NO314902B1

NO314902B1 - Biologisk funksjonelt plasmid eller virus-DNA-vektor som koder for en analog av granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), samtprokaryot eller eukaryot vertscelle

Info

Publication number: NO314902B1
Application number: NO19982132A
Authority: NO
Inventors: Lawrence M Souza
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Priority date: 1985-08-23
Filing date: 1998-05-11
Publication date: 2003-06-10
Also published as: IL79805A0; US4810643A; DE3650788T2; AU6334686A; IL79805A; US5582823A; ATE332375T1; NL930127I1; NO2003008I1; NO871679D0; JPH0231675A; SG48964A1; FI105191B; FI871700A0; PT83242B; GR862185B; JP2660179B2; NO318755B1; KR880700071A; JP3115561B2

Description

Bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse vedrører biologisk funksjonelt plasmid eller virus-DNA-vektor som koder for en analog av granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF). Foreliggende oppfinnelse vedrører også prokaryot eller

eukariot vertscelle.

Det humane bloddannende (hematopoietiske) system er-statter forskjellige hvite blodlegemer (deriblant neutrofiler, makrofager og basofiler/mast-celler), røde blodlegemer (erythrocytter) og klump-dannende celler (megakaryocyter/blodplater). Det bloddannende system hos det gjennomsnittlige menneske av hankjønn er blitt anslått å produsere i størrelsesorden 4,5 x 10 11 granulocytter og eryhtrocytter hvert år, noe som er ekvivalent med en årlig erstatning av den samlede kropps-vekt. Dexter et al., BioEssays, 2, 154-158 (1985).

Det antas at små mengder av bestemte vekstfaktorer for bloddannelse er ansvarlig fo~r differensieringen av et lite antall forløper-"stamceller" til de forskjellige blodcelle-linjene, for den voldsomme formeringen av disse linjene, og for den endelige differensiering av ferdig utviklede blod-celler fra disse linjene. Ettersom vekstfaktorene for bloddannelse er tilstede i svært små mengder, har påvisningen og identifikasjonen av disse faktorene vært basert på en lang rekke prøver som hittil bare skjelner mellom de forskjellige faktorer på grunnlag av stimulerende virkninger på dyrkede celler under kunstige betingelser. Som et resultat av dette, har et stort antall navn blitt laget for å betegne et mye mindre antall faktorer. Som et eksempel på den resulterende forvirring, er uttrykkene IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF

og PSF alle kortord som nå antas å gjelde for en enkelt murin vekstfaktor for bloddannelse. Metcalf, Science, 229, 16-22,

(1985). Se også Burgess et al., J. Biol. Chem., 252, 19.88

(1977), Das et al., Blood, 58, 600 (1980), Ihle et al-,

J. Immunol., 129, 2431 (1982), Nicola et al., J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983), Metcalf et al., Int. J. Cancer, 30., 773,

(1982) og Burgess et al., Int. J. Cancer, 26, 647 (1980),

som vedrører forskjellige murine vekstregulerende glycopro-teiner.

Anvendelsen av rekombinante genetiske teknikker har bragt en viss orden i dette kaoset. F.eks. har man oppnådd aminosyre- og DNA-sekvensene for human erythropoietin som stimulerer produksjonen av erythrocytter. (Se Lin, PCT publisert søknad nr. 85/02610, publisert 20. juni 1985). Rekombinante metoder er også blitt anvendt for isolering av cDNA

for en human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor.

Se Lee et al.. Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 4360-4364

(1985) og Wong et al., Science, 228, 810-814 (1985). Se' også Yokota et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 81, 1070 (1984), Fung et al., Nature, 307, 233 (1984) og Gough et al., Nature, 309, 763 (1984) vedrørende kloning av murine gener, samt Kawasaki et al., Science, 230, 291 (1985) vedrørende human-M-CBF.

En human vekstfaktor for bloddannelse kalt human kolonistimulerende faktor med flere forskjellige virkninger (hpCSF) eller pluripoietin, er blitt påvist å være tilstede i dyrknings-mediet til en human carcinomcellelinje fra urinblære betegnet 5637 og deponert under restriktive betingelser ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland som A.T.C.C de-poneringsnr. HTB-9. Den hpCSF som renses fra denne cellelinje, er blitt rapportert å stimulere formering og differensiering av forløperceller med flere forskjellige virkninger som fører til produksjonen av alle de viktigste blodcelletypene, i prøver hvor det brukes human benmarg-forløperceller. Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1530 (1985). Ved rensing av hpCSF ble det brukt: (NH4)2S04-utfelling, anionbytterkromatografi ( DEAE-cellulose, DE52), gelfiltrering (AcA54-kolonne) og C18 væskekromatografi i omvendt fase med høy yteevne. Et protein identifisert som hpCSF som elueres i den andre av to aktivitetstopper i fraksjoner fra C18 HPLC i omvendt fase, ble angitt å ha en molekylvekt (MW) på 18.000 bestemt ved hjelp av natriumdodecylsulfat (SDS)-polyacrylamid-gelelektroforese (PAGE) under anvendelse av sølvfarging.

hpCSF ble tidligere angitt å ha et isoelektrisk punkt på 5,5

[Welte et al., J. Cell. Biochem., Supp 9A, 116 (1985)] og en høy differenseriengsaktivitet for den myelomonocyttiske leukemicellelinje WEHI-3B D<+> fra raus [Welte et al., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Gale et al., utg., New Series, 28, (1985)]. Foreløpige undersøkelser indikerer at faktoren identifisert som hpCSF i overveiende grad har granulocytt-kolonistimulerende aktivitet i løpet av de første 7 dagene i en human CFU-GM-prøve.

En annen faktor, betegnet human CSF-(3, er også blitt isolert fra human urinblære carcinomcellelinje 5637 og er

125

blitt beskrevet som en konkurrent til murin 1-merket granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF) når det gjelder binding til WEHI-3B D<+->celler i et doseresponsforhold som er identisk med forholdet til umerket murin G-CSF [Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985)].Dette doseresponsforhold var tidligere blitt rapportert å være enestående for umerket murin G-CSF og ikke å finnes hos slike faktorer som M-CSF, GM-CSF eller multi-CSF [Nicola et-al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 81, 3765-3769 (1984)]. CSF-(3 og G-CSF er også enestående blant CSF-er ved at de deler en høy grad av evne til å indusere differensiering av WEHI-3B D -celler. Nicola et al., Immuno-logy Today, 5., 76-80 (1984) . Ved høye konsentrasjoner stimulerer G-CSF blandede granulocytt/makrofag-kolonidannende celler [Nicola et al., (1984) supra], noe som er i overens-stemmelse med foreløpige resultater som indikerer frem-komsten av granulocyttiske, monocyttiske, blande granulocy-tiske/monocyttiske og eosinofile kolonier (CFU-GEMM) etter 14 dagers inkubasjon av humane benmargkulturer med hpCSF. CSF-)3 er også blitt angitt å stimulere dannelse av neutrofile granulocyttiske kolonier i prøver hvor det ble anvendt benmarg-celler fra mus, en egenskap som har vært et kriterium for identifikasjon av en faktor som en G-CSF. På grunnlag av disse likheter, er human CSF-(3 blitt identifisert med G-CSF (granulocyttisk kolonistimulerende faktor). Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985).

På grunnlag av de felles egenskaper synes det som om human SCF-[3 ifølge Nicola et al., supra, og hpCSF ifølge Welte et al., supra, er den samme faktor som passende kunne refereres til som en human granulocytt-kolonistimurererrde faktor (hpG-CSF). Karakterisering og rekombinant produksjon av hpG-CSF ville være særlig ønskelig på bakgrunn av den rapporterte egenskap hos murin G-CSF til å undertrykke en in vitro WEHI-3B 3 leukemisk cellepopulasjon fullstendig ved "helt normale konsentrasjoner", og den rapporterte egenskap hos rå, injiserte preparater av murin G-CSF til å undertrykke etablerte transplanterte myeloid-leukemier i mus. Metcalf, Science, 229, 16-22 (1985). Se også Dachs Scientific American, 284 ( 1) , 40-47 (1986) .

I den utstrekning hpG-CSF kan vise seg å være tera-peutisk betydningsfull og således trengs å være tilgjenge-lig i mengder i kommersiell skala, er det usannsynlig at isolering fra cellekulturer kan utgjøre en adekvat material-kilde. Det er f.eks. verd å legge merke til at det fore-ligger restriksjoner mot kommersiell bruk av celler fra human tumorbank, slik som den humane urinblære-carcinomcellelinje 5637 (A.T.C.C. HTB9) som er blitt angitt som kilder for naturlige hpCSF-isolater i "Welte et" al. (1985 supra).

Oppsummering av oppfinnelsen

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes biologisk funksjonelt plasmid eller virus-DNA-vektor. Disse er kjennetegnet ved at de omfatter en renset og isolert DNA-sekvens som koder for ekspresjon av en analog av hpG-CSF valgt fra gruppen bestående av:

[Ser<17>]hpG-CSF,

[Ala^hpG-CSF,

[Ser<36>]hpG-CSF,

[Ser<42>]hpG-CSF,

[Ser"]hpG-CSF,

[Ser<74>]hpG-CSF,

[Met^lhpG-CSF,

[Met"<1>, Ser<17>]hpG-CSF,

[Met"<1>, Ser<36>]hpG-CSF,

[Met"1, Ser<42>]hpG-CSF,

[Met"<1>, Ser<S4>]hpG-CSF og

[Met"<1>, Ser74]hpG-CSF.

Også omfattet av foreliggende oppfinnelse er prokaryote eller eukariote vertceller som er kjenntegnet ved at de er stabilt transformert eller transfektert med en DNA-vektor ifølge krav 1, og er i stand til å uttrykke det gitte genet.

Farmasøytiske preparater som omfatter effektive mengder av polypeptidprodukter fremstilt ved ekspresjon i prokaryote eller eukaryote vertceller ifølge oppfinnelsen, sammen med egnede fortynningsmidler, hjelpestoffer og/eller bærere, kan anvendes i hpG-CSF-terapi.

Polypeptidproduktene kan "merkes" ved tilknytning til et påvisbart markørstoff (f.eks. merkes radioaktivt med 125I), hvorved det fåes reagenser som kan brukes ved påvisning og kvantifisering av human hpG-CSF i faste vevs- og væskeprøver, slik som blod eller urin. DNA-produkter ifølge oppfinnelsen kan også merkes med påvisbare markører (slik som radioaktive markører og ikke-isotopiske markører, slik som biotin), og anvendes i fremgangsmåter for DNA-hybridisering for å lokalisere stillingen til det humane hpG-CSF-gen og/eller stillingen til en nær beslektet genfamilie i et kromosomkart. De kan også brukes til å identifisere feil i det humane hpG-CSF-gen på DNA-nivået og brukes som genmarkør for å identifisere nabogener og feil i disse.

Polypeptidproduktene kan, alene eller sammen med andre faktorer for bloddannelse eller legemidler, være anvendbare i behandlingen av feil i bloddannelsen, slik som aplastisk anemi. De kan også være anvendbare ved behandlingen av mangler i bloddannelsen som oppstår av kjemoterapi eller av stråleterapi. F.eks.kan vellykketheten ved benmargstrans-plantasjon økes ved anvendelse av hpG-CSF. Sårhelende behandling av brannskade og behandling av bakteriebetennelse kan også dra nytte av anvendelse av hpG-CSF. I tillegg kan hpG også være nyttig ved behandlingen av leukemier basert på en rapportert evne til å differensiere leukemiceller. Welte et al. Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1530 (1985) og Sachs, supra.

En rekke aspekter og fordeler ved oppfinnelsen vil være åpenbare for fagfolk innen teknikken ut fra den nærmere beskrivelse nedenunder som gir illustrasjoner på utøvelsen av oppfinnelsen ved dens for tiden foretrukne utførelsesformer.

Kort beskrivelse av tegningene

Figuren er et partielt restriksjonsendonukleasekart over hpG-CSF-genet ledsaget av piler som viser den sekvenseringsstrategi som er brukt for å komme frem til genomsekvensen.

Nærmere beskrivelse

Ifølge foreliggende oppfinnelse er DNA-sekvenser som koder for en del av eller hele polypeptidsekvensen til hpG-CSF, blitt isolert og karakterisert.

De følgende eksempler er gitt for å illustrere oppfinnelsen og er spesielt rettet mot fremgangsmåter utført før identifikasjon av hpG-CSF-cDNA og -genomkloner, mot fremgangsmåter som fører til slik identifikasjon, og mot sekvenseringen, utviklingen og ekspresjonssystemer basert på cDNA, genomgener og fremstilte gener, og verifikasjon av ekspresjon av hpG-CSF og analoge produkter i slike systemer.

Nærmere bestemt er eksempel 1 rettet mot aminosyresekvensering av hpG-CSF. Eksempel 2 er rettet mot fremstillingen av et cDNA-bibliotek for screening av kolonihybridisering. Eksempel 3 vedrører konstruksjon av hybridiseringsprober. Eksempel 4 vedrører hybridiserings-screening, identifikasjon av positive kloner, DNA-sekvensering av en positiv cDNA-klon og frembringelsen av informasjon vedrørende primær polypeptidstrukturkonformasjon (aminosyresekvens). Eksempel 5 er rettet mot identifikasjonen og sekvenseringen av en genomklon som koder for hpG-CSF. Eksempel 6 er rettet mot konstruksjonen av et fremstilt gen som koder for hpG-CSF hvor det anvendes kodoner som begunstiges av E. coli.

Eksempel 7 er rettet mot fremgangsmåter for konstruksjon av en E. coli transformasjonsvektor som omfatter hpG-CSF-kodende DNA, bruken av vektoren i prokaryot ekspresjon av hpG-CSF, og analyse av egenskaper til rekombinante produkter. Eksempel 8 er rettet mot fremgangsmåter for frembringelse av analoger av hpG-CSF hvor cysteinrester er erstattet med et en annen egnet aminosyrerest ved hjelp av mutagenese utført på DNA som koder for hpG-CSF. Eksempel 9 er rettet mot fremgangsmåter for konstruksjon av en vektor som omfatter hpG-CSF-analog-kodende DNA avledet fra en positiv cDNA-klon, bruken av vektoren for transfeksjon av C0S-1-celler, og de" transfekterte celler i vekst i kultur.

Eksempel 1

A. Sekvensering av materiale tilveiebrakt ved hjelp av metoder ifølge litteraturen"

En prøve (3-4 pig, 85-90 % ren etter SDS, sølvfarge-PAGE) av hpG-CSF ble erholdt fra Sloan Kettering Institute, New York, New York, isolert og renset i henhold til Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82,.1526-1630 (1985).

Den N-terminale aminosyresekvens til denne prøve av hpG-CSF ble bestemt i et forsøk nr. 1 ved mikrosekvensanalyse under anvendelse av et AB407A gassfase-sekvensapparat (Applied Biosystems, Foster City, California) for å tilveiebringe sekvensinformasjon som er angitt i tabell I nedenunder. I tabellene I - IV er det anvendt én-bokstavkoder, "X" betegner en rest som ikke ble entydig bestemt, og rester i parenteser ble bare alternativt eller forsøksvis utpekt.

En stor grad av bakgrunnsforstyrrelse var tilstede i hver runde av forsøket som det er gjengitt resultater for i tabell I, noe som. indikerer at prøven hadde mange forurensende bestanddeler, sannsynligvis i form av kjemiske rester fra rensing. Sekvensen ble beholdt bare for bruk som referanse.

I forsøk nr. 2 ble en andre prøve (5-6 ug, ,— 95% ren) erholdt fra Sloan Kettering som for forsøk nr. 1 og det ble utført en sekvenseringsprosedyre som for forsøk nr. 1. Denne prøven var fra det samme parti av materiale som ble anvendt til å frembringe figur 4 hos Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1530 11985). Resultatene er gjengitt i tabell II.

Selv om flere rester ble identifisert, ga ikke forsøk nr. 2 en tilstrekkelig lang, entydig sekvens hvorfra et rimelig antall prober kunne konstrueres for å lete etter hpG-CSF-DNA. Det ble beregnet at minst 1536 prober ville ha vært påkrevet for å forsøke isolering av cDNA basert på sekvensen ifølge tabell II. Igjen ble det antatt at forurens-ning av prøven var problemet.

Følgelig ble det erholdt en tredje prøve (3-5 ug, ~~ > 40% ren) fra sloan Kettering som ovenfor. Dette preparatet ble elektroblottet etter separasjon ved hjelp av SDS-PAGE i et forsøk på ytterligere rensing. Sekvensanalyse av denne

prøven ga ingen data.

(B) Sekvensering av materialer tilveiebragt ved hjelp av reviderte metoder

For å oppnå en tilstrekkelig mengde rent materiale til å utføre passende avgrenset aminosyresekvensanalyse, ble det erholdt celler fra en urinblære-carcinomcellelinje 5637 (sub-klon 1A6) fremstilt ved Sloan-Kettering fra dr. E. Platzer. Celler ble først dyrket i Iscove's medium (GIBCO, Grand Island, New York) i kolber inntil sammenflyting. Etter sammenflyting ble kulturene trypsinert og plassert i rulleflasker

(1 - 1/2 kolber/flaske) som hver inneholdt 25 ml forkondi-sjonert Iscove's medium under 5% CC^. Cellene ble dyrket over natten ved 37°C ved 0,3 rpm.

Cytodex-l-kuler (Pharmacia, Uppsala, Sverige) ble vasket og sterilisert ved å bruke følgende fremgangsmåter. 8 g kuler ble innført i en flaske og 400 ml PBS ble tilsatt. Kulene ble oppslemmet ved forsiktig rotering i 3 timer. Etter å ha latt kulene få synke ned, ble PBS trukket av, kulene ble skylt i PBS og frisk PBS ble tilsatt. Kulene ble auto-klavert i 15 minutter. Før bruk ble kulene vasket i Iscove's medium + 10% kalveforsterserum (FCS) før det ble tilsatt friskt medium + 10% FCS for å oppnå behandlede kuler.

Etter fjerning av alt bortsett fra 30 ml av mediet

fra hver rulleflaske, ble det tilsatt 30 ml friskt medium + 10% FCS og 40 ml behandlede kuler til flaskene. Flaskene ble gasset med 5% C02 og alle boblene ble fjernet ved avsuging. Flaskene ble plassert i rullerader ved 3 rpm i en halv time før hastigheten ble redusert til 0,3 rpm. Etter 3 timer ble en ytterligere kolbe trypsinert og tilsatt hver rulleflaske som inneholdt kuler.

Ved 40 - 50% sammenflyting ble rulleflaskekulturene vasket med 50 ml PBS og rotert i 10 minutter før fjerning av PBS. Cellene ble dyrket i 48 timer i medium A (lscove's medium som inneholdt 0,2% FCS, 10 — 8hydrokortison, 2 mm glutamin, 100 enheter/ml penicillin og 100 ug/ml strepto-mycin) . Deretter ble kultursupernatanten innhøstet ved sentrifugering ved 3000 rpm i 15 minutter og lagret ved -70°C. Kulturene ble på nytt tilført medium A inneholdende 10% FCS og ble dyrket i 48 timer. Etter at mediet var kassert, ble cellene vasket med PBS som ovenfor og dyrket i 48 timer i medium A. Supernatanten ble på nytt irinhøstet og behandlet som tidligere beskrevet.

Omtrent 30 liter medium kondisjonert ved hjelp av 1A6-celler ble oppkonsentrert til ca. 2 liter på en Millipore® Pellicon-enhet utstyrt med 2 kassetter med avkuttinger med molekylvekt 10.000, ved en filtreringshastighet på ca. 200 ml/minutt og en tilbakeholdelseshastighet på ca. 1000 ml/ minutt. Konsentratet ble diafiltrert med ca. 10 liter 50 mM Tris (pH 7,8) under anvendelse av det samme apparat og de samme strømningshastigheter. Det diaf iltrerte. konsentrat ble påfylt ved 40 ml/minutt på en 1 liters DE-cellulose-kolonne ekvilibrert i 50 mM Tris (pH 7,8). Etter påfylling ble kolonnen vasket ved den samme hastighet med en 1 liter 50 mM Tris (pH 7,8) og deretter med 2 liter 50 mM Tris (pH 7,8)

med 50 mM NaCl. Kolonnen ble så i rekkefølge eluert med 6

én liters oppløsninger av 50 mM Tris (pH 7,5) som inneholdt følgende konsentrasjoner av NaCl: 75mM, 100 mM, 125 mM,

200 mM og 300 mM. Fraksjonene (50 ml) ble samlet opp og aktive fraksjoner ble slått sammen og oppkonsentrert til 65 ml på

en Amicon ultrafiltreringscelleenhet med omrøring utstyrt med en YM5-membran. Dette konsentratet ble fylt på en 2 liter AcA54 gelfiltreringskolonne ekvilibrert i PBS. Kolonnen ble kjørt ved 80 ml/time og 10 ml fraksjoner ble samlet opp. Aktive fraksjoner ble slått sammen og påfylt direkte på en

C!4 væskekromatografikolonne med høy yteevne (HPLC) .

Prøver som varierte i volum fra 125 ml til 850 ml, og som inneholdt 1 - 8 mg protein hvorav ca. 10% var hpG-CSF, ble fylt på kolonnen ved en strømningshastighet som varierte fra 1 ml til 4 ml pr. minutt. Etter påfylling og en innledende vasking med 0,1 M ammoniumacetat (pH 6,0-7,0) i 80% 2-propanol ved en strømningshastighet på 1 ml/minutt, ble 1 ml store fraksjoner samlet opp og undersøkt med hensyn på pro-teiner ved 220 nm, 260 nm og 280 nm.

Som et resultat av rensing ble fraksjoner som inneholdt hpG-CSF klart separert (som fraksjoner 72 og 72 av 90) fra andre protein-holdige fraksjoner. hpG-CSF ble isolert

(150 - 300 ug) ved en renhet på ca. 85 - 5% og et utbytte på ca. 50%. Fra dette rensede materiale ble 9 pg brukt i forsøk nr. 4, en aminosyresekvensanalyse hvor proteinprøven ble til-ført en TFA-aktivert glassfiberplate uten polybren. Sekvensanalyse ble utført med en AB 470A-sekvenser ifølge fremgangsmåtene til Hewick et al., J. Biol. Chem., 256, 7990-7997 (1981) og Lai, Anal. Chim. Acta, 163, 243-248 (1984). Resultatene fra forsøk nr. 4 fremgår av tabell III.

Etter 31 sykluser i forsøk nr. 4 (svarende til rest 31 i tabell III) ble det ikke oppnådd noen ytterligere signifikant sekvensinformasjon. For å oppnå en lengre utve-tydig sekvens ble 14 ug hpG-CSF renset fra kondisjonert medium redusert med 10 ul (3-mercaptoethanol i 1 time ved 45°C i et forsøk nr. 5, deretter grundig tørket under vakuum. Proteinresten ble så på nytt oppløst i 5% maursyre før den ble tilført en polybrenisert glassfiberplate. Sekvensanalyse ble utført som for forsøk nr. 4 ovenfor. Resultatene fra forsøk nr. 5 er gjengitt i tabell IV.

Aminosyresekvensen som er gjengitt i tabell IV var tilstrekkelig lang (44 rester) og entydig til å konstruere prober for å oppnå hpG-CSF-cDNA som beskrevet nedenunder.

Eksempel 2

Blant standardfremgangsmåter for isolering av cDNA-sekvenser av interesse er fremstillingen av plasmidbårne cDNA-"bibliotek" avledet fra revers-transkripsjon av mRNA som det finnes rikelig av av donorceller valgt på grunnlag av ekspresjon av et målgen. Når vesentlige deler av aminosyresekvensen til et polypeptid er kjent, kan det anvendes merkede, énkjedede DNA-probesekvenser som duplikerer en sekvens som antas å være tilstede i "mål"-cDNA, i DNA/DNA-hybridiserings-fremgangsmåter utført på klonede kopier av den cDNA som er blitt denaturert til énkjedet form. Weissman et al., U.S. patentskrift nr. 4 394 443; Wallace et al., Nucleic Acids Res., 3543-3557 (1979), Reyes et al.. Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 79, 3270-3274 (1982) og Jaye et al., Nucleic Acids Res., 11, 2325-2335 (1983). Se også U.S. Patentskrift nr. 4 358 535 som vedrører DNA/DNA-hybridiseringsfremgangs-måter for å utføre diagnoser, og Davis et al., "A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980) , sider 55 - 58 og 174 - 176 som vedrører koloni- og plakk-hybridiseringsteknikker.

Total RNA ble ekstrahert fra omtrent 1 g celler fra en urinblære-carcinomcellelinje 5537 (1A6) ved å bruke en guanidinthiocyanatfremgangsmåte for kvantitativ isolering av intakt RNA. [Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299

(1979) ].

Den sterile vandige RNA-oppløsning inneholdt total RNA fra I 6-cellene. For å oppnå bare budbringer-DNA fra den totale RNA-oppløsning, ble oppløsningen sendt gjennom en kolonne som inneholdt oligodeoxythymidylat [oligo(dT)] (Colla-borative Research, Inc., Waltham, Massachusetts. Poly-adeny-lerte (poly-A ) haler ■som er karakteristiske for budbringer-RNA fester seg.til kolonnen mens ribosom-RNA elueres. Som et resultat av denne fremgangsmåte, ble det isolert omtrent 90 ug poly-adenylart budbringer-RNA (poly-A +-mRNA). Den iso-lerte poly-A<+->budbringer-RNA var forbehandlet med methyl-kvikksølvhydroxyd (Alpha Ventron, Danvers, Massachusetts) ved en sluttkonsentras jon på 4 mM i "5 mimittter ved værelsetemperatur før bruk i en cDNA-reaksjon. Methylkvikksølvhydroxyd-behandlingen denaturerte reaksjonsprodukter av budbringer-RNA, både med seg selv og med forurensende molekyler som inhiberer translasjon. Payvar et al., J. Biol. Chem., 258, 7636-7642

(1979).

Ifølge Okayama-fremgangsmåten [Okayama et al., Molecular & Cellular,.Biology, 2, 161-170 (1982)], ble en cDNA-bank fremstilt ved å bruke mRNA erholdt fra IA6-celler. cDNA-ene ble deretter transformert ved inkubasjon i en vertmikro-organisme E. coli K-12 stamme HB101 for forsterkning.

Eksempel 3

Hybridiseringsprober utformet på grunnlag av den hpG-CSF-aminoterminale sekvens ifølge tabell IV besto av et sett av 24 oligonukleotider som hver var 23 baser lange og inneholdt 3 inosinrester. Probeoligonukleotidene ble fremstilt ifølge fremgangsmåten til Caruthers et al., Genetic Engi-

32

neering, 4, 1-18 (1982) og merket med 7- P ATP ved kinase-behandling med polynukleotidkinase. Probeoligonukleotidene som svarte til budbringer-RNA for restene 23-30 i sekvensen ifølge tabell IV, er illustrert i tabell V.

Opprettelsen av nøytralitet hos I var basert på det publiserte arbeide av Takahashi et al., Proe. Nati. Acad.

Sei. ( USA), 82, 1931-1935 (1985) og Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260, 2605-2608 (1985). Inosin kan imidlertid ha en destabiliserende virkning dersom det er baseparet med et G eller T. Ifølge Takahashi et al. kan inosiner vise seg å ha en nøytral virkning ettersom de gjennomsnittlig kommer ut som en gruppe nær nøytralitet (f.eks. tre som på gunstig måte har dannet par med C og to som ikke på gunstig måte danner par med T).

For å teste virkningen av at I har dannet basepar med

G, ble det utformet kontrollforsøk ved å bruke en.N-myc-gen-sekvens og klon. Sekvensene tatt ut fra N-myc-genet hadde det samme totale G- og C-innhold i de to første stillingene i hvert kodon, slik det var foreskrevet ved hjelp av hpG-CSF-probene. Således hadde N-myc-testprobene den samme lengde, inneholdt I-er i de samme relative stillinger og hadde "potensielt den samme gjennomsnittlige Tm (62 - 66°C, hvor de 3 eller 4 inosinrestene inkludert ikke telte med) som hpG-CSF-probene.

Det ble konstruert to sett med N-myc-testprober ifølge fremgangsmåten til Caruthers et al., supra. Sett I omfattet som vist i tabell VI: 1, en 23 mer med perfekt tilpasning;

2, hvor tre C-er i tredje stilling var erstattet med I-er slik at det verst mulige tilfelle for tilsetning av I-er var frembragt; og 3, hvor fire C-er i tredje stilling var erstattet med I-er. Det andre settet av testprober ble utformet for å utgjøre en mer tilfeldig fordeling av inosin-basepar som ville kunne gi en samlet nøytral baseparingseffekt. Sett II omfattet som vist i tabell VI: 4, inneholdende to I-er som ville danne basepar med C-er, og en med en G; og 5, iden-

tisk med 4, med tillegg av et I:G-basepar mer.

Fem replikafiltere som inneholdt N-myc-DNA-sekvenser og kylling-veksthormon-DNA-sekvenser (som en negativ kontroll), ble oppvarmet i en vakuumovn i 2 timer ved 80°C før hybridisering. Allé filtrene ble hybridisert som beskrevet i eksempel 4 for hpG-CSF-probene, bortsett fra at hybridiserings-tiden bare var 6 timer. Filtrene ble vasket tre ganger ved vaerelsetemperatur, deretter én gang ved 45°C, 10 minutter hver. Filtrene ble undersøkt med en Geiger-teller.

Filteret som representerte N-myc-probe 3 ga et svært svakt signal i forhold til de øvrige fire filtrene med prober og ble ikke vasket noe mer. Etter vasking i 10 minutter ved 50°C ga Geiger-telleren følgende prosentvise signal, idet Probe 1 var satt til 100%: Probe 2- 20%, Probe 3 (45°C): .2%, Probe 4: 92% og Probe 5: 75%. Etter vasking ved 55°C var prosenttallene: Probe 2: 16%, Probe 4: 100% og Probe 5: 80%. En sluttvask ved 60°C ga følgende prosenttall: Probe 2: 1,6%, Probe 4: 90% og Probe 5: 70%.

I nærvær av tre I-er, som i Probe 2 og 4, ble det således iakttatt opp til en 60 gangers forskjell i signal når den teoretiske Tm (I-er ikke inkludert i beregningen) nåes [basert på et verste tilfelle I-baseparing (Probe 2) og et forholdsvis nøytralt I-basparingstilfelle (Probe 4)].

Den standardiseringsinformasjon som ble vunnet ved hjelp av N-Myc-testhybridiseringene ble benyttet ved vasking og undersøkelse av hpG-CSF-hybridiseringen som angitt nedenunder, for å måle den sikkerhetsgrad som resultatene fra mindre nøye vasking kan aksepteres ved.

Eksempel 4

Ifølge fremgangsmåten til Hanahan et al., J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983), ble bakterier som inneholdt rekombi-nanter med cDNA- innskudd fremstilt ifølge eksempel 2 spredd ut på 24 nitrocellulo■sefiltere (Millipore<®>, Bedford, Massachusetts) lågt på agarplater. Platene ble deretter inkubert slik at det ble etablert omtrent 150.000 kolonier som ble replika-utplatet på 24 andre nitrocellulosefiltere. Replikaene ble inkubert inntil utydelige kolonier kom til syne. Bakteriene på filtrene ble lysert på ark av Whatman 3 mm papir såvidt mettet med natriumhydroxyd (0,5M) i 10 minutter, deretter blottet med Tris (IM) i 2 minutter etterfulgt av blotting med Tris (0,5M) som inneholdt NaCl (1,5M) i 10 minutter. Da filtrene var nesten tørre, ble de varmet opp i 2 timer ved 80°C

i en vakuumovn før nukleinsyrehybridisering. [Wahl et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 76, 3683-3687 (1979)] og Mania-tiset al., Cell, 81, 163-182 (1976).

Filtrene ble forhybridisert i 2 timer ved 65°C i 750

ml 10X Denhardfs, 0,2% SDS og 6X SSC. Filtrene ble skylt i 6X SSC, deretter ble fire plassert i en pose og hybridisert i 14 timer i 6X SSC og 10X Denhardfs. Det var omtrent 15 ml oppløsning pr. pose som inneholdt 50 x 10 6 cpm <32->P-merket probe (oligonukleotider).

Etter hybridisering ble filtrene vasket tre ganger i

6X SSC (1 liter/vask) ved væreIsetemperatur i 10 minutter hver. Filtrene ble så vasket to ganger ved 45°C i 15 minutter hver, en gang ved 50°C i 15 minutter og en gang ved 55°C i 15 minutter under anvendelse av 1-litervolumer i 6X SSC. Filtrene ble autoradiografert i 2 timer ved -70°C under anvendelse av et forsterkergitter og Kodak<®>XAR-2-film. På den autoradio-graf ble det påvist 40 - 50 positive signaler, deriblant 5 svært sterke signaler.

Områdene som inneholdt de fem sterkeste signalene og ytterligere fem positive områder ble avskrapet fra master-platene og på nytt platet ut for en andre screening under anvendelse av den samme probeblanding under de samme betingelser. Vaskefremgangsmåten adskilte seg ved at høytemperatur-vaskingene besto av to ved 55°C i 15 minutter hver og deretter en ved 60°C i 15 minutter. Basert på N-myc-probeunder-søkelsen ifølge eksempel 3 ble sluttemperaturene ved vasking i den andre screening økt fordi aggregatsmeltepunktet for de 24 23-merer var 60 - 68°C, det samme som for N-myc-probene. Like etter den andre vasking ved 55°C ble filtrene etterlatt fuktige og det ble utført en autoradiografering. Sammenligning av denne autoradiografering med den andre autoradiografering utført for et lignende tidsrom etter en sluttvasking ved 60°C, viste at bare to av de ti klonene som ble testet, ikke led av et vesentlig tap i signal når man økte fra 55 til 60°C. Disse to klonene ble senere vist å ha nesten identiske lengder og restriksjonsendonukleasemønstere. En klon betegnet Ppo2 ble valgt ut for sekvensering.

Sekvensering av den rekombinante hpG-SCF-cDNA-klon, Ppo2, oppnådd ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor ble ut-ført ved hjelp av dideoxymetoden til Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 74, 5463-5467 (1977). Den énkjedede DNA-fag M-13 ble brukt som en kloningsvektor for å skaffe tilveie énkjedede DNA-templater fra de dobbeltkjedede cDNA-kloner. Metoden til Sanger et al. avslørte den sekvens som er gjengitt i tabell VII ledsaget av dens aminosyretranslasjon og en komplementær kjede i det polypeptidkodende område.

Følgende kjennetegn ved sekvensen ifølge tabell VII

er verd å merke seg. Ved 5<*->enden i sekvensen er det vist baser svarende til de i poly G cDNA-linkeren. Det oppstår så ca. 5 baser (betegnet som "N") med en sekvens som ikke lett kunne bestemmes éntydig ved hjelp av metoden til Sanger et al. på grunn av de mange G-er som går forut. Sekvensen legger deretter for dagen en serie på 12 kodoner som koder for en del av en antatt ledersekvens for polypeptidet. Basert på samsvarhet med N-aminosekvensen i naturlige isolater av hpCSF beskrevet i eksempel 1, er den første threoninrest: i den antatt "ferdige" form av hpG-CSF angitt ved +1. Ferdig hpG-CSF viser seg deretter å omfatte 174 rester som angitt. Etter "stopp"-kodonet (OP-kodonet, TGA) kommer det omtrent 856 baser av en ikke-translatert 3'-sekvens og flere A-er av poly A "halen". Unike HgiAi- og Apal-restriksjonsendonukleaser-gjenkjenningssteder , samt to Stul-steder (omtalt nedenunder når det gjelder konstruksjon av prokaryote og eukaryote ekspresjonssystemer) er også betegnet i tabell VII. På grunn av mangel på asparaginrester i polypeptidet, er det ingen klare steder for N-glycosylering. De understrekede 6 baser nær enden av den 3r<->ikke-translaterte sekvens utgjør et potensielt polyadenyleringssted.

Det er verd å merke seg at hver av to ytterligere cDNA-kloner identifisert ved hjelp av hybridiseringsfrem-gangsmåtene beskrevet ovenfor, fra et samlet antall på 450.000 kloner, unnlot å ta opp DNA som koder for hele ledersekvensen fra transkripsjonsinitieringsstedet og fremover. Faktisk terminerte alle tre hpG-SCF-klonene i 5"-området nøyaktig på samme tid, noe som indikerer at sekundærstrukturen til den transkriberte mRNA på ugunstig måte hindrer cDNA-dannelse utenfor dette sted. Som en sak av praktisk betydning, kunne derfor slik cDNA-ekspresjonsscreening som beskrevet i Okayama et al., Mol, and Cell. Biol., 3, 280-289 (1983), og som faktisk anvendes for å isolere GM-CSF i Wong et al., Science, 228, 810-814 (1985), kunne ikke lett ha vært anvendt til isolering av hpCSF-DNA ettersom slike isoleringssystemer vanligvis beror på tilstedeværelsen av en cDNA-transkript i full lengde i de analyserte kloner.

Sekvensen ovenfor er ikke lett mottagelig for sikring av direkte ekspresjon av hpG-CSF i en mikrobevert. For å sikre slik ekspresjon, bør det hpG-CSF-kodehde område være forsynt med et første ATG-kodon og sekvensen bør være innskutt i en transformasjonsvektor på et sted som er under kontroll av en egnet promoter/regulator-DNA-sekvens.

Eksempel 5

I dette eksemplet ble cDNA som koder for hpG-CSF som isolert i eksemplet ovenfor, brukt til å undersøke en genomklon. Et gehombibliotek med fag lambda human fosterlever, (fremstilt ifølge fremgangsmåten til Lawn et al;, Cell, 15, 1157-1174 (1978) og erholdt fra T. Maniatis) undersøkt ved å bruke en "nick"-translatert probe bestående av to hpG-CSF-cDNA-fragmenter isolert ved oppløsning med HgiAI og Stul ( HgiAI til Stul, 649 b.p., Stul til Stul, 639 b.p.). Tilsammen ble omtrent 500.000 fager platet ut på 12 (15 cm) petriskåler og plakk tatt ut og hybridisert til probe ved å bruke fremgangsmåten til Benton/Davidson [Behton et al., Science, 196, 180 (1977)]. Det ble tilsammen iakttatt 12 positive kloner. Tre kloner (1-3) som ga de sterkeste signaler etter autoradiografi i en sekundær screening, ble dyrket i 1 liter kulturer og kartlagt ved hjelp av restrik-sjonsenzymoppløsning og Southern-blotting under anvendelse av et radioaktivt merket 24-mer oligonukleotid (kinase behandlet med 7-<32>P- ATP)5'-CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3<*.> Resultatene fra kartleggingen viste at isolatene 1 og 3 var identiske, og at to inneholdt 2000 ytterligere baser 5' til hpG-CSF-genet. Klon 2 ble derfor brukt til ytterligere karakterisering. DNA fra klon 2 ble oppløst med Ri for å frigi en 8500 bp hpG-CSF som inneholder fragment som deretter ble subklonet inn i pBR322, og ytterligere kartlagt ved hjelp av restriksjonsnedonuklaseoppløsninger, Southern-blotting/Ml3-subkloning og sekvensering. Sekvensen som ble oppnådd, er som angitt i tabell VIII.

Et restriksjonsendonukleasekart (omtrent 3,4 Kb) av genom-DNA som inneholdt hpG-CSF-genet, er spesifisert i fig. 1. Restriksjonsnedonukleasene som er vist i figur 1 er: Ncol, N; Pstl, P; BamHI, B; Apal, A; Xhol, X og Kpn, K. Pilene under kartet viser sekvenseringsstrategien som ble brukt for å oppnå genomsekvensen. De innrammede områder er de som ble funnet i cDNA-klonen, idet rammen med stiplet åpen ende representerer en sekvens som ikke var tilstede i cDNA-klonen, men identifisert ved å undersøke mRNA-flekker. Identifikasjonen av de antatte kodende sekvenser for exon 1 ble utført ved hjelp av Northern blotteanalyse. En 24-mer oligonukleotidprobe, -CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT , som' spente over sammenknytningspunktene for exoner 1 og 2 som var forutsagt, ble hybridisert til hpG-CSF-mRNA i et Northern blotteformat. Den resulterende flekk oppviste en mRNA med den samme størrelse (ca. 1650 bp) som den som fåes med en exon 2 oligonukleotidprobe. Disse data sammen med evnen til å styre ekspresjon av hpG-GSF fra pSVGM-Ppol-vektoren (eksempel 9) under anvendelse av Met-initieringkodonet vist i tabell VIII, definerer de kodende sekvenser som finnes i exon 1. Exonene 1-5 defineres ved hjelp av de kodende sekvenser erholdt i cDNA-klonen i hpG-CSF-genet (tabell VII).

Eksempel 6

Dette eksemplet vedrører fremstilling av et produsert gen som koder for hpG-CSF og omfatter E. coli preferansekodoner.

I korte trekk var den anvendte fremgangsmåte som angitt i beskrivelsen i PCT patentsøknad nr. WO83/04053. Genene ble utformet for først å samle komponentoligonukleotider i multiple duplekser som deretter ble samlet i tre adskilte avsnitt. Disse avsnittene ble utformet for hurtig forsterkning og, etter fjerning fra forsterkningssystemet, kunne de samles i rekkefølge eller gjennom en flertrinns fragment-ligering i en egnet ekspresjonsvektor.

Konstruksjonen av avsnittene I, II og III er illustrert i tabellene IX - XIV. Ved konstruksjonen av avsnitt I ble, som vist i tabellene IX og X, oligonukleotidene 1-14 samlet i 7 duplekser (1 og 8), 2 og 9, 3 og 10, 4 og 11, 5 og 12, 6 og 13, og 7 og 14). Disse dupleksene ble deretter ligert slik at de utgjorde avsnitt I som vist i tabell X. Det kan også legges merke til i tabell X at avsnitt I omfatter en oppstrøms Xbal klebrig ende og en nedstrøms BamHI klebrig ende som kan benyttes til ligering for å forsterke og uttrykke vektorer, og for ligering til avsnitt II.

Som vist i tabellene XI og XII, ble oligonukleotidene 15 - 30 ved konstruksjonen av avsnitt II samlet i 8 duplekser (15 og 23, 16 og 24, 17 og 25, 18 og 26, 19 og 27, 20 og 28, 21 og 29 og 22 og 30). Disse 8 dupleksene ble deretter ligert, hvorved man fikk avsnitt II, som vist i tabell XII. Som videre vist i tabell XII, har avsnitt II en oppstrøms BamHI klebrig ende og en nedstrøms EcoRI klebrig ende som kan brukes for ligering til en forsterkningsvektor og for ligering til avsnitt I. Nær sin nedstrøms ende omfatter avsnitt II også et nedstrøms Sstl-sted som kan brukes i den eventuelle ligering av avsnittene II og III. Til slutt ble avsnitt III konstruert som vist i tabellene XIII og XIV. Til denne konstruksjon ble oligonukleotidene 31 - 42 samlet i 6 duplekser (31 og 37, 32 og 38, 33 og 39, 34 og 40, 35 og 41 og 36 og 42). De 6 dupleksene ble deretter ligert, hvorved man fikk avsnitt III som vist i tabell XIV. Som også vist i tabell XIV omfatter avsnitt III en oppstrøms BamHI klebrig ende og on nedstrøms EcoRI klebrig ende som kan brukes for ligering.i en forsterkningsvektor, og i det minste i tilfellet med EcoRI-enden, i en ekspresjonsvektor. I tillegg har avsnitt III et oppstrøms Sstl-sted som kan brukes ved den eventuelle ligering av avsnittene II og III.

Fragmentet fra Xbal til BamHI dannet av avsnitt I ble ligert inn i en Ml3mpll fagvektor som var åpnet med Xbal og BamHI. Vektoren ble deretter på nytt åpnet ved oppløsning med BamHI og EcoRI etterfulgt av ligering med BamHI-EcoRI-fragmentet dannet av avsnitt II. På dette trinn var avsnittene I og II blitt knyttet sammen i korrekt orientering. Deretter ble en annen M13mpll-vektor åpnet ved hjelp av BamHI- EcoRI-oppløsning og deretter ligert med BamHI- EcoRI-fragmentet dannet av avsnitt III.

Vektoren som inneholdt avsnittene I og II, ble opp-løst med Xbal og Sstl. På samme måte ble vektoren som inneholder avsnitt III, oppløst med Sstl og EcoRI. Begge de minste av de to fragmentene som fåes fra hver oppløsning, ble ligert inn i et plasmid pCFMH56 som på forhånd var blitt åpnet med Xbal og EcoRI. Produktet fra denne reaksjon var et ekspre-sjonsplasmid som inneholder en sammenhengende DNA-sekvens som vist i tabell XV, og som koder for hele hpG-CSF-polypeptidet med et aminoterminalt methioninkodon (ATG) for E. coli translasjdnsinitiering.

Selv om hvilken som helst egnet vektor kan anvendes til å uttrykke denne DNA, kan ekspresjonsplasmidet pCFMH56 lett konstrueres fra et plasmid pCFM83 6, hvis konstruksjon er beskrevet i den publiserte europeiske patentsøknad nr. 136 490. pCFM836 ble først kuttet med Ndel og deretter gjort butt i endene med Poll slik at begge de foreliggende Ndel-steder ble ødelagt. Deretter ble vektoren oppløst med Clal og SacII for å fjerne en tilstedeværende polylinker før ligering til en substituttpolylinker, slik som vist i tabell XVI. Denne substituttpolylinker kan konstrueres ifølge fremgangsmåten til Alton et al., supra. Kontroll av ekspresjon i ekspresjonsplasmidet pCFMH56 skjer ved hjelp av en lambda-P^-promoter som selv kan være under kontroll av et Cio 5 7" repressorgen (slik som det som er tilveiebragt i E. coli stamme Kl2AHtrp).

Eksempel 7

Dette eksempel vedrører ekspresjon i E. coli av et hpG-CSF-polypeptid ved hjelp av en DNA-sekvens som koder for [Met ^]-hpCSF. Den anvendte sekvens var delvis syntetisk og delvis cDNA-avledet. I den syntetiske sekvens ble det brukt E. coli preferansekodoner.

Plasmid Ppo2 som inneholder hpG-CSF-genet vist i tabell VII, ble oppløst med HgiAI og Stul slik at :man fikk et fragment med omtrent 645 basepar inkludert genet for ferdig hpCSF (som vist i tabell VII) med syv av ledersekvens-kodonene i 5'-enden og 100 basepar av 3<1->ikke-kodende område. HqiAI-oppløsning etterlot en klebrig 5'-ende med 4 baser som er identisk med det som fåes med Pstl, og Stul etterlot en stump ende. Dette muliggjorde hurtig innskudd av fragmentet i M13 mp8 (Rf) kuttet med Pstl og med restriksjonsenzymet HincII som gir stumpe ender. Etter forsterkning i M13, ble hpG-CSF-DNA tatt ut ved oppløsning med Apal og BamHI som kutter henholdsvis ved Apal-stedet og strekker seg over kodonene for restene +3 til +5 i hpCSF, og ved et BamHI-sted "nedstrøms" fra HincII-stedet i M13 mp8 restriksjons-linkeren. For å muliggjøre ekspresjon i E. coli av hpG-CSF-polypeptidet, ble det fremstilt et syntetisk fragment som angitt i tabell XVII nedenunder.

Som det kan bestemmes ut fra analyse av tabell XVII, omfatter linkeren en Apal klebrig ende, kodoner som angir de første tre restene i aminoenden av hpG-CSF ("gjeninnsetter"

12 3

de Thr -, Pro -, Leu -spesifiserende kodoner fjernet etter

Åpal-oppløsning av M13-DNA beskrevet ovenfor og som anvender kodoner som fortrinnsvis uttrykkes i E. coli), et translasjons-initierings-ATG, en sekvens med 24 basepar som gir et ribosom-bindende sted og en Xbal klebrig ende.

Ekspresjonsvektoren som ble anvendt for ekspresjon i E. coli, var den som er beskrevet som pCFM536 i europeisk patentsøknad nr. 176 490, publisert 10. april 1975. (Se også A.T.C.C. 39974, E. coli JM103 som inneholder pCFM536). I korte trekk ble plasmid pCFM536 opløst med Xbal og BamHI. hpG-CSF-fragmentet ( Apal/ BamHI) og linkeren ( Xbal/ Apal) beskrevet ovenfor ble' deretter ligert inn slik at det ble dannet et plasmid betegnet p536Ppo2.

Plasmid p536Ppo2 ble transformert inn i en fag-resi-stent variant av E. coli AM7-stammen som tidligere var blitt transformert med plasmid pMWl (A.T.C.C. nr. 39933) som inneholder et CI 857-gen. Transformasjon ble bekreftet på grunnlag av markørgenet for antibiotisk (amp)-resistens som bæres på pCFM536 forløperplasmidet.- Kulturer av celler i LB dyrknings-veeske (ampicillin 50 ug/ml) ble holdt ved 28°C og etter vekst av celler i kultur til A600 = 0,5, ble hpCSF-ekspresjon indu-sert ved å øke dyrkningstemperaturen til 42°C i 3 timer. Den endelige O.D. i kulturen var A600 = 1,2.

Ekspresjonsnivået for hpG-CSF i de transformerte celler ble bestemt på en SDS-polyacrylamidgel farget med "coomassie blue"-fargestoff til 3 - 5% av det totale cellulære protein.

Cellene ble innhøstet ved sentrifugering ved 3500 g

i 10 minutter i en JS-4.2-sentrifuge. Celler ved 25% (vekt/ volum) i vann ble brudt ned ved å passere tre ganger gjennom en "French Pressure Cell" ved 10.000 p.s.i. Suspensjonen av nedbrudte celler ble sentrifugert ved 10.000 g i 15 minutter i en JA-20-sentrifuge. Pelleten ble på nytt oppslemmet i vann og oppløseliggjort ved ca. 5 mg/ml totalt protein i 1% laurin-syre, 50 mM Tris, pH 8,7. Det oppløseliggjorte pelletmateriale ble sentrifugert ved 15.000 g i 10 minutter og det ble tilsatt 20 mM CuSG*4 til supernatanten. Etter 1 time ble denne prøven fylt på en C4 HPLC-kolonne for rensing i henhold til fremgangsmåtene ifølge eksempel 1 (B), idet det. ble gjort regu-leringer for volum og konsentrasjon.

En andre rensingsfremgangsmåte ble utviklet for å gi større mengder hpG-CSF formulert i en buffer uten organiske forbindelser. Dette materiale er egnet for in vivo under-søkelser. 150 g cellemasse ble på nytt oppslemmet i ca. 600 ml 1 mM DTT og sendt fire ganger gjennom en Manton Gualin homogenisator ved ca. 7000 PSI. Suspensjonen av nedbrudte celler ble sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter og pelleten ble på nytt oppslemmet i 4 00 ml 1% deoxycholat (DOC), 5 mM EDTA, 5mM DTT og 50 mM Tris, pH 9. Denne suspensjon ble blandet ved værelsetemperatur i 30 minutter og sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble på nytt oppslemmet i ca. 400 ml vann og sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløseliggjort i 100 ml 2% "Sarkosyl" og 50 mM

ved pH 8. CuSO^ ble tilsatt til 20 um og blandingen ble omrørt i 16 timer ved værelsetemperatur og deretter sentrifugert ved 20.000 g i 30 minutter. Til supernatanten ble det tilsatt 300 ml aceton. Denne blanding ble plassert på is i 30 minutter og deretter sentrifugert ved 5000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløst i 250 ml 6 M guanidin og 40 mM natriumacetat ved pH 4, og sendt over en 1200 ml G-25-kolonne ekvilibrert og betjent med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. hpG-CSF-toppen (ca. 400 ml) ble slått sammen og tilført en 15 ml CM-cellu-losekolonne ekvilibrert med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. Etter påfylling ble kolonnen vasket med 60 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 25 mM natriumklorid, og deretter ble kolonnen eluert med 200 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 37 mM natriumklorid. 150 ml av dette elueringsmiddel ble oppkonsentrert til 10 ml og tilført en 300 ml G-75-. kolonne ekvilibrert og betjent med 20 mM natriumacetat og 100 mM natriumklorid ved pH 5,4. Toppfraksjonene som utgjorde 35 ml, ble slått sammen og filtersterilisert. Sluttkonsentra-sjonen av hpG-CSF var 1,5 mg/ml, var mer enn 95% ren bestemt ved analyse på en gel og inneholdt mindre enn 0,5 mg pyrogen pr. 0,5 mg hpG-CSF. Pyrogennivået ble bestemt ved å bruke et prøvesett for "Limulus Amebocyte Lysate" (LAL) (M.A. Bio-products, Walkersville, Maryland).

Eksempel 8

Dette eksempel vedrører bruken av rekombinante metoder for å generere analoger av hpG-CSF hvor tilstedeværende cysteinrester i posisjonene 17, 36, 42, 64 og 74 individuelt ble erstattet med en passende aminosyrerest.

Stedrettede mutagenesefremgangsmåter ifølge Souza et al., publisert PCT patentsøknad nr. WO85/00817, publisert 28. februar 1985, ble utført på (Met"<1>]-kodende DNA fra plasmid p536Ppo2, beskrevet nedenunder, ved å bruke syntetiske oligonukleotider som varierte i størrelse fra 20 til 23 baser, slik som vist i tabell XVIII nedenunder. Oligonukleotid nr.

1 ga dannelse av et gen som koder for [Ser 17]hpG-CSF, oligo-36

nukleotid nr. 2 ga dannelse av [Ser ]hpG-CSF, osv.

De mot Cys til Ser stedrettede mutageneserestriksjoner ble utført ved å bruke M13 mplO med et Xbal- BamHI hpG-CSF-fragment isolert fra p536Ppo2 som et templat. DNA fra hver M13 mplO-klon inneholdende en Cys-Ser-substitusjon ble behandlet med Xbal og BamHI. Det resulterende fragment ble klonet inn i ekspresjonsvektor pCFM746 og ekspresjonspro-dukter ble isolert som i eksempel 7.

Plasmidet pCFM746 kan konstrueres ved å spalte et plasmid pCFM736 (konstruksjonen av dette fra deponerte og ålment tilgjengelige materialer er beskrevet i Morris, publisert PCT patentsøknad nr. WO85/00829, publisert 28. februar 1985) med Clal og BamHI for å fjerne en tilstedeværende polylinker, og ved å bytte ut følgende polylinker.

Ved en rensefremgangsmåte for Cys-Ser-analoger ifølge foreliggende oppfinnelse ble ca. 10 - 15 g cellemasse på nytt oppslemmet i 40 ml 1 mM DTT og sendt 3 ganger gjennom en "French Pressure Cell" ved 10.000 psi. Suspensjonen av nedbrudte celler ble sentrifugert ved 1000 g-i 30 minutter. Pelleten ble på nytt oppslemmet i 1% DOC, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 50 mM Tris, pH 9 og fikk blandes i 30 minutter ved væreIsetemperatur. Blandingen ble sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter, på nytt oppslemmet i 40 ml 1^0 og resentrifu-gert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløst i 10 ml 2% "Sarkosyl", 50 mM DDT, 50 mM Tris, pH 8. Etter blanding i 1 time ble blandingen klaret ved sentrifugering ved 20.000 g i 30 minutter og deretter tilført en 300 ml G-75-kolonne ekvilibrert og betjent med 1% "Sarkosyl, 50 mM Tris, pH 8. Fraksjoner som inneholdt analogen, ble slått sammen og fikk oxyderes i luft ved henstand med eksponering mot luft i minst 1 dag. Sluttkonsentrasjonene varierte fra 0,5 til 5 mg/ml.

Eksempel 9

I dette eksempel ble et ekspresjonssystem for pattedyrceller utformet for å sikre at et aktivt polypeptidpro-dukt av hpG-CSF-DNA kunne bli uttrykt i og utskilt fra pattedyrceller (COS-1, A.T.C.C. CRL-1650). Dette systemet ble utformet for å sørge for sekresjon av en polypeptidanalog til hpG-CSF via ekspresjon og sekresjonsbearbeiding av en delvis syntetisk, delvis cDNA-avledet konstruksjon som koder for [Ala<1>]-hpG-CSF som kommer etter et lederpolypeptid med den rekkefølge av rester som er tilskrevet human GM-CSF i Wong et al., Science, 228, 810-815 (1985) og Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 4360-4364 (1985).

Den ekspresjonsvektor som ble anvendt til foreløpige undersøkelser av ekspresjon av polypeptidprodukter, var en "ferge"-vektor som omfatter både pBR322- og SV40-DAN som var blitt utformet for å gi autonom replikasjon i både E. Coli-"'celler og pattedyrceller, med pattedyrcelleekspresjon av innskutt eksogen DNA under kontroll av en virus-promoter/regulator-DNA-sekvens. Denne vektor, betegnet pSVDM-19, plassert,i E. coli'101, ble deponert 3. august 1985, ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, og fikk tilvekstnummeret A.T.C.C. 53241.

De bestemte manipulasjoner som er involvert i konstruksjonen av ekspresjonsvektoren, var som følger. En lederkodende DNA-sekvens ble syntetisert som angitt i tabell XX nedenunder.

Som angitt i tabell XX, omfatter sekvensen Hindlll og-Apal klebende ender og kodoner for de 17 aminosyrerestene som tilskrives "lederen" til human GM-CSF. Det følger kodoner som angir en alaninrest, en prolinrest og en leucinrest. Pro-lin- og leucinrestene duplikerer aminosyrene som er tilstede i stillingen +2 og +3 i hpG-CSF, mens alaninresten er et duplikat av den første aminoenderesten (+1) i GM-CSF, og ikke i hpG-CSF. Erstatning av threonin med alanin ble bestemt for lettere å gi korrekt vertcelle-"processing off" av GM-CSF-lederen ved hjelp av cellulære mekanismer som vanligvis er involvert i' sekretorisk behandling av GM-CSF.

Plasmid pSVDM-19 ble oppløst med Kpnl og oppløsnings-stedet ble gjort stumpt i endene med Klenow-enzym. Deretter ble DNA kuttet med Hindlll. Det resulterende store fragment ble kombinert og ligert med Hindlll/ PvuII-fragment vist i tabell VII (isolert fra plasmid Ppo2 som det neststørste fragment som resulterte fra Hindlll-oppløsning og delvis oppløs-ning med PvuII), hvorved det ble dannet plasmid pSV-Ppol. Det fremstilte GM-CSF-ledersekvensfragment ifølge tabell VIII ble så ligert inn i pSV-Ppol (etter dets spalting med Hindlll og Apal), hvorved man fikk plasmid pSVGM-Ppol.

Kalsiumfosfatutfellinger (1-5 ug) av plasmid pSVGM-Ppol-DNA ble transformert i doble 60 ml plater med COS-l-celler, i det vesentlige som beskrevet i Wigler et al., Cell, 14, 725-731 (1978). Som en kontroll, ble også plasmid pSVDM-19 transformert i COS-l-celler. Vevkultursupernåtanter ble inn-høstet 5 dager etter transfeksjon og analysert med hensyn på hpG-CSF-aktivitet. Utbytter av [Ala<1>]hpG-CSF fra kultur-

. supernatanten var i størrelsesorden 1 til 2,5 ug/ml.

Etter vellykket ekspresjon av det [Ala^hpG-CSF-produkt-kodende plasmid pSVGM-Ppol i COS-l-celler, ble en annen vektor konstruert som omfattet den humane GM-CSF-ledersekvens, men hadde et kodon for en threoninrest (som naturlig opptrer i stilling 1 i hpG-CSF) som erstatning for kodonet for alanin i denne stillingen. I korte trekk ble et oligonukleotid syntetisert(<5> CAGCATCTCTACACCTCTGGG) for stedrettet mutagenese (SDM). hpG-CSF-fragmentet fra Hindlll til BamHI i pSVGM-Ppol ble ligert inn i Ml3mpl0 for SDM. Det nysyntetiserte hpG-CSF-gen-som inneholdt et Thr-kodon i stilling 1, ble isolert ved spalting med Hindlll og EcoRI. Fragmentet ble deretter klonet inn i pSVDM-19 fremstilt ved spalting med de samme to restriksjonsendonukleasene. Den resulterende vektor pSVGM-<p>po(Thr) ble transformert inn i COS-celler og utbyttene av hpG-CSF målt i kultursupernatantene varierte fra 1 til 5 jig/ml.

Til slutt ble den genomsekvens som det er beskrevet isolering av i eksempel 5, anvendt til å danne en ekspresjonsvektor for pattedyrcelleekspresjon av hpG-CSF. Nærmere bestemt ble pSVDM-19 oppløst med Kpnl og Hindlll og det store fragmentet brukt i en fireveis ligering med en syntetisk linker med Hindlll og Ncol klebrige ender, som vist i tabell XXI. Et NcoI- BamHI-fragment som inneholdt exon 1 isolert fra pBR322 (8500 hpG-CSF), en genomsubklon og et BamHIII- Kpnl-fragment som inneholdt exoner 2-5 isolert fra plasmidet PBR322 (8500 hpG-CSF-genomsubklon). Den resulterende patte-dyrekspresjonsvektor, pSV/ghG-CSF ga 1 til 2,5 ug/ml hpG-CSF fra transformerte COS-:celler.

Claims

1. Biologisk funksjonelt plasmid eller virus-DNA-vektor, karakterisert ved at den omfatter en renset og isolert DNA-sekvens som koder for ekspresjon av en analog av hpG-CSF valgt fra gruppen bestående av: [Ser<17>]hpG-CSF, [Ala^hpG-CSF, [Ser<36>]hpG-CSF, [Ser<42>]hpG-CSF, [Ser<64>]hpG-CSF, [Ser<74>]hpG-CSF, [Met_<1>]hpG-CSF, [Met"<1>, Ser<17>]hpG-CSF, [Met"<1>, Ser36]hpG-CSF, [Met"<1>, Ser<42>]hpG-CSF, [Met"<1>, Ser64]hpG-CSF og [Met"<1>, Ser<74>]hpG-CSF.

2. Prokaryot eller eukaryot vertscelle, karakterisert ved at den er stabilt transformert eller transfektert med en DNA-vektor ifølge krav 1, og er i stand til å uttrykke det gitte genet.

3. Prokaryot eller eukaryot vertscelle som er transformert eller transfektert, ifølge krav 2, karakterisert ved at DNA-sekvensen koder for aminosyresekvensen 1-174 i tabell VII, med en ytterligere metionylrest i stilling -1.