JP2521094B2 - ヒト顆粒球マクロファ―ジコロニ―刺激因子をコ―ドする合成ｄｎａ、そのｄｎａを含むプラスミド、およびそのｄｎａで形質転換された大腸菌 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子（以下「hGM−CSF」という）の遺伝子組換えによる製
造技術に関する。具体的にはhGM−CSFをコードする合成
遺伝子、該DNAを含むプラスミド、および該DNAで形質転
換された大腸菌に関する。

従来技術 コロニー刺激因子（以下「CSF」という）は軟寒天中
で造血幹細胞の増殖分化を刺激し、特定のタイプの血液
細胞から成るコロニー形成を促進する生理活性物質であ
る。hGM−CSFは、顆粒球マクロファージ系の幹細胞（CF
U−GM）を刺激して、顆粒球マクロファージの形成を促
進する因子であって、次の用途に利用することが期待さ
れている。

すなわち、癌の放射線療法あるいは化学療法による白
血球減少症の治療、骨髄移植後速やかに白血球を増殖さ
せる、その他に有用と考えられている。

hGM−CSFの遺伝子組換えによる製造技術については既
にいくつかの報告（PCT公開公報WO86/00639、同WO86/03
225、EPO公開公報0183350その他）があり、hGM−CSFを
コードする遺伝子の塩基配列並びにそれによって生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列は共に公知である。な
お、hGM−CSFは、144ケのアミノ酸から成るポリペプチ
ドを含む糖蛋白と考えられている（PCT公開公報WO86/00
639号参照）。

〔発明の概要〕

発明が解決しようとする問題点 一般に遺伝子組換え技術による物質生産においては、
宿主として動物細胞あるいは酵母を用いるよりも大腸菌
を用いたほうが物質の生産性が高いのが普通である。

hGM−CSFをコードする遺伝子の大腸菌による発現に関
しては、本発明者らの知る限り二つの報告がある。クラ
ークらは、hGM−CSFを構成するポリペプチドのアナログ
（hGM−CSFを構成するポリペプチドとはそのアミノ酸配
列が３ヵ所において異なりかつＮ末にメチオニンを有す
るポリペプチド）をコードする遺伝子を大腸菌で発現さ
せているが（PCT公開公報WO86/00639号参照）、このと
きの遺伝子の発現レベルは、細胞（大腸菌）蛋白の高々
５％と極めて低くかつその発現産物がhGM−CSF活性を有
するか否かは全く不明であった。また、バージェスら
は、ヒト単球細胞株U937より得たhGM−CSFをコードする
cDNAを大腸菌で発現させているが、このときの発現レベ
ルは大腸菌蛋白の８〜10％（Blood,69，（１）43（198
7））であって、十分なものではなかった。

このため、hGM−CSF活性を有するポリペプチドないし
糖蛋白のより効率的な製造技術を確立することが望まれ
ていた。

発明の要旨 本発明は上記の問題点を解決するためになされたもの
であり、hGM−CSF活性を有するポリペプチドを大腸菌で
効率よく製造するための手段を提供するものである。す
なわち本発明は、 （１）第１図又は第２図に示す塩基配列を含むDNA鎖。

（２）第１図又は第２図に示す塩基配列を含むDNA鎖を
その遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミドによっ
て形質転換されたものであることを特徴とする大腸菌
（E.coli）。

（３）第１図又は第２図に示す塩基配列を含むDNA鎖を
その遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミド。

である。

〔発明の具体的説明〕

本発明のDNA鎖 本発明のDNA鎖は第１図又は第２図に示す塩基配列を
含むものである。この塩基配列は公知のhGM−CSF（Matu
re部分）のアミノ酸配列のＮ末にMetを付加したポリペ
プチドをコードするものであるが、大腸菌で高発現させ
ることができるよう次の諸点を考慮して本発明者らが設
計したものである。

大腸菌において優先的に用いられているコドンを使
用する。大腸菌において優先的に用いられているコドン
は池村によって報告されている（池村、Jpn.J.Genet.56
p533−555（1981））。

５′末端の塩基配列を大腸菌の各種遺伝子の翻訳開
始部位に共通な塩基配列に近づけた（Scherer et al.,N
ucl.Acids.Res.8p3895−3905（1980））。

なお、本発明のDNA鎖は、これを適当なベクターに結
合させ大腸菌に導入し高発現させるためのものである
が、このDNA鎖の高発現を実現させるためには、前記の
塩基配列の５′末端上流側にS.D.配列を含む TAAGGAGGTATATTの塩基配列 ATTCCTCCATATAA （Scherer.et al,Nucl.Acids Res.8p3895−3905（198
0））を有することが好ましく、また前記の塩基配列の
３′末端下流に終止コドンを２つ以上有していてもよ
い。更にこの遺伝子の５′末端及び３′末端には遺伝子
組換操作を容易にするための適当な制限酵素部位を付加
しておくことが好ましい。

本発明のDNA鎖の製造 本発明のDNA鎖は、合目的的な任意の方法で製造する
ことができるが、その一例を示すと次の通りである。

（１）第１図の塩基配列を含むDNA鎖の製造DNA鎖を３〜
４個の約100塩基対程度のブロックに分けて合成し、各
ブロックを順次適当なクローニングプラスミド（例えば
pUC19,MessingらGene33p110〜115（1985））に挿入連結
することにより目的とするDNA鎖を得る。

各ブロックの合成は、これを25〜35塩基程度のオリゴ
ヌクレオチドに分けて合成し、これらを会合させること
により行う。ブロックをオリゴヌクレオチドに区分けす
る際には、各オリゴヌクレオチドが自己会合を起こすこ
とがないよう１つのオリゴヌクレオチド内に自己相補的
配列が出現しないようにすることが必要である。また、
繰返し配列が１つのオリゴヌクレオチド内に出現しない
ようにすることも必要である。第３図に区分けしたオリ
ゴヌクレオチドの塩基配列の一例を、また第４図にこれ
らのオリゴヌクレオチドからの各ブロックの構成例を、
また第５図に各ブロックの塩基配列と制限酵素部位の一
例を示す。

各オリゴヌクレオチドは既知の合成法によって合成す
ることが出来る〔例えばホスホアミダイト法による固相
合成法（BeaucageらTetrahedron Letters221859〜1862
（1981）〕。またこの合成法に基づく自動合成機を使用
することも可能である。各ブロックの構築は、各オリゴ
ヌクレオチドの５′末端を、必要に応じてポリヌクレオ
チドキナーゼでリン酸化した後アニールし、DNAリガー
ゼによって二重鎖DNAとすることにより行う。各ブロッ
クを連結する手順は次の通りである。

第５図のＣブロックを、pUC19のHindIII及びPstIによ
る切断片と結合させプラスミドpYC8を得、これで大腸菌
JM109を形質転換する。次いで、pYC8を単離し、ダイデ
オキシ法によって塩基配列を確認するとともに、pYC8を
NheI及びAvaIで消化してからＢブロックを結合させ、pS
CB86を得、これでJM109を形質転換する。pSCB86の塩基
配列を確認した後、pSCB86で大腸菌dam^-株GM33を形質転
換し、pSCB86を改めて単離する。pSCB86をBclI及びSacI
で消化してからこれにＡブロックを結合させpSCBA867を
得、これでJM109を形質転換する。同様にpSCB867の塩基
配列を確認し、更にpSCBA867をNcoI及びEcoRIで消化
し、これにＤブロックを結合させることによりpSCBAD86
76を得、JM109を形質転換し、同様にして塩基配列を確
認する。

このようにして得られるpSCBA867をXbaI（SacI）及び
BamHI（HindIII）にて消化することにより、第１図に示
した塩基配列を含む本発明のDNA鎖を得ることができる
（第６図（１））。pSCBAD8676をClaI（EcoRI）及びBam
HI（HindIII）にて消化すればSD配列を含む本発明のDNA
鎖を得ることができる（第６図（２））。

（２）第２図の塩基配列を含むDNA鎖の製造前記の「第
１図の塩基配列を含むDNA鎖の製造」に準じた手順によ
り製造することができる。

ただし、この場合には、前記のオリゴヌクレオチドＣ
−３の代わりに下記のＣ−13を、またＣ−９の代わりに
下記のＣ−14を用いる。

Ｃ−13 CTACTCAGATCATCACTTTCGAATCTTT Ｃ−14 TCTTTGAAAGATTCGAAAGTGATGATCT このようにして得られる本発明のDNA鎖を第７図に示
す。

形質転換体の作成 上記のようにして調製される本発明DNA鎖は、hGM−CS
F蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいるので、このD
NA鎖をこれをその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラ
スミドとして生物工学的手法によって大腸菌（E.coli）
に導入して形質転換し、得られる形質転換体を培養する
ことにより、hGM−CSF蛋白をつくらせることができる。

形質転換体の作成（およびそれによるhGM−CSFの生
産）のための手順ないし方法そのものは、分子生物学、
生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用されてい
るものでありうるので、本発明においても下記したとこ
ろ以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実施す
ればよい。

大腸菌中で本発明DNA鎖の遺伝子を発現させるために
は、まず大腸菌中で安定に存在するプラスミドベクター
中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。このプラス
ミドベクターとしては、pBR322等合目的的な任意のもの
を用いることができる。

一方、本発明DNA鎖の遺伝子を大腸菌で発現させるた
めには、そのDNAをmRNAへ転写させる必要がある。その
ためには、転写のためのシグナルであるプロモーターを
本発明DNA鎖の５′側上流に組込めばよい。このプロモ
ーターについてはすでにtrp、lac、PL、OmpF等種々知ら
れており、本発明でもこれらのいずれをも利用すること
ができる。

また、転写を終結させるためのターミネーターを本発
明DNA鎖の３′側下流に組込むことが好ましい。強力な
プロモーターを用いた場合、ターミネーターを挿入する
ことにより、プラスミドの安定性を高めることができ
る。ターミネーターとしては、trpa、rrnc、λtoop等を
用いることができる。

また、mRNAを蛋白に翻訳させる段階では蛋白合成の場
であるリボソームが翻訳開始部位の先端に結合するため
に必要な配列（S.D.配列と呼ばれる）を蛋白合成の開始
信号であるATGの前につける必要がある。更に効率的に
発現させる為には、このS.D.配列並びにこのS.D.配列と
蛋白合成の開始信号であるATGとの間の塩基配列を、大
腸菌における翻訳開始部位に共通な塩基配列に近づける
ことが好ましい。例えば TAAGGAGGTATATTとすることが好まATTCCTCCATATAA しい。

このようにしてつくったプラスミドによる大腸菌の形
質転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用され
ている合目的的な任意の方法によって行なうことができ
る。その一般的な事項については適当な成書または総説
たとえばManiatisら、「Molecular Cloning−A Laborat
ory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory（198
2）を参照すればよい。

形質転換体は、本発明DNA鎖によって導入された遺伝
情報による新しい形質（すなわちhGMCSFの生産能）およ
び使用ベクター由来の形質ならびに場合によっては、生
じているかも知れない遺伝子組換時の使用ベクターから
の一部の遺伝情報の欠落による対応形質の欠落を除け
ば、そのゼノタイプないしフェノタイプあるいは菌学的
性質において使用大腸菌と同じである。

hGM−CSFの生産 上記のようにして得られる形質転換体のクローンは、
これを培養すれば菌体中にhGM−CSF蛋白を生産する。

形質転換体の培養ないし増殖条件は、使用大腸菌に対
するそれと本質的には変らない。また、培養物すなわち
菌体および（または）培養液からの生産蛋白の回収も合
目的的な任意の方法（例えば、後記実施例６記載の方
法）に従って行なうことができる。hGM−CSFは大腸菌中
において凝集した形で産生されるので、この蛋白を回収
後変性剤（例えば、塩酸グアニジン、尿素）を用いて溶
解し、ジスルフィド結合を還元剤（例えばジチオスレイ
トール）を用いて切断してから常法に従って精製するこ
とが好ましい。

実施例１ オリゴヌクレオチドの合成 第３図に示すオリゴヌクレオチド並びに前記のオリゴ
ヌクレオチドＣ−13およびＣ−14は、ホスホアミダイト
法（Beaucageら、Tetrahedron Letters221859〜1962（1
981））を用いたDNA自動合成機（アプライドバイオシス
テムズ社製380A型、M.Hunkapillerら、Nature310105〜1
11（1984））を使用して合成した。

合成終了後、濃アンモニア水で60℃で５時間処理し
て、塩基の保護基を除き、担体よりオリゴヌクレオチド
を切出した。得られたオリゴヌクレオチドを高性能液体
クロマトグラフィー（HPLC）を用いて精製した。すなわ
ち逆相の中性硬質ポリスチレン系ゲル（PRP−１、ハミ
ルトン社）のカラム（φ４、１×150mm）にかけ、0.1M
トリエチルアミン酢酸緩衝液中（pH7.0）のアセトニト
リルの直線濃度勾配法によって精製した。目的とするピ
ークのものを集め、8Mウレアを含む12％ポリアクリルア
ミドを用いた電気泳動にかけた。泳動後ゲルの下に螢光
色素を含むTLCプレートを置き、UVランプを用いて目的
のバンドの存在を確認した。目的とするオリゴヌクレオ
チドを含むゲル片を、透析チューブ内に封入し、DNAを
ゲルから電気的に溶出した。この透析チューブ内液をセ
ファデックスG25（ファルマシア社製）のゲル過カラ
ム（φ1.5×43cm）にかけ0.05Mトリエチルアミン重炭酸
緩衝液（pH7.5）にて溶出し脱塩した。目的とするオリ
ゴヌクレオチドを含む溶出液を減圧濃縮して、純粋なオ
リゴヌクレオチドを得た。

実施例２ オリゴヌクレオチドのライゲーション 化学合成したオリゴヌクレオチド34本を第４図のブロ
ックの調製計画に従ってライゲーションした。以下詳細
にのべる。各ブロックの５′末端にあるオリゴヌクレオ
チドを除く残りの26本の各オリゴヌクレオチド（各0.8n
mol）を20μｌのリン酸化反応液〔50mM Tris−HCl、pH
7.4、10mM MgCl₂、10mM DTT、30μCiの〔α−³²P〕ATP
（3000Ci/mmol）、15ユニットのT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社）〕中で37℃30分
間反応させて５′末端をリン酸化してラベルした。次い
で100mM ATPを１μｌ加え、37℃30分間反応させること
で完全に５′末端をリン酸化し、100℃５分間加熱する
ことで反応を停止した。

次いで、第４図のライゲーション計画に従い、各オリ
ゴヌクレオチドを混合し、95℃５分間加熱し２時間かけ
て常温まで戻してアニーリングを行なった。これを200
μｌのライゲーション反応液〔50mM Tris−HCl、pH7.
4、10mM MgCl₂、15mM DTT、1mM ATP、T4 DNAリガーゼ30
ユニット（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社）〕
中にて15℃14時間反応させた。一部の反応溶液を８％ポ
リアクリルアミド電気泳動にかけ、ラジオオートグラフ
で各ブロックがライゲーション反応の結果として得られ
たことをそれぞれ確認した。次に上記反応液にエタノー
ルを加えてDNAを沈殿させ、同様に８％ポリアクリルア
ミド電気泳動にて分離した。各ブロックを含むゲル片を
透析チューブに入れ、泳動緩衝液中で電気泳動すること
によりそれぞれ溶出した。次に各透析チューブ内液をNA
CSカラム（ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリー社）にか
け、溶出液にエタノールを加えDNAをそれぞれ沈殿させ
た。

実施例３ hGM−CSF遺伝子のクローニング クローニングベクターには大腸菌のプラスミドpUC19
（ファルマシア社）を用いた。１μｇのpUC19DNAを30μ
ｌの反応液〔10mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl₂、1mM
DTT、50mM NaCl、12ユニットのHindIII（宝酒造）、10
ユニットのPstI（宝酒造）〕中、37℃２時間反応させた
後、65℃20分間処理して制限酵素を失活させた。１μｇ
のＣブロックDNA20μｌの反応液〔50mM Tris−HCl、pH
7.4、10mM MgCl₂、5mM ATP、10ユニットのT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造）〕中、37℃１時間反応させ、
リン酸化した。この反応２μｌを前記のpUC19DNAとHind
III及びPstIとの反応液７μｌに加え、更に２μｌの〔5
00mM Tris−HCl、pH7.4、100mM MgCl₂〕溶液、１μｌの
100mM DTT、１μｌの100mM ATP、２μｌ（２ユニット）
のT4DNAリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム社）、15
μｌのオートクレーブ水を加え、14℃で14時間反応させ
た。

この反応液を用い、大腸菌JM109株（C.Yanisch−Perr
onらGene33p103−119（1985））を既知の方法（D.Hanah
an J.Mol.Biol.p557〜580（1980））により形質転換さ
せた。その際、プレートにはLBプレートを用い、50μg/
mlのアンピシリン、0.24mg/mlのイソプロピル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（IPTG）及び0.04mg/ml 5−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド
（Ｘ−gal）を含んでいた。アンピシリン耐性で無色の
コロニーを選び、そのうちの１つをpYC8/JM109と命名し
た。

ＣブロックDNAがpUC19のHindIII及びPstIの間に挿入
された場合、ＣブロックDNAによるユニークなNheI制限
酵素部位が存在する。そこで、pYC8/JM109の菌株よりプ
ラスミドDNAをアルカリ法（T.Maniatisら、Molecular C
loning p368〜369（1982）Cold Spring Harbor）にて分
離し、NheI（ニューイングランドバイオラブズ社）によ
って消化されることを確認した。またpYC8についてダイ
デオキシ法（服部ら、Anal.Biochem.152p232−238（198
6））を用いて塩基配列を確認した。

pYC8をNheI及びAvaIにて消化した後、上記と同様な方
法にて、ＢブロックDNAをライゲーションして挿入し、
大腸菌JM109株を形質転換させた。Ｂブロックが挿入さ
れたことを、SalI制限酵素の消失によって確認し、前記
の方法にて塩基配列を確認した。得られた菌株をpSCB86
/JM109とした。このプラスミドpSCB86で大腸菌dam^-株で
あるGM33株（東洋紡績（株）より入手）を形質転換し
た。この菌株をpSCB86/GM33とした。

この菌株よりプラスミドを単離し、BclI及びSacIにて
消化後、ＡブロックDNAを挿入し、大腸菌JM109株を形質
転換させた。Ａブロックが挿入されたことをNcoI制限酵
素部位の存在で確認した。塩基配列を前記の方法で確認
した。得られた菌株をpSCBA867/JM109とした。これによ
り、第６図（１）に示す本発明のDNA鎖を調製した。

更にS.D.配列を含むhGM−CSF遺伝子を調製する為に、
プラスミドpSCBA867をNcoI及びEcoRIにて消化し、Ｄブ
ロックDNAを挿入し、大腸菌JM109株を形質転換させた。
Ａブロックが挿入されたことをClaI制限酵素部位の存在
で確認した。塩基配列を前記の方法で確認した。得られ
た菌株をpTCBAD8676/JM109とした。これにより第６図
（２）に示すS.D.配列を含む本発明のDNA鎖を調製し
た。

以上のクローニングプロセスの概要を第８図に示し
た。また前記と同様の手順により第７図（１）（２）に
示す本発明のDNA鎖を製造した。ただし、オリゴヌクレ
オチドＣ−３の代わりにＣ−13を、またＣ−９の代わり
にＣ−14を用いた。

実施例４ 発現ベクターの構築 大腸菌トリプトファンオペロンのプロモーター及びオ
ペレーター領域の塩基配列については既にBennettらに
より報告されている（J.Mol.Biol.121 p113−p137（197
8））。転写開始点から、５′上流−94塩基より、３′
下流＋21塩基までの配列をベースとし、その転写開始点
直後にClaIサイトをまたS.D.配列の直後にXbaIサイトを
設け、さらに５′末端にはEcoRIサイトをまた３′末端
にはHindIIIサイトを設けた131塩基対を化学的に合成し
た（第９図）。この131塩基のトリプトファンプロモー
ターをpBR322のEcoRI及びHindIIIにて消化したDNAに挿
入し、トリプトファンプロモーターを含む発現ベクター
とし、pST8と命名した。

トリプトファンオペロンの転写終結の為のターミネー
ターは、Christieらによってその塩基配列とその終結の
強さが報告されている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA78
（７）p4180〜4184（1981））。Trpaターミネーターの
５′末端にBamHIサイトを、３′末端にSphIサイトを設
けたオリゴヌクレオチドを化学的に合成（第10図）し
た。このターミネーターを含むオリゴヌクレオチドを、
pST8のBamHI及びSphIにて消化したDNAに挿入して、プラ
スミドpST81を得た。

pBR322由来のプラスミドで、大腸菌におけるコピー数
の高いpAT153がTwiggらにより作られている（Nuture283
p216〜p218（1980））。そこでpST81のトリプトファン
プロモータ及びTrpaターミネーターを含むDNA断片をEco
RI及びSphIにて消化して得、pAT153（アマシャム社）の
EcoRIおよびSphI消化断片に挿入して、プラスミドpST81
1を得た（第11図参照）。

実施例５ hGM−CSFの発現用プラスミドの構築 （１）プラスミドpST811による発現用プラスミド 前記pSCBAD8676をClaI及びBamHIにて消化後、0.8％ア
ガロース電気泳動により、423塩基対のDNA断片を精製し
た。前記発現用ベクターpST811をClaI及びBamHIにより
消化後、上記423塩基対のS.D.配列を含むhGM−CSF遺伝
子（第６図（２）をT4リガーゼによりライゲーションし
て挿入し、大腸菌RR1株を形質転換した。アンピシリン
耐性のコロニーよりプラスミドを単離し、PstIにて消化
し、その切断パターン及び、XbaI制限酵素部位の消失か
ら、S.D.配列を含むhGM−CSF遺伝子が挿入された事を確
認した。得られた菌株をpST6311/RR1とした（第12図
（１）参照）。

（２）プラスミドpCFM526による発現用プラスミド λファージPLプロモーターを含む発現ベクターpCFM52
6（特表昭60−501988、PCT publication WO85/00829、A
TCC39932）を用い、S.D.配列を含むhGM−CSF遺伝子（第
６図（２））を挿入した。即ち、上記423塩基対のS.D.
配列を含むhGM−CSF遺伝子を、pCFM526をClaI及びBamHI
にて消化したDNAにT4リガーゼによりライゲーションし
て挿入し、λCI₈₅₇遺伝子を含むプラスミドpMW1（ATCC
No.39933）を有する大腸菌AM7を形質転換した。アンピ
シリン及びカナマイシン耐性のコロニーより、プラスミ
ドを単離し、PstIにて消化し、その切断パターンからS.
D.配列を含むhGM−CSF遺伝子が挿入された事を確認し
た。得られた菌株をpTO614/AM7とした（第12図（２））
参照。

実施例６ hGM−CSFの製造法（第１図のDNA鎖の発現） （１）プラスミドpST6311/RR1の発現 前記pST6311/RR1をアンピシリンを含むＬ培地にて37
℃にて一晩振とう培養した。この培養液2mlを100mlのM9
培地（0.8％グルコース、0.4％カザミノ酸、10μg/mlチ
アミン、50μg/mlアンピシリンを含む）に加え、37℃に
て３時間振とうした。インドールアクリル酸を最終濃度
40μg/mlになるように添加した。このまま更に５時間振
とう培養した。得られた大腸菌の一部をサンプル緩衝液
中で煮沸（５分）し、煮沸液についてSDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動を行ない、hGM−CSFの含有量を調べ
た。この条件においてhGM−CSFは、大腸菌細胞蛋白質の
30％以上であった。

（２）プラスミドpTO614/AM7の発現 前記のpTO614/AM7をアンピシリン及びカナマイシンを
含むＬ培地にて29℃で一晩振とう培養した。この培養液
10mlを500mlのアンピシリン及びカナマイシンを含むＬ
培地に加え、５連で29℃で３時間振とう培養した。予め
54℃にしておいたＬ培地500mlを各培養液に加え、42℃
にして更に３時間培養した。前記と同様にしてhGM−CSF
の含有量を調べた結果、大腸菌細胞蛋白質の30％以上で
あった。

更に、培養液を遠心分離して合計約10gの菌体を得
た。蒸留水を加え、３℃にて完全に分散するまでホモジ
ナイザーを用いて分散させた。この懸濁液をフレンチ・
プレスに３回かけた。この間懸濁液は、18℃以下に保持
した、この均質液を蒸留水で125mlに希釈し、得られた
混合液を30℃において遠心分離した。上澄液をデカンテ
ーションし、残渣は蒸留水を用いて再懸濁させて最終容
量80mlにした。得られた混合液を３℃にて遠心分離して
上澄液をデカンテーションし、残渣を蒸留水にて懸濁さ
せて最終容量12mlにした。得られた混合液に4mlの1Mト
リス緩衝液（pH8.5）と64mlの10M尿素を加えた。得られ
た混合液を14℃において遠心分離し、上澄液を集めた。
この上澄液に533mgの還元型グルタチオン及び107mgの酸
化型グルタチオンを含む720mlの20mMのトリス緩衝液（p
H8.5）を加えた。この混合液を５℃にて20時間放置し
た。この混合液を５℃にて分子量10,000のメンブランを
通過させることで濃縮した。この濃縮液を、５℃にて少
なくとも400mlの20mMトリス緩衝液（pH8.5）とともに、
分子量10,000のメンブランを通過させバッフアー交換し
た（ミリポア社製、ペリコンラボカセットを使用）。濃
縮液のpHを50％酢酸によってpH5.3とした。この混合液
を３℃において遠心分離した。希釈した上澄液をCM−セ
ファロースカラムにかけ、45mM NaCl−20mM酢酸ナトリ
ウム（pH5.4）緩衝液にて溶出した。溶出液のpHを1Mト
リス緩衝液（pH8.5）を用いてpH7.7にした。CM−セファ
ロースカラムからの溶出液を５℃においてC4カラムにか
け、20％エタノール−50mMトリス緩衝液（pH7.7）にて
溶出し、次いで40％エタノール−50mMトリス緩衝液にて
溶出した。hGM−CFは、40％エタノール−50mMトリス緩
衝液（pH7.7）より60％エタノール−50mMトリス緩衝液
（pH7.7）までのグラジェントで溶出した。溶出液を集
め、５℃にてDEAEセファロースカラムにかけ、20mMトリ
ス緩衝液（pH7.7）、次いで10mMリン酸緩衝液（pH7.
5）、そして15mM NaCl−10mMリン酸緩衝液にて溶出し
た。hGM−CSFは、60mM NaCl−10mMリン酸緩衝液（pH7.
5）を用いてカラム溶出することににより精製した。

実施例７ hGM−CSFの活性確認 hGM−CSFの活性は、寒天中のヒト骨髄細胞由来のコロ
ニーの成長を促進する能力の検定により確認した。健常
人の骨髄細胞をMcCoy's5A培地（ギブコ社）で希釈し、F
icoll−Plaque（ファルマシア社）溶液上に重層した。
室温で20分間500×ｇで遠心分離し、中間層を集めて20
倍量のMcCoy's5A培地で洗浄した。次に懸濁液を室温で1
0分間250×ｇで遠心し、洗浄した。次に細胞を10％牛胎
児血清を含むMcCoy's5A培地に懸濁し、プラスチックシ
ャーレ中で２時間37℃、５％二酸化炭素の状態で培養し
た。培養後、上清を集め２×10⁶cells/mlの細胞懸濁液
を調製した。

検定において骨髄細胞は以下の組成を持つ培地に最終
濃度が２×10⁵cells/mlになる様に加えた。ａ）1.84×M
cCoy's5A培地−2mMピルビン酸ナトリウム−0.8×MEMア
ミノ酸（ギブコ社）−0.08×MEM非必須アミノ酸（ギブ
コ社）−0.09％重炭酸ナトリウム−0.8×MEMビタミン溶
液（ギブコ社）−2.4mM L−グルタミン−3.2mg/mlL−セ
リン−1.68mg/mlL−アスパラギンを含む溶液５部、およ
びｂ）0.6％Noble寒天（Difco社）３部、ｃ）牛胎児血
清１部。これに実施例６（２）で精製したhGM−CSF溶液
を加えた。培養細胞は、５％CO₂存在下で湿潤空気37℃
にて保温した。７日乃至14日間の培養後、エステラーゼ
二重染色により顆粒球とマクロファージの確認を行なっ
た。その結果0.5×10⁷ユニット/mg以上の活性を有する
ことが判った。２×10⁵の骨髄細胞から得られるコロニ
ーの平均数は約270であるという結果を得た。なお、ユ
ニットの定義についてはメトカーフらの報告によった
〔Blood67（１）37〜45（1986）〕。

陽性対照実験として、ヒトGCT培養上澄液（Gibco社）
を、前記の培地に10％になる様に加え、同様の結果を得
た。

微生物の寄託 λファージPLプロモーターを含む発現ベクターpCFM52
6を有する大腸菌E.coli AM7、すなわちE.coli AM7（pCF
M526）、は米国メリーランド州、ロックビル・パークロ
ーン・ドライブのアメリカン・タイプ・カルチュア・コ
レクション（ATCC）に国際寄託されて、ATCC39932の寄
託番号を得ている。

λCI₈₅₇遺伝子を含むプラスミドpMW1は、それを含む
E.coli JM103、すなわちE.coli JM103（pMW1）、として
ATCCに国際寄託されていて、ATCC39933の寄託番号を得
ている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、hGM−CSF（ｎ＝101、Thr）のアミノ酸配列と
これをコードする塩基配列を示す説明図である。 第２図は、hGM−CSF（ｎ＝101、Ile）のアミノ酸配列と
これをコードする塩基配列を示す説明図である。 第３図は、オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す説明図
である。 第４図は、各ブロックを形成するためのオリゴヌクレオ
チドのライゲーション計画を示す説明図である。 第５図は、各ブロックの塩基配列と制限酵素部位を示す
説明図である。 第６図（１）はhGM−CSF（ｎ＝101、Thr）をコードする
本発明のDNA鎖を、第６図（２）はhGM−CSF（ｎ＝101、
Thr）をコードするS.D.配列を含む本発明のDNA鎖を、そ
れぞれ示す説明図である。 第７図（１）はhGM−CSF（ｎ＝101、Ile）をコードする
本発明のDNA鎖を、第７図（２）はhGM−CSF（ｎ＝101、
Ile）をコードするS.D.配列を含む本発明のDNA鎖を、そ
れぞれ示す説明図である。 第８図は、pUC19へのhGM−CSF（ｎ＝101、Thr）遺伝子
のクローニングを示す説明図である。 第９図は、合成trpプロモーターの塩基配列と制限酵素
部位を示す説明図である。 第10図は、合成trpaターミネーターの塩基配列と制限酵
素部位を示す説明図である。 第11図は、発現ベクターの構築を示す説明図である。 第12図（１）はpST6311の構築を、第12図（２）はpTO61
4の構築を、それぞれ示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 玉井 幸夫 前橋市総社町１丁目２番２号 麒麟麦酒 株式会社医薬開発研究所内 (56)参考文献 特開 昭61−502682（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記（ａ），（ｂ）のいずれかによって示
   される塩基配列を含むヒト顆粒球マクロファージコロニ
   ー刺激因子をコードするDNA鎖。
2. 【請求項２】下記（ａ），（ｂ）のいずれかによって示
   される塩基配列を含むヒト顆粒球マクロファージコロニ
   ー刺激因子をコードするDNA鎖をその遺伝情報が発現可
   能な状態で含むプラスミド。
3. 【請求項３】下記（ａ），（ｂ）のいずれかによって示
   される塩基配列を含むヒト顆粒球マクロファージコロニ
   ー刺激因子をコードするDNA鎖をその遺伝情報が発現可
   能な状態で含むプラスミドによって形質転換されたもの
   であることを特徴とする、大腸菌（E.coli）。