JPS63269983A - ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をコードする合成dna、そのdnaを含むプラスミド、およびそのdnaで形質転換された大腸菌 - Google Patents

ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をコードする合成dna、そのdnaを含むプラスミド、およびそのdnaで形質転換された大腸菌

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JPS63269983A
JPS63269983A JP10614887A JP10614887A JPS63269983A JP S63269983 A JPS63269983 A JP S63269983A JP 10614887 A JP10614887 A JP 10614887A JP 10614887 A JP10614887 A JP 10614887A JP S63269983 A JPS63269983 A JP S63269983A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
(以下rhGM−C3FJという)の遺伝子組換えによ
る製造技術に関する。具体的にはhGM−C8Fをコー
ドする合成遺伝子、該DNAで形質転換された大腸菌及
びこれらを用いるhGM−C3Fの製造法に関する。
従来技術 ]ロニー刺激因子(以下rCSFJという)は軟寒天中
で造血幹細胞の増殖分化を刺激し、特定のタイプの血液
細胞から成るコロニー形成を促進する生理活性物質であ
る。hGM−C5Fは、顆粒球マクロファージ系の幹細
胞(CFU−GM)を刺激して、顆粒球マクロファージ
の形成を促進する因子であって、次の用途に利用するこ
とが期待されている。
すなわち、癌の放射線療法あるいは化学療法による白血
球減少症の治療、骨髄移植俊速やかに白血球を増殖させ
る、その他に存用と考えられている。
hGM−C3Fの遺伝子組換えによる製造技術について
は既にいくつかの報告(PCT公開公報WO36100
639、同WO36103225、EPO公開公報01
83350その他)があり、hGM−C3Fをコードす
る遺伝子の塩基配列並びにそれによって生産されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は共に公知である。なお、hG
M−C5Fは、144ケのアミノ酸から成るポリペプチ
ドを含む糖蛋白と考えられている(PCT公開公報WO
36100639号参照)。
〔発明の概要〕
発明が解決しようとする問題点 一般に遺伝子組換え技術による物質生産においては、宿
主として動物細胞あるいは酵母を用いるよりも大腸菌を
用いたほうが物質の生産性が高いのが普通である。
hGM−C8Fをコードする遺伝子の大腸菌による発現
に関しては、本発明者らの知る限り二つの報告がある。
クラークらは、hGM−C8Fを構成するポリペプチド
のアナログ(hG〜1−CSFを構成するポリペプチド
とはそのアミノ酸配列が3カ所において異なりかつN末
にメチオニンを有するポリペプチド)をコードする遺伝
子を大腸菌で発現させているが(PCT公開公報WO3
6100639号参照)、このときの遺伝子の発現レベ
ルは、細胞(大腸菌)蛋白の高々5%と極めて低くかつ
その発現産物がhGM−CSF活性を有するか否かは全
く不明であった。
また、バージニスらは、ヒト単球細胞株U937より得
たhGM−C3FをコードするcDNAを大腸菌で発現
させているが、このときの発現レベルは大腸菌蛋白の8
〜10%(Blood。
廷、 (1) 43(1987))であって、十分なも
のではなかった。
このため、hGM−C8F活性を有するポリペプチドな
いし糖蛋白のより効率的な製造技術を確立することが望
まれていた。
発明の要旨 本発明は上記の問題点を解決するためになされたもので
あり、hGM−CSF活性を有するポリペプチドを大腸
菌で効率よく製造するための手段を提供するものである
。すなわち本発明は、(1) 第1図又は第2図に示す
塩基配列を含むDNA鎖。
(2) 第1図又は第2図に示す塩基配列を含むDNA
鎖をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミドに
よって形質転換されたものであることを特徴とする大腸
菌(E、coli)。
(3) 第1図又は第2図に示す塩基配列を含むDNA
鎖を用意し、このDNA鎖を、これをその遺伝情報が発
現可能な状態で含むプラスミドの作成、このプラスミド
による大腸菌 (E.coli)の形質転換および得られる形質転換体
の培養から成る工程に付して培養物中にhGM−C8F
を産生させることを特徴とする、hGM−C3Fの製造
法。
である。
〔発明の詳細な説明〕
本発明のDNA鎖 本発明のDNA鎖は第1図又は第2図に示す塩基配列を
含むものである。この塩基配列は公知のh G M −
CS F (Mature部分)のアミノ酸配列のN末
にMetを付加したポリペプチドをコードするものであ
るが、大腸菌で高発現させることができるよう次の諸点
を考慮して本発明者らが設計したものである。
■ 大腸菌において優先的に用いられているコドンを使
用する。大腸菌において優先的に用いられているコドン
は池村によって報告されている(池村、Jpn、 J、
Gcnct、 56 p533−555 (1981)
)。
■ 5′末端の塩基配列を大腸菌の各種遺伝子の翻訳開
始部位に共通な塩基配列に近づけた(Scherer 
et al、、 Nucl、 Ac1ds、 Res、
 8  p3895−3905 (1980))。
なお、本発明のDNA鎖は、これを適当なベクターに結
合させ大腸菌に導入し高発現させるためのものであるが
、このDNA鎖の高発現を実現させるためには、前記の
塩基配列の5′末端上流側にS、 D、配列を含む TAAGGAGGTATATTの塩基配列ATTCCT
CCATATAA (Scherer、 et at、 Nucl、 Ac
1ds Res、 8 p3895−3905(198
0))を有することが好ましく、また前記の塩基配列の
3′末端下流に終止コドンを2つ以上有していてもよい
。更にこの遺伝子の5′末端及び3′末端には遺伝子組
換操作を容易にするだめの適当な制限酵素部位を付加し
ておくことが好ましい。
本発明のDNA鎖の製造 本発明のDNA鎖は、合目的的な任意の方法で製造する
ことができるが、その−例を示すと次の通りである。
(1) 第1図の塩基配列を含むDNA鎖の製造DNA
鎖を3〜4個の約100塩基対程度のブロックに分けて
合成し、各ブロックを順次適当なりローニングブラスミ
ド(例えばpUc19゜MO5SingらGcna 3
3 pHo 〜115’(1985) )に挿入連結す
ることにより目的とするDNA鎖を得る。
各ブロックの合成は、これを25〜35塩基程度のオリ
ゴヌクレオチドに分けて合成し、これらを会合させるこ
とにより行う。ブロックをオリゴヌクレオチドに区分け
する際には、各オリゴヌクレオチドが自己会合を起こす
ことがないよう1つのオリゴヌクレオチド内に自己相補
的配列が出現しないようにすることが必要である。第3
図に区分けしたオリゴヌクレオチドの塩基配列の一例を
、また第4図にこれらのオリゴヌクレオチドからの各ブ
ロックの構成例を、また第5図に各ブロックの塩基配列
と制限酵素部位の一例を示す。
各オリゴヌクレオチドは既知の合成法によって合成する
ことが出来る〔例えばホスホアミダイト法による固相合
成法(BeaucagcらTctrahedronLa
tters 221859〜18B2(1981)) 
、またこの合成法に基づく自動合成機を使用することも
可能である。各ブロックの構築は、各オリゴヌクレオチ
ドの5′末端を、必要に応じてポリヌクレオチドキナー
ゼでリン酸化した後アニールし、DNAリガーゼによっ
て二重鎖DNAとすることにより行う。
各ブロックを連結する手順は次の通りである。
第5図のCブロックを、pUc19のHind■及びP
stlによる切断片と結合させプラスミドpYC8を得
、これで大腸菌JM109を形質転換する。次いで、p
YC8を単離し、ダイデオキシ法によって塩基配列を確
認するとともに、pYC8をNhel及びAvalで消
化してからBブロックを結合させ、pSCB86を得、
これでJM109を形質転換する。pSCB86の塩基
配列を確認した後、pSCB86で大腸菌dam−株G
M33を形質転換し、pSCB86を改めて単離する。
pSCB86をBclI及び5acIで消化してからこ
れにAブロックを結合させpscBA867を得、これ
でJM109を形質転換する。同様にpSCBA867
の塩基配列を確認し、更にpSCBA867をNcoI
及びEcoRIで消化し、これにDブロックを結合させ
ることによりp 5CBAD8676を得、JM109
を形質転換し、同様にして塩基配列を確認する。
このようにして得られるpSCBA867をXbal 
(Sacl)及びBamHI (Hind■)にて消化
することにより、第1図に示した塩基配列を含む本発明
のDNA鎖を得ることができる(第6図(1))。pS
CBAD8676をC1al (EcoRI)及びBa
mHI(HindI[[)にて消化すればSD配列を含
む本発明のDNA鎖を得ることができる(第6図(2)
)。
(2) 第2図の塩基配列を含むDNA鎖の製造前記の
「第1図の塩基配列を含むDNA鎖の製造」に準じた手
順により製造することができる。
ただし、この場合には、前記のオリゴヌクレオチドC−
3の代わりに下記のC−13を、またC−9の代わりに
下記のC−14を用いる。
C−13CTACTCAGATCATCACTTTCG
AATCTTT C−14TCTTTGAAAGATTCGAAAGTG
ATGATCT このようにして得られる本発明のDNA鎖を第7図に示
す。
形質転換体の作成 上記のようにして調製される本発明DNA鎖は、hGM
−CSF蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいるので
、これを生物工学的手法によって大腸菌(E、coli
)に導入して形質転換し、得られる形質転換体を培養す
ることにより、hGM−CSF蛋白をつくらせることが
できる。
形質転換体の作成(およびそれによるhGM−C8Fの
生産)のための手順ないし方法そのものは、分子生物学
、生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用されて
いるものでありうるので、本発明においても下記したと
ころ以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実施
すればよい。
大腸菌中で本発明DNA鎖の遺伝子を発現させるために
は、まず大腸菌中で安定に存在するプラスミドベクター
中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。このプラス
ミドベクターとしては、pBR322等合目的的な任意
のものを用いることができる。
一方、本発明DNA鎖の遺伝子を大腸菌で発現させるた
めには、そのDNAをmRNAへ転写させる必要がある
。そのためには、転写のためのシグナルであるプロモー
ターを本発明DNA鎖の5′側上流に組込めばよい。こ
のプロモーターについてはすでにt rp、lac、P
LSOmpF等種々知られており、本発明でもこれらの
いずれをも利用することができる。
また、転写を終結させるためのターミネータ−を本発明
DNA鎖の3′側下流に組込むことが好ましい。強力な
プロモーターを用いた場合、ターミネータ−を挿入する
ことにより、mRNAの安定性を高めることができる。
ターミネータ−としては、trpa、rrncs λt
 oop等を用いることができる。
また、mRNAを蛋白に翻訳させる段階では蛋白合成の
場であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合するた
めに必要な配列(S、 D、配列と呼ばれる)を蛋白合
成の開始信号であるATGの前につける必要がある。更
に効率的に発現させる為には、このS、 D、配列並び
にこのS、 D、配列と蛋白合成の開始信号であるAT
Gとの間の塩基配列を、大腸菌における翻訳開始部位に
共通な塩基配列に近づけることが好ましい。例えばTA
AGGAGGTATATTとすることが好まATTCC
TCCATATAA しい。
このようにしてつくったプラスミドによる大腸菌の形質
転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されて
いる合目的的な任意の方法によって行なうことができる
。その一般的な事項については適当な底置または総説た
とえばManiatisら、rMolccular C
Ionl、ng−A Laboratory Manu
al J、Co1d SprIng Harbor L
aboratory (1982)を参照すればよい。
形質転換体は、本発明DNA鎖によって導入された遺伝
情報による新しい形質(すなわちhGMCSFの生産能
)および使用ベクター由来の形質ならびに場合によって
は、生じているかも知れない遺伝子組換時の使用ベクタ
ーからの一部の遺伝情報の欠落による対応形質の欠落を
除けば、そのゼノタイプないしフェノタイプあるいは菌
学的性質において使用大腸菌と同じである。
hGM−C3Fの生産 上記のようにして得られる形質転換体のクローンは、こ
れを培養すれば培養物中にh G M −C3F蛋白を
生産する。
形質転換体の培養ないし増殖条件は、使用大腸菌に対す
るそれと本質的には変らない。また、培養物すなわち菌
体および(または)培養液からの生産蛋白の回収も合目
的的な任意の方法(例えば、後記実施例6記載の方法)
に従って行なうことができる。hGM−CSFは大腸菌
中において凝集した形で産生されるので、この蛋白を回
収後変性剤(例えば、塩酸グアニジン、尿素)を用いて
溶解し、ジスルフィド結合を還元剤(例えばジチオスレ
イトール)を用いて切断してから常法に従って精製する
ことが好ましい。
実施例1 オリゴヌクレオチドの合成 第3図に示すオリゴヌクレオチド並びに前記のオリゴヌ
クレオチドC−13およびC−14は、ホスホアミダイ
ト法(Beaucageら、TetrahedronL
etters 221859〜19B2(1981))
を用いたDNA自動合成機(アプライドバイオシステム
ズ社製380A型、M、 l1unkapl I Ie
rら、Nature 310105〜111(1984
) )を使用して合成した。
合成終了後、濃アンモニア水で60℃で5時間処理して
、塩基の保護基を除いた。得られたオリゴヌクレオチド
を高性能液体クロマトグラフィー(HP L C)を用
いて精製した。すなわち逆相の中性硬質ポリスチレン系
ゲル(PRP −1、ハミルトン社)のカラム(φ4、
IX150mm)にかけ、0.1Mトリエチルアミン酢
酸緩衝液中(pH7,0)のアセトニトリルの直線濃度
勾配法によって精製した。目的とするピークのものを集
め、8Mウレアを含む12%ポリアクリルアミドを用い
た電気泳動にかけた。泳動後ゲルの下に螢光色素を含む
TLCプレートを置き、UVランプを用いて目的のバン
ドの存在を確認した。目的とするオリゴヌクレオチドを
含むゲル片を、透析チューブ内に封入し、DNAをゲル
から電気的に溶出した。この透析チューブ内液をセファ
デックスG25(ファルマシア社製)のゲル濾過カラム
(φ1.5X4Bco+)にかけ0.05M)リエチル
アミン重炭酸緩衝液にて溶出し脱塩した。目的とするオ
リゴヌクレオチドを含む溶出液を減圧濃縮して、純粋な
オリゴヌクレオチドを得た。
実施例2 オリゴヌクレオチドのライゲーション化学合
成したオリゴヌクレオチド34本を第4図のブロックの
調製計画に従ってライゲーションした。以下詳細にのべ
る。各ブロックの5′末端にあるオリゴヌクレオチドを
除く残りの26本の各オリゴヌクレオチド(各0.8μ
mol)を20μgのリン酸化反応液(50mM  T
r i s −HCl、pH7,4,10m M  M
 g CI 2.10mM  DTT、30uC1の(
a−32P”JATP (3000C110+mol)
 、15ユニツトのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(ベ
ーリンガー・マンハイム社)〕中で37℃30分間反応
させて5′末端をリン酸化してラベルした。次いで10
0mM  ATPを1μg加え、37℃30分間反応さ
せることで完全に5′末端をリン酸化し、100℃5分
間加熱することで反応を停止した。
次いで、第4図のライゲーション計画に従い、各オリゴ
ヌクレオチドを混合し、95℃5分間加熱し2時間かけ
て常温まで戻した。これを最終容量200μgのライゲ
ーション反応液(50mMTris−HCI、pa7.
4.10mMMgC12,15mM  DTT、1mM
  ATP。
T4  DNAリガーゼ30ユニツト(ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ社)〕中にて15℃14時間反応
させた。一部の反応溶液を8%ポリアクリルアミド電気
泳動にかけ、ラジオオートグラフで各ブロックがライゲ
ーション反応の結果として得られたことをそれぞれ確認
した。次に上記反応液にエタノールを加えてDNAを沈
殿させ、同様に8%ポリアクリルアミド電気泳動にて分
離した。各ブロックを含むゲル片を透析チューブに入れ
、泳動緩衝液中で電気泳動することによりそれぞれ溶出
した。次に各透析チューブ内液をNACSカラム(ベゼ
スダ・リサーチ・ラボラトリ−社)にかけ、溶出液にエ
タノールを加えDNAをそれぞれ沈殿させた。
実施例3  hGM−CSF遺伝子のクローニングクロ
ーニングベクターには大腸菌のプラスミドpUc19 
(ファルマシア社)を用いた。1μgのpUc19DN
Aを30Mgの反応液(10mM  Trts−HCI
、pH7,5,10mM  MgCl2.1mM  D
TT。
50mM  NaC!、12−LニットのHindm(
宝酒造)、10ユニツトのPstI(宝酒造)〕中、3
7℃2時間反応させた後、65℃20分間処理して制限
酵素を失活させた。1μgのCブロックDNA20μ、
lJの反応液(50mMTRiS−HCI、pH7,4
,10mMM g CI 2.5mM  ATP、10
ユニツトの4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造)〕中
、37℃1時間反応させ、リン酸化した。この反応2μ
gを前記のpUc19DNAとHindIn及びPst
lとの反応液7μgに加え、更に2μgの[500mM
  Tris−HCI、pH7,4,100、mM  
Mg C12)溶液、1u(lの100Mm  DTT
、lμfの100mM  ATP、2μg (2ユニツ
ト)のT4DNAリガーゼ(べ一リンガー・マンハイム
社)、15μgのオートクレーブ水を加え、14℃で1
4時間反応させた。
この反応液を用い、大腸菌JM109株(C。
Yanisch−PerronらGene 33 p1
03−IL9 (In2))を既知の方法(D、 l1
anahan J、 Mo1. Blol、 p557
〜580 (1980))により形質転換させた。その
際、プレートにはLBプレートを用い、50μg/ml
のアンピシリン、0.24ff1g/mlのイソプロピ
ル−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)及び0、
 04mg/ml  5−ブロモ、−4−クロロ−3−
インドリル−β−ガラクトシド(X−gal)を含んで
いた。アンピシリン耐性で無色のコロニーを選び、その
うちの1つをpYC8/JM109と命名した。
CブロックDNAがpUc19のHind■及びPst
Iの間に挿入された場合、CブロックDNAによるユニ
ークなNhel制限酵素部位が存在する。そこで、pY
C8/JM109の菌株よりプラスミドDNAをアルカ
リ法(T、Maniatisら、Mo1ecular 
Cloning p368〜3B9(1982) Co
ldSpring l1arbor )にて分離し、N
 h e I (−二−イングランドバイオラブズ社)
によって消化されることを確認した。またpYC8につ
いてダイデオキシ法(版部ら、Anal、 Bloch
cm、 152p232−238 (1986) )を
用いて塩基配列を確認した。
pYC8をNheI及びAvaIにて消化した後、上記
と同様な方法にて、BブロックDNAをライゲーション
して挿入し、大腸菌JM109株を形質転換させた。B
ブロックが挿入されたことを、5ail制限酵素の消失
によって確認し、前記の方法にて塩基配列を確認した。
得られた菌株をpSCB86/JM109とした。この
プラスミドpSCB86で大腸菌dam−株である0M
33株(東洋紡績■より入手)を形質転換した。
この菌株をpSCB86/GM33とした。
この菌株よりプラスミドを単離し、Bcll及びSac
 Iにて消化後、AブロックDNAを挿入し、大腸菌J
M109株を形質転換させた。Aブロックが挿入された
ことをNcol制限酵素部位の存在で確認した。塩基配
列を前記の方法で確認した。得られた菌株をpSCBA
867/JM109とした。これにより、第6図(1)
に示す本発明のDNA鎖を調製した。
更i、ms、 D、 配列を含むhGM−CSF遺伝子
を調製する為に、プラスミドpsCBA867をNco
I及びEcoRIにて消化し、DブロックDNAを挿入
し、大腸菌JM109株を形質転換させた。Aブロック
が挿入されたことをC1aI制限酵素部位の存在で確認
した。塩基配列を前記の方法で確認した。得られた菌株
をpTCBAD8676/JMI 09とした。これに
より第6図(2)に示すS、 D、配列を含む本発明の
DNA鎖を調製した。
以上のクローニングプロセスの概要を第8図に示した。
また前記と同様の手順により第7図(1)(2)に示す
本発明のDNA鎖を製造した。ただし、オリゴヌクレオ
チドC−3の代わりにC−13を、またC−9の代わり
にC−14を用いた。
実施例4 発現ベクターの構築 大腸菌トリプトファンオペロンのプロモーター及びオペ
レーター領域の塩基配列については既にBennett
らにより報告されている(J、 Hot、 Blol。
121 pH3−p137 (1978))。転写開始
点から、5′上流−94塩基より、3′下流+21塩基
までの配列をベースとし、その転写開始点直後にC1a
IサイトをまたS、D、配列の直後にXbaIサイトを
設け、さらに5′末端にはEcoRIサイトをまた3′
末端にはHindIIIサイトを設けた131塩基対を
化学的に合成した(第9図)。この131塩基のトリプ
トファンプロモーターをpBR322のEcoRI及び
HindII[にて消化したDNAに挿入し、トリプト
ファンプロモーターを含む発現ベクターとし、pST8
と命名した。
トリプトファンオペロンの転写終結の為のターミネータ
−は、Chrlstjeらによってその塩基配列とその
終結の強さが報告されている(Proc、 Natl。
Acad、 Set、 USA  78 (7) p4
180〜4184 (1981) )。
Trpaターミネータ−の5′末端にBamHIサイト
を、3′末端にsph Iサイトを設けたオリゴヌクレ
オチドを化学的に合成(第10図)した。このターミネ
ータ−を含むオリゴヌクレオチドを、pST8のBam
HI及び5phIにて消化したDNAに挿入して、プラ
スミドpsT81を得た。
pBR322由来のプラスミドで、大腸菌におけるコピ
ー数の高いpA7153がTν1ggらにより作られて
いる(Nuture 283 p21B−p218(1
980))。
そこでpsT81のトリプトファンプロモータ及びTr
paターミネータ−を含むDNA断片をEcoRI及び
5phIにて消化して得、pAT153のEcoRIお
よび5phI消化断片に挿入して、プラスミドpsT8
11を得た(第11図参照)。
実施例5  hGM−CSFの発現用プラスミドの構築 (1) プラスミドpsT811による発現用プラスミ
ド 前記pSCBAD8676をC1aI及びBamHIに
て消化後、0.8%アガロース電気泳動により、423
塩基対のDNA断片を精製した。前記発現用ベクターp
sT811をC1aI及びBamHIにより消化後、上
記423塩基対のS、 D、配列を含むhGM−C3F
遺伝子(第6図(2)をT4リガーゼによりライゲーシ
ョンして挿入し、大腸菌RRI株を形質転換した。アン
ピシリン耐性のコロニーよりプラスミドを単離し、Ps
tIにて消化し、その切断パターン及び、Xbal制限
酵素部位の消失から、S、  D、配列を含むhGM−
CSF遺伝子が挿入された事を確認した。得られた菌株
をpsT6311/RRIとした(第12図(1)参照
)。
(2) プラスミドp CFM526による発現用プラ
スミド λファージPLプロモーターを含む発現ベクターpCF
M526 (特表昭60−501988、PCT pu
blication  WO35100829、ATC
C399B2)を用い、S、 D、配列を含むhGM−
CSF遺伝子(第6図(2))を挿入した。即ち、上記
423塩基対のS、 D、配列を含むhGM−CSF遺
伝子を、pCFM526をC1al及びBamHIにて
消化したDNAにT4リガーゼによりライゲーションし
て挿入し、λCI8.7遺伝子を含むプラスミドpMW
1(ATCCNo、39933)を有する大腸菌AM7
を形質転換した。アンピシリン及びカナマイシン耐性の
コロニーより、プラスミドを単離し、Pstlにて消化
し、その切断パターンからS。
D、配列を含むhGM−C3F遺伝子が挿入された事を
確認した。得られた菌株をpTO614/AM7とした
(第12図(2)参照)。
(1) プラスミドpsT6311/RRIの発前記p
ST6311/RRIをアンピシリンを含むし培地にて
37℃にて一晩振とう培養した。
この培養液2mlを100m1のM9培地(0,8%グ
ルコース、0.4%カザミノ酸、10μg/mlチアミ
ン、50Iig/mlアンピシリンを含む)に加え、3
7℃にて3時間振とうした。インドールアクリル酸を最
終濃度40μg/mlになるように添加した。このまま
更に5時間振とう培養した。
得られた大腸菌の一部をサンプル緩衝液中で煮沸(5分
)し、煮沸液について5DS−ポリアクリルアミド電気
泳動を行ない、ROM−C5Fの含有量を調べた。この
条件においてhGM−C8Fは、大腸菌細胞蛋白質の3
0%以上であった。
(2) プラスミドpTO614/AM7の発現前記の
pTO614/AM7をアンピシリン及びカナマイシン
を含むし培地にて29°Cで一晩娠とう培養した。この
培養液10m1を500 mlのアンピシリン及びカナ
マイシンを含むし培地に加え、5連で29℃で3時間振
とう培養した。予め54℃にしておいたL培地500m
1を各培養液に加え、42℃にして更に3時間培養した
。前記と同様にしてhGM−C3Fの含有量を調べた結
果、大腸菌細胞蛋白質の30%以上であった。
更に、培養液を遠心分離して合計的10gの菌体を得た
。蒸留水を加え、3℃にて完全に分散するまでホモジナ
イザーを用いて分散させた。この懸濁液をフレンチ・プ
レスに3回かけた。この間懸濁液は、18℃以下に保持
した、この均質液を蒸留水で125m1に希釈し、得ら
れた混合液を30℃において遠心分離した。上澄液をデ
カンテーションし、残渣は蒸留水を用いて再懸濁させて
最終容量80m1にした。得られた混合液を3℃にて遠
心分離して上澄液をデカンテーションし、残渣を蒸留水
にて懸濁させて最終容量121にした。
得られた混合液に41の1Mトリス緩衝液(pH8,5
)と64m1の10M尿素を加えた。得られた混合液を
14℃において遠心分離し、上澄液を集めた。この上澄
液に533+ngの還元型グルタチオン及び1107I
I1の酸化型グルタチオンを含む720m1の20mM
のトリス緩衝液(p)I8.5)を加えた。この混合液
を5℃にて20時間放置した。この混合液を5℃にて分
子量10,000のメンプランを通過させることで濃縮
した。この濃縮液を、5℃にて少なくとも400m1の
20mMトリス緩衝液(pH8,5)とともに、分子量
10.000のメンプランを通過させバッファー交換し
た(ミリポア社製、ベリコンラボカセットを使用)。濃
縮液のpHを50%酢酸によってpH5,3とした。こ
の混合液を3℃において遠心分離した。希釈した上澄液
をCM−セファロースカラムにかけ、45mM  Na
C1−20mM酢酸ナトリウム(pH5,4)緩衝液に
て溶出した。溶出液のpHを1Mトリス緩衝液(pH8
,5)を用いてpH7,7にした。CM−セファロース
カラムからの溶出液を5℃において04カラムにかけ、
20%エタノール−50mMトリス緩衝液(pH7,7
)にて溶出し、次いで40%エタノール−50mM)リ
ス緩衝液にて溶出した。hGM−CFは、40%エタノ
ール−50mM)リス緩衝液(pH7,7)より60%
エタノール−50mM)リス緩衝液(pH7,7)まで
のグラジェントで溶出した。溶出液を集め、5°Cにて
DEAEセファロースカラムにかけ、20mM)リス緩
衝液(pH7,7) 、次いで10mMリン酸緩衝液(
pH7,5)、そして15mM  NaC1−10mM
リン酸緩衝液にて溶出した。hGM−C8Fは、60m
MNaC1−10mMリン酸緩衝液(pH7,5)を用
いてカラム溶出することににより精製した。
実施例7  hGM−CSFの活性確認hGM−C3F
の活性は、寒天中のヒト骨髄コロニーの成長を促進する
能力の検定により確認した。健常人の骨髄細胞をMcC
oy’s 5A培地(ギブコ社)で希釈し、Picol
l−Plaque  (ファルマシア¥r、)溶液上に
重層した。室温で20分間500×gで遠心分離し、中
間層を集めて20倍量のMcCoy’s 5A培地で洗
浄した。次に懸濁液を室温で10分間250Xgで遠心
した。次に細胞を10%牛脂児血清を含むMcCoy’
s 5A培地に懸濁し、プラスチックシャーレ中で2時
間37℃、5%二酸化炭素の状態で培養した。培養後、
上清を集め2 X 106cells /mlの細胞懸
濁液を調製し。
た。
検定において骨髄細胞は以下の組成を持つ培地に最終濃
度が2 X 105cclls /’mlになる様に加
えた。a)  1.84部McCoy’s 5A培地−
2mMピルビン酸ナトリウム−〇、8XMEMアミノ酸
(ギブコ社)−0,08部MEM非必須アミノ酸(ギブ
コ社)−0,09%重炭酸ナトリウム−0,8部MEM
ビタミン溶液(ギブコ社)−2,4mML−グルタミン
−3,2mg/mlL −セリン−1,68+++g/
m1L−アスパラギンを含む溶液5部、およびb)0.
6% Noble寒天(Dll’co社)3部、C)牛
胎児血清1部。これに実施例6(2)で精製したhGM
−CSF溶液を加えた。培養細胞は、5%C02存在下
で湿潤空気37℃にて保温した。70乃至140間の培
養後、エステラーゼ二重染色により顆粒球とマクロファ
ージの確認を行なった。その結果0.5X107ユニッ
ト/W以上の活性を有することが判った。
2×105の骨髄細胞から得られるコロニーの平均数は
約270であるという結果を得た。なお、ユニットの定
義についてはメトカーフらの報告によった[Blood
 87 (1)37〜45(198B):l。
陽性対照実験として、ヒトOCT培養上澄液(Gibc
o社)を、前記の培地に10%になる様に加え、同様の
結果を得た。
微生物の寄託 λファージPLプロモーターを含む発現ベクターpCF
M526を有する大腸菌E、coltAM7、すなわち
E、colt  AM7(pCFM526) 、は米国
メリーランド州、ロックビル・パークローンΦドライブ
のアメリカン・タイプφカルチュア・コレクション(A
TCC)に国際寄託されて、ATCC39932の寄託
番号を得ている。
λCI8.7遺伝子を含むプラスミドp M W 1は
、それを含むE、coli  JM103、すなわちE
、co l i  JM103 (pMWl) 、とじ
てATCCに国際寄託されていて、ATC03993B
の寄託番号を得ている。
【図面の簡単な説明】
第1図は、hGM−CSF (n−101、Th r)
のアミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を示す説明
図である。 第2図は、hGM−CSF (n−101,11e)の
アミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を示す説明図
である。 第3図は、オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す説明図
である。 第4図は、各ブロックを形成するためのオリゴヌクレオ
チドのライゲーション計画を示す説明図である。 第5図は、各ブロックの塩基配列と制限酵素部位を示す
説明図である。 第6図(1)はhにM−C3F (n−101、Thr
’)をコードする本発明のDNA鎖を、第6図(2)は
hGM−C3F (n−101、Th r)をコードす
るS、D、配列を含む本発明のDNA鎖を、それぞれ示
す説明図である。 第7図(1)はhGM−C3F (n−101,11e
)をコードする本発明のDNA鎖を、第7図(2)はh
GM−CSF (n−101、l1e)をコードするS
、 D、配列を含む本発明のDNA鎖を、それぞれ示す
説明図である。 第8図は、pUC19へのhGM−CSF(n−101
、Th r)遺伝子のクローニングを示す説明図である
。 第9図は、合成trpプロモーターの塩基配列と制限酵
素部位を示す説明図である。 第10図は、合成t rpaルミターミネータ塩基配列
と制限酵素部位を示す説明図である。 第11図は、発現ベクターの構築を示す説明図である。 第12図([)はpsT6311の構築を、第12図(
2)はpTO614の構築を、それぞれ示す説明図であ
る。 出願人代理人  佐  藤  −雄 鴎 1図 兜2図 A −l    CTCTA GATGGCACCA 
GCTCGATCACCGTCCCCA−2GTCCA
CTCAACQA TGGGAAQA−3ATG TT
AACGCAAT CCAGGAAGCT CGTC・
A−4GTCTGCTGAACCTGTCTCGTGA
TACT GCTGCA −5TGAAA TGMCG
’AAACTGTTGAAGT。 a−6GGTGATCGAacraarcc cArc
TAaAGA c、crA−7TAACATGTT C
CCATGGTTG AGTGGACCiGG  GA
CA−8、acAa、i、CcAcaAacrrc c
rcaATTacc TA −9ATTTCAG CA
GCAGTATCACGAGAcAGG TTCAA 
・−10QATCACTTCAACAGTTTCG T
TcB −1’CCGGGTGAT CAGCGAAA
TG TTCGATCTGCAGB−2GAACCGA
CT丁GTCTGCAA  ACCCGTCTGG  
AACB −3TGTACAA  ACAAGGTC丁
G  CGTGGTTCTCTGB−4λCTAAAC
T GAAAGGTCCG crcAcrATaATc
cs−5CGGTTCCTGCAGATCGAACA 
TTTcacTaA’rcAcB−6TGTACAGT
TCCAGACGGGTTT  GCAGACAAGT
B−7TTTAGTCAGA GAACCACGCA 
GACCTTCTT[3−8CTAGCCATCATA
GTCAGCG GACCTTTCAG第3図(1) ACCGATC,NheI GTGAGTTGGT ACFCTTGTAC506゜ TTGTCTGCAA  ACCCGTCTGGAAC
AGACGTT  TGGGCAGACCllo   
      126 (iAAAGGTCCG  CTGACTATGACT
TTCCAGGCGACTGATACTAAGCTAA
CAA  CCCTTGGCCA  AGTCCTTA
TT708ONCO工 CGTCCCCGTCCACTCAACGCAGGGG
CAG  GTGAGTTGGT  Ac第 6図 TCGAGAGAT CTACCGTGGT CGAG
CTACTACTTCCTTTG  ACAACTTC
ACTAGTCGCTTCACGATGAGT  CT
AGTAGTGA  AAGCTTAGAAATAGC
GCAfi、GCTAACAACCCTTGGCCAA
・] AATTCATCG  ATTAATTTAT TAA
AACTTAAGTAGCTAATTAAATA  A
TTTTGAATTCGTCCCCGTCCACTCA
ACCA  TGGGAACATGGCAGGGC;C
AG  GTGA’GTTGGT  ACCCTTGT
ACTGAACCTGTCTCGTGATAC丁 GC
TGCTGAAAACTTGGΔCAG  AGCAC
TATGA  CGACGACTTT190 ’   
    200       210TGTTCGAT
CT  GCAGGAACCG  八CTTGTCTG
CΔCAAGCTAGA  CGTCCTTGGCTG
AACAGACGTGCGTGGTTCTCTGACT
AAA  CTGAA、AGGTCACGCACCAA
G  AGACTGATTT  GACTTTCCAG
TCAAAGAAAA  CCTGAAAGAT  ’
rTCCTGCTGGAGTTTC1’TTT  GG
ACTTTCTA  AAGGACGACCl30 AGGAATΔATA  GGATCCATCCTTA
l”I’AT  CCTAGGTTCG  A100 
     110     、  120TTAACG
CAAT  CCAGGAAGCT  CGTCGTC
TGCAATTGCGTTA  GGTCCTTCGA
  GCAGCAGACGTGAACGAAACTGT
TGAAGTGAT’CAGCGA△ノ\ACTTGC
TTTG  A、CAACTTCACTAGTCGCT
TTAAACCCGTCT  GGAACTGTACA
AACAAGGTCTTTGGGCI〜GA  CCT
TGACATG TTTGTTCCAGCGCTGAC
TAT  GATGGCTAGCCATTACAAAC
GCGACTGATA  CTACCGATCG  G
TAATGTTTG3.10       350  
     360GTGCTACTCA  GATCA
TCACT  TTCGAATCT’rCACGATG
AGT  CTAGTAGTGA  AAGCTTAG
八A400  へ     410       42
0TTATCCCGTT  CGATTGTTGG  
GAACCGGTTCAATAGGGCAA  GCT
AACAACCCTTGGCCAAG第8図(2) 第12図(1) 第12図(2) 手続補正書 昭和62年7月27日 工 事件の表示 昭和62年 特許願 第1.06148号2 発明の名
称 ヒ)−14粒球マクロファージコロニー刺激因子の製造 3 補正をする者 事件との関係  特許出願人 ア  ム  ジ  エ  ン 4代理人    ((上刃)1名) 8 補正の内容 1) 明細書を下記の通りに補正する。 (1)  第8頁第10行 「必要である。」と「第3図」の間に、下記を加入する
。 「また、繰返し配列が1つのオリゴヌクレオチド内に出
現しないようにすることも必要である。」(2)  第
11頁第8行 「これを」を下記の通りに補正。 「このDNA鎖をこれをその遺伝情報が発現可能な状態
で含むプラスミドとして」 (3)  第12頁第15行 r rmRNAJを「プラスミド」と補正する。 (4)  第14頁第9行 「培養物」を、「菌体」と補正する。 (5)  第15頁第11行 「除いた。」を、「除き、担体よりオリゴヌクレオチド
を切出した。」と補正する。 (6)  第16頁第7〜8行 rO,05Mトリエチルアミン重炭酸緩衝液」の後に、
r (pH7,5)Jを加入する。 (7)  第17頁第9〜10行 「戻した。これを最終容量」を、「戻してアニーリング
を行なった。これを」と補正する。 (8)  第18頁第18行 rTRIs−HCIJを、rTr i 5−HCIJと
補正する。 (9)  第18頁第19行 「の4」を、「のT4Jと補正する。 (10)第19頁第6行 rMmJを、rmMJと補正する。 (11)第19頁第7行 「T4」を「T4」と補正する。 (12)第23頁第19行 r153Jを、r153(アマジャム社)」と補正する
。 (13)第26頁第12行 rRGM−Jを、rhGM−Jと補正する。 (14)第29頁第12〜13行 「ヒト骨髄コロニー」を、「ヒト骨髄細胞由来のコロニ
ー」と補正する。 (15)第29頁第19行 「遠心した。」を「遠心し、洗浄した。」と補正する。 2) 第12図(1)および第12図(2)を、それぞ
れ別紙の通りに補正する。 第12図(1) 第12図(2)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、第1図又は第2図に示す塩基配列を含むDNA鎖。 2、第1図又は第2図に示す塩基配列を含むDNA鎖を
    その遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミドによっ
    て形質転換されたものであることを特徴とする、大腸菌
    (E.coli)。 3、第1図又は第2図に示す塩基配列を含むDNA鎖を
    用意し、このDNA鎖を、これをその遺伝情報が発現可
    能な状態で含むプラスミドの作成、このプラスミドによ
    る大腸菌(E.coli)の形質転換および得られる形
    質転換体の培養から成る工程に付して培養物中にヒト顆
    粒球マクロファージコロニー刺激因子を産生させること
    を特徴とする、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激
    因子の製造法。
JP62106148A 1987-04-28 1987-04-28 ヒト顆粒球マクロファ―ジコロニ―刺激因子をコ―ドする合成dna、そのdnaを含むプラスミド、およびそのdnaで形質転換された大腸菌 Expired - Lifetime JP2521094B2 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPH05503574A (ja) * 1990-01-31 1993-06-10 アルフレッド・テヴェス・ゲーエムベーハー 作動伝達液の状態を測定するための装置

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JPS61502682A (ja) * 1984-07-06 1986-11-20 サンド・アクチエンゲゼルシヤフト リンホカインの生産および精製

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