FI110576B - Menetelmä ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloiva tekijä- (hpG-CSF-) tuotteen valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 110576

Menetelmä ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivateki-jä- (hpG-CSF-) tuotteen valmistamiseksi Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta Fl 20000014, 5 joka on jakamalla erotettu hakemuksesta Fl 871700.

Tämä keksintö liittyy yleisesti hematopoieettisiin kasvutekijöihin, ja niitä koodaaviin polynukleotideihin. Erityisesti tämä keksintö koskee menetelmää ihmisen monitehoisen granylosyyttipesäkkeitä stimuloivatekijä- (hpG-CSF-) tuotteen valmistamiseksi, jolla on luonnossa esiintyvän hpG-CSF:n gra-10 nulosyyttipoieettinen biologinen ominaisuus in vivo.

Ihmisen verta muodostava (hematopoieettinen) järjestelmä korvaa erilaisia valkeita verisoluja (mukaan luettuina neutrofiilit, makrofagit ja basofii-Iit/syöttösolut), punaisia verisoluja (erytrosyyttejä) ja hyytymiä muodostavia soluja (megakaryosyyttejä/verihiutaleita). Keskiarvomiehen hematopoieettisen 15 järjestelmän on arvioitu tuottavan suunnilleen 4,5 x 1011 granulosyyttiä ja eryt-rosyyttiä vuosittain, joka määrä vastaa koko ruumiinpainon vuosittaista korvautumista [Dexter et ai., Bio-Essays 2 (1985) 154 - 158].

Otaksutaan, että pienet määrät tiettyjä hematopoieettisia kasvutekijöitä vastaavat pienten kantasolumäärien erilaistumisesta erilaisiksi verisolulin-··· 20 joiksi, näiden linjojen valtavasta lisääntymisestä ja valmiiden verisolujen lopul lisesta muodostumisesta näistä linjoista. Koska hematopoieettisia kasvutekijöi-.·. tä esiintyy äärimmäisen pieninä määrinä, on näiden tekijöiden detektointi ja ’ · identifiointi ollut määritysten varassa, joilla pystytään erottamaan erilaiset teki jät toisistaan vain sen perusteella, miten ne stimuloivat viljeltyjä soluja keinote-25 koisissa olosuhteissa. Tämän tuloksena on annettu suuri määrä nimiä paljon '···' pienemmälle määrälle tekijöitä. Esimerkkinä tuloksena olevasta termien seka vuudesta mainittakoon IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF ja PSF, jotka kaikki ovat akronyymejä, joiden nykyisin otaksutaan merkitsevän yhtä hiiren hematopoieettista kasvutekijää [Metcalf, Science 229 (1985) 16 - 22]. Katso 30 myös julkaisut Burgess et ai., J. Biol. Chem. 252 (1977) 1988, Dasetal. Blood :'* 58 (1980) 600, Ihle et ai., J. Immunol. 129 (1982) 2431, Nicola et ai., J. Biol.

• : Chem. 258 (1983) 9017, Metcalf et ai., Int. J. Cancer 30 (1982) 773 ja Burgess et a]., Int. J. Cancer 26 (1980) 647, jotka käsittelevät hiiren erilaisia kasvua ‘ ' sääteleviä glykoproteiineja.

35 Yhdistelmägeenitekniikan käyttöönotto on tuonut jonkin verran jär- .···. jestystä tähän kaaokseen. On esimerkiksi selvitetty ihmisen erytropoietiinin, 2 110576 joka stimuloi erytrosyyttien tuotantoa, aminohappo- ja DNA-sekvenssi. (Katso Lin, PCT-hakemusjulkaisu nro 85/02610, 20. kesäkuuta 1985). Yhdistelmäme-netelmiä on käytetty myös ihmisen granulosyytti-makrofagipesäkkeitä stimuloivaa tekijää vastaavan cDNA:n eristämiseen. Katso Lee fit ai., Proc. Natl.

5 Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 4360 - 4364 ja Wong et ai., Science 228 (1985) 810 - 814. Katso myös Yokota fit ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81 (1984) 1070, Fung fit ai., Nature 307 (1984) 233 ja Gough fit a!·, Nature 309 (1984) 763, joissa julkaisuissa käsitellään hiiren geenien kloonausta, samoin kuin Kawasaki et ai., Science 230 (1985) 291, joka julkaisu käsittelee ihmisen 10 M-CSF:ää.

Erästä ihmisen hematopoieettista kasvutekijää, josta käytetään nimitystä ihmisen monitehoinen pesäkkeitä stimuloiva tekijä (hpCSF) tai pluri-poietiini, on osoitettu esiintyvän erään ihmisen virtsarakkokarsinoomasolulin-jan, josta käytetään merkintää 5637 ja joka on rajoittavin ehdoin talletettu the 15 American Type Culture Collectioniin, Rockville, Maryland ATCC-talletusnume-rolla HTB-9, kasvualustassa. Tästä solulinjasta puhdistetun hpCSF:n on ilmoitettu stimuloivan monitehoisten kantasolujen lisääntymistä ja erilaistumista kaikiksi verisolujen päätyypeiksi kokeissa, joissa käytetään ihmisen luuytimen kantasoluja. Katso Welte fil ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 1526 -20 1 530. hpCSF.n puhdistukseen on käytetty: (NH4)2S04-saostusta; anioninvaih- tokromatografiaa (DEAE selluloosa, DE52); geelisuodatusta (AcA54-kolonni); ja C18-RP-HPLC:tä. hpCSFiksi identifioidun proteiinin, joka eluoituu toisessa aktiivisuuspiikissä C18-RP-HPLC:ssä, molekyylipainon on ilmoitettu olevan 18 000 määritettynä natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -polyakryyliamidigeeli-25 elektroforeesilla (PAGEilla), jossa käytetään hopeavärjäystä. Aiempien raporttien mukaan hpCSF:n isoelektrinen piste on 5,5 [Welte et ai., J. Cell. Biochem., Supp 9A, (1985) 116] ja sillä on voimakas erilaistamisaktiivisuus hiiren mye-lomonosyyttileukemiasolulinjan WEHI-3B D+ suhteen (Welte fit ai., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, toim. Gale et al., New Series •' 30 28, 1985). Alustavat tutkimukset viittaavat siihen, että hpCSFiksi identifioidulla :,( tekijällä on pääasiassa granylosyyttipesäkkeitä stimuloiva vaikutus ensimmäis- ... · ten seitsemän päivän aikana ihmis-CFU-GM-kokeessa.

Ihmisen virtsarakkokarsinoomasolulinjasta 5637 on eristetty myös . . eräs toinen tekijä, josta käytetään merkintää CSF-β, ja jonka on kuvattu kilpai- 35 levän hiiren 125l-leimatun granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän (G-CSF:n) kanssa sitoutumisesta WEHI-3B D+ -soluihin annos-vasteriippuvuuden ollessa 3 110576 samanlainen kuin leimaamattomalla hiiren G-CSF:llä [Nicola gt ai., Nature 314 (1985) 625 - 628], Tämän annos-vaste-riippuvuuden on aiemmin ilmoitettu olevan ainutlaatuinen leimaamattomalle hiiren G-CSF:lle ja puuttuvan sellaisilta tekijöiltä kuin M-CSF, GM-CSF ja multi-CSF [Nicola et ai., Proc. Natl.

5 Acad. Sei. (USA) 81 (1984) 3765 - 3769]. CSF-β ja G-CSF ovat ainutlaatuisia CSF:ien joukossa myös siinä suhteessa, että niille on yhteistä suuri kyky indusoida WEHI-3B D+ -solujen erilaistumista. Katso Nicola et aj. Immunology Today 5 (1984) 76 - 80. Suurina pitoisuuksina G-CSF stimuloi granylosyyt-ti/makrofagipesäkkeitä muodostavien solujen seoksia [Nicola si ai., supra 10 (1984)], mikä sopii yhteen alustavien tulosten kanssa, jotka osoittavat granu- losyytti-, monosyytti-, granulosyytti/monosyyttiseos- ja eosinofiilipesäkkeiden (CFU-GEMM) ilmaantumisen, kun ihmisen luuydinviljelmiä on inkuboituu 14 vrk hpCSF:n kanssa. CSF-βιη on kuvattu myös stimuloivan neutrofiilisten gra-nulosyyttipesäkkeiden muodostumista kokeissa, joissa käytettiin hiiren luuydin-15 soluja, jota ominaisuutta on pidetty kriteerinä tekijän identifioimiseksi G-CSF:ksi. Näiden samankaltaisuuksien perusteella ihmisen CSF-β on identifioitu G-CSF:ksi (granulosyyttipesäkkeitä stimuloivaksi tekijäksi). Katso Nicola gtal-, Nature 314 (1985) 625-628.

Yhteisten ominaisuuksiensa perusteella ihmisen CSF-β (Nicola gt 20 ai., supral ja hpCSF (Welte gt ai., supral näyttävät olevan sama tekijä, jota voitaisiin hyvin kutsua ihmisen monitehoiseksi granulosyyttipesäkkeitä stimuloivaksi tekijäksi (hpG-CSF). hpG-CSF:n karakterisointi ja tuottaminen yhdis-telmä-DNA-menetelmin olisi erityisen toivottavaa, kun otetaan huomioon hiiren ...: G-CSF:n ilmoitettu kyky kokonaan vaientaa jn vitro WEHI-3B D+ -leukemia- 25 solupopulaatio "aivan normaaleina pitoisuuksina" ja injektoitujen hiiren G-CSF-raakapreparaattien ilmoitettu kyky vähentää hiireen istutettuja myeloidileuke-mioita. Katso Metcalf, Science 229 (1985) 16-22. Katso myös Sachs, Scientific American 284(1) (1986) 40 - 47.

Siinä määrin kuin hpG-CSF saattaa osoittautua terapeuttisesti mer-: 30 kittäväksi ja siten tarpeelliseksi olla saatavana kaupallisina määrinä, ei eristä- minen soluviljelmistä todennäköisesti tarjoa riittävää tämän materiaalin lähdettä. On esimerkiksi huomionarvoista, että näyttää olevan olemassa rajoituk-....· siä Human Tumor Bankin solujen, kuten ihmisen virtsarakkokarsinoomasolu- linjan 5637 (ATCC HTB9), jotka Welten gt ai., (supra. 1985) mukaan ovat » · : *· 35 luonnosta eristettyjen hpCSFrien lähteitä, kaupalliselle käytölle .

4 110576

Keksinnön yhteenveto

Esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmän hpG-CSF:n valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Tämän keksinnön yhteydessä kuvataan DNA-sekvenssejä, jotka 5 koodaavat koko hpG-CSF:ää tai osaa siitä. Tällaiset sekvenssit saattavat sisältää: kodoneja, jotka ovat "edullisia" ilmentymiselle valituissa ei-nisäkäsisännissä; restriktioentsyymipilkkoutumiskohtia; ylimääräisiä alku-, loppu- tai väli-DNA-sekvenssejä, jotka helpottavat helposti ilmentyvien vektoreiden konstruoimista. Tässä kuvataan myös DNA-sekvenssien ilmentymistä 10 mikrobeissa, jotka sekvenssit koodaavat hpG-CSF:n polypeptidianalogeja tai johdoksia, jotka eroavat luonnossa esiintyvistä muodoista yhden tai useamman aminohapporyhmän identiteetin tai sijainnin suhteen (ts. deleetioanalogi-en, jotka sisältävät vähemmän kuin kaikki hpG-CSF:lle ominaiset ryhmät; sub-stituutioanalogien, kuten [Ser17]hpG-CSF:n, joissa yksi tai useampia ryhmiä on 15 korvautunut muilla ryhmillä; ja additioanalogien, joissa polypeptidin päähän tai keskelle on lisätty yksi tai useampia aminohapporyhmiä) ja joiden jotkut tai kaikki ominaisuudet ovat yhteisiä luonnossa esiintyvien muotojen kanssa.

Uusiin DNA-sekvensseihin sisältyy sekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia sen varmistamiseen, että prokaryoottisissa tai eukaryoottisissa isän-·...* 20 täsoluissa muodostuu polypeptidituotteita, joilla on ainakin osa luonnossa : esiintyvän monitehoisen granylosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän primaari- rakenteesta ja yksi tai useampia sen biologisista ominaisuuksista. Näiden DNA-sekvenssien katsotaan sisältävän erityisesti: (a) taulukossa VII ja taulu-··.' kossa Vili esitetyn DNA-sekvenssin tai sen komplementaarisen säikeen; (b) 25 DNA-sekvenssin, joka hybridisoituu (hybridisaatio-olosuhteissa, kuten tässä kuvatuissa, tai ankarammissa olosuhteissa) taulukossa VII esitettyjen DNA-sekvenssien tai niiden osien kanssa; ja (c) DNA-sekvenssin, joka - ellei geneettinen koodi olisi degeneroitunut - hybridisoituisi taulukon VII mukaisen DNA-sekvenssin kanssa. Kohdassa (b) tarkoitetaan erityisesti geno-30 mi-DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat hpGCSF:n alleelisia varianttimuotoja tai »· · muiden nisäkäslajien monitehoisia granylosyyttipesäkkeitä stimuloivia tekijöitä. Kohdassa (c) tarkoitetaan erityisesti valmistettuja DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat hpG-CSF:ää, hpG-CSF:n fragmentteja ja hpG-CSF:n kanssa • · analogisia polypeptidejä, jotka DNA-sekvenssit voivat sisältää kodoneja, jotka • · : ’* 35 helpottavat lähetti-RNA:n translaatiota mikrobi-isännissä. Tällaisia valmistettu-

• > I

5 110576 ja sekvenssejä on helppo konstruoida Altonin et ai., menetelmien mukaisesti (PCT-hakemusjulkaisu WO 83/04053).

Tässä esitetään edelleen sitä polypeptidiryhmää, jota koodaavat osat ihmis-cDNA:n tai tässä esitettyjen taulukoiden VII ja Vili mukaisten ge-5 nomi-DNA-sekvenssien ylemmälle säikeelle komplementaarisesta DNArsta, ts. "komplementaarisesti käännetyt proteiinit", joita kuvaavat Tramontano et ai., [Nucleic Acids Res., 12 (1984) 5049 - 5059],

Kuvaukseen sisältyy myös puhdistettuja ja eristettyjä polypeptidi-tuotteita, joilla on osittain tai kokonaan luonnossa esiintyvän hpG-CSF:n, sen 10 alleeliset variantit mukaan luettuina, primaarirakenne (ts. aminohapporyhmistä koostuva jatkuva sekvenssi) ja yksi tai useampia sen biologisista ominaisuuksista (ts. immunologisia ominaisuuksia ja biologinen aktiivisuus in vitro) ja fysikaalisista ominaisuuksista (esimerkiksi molekyylipaino). Näille polypeptideille on tunnusomaista myös se, että ne ovat kemiallisten synteesimenettelyjen tu-15 los tai tulosta genomi-DNA:n tai cDNA:n kloonauksella tai geenisynteesillä saatujen eksogeenisten DNA-sekvenssien ilmentymisestä prokaryoottisessa tai eukaryoottisessa isännässä (esimerkiksi viljelmässä olevissa bakteeri-, hiiva-, korkeampien kasvien, hyönteis-ja nisäkässoluissa). Tyypillisten hiivaisän-täsolujen (esimerkiksi Saccharomvces cerevisiae) tai prokaryootti-isän-• 20 täsolujen [esimerkiksi Escherichia coli (E. coli)] tuotteet ovat vapaita kaikista ] nisäkkäiden proteiineista. Selkärankaissolujen (esimerkiksi muiden nisäkkäi den kuin ihmisen solujen ja lintusolujen) ilmentymistuotteet eivät sisällä mitään ihmisen proteiineja. Käytetystä isännästä riippuen voivat polypeptidit olla gly-kosyloituneita nisäkkäiden tai muiden eukaryoottien hiilihydraateilla tai gly-25 kosyloitumattomia. Polypeptidit voivat sisältää myös metioniinialoitusamino-happoryhmän (asemassa-1).

Lisäksi kuvataan farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät vaikuttavia määriä polypeptidituotteita yhdessä soveltuvien laimennus-, apu- ja/tai kantaja-aineiden kanssa, jotka ovat käyttökelpoisia hpG-CSF-terapiassa.

30 Polypeptidituotteet voidaan "leimata" liittämällä niihin detektoitavis- sa olevaa merkkiainetta (esimerkiksi radioleimata 125l:llä), jolloin saadaan rea-' gensseja, jotka ovat käyttökelpoisia ihmisen hpG-CSF:n detektointiin ja kvanti tatiiviseen määrittämiseen kiinteästä kudoksesta ja nestenäytteistä, kuten ve-\ . restä tai virtsasta. Myös DNA-tuotteet voidaan leimata detektoitavissa olevilla : ·. 35 merkkiaineilla (kuten radioaktiivisilla merkkiaineilla ja ei-isotooppimerkki- aineilla, kuten biotiinilla) ja käyttää DNA-hybridisaatiomenetelmissä ihmisen 6 110576 hpG-CSF-geenin ja/tai siihen mahdollisesti liittyvän geeniryhmän aseman kromosomikartassa määrittämiseksi. Niitä voidaan käyttää myös ihmisen hpG-CSF-geenihäiriöiden identifioimiseksi DNA-tasolla ja geenimarkkereina naapurigeenien ja niiden häiriöiden identifiomiseksi.

5 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut polypeptidituotteet voivat olla käyttökelpoisia yksinään tai yhdistettyinä muihin hematopoieettisiin tekijöihin tai lääkkeisiin verenmuodostushäiriöiden, kuten aplastisen anemian hoidossa. Esimerkiksi luuydinsiirron onnistumista voidaan edistää antamalla hpG-CSF:ää. hpG-CSF voi lisäksi olla käyttökelpoinen leukemian hoidossa 10 sen perusteella, että sillä on ilmoitettu olevan kyky erilaistaa leukemiasoluja. Katso Welte et ai., Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 82 (1985) 1526 - 1530 ja Sachs, suora.

Tämän keksinnön lukuisat aspektit ja edut käynevät ilmi alan am-mattimiehille seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta, jossa valaistaan 15 tämän keksinnön käytännön toteutusta sen tällä hetkellä edullisissa suoritusmuodoissa.

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvio esittää hpG-CSF-geenin osittaista restriktioendonukleaasikart-*· taa, johon on liitetty nuolet, jotka osoittavat genomisekvenssin määrittämiseen 20 käytetyn sekventointistrategian.

Yksityiskohtainen kuvaus Tämän keksinnön yhteydessä on eristetty ja karakterisoitu DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat koko hpG-CSF-polypeptidisekvenssiä tai osaa • t '·, . siitä.

25 Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön valaisemiseksi, ja ne kos kevat erityisesti ennen hpG-CSF-cDNA:n ja genomikloonien identifiointia toteutettuja menettelyjä, tällaiseen identifiointiin johtaneita menettelyjä, ,·. sekventointia, cDNA:han, genomiin ja valmistettuihin geeneihin perustuvien ilmentymisjärjestelmien kehittämistä ja tällaisissa järjestelmissä olevien « 30 ilmentyvien hpG-CSF;n ja analogisten tuotteiden varmistamista.

Tarkemmin määriteltynä esimerkki 1 koskee hpG-CSF:n aminohap-posekventointia. Esimerkki 2 koskee cDNA-kirjaston valmistamista pesäkehyb-ridisaatioseulontaa varten. Esimerkki 3 koskee hybridisaatiokoettimien konst- • · ruoimista. Esimerkki 4 koskee hybridisaatiotutkimusta, positiivisten kloonien 35 identifioimista, erään positiivisen kloonin DNA-sekventointia ja polypeptidin 7 110576 primaarirakennetta (aminohapposekvenssiä) koskevien tietojen hankkimista. Esimerkki 5 koskee hpG-CSF:ää koodaavan genomikloonin identifiointia ja sekventointia. Esimerkki 6 koskee hpG-CSF:ää koodaavan keinotekoisen geenin, jossa käytetään E. colin kannalta edullisia kodoneja, konstruoimista.

5 Esimerkki 7 koskee menettelyjä E. coH -transformaatiovektorin, joka sisältää hpG-CSF:ää koodaavan DNA:n, konstruoimiseksi, tämän vektorin käyttöä hpG-CSF:n tuottamiseen prokaryoottisesti ja yhdistelmätuotteiden ominaisuuksien analysoimista. Esimerkki 8 käsittelee menettelyjä, jolla muodostetaan hpG-CSF:n kanssa analogisia polypeptidejä, joissa kysteiiniryhmät on 10 korvattu muulla soveltuvalla aminohapporyhmällä hpG-CSF:ää koodaavan DNA:n mutageneesin kautta. Esimerkki 9 koskee menettelyjä, joilla konstruoidaan vektori, joka sisältää positiivisesta cDNA-kloonista peräisin olevan, hpG-CSF-analogia koodaavaa DNA:ta, tämän vektorin käyttöä COS-1-solujen transfektointiin ja transfektoitujen solujen kasvatusta viljelmänä. Esimerkki 10 15 koskee rekombinanttia polypeptidituotteiden fysikaalisia ja biologisia ominaisuuksia.

Esimerkki 1 (A) Kirjallisuuden mukaisilla menetelmillä aikaansaadun materiaalin sek-* ventointi I I I i !'·[ 20 hpG-CSF-näytteen (3 - 4 pg, puhtausaste 85 - 90 % SDS-PAGE, ·*· hopeavärjäys) toimitti Sloan Kettering Institute, New York, eristettynä ja puh- .*' distettuna Welte et ai., menetelmällä [Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 1526-1530].

, . Tämän hpG-CSF-näytteen N-terminaalinen aminohapposekvenssi 25 määritettiin mikrosekvenssianalyysillä, jossa ajossa # 1 käyttämällä AB407A-kaasufaasisekventoijaa (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia), jolloin saatiin jäljempänä taulukossa I esitettävät sekvenssitiedot. Taulukoissa I - IV käytetään yksikirjainkoodeja, "X" tarkoittaa ryhmää, jota ei ole määritetty yksi--y > selitteisesti, ja suluissa olevat ryhmät ovat vaihtoehtoisia tai mahdollisia.

t · * *

’· · 30 Taulukko I

I < I

_ I 5 10 15

K-P-L-G-P-A-S-K-L-K-Q-(G,V,S)-G-L-X-X-X

f 8 110576

Joka ajosyklissä, josta esitetään tuloksia taulukossa I, oli korkea tausta, mikä osoittaa, että näytteessä oli monia kontaminoivia komponentteja, todennäköisesti puhdistuksesta jääneiden kemikaalijäännösten muodossa.

Ajon # 2 yhteydessä käytetty toinen näyte (5-6 pg, puhtausaste 5 noin 95 %) saatiin Sloan Ketteringista samoin kuin ajon # 1 näytekin, ja sek-ventointi tehtiin kuten ajossa # 1. Tämä näyte oli peräisin samasta materiaali-erästä kuin Welten et ai., julkaisun [Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 1526 - 1530] kuvion 4 aikaansaantiin käytetty aine. Tulokset annetaan taulukossa II.

10 Taulukko II

15 10 15 20 T-P-L-G-P-A-S-(S)-L-P-Q-(S)-M-(L)-X-K-(R)-X-X-(R)-(L)-X- X (M) 15 Vaikka ajossa # 2 identifioitiin useampia ryhmiä, ei se antanut riittä vän pitkää varmaa sekvenssiä, josta voitaisiin muodostaa kohtuullinen määrä koettimia hpG-CSF-DNA:n etsimiseen. Laskettiin, että olisi tarvittu vähintään ; 1536 koetinta, jotta olisi voitu yrittää taulukon II mukaiseen sekvenssiin pe- • rustuvan cDNA:n eristämistä. Näytteen epäpuhtauksien uskottiin tälläkin ker- l 20 taa olevan ongelmana.

Kolmannenkin näytteen (3 - 5 pg, puhtausaste noin 40 %) toimitti Sloan Kettering. Tälle valmisteelle tehtiin elektroforeettinen täpläsiirto SDS-PAGE:n jälkeen yritettäessä lisäpuhdistusta. Tämän näytteen sekvenssiana-. fyysistä ei saatu tuloksia.

25 (B) Korjatuilla menetelmillä saatujen materiaalien sekventointi

Jotta saataisiin riittävä määrä puhdasta materiaalia sopivan tarkan aminohapposekvenssianalyysin tekemiseksi, saatiin tri E. Platzerilta virtsarak- > λ. kokarsinomaasolulinjan 5637 (alaklooni 1A6) soluja, jotka oli tuotettu Sloan

Ketteringissä. Soluja kasvatettiin aluksi Iscoven alustassa (GIBCO, Grand Is- 30 land, New York) pulloissa yhtenäiseksi kasvustoksi. Kun viljelmät olivat kasva-neet yhtenäisiksi, ne käsiteltiin trypsiinillä ja siirrostettiin pyörityspulloihin (12 ‘ pullollista/pyörityspullo), joista kukin sisälsi 25 ml ennalta ilmastoitua Iscoven '... alustaa 5 % C02:a sisältävässä atmosfäärissä. Soluja kasvatettiin yön yli läm pötilassa 37 °C pyöritysnopeuden ollessa 0,3 min1.

9 110576

Cytodex-1-helmet (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) pestiin ja steriloitiin seuraavia menettelyjä käyttämällä. Laitettiin pulloon 8 g helmiä, ja lisättiin 400 ml PBS:ää. Helmet suspendoitiin pyörittämällä varovasti 3 tuntia. Kun helmien oli annettu laskeutua, PBS imettiin pois, helmet huuhdottiin PBSillä, ja 5 lisättiin uutta PBS:ää. Ennen käyttöä helmet pestiin Iscoven alustalla, joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia (FSC), ja lisättiin niille sitten uutta FCS-pi-toista (10 %) alustaa, jolloin saatiin käyttövalmiita helmiä.

Kun kustakin pyörityspullosta oli poistettu alusta 30 ml:aa lukuun ottamatta, lisättiin pulloihin 30 ml FCS-pitoista (10 %) tuoretta alustaa ja 40 ml 10 käsiteltyjä helmiä. Pullot kaasukäsiteltiin 5 % C02:a sisältävällä seoksella, ja kaikki kuplat poistettiin imemällä. Pullot laitettiin telasekoittimelle, ja pyöritettiin nopeudella 3 min'1 1/2 tuntia ennen pyöritysnopeuden alentamista arvoon 0,3 min1. 3 tunnin kuluttua käsiteltiin lisäpullo trypsiinillä ja lisättiin kuhunkin helmiä sisältävään pyörityspulloon.

15 40-50 % yhtenäisestä kasvustosta pyörityspulloissa pestiin 50 ml:lla PBS:ää ja pyöritettiin 10 minuuttia ennen PBS:n poistamista. Soluja kasvatettiin 48 tuntia alustassa A (Iscoven alusta, joka käsittää 0,2 % FCS, 10"®M hydrokortisonia, 2 mM glutamiinia, 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja 100 pg/ml streptomysiiniä). Seuraavaksi viljelmän supernatantti kerättiin sentrifugoimalla no-20 peudella 3 000 min'1 15 minuutin ajan ja säilytettiin -70 °C:ssa. Viljelmiin lisättiin alustaa A, joka sisälsi 10 % FCS:ää ja kasvatettiin 48 tuntia. Alustan poistamisen jälkeen solut pestiin PBS:llä kuten edellä ja kasvatettiin 48 tuntia alustassa A. Supernatantti kerättiin jälleen ja käsiteltiin kuten edellä on kuvat-:···; tu.

’* · 25 Noin 30 I 1A6-solujen käytettyä kasvualustaa konsentroitiin noin :: 2 l:ksi Millipore Pellicon -yksiköllä, joka oli varustettu 2 kasetilla, joiden läpäisy- raja vastasi molekyylipainoa 10 000, ja jossa suodoksen keräysnopeus oli noin 200 ml/min ja retentaatin keräysnopeus noin 1 000 ml/min. Konsentraatti dia-lyysisuodatettiin noin 10 l:n kanssa 50 mM Tris-puskuria (pH 7,8) käyttämällä : 30 samaa laitetta ja samoja virtausnopeuksia. Dialyysisuodatettu konsentraatti syötettiin nopeudella 40 ml/min pylvääseen, joka sisälsi 1 I 50 mM Tris-pusku-:'· riita (pH 7,8) tasapainotettua DE-selluloosaa. Kun konsentraatti oli syötetty pylvääseen, tätä huuhdottiin samalla virtausnopeudella 1 lilla 50 mM Tris-puskuria (pH 7,8) ja sitten 2 lilla 50 mM Trispuskuria (pH 7,8), joka sisälsi 50 35 mmol/l NaClia. Sitten kolonnia eluoitiin peräkkäin kuudella 1 Iin annoksella ’ · · ·. 50 mM Tris-liuosta (pH 7,8), jotka annokset sisälsivät NaClia seuraavina pitoi- 10 1 10576 suuksina: 75, 100, 125, 150, 200 ja 300 mmol/l. Kerättiin fraktioita (50 ml), yhdistettiin aktiiviset fraktiot ja väkevöitiin ne 65 ml:ksi sekoituksella varustetulla Amico-ultrasuodatusyksiköllä, joka oli varustettu YM5-kalvolla. Tämä konsent-raatti syötettiin kolonnille, joka sisälsi 1 I AcA54-geelisuodatusainetta, joka oli 5 tasapainotettu PBS:llä. Virtausnopeus kolonnin läpi oli 80 ml/h, ja kerättiin 10 ml:n fraktioita. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja syötettiin suoraan C4-HPLC-kolonnille.

Näytteet, joiden tilavuus oli 125 - 850 ml ja jotka sisälsivät 1 - 8 mg proteiinia, josta noin 10 % oli hpG-CSF:ää, syötettiin kolonnille virtausnopeu-10 della 1-4 ml/min. Kun näyte oli syötettyjä kolonnille oli tehty alkuhuuhtelu liuoksella, joka sisälsi 0,1 mol/l ammoniumasetaattia (pH 6,0 - 7,0) 80-%:isessa 2-propanolissa, virtausnopeudella 1 ml/min, kerättiin 1 ml:n fraktioita ja seurattiin proteiineja aallonpituuksilla 220, 260 ja 280 nm.

Puhdistuksen seurauksena oli hpG-CSF:ää sisältävien fraktioiden 15 (fraktiot 72 ja 73 80:stä) selvä erottuminen muista proteiinipitoisista fraktioista. Eristettiin hpG-CSF (150 - 300 pg), jonka puhtausaste oli noin 85 ± 5 % ja saanto noin 50 %. Tästä puhdistetusta materiaalista käytettiin 9 pg ajoon # 4, aminohapposekvenssianalyysiin, jossa proteiininäyte laitettiin TFA:lla aktivoituun lasikuitukiekkoon, jossa ei ollut polybreeniä. Sekvenssianalyysi tehtiin AB 20 470A -sekventoijalla Hewickin et ai-, [J. Biol. Chem. 256 (1981) 7990 - 7997] ja ; Lain [Anal. Chim. Acta 163 (1984) 243 - 248] menetelmillä. Ajon # 4 tulokset ; annetaan taulukossa III.

Taulukko III

··· 1 5 10 ·· 25 Thr - Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu - Pro- 15 20

Gin - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys -(Lys)- Leu -(Glu)- Glu- 30 25 30 ·.. Vai - Arg - Lys - Ile -(Gin)- Gly - Vai - Gly - Ala - Ala- ....· Leu - X - X - ..· · Ajossa # 4 ei 31 syklin (taulukon III ryhmän 31) jälkeen saatu enää • ' ‘ 35 lisää merkittäviä sekvenssitietoja. Jotta ajossa # 5 saataisiin pitempi varmasti määritetty sekvenssi, 14 pg hpG-CSF:ää, joka oli puhdistettu käytetystä alus- n 110576 tästä, pelkistettiin 10 piillä β-merkaptoetanolia 1 tunti lämpötilassa 45 °C ja kuivattiin sitten perusteellisesti alipaineessa. Proteiinijäännös liuotettiin sitten 5-%:iseen muurahaishappoon ja laitettiin polybreenikäsiteltyyn lasikuitukiek-koon. Sekvenssianalyysi tehtiin kuten edellä ajon # 4 yhteydessä kuvattiin.

5 Ajon # 5 tulokset esitetään taulukossa IV.

Taulukko IV

1 5 10

Thr - Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu - Pro - 15 20 10 Gin - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys - Cys - Leu - Glu - Gln- 25 30

Vai - Arg - Lys - Ile - Gin - Gly - Asp - Gly - Ala - Ala - 35 40 15 Leu - Gin - Phe - Lys - Leu - Gly - Ala - Thr - Tyr - Lys - 45

Vai - Phe - Ser - Thr - (Arg) - (Phe) - (Met) -X-

Taulukossa IV annettu aminohapposekvenssi oli riittävän pitkä (44 ryhmää) ja yksiselitteinen koettimien konstruoimiseksi hpG-CSF-cDNA:n ai-: 20 kaansaamiseksi tässä hakemuksessa kuvattavalla tavalla.

Esimerkki 2 : Standardimenetelmiin kiinnostuksen kohteena olevien cDNA-sek- venssien eristämiseksi kuuluu plasmidiperäisten cDNA-"kirjastojen" valmista-. - minen käänteiskopioimalla mRNAita, jota esiintyy runsaasti luovuttajasoluissa, 25 jotka valitaan sen perusteella, että kohdegeeni ilmentyy niissä. Kun tunnetaan oleellisia osia polypeptidin aminohapposekvenssistä, voidaan käyttää tunnettuja, leimattuja yksisäikeisiä DNA-koetinsekvenssejä, joissa toistuu "kohde"-cDNAissa otaksuttavasti esiintyvä sekvenssi, DNA/DNA-hybridisaa-tiossa, jo-ka tehdään kloonatuille cDNA-kopioille, jotka on denaturoitu yksisäikeiseen 30 muotoon. Katso Weissman et ai., US-patenttijulkaisu 4 393 443; Wallace et a]., Nucleic Acids Res. 6 (1979) 3543 - 3557; Reyes et ai·. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 79 (1982) 3270 - 3274; ja Jaye et ai- Nucleic Acids Res. 11 (1983) . . 2325-2335. Katso myös US-patenttijulkaisu 4 358 535 (Falkow at ai·,), joka • '·· käsittelee DNA/DNA-hybridisaatiomenettelyjen käyttöä diagnosointiin; ja Davis 35 et ai-, A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold 110576 12

Spring Harbor, N.Y. 1980, s. 55 - 58 ja 174 - 176, jossa käsitellään pesäkehy-bridisaatiomenetelmiä.

Kokonais-RNA eristettiin noin 1 g:sta virtsarakkokarsinoomasolu-linjan 5637 (1A6) soluja käyttämällä guanidiumtiosyanaattimenettelyä muuttu-5 mattoman RNA:n eristämiseen [Chirgwin et ai., Biochemistry 18 (1979) 5294 -5299].

Steriili RNA-vesiliuos sisälsi 1A6-solujen kokonais-RNA:n. Lähetti-RNA:n erottamiseksi kokonais-RNA-liuoksesta tämä johdettiin kolonnin läpi, joka sisälsi oligodeoksitymidylaattia [oligo(dT)] (Collaborative Research, Inc., 10 Waltham, Massachusetts). Lähetti-RNA:lle tunnusmerkilliset polyadenyloitu-neet (poly-A+) hännät tarttuvat kolonniin, kun taas ribosomi-RNA eluoituu. Tällä menettelyllä eristettiin noin 90 pg polyadenyloitunutta lähetti-RNA:ta (poly-A+-mRNA:ta). Eristetty poly-A+-mRNA esikäsiteltiin metyylielohopeahyd-roksidilla (Alpha Ventron, Danvers, Massachusetts), jonka loppupitoisuus oli 15 4 mmol/l, 5 min huoneenlämpötilassa ennen käyttämistä cDNA-reaktioon. Me-tyylielohopeahydroksidikäsittely denaturoi lähetti-RNA:n vuorovaikutukset sekä itsensä kanssa että kontaminoivien molekyylien kanssa, jotka estävät translaatiota. Katso Payvargt ai-, J· Biol. Chem. 258 (1979) 7636 - 7642.

Valmistettiin cDNA-pankki Okayaman menetelmällä [Okayama gt 20 ai-, Molecular & Cellular Biology 2 (1982) 161-170] käyttämällä 1A6-soluista saatua mRNA:ta. cDNA:illa transformoitiin DNA:n lisäämiseen käytetty isäntä-:. : mikro-organismi £. fioli K-12 -kanta HB101 tekemällä inkubointi.

Esimerkki 3

Taulukon IV mukaisen hpG-CSF:n aminoterminaalisen sekvenssin ’ 25 perusteella suunnitellut hybridisaatiokoettimet koostuivat 24 oligonukleotidista, joista kukin oli 23 emäksen pituinen ja sisälsi kolme inosiiniryhmää. Koetinoli-gonukleotidit valmistettiin Caruthersin et ai., menetelmällä [Genetic Engineering 4 (1982) 1-18] ja leimattiin y-32P-ATP:lla tekemällä kinaasikäsittely polynukleo-tidikinaasilla. Koetinoligonukleotidit, jotka vastaavat taulukon IV mukaisen sek-!.. 30 venssin ryhmiä 23 - 30 vastaavaa RNA:ta, esitetään taulukossa V.

Taulukko V

hpG-CSF-koettimet 5' GC IGC ICC §TC ICC £tG ^AT £tT3' '35 τ 13 110576

Iiiden merkitseminen neutraaleiksi perustui Takahashin et ai-, [Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 82 ( 1985) 1931 - 1935] ja Ohtsukan et ai-, [J. Biol. Chem. 260 (1985) 2605 - 2608] julkaistuihin töihin. Inosiinilla voi kuitenkin olla destabiloiva vaikutus, jos se emäspariutuu G:n tai T:n kanssa. Takahashin ei 5 a]., työssä inosiineilla saattaa näyttää olevan neutraali vaikutus, koska ne ryh mänä ovat keskimäärin lähellä neutraalia (esimerkiksi kolme on suosinut pariutumista C:n kanssa, ja kaksi ei pariudu helposti T:n kanssa).

I:iden ja G:iden välisten emäsparien vaikutuksen tutkimiseksi suunniteltiin vertailukokeita, joissa käytettiin N-myc-geenisekvenssiä ja -kloonia. 10 N-myc-geenistä poimituilla sekvensseillä oli sama G:n ja C:n kokonaissisältö kunkin kodonin kahdessa ensimmäisessä asemassa kuin minkä hpG-CSF-koettimet määräsivät. N-myc-testikoettimet olivat siten samanpituisia, sisälsivät l:t samoissa suhteellisissa asemissa, ja niillä oli mahdollisesti sama keskimääräinen Tm (sulamislämpötila) (62 - 66 °C, jakson sisältämien 3 tai 4 inosii-15 niryhmän vaikutusta ei oteta huomioon) kuin hpG-CSF-koettimilla.

Muodostettiin kaksi ryhmää N-myc-testikoettimia Caruthersin et el-, (supra) menetelmällä. Ryhmä I, joka esitetään taulukossa VI, sisälsi; 1. täydellisesti yhteensopivan 23-meerin; 23-meerin, jossa kolme kodonin kolmannessa asemassa olevaa C:tä oli korvattu kiliä, jolloin muodostui pahin mahdollinen 20 kiden lisäämistapaus; ja 3. 23-meerin, jossa neljä kodonin kolmannessa ase-; massa olevaa C:tä oli korvattu kiila. Toinen ryhmä testikoettimia suunniteltiin edustamaan sattumanvaraisempaa inosiiniemäsparien jakautumaa, jolla saattaisi olla neutraali kokonaisvaikutus emäspariutumisen suhteen. Taulukossa VI esitetty ryhmä II sisälsi: 4. 23-meerin, joka sisälsi kaksi C:n kanssa pariutuvaa 25 ktä ja yhden G:n kanssa pariutuvan kn; ja 5. 4:n kanssa muuten identtisen ' 23-meerin, johon oli kuitenkin lisätty vielä yksi kG-emäspari.

Taulukko VI

N-myc-testikoettimet l. 5’cac aac tat gcc gcc ccc tcc cc3’ V 30 : . 2. 5'cac aac tat gci gcc cci tci cc3' :·· 3. 5'cAI AAC TAT GCI GCC CCI TCI CC3' 35 4. 5'aac GAG CTG TGI GGC AGI cci gc3' 5. 5'äAI GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3 ' 14 110576

Viittä replikasuodatinta, jotka sisälsivät N-myc-DNA-sekvenssejä ja kanan kasvuhormonia vastaavia DNA-sekvenssejä (negatiivisena vertailunäyt-teenä) pidettiin vakuumiuunissa 80 °C:ssa 2 tuntia ennen hybridisaatiota. Kaikki suodattimet hybridisoitiin esimerkissä 4 hpG-CSF-koettimien yhteydessä ku-5 vattavalla tavalla; hybridisaatioaika oli kuitenkin vain 6 tuntia. Suodattimet pestiin kolmesti huoneenlämpötilassa ja sitten kerran 45 °C:ssa 10 min kerrallaan. Suodattimet tutkittiin Geiger-laskurilla.

N-myc-koetinta 3 edustava suodatin antoi hyvin heikon signaalin muihin neljään tutkittuun suodattimeen verrattuna, eikä sitä pesty enää. Kun 10 suodattimia oli pesty 10 min 50 °C:ssa, Geiger-laskurilla saatiin seuraavat prosentuaaliset signaalit merkittäessä koettimen 1 signaalia 100 %:lla: koetin 2, 20 %: koetin 3 (45 °C) 2 %: koetin 4, 92 %; ja koetin 5, 75 %. Kun suodattimia oli pesty 55 °C:ssa, prosenttiluvut olivat: koetin 2, 16 %: koetin 4, 100 %; koetin 5, 80 %. Viimeisen pesun jälkeen (60 °C) saatiin seuraavat prosenttiluvut: 15 koetin 2, 1,6 %; koetin 4, 90 %; koetin 5, 70 %.

Kolmen l:n läsnä ollessa, kuten koettimissa 2 ja 4, havaitaan siten jopa 60-kertainen ero signaalissa saavutettaessa teoreettinen Tm (l:itä ei ole otettu mukaan laskussa) [perustuu pahimman tapauksen l-emäspariutumiseen (koetin 2) ja suhteellisen neutraaliin l-emäspariutumiseen (koetin 4)].

20 N-myc-testihybridisaatioissa saatuja standardisointitietoja käytettiin : hyväksi pesussa ja hpG-CSF-hybridisaation seuraamisessa jäljempänä ku vattavalla tavalla sen arvioimiseen, kuinka luotettavina voitaisiin pitää tuloksia, : ’ jotka saadaan vähemmän ankarissa pesuolosuhteissa.

Esimerkki 4 » · I % . . 25 Noudattaen Hanahanin et ai-, [J. Mol. Biol. 166 (1983) 557 - 580] levitettiin bakteereja, jotka sisälsivät esimerkin 2 mukaisesti valmistettuja cDNA-inserttejä, 24 nitroselluloosasuodattimelle (Millipore, Bedford, Massachusetts), jotka oli laitettu agarmaljoille. Maljoja inkuboitiin sitten siten, että saatiin noin 150 000 pesäkettä, jotka replikasiirrostettiin toisille 24 nitrosellu-30 loosasuodattimelle. Replikamaljoja inkuboitiin, kunnes ilmaantui erottuvia pesäkkeitä. Suodattimilla olevat bakteerit hajotettiin Whatman 3 MM -paperiar-'· · keillä, jotka oli juuri ja juuri kyllästetty natriumhydroksidilla (0,5 M), 10 min ja käsiteltiin sitten 2 min Tris-liuoksella (1 M) ja sen jälkeen 10 min Tris-liuoksella (0,5 M), joka sisälsi NaCl.a (1,5 mol/l). Kun suodattimet olivat lähes kuivat, :·' ‘ 35 niitä pidettiin 2 tuntia lämpötilassa 80 °C vakuumiuunissa ennen nukleiinihap- pohybridisaatiota [Wahl et aL, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76 (1979) 3683 -3687); Maniatis ei ai-, Cell 81 (1976) 163- 182].

„ 110576 15

Suodattimia esihybridisoitiin 2 tuntia lämpötilassa 65 °C 750 ml:ssa liuosta 10 x Denhardt, 0,2 % SDS:ää ja 6 x SSC. Suodattimet huuhdottiin 6 x SSC:llä, pakattiin sitten pusseihin (4 kpl/pussi) ja hybridisoitiin 14 tuntia liuoksessa 6 x SSC, 10 x Denhardt. Pussissa, joka sisälsi 50 x 106 pulssia/min 5 32P-leimattua koetinta (oligonukleotideja), oli noin 15 ml liuosta.

Hybridisaation jälkeen suodattimia pestiin kolmesti 10 min 6 x SSC:llä (1 l/pesukerta) huoneenlämpötilassa. Sitten suodattimia pestiin kahdesti 15 min lämpötilassa 45 °C, kerran 15 min lämpötilassa 50 °C ja kerran 15 min lämpötilassa 55 °C käyttäen kuhunkin pesuun 1 litra 6 x SSC.tä. Suo-10 dattimille tehtiin 2 tunnin pituinen autoradiografia-lämpötilassa -70 °C käyttämällä kuvanvahvistuslevyä ja Kodak XAR-2 -filmiä. Tässä autoradiografiassa detektoitiin 40 - 50 positiivista signaalia, joissa 5 oli hyvin voimakkaita.

Alueet, jotka sisälsivät viisi voimakkainta signaalia, ja viisi muuta positiivista aluetta kaavittiin alkuperäisiltä maljoilta ja siirrostettiin toista tutki-15 mistä varten, jossa käytettiin samaa koetinseosta samoissa olosuhteissa. Pesu menettely erosi edellisestä siinä suhteessa, että korkeassa lämpötilassa tehdyt pesut koostuivat kahdesta 15 min:n pesusta lämpötilassa 55 °C ja sitten yhdestä 15 min:n pesusta lämpötilassa 60 °C. Esimerkin 3 mukaisen N-myc-koetintutkimuksen perusteella nostettiin viimeisen pesun lämpötilaa toisessa 20 tutkimuksessa, koska aggregaatin sulamislämpötila näillä 24:llä 23-meerillä oli ..; · 60 - 68 °C, sama kuin N-myc-koettimilla. Heti toisen lämpötilassa 55 °C tehdyn : ·' pesun jälkeen suodattimet jätettiin märiksi, ja tehtiin autoradiografia. Tämän j* ·' autoradiogrammin vertaaminen toiseen autoradiogrammiin, joka otettiin samal- .·* la säteilytysajalla viimeisen, lämpötilassa 60 °C tehdyn pesun jälkeen, osoitti, 25 että vain kahdella tutkituista 10 kloonista signaali ei heikentynyt oleellisesti . . lämpötilan noustessa 55:stä 60 °C:seen. Näiden kahden kloonin osoitettiin myöhemmin olevan lähes identtisiä pituutensa ja restriktioendonukleaasikart-tansa suhteen. Yksi klooni, josta käytetään merkintää Ppo2, valittiin sekven-toitavaksi.

30 Edellä kuvatulla menettelyllä saadun yhdistelmä-hpC-CSF-cDNA- :kloonin sekventointi tehtiin Sangerin et aj. dideoksimenetelmällä [Proc. Natl.

Acad. Sei. (USA) 74 (1977) 5463 - 6467]. Yksisäikeistä DNA-faagia M-13 käytettiin kloonausvektorina yksisäikeisten DNA-templaattien hankkimiseen kaksisäikeisistä cDNA-klooneista. Sangerin et aj., menetelmällä saatiin sek-35 venssi, joka esitetään taulukossa VII, jossa näkyy myös vastaava aminohap-: . t posekvenssi ja komplementaarinen säie polypeptidiä koodaavalla alueella.

16 1 10576 O Eh «J CUU 3 U U OUU u U U u dj Eh

u U U Hii i—f <C E-1 u u U >I< Eh £ U U

BiUO OUU UUU fcUO Eh Eh dj Eh dj Eh >iU u ajuu ouu muu suu au o hocjh i-h eh dj noo >iO u a; Eh dj m dj Eh U U U (0 H <J E1 HiUO U Eh dj JUU <c u u r-, a 2 d o u <1 moo muu uuu quo nuo

2 <U Eh dj >idj Eh ·Η dj Eh (UUU m Eh dj (U Eh «J

2 JUU JöjE-i KUU CO dj Eh m £h d3 U <

2 O U U - CPU U QUO nuo 3 E < u U O

u_, nuo ui U U ><U U QOU q Eh < JUU

_ CUUU dj tSj Eh U Eh dj CO dj En JUU Eh dj Eh

^ ^HuiUU rH U U SUU 3 U U >iU U O U U

to + m U O (0 Eh «J <U E-ι <C <U Eh dj r—i U U nuU

y e-i<e-i > u u juu juu uuu muu to muu e dj eh muu ouu ui u u o >,eh <

to rHUU O H öi En O >,dJ E-I OUiUU O <U U U OrHUU

U Ή < U U CNUUU T J «J EH VDOiUU COMCEi iHUUU

S a < eh suu u u u m eh < auu

En 1-hCEh 1—I dj Eh >I<J EH 1-HUU -nHdJEH (UEH< y UUU UUU Eh Eh dj dJUU muu JEH<

u CUU 3 dj EH UUU fXUU 3 U U 3 U U

y H dj E d)EH< muu ηυυ Q E < HdJE

y UUU J Eh <5 Eh dj En Eh Eh dj JUU UUU

y 1-HUU MUU (OUU OUU C dj Eh OUU

y ta Eh dj >,u U rHUU ηυυ -h<Eh uUU

y >uu ue<< «juu muu uuu muu

y ui < Eh MOO m Eh «J (UUU nuo uiUU

y muu >i«J EH >iU U -H Eh dj 0) U U OUU

y Eh < Eh J < £h U Eh dj M dj Eh CO dj £h W E < y auu 3 U U 3 U U >,UU 3UU muu y n U U Q)Eh< Q E “S rH U U m Eh dj hE<

y EHEHdJ JUU JUU UUU J Eh dj HdJE

H rn H y 3UU 3UU muu 3UU muu ShU u >My ω EH < 0JEh< >i dj Eh Q e < >iUU rH u u

... Mg JUU JUU J<EH JUU U E dj UUU

! ' O *""* c)

:. v Ό y (0 «J Eh m (UUU 3 U U u e dj >iUU 3 dj E

... AJCd* iHUUdJ m Eh dJ J dj Eh OUU rH O U iHdJEn

: · 3'h3 «JUU-h m EH UUU CO En dj UUU UUU

* ' rH ® C-ι O"

·· 3 tl u, EH «J m nuo CUU muu nj dj £h SUU

: m y <u u u ouu .h dj eh h<e juu q e <

*· Eh u CO dj Eh CO dj Eh UUU KUU JUU

S omuu CUU 3UU >< E< 3 U U (OUU

pj rH — ( dj Eh H dj E Q E dj rHUU Q E dj rHUU

.'· y imuu uuu juu uuu juu <uu

y au u ouu muu 3 U U CUU CUU

^ Ui u U OUlCJU OrHUU o<UEh< Ό ,—I dj E O rH dj E

I Eh E·' «I rH m U U m «J U U LOJUU t^UUU OUUU

. 3 U U 3 U U (0 dj E 3UU 3 U U 3UU

(N QE< <UE«J rHUU (U Eh dj q e C m Eh «J

^ -HJUU JUU «JUU JUU JUU JUU

-uuu >|U U rHUU (OUU 3UU

(UUU JUU (0 Eh dj rHUU (U Eh «J

CO Eh «J UUU >UU dj U U JUU

UUU aE dj 3 U U CUU >iU u

(UUU m dj Eh (U Eh dj rH «J Eh -HUU

.. COdJEn «JUU JUU UUU UUU

(OUU >iU U 3UU uuu CUU

rHUU rHUU rH dj Eh QOU .-HdJEH

.. «JUU UUU UUU C0«JEH uuu 17 1 10576 ί j

>1< Eh COU u CJ U U O U O U U

Ή U U I-H <33 Eh >i<33 Eh Eh U <3 < U <3

U CJ U CJ U CJ B Eh <33 <33 U U <£ U U

3UU moo u U U Eh «C U U U U

<UEh< .C Eh <33 OJ U O eh eg < u u u

Juu OiEh«£ CD £h <3j Eh U Eh <33 < Eh

3 <33 Eh (0 Eh <33 rH U U <33 <33 O Eh O CJ

H « Eh -H U U <ΰ Eh «ί Eh CJ Eh t£ Eh Eh uuu < o u >uu o o u 2 < δ

3 <3 Eh >h Eh <C 3ϋϋ Eh <33 CJ <33 U CJ

γΗ<Εη QJ U O <H <33 Eh <33 CJ CJ £h CJ <

CJCJCJ CP Eh <33 UUU CJ < Eh CJ CJ CJ

xj CJ U m U CJ 3 CJ CJ CJ < u CJ Eh £h QJ Eh < r-HCJCJ 0) Eh <33 CJ CJ CJ <33 CJ <S3 S3 <33 Eh <CJU JUCJ Eh CJ Eh Eh < £h

OCOC3 OJIUCJ OJIUO <4 CJ CJ <33 CJ CJ

<N Η <ΐ EH ^ £3 Eh <33 ΐύ J E <ί O <33 Eh CJ CJ <

•HCJCJCJ >—I di Eh <=C iH P-ι Eh <33 U U Eh <33 CJ CJ

CCJCJ 1X3 CJ CJ >hOCJ CJ <3j <33 ζ-ι CJ <

H <C E r-HCJCJ 0J U U CJ CJ U CJ Eh CJ

CJCJCJ CCJCJ UJCEh Eh C Eh CJ C Eh ao cj ocjcj cou cj c eh c c eh

ή O U h CJ O H C Eh CJ C Eh CJ CJ CJ

Eh Eh C (¾ CJ CJ CJCJCJ CJ Eh CJ CJ CJ CJ

OJCJCJ XJCJCJ 3 CJ CJ CJ EH < CJ Eh CJ

' I Eh C <UEh< <JEh< C Eh CJ Eh CJ <

M < Eh S < Eh JUCJ <33 C Eh U Eh CJ

>h U U (X3UCJ WEh< U Eh CJ < U U

-CUCJ <h U U ·ή<Εη U < Eh CJ CJ CJ

Λ Eh<Eh <33 U U 23 U U CJ U Eh cj CJ eh

3 n CJ U >iEh .33 WUCJ <£Eh eh Eh Eh Eh CJ

3 ruu CJ U O U O ftUU U <33 u U U

Eh <33 Eh CJCJO CD Eh < O E < U CJ U U <33

'3 3 IX3UCJ CCJCJ «J U O -a· O U U CJ CJ U U U

*'·* *f> Ή CJ U r-H C Eh H CJ CJ r~ J-i U CJ <3? Eh U CJ U

:*.· < o u oou <cuu hhuu «ί u eh < u • * H OJEhcC wi U CJ <H Eh <33 COU Eh u < o u [-1 jCEHefi x: CJ CJ (XJ Eh <33 <h <33 Eh Eh CJ U U Eh :. > O.EH< Eh <33 Eh > U U CJUU Eh Eh ,u u u o QCJU OOCJ 3 CJ U muu <33 EH u u u

·.. J3 ω <33 Eh 1-iCJCJ OJ Eh «33 rH CJ CJ Eh CJ Eh Eh CJ

«ί CJ CJ Ph CJ CJ JUO <33 U U u u u u < ‘ * * *

H Π3 CJ CJ C CJ U HCJC3 3 Eh <33 Eh Eh U CJ CJ

, · 3 i-HOCJ t—; <33 Eh (TJ Eh <33 OJ Eh <3! CJ CJ £h Eh Eh

ti < CJ U OUO > CJ U JUO Eh Eh CJ U U

c~t O rH CJ CJ 03CJU O >iCJ u O U1 u O <3j cj EH < u rH(XJEH< fH <U E-i <33 Ln fH CJ CJ Γ- -H <£ Eh Eh Eh U CJ Eh

<H > CJ U rHjUU rHUUU HKUO Eh U U Eh U

OhCJ cj <TJ U CJ >1< Eh CPU CJ Eh Eh Eh < U

tn<EH rH CJ CJ iHCJU HCJU <33 u U EH Eh

<33 CJ U < OU UUU <33 U U Eh U CJ U U

3 CJ U O Eh <33 . (X3CEH 3 <33 Eh <33 CJ 3 < < U

: . QJEh< HUO HUO QJ Eh «33 <33 cj H < Eh U

JUU OrUCJ <33 O U JUU Eh < Eh U

• C CJ u (0 U O CPU U rHEHrf Eh u <33 < o rH <3 £h iH U U HUU IX3EH«S Eh U < Eh <

UOU <UU <UU >OU < CJ U Eh U

3 CJ U hi CJ U CPU O CPU U Eh U <33 Eh Eh

QJ Eh <33 QJ Eh <33 HOU UOU U u U <33 U

·; JUO 53<Eh <UO <33UU Eh < Eh Eh Eh 18 110576 Ε-·<Ε-ι«3;ου<α e-'UrfcjcscdiE-*

CJE-i<<OU<U

uuod:oou<

E-iE-iUO^CE-iE-iU

OUdJUUUOU

ΟΟΟυοοΕ-ιΕ-ι puuuuE-i.ua jo

^EhUEhUE^E-iU

U^E^-UUUUU m &-<00<0UE-*U *5 <UUUE-iUUEh -g UUUE-iUE-iUU -¾ U U U E-ι U £-i U i-t E-ι .y U £h E-ι E-t U E-i 030 2 u < u o o < *= E-'UUOHUUUtia, E-iOUE-(U<E-<UuS: OEHO-iUUOrfJU^

e-iuoucoe-iue-iS

OUEh<UE-i<E-'Uq_ <u<a:o<oouoc:

UUU00UE-|<0<U

UOOOOU<UE-ig

<OUE-*OE^<UEh<D

yu<E-tUOOUE-*ro <ooe-<ehouuu+-: — <<OEHU<<U e-1^ 3 «ίοουυοουυί;

3 E-i<E-iö;uc3U<<lJ

M ~ +3 E-»UUOOO<CU<.^

to E^OO<E-i<U E^<P

π <E-t<<UU<EHE-t55 E-<UOE-IOUOU<-?

H <<ί<a:E^UU<E-trf:Q

H COUUEHUUUE-Itro ...: ε-·ουΗυοου<:$

... o E-|U0E-iE-i<«a:<0'C

• · ^ EhOOUEhEhOUU^ • * Φ

... 3 OcSEhEhEhEhOUi^O

: * -H E-t OOE-*E-<E-<OE-iUCO

• * 3 u E-I O EH E-I EH d! U E-ii : E-t UU<MOEhO UE-<oj ··> UUOE^EnUUUu'’^ .... ^0<0UE^U<< +

< OUUUUE-<U<<i· <Ε-·ΟΕηΕη<ΟΕ-ιΟ^ dJUCUUOE-tOE-tO

Q.

OE-t<E-t£HEH<i^Uc= <UUCOOOU*£a5 <<<<ΕΗΕπΟ«3:3<η UUOOOUOUEH=ro < E-I O O U C O U OF OUE-iO<OE^EhE-iq3 <U'UOOOUUE-i£

• OUUE^UC.dlO^S

ουυυυυο<υν o ο <υο<ΕΗθ<<ιο ,. E-ι UOE-iUUOUUT" OOOE-iE-iUOOE-i ^ ( ( 19 110576

Taulukon VII mukaisen sekvenssin seuraavat ominaispiirteet ovat mainitsemisen arvoisia. Sekvenssin 5'-päässä on emäksiä, jotka vastaavat polyG-cDNA-kytkijän emäksiä. Sitten on noin viisi emästä (joista käytetään merkintää "N"), joiden sekvenssiä ei ollut helppo määrittää yksiselitteisesti 5 Sangerin et ai., menetelmällä edeltävien useiden G:iden vuoksi. Sen jälkeen tulee 12 kodonin sarja, joka koodaa osaa polypeptidin oletetusta esijaksosta. Esimerkissä 1 kuvattujen luonnosta eristettyjen hpCSF:ien aminoterminaalisen sekvenssin perusteella osoitetaan oletetun "valmiin" hpG-CSF:n ensimmäinen treoniiniryhmä numerolla +1. Sitä seuraa valmis hpG-CSF, joka sisältää kuvios-10 sa esitetyt 174 ryhmää. "Lopetuskodonin" (OP-kodoni, TGA) jälkeen on noin 856 emäksen verran luetuksi tulematonta 3-pään sekvenssiä ja useista A:ista koostuva polyA-"häntä". Taulukossa VII näkyvät myös ainutkertaiset HgiAi- ja Apal-restriktioendonukleaasien tunnistuskohdat samoin kuin kaksi Stul-kohtaa (joita käsitellään tässä hakemuksessa prokaryoottisten ja eukaryoottisten il-15 mentymisjärjestelmien konstruoinnin yhteydessä). Koska polypeptidistä puuttuvat asparagiiniryhmät, ei siinä ole ilmeisiä N-glykosyloitumiskohtia. Alleviivatut 6 emästä lähellä 3'-pään luetuksi tulemattoman sekvenssin loppua edustavat mahdollista polyadenylaatiokohtaa.

On huomionarvoista, ettei kumpikaan kahdesta muusta cDNA-20 kloonista, jotka identifioitiin edellä kuvatuilla hybridisaatiomenettelyillä kaikki-v aan 450 000 kloonin joukosta, sisältynyt koko esijaksoa koodaavaa DNA:ta ! transkription aloituskohdasta eteenpäin. Itse asiassa kaikki kolme hpG-CSF- kloonia päättyivät 5'-päässä täsmälleen samassa kohdassa, mikä osoittaa, että kopioidun mRNA sekundaarirakenne estää voimakkaasti cDNA:n muodos- « t 25 tumisen tästä kohdasta taaksepäin. Käytännössä tämä merkitsee sitä, ettei Okayaman et a[·, [Mol. and Cell. Biol. 3 (1983) 280 - 289] kuvaaman kaltaista cDNA-ilmentymistutkimusta, jotka käytettiin GM-CSF:n eristämiseen [Wong et ai., Science 228 (1985) 810 - 814], olisi helposti voitu käyttää hpCSF-DNA:n eristämiseen, koska tällaiset eristysjärjestelmät tavallisesti edellyttävät täyspit- ;" ’. 30 kän cDNA-transkriptin läsnäoloa tutkittavissa klooneissa.

.·* Edellä esitetyn sekvenssin ei voida helposti odottaa varmistavan * hpG-CSF-geenin suoraa ilmentymistä mikrobi-isännässä. Tällaisen ilmentymi sen varmistamiseksi hpG-CSF:ää koodaava alue tulisi varustaa aloituskodo-nilla ATG, ja sekvenssi tulisi insertoida transformaatiovektoriin kohtaan, joka 35 on sopivan promoottori-/regulaattori-DNA-sekvenssin ohjauksen alaisena.

* 20 1 10576

Esimerkki 5 Tässä esimerkissä käytettiin edellisessä esimerkissä eristettyä hpG-CSF:ää koodaavaa cDNA:ta genomikloonin etsimiseen. Ihmissikiön maksasta valmistettu lambdafaagigenomikirjasto [valmistettu Lawnin et ai., mene-5 telmällä [Cell 15 (1978) 1157 - 1174] ja saatu T. Maniatisilta] tutkittiin käyttämällä nick-luettua koetinta, joka koostui kahdesta hpG-CSF-fragmentista, jotka oli eristetty pilkkomalla HgiAkllä ja Stul.llä (HgiAl - Stul, 649 emäsparia; Stul -Stul, 639 emäsparia). Kaikkiaan noin 500 000 faagia siirrostettiin petrimaljoille (12 kpl, 15 cm), kasvatettiin pesäkkeet ja hybridisoitiin ne koettimen kanssa 10 käyttämällä Benton/Davison-menettelyä [Benton et ai., Science 196 (1977) 180]. Kolme kloonia (1 - 3), jotka antoivat toisessa tutkimuksessa voimakkaimmat autoradiografiasignaalit, kasvatettiin 1 litran viljelminä ja kartoitettiin pilkkomalla restriktioentsyymeillä ja tekemällä Southern-täpläanalyysi, jossa käytettiin radioleimattua 24-meerioligonukleotidia (merkkiaineena γ-32Ρ-ΑΤΡ) 15 5'CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3'. Kartoitustulokset osoittivat, että eristetyt kloonit 1 ja 3 olivat identtisiä ja klooni 2 sisälsi 2 000 lisäemästä hpG-CSF-geenin 5-puolella. Kloonia 2 käytettiin sen vuoksi jatkokarakterisointiin.

Kloonin 2 DNA pilkottiin EcoR1 :llä hpG-CSF-geenin sisältävän 8 500 20 emäsparin (ep) pituisen fragmentin vapauttamiseksi, joka sitten alakloonattiin pBR322:een ja kartoitettiin tarkemmin pilkkomalla restriktioentsyymeillä, teke-: mällä Southern Blotting -tutkimus, M13-alakloonaus ja sekventointi. Saatu :"' · sekvenssi esitetään taulukossa Vili.

2i 110576 j ( o o O O O O o O O o O O O o ή <N ro tj* in us u u o t* se ti ju u o u o o u U 3 0 ^ < U O HU E* «En

H CJ U O EU U t< JU

t*0<0HCJ Oco U O C tl <U O O rH < < o u < en e u ou

UOUCJ CO O US 3 O

UHtu ih < u^tajf

U O Ei ti OU E-I I J O

E-ι O O U HU C «JU

U O E-ι O SZ U O rH U

o El tl O Eh C O o

C U £h _ O «JU O C

UUE-|< rHU O U

HOE-IO CO El U

youuoti u o <<OU HCJ o u OUCE-I EU O O Eh

y E-I O U >,c O O

UtlCU r-IO O El

y C C tl OO C U

yu eti fl E-ι O tl <UUEh #-H u e u y o o e co u o COUCojjo e u

UotiE-iroaiE-i o u U o E-ι O I S C E-I o

O E-ι E-I O U O O

e O O e U EH C

y ti e o u o o cucu e o ti y e e u o eh u < u e u e o u

y C U O U O EH

y e e o u o o

< C U EH U C EH

O U f o C O O

< Eh Eh U U O Eh

U Eh Eh Eh U O C

U O C O U C U

O f e e u o o

Eh U U ti O O C

U EH e El C O U

H ti Eh U U U Eh e£

HOOUU U C C

M C Eh Eh O U U O

>CUEHC o o o • o o e e e o o n^COEn U EH e hi^JUCU O U Eh -76 U Eh O C EH u o

U Eh C Eh U o O

SUOUEh U o EH

iHUEhEhC O Eh O

3 O Eh C Ei C O O

(Ö Eh Eh O Ei O U C

EhUUOO o o u

C O C e U u EH

u o o e u u u ccoo u o u o a e o o e o

• O EH e O C O O

< U C El U e O

e o u u e o e

e O Eh u C O O

U U O El e o C

O O U e e EH o o e e e u e u o u o e u o u

O El Ο Eh U o U

e e o e u e u O EH o U O U f e u e o o u o O EH e EH O O f

; · O O U Eh Eh O O

. ’ C U O Eh U O C

C O O C O Eh U

: e O O e C El U

u e o e o u u , . U U O u C Eh e

U U O U Eh O U

Ei Eh C C U f O

C Eh O U U O O

C U f C U C C

---- O O f O U O C

' · C U f O U Eh C

O U O Eh O O Eh .. Eh O C Eh OCO Eh

· EnfOU O co -u O C

. " U O O Eh < HUE O

... OUOO CISC O

O Eh C Eh C 30 O

CUCEh t· OI Eh O

UOOC C i-3 U Eh

CUUU EHO CIU C

OCCO O (N >, C C

O U O Ei EhiJC O

OCOCJ e 4JO o

OUOU tl 01 El O

22 1 10576 o o o o o o o o o o o o o h <n n

CO rH (H rH -H

(OH O H O U «£ O

> o o u h o au OC< UUUO u u

(N -h O < O U 8-i H

U U «< o o «ΐ OO

3 0 «S O O U u U

H < H < O U SO

ou uuno au

3 < UUUO rH H

an < < < u i-t<

J H OUOU >, U

« O- «£ O < U r-(U

>i O O O O < uu

UH O O < O 3U

mu uhuu aH

5* < O H H U J U

J «S H O < O u 8-i 3 U O «£ O U au an o o < o μη

J U U O O «£ MU

30 UUHU ~t«£ an U <£ O O su J υ o 3 h «i >, < au «fi o u < -ho

JS H < O U O UO

SH O O U O o 3 U

u U O H U O m a H

au ouou j o m «£ <c o o u 30 co ooou an

H < O «£ «£ < J U

OU H «2 -3 O »H o

a o u OOUO (tj H

3 r-iuu H O O «S >u 3 SU UOOO 30 >> co oo-oo an

+J an O H <£ O J U

Z, J u o u 2 o 30 u u < o 2 o -te π au o<oh oo - MH < O < O 30 h u o o o < -h < H ao H H o o oo

H M < O O < < OU

H (OU OCUO u U

> -Hu ouh< su n OH O < < u < H u u o o u < su

-5 su < o < o MU

·* >1 U O < U < >1 O

3 -H O* H H H *£ UH

-H OO O H «£ 2 30 3 30 < < u o an (O an ohoo j u

H J U H «£ O O O M O

OU O 2 < O τ >. < UU in 3 o O O < J 2 ·· sunaH<oo uu H u U (-5 U O H O >|«£

. + S U MO O O O HH

Η«ί S-i < O < < UU

-H(OU J2HOO su

Ir-tu 30 < O O H «S

<0 -HöIUOH au

3 «S O O < H < -HU

-h 2 c o o 2 u <u

OO <H 2 O O 2 io m H

CO OU O O O m >, O

-H 2 3 U 2 O O UH

ou a H 2 H 2 o rHO J U O U U 2 , (OHomouou u

>0 n-HU H O O U

·.· U< «CO U H H U

, SU (O 2 H U U U

. " H 2 -HUUO U H

ao 2 o u o o <

UO >1 U H O 2 U

HH »H O 2 2 U U

30 O O U O 2 H

an an < o < h J U M 2 2 O O u <0 2 2 0 U U H u

• · »HU >1 U U H U H

2 0 -HOOU< «£

n H O O O O 2 U

.. aocouHo o ; en 2 »h 2 2 O O 2

, O M U O U U 2 2 U

-H -h 2 auouu H

ISU <h H H 2 2 U

ao m<uoo <

uo 01O«£O< U

HH > 2 2 O U H

30 J 2 O O O U

an O' O O H O H

JU u o H O O O

30 2 2 2 0 2 2 an -hoohu o 110576 O O O O o O o O O o 'Tm vo p» oo rH M M M i—| i O e C C O o o o

l U M .£ O M U O 3 C

ί O O CJ H (Q ^ EH M <J

f E< (J U H > O < CJ O

I C Cl O a U E-< M jj o u en c m C o ch ai e< I 030 CO E-· i-4 s <

CJ <U E-* 3 0 O O

c u e ω h eh c

CJ mu U U U CJ

C >, O CO u C

C U E· M C O U

O >1 CJ O U O CJ

O "-to 3 0 CJ o

C O O 0) Ei U CJ

o cm « c u u a cj

Or'—iCJ u < O E-· c c o js u c E" CJ o Eh C CJ £h c c au c u cj u mc u o CJ C CO u c C CJ 3 0 c o C En oj 6-· u c

CJ O .J E-I O U

O E-I u U O E-I

O O JS u o c o e El C E-I o

CJ U O U U EH

C E-I 1-1 U E" U

CJ U CU U E-I c

CJ O o >, E-I C U

C U <3 M O U U

3 U U »H o O O C

3 E" Ei 3 0 O C

V “5 E-· U E Ei U

5 < U U Ei U U

t, Ei E-i 3 0 O U

10 U U r-4 C E-ι O

•i~i O C O O O O

^ CJ c O u u o

C E-i i-ι U Ei C

h C u au o c

H E* U Ui U O O

h < u mu C c • 3, cj u en Ei c u ^ o u ai u u E·

• 0 C C 1-4 E U U

υ C u m c o c -¾ C O >1 o o u

> O C 1-4 0 E-I U

. 3 CJ U O O O U

H C O 3 C O O

. 3 U . O M C O U

rt E-ι C CJ O C C

lZ CJ U 3 CJ U 3 ^ E-· Ei aj E· O E-i

O U U U O C

C E-· <0 U O C

CJ C M U E" E<

E-i E-ι CU E-ι O

O O O C O O E-i . --I30 U σι r-4 C E-ι E·

Γ' a E C OU Ei EH

U U O 3 0 U C

OCO EH <U Eh cj u r- -H C U U U O Ei O U U 3 u c u 3 0 o <υ Ei o u ai eh o u u e*4 eh U U O >1 O O Eh

flJU O rH O OCO EH

rH U O O O CN 1-4 c C

:·. CO EH CO-HOU U

• · CO U M < CO O

' rH C O UU rH< C

,·· OU C UU OU u • uu C >rc a o u

'· <U O U EH EH u O U

·· M C U 3 U Eh Eh U

... OU E* <1>Eh <UU U

UU Eh UU rH Eh O

au o mu mc c

mu O JS EH uu U

>|U C aE< JS U Eh

U Eh U 3 Eh Eh C U

·· u CJ CJ «EhuU Eh

;·, OJO Eh UU JSU U

· en e u >iU Ehc o U U Eh mo nj U Eh

· (UU O O CJ MU C

en C Eh o u u CO U

30 e co <U O ti e U

(UEh O en C JS Ei Eh

UU U (0 Eh a Eh O

oou O M e au Eh ό u u o s ci mc u au u 3 u co u

<0 Eh EH «Eh (OU U

MU U UU MU U

I 110576 j 24

O OOOOOOO

o OOOOOOO

σ\ ο ή <n m ·*τ in vo

F-ι CN (N (N <N (N ΓΗ <N

H < Eh O U U Eh O Eh ' EC U < U U < Eh < u c U Eh U Eh < O U Eh 0)0 < Eh O O O < u w Eh < u u < u < < <u u eh u u u u eh u --ia eh eh u < eh eh u < U Eh O < U < O <

H Eh < Eh U U O Eh O

10 H Eh Eh U U U Eh Eh

> U O < O Eh Eh O U

a U E-<UUC3UHU

0) Eh “ O Eh Eh O O Eh U

JO Eh Eh U < O Eh <

<-* U < Eh U Ο Ο Eh U

C Eh Eh U Eh O U Eh O

> u eh < ο u u u <

o >1 t3 Eh U < Eh O O U

un >h O < Eh U O U Eh O

ή U U Eh O Eh Eh < Ο O

>< < U Eh < U O Eh O

*-· U Eh Eh £h U < < O

ϋ ϋ < Eh Ο < Ο < O

<o < o < < o u u eh *-* CJ O Ο Eh Ε< Eh U Ο < ö o u eh < ο o ο σ> U Eh Eh < Eh < O Ο

c O < Ο Eh O O Eh U

< ο ο ο eh < ο ο εη en ο o o Eh u ο ο ο

c O O Eh < < U Eh O

< O O Eh Eh U < Eh <

CU Eh O O Eh O Eh O

r-H < O O < Eh Eh < < a uu o eh < o o < o 3 0)0 uuuuuuu

ri -e £h UEhUUUUU

7Ί .cueh < u < < u < o z~ Ό&Η «CHEhUEhUEh *c r-1 O o o < o o o o < u uh<4uehuu c £h o o < eh o eh o

0)U < O Eh O < U O

h en Eh O.UOOUOUEh

h <au OEhUU<EhUU

. <-<u-'rou<<uuoo

;· iT < O n» u u . O Eh U O Eh U

. 00)0 rHOiO O < O O O EH

. _ ^ -C Eh cuouuouu O ή O. Eh >-h < O < H < o Eh X Π30 UOUEhUOUEh , x ήο <tjo<uuuueh es < o i-huouuehhh

iH ou <UU<<EH<EH

, 3 CO 3EHOUUOOU

« 0.0 0)Eh<UEhOUEh

, 4-IU JO<UOEhUO

^ 0) H oenu u &H O U < O

S<[''-h<<OEhUUEh (OO rHXO o < u u u o rHu cnuuou&HUEn

• <U cU<UEhOEhU

>1 Eh <0 U £h o Eh o Eh HU a < < O O < u u

UU 0)Eh<OOU<U

CU ►oouuuuu< H < HEH u o u o < u

UU <0 Eh U Eh < O O O

CO >0<<UEhOO

JOO eno O O Eh EH u <

Eh< cO<UUUUO

OU <OUOEhEhEhEh CO cO<EhOUU<

0.0 >1<<UU<0U

ocu eh.En <ou o << • nrH< CU EH Eh O U U <

·· «H O O 0)OEhUU<<U

: au WEhEhEh<OOU

*· 0) Eh r-i0<uu<00

· JO <0EHEHUEH<<O

<0U >U<Eh<<<Eh r—i o au O O O Eh o o <U H<EHUUEH<<

OEh UU O < U Eh U U

': * ·. CO aUO<EH<UEH

0.0 0)EhU<UEhEhEh

«JO C1U<<<<OEH

*· HUOOJU<<U<UU

:·, <U onEH EH U U EH O O

* 4J U H 0. Eh E< < U EH O Eh 0) Eh CU Eh U U Eh O <

X < Q)U < Eh £h U O U

>,< W<EHU<EH<< hu cuu<<ouu

UU H< Eh U O U Eh U

au uuuuuouu

0) Eh aUEH<£HEHEHEH

O O 0)Eh < Eh O < U £h a< CJOEhUEh<UEh H < 01 Eh Eh Eh O < U E4 25 110576 o o o o o oooor-r- co σ\ o o <n cn cn m m E· CJ E* E-i

O <C O CJ

Ei «£ CJ < a 3 < E* a ei a cj cj «c cj cj cj < a <

<C E-t <C CJ

CJ < CJ CJ

H CJ «S < cj cj a cj EH < u El

< O CJ CJ

CJ · E-< cj E-i E-i E-· < < < CJ CJ Ei < < < E-i CJ <. CJ E< CJ CJ CJ <

< E-I CJ E-I

o a e-< < a < cj a «C *3 CJ < a e-i o a

<C CJ < CJ

CJ E-I «2 <

*C E-I CJ E-I

CJ < E-< H

o cj a cj < < CJ u cj cj cj u a CJ Eh E-· E-i <

CJ CJ CJ E< CJ

«S E-ι CJ C CJ

CJ CJ < CJ E-·

^ CJ < CJ E-I CJ

= CJ CJ CJ E-· <

3 E-ι CJ O < CJ

rl CJ E-· CJ U CJ

•f, E-ι CJ E-ι «i E-i

i" < CJ CJ CJ CJ

Cu CJ CJ CJ E-ι E-i -rn CJ CJ CJ CJ <£ — CJ E-ι CJ E-· <

CJ CJ CJ CJ CJ

H Ei E-i < CJ CJ

H CJ CJ CJ E-· E" M < < CJ E« <

CJ CJ CJ CJ CJ

. ^ CJ CJ CJ <£ <

„ CJ < Ei < CJ

o CJ CJ CJ CJ <

. El E-I U El O

, X < CJ CJ CJ CJ

3 CJ < E-i E-ι CJ

r—f CJ O CJ E-ι «C

3 E-I a CJ CJ «£

m CJ Cj E-I «£ CJ

S cj o cj < <

Eh U CJ < <

E-I CJ < CJ CJ

CJ < CJ CJ CJ

o a cj «i cj CJ E-ι E-· CJ <

E-I E-I CJ O CJ

* E-I O < «£ CJ

E-I E< a o <

«ί U El CJ O

CJ CJ El < <

< < CJ CJ CJ

cj a e-i cj <

CJ CJ El CJ CJ

E-I El CJ < CJ

CJ CJ CJ U CJ

a cj E-· u cj CJ .CJ CJ E-I El

; * , E-i *£ CJ CJ CJ

. CJ CJ El CJ CJ

. CJ E-I E-I < E-I

: < cj u cj o CJ E-· CJ CJ «c CJ CJ E-i < < CJ < CJ CJ El " > < cj cj cj a

CJ CJ < CJ CJ

CJ E· U CJ CJ

; · · CJ U E-I El CJ

o cj cj a E·

. . CJ < < E-I U

eC «C CJ CJ CJ

; > E-I CJ CJ CJ a

En CJ e-i < < E· < cj a cj E" cj cj < e· 2 a < u

O CJ El CJ CJ

E-I E* E-I CJ El

CJ CJ El CJ O

< E* CJ CJ E-· cj cj E" cj a „ 110576 26 hpG-CSF-geenin sisältävän genomi-DNA:n restriktioendonukleaasi-kartta (noin 3,4 kiloemäsparia) esitetään yksityiskohtaisesti kuviossa 1. Kuviossa 1 näkyvät restriktioendonukleaasit ovat: Ncol, N; Pstl, P; BamHI, B; Apal, A; Xhol, X; Kpn, K. Kartan alapuolella olevat nuolet osoittavat genomi-5 sekvenssin selvittämiseen käytetyn sekventointistrategian. Laatikoilla merkityt alueet ovat cDNA-kloonissa esiintyviä alueita, ja varjostettu päästä avoin laatikko edustaa sekvenssiä, joka ei esiinny cDNA-kloonissa, mutta identifioitiin tutkimalla mRNA-täpliä koettimilla. Eksonille nro 1 ehdotettujen koodaavien sekvenssien identifiointi tehtiin Northern-täpläanalyysillä. 24-meerinen oligonuk-10 leotidikoetin, 5'CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3\ joka kattaa ennustetut eksonien 1 ja 2 silmukoitumiskohdat, hybridisoitiin hpG-CSF-mRNA:n kanssa Northern-täplämuodossa. Tuloksena olevassa täplässä näkyy samankokoinen (noin 1 650 ep) mRNA kuin eksoni 2-oligonukleotidikoettimella. Nämä tulokset yhdistettyinä kykyyn ohjata pSVGM-Ppol-vektorista peräisin olevan hpG-CSF-15 geenin ilmentymistä (esimerkki 9), jossa käytetään taulukossa Vili esitettyä Met-aloituskodonia, määrittelevät eksonin 1 sisältämät koodaavat sekvenssit. Eksoneille 2 - 5 ovat ominaisia hpG-CSF-geenin (taulukko VII) cDNA-kloonista (Ppo2) saadut koodaavat jaksot.

Esimerkki 6 ·'·* 20 Tämä esimerkki koskee keinotekoisen geenin, joka koodaa :·.· hpG-CSF:ää ja sisältää E. colin kannalta etusijalla olevia kodoneja, valmis- .**· tusta.

» “ Lyhyesti ilmaistuna noudatettiin yleisesti ottaen tämän hakemuksen tekijän nimissä olevan PCT-julkaisun WO 83/04053 (Alton et ai.), joka maini-25 taan tässä viitteenä, mukaista menettelyä. Geenit suunniteltiin sillä tavalla, että komponenttioligonukleotideista koottiin ensin useita kaksoissäikeitä, joista puolestaan koottiin kolme erillistä jaksoa. Nämä jaksot suunniteltiin helposti lisättäviksi, ja ne voitiin amplifikaatiojärjestelmästä poistamisen jälkeen sijoittaa sopivaan ilmentymisvektoriin peräkkäin tai usean fragmentin samanaikaisella 30 ligaatiolla.

' * Jaksojen I, Il ja III konstruointia valaistaan taulukoissa IX - XIV.

Muodostettaessa jakso I, mitä valaistaan taulukoissa IX ja X, oligonukleoti-deista 1-14 koottiin 7 kaksoissäiettä (1 ja 8; 2 ja 9; 3 ja 10; 4 ja 11; 5 ja 12; 6 :’·. ja 13; 7 ja 14). Nämä 7 kaksoissäiettä ligatoitiin sitten taulukon X mukaiseksi 35 jaksoksi I. Taulukosta X on myös havaittavissa, että jakso I sisältää jakson alussa olevan tarttuvan Xbal-pään ja sen lopussa olevan tarttuvan BamHI- 27 110576 pään, jotka ovat käyttökelpoisia tehtäessä ligaatio amplifikaatio- ja ilmentymis-vektoreihin ja jaksoon II.

Taulukko IX

EChpG-CSFDNA -JAKSO I

CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAA 1 TAATGACTCCATTAGGTCCTGCTTCTTCT 2 CTGCCGCAAAGCTTTCTGCTGAAATGTCTGG 3 AACAGGTTCGTAAAATCCAGGGTGACGGT 4 10 GCTGCACTGCAAGAAAAACTGTGCGCTA 5 CTTACAAACTGTGCCATCCGGAAGAGC 6 TGGTACTGCTGGGTCATTCTCTTGG 7 CATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT 8 GCAGAGAAGAAGCAGGACCTAATGGAGT 9 15 TGTTCCAGACATTTCAGCAGAAAGCTTTGCG 10 CAGCACCGTCACCCTGGATTTTACGAACC 11 TAAGTAGCGCACAGTTTTTCTTGCAGTG 12 ACCAGCTCTTCCGGATGGCACAGTTTG 13 ' GATCCCAAGAGAATGACCCAGCAGT 14 ♦

9 a I

» · j ? p 110576

QUO O ou o U O

vO CJ U CM Eh <93 CO CJ U

Eh< HUU HEh< U U U U u o

Eh < Eh < < Eh u u u u eh <

Eh «93 U U U U

Eh <ί U U U U

a ϋ < EH Eh eC

Eh < U U U U

O Eh <93 o Eh < O CJ CJ

in U U H U U Γ' < Eh

U U <-H U U H O CJ

Eh < σν| OOHl <£Eh U U «93 Eh Ή | «93 Eh o| U U ^tU U DUH|

Eh < U U volO U

CMlCJ O Eh < U U

U CJ <93 Eh U U

< Eh < Eh Eh < O Eh < O < Eh a <93 Eh

htEh< 0<Εη Ό CJ CJ

*33 Eh <-H £h <£ H CJ O

a o cj cj cj cj CJ CJ U CJ Eh <

Eh < Eh <93 CJ CJ

CJ CJ Eh < Eh <

< Eh CJ a CJ CJ

CJ CJ CJ CJ <93 Eh

Eh < <93 Eh <93 Eh 0<£h OCJCJ O <93 Eh

m ΰ! Eh ctvCEh LficJO

Eh <3 <3 Eh i—I «93 Eh < Eh C CJ Eh <93 < Eh CJ CJ Eh <

< Eh Eh <93 CJ CJ

Eh < U CJ <93 Eh < Eh Eh < Eh <

< Eh CJ CJ CJ CJ

* Eh < Eh < CJ CJ

* * HH

*··* OCJCJ O «93 £h OCJCJ O CJ K

;·.* x CNCJCJ oo «a! £h -crcjo ο <93 E

• «3 Eh *£ £h <H E< <93 <—i Eh H3 * o o u cjcj cjcj u m

:·.* v< CJ CJ 00| Eh < Eh «3 CJCJ

* 3 < Eh U U U U CJCJ

,,, 3 <-H|< Eh n|CJ U Ol <£ Eh Eh <93 rH CJCJ Eh «93 i—1| <EhCN| Eh «93

,. 3 O CJ CJCJ in|<i Eh rH I UCJ

£ << <Eh Eh <93 <=C Eh Eh «93 e * r_" 2

Ω 0<Eh O £h eC 0<Eh O U CJ

, Cm iH«£Eh C" Eh <33 n CJ Cl cr> Eh < σΐ <5 Eh CJU h «f E< H &h <£ CJ «33 Eh CJU <Eh <93 Eh

I <EhM <93 Eh UCJ CJ CJ h3> I

U CJ <0 >93 Eh UU Eh <93 iH|

CU <93 XI < Eh Eh <3 MU U

X3 Eh X CJ CJ UCJ UCJ

U U UU <93Eh UU

W U U U U Eh <33 ' t 29 110576

Kuten taulukoista XI ja XII ilmenee, jaksoa II muodostettaessa oli-gonukleotidit 15-30 yhdistettiin 8 kaksoissäikeeksi (15 ja 23; 16 ja 24; 17 ja 25; 18 ja 26; 19 ja 27; 20 ja 28; 21 ja 29; 22 ja 30). Nämä 8 kaksoissäiettä ligatoi-tiin sitten jaksoksi II taulukon XII mukaisesti. Kuten taulukosta XII lisäksi ilme-5 nee, jakson II alussa on tarttuva BamHI-pää ja lopussa tarttuva EcoRI-pää, jotka ovat käyttökelpoisia ligaatiosssa amplifikaatiovektoriin ja jaksoon I. Jaksossa Il on loppupään lähellä myös Sstl-kohta, joka on käyttökelpoinen mahdollisessa ligaatiossa jaksoihin II ja III.

Taulukko XI

10

EChpG-CSFDNA -JAKSO II

GATCCCGTGGGCTCCGCTGTCTTCT 15 15 TGTCCATCTCAAGCTCTTCAGCTGGC 16 TGGTTGTCTGTCTCAACTGCATTCTGGT 17 CTGTTCCTGTATCAGGGTCTTCTG 18 CAAGCTCTGGAAGGTATCTCTCCGGA 19 . ACTGGGTCCGACTCTGGACACTCTGCA 20 ‘i 2Q GCTAGATGTAGCTGACTTTGCTACTACT 21 ; ATTTGGCAACAGATGGAAGAGCTCAAAG 22- GACAAGAAGACAGCGGAGCCCACGG 23 » » ACCAGCCAGCTGAAGAGCTTGAGATG 24 ACAGACCAGAATGCAGTTGAGACAGACA 25 CTTGCAGAAGACCCTGATACAGGA 26 CAGTTCCGGAGAGATACCTTCCAGAG 27 TAGCTGCAGAGTGTCCAGAGTCGGACC 28 AAATAGTAGTAGCAAAGTCAGCTACATC 29 AATTCTTTGAGCTCTTCCATCTGTTGCC 30 r » s * » t * · 110576 OCJ Ο O dj Eh o dj Eh νο Eh <£ cnEh< cd Eh «£

UU rH U U rH U U

E-< eC U U Γ-Ι U U

Eh cn|< Eh cm I E-· < σι I

U U r-HeC Eh Eh <. <N | U U U Ο γΗΙΕη dj

Eh < U U (N|u U

U U Eh <£ < Eh

U U U U U U

OUU O Eh < OEh<

LH Eh dj rHUU r- U U

UU rHUU rHUU

U U < Eh < Eh dj Eh < Eh Eh <

U U ^ U U U U

vo|Eh dj fN| U U Eh dj

γΗ|Εη < Eh dj C EH

u u u u u u

Eh < Eh dj < Eh

M

OUU O Eh < o Eh < Pi

U U OUU vo U U O

«£ Eh rHEH< rHUU O

dj Eh UUvol CEh UU oo |U U cm I UU <

Eh< rH|UU UU Eh U U dj Eh Eh dj Eh

Eh< UU UU UU

dJEn En< Eh dj <Eh .:. H uu <eh uu <eh X OUU o Eh <C o < Eh o dj Eh _ n Eh C OUU inUO H U U m :.· 0 UU El < rHeCEH CN Eh dj 4-> ·* EH< uu uu uuw

;·· ^ £h UU UUCQl UUU

• ·' 3 UU Eh < Eh «£ cn| eC Eh

Eh dj Eh «5 o|U U UUOl :: 5 eh *2 uu cn|eh < γηι^εηπΙ <0 UU Eh< UU Oj|<i Eh

..: Eh £-,,¾ U U dl Eh U U

H

H OUU O Eh < OUU OUU

CS EH < CO u U «JUU O Eh <=C

0 UU UU rHUU <N<Eh

ω U U ml Eh < Eh dj UU

X inlUUtNI UU UU <Eh

< rH|U U Eh «£ U U U U

hD Eh dj Eh dj UU <Eh 1 UU dj Eh vn| Eh dj dj Eh

U U t^|U U CNi U U U U

dj UU H |u U dj Eh UU

2

D OUU O Eh < O dj Eh OUU

Cu H Ei C P'UU ciUU o Eh dj · cn UU dj Eh rHUU rH £h dj U UU dj Eh UU Eh dj I UU UU UU dj Eh U U M Eh dj EndJ Eh dj

DU EnffiUU UU UU

C dj fc Eh dj EndJ dj Eh ···· U U«UU UU Eh dj

W PQ Eh dj Eh dj UU

31 1 10576

Lopuksi valmistettiin jakso III taulukoissa XIII ja XIV esitettävällä tavalla. Tätä varten oligonukleotideista 31-42 koottiin 6 kaksoissäiettä (31 ja 37; 32 ja 38; 33 ja 39; 34 ja 40; 35 ja 41; 36 ja 42). Nämä 6 kakoissäiettä ligatoitiin sitten taulukossa XIV esitettäväksi jaksoksi III. Kuten taulukosta myös ilmenee, 5 jakson III alkupäässä on tarttuva BamHI-pää ja lopussa tarttuva EcoRI-pää, jotka ovat käyttökelpoisia ligaatiossa amplifikaatiovektoriin, ja ainakin EcoRI-pään kyseessä ollessa, ilmentymisvektoriin. Jaksossa III on lisäksi alkupäässä Sstl-kohta, joka on käyttökelpoinen mahdollisessa ligaatiossa jaksoihin II ja III.

Taulukko XIII

10

EChpG-CSFDNA -JAKSO III

GATCCAAAGAGCTCGGTATGGCACCAG 31 15 CTCTGCAACCGACTCAAGGTGCTATGCCG 32 GCATTCGCTTCTGCATTCCAGCGTCGTGC 33 AGGAGGTGTACTGGTTGCTTCTCATCTG 34 CAATCTTTCCTGGAAGTATCTTACCGTGT 35 TCTGCGTCATCTGGCTCAGCCGTAATAG 36 ; 20 AGAGCTGGTGCCATACCGAGCTCTTTG 37 : · ATGCCGGCATAGCACCTTGAGTCGGTTGC 38 : TCCTGCACGACGCTGGAATGCAGAAGCGA 39 ATTGCAGATGAGAAGCAACCAGTACACC 40 CAGAACACGGTAAGATACTTCCAGGAAAG 41 AATTCTATTACGGCTGAGCCAGATGACG 42 32 1 10576 l i O / w ο < Eh o EH <

lOtJU cn U U

U U rH Eh < M

U U < Eh K

U O < Eh O

CJ U U U «ΐ ϋ

U U U U <3 W

Eh < Eh <C Eh < Eh U U Eh

Eh C Eh < U U

O U U 0<Eh OisCEh inuu rH U U Γ^Εη<

Eh <3 ιΗΕι<ΐΟ| -H<Eh U U UO'il «ί Eh U U C0| <3·|Εη <3 Eh < cn|«s; Eh H n Ieh < cj u

m|< Eh U U U U

U U O CJ CJ U

Eh < Eh <. O CJ CN I

U U Eh «£ <3 EH Ή

o Eh o CJ O O CJ CJ

'JUU O CJ CJ vOEh<

U U H Eh < HUU

a cj a cj cj cj

rf EH < Eh CJ CJ

5 eh Eh < O I £h <

U CJ O U m|U CJ

CJ CJ Eh < Eh <

Eh < CJ CJ < Eh

U CJ CJ CJ CJ CJ

OIEh <£ O < Eh O Eh <

m |cj CJ σ\ O CJ in CJ CJ

cj cj o cj μ cj cj

< Eh < Eh CJ CJ

CJ CJ CJ CJ Eh <

CJ CJ CJ CJ CJ CJ

> < Eh Eh Eh < H CJ CJ CJ CJ Eh < :· xi cj cj cj cj cj cj h U U Eh < Eh <

5 ä OEh< OCJU OCJU

3 CN < Eh COUCJ ^ O U

3 O E<iH UU r-H U U

rH m Cjuml <EH <ίH

3 y rH|CJ U U U CT, Eh <3 s U nlucj HU U H Eh <£

FH H Eh <3 M Heh t£ U U

? UCJ-U Eh «3 Eh< 1 CJ U W < Eh < Eh <C CE M UCJ Eh< 2

Q OCJU OCJU OCJU

fei H «£ Eh Γ" Eh < n «£ Eh

cn <2 Eh UU -HCEH

U <Eh Eh *£ OUHl

I U U Eh «5 U U H

CJ U m UU injEn <

tt Eh CC U U Ho U

js < e u u u u U U m Eh < Eh <£ W m Eh|< Eh < 33 ^576

Jakson I muodostama Xbal - BamHI -fragmentti ligatoidaan Xbakllä ja BamHUIä avattuun M13mp11-faagivektoriin. Vektori avataan sitten uudestaan pilkkomalla BamHUIä ja EcoRUIä, minkä jälkeen tehdään ligaatio jakson Il muodostaman BamHI - EcoRI -fragmentin kanssa. Tässä vaiheessa jaksot I 5 ja II on yhdistetty oikein orientoituneina. Seuraavaksi avataan toinen M13mp11-vektori pilkkomalla BamHUIä ja EcoRUIä ja ligatoidaan jakson III muodostaman BamHI - EcoRI -fragmentin kanssa.

Jaksot I ja II sisältävä vektori pilkotaan Xbakllä ja Sstkllä. Jakson III sisältävä vektori pilkotaan vastaavasti SStUlä ja EcoRUIä. Kummassakin piilo konnassa saaduista kahdesta fragmentista pienemmät ligatoidaan plasmidiin pCFM1156, joka on ennalta avattu Xbakllä ja EcoRUIä. Tämän reaktion tuloksena on ilmentymisplasmidi, joka sisältää jatkuvan, taulukossa XV esitettävän DNA-sekvenssin, joka koodaa koko hpG-CSF-polypeptidiä ja jossa on amino-terminaalinen metioniinikodoni (ATG) translaation aloittamiseksi E. colissa.

34 110576 3ΰ E-t OJ 30 3 Eh 30 CUEh Φ Eh >,< «,ρη φ Eh uh φ en ω εη φ Eh tn < μ ο ηο 2™ J υ ο< J U J U JO < ο < ο οο Η Εη Εη >- -η < <0 Εη 3 Εη 3 < Ο < φ < - ΓΠ Φ U Ο Ή <Π Εη HU Φ Εη Φ Εη η Ο (—i Ο ?. Η WE ΟΟ >0 < O J U J U B(U < o η Εη οα 30 C <£ >ι£η CO HJ < CT-Εη r.

ΦΟ <01 ΦΕη' -Η < γΗ Ο -η < HU u O

«E o< JO oo oo oo <o <o >5 ΦΕη Eh Sh 30 U E CO 30 4J O tTEn mc-.

1—1 O O -H rH< Φ U H < O) E ΦΕΗ HO

< O OO OO en Eh OO JO S< <o cju

O Eh OC 3 < 0< H Eh uEh >,Eh CO uM

>H O < rH rH <£ H O >1 < .CO -H O rH< ^ CEO OO OO 0*0 EhEh Eh< oo oo £7^

>tEh ΟΦ OO M EH 30 au 30 Φ O u IH

ΉΟ E H H O Sh O ΦΕη cn< ΦΕΗ K Eh niM

OO <m CU O O Eh JO <0 -HO CUEh $ ju 3 < <cn tn E UE ΦΟ 30 30 <3 < . ^ ΦΕη < Sh -H< Φ O -C Eh ΦΕη -h< ,h O ~ £ J E <J KO W Eh . CE Eh JO OO <0 >3 O < EH0> en U heh 30 HEH 3< HEH -J.

HO OH Sh O ΦΟ ΦΕη K O -H < OJO ,5 J

CEO 0< O Eh UI Eh JO Eh< OO en Eh yg H HE Eh rH 30 30 >i Eh OO -u O ΦΕη _

+ -C O Εηπ3 ΦΕη ΦΕη -HO HO ΦΕη HO 3 H

&h < 0> JU JO OO CUO E < < O jo «H J-> O O O C O CO < O O O .OHEh O >E O C O O Φ O m m r i

I Φ Eh CM<rH *S- Sh < VO H O CO Φ O O -H O CN -H < *3· K Eh m r- cU

OO J -3 CEO OEH-HOOJOOrHCUEH^gp : < <3 HO ΦΕη ra E 30 C< m< P-.

r- Eh <rH SH < HO ·Η< Φ E -H < HO m M

£ < OO Eh EH Φ O KO JO OO <0 ,¾ ^ n < 0 3 H E CUO 3 0 3 < OiO O O <- -j.

*. 2 < E (U JO" HO ΦΕη -h < HO h O J S5 2 ^ U J Eh < Eh Eh U O Eh Eh CU U OO Eh «3 Eh UI ΦΕη OO C< OO ΦΕη jj O -in ph O «ai 0>1 -HO HO -H *3 HO H H (UEh mpl 5« jjj EH EH O <0 CU O OO CUO M X, - _ S < j [j 5 O «e en eno ou ' heh heh ΦΕη m r. rn O < >1 >10 H E ΦΟ ΦΟ KO HO 2 5- Ch < < J O Eh M < en Eh enEH Eh< < o ¢3 Eh O 0 3 30 >10 30 ΦΟ HEH >iEh u Ph < O ΕηΦ ΦΕη -HO ΦΕη HE KO HO «, Γ, 2 < OJ JO OO JO m < Eh < OO $ ^ g < 03 01< 3 E ra E >iEh ΦΕη C< - r. «-no

O EH Φ Sh<3 Φ EH >iO HO HO -H < 2 m m 2 M

o oj j3 ju UEh oo <o ou ίκυ < EH Φ 3 < H EH >i E- 3 < ΦΕη u E , ero < EH K -H < Φ O -HO rH < K EH KU ^ Fh -h < <3 Eh CU OO enEH OO OO CUEh Eh < £ g yg < OH C< ΦΕΗ ΦΕη 30 CUU O O - m m Ph <5 O Φ -H< -H< HO ΦΕη cn< HO m CU 2 n «3 < en oo ku Co jo <o cu o 33 55 O < e 30 >iEH 30 fO EH ΦΕη C< ^ -m

< *3 rH Φ EH rH O ΦΕΗ rH O rH U HC «S

Eh OO JO OO JU <0 <0 OU £5 jg U O O O Οφ< 030 o C o o C < OH< 0 3 0 rn -u Ph m ,n Ph -HUH MiHU Ifl Φ E I -H < CT1-H< H m E η Φ E S25· UK <0 JU OU UUJ>OrHJU^^g^^g 35 110576

Vaikka tämän DNA:n ilmentämiseen voidaan käyttää mitä tahansa soveltuvaa vektoria, voidaan ilmentymisplasmidi pCFM1156 helposti muodostaa plasmidista pCFM836, jonka konstruoimista kuvataan EP-hakemusjul-kaisussa 136 490. pCFM836 pilkotaan ensin Ndelillä ja tehdään sitten tylppä-5 päiseksi Pöllillä, niin että molemmat olemassa olevat Ndel-kohdat tuhoutuvat. Seuraavaksi vektori pilkotaan Clalillä ja Saclklla olemassa olevan polykytkijän poistamiseksi ennen ligaatiota tilalle tulevan polykytkijän kanssa taulukon XVI mukaisesti. Tämä korvaava polykytkijä voidaan muodostaa Altonin et ai., (supra) menetelmällä. Ilmentymisplasmidissa pCFM1156 tapahtuvaa ilmentymistä sää-10 dellään lambda-PL-promoottorilla, joka puolestaan voi olla C|857-repressorigee-nin oh jauksessa (jollainen on E. coli -kannassa K12 AHtrp).

» · 110576 36

I—I

M

Eh < 05 < H Ol CJ CJ Ol cj cj wl

< EH

Eh C

e> cj ί ου *=r α cj Eh <

Eh < rH

< Eh 3 < Eh rH cn cj u 2 υ cj u m

Eh «£ σι cn

Eh <3 n CJ U cr\ CJ a - U CJ ΙΟ U rH CJ u U CJ ml Eh <

rf EH ÖJ < EH CN

< Eh Wl CJ U O

eh < u cj x:

EH < - < EH X

CJ CJ rH < Eh CJ O rH Eh <C m

Eh < CJ| CJ CJ W

< Eh C <£ Eh E

Eh «ί *h < Eh m < Eh Wl Eh < m

U CJ - < EH

«£ £h in rH <X Eh in < EH m >J < Eh t—

Eh < 4-> Eh < < Eh * CO j < Eh

< Eh rH CJ O rH

cj cj ajirHOCj o > cjcj ό oi u o n . X < Eh zlu cj a x : _ cj u zl a cj

• o CJ CJ OH CJ CJ rH

• j^iCE-icNr-EHdjm ' a: < ei m < Eh > • S3 CJ CJ CJ CJ <ί

• H < Eh H * CJ CJ

S3 Eh< m rH < Eh O

• m u cj X2 e cj u c-

Eh eh < X & U CJ

Eh Xl Eh < -

< Eh cn CJ CJ rH

. CJ CJ rH rH >ΐ EH rH

Eh < CJ EH t£ H

Eh << -·η| Eh <5 m3

Eh < rH OI U CJ C

< Eh mlWI CJ U -n

CJ CJ rH <£ Eh W

CJ CJ cj|cn < eh

Eh < tn CJ U cn e£ Eh H CJ U m

rH rH

110576

Esimerkki 7 Tämä esimerkki koskee hpG-CSF-polypeptidin tuottamista E. colis-sa [Met'1 ]-hpCSF:ää koodaavan DNA-sekvenssin avulla. Käytetty sekvenssi oli osittain synteettinen ja osittain cDNA-peräinen. Synteettisessä sekvenssis-5 sä käytettiin E. colin suosimia kodoneja.

Plasmidi Ppo2, joka sisältää taulukon VII mukaisen hpG-CSF-gee-nin, pilkottiin HgiAkllä ja Studia, jolloin saatiin noin 645 emäsparin fragmentti, joka sisältää valmista hpCSF:ää vastaavan geenin (taulukko VII), seitsemän esijaksoryhmiä vastaavaa kodonia 5'-päässä ja noin 100 emäsparia 3'-pään 10 koodaamatonta aluetta. Pilkottaessa HgiAl:llä jää neli-emäksinen tarttuva 5'-pää, joka on identtinen Pstl-kohdan kanssa, ja Stul-pilkonnassa jää tylppä pää. Tämä mahdollistaa fragmentin helpon sijoittamisen M13mp8(Rf):ään, joka on pilkottu Pstl:llä ja tylpän pään muodostavalla restriktioentsyymillä Hindi. Kun oli tehty amplifikaatio M13:ssa, hpG-CSF-DNA irrotettiin pilkkomalla 15 Apakllä ja BamHI:llä, jotka katkaisevat ketjun Apal-kohdasta, joka kattaa hpCSF:n ryhmiä +3 - +5 vastaavat kodonit, ja vastaavasti BamHI-kohdasta, joka sijaitsee M13mp8-restriktiopolykytkijässä olevan Hincll-kohdan jälkeen. hpG-CSF-polypeptidin tuottamisen mahdollistamiseksi E. colissa valmistettiin alla olevassa taulukossa XVII esitetty synteettinen fragmentti.

»

• : 20 Taulukko XVII

5’ - C TAG AAA AAA CCA AGG AGG TAA TAA ΑΤΑ 3' - TTT.TTT GGT TCC TCC ATT ATT TAT Xbal -1 +1 25 Met Thr Pro Leu ATG ACA CCT CTG GGC C - 5' TAC TGT GGA GAC -3'

Apal

Kuten taulukkoa XVII analysoimalla voidaan todeta, kytkijä sisältää tarttuvan Apal-pään, kodonit, jotka vastaavat hpG-CSF:n kolmea ensimmäistä 30 aminopään ryhmää (jolloin "saadaan takaisin" edellä kuvatussa M13-DNA:n | ' Apal-pilkonnassa poistuneet Thr1:ä, Pro2:a ja Leu3:a vastaavat kodonit ja käy tetään E. colissa ensisijaisesti ilmentyviä kodoneja), translaation aloituskodo-nin ATG, 24 emäsparin pituisen sekvenssin, joka toimii ribosomisitoutumis-kohtana, ja tarttuvan Xbal-pään.

38 110576 E. coli -ilmentämisessä käytetty ilmentymisvektori oli vektori, jota kuvataan pCFM536:na EP-hakemusjulkaisussa 136 490 (Morris, 10. huhtikuuta 1985). (Katso myös ATCC 39934, E. coji JM103, joka sisältää pCFM536:n). Lyhyesti ilmaistuna plasmidi pCFM536 pilkottiin Xbakllä ja BamH:llä. Sitten sii-5 hen ligatoitiin edellä kuvatut hpGCSF-fragmentti (Apal/ BamHI) ja kytkijä (Xba/ Apal), jolloin saatiin plasmidi, josta käytetään merkintää p536Ppo2.

Plasmidilla p536Ppo2 transformoitiin E. coli AM7 -kannan faagin-kestävä variantti, joka oli ennalta transformoitu plasmidilla pMW1 (ATCC-nro 39933), joka sisältää Cl857-geenin. Transformoituminen varmistettiin kantaplas-10 midin pCSF536 sisältämän antibioottiresistenssimarkkerigeenin (amp) avulla. Soluviljelmiä pidettiin yllä LB-liemessä (50 pg/ml ampisilliinia) lämpötilassa 28 °C, ja kun soluviljelmä oli kasvanut tiheyteen joka vastasi aallonpituudella 600 nm mitattua absorbanssia 0,5 (A600 = 0,5), indusoitiin hpCSF-ilmen-tyminen nostamalla viljelmän lämpötila 42 °C:ksi kolmen tunnin ajaksi. Viljel-15 män lopullinen optinen tiheys vastasi A600-arvoa 1,2.

hpG-CSF-geenin ilmentymistaso transformoiduissa soluissa oli Coomassie-sinisellä värjätystä SDS-polyakryyliamidigeelistä arvioituna 3 - 5 % solun kokonaisproteiinista.

Solut otettiin talteen sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 3 500 x g 10 min i 20 JS-4.2-roottorissa. Veteen sekoitetut solut [25 % (paino/tilavuus)] rikottiin johtamalla seos kolmesti French Pressure Cell -laitteen läpi, jossa vallitsi paine 69 000 kPa. Rikotut solut sisältävää suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä » 10 000 x g 15 min JA-20-roottorissa. Pelletti suspendoitiin takaisin veteen ja liuotettiin kokonaisproteiinipitoisuutena noin 5 mg/ml 1-%:iseen lauriinihappoon, . 25 joka sisälsi 50 mmol/l Trisiä, pH 8,7. Liuotettua pellettimateriaali sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 15 000 x g 10 min, ja lisättiin supernatanttiin CuS04:a pitoisuudeksi 20 mmol/l. Tunnin kuluttua tämä näyte syötettiin C4-HPLC-kolonnille puhdistettavaksi esimerkin 1(B) mukaisella menettelyllä, jolloin tehtiin tarvittavat tilavuus-ja pitoisuussäädöt.

30 Toinen puhdistusmenettely kehitettiin, jotta saataisiin suurempia määriä hpG-CSF:ää formuloituna orgaanisia aineita sisältämättömään pusku-‘ riin. Tämä materiaali soveltuu in vivo -tutkimuksiin. 150 g solutahnaa suspen doitiin noin 600 ml:aan 1 mM DTT-liuosta, ja johdettiin neljästi Manton Gualin , . -homogenaattorin läpi, jossa vallitsi noin 48 000 kPa:n paine. Rikottuja soluja 35 sisältävää suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min, ja pel-’’ letti suspendoitiin 400 ml:aan liuosta, joka sisälsi 1 % deoksikolaattia (DOC), 39 110576 5 mmol/l EDTAa, 5 mmol/l DTT:tä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 9. Tätä suspensiota sekoitettiin huoneenlämpötilassa 30 min ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min. Pelletti suspendoitiin takaisin noin 400 ml:aan vettä ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min. Pelletti liuotettiin 100 ml:aan liuosta, joka si-5 sälsi 2 % Sarkosyliä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 8. Lisättiin CuS04:a pitoisuudeksi 20 mmol/l, ja seosta sekoitettiin 16 tuntia huoneenlämpötilassa ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 20 000 x g 30 min. Supernatanttiin lisättiin 300 ml asetonia. Tämä seos laitettiin jäähauteeseen 5 000 x g 30 min. Pelletti liuotettiin 250 ml:aan liuosta, joka sisälsi 6 mol/l guanidiinia ja 40 mmol/l natriumasetaattia, 10 pH 4, ja laitettiin liuos 1 200 ml:n G-25-kolonnille, joka tasapainotettiin ja eluoi-tiin 20 mM natriumasetaattiliuoksella, pH 5,4. hpG-CSF-piikki (noin 400 ml) yhdistettiin ja laitettiin 15 ml:n CM-selluloosakolonniin, joka oli tasapainotettu 20 mM natriumasetaattiliuoksella, pH 5,4. Näytteen lisäämisen jälkeen kolonni huuhdottiin 60 ml:lla liuosta, joka sisälsi 20 mmol/l natriumasetaattia (pH 5,4) 15 ja 25 mmol/l natriumkloridia, ja eluoitiin sitten 200 ml:lla liuosta, joka sisälsi 20 mmol/l natriumasetaattia (pH 5,4) ja 37 mmol/l natriumkloridia. 150 ml tätä eluenttia väkevöitiin 10 ml:ksi ja syötettiin 300 ml:n G-75-kolonniin, joka tasapainotettiin ja eluoitiin liuoksella, joka sisälsi 20 mmol/l natriumasetaattia ja 100 mmol/l natriumkloridia (pH 5,4). Piikin sisältävät fraktiot, jota oli 35 ml, yh- • 20 distettiin ja steriloitiin suodattamalla. Lopullinen hpG-CSF-pitoisuus oli 1,5 mg/ml, * tuotteen puhtausaste on yli 95 % geelillä analysoituna, ja se sisälsi alle 0,5 ng pyrogeeniä 0,5 mg:aa kohden hpG-CSF:ää. Pyrogeenipitoisuus määritettiin > '· käyttämällä Limulus Amebocyte Lysate (LAL) -testivälineistöä (M.A. Biopro- ducts, Walkersville,Maryland).

25 Esimerkki 8 Tämä esimerkki koskee yhdistelmämenetelmien käyttöä hpG-CSF:n kanssa analogisten polypeptidien valmistamiseen, joissa asemissa 17, 36, 42, 64 ja 74 olevat kysteiiniryhmät korvattiin yksilöllisesti sopivilla aminöhappo-ryhmillä.

30 Souzan ej ai., (PCT-hakemusjulkaisu W085/00817, 28. helmikuuta j ‘ 1985) mukaiset paikkaohjattu mutageneesi -menettelyt tehtiin plasmidin p536Ppo2 [Met'1] -ryhmää koodaavalle DNA:lle, jota kuvataan tässä hakemuksessa, käyttämällä seuraavassa taulukossa XVIII kuvattuja synteettisiä oligo-nukleotideja, joiden koko on 20 - 23 emästä. Oligonukleotidi nro 1 mahdollisti 35 [Ser17]hpG-CSF:ää koodaavan geenin muodostumisen; oligonukleotidilla nro 2 saatiin [Ser^hpG-CSF jne.

„„ 110576 40

Taulukko XVIII

Oligonukleotidi Sekvenssi 1. 5'-CTG CTC AAG TCC TTA GAG CAA GT-3' 5 2. 5'-GAG AAG CTG TCT GCC ACC TACA-3' 3. 5'-TAC AAG CTG TCC CAC CCC GAG-3' 4. 51-TGA GCA GCT CCC CCA GCC AG-3' 5. 5’-CTG GCA GGC TCC TTG AGC CAA-3’

Cys-Ser-paikkaohjattu mutageneesi -restriktiot tehtiin käyttämällä 10 templaattina M13mp10:ä, joka sisälsi p536Ppo2:sta eristetyn hpG-CSF-frag-mentin Xbal-BamHI. Kunkin Cys-Ser-substituution sisältävän M13mp10-kloo-nin DNA käsiteltiin Xbalillä ja BamHlillä. Saatu fragmentti kloonattiin ilmenty-misvektoriin pCFM746, ja ilmentymistuotteet eristettiin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla.

15 Plasmidi pCFM746 voidaan konstruoida pilkkomalla plasmidi pCFM736 (jonka muodostamista talletetuista ja julkisesti saatavilla olevista materiaaleista kuvaa Morris PCT-hakemusjulkaisussa WO 85/00829, 28. helmikuuta 1985) Clakllä ja BamHlillä olemassa oleva polykytkijän poistamiseksi ja seuraavan polykytkijän tuomiseksi tilalle.

;·; 20 Taulukko XIX

Clal '., j ς ·

J CGATTTGATTCTAGAATTCGTTAACGGTACCATGGAA

3' TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGCCATGGTACCTT

GCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAAC3' CGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAG5'

Sau3a , : Puhdistettaessa tämän keksinnön mukaisia Cys-Ser-analogeja sus- 30 pendoitiin noin 10 - 15 g solutahnaa 40 ml:aan 1 mM DTT-liuosta, ja johdettiin . seos French Pressure Cell -laitteen läpi (paine 69 000 kPa). Rikotut solut si- : sältävää suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 1 000 x g 30 min. Pelletti ··: suspendoitiin liuokseen, joka sisälsi 1 % DOC:ta, 5 mmol/l EDTAa, 5 mmol/l ’ ‘ DTT:tä ja 50 mmol/l Trisiä (pH 9), ja annettiin sekoittua 30 min huoneenlämpö- 35 tilassa. Seosta sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min, suspendoitiin 41 110576 40 ml:aan vettä ja sentrifugoitiin uudelleen kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min. Pelletti liuotettiin 10 ml:aan liuosta, joka sisälsi 2 % Sarkosyliä, 50 mmol/l DTT:ä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 8. Kun seosta oli sekoitettu 1 tunti, se selkeytettiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 20 000 x g 30 min ja laitettiin sitten 300 ml:n 5 G-75-kolonniin, joka tasapainotettiin ja eluoitiin liuoksella, joka sisälsi 1 % Sarkosyliä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 8. Analogista polypeptidiä sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja niiden annettiin hapettua seisottamalla niitä ilman vaikutuksen alaisina vähintään 1 vrk. Loppupitoisuudet vaihtelivat alueella 0,5 - 5 mg/ml.

Esimerkki 9 10 Tässä esimerkissä muodostettiin nisäkässoluilmentymisjärjestelmä sen toteamiseksi, voisivatko nisäkässolut (COS-1, ATCC CRL-1650) tuottaa ja erittää hpG-CSF-DNA:n koodaamaa aktiivista polypeptidituotetta. Tämä järjestelmä suunniteltiin sellaiseksi, että saataisiin aikaan hpGCSF:n kanssa analogisen polypeptidin erittyminen osittain synteettisen ja osittain cDNA-peräisen 15 rakenteen, joka koodaa [Ala1]hpG-CSF:ää, jota edeltää esipolypeptidi, jolla on Wongin et a]., [Science 228 (1985) 810 - 815] ja Leen et a]., [Proc. Natl. Acad. Sei.(USA) 82 (1985) 4360 - 4364] mukaan ihmis-GM-CSF:ään liittyvä sekvenssi, ilmentymis-ja erittymisprosessoinnin kautta.

: llmentymisvektori, jota käytettiin keksinnön mukaisten polypeptidi- 20 tuotteiden muodostumisen alustavaan tutkimiseen, oli "sukkulavektori", joka sisältää sekä pBR322:n että SV40:n DNA:n ja joka on suunniteltu mahdollistamaan autonominen replikaatio sekä £. Coli- että nisäkässoluissa, jolloin in-sertoidun eksogeenisen DNA:n ilmentyminen nisäkässoluissa on viruksen pro-moottori/säätely-DNA-sekvenssin ohjauksen alainen. Tämä vektori, josta käy-25 tetään merkintää pSVDM-19 ja joka on E. £Qli HB101:ssä, on talletettu 23. elokuuta 1985 the American Type Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, numerolla ATCC 53241.

Ilmentymisvektorin muodostamiseen liittyvät erityistoimenpiteet oli-. : vat seuraavat. Syntetisoitiin alla olevan taulukon XX mukainen esijaksoa koo- .. 30 daava DNA-sekvenssi.

110576

Taulukko XX

-17

Hindlll Met Trp

5’ - A GCT TCC AAC ACC ATG TGG 5 3' - AGG TTG TGG TAC ACC

-10

Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Vai

CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG

10 GAC GTC TCG GAC GAC GAG AAC CCG TGA CAC

-1 +1

Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Leu GCC TGC AGC ATC TCT GCA CCC CTG GGC G -3' 15 CGG ACG TCG TAG AGA CGT GGG GAC -5'

Apal

Kuten taulukosta XX ilmenee, sekvenssi sisältää tarttuvat Hindlll-ja Apal-päät ja kodonit, jotka vastaavat ihmis-GM-CSF:n "esijaksoon" sisältyviksi 20 katsottua 17 aminohapporyhmää. Sen jälkeen tulevat alaniini-, proliini- ja leu-siiniryhmiä vastaavat kodonit. Proliini- ja leusiiniryhmät toistavat hpG-CSF:n : asemissa +2 ja +3 olevat aminohapot, kun taas alaniiniryhmä toistaa GM-CSF:n aminoterminaalisen (+1) ensimmäisen kodonin, eikä hpG-CSF:n vastaavaa kodonia. Treoniinin korvaamisen alaniinilla suunniteltiin helpottavan GM-CSF-25 esijakson asianmukaista "prosessoitumista pois" isäntäsolussa GM-CSF:n erittymiskäsittelyyn tavallisesti osallistuvien solumekanismien kautta.

Plasmidi pSVDM-19 pilkottiin Kpnkllä, ja katkaisukohta tehtiin tylppäpäiseksi Klenovv-entsyymillä. Sen jälkeen DNA pilkottiin Hindllklla. Tuloksena oleva suuri fragmentti yhdistettiin ja ligatoitiin taulukossa VII esitettyyn .·. 30 Hindlll-Pvulll-fragmenttiin (eritetty plasmidista Ppo 2 Hindlll-pilkonnalla ja osittaisella Pvulll-pilkonnalla saatuna toiseksi suurimpana fragmenttina), jolloin muodostui plasmidi pSV-Ppol. Taulukon Vili mukainen keinotekoinen GM-CSF-esijaksosekvenssifragmentti ligatoitiin sitten pSV-Ppol:een (kun tämä oli pil-“ kottu Hindllklla ja Apakllä), jolloin saatiin plasmidi pSVGM-Ppol.

35 Plasmidin pSVGM-Ppol DNA:n kalsiumfosfaattisakoilla (1-5 pg) transformoitiin kahdella 60 mm:n maljalla olevat COS-1-solut suurin piirtein 43 1 10576

Wiglerin et ai., mukaisesti [Cell 14 (1978) 725 - 731]. Vertailunäytteeksi transformoitiin COS-1 -solut myös plasmidilla pSVDM-19. Soluviljelmien superna-tantit otettiin talteen 5 vrk:n kuluttua transfektoinnista, ja niistä tutkittiin hpG-CSF-aktiivisuus. [Ala1]hpG-CSF-saannot viljelmäsupernatanteissa olivat suu-5 ruusluokkaa 1 - 2,5 pg/ml.

Kun [Ala1]hpG-CSF-tuotetta koodaava plasmidi pSVGM-Ppol oli menestyksellisesti saatettu ilmentymään COS-1-soluissa, konstruoitiin toinen vektori, joka sisälsi ihmis-GM-CSF-esijakson, mutta jossa oli treoniiniryhmää (esiintyy luonnossa hpG-CSF:n asemassa 1) vastaava kodoni vastaavassa 10 asemassa olevan alaniinikodonin tilalla. Lyhyesti ilmaistuna syntetisoitiin oligo-nukleotidi (5'CAGCATCTCTACACCTCTGGG3') paikkaohjattua mutaqeneesiä (SDM, siten-directed mutagenesis) varten. pSVGM-Ppol:n sisältämä hpG-CSF-fragmentti Hindlll-BamHI ligatoitiin M13mp10:een SDM:ää varten. Syntetisoitu hpG-CSF-geeni, joka sisälsi Thr-kodonin asemassa 1, eristettiin pilkkomalla 15 Hindllklla ja EcoRkllä. Tämä fragmentti kloonattiin sitten pSVDM-19:ään, joka oli preparoitu pilkkomalla samoilla kahdella restriktioendonukleaasilla. Saadulla vektorilla pSVGM-Ppo(Thr) transformoitiin COS-solut, ja viljelmäsuper-natanttien hpG-CSF-pitoisuuksiksi mitattiin 1 - 5 pg/ml.

Lopuksi käytettiin genomisekvenssiä, jonka eristämistä kuvataan 20 esimerkissä 5, ilmentymisvektorin muodostamiseen hpG-CSF:n tuottamiseksi j nisäkässoluissa. Tarkemmin ilmaistuna pSVDM-19 pilkottiin Kpnkllä ja HindllLIIa, ; ja käytettiin suurta fragmenttia nelitieligaatiossa taulukossa XXI esitetyn syn teettisen kytkijän kanssa, jossa oli tarttuvat Hindlll- ja Ncol-päät. Ncol-BamHI-fragmentti, joka sisälsi eksonin 1 ja joka oli eristetty pBR322:sta (8500 25 hpG-CSF), genomialaklooni ja eksonit 2 - 5 sisältävä BamHI-Kpnl-fragmentti, joka oli eristetty plasmidista pBR322 (8500 hpG-CSF -genomialaklooni). Saatu nisäkäsilmentymisvektori, pSV/hpG-CSF, tuotti 1 - 2,5 μg/ml hpG-CSF:ää transformoiduista COS-soluista.

Taulukko XXI

:, ’ 30

Hindlll

5'AGCTTCCAACAC

AGGTTGTGGTAC5' '' Ncol

Esimerkki 10 44 110576 44 Tämä esimerkki koskee keksinnön mukaisten yhdistelmäpolypepti-dituotteiden fysikaalisia ja biologisia ominaisuuksia.

1. Molekyylipaino 5 Esimerkissä 7 kuvatun E. eoji -ilmentymisen tuotteena olevan yh distelmä hpG-CSF:n näennäinen molekyylipaino oli 18,8 kD määritettynä pelkistävällä SDS-PAGE:lla (kuten voitaisiin ennustaa taulukon VII mukaisesta päätellystä aminohappokoostumuksesta), kun taas esimerkin 1 mukaisesti puhdistettujen luonnosta eristettyjen polypeptidien näennäinen molekyylipaino oli 10 19,6 kD. Luonnosta eristettyihin polypeptideihin liittyvien N-glykaanien läsnä olo voitiin varmuudella sulkea pois, koska taulukon VII mukainen hpG-CSF-primaarisekvenssi ei sisällä asparagiiniryhmiä, ja siksi suunniteltiin menettely sen määrittämiseksi, aiheuttivatko O-glykaanit luonnosta eristettyjen polypeptidien ja glykosyloimattomien yhdistelmätuotteiden väliset molekyylipainoerot.

15 Noin 5 pg luonnosta eristettyä materiaalia käsiteltiin neuraminidaasilla (Cal-biochem, LaJolla, Kalifornia), erotettiin 0,5 pg:n näyte, ja inkuboitiin loppu materiaali 4 milliyksikön kanssa O-Glycanasea (endo-x-n-asetyyligalaktoosi-aminidaasi, Genzyme, Boston, Massachusetts) 37 °C:ssa. Seoksesta otettiin näytteet Yz, 2 ja 4 tunnin inkuboinnin jälkeen. Näille näytteille tehtiin SDS-20 PAGE E. coli -peräisen yhdistelmämateriaalin rinnalla. Neuraminidaasikäsitte-lyn seurauksena eristetyn materiaalin näennäinen molekyylipaino muuttui 19,6 kD:sta 19,2 kD:ksi, mikä viittaa sialiinihapporyhmän poistumiseen. Kun näytettä oli käsitelty 2 tuntia O-glykanaasilla, molekyylipaino oli 18,8 kD-identtinen E. £oli -peräisen materiaalin molekyylipainon kanssa. Hiilihydraattirakenteen 25 herkkyys neuraminidaasille ja O-glykanaasille viittaa hiilihydraattikomponentin seuraavaan rakenteeseen: N-asetyylineuramiinihappo-p(2-6)galaktoosi-p(1-3)-N-asetyyligalaktoosiamiini-R, jossa R on seriini tai treoniini.

2.3H-tymidiinin vastaanotto

Ihmisen luuydinsolujen proliferaation indusoitumista tutkittiin 3H-ty-30 midiinin lisääntyneen vastaanoton perusteella. Terveiltä luovuttajilta saaduille ihmisen luuydinsoluille tehtiin tiheyserotus Ficoll-Hypaquella (1,077 g/ml, Pharmacia), ja pienitiheyksiset solut suspendoitiin Iscoven alustaan (GIBCO), , ‘ ' joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia ja glutamiinia, penisilliiniä ja strepto mysiiniä. Sen jälkeen 2 x 104 ihmisen luuydinsolua inkuboitiin joko vertailu-35 alustan tai esimerkin 7 mukaisen E. coji -yhdistelmämateriaalin kanssa 96 tasapohjaista syvennystä sisältävissä maljoissa lämpötilassa 37 °C 5 % C02:a sisältävässä ilmassa 2 vrk. Mitattiin pitoisuudet kahdesta rinnakkaisnäytteestä; 45 1 10576 erot olivat 10 000-kertaisia. Viljelmiä käsiteltiin sitten 4 tuntia 3H-tymidiinillä (0,5 pCi/syvennys, New England Nuclear, Boston, Massachusetts). 3H-tymidii-nin vastaanotto mitattiin Ventuan et ai-, [Blood 61 (1983) 781] kuvaamalla menetelmällä. Tässä kokeessa eristetyt ihmis-hpG-CSF-näytteet pystyvät indu-5 soimaan 3H-tymidiinin sisällytystä ihmisen luuydinsoluihin noin 4-10 kertaa voimakkaammin kuin vertailusupernatantit. Esimerkin 6 mukaisella E. soli -pe-räisellä hpG-CSF-materiaalilla oli samanlaiset ominaisuudet.

Toinen ihmisen luuydinsolujen proliferaatiotutkimus tehtiin käyttämällä esimerkin 9 mukaisesti valmistettua transfektoitujen COS-1 -solujen kas-10 vualustaa, ja siinä saatiin samankaltaisia tuloksia, mikä osoittaa, että koodatut polypeptidituotteet todella erittyivät kasvualustaan aktiivisina materiaaleina.

3. WEHI-3B D+ -solujen erilaistumisen indusointi E. sqN -peräisten yhdistelmämateriaalien kykyä indusoida hiiren myelomonosyyttileukemiasolulinjan WEHI-3B D+ erilaistumista tutkittiin puoli-15 kiinteässä agaralustassa Metcalfin [Int. J. Cancer 15 (1980) 225] kuvaamalla tavalla. Yhdistelmä hpG-CSF-tuotetta ja alustavertailunäytteitä inkuboitiin WEHI-3B D+-solujen (noin 60/syvennys) kanssa lämpötilassa 37 °C ilmassa, joka sisälsi 5 % C02:a, 7 vrk. Näytteitä inkuboitiin 24 tasapohjaista syvennystä sisältävillä maljoilla, ja pitoisuuserot olivat 2 000-kertaisia. Pesäkkeet luokitel-20 tiin erilaistumattomiksi, osittain erilaistuneiksi ja kokonaan erilaistuneiksi, pe-: säkkeiden solut laskettiin mikroskoopin avulla. E. coli -yhdistelmämateriaalien havaittiin indusoivan erilaistumista.

4. CFU-GM-, BFU-E-ja CFU-GEMM-määritykset ‘ ’ Luonnosta eristettyjen monitehoisten ihmis-G-CSF:ien (hpG-CSF:ien) 25 ja yhdistelmämenetelmillä valmistetun monitehoisen ihmis-G-CSF:n (rhpG-CSF:n) havaittiin aiheuttavan ihmisen luuydinsolujen proliferaation ja erilaistumisen. Nämä vaikutukset mitattiin CFU-GM [Broxmeyer gt ai Exp. Hematol. 5 (1971) 87], BFU-E- ja CFU-GEMM-määrityksillä [Lu et ai., Blood 61 (1983) 250], joissa käytettiin terveiltä ihmisluovuttajilta saatuja pienitiheyksisiä tarttu-30 mattomia luuydinsoluja. Seuraavassa taulukossa XXII verrataan-CFU-GM-, BFU-E- ja CFU-GEMM-aktiivisuuksia, jotka saatiin käyttämällä 500 yksikköä hpG-CSF:ää ja rhpGCSF:ää.

‘ * Kaikki pesäketutkimukset tehtiin käyttämällä pienitiheyksisiä tarttu- mattomia luuydinsoluja. Ihmisen luuydinsoluille tehtiin tiheyserotus Ficoll-35 Hypaquella (tiheys 1,077 g/cm3; Pharmacia). Pienitiheyksiset solut suspendoi-tiin sitten Iscoven muunnettuun Dulbecco-alustaan, joka sisälsi naudan sikiö- 46 110576 seerumia, ja sijoitettiin Falcon-kudosviljelymaljoille (nro 3003, Becton Dickenson, Cockeysville, MD.) 1/2 tunniksi lämpötilassa 37 °C.

Taulukko XXII

CFU-GM BFU-E CFU-GEMM

5

Alusta 0±0 26 + 1 OtO

luonnon hpG-CSF 83+5,4 83±6r7 4+0 rhpG-CSF 87+5 81+0,1 6+2 10 Alustavertailunäyte koostui Iscoven muunnetusta Dulbecco-alustas- ta, johon oli lisätty 10 % FCS:ää, 0,2 mM hemiiniä ja 1 yksikköä yhdistelmä-erytropoietiinia.

CFU-GM-määritysta varten 1 x 105 kohdesolua siirrostettiin 1 ml:aan 0,3-%:ista agarkasvualustaa, joka sisälsi täydennettyä McCoyn 5A-alustaa ja 15 10 % lämmöllä inaktivoitua naudan sikiöseerumia. Viljelmistä laskettiin pesäk keet (yli 40 solua/aggregaattia) ja todettiin muoto 7. viljelypäivänä. Ilmoitettu pesäkemäärä on neljältä rinnakkaismaljalta laskettujen määrien keskiarvo +/-keskivirhe.

BFU-E- ja CFU-GEMM-määrityksiä varten soluja (1 x 105) lisättiin ·: 20 1 ml:aan seosta, joka sisälsi Iscoven muunnettua Dulbecco alustaa (Gibco), • « »· :v 0,8 % metyyliselluloosaa, 30 % naudan sikiöseerumia, 0,05 nM 2-merkapto- • · :·.· etanolia, 0,2 mM hemiiniä ja 1 yksikkö yhdistelmäerytropoietiinia. Astioita in- kuboitiin kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5 % C02 ja 5 % 02. Matala '·' happipaine saatiin aikaan käyttämällä Reming Bioinstrumentsin (Syracuse, 25 N.Y.) hapenvähentäjää. Pesäkkeet laskettiin 14 päivän inkubaation jälkeen.

Rinnakkaisilta maljoilta laskettujen pesäkkeiden määrä on maljoilta laskettujen määrien keskiarvo ± keskivirhe.

Kaikkien CFU-GM-määrityksessä muodostuneiden pesäkkeiden havaittiin olevan klooriasetaattiesteraasipositiivisia ja negatiivisia epäspesifisen 30 esteraasin (alfanaftyyliasetaattiesteraasin) suhteen, mikä sopii yhteen sen kanssa, että pesäkkeet ovat tyypiltään granylosyyttejä. Sekä luonnon hpG-: . CSF:n että rhpG-CSF:n ominaisaktiivisuuden havaittiin olevan suunnilleen 1 x 108 yksikköä/mg puhdasta proteiinia määritettynä sarjalaimennusmenetelmällä :· CFU-GM-kokeella. Taulukossa XXIII esitettävät BFU-E- ja CFU-GEMM-tulok- ’ 35 set edustavat kolmea erillistä koetta, ja ne vastaavat luonnon hpG-CSF:lle kirjallisuudessa annettuja arvoja. On tärkeätä huomata, että rhpG-CSF on äärimmäisen puhdasta ja vapaa muista mahdollisista nisäkkäiden kasvutekijöistä 47 110576 sen ansiosta, että se tuotetaan E. colissa. Siten rhpG-CSF:llä on kyky tukea sekapesäkemuodostusta (CFU-GEMM) ja BFU-E:ta lisättynä yhdistelmäeryt-ropoietiinin länsä ollessa.

5. Solusitoutumismääritykset 5 Kirjallisuudessa on kuvattu, että WEHI-3B(D+)-solut ja äskettäin diagnosoiduista leukemioista peräisin olevat ihmisen leukemiasolut sitovat 125l-leimattua hiiren GCSF:ää ja että tästä sitoutumisesta voidaan kilpailla lisäämällä leimaamatonta G-CSF:ää tai ihmis-CSF-p:aa. Testattiin luonnon hpG-CSF:n ja rhpG-CSF:n kyky kilpailla 125l-hpG-CSF:n kanssa sitoutumisesta 10 ihmisen ja hiiren leukemiasoluihin. Hyvin puhdas luonnon hpG-CSF (puhtausaste > 95 %; 1 pg) jodattiin [Tejedor, et ai·. Anal. Biochem. 127 (1982) 1437 ja erotettiin reagensseista geelisuodatuksella ja ioninvaihtokromatografialla. Luonnon 125l-hpG-CSF:n ominaisaktiivisuus oli noin μΟ\^ proteiinia. Tutkittiin hiiren WEHI-3B(D+) -soluista ja kahdesta ihmisen ääreisveren myeloidileuke-15 miasolupreparaatista (ANLL, toinen luokiteltu M4:ksi ja toinen M5B:ksi) kyky sitoa 125l-hpG-CSF:ää.

Hiiren leukemiasolut ja juuri eristetyt ihmisen ääreisveren myeloidi-leukemiasolut pestiin kolmesti PBS:llä, joka sisälsi 1 % BSA:ta. WEHI-3B(D+)-soluja (5 x 106) tai tuoreita leukemiasoluja (3 x 106) inkuboitiin kahtena rinnak-20 kaisnäytteenä PBS.ssä, joka sisälsi 1 % BSA.ta, (100 μΙ) leimaamattomien hpG-CSF:n, rhpG-CSF:n tai GM-CSF:n poissa ollessa tai ollessa läsnä erilai-i *t sinä pitoisuuksina (tilavuus 10 μΙ) ja 125l-hpG-CSF:n (noin 100 000 pulssia/min :’·* eli 1 ng) läsnä ollessa lämpötilassa 0 °C 90 min (kokonaistilavuus 120 μΙ). Sit ten solut suspendoitiin uudelleen, laitettiin kerrokseksi 200 μΙ:ΙΙβ jääkylmää •»· 25 FCS:ää 350 μΙ:η muovisessa sentrifugiputkessa, ja sentrifugoitiin (1000 x g; 1 min). Pelletti otettiin talteen leikkaamalla pois putken pää, ja tehtiin pelletille ja supernatantille erikseen laskenta gammalaskurissa (Packard).

Ominaissitoutuminen (pulssia/min) määritettiin mittaamalla koko-naissitoutuminen kilpailijan poissa ollessa (kahden rinnakkaismäärityksen kes-30 kiarvo) ja vähentämällä siitä sitoutuminen (pulssia/min) leimaamattoman hpG-CSF:n ollessa läsnä 100-kertaisena ylimääränä (epäspesifinen sitoutuminen). Epäspesifinen sitoutuminen oli korkeimmillaan 2 504 pulssia/min WEHI-3B(D+)-solujen, 1 072 pulssia/min ANLL (M4 ) -solujen ja 1 125 pulssia/min ANLL (M5B) -solujen ollessa kyseessä. Kokeet 1 ja 2 tehtiin eri päivinä käyt-35 tämällä samaa 125l-hpG-CSF-valmistetta, ja todettiin prosentuaalisen inhibition * · yhtenäisyys käytettäessä 2 000 yksikköä hpG-CSF:ää. Saadut tulokset annetaan taulukossa XXIII.

48 1 10576 <Λ°

O

•H

-P

H

_ 5 · ° ° m -5

m H

5 P J.

ä 5 < tn

w CM VO O

3 CM Γ'

PJ *-< M

<Sf>

-S

-P

•h I r·' co ^ cv oo o* ·£ s .5 p Ί P \ < -3

tn CO «3· CM

rH CO O

^ CM CM

H —

H £P

H O

X P

X -P i o o· o o cm m o co o •H o r·· vo o oo VO f» O — 5 ^

Ai + _c «... a; Qc

.. . 3 — -H

! Ή ffl • · 3 ro ^ - · · m I .3 eh h g * h0 \

frl [Ö CO ID O) H O LD O OCO rH

·,,, I2 '3 o co cr, ro -co ro άγ cm rH

in vo vo vo. o i—t ro o vo ro .... h - «.«. - *· - ·>

g^vo rH CM rH CM CM CO

i—1

£ O 0 0 0-0 0 0 O O O

\ oooooo oo

• O O CM O O CM O O

en - « « ·. ·.

.V O CM O CM CM CM

>- rH rH

td td td 3 td Ί 1 -n

. . -n -H -H

H I—I ·· |—I »· rH -rl fr, ·· -H fr, 1 * Ή (¾ co fr, td en id r- & c;u tn cnocCO·· P fH O 1 P rH O I fr* rH tl) -H β U I tl) -H e O tn

. -H O Ai 3 g* u OAieP V

xxo-c a x op i

. -rl 3 -P -r| 3 S

Q) rH H Q) H U

49 110576

Kuten taulukosta XXIII ilmenee, 125l-hpG-CSF sitoutui WEHI-3B(D+)-leukemiasoluihin. Sitoutumista inhiboi annoksesta riippuvalla tavalla leimaa-maton luonnon hpG-CSF tai rhpG-CSF, muttei GM-CSF. Lisäksi havaittiin luonnon hpG-CSF:n sitoutumista ihmisen myelomonosyyttileukemiasoluihin 5 (ANLL, M4). Näihin soluihin sitoutumisen rinnakkaisilmiönä tapahtuu reaktiona luonnon hpG-CSF:lle nesteviljelmissä erilaistuminen valmiiksi makrofageiksi, joka voidaan todeta solujen muodosta. Se, ettei luonnon 125l-hpG-CSF sitoutunut toiselta potilaalta saatuihin monosyyttileukemiasoluihin (ANLL, M5B), viittaa siihen, että tietyissä leukemioissa voi olla eroja hpG-CSF-reseptorien esiin-10 tymisessa. rhpG-CSF:n kyky kilpailla luonnon hpG-CSF:n kanssa samalla tavalla sitoutumisesta 125l-hpG-CSF:n kanssa viittaa siihen, että reseptorit tunnistavat molemmat muodot yhtä hyvin.

Näiden kokeiden, jotka osoittavat luonnon 125l- leimatun hpG-CSF:n kyvyn sitoutua leukemiasoluihin, rinnakkaisilmiönä on luonnon hpG-CSF:n ky-15 ky indusoida viljelmässä akuuttia promyelosyyttileukemiaa (M3) ja akuuttia mye-loblastileukemiaa (M2) sairastavien potilaiden pienitiheyksisten luuydinsolujen granulosyytti- ja monosyyttierilaistumista. Kummankin potilaan soluja viljeltiin 4 vrk alustassa joko yksinään tai rhpG-CSF:n läsnä ollessa (1 x 105 yksikköä). Pelkässä alustassa inkuboitujen M3-vertailuviljelmien solut olivat edelleen tyy-: · 20 piltään promyelosyyttejä, kun taas rhpG-CSF:n läsnä ollessa viljellyissä soluissa näkyi myeloidityyppisiä valmiita soluja mukaan luettuna metamyelosyytit, jätti-·. läisnauhamuotoiset ja segmentoituneet neutrofiilit ja monosyytit. Tämän poti laan kohdalla todelliset erot tutkittaessa 100 solua olivat seuraavat: vertailu-näyte, 100 % promyelosyyttejä; rhpG-CSF-käsitellyt solut, 22 % emosoluja ja 25 promyelosyyttejä, 7 % myelosyyttejä, 35 % metamyelosyyttejä, 20 % nauha-muotoja ja segmentoituneita neutrofiilejä, 14 % monosyyttejä ja 2 % makrofa-geja. Huomionarvoinen on se seikka, että yksi polymorfonukleaarisista granu-losyyteistä sisälsi edelleen voimakkaan auer-sauvan, mikä viittaa siihen, että ainakin tämä solu oli erilaistunut leukemiaklooniin kuuluva solu. Toisen mye-30 loblastileukemiapotilaan soluja (M2) viljeltiin myös 4 vrk rhpG-CSF:n läsnä tai poissa ollessa. Pelkässä alustassa kasvatettujen M2-solujen visuaalinen ana-] lyysi osoitti suuria "emosolun kaltaisia" soluja, joista joissakin oli nukleoleja.

Jotkut rhpG-CSF:llä käsitellyistä M2-soluista erilaistuivat valmiiksi segmentoituneiksi neutrofiileiksi, joissa oli jäljellä auersauvoja keskusneutrofiilissä, mikä : 35 viittaa erilaistumisen tapahtumiseen leukemiaklooniin kuuluvassa solussa. Tut- kiitäessä morfologisesti 100 solun todellinen erilaistuminen, todettiin, että ver- 50 110576 tailusolut olivat 100-%:isesti emosoluja. RhpG-CSF-käsitellyistä soluista oli 43 % emosoluja, 1 % myelosyyttejä, 15 % metamyelosyyttejä, 28 % nauhamuotoja ja segmentoituneita neutrofiilejä, 2 % promonosyyttejä ja 11 % monosyyttejä. Leukemiasolujen erilaistumista tutkittiin myös neljällä muulla rhpG-CSF-pitoi-5 suudella (5 x 103, 1 x 104, 2,5 x 104 ja 5 x 104 yksikköä/ml, tuloksia ei esitetä). Jopa pienimmällä tutkitulla rhpG-CSF-pitoisuudella (5 x 103 yksikköä/ml) tapahtui merkittävä erilaistuminen (solut erilaistuivat myelosyyttivaiheen ohi) sekä M3- (50 %) että M2 (37 %) -leukemiasolujen kohdalla.

6. Immuunimääritys 10 Polyklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi immuunimäärityk- sessä käytettäviksi käytettiin antigeeninä esimerkin 1(B) mukaisesti preparoidusta ihmisen virtsarakkokarsinoomasolulinjasta 5637 (1A6) puhdistettua mo-nitehoista G-CSF:ää. Tämän materiaalin puhtausasteen todettiin olevan 85 % polyakryyliamidigeelien hopeanitraattivärjäyksen mukaan. Kuuden viikon ikäiset 15 Balb/C-hiiret immunisoitiin injektoimalla ihonalaisesti useaan kohtaan antigeeniä. Antigeeni suspendoitiin PBS:ään ja emulgoitiin yhtä suurten tilavuuksien kanssa Freundin täydellistä apuainetta. Annos oli 5 - 7 pg antigeenia/hii-ri/injektio. Tehosteimmunisointi tehtiin 18 vrk:n kuluttua samalla määrällä antigeeniä emulgoituna yhtä suureen määrään Freundin epätäydellistä apuainetta.

20 4 vrk:n kuluttua otettiin hiirestä seeruminäyte ihmisen monitehoiselle G-CSF:lle spesifisen vastaaineen testaamista varten.

Pitimissä olevat Dynatech Immulon II Removawell -liuskat (Dyna-teck Lab., Inc., Alexandria, Virginia) päällystettiin seoksella, joka. sisälsi 5 pg/ml hpG-CSF:ää 50 mM karbonaatti-bikarbonaattipuskurissa, pH 9,2. Sy-25 vennykset päällystettiin 0,25 pg:lla materiaalia 50 μΙ tilavuudessa. Antigeenillä päällystettyjä maljoja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa ja yön yli lämpötilassa 4 °C. Liuos dekantoitiin, ja levyjä inkuboitiin 30 min 5 % BSA:ta sisältävän PBS:n kanssa reaktiivisen pinnan suojaamiseksi. Tämä liuos kaadettiin pois, lisättiin syvennyksiin laimennettua ennen immunisointia otettua tai testi-30 seerumia, ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Seerumit laimennettiin 1 % BSA:ta sisältävällä PBS:llä, pH 7,0. Seerumiliuos dekantoitiin, ja maljat >t‘ ‘ pestiin kolmesti Wash Solution -liuoksella (KPL, Gaithersburg, Maryland). Ku hunkin syvennykseen lisättiin noin 200 000 pulssia/min jodattua kaniinin an-ti-hiiri-lgG:tä (NEN; Boston, Massachusetts) 50 pl:ssa PBS:ää, pH 7,0, joka si-; '·· 35 sälsi 1 % BSA:ta. Kun maljoja oli inkuboitu 1 1/2 tuntia huoneenlämpötilassa, liuos dekantoitiin, ja levyt pestiin viidesti Wash Solutionilla. Syvennykset pois- si 110576 tettiin pitimestä ja niille tehtiin laskenta Beckman 5500 -gammalaskurissa. Hiiren seerumit, joissa pitoisuudet olivat suuria, osoittivat yli 12-kertaista reaktiivisuutta vastaaviin ennen immunisointia otettuihin seerumeihin nähden laimennussuhteen ollessa 1:100.

5 E. coii -peräisen hpG-CSF:n immunologiset ominaisuudet määritet tiin mittaamalla reaktiivisuus hiiren seerumin kanssa, joka sisälsi suurena pitoisuutena nisäkässoluperäiselle hpG-CSF:lle spesifistä vasta-ainetta. 0,25 pg E. eoli-peräistä proteiinia (puhtausaste 90 %) laitettiin Immulon II Removawell -syvennyksiin 50 μΙ:η tilavuudessa, ja tutkittiin hiiren seerumi edellä kuvatulla 10 tavalla.

Hiiren seerumien, joissa pitoisuus oli suuri, reaktiivisuus E. coli -peräisen materiaalin kanssa oli 24-kertainen vastaavaan ennen immunisointia otettuun seerumiin nähden laimennussuhteen ollessa 1:100.

7. Seriinianalogien biologiset määritykset 15 Esimerkin 9 mukaisesti valmistetuista [Ser17]hpG-CSF-, [Ser36]- hpG-CSF-, [Ser^hpG-CSF-, [Ser*4]hpG-CSF- ja [Ser74]hpG-CSF-tuotteista tutkittiin hpG-CSF-aktiivisuus 3H-tymidiinin vastaanotto, CFU-GM ja WEHI3B D+ -määrityksillä. Kussakin määrityksessä [Ser17]-analogilla oli rakenteeltaan luontaisten yhdistelmämolekyylien kanssa vertailukelpoinen aktiivisuus. Muiden 20 analogien aktiivisuus oli noin 100 kertaa pienempi 3H-tymidiinin vastaanotto -kokeessa, 250 kertaa pienempi CFU-GM-määrityksessä ja 500 kertaa pienempi WEHI-3B D+ -määrityksessä. Nämä tulokset tukevat sitä olettamusta, että asemissa 36, 42, 64 ja 74 olevia kysteiiniryhmiä saatetaan tarvita täyden ’ biologisen aktiivisuuden saavuttamiseksi.

25 8. In vivo -biologinen määritys

Alzet®-osmoottiset pumput (Alzet Corp., Palo Alto, CA; malji 2001) kytkettiin oikean kaulavaltimon sisäisiin katetreihin ja istutettiin ihon alle seitsemään Syyrian kultahamsteriurokseen. Neljä pumpuista sisälsi puskuria [20 mmol/l natriumasetaattia (pH 5,4) ja 37 mmol/l natriumkloridia] ja 1,5 mg/ml £.

·.'· 30 £Qli -peräistä hpG-CSF:ää, kun taas 3 sisälsi pelkkää puskuria. Osmoottisten pumppujen ilmoitettu pumppausnopeus oli 1 μΙ/h korkeintaan 7 vrk:n ajan. Kol-· mantena päivänä pumppujen istutuksen jälkeen neljän käsitellyn hamsterin . keskimääräinen granulosyyttiluku oli kuusinkertainen kolmeen vertailueläimeen nähden (puskuria saaneet), ja kohonnut granulosyyttiluku heijastui kokonais-35 lymfosyyttimäärään, joka nelinkertaistui. Käsittely ei muuttanut erytrosyyttien 52 110576 määrää. Nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmämateriaali edistää spesifisesti granulosyyttien tuotantoa ja/tai vapautumista nisäkkäässä.

Luonnossa esiintyvien hpG-CSF:n alleelisten muotojen lisäksi voidaan tuottaa myös muita hpG-CSF-tuotteita, kuten hpG-CSF:n kanssa analo-5 gisia polypeptidejä ja hpG-CSF-fragmentteja. Noudattamalla edellä mainitun Altonin et ai., nimissä olevan hakemusjulkaisun (WO 83/04053) mukaisia menettelyjä on helppo suunnitella ja valmistaa geenejä, joiden mikrobi-ilmen-tymistuotteina on polypeptidejä, joiden primaarirakenne on erilainen kuin tässä määritelty yhden tai useamman ryhmän identiteetin tai sijainnin suhteen (esi-10 merkiksi substituutiot, lisäykset ketjun päihin tai keskelle ja deleetiot). cDNA-ja genomigeenejä voidaan vaihtoehtoisesti helposti muuntaa käyttämällä tunnettuja paikkaohjattu mutageneesi -menetelmiä, ja käyttää näitä muunnettuja geenejä analogisesti polypeptidien ja polypeptidijohdosten muodostamiseen. Tällaisilla tuotteilla olisi ainakin yksi yhteinen biologinen ominaisuus hpGCSF.n 15 kanssa, mutta muut ominaisuudet voivat olla erilaisia. Esimerkkeinä keksinnön mukaisista johdoksista mainittakoon tuotteet, joita on lyhennetty esimerkiksi deleetioiden kautta; hydrolyysiä paremmin kestävät tuotteet (joiden vaikutukset voivat siksi olla voimakkaampia tai pitempään kestäviä kuin luonnossa esiintyvillä tuotteilla); tuotteet, joista on poistettu yksi tai useampia mahdollinen 20 o-glykosylaatiokohta (mikä saattaa johtaa hiivassa tuotettujen tuotteiden suurempiin aktiivisuuksiin); tuotteet, joista on poistettu yksi tai useampia kyste-iiniryhmiä tai joissa ne on korvattu esimerkiksi alaniini- tai seriiniryhmillä ja jotka on mahdollisesti helpompi eristää aktiivisessa muodossa mikrobijärjestel-mistä; tuotteet, joissa yksi tai useampia tyrosiiniryhmiä on korvattu fenyyliala-, . 25 niinillä ja jotka voivat enemmän tai vähemmän helposti sitoutua kohdesoluilla • oleviin hpG-CSF-reseptoreihin. Keksinnön piiriin kuuluvat myös polypeptidi- fragmentit, jotka sisältävät vain osan hpG-CSF:n jatkuvasta aminohapposekvenssistä tai sekundaarirakenteesta, joilla fragmenteilla voi olla yksi hpG-CSF:n vaikutuksista (esimerkiksi sitoutuminen reseptoreihin) mutta ei 30 muita (esimerkiksi pesäkkeiden kasvua stimuloivaa aktiivisuutta). On huomionarvoista, että tuotteiden ei välttämättä tarvitse olla aktiivisia ollakseen te-’ * rapeuttisesti käyttökelpoisia [katso Weiland et ai., Blut 44 (1982) 173 - 175] tai käyttökelpoisia muissa yhteyksissä, kuten hpG-CSF-antagonismimäärityksis-‘ [ sä. Kompetitiiviset antagonistit voivat olla sangen käyttökelpoisia esimerkiksi 35 hpG-CSF:n ylituotantotapauksissa.

53 110576

Toisen aspektin mukaisesti tässä kuvattu hpG-CSF-polypeptidejä koodaava DNA-sekvenssi on arvokas sen informaation ansiosta, jonka se antaa tämän nisäkäsproteiinin aminohapposekvenssistä ja jota ei tähän asti ole ollut saatavissa muulla tavalla kuin analysoimalla luonnosta eristettyjä tuottei-5 ta. Nämä DNA-sekvenssit ovat myös huomattavan arvokkaita tuotteina, jotka ovat käyttökelpoisia suurimittaisen hpG-CSF-mikrobisynteesin aikaansaantiin erilaisilla yhdistelmämenetelmillä. Toisin sanoen tämän keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit ovat käyttökelpoisia muodostettaessa uusia ja käyttökelpoisia virus-ja rengasplasmidi-DNA-vektoreita, uusia ja käyttökelpoisia transformoitu-10 ja ja transfektoituja prokaryoottisia ja eukaryoottisia mikrobi-isäntäsoluja (mukaan luettuina bakteeri-ja hiivasolut ja viljelmässä kasvatettavat nisäkässolut), ja uusia ja käyttökelpoisia menetelmiä tällaisten, hpG-CSF:ää ja sen sukulais-tuotteita tuottamaan kykenevien mikrobi-isäntäsolujen kasvattamiseksi viljelmässä. DNA-sekvenssit ovat myös huomattavan käyttökelpoisia materiaaleja 15 käytettäviksi leimattuina koettimina ihmisen genomi-DNA-sekvenssien samoin kuin muiden nisäkäslajien cDNA- ja genomi-DNA-sekvenssien, jotka koodaa-vat hpG-CSF:ää ja sen sukulaisproteiineja, eristämisessä. DNA-sekvenssit voivat olla käyttökelpoisia myös erilaisissa vaihtoehtoisissa proteiinisynteesi-menetelmissä (esimerkiksi hyönteissolumenetelmissä) tai ihmisen ja muiden i 20 nisäkkäiden geeniterapiassa. DNA-sekvenssien odotetaan olevan käyttökelpoisia kehitettäessä transgeenisiä nisäkäslajeja, jotka voivat toimia eukaryoot-tisina "isäntinä" suurten hpG-CSF-määrien ja hpGCSF-tuotemäärien tuottamiseksi. Katso yleisesti Palmiter et a}., Science 222(4625) (1983) 809 - 814.

" hpG-CSF:n fragmenttien ja sen kanssa analogisten polypeptidien . . 25 kannalta käyttökelpoisia ovat raportit, jotka koskevat synteettisten peptidien, jotka suurin piirtein toistavat luonnossa esiintyvien proteiinien, glykoproteiinien ja nukleoproteiinien sisältämän aminohapposekvenssin, immunologista aktiivisuutta. Tarkemmin määriteltynä suhteellisen pienimolekyylisten polypeptidien on osoitettu osallistuvan immuunireaktioihin, jotka pituudeltaan ja laajuudeltaan ;/· 30 vastaavat fysiologisesti merkittävien proteiinien, kuten virusantigeenien, poly- peptidihormonien tms. aikaansaamia immuunireaktioita. Tällaisten polypeptidi-[ ’ en immuunireaktioiden joukkoon kuuluu spesifisten vasta-aineiden muodos tumisen provosointi immunologisesti aktiivisissa eläimissä. Katso esimerkiksi | Lerner et ai., Cell 23 (1981) 309 - 310; Ross et ai., Nature et ai 294 (1981) 654 35 - 656; Walter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 77 (1980) 5197 - 5200;

Lerner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 78 (1981) 3403 - 3407; Walter et ai., 54 1 10576

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78 (1981) 4882 - 4886; Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78 (1981) 7412 - 7416; Green et al., Cell 28 (1982) 477 -487; Nigg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79 (1982) 5322 - 5326; Baron et al., Cell 28 (1982) 395 - 404; Dreesman et al., Nature 295 (1982) 185 - 160; ja 5 Lerner, Scientif-ic American 248, nro 2 (1983) 66 - 74. Katso myös Kaiser et al., Science 223 (1984) 249 - 255, joka julkaisu koskee synteettisten peptidien, joilla on suurinpiirtein samanlainen sekundaarirakenne kuin peptidihormoneilla muttei välttämättä niiden kanssa yhteistä primaarirakennetta, biologisia ja immunologisia vaikutuksia.

10 Vaikka tätä keksintöä on kuvattu edullisten suoritusmuotojen suh teen, ymmärrettäneen, että alan ammattimiehelle tulee mieleen variaatioita ja modifikaatioita. Siksi on tarkoitus, että liitteenä olevat patenttivaatimukset kattavat kaikki tällaiset ekvivalenttiset variaatiot, jotka kuuluvat keksinnön piiriin.

Claims (2)

1. Menetelmä ihmisen monitehoisen granylosyyttipesäkkeitä sti-muloivatekijä- (hpG-CSF-) tuotteen valmistamiseksi, jolla on luonnossa esiinty- 5 vän hpG-CSF:n granulosyyttipoieettinen biologinen ominaisuus in vivo, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (a) viljellään sopivissa ravinto-olosuhteissa kädellisen isäntäsoluja, jotka käsittävät viraalisen promoottori-DNA:n kytkettynä operatiivisesti DNA:han, joka koodittaa hpG-CSF-polypeptidiä, jolla on taulukon VII mukainen kypsä amino- 10 happosekvenssi; ja (b) eristetään mainittujen solujen ilmentämä hpG-CSF.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kädellisen solut ovat COS-soluja. • · • · · Patentkrav -j "| Q ^ rJ