCCAGGCGACTGATACTAAGCTAA
CAA CCCTTGGCCA AGTCCTTA
TT708ONCO工 CGTCCCCGTCCACTCAACGCAGGGG
CAG GTGAGTTGGT Ac第 6図 TCGAGAGAT CTACCGTGGT CGAG
CTACTACTTCCTTTG ACAACTTC
ACTAGTCGCTTCACGATGAGT CT
AGTAGTGA AAGCTTAGAAATAGC
GCAfi、GCTAACAACCCTTGGCCAA
・] AATTCATCG ATTAATTTAT TAA
AACTTAAGTAGCTAATTAAATA A
TTTTGAATTCGTCCCCGTCCACTCA
ACCA TGGGAACATGGCAGGGC;C
AG GTGA’GTTGGT ACCCTTGT
ACTGAACCTGTCTCGTGATAC丁 GC
TGCTGAAAACTTGGΔCAG AGCAC
TATGA CGACGACTTT190 ’
200 210TGTTCGAT
CT GCAGGAACCG 八CTTGTCTG
CΔCAAGCTAGA CGTCCTTGGCTG
AACAGACGTGCGTGGTTCTCTGACT
AAA CTGAA、AGGTCACGCACCAA
G AGACTGATTT GACTTTCCAG
TCAAAGAAAA CCTGAAAGAT ’
rTCCTGCTGGAGTTTC1’TTT GG
ACTTTCTA AAGGACGACCl30 AGGAATΔATA GGATCCATCCTTA
l”I’AT CCTAGGTTCG A100
110 、 120TTAACG
CAAT CCAGGAAGCT CGTCGTC
TGCAATTGCGTTA GGTCCTTCGA
GCAGCAGACGTGAACGAAACTGT
TGAAGTGAT’CAGCGA△ノ\ACTTGC
TTTG A、CAACTTCACTAGTCGCT
TTAAACCCGTCT GGAACTGTACA
AACAAGGTCTTTGGGCI〜GA CCT
TGACATG TTTGTTCCAGCGCTGAC
TAT GATGGCTAGCCATTACAAAC
GCGACTGATA CTACCGATCG G
TAATGTTTG3.10 350
360GTGCTACTCA GATCA
TCACT TTCGAATCT’rCACGATG
AGT CTAGTAGTGA AAGCTTAG
八A400 へ 410 42
0TTATCCCGTT CGATTGTTGG
GAACCGGTTCAATAGGGCAA GCT
AACAACCCTTGGCCAAG第8図(2) 第12図(1) 第12図(2) 手続補正書 昭和62年7月27日 工 事件の表示 昭和62年 特許願 第1.06148号2 発明の名
称 ヒ)−14粒球マクロファージコロニー刺激因子の製造 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 ア ム ジ エ ン 4代理人 ((上刃)1名) 8 補正の内容 1) 明細書を下記の通りに補正する。 (1) 第8頁第10行 「必要である。」と「第3図」の間に、下記を加入する
。 「また、繰返し配列が1つのオリゴヌクレオチド内に出
現しないようにすることも必要である。」(2) 第
11頁第8行 「これを」を下記の通りに補正。 「このDNA鎖をこれをその遺伝情報が発現可能な状態
で含むプラスミドとして」 (3) 第12頁第15行 r rmRNAJを「プラスミド」と補正する。 (4) 第14頁第9行 「培養物」を、「菌体」と補正する。 (5) 第15頁第11行 「除いた。」を、「除き、担体よりオリゴヌクレオチド
を切出した。」と補正する。 (6) 第16頁第7〜8行 rO,05Mトリエチルアミン重炭酸緩衝液」の後に、
r (pH7,5)Jを加入する。 (7) 第17頁第9〜10行 「戻した。これを最終容量」を、「戻してアニーリング
を行なった。これを」と補正する。 (8) 第18頁第18行 rTRIs−HCIJを、rTr i 5−HCIJと
補正する。 (9) 第18頁第19行 「の4」を、「のT4Jと補正する。 (10)第19頁第6行 rMmJを、rmMJと補正する。 (11)第19頁第7行 「T4」を「T4」と補正する。 (12)第23頁第19行 r153Jを、r153(アマジャム社)」と補正する
。 (13)第26頁第12行 rRGM−Jを、rhGM−Jと補正する。 (14)第29頁第12〜13行 「ヒト骨髄コロニー」を、「ヒト骨髄細胞由来のコロニ
ー」と補正する。 (15)第29頁第19行 「遠心した。」を「遠心し、洗浄した。」と補正する。 2) 第12図(1)および第12図(2)を、それぞ
れ別紙の通りに補正する。 第12図(1) 第12図(2)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、第1図又は第2図に示す塩基配列を含むDNA鎖。 2、第1図又は第2図に示す塩基配列を含むDNA鎖を
その遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミドによっ
て形質転換されたものであることを特徴とする、大腸菌
(E.coli)。 3、第1図又は第2図に示す塩基配列を含むDNA鎖を
用意し、このDNA鎖を、これをその遺伝情報が発現可
能な状態で含むプラスミドの作成、このプラスミドによ
る大腸菌(E.coli)の形質転換および得られる形
質転換体の培養から成る工程に付して培養物中にヒト顆
粒球マクロファージコロニー刺激因子を産生させること
を特徴とする、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62106148A JP2521094B2 (ja) | 1987-04-28 | 1987-04-28 | ヒト顆粒球マクロファ―ジコロニ―刺激因子をコ―ドする合成dna、そのdnaを含むプラスミド、およびそのdnaで形質転換された大腸菌 |
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Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP7263370A Division JP2562572B2 (ja) | 1995-10-11 | 1995-10-11 | ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の製造法 |
Publications (2)
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JPS63269983A true JPS63269983A (ja) | 1988-11-08 |
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JP62106148A Expired - Lifetime JP2521094B2 (ja) | 1987-04-28 | 1987-04-28 | ヒト顆粒球マクロファ―ジコロニ―刺激因子をコ―ドする合成dna、そのdnaを含むプラスミド、およびそのdnaで形質転換された大腸菌 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05503574A (ja) * | 1990-01-31 | 1993-06-10 | アルフレッド・テヴェス・ゲーエムベーハー | 作動伝達液の状態を測定するための装置 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61502682A (ja) * | 1984-07-06 | 1986-11-20 | サンド・アクチエンゲゼルシヤフト | リンホカインの生産および精製 |
-
1987
- 1987-04-28 JP JP62106148A patent/JP2521094B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61502682A (ja) * | 1984-07-06 | 1986-11-20 | サンド・アクチエンゲゼルシヤフト | リンホカインの生産および精製 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05503574A (ja) * | 1990-01-31 | 1993-06-10 | アルフレッド・テヴェス・ゲーエムベーハー | 作動伝達液の状態を測定するための装置 |
JP2975108B2 (ja) * | 1990-01-31 | 1999-11-10 | アルフレッド・テヴェス・ゲーエムベーハー | 作動伝達液の状態を測定するための装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2521094B2 (ja) | 1996-07-31 |
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