JP2527365B2

JP2527365B2 - 造血促進因子タンパク質及びその製造方法

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Publication number: JP2527365B2
Application number: JP1113512A
Authority: JP
Inventors: エム．サウザ，ローレンス
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1985-08-23
Filing date: 1989-05-02
Publication date: 1996-08-21
Anticipated expiration: 2011-08-21
Also published as: IL79805A; DE3650788D1; NO2003010I1; EP0237545B2; FI107540B; NO982132L; JP2002315578A; HK1029600A1; NZ217334A; US5676941A; US5582823A; ES2001883A6; JPH06181791A; JPH11276168A; JP2660178B2; NL930127I1; NO314902B1; DE3650788T2; CN1020924C; NO303544B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般に、造血促進因子及びかかる因子をコ
ードするポリヌクレオチドに関する。本出願は、詳しく
は、哺乳動物の多分化能性コロニー刺激因子、特にヒト
多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（hpG−CSF）、その
断片及びポリペプチド（タンパク質）類縁体、並びにそ
れらをコードするポリヌクレオチドに関する。造血促進
因子とは、血液細胞前駆体の分化・増殖を促進する活性
を有するものである。該活性は、一般には、骨髄細胞を
標的として半固型培地を用いるin vitroのアッセイにお
いて、血液細胞のコロニー形成を促進する活性として示
されるものであるが、本明細書中にも示されているよう
に、³H−チミジン取込み分析における骨髄細胞増殖活
性、あるいは、白血病細胞等の分化誘導活性としても捉
えられ得るものである。

背景技術ヒト血液生成（造血）系は、様々な白血球（好中球、
マクロファージ及び好塩基球／肥満細胞を含む）、赤血
球（エリスロサイド）及び凝血形成細胞（巨核球／血小
板）を補充する。平均的ヒト男性の造血系は毎年4.5×1
0¹¹のオーダーの顆粒球及び赤血球を産生すると推測さ
れていなが、これは１年間で全体重に相当する。デキス
ターら、バイオエッセイズ、第２巻、第154〜158頁、19
85年〔Dexter et al.,BioEssays,２,154−158（198
5）〕。

少量の特定の造血促進因子は、少数の前駆体“幹細
胞”の各種血液細胞系への分化、これらの系の著しい増
殖及びこれらの系からの成熟血液細胞の最終的分化の原
因をなすと考えられている。造血促進因子は極端に少量
で存在しているため、これら因子の検出及び同定は分析
の仕方にかかっていたが、今までは人為的条件下での培
養細胞に対する刺激効果に基づき様々な因子の中から区
別できるにすぎなかった。その結果、多数の名称が極め
て少数の因子を表示するために考え出されてきた。かか
る混同が生じた例として、IL−3,BPA、マルチ−CSR、HC
GF,MCGF及びPSFという語は、すべて現在では同一のマウ
ス造血促進因子に該当すると考えられている頭字語であ
る。メトカーフ、サイエンス、第229巻、第16〜22頁、1
985年〔Metcalf,Science,229,16−22（1985）〕。更
に、各種マウスの成長調節糖タンパク質に関する、バー
ジェスら、ジャーナル・オブ・バイロジカル・ケミスト
リー、第252巻、第1988頁、1977年〔Burgess,et al.,J.
Biol.Chem.,252,1988（1977）〕、ダスら、ブラッド、
第58巻、第600頁;1980年（Das,et al.,Blood,58,600（1
980）〕；イーレら、ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー、第129巻、第2431頁、1982年〔Ihle,et al.,J.Immun
ol.,129,2431（1982）〕、ニコラら、ジャーナル・オブ
・バイロジカル・ケミストリー、第258巻、第9017頁、1
983年〔Nicola,et al.,J.Biol.Chem.,258,9017（198
3）〕、メトカーフら、インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・キャンサー、第30巻、第773頁、1982年〔Met
calf,et al.,Int.J.Cancer,30,773（1982）〕；及び、
バージェスら、インターナショナル・ジャーナル・オブ
・キャンサー、第26巻、第647頁、1980年〔Burgess,et
al.,Int.J.Cancer,26,647（1980）〕参照。

組換え遺伝子技術の利用はこの混乱の中から一定の秩
序をもたらした。例えば、赤血球産生を促進するヒトエ
リスロポエチンのアミノ酸及びDNA配列が得られた〔198
5年６月20日に公開されたリン（Lin）のPCT出願公開第8
5/02610号明細書参照。〕組換え方法は、ヒト顆粒球−
マクロファージコロニー刺激因子のcDNAの単離に関して
も利用された。リーら、プロシーディングス・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（USA）第82
巻、第4360〜4364頁、1985年〔Lee et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.（USA），82,4360−4634（1985）〕及びウオン
ら、サイエンス、第228巻、第810〜814頁、1985年〔Won
g et al.,Science,228,810−814（1985）〕。更に、マ
ウス遺伝子のクローニングに関する。ヨコタら、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（USA）、第81巻、第1070頁、1984年〔Yokot
a,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），81,1070（198
4）〕、ファングら、ネーチャー、第307巻、第233頁、1
984年〔Fung,et al.,307,233（1984）〕及び、ゴーフ
ら、ネーチャー、第309巻、第763頁、1984年〔Gough,et
al.,Nature,309,763（1984）〕、並びにヒトＭ−CSFに
関するカワサキら、サイエンス、第230巻、第291頁、19
85年〔Kawasaki et al.,Science,230,291（1985）〕参
照。

ヒト多分化能性コロニー刺激因子（hpCSF）又はプル
リポエチンと称されるヒト造血促進因子は、ヒト膀胱癌
細胞系の培養液中に存在していることが示された。この
細胞系は5637と呼ばれて、米国菌寄託機関（American T
ype Culture Collection）、ロックビル、メリーランド
において制限条件付でATCC寄託番号第HTB−９号として
寄託されている。この細胞系から精製されたhpCSFは、
ヒト骨髄前駆体細胞を用いた分析において、すべての主
な血液細胞系の産生につながるような多分化能性前駆細
胞の増殖及び分化を促進することが報告された。ウェル
トら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（USA）、第82巻、第1526〜153
0頁、1985年〔Welte et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A），82,1526−1530（1985）〕。hpCSFの精製には、（N
H₄）₂SO₄沈降、陰イオン交換クロマトグラフィー（DEAE
セルロース、DE52）、ゲル濾過（AcA54カラム）、及びC
18逆相高性能液体クロマトグラフィーを利用していた。
C18逆相HPLC画分において２つの活性ピークの２番目に
溶出するhpCSFとして確認されたタンパク質は、銀染色
を用いるドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリ
ルアミド電気泳動（PAGE）での測定によれば、分子量
（MW）18,000を有すると報告された。hpCSFは、等電点
5.5を有し〔ウェルトら、ジャーナル・オブ・セル・バ
イオケミストリー、増刊第9A号、第116頁、1985年（Wel
te,et al.,J.Cell Biochem.,Supp 9A,116（1985）〕、
マウス骨髄単球性白血病細胞系WEHI−3B D⁺に対して高
分化能を有する〔ウェルトら、分子及び細胞生物学のUC
LA討論会、ゲールら編集、ニューシリーズ、第28巻、19
85年〔Welte,et al.,UCLA Symposia on Molecular an
d Cellular Biology,Gale,et al.,eds.,New Series,28
（1985））〕ことが早期に報告された。予備研究では、
hpCSFと確認された因子はヒトCFU−GM分析において最初
の７日間に顕著な顆粒球コロニー刺激活性を有すること
を示している。

ヒトCFU−βと称されるもう１つの因子も、ヒト膀胱
癌細胞系5637から単離されたが、未標識マウスＧ−CSF
の場合と同一の用量応答関係においてWEHI−3B D⁺細胞
との結合性に関しマウス¹²⁵I−標識顆粒球コロニー刺激
因子（Ｇ−CSF）の競合体として記載されていた〔ニコ
ラら、ネーチャー、第314巻、第625〜628頁、1985年（N
icola,et al.,Nature,314,625−628（1985））〕。この
用量応答関係は、以前、未標識マウスＧ−CSFに独特で
あって、Ｍ−CSF、GM−CSF又はマルチ−CSFのような因
子には見られないと報告されていた〔ニコラら、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（USA）、第81巻、第3765〜3769頁、1984年
（Nicola,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci（USA），81,3765
−3769（1984））〕。CSF−β及びＧ−CSFはともに、そ
れらがWEHI−3B D⁺細胞の分化を誘導する高い能力を有
している点において、CSF類の中では独特である（ニコ
ラら、イムノロジー・トゥデー、第５巻、第76〜80頁、
1984年〔Nicola,et al.,Immunology Today,５,76−80
（1984）〕）。高濃度でＧ−CSFは混合顆粒球／マクロ
ファージコロニー形成細胞を刺激するが（ニコラら、19
84年、同上）、このことは、ヒト骨髄培養物及びhpCSF
の14日間のインキュベート後に顆粒球性、単球性、混合
顆粒球／単球性及び好酸球性のコロニー（CFU−GEMM）
の出現を示す予備実験結果と一致する。CSF−βもマウ
ス骨髄細胞使用分析において好中球性、顆粒球性のコロ
ニー形成を促進すると記載されていたが、この性質は因
子をＧ−CSFとして同定するための基準とされた。これ
らの類似性から、ヒトCSF−βはＧ−CSF（顆粒球コロニ
ー刺激因子）と同一視された（ニコラら、ネーチャー、
第314巻、第625〜628頁、1985年〔Nicola,et al.,Natur
e,314,625−628（1985）〕）。

これらの共通の性質に基づけば、ニコラら、同上のヒ
トCSF−β及びウェルトら、同上のhpCSFは、適切にはヒ
ト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（hpG−CSF）と称
される同一の因子であると思われる。hpG−CSFの特徴づ
け及び組換え産生は、イン・ビトロWEHI−3B D⁺白血病
細胞数を“全く正常な濃度”で完全に抑制するマウスＧ
−CSFの報告されている能力、並びに、マウスで確立さ
れた移植骨髄白血病を抑制する粗製マウスＧ−CSF注射
製剤の報告されている能力からみて、特に望ましいであ
ろう。メトカーフ、サイエンス、第229巻、第16〜22
頁、1985年〔Metcalf,Science,229,16−22（1985）〕参
照。更に、サックス、サイエンティフィック・アメリカ
ン、第284巻、第１号、第40〜47頁、1986年〔Sachs,Sci
enticic American,2848（１）,40−47（1986）〕参照。

hpG−CSFが治療上重要であるとわかり、したがって市
販規模量の入手が必要となる限り、細胞培養物からの単
離では、十分な物質源を提供することは困難である。た
とえば、ウェルトら（1985年、同上）により天然hpCSF
単離物源として報告されたヒト膀胱癌細胞系5637（ATCC
HTB9）等のヒト腫瘍バンク細胞の商業的使用に対して
制約が存在していることは、注目される。

発明の要旨本発明によれば、hpG−CSFの全部又は一部をコードす
るDNA配列が提供される。このような配列は、選択され
た非哺乳動物宿主による発現に“好ましい”コドンの組
込み、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断部位の供
与、及び、簡易的発現ベクターの組立てを容易にする前
端、後端又は中間部へのDNA配列の付加的供与を含むこ
とができる。本発明は更に、１以上のアミノ酸残基の同
一製又は位置に関して天然型と異なり、しかも天然型の
性質の一部又は全部を保有している、hpG−CSFのポリペ
プチド類縁体又は誘導体（即ち、hpG−CSFに特異的な残
基のすべてまでは含有していない削除類縁体、１以上の
特異的残基が他の残基で置換されている〔Ser¹⁷〕hpG−
CSFのような置換類縁体、及び、１以上のアミノ酸残基
がポリペプチドの末端又は中間部分に付加している付加
類縁体）の微生物発現をコードするDNA配列を提供す
る。

本発明の新規DNA配列は、天然多分化能性顆粒球コロ
ニー刺激因子における一次構造配列の少なくとも一部及
び生物学的性質の１以上を有するポリペプチド産物の原
核もしくは真核宿主細胞での発現を確実化するために使
用される配列を含有している。本発明のDNA配列は、特
に、（ａ）表VII及び表VIIIに示されたDNA配列又はそれ
らの相補鎖、（ｂ）表VIIのDNA配列又はその断片と（本
明細書記載のようなハイブリッド形成条件下又はより厳
格な条件下で）ハイブリッド形成するDNA配列、又は
（ｃ）遺伝コードの縮重がなければ表VIIのDNA配列とハ
イブリッド形成し得るDNA配列をも含むものである。特
に（ｂ）に包含されるものとしては、hpG−CSFの対立変
異型及び／又は他の哺乳動物種の多分化能性顆粒球コロ
ニー刺激因子をコードするゲノムDNA配列がある。特に
（ｃ）に包含されるものとしては、hpG−CSF、hpG−CSF
の断片及びhpG−CSF類縁体をコードする人工DNA配列が
あるが、このDNA配列には微生物宿主でのメッセンジャ
ーRNAの翻訳を促進するコドンを組込むことができ。こ
のような人工配列は、アルトン（Alton）らのPCT出願公
開第WO83/04053号の方法により容易に組立てることがで
きる。

更に本発明に包含されるものとしては、本明細書の表
VII又は表VIIIの上部鎖ヒトcDNA又はゲノムDNA配列に相
補的なDNAの一部によりコードされたポリペプチド類、
即ちトラモンタノら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、第12巻、第5049〜5059頁、1984年〔Tramontano,et
al.,Nucleic Acids Res.,12,5049−5059（1984）〕に
記載された“相補的転化タンパク質”がある。

本発明は、対立変異体を含む天然hpG−CSFにおける一
次構造配列（即ち、アミノ酸残基の連続配列）の一部も
しくは全部、生物学的性質（例えば、免疫学的性質及び
イン・ビトロ生物学的活性）の１以上、及び物性（例え
ば、分子量）を有する精製単離ポリペプチド産物を提供
する。これらのポリペプチドは、化学合成操作又はゲノ
ムもしくはcDNAのクローニングもしくは遺伝子合成によ
り得られる外来性DNA配列の原核もしくは真核宿主発現
（例えば、細菌、酵母菌、高等植物、昆虫及び哺乳動物
細胞の培養による）の産物である、ということによって
も特徴づけられる。典型的な酵母菌〔例えばサッカロマ
イセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）〕
又は原核生物〔例えば、エシェリキア・コリ（Escheric
hia coli）〕宿主細胞の産物は、いずれの哺乳動物タン
パク質とも会合していない。脊椎動物（例えば、非ヒト
哺乳動物及び鳥類）細胞における微生物発現産物は、い
ずれのヒトタンパク質とも会合していない。用いられる
宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、哺乳動物その
他の真核生物の炭水化物でグリコシル化していてもよい
し、非グリコシル化のままでもよい。本発明のポリペプ
チドは、（−１位に）最初のメチオニンアミノ酸残基を
有することもできる。

本発明は、下記のアミノ酸配列において、１つ以上の
アミノ酸残基が置換されており、且つヒト多分化能性顆
粒球コロニー刺激因子活性を有するタンパク質を提供す
る。

ここで、アミノ酸残基の置換は、例えば、D.F.Mark
等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.81,p.5662−5666,198
4、PCT WO85/00817,1985年２月28日公開、R.P.Wharton
等,Nature,Vol.316,p.601−605,Aug.15,1985に記載され
ている本願優先権主張日前の周知技術である部位特定突
然変異誘発法等により実施することができる。

アミノ酸残基の置換に関し、１つ以上のアミノ酸残基
とは、該部位特定突然変異誘発法等により置換できる程
度の数のアミノ酸残基を意味する。

更に本発明に包含されるものとしては、有効量の本発
明のポリペプチド産物と一緒に適切な希釈剤、アジュバ
ント及び／又は担体を含有する、hpG−CSF療法に使用さ
れる医薬組成物がある。

本発明のポリペプチド産物は、固体組織及び血液もし
くは尿等の液体試料中におけるヒトhpG−CSFの検出及び
定量に使用される試薬を提供するために、検出可能なマ
ーカー物質と結合させることにより“標識”する（例え
ば、¹²⁵Iで放射線標識する）ことができる。

本発明のDNA産物は、検出可能なマーカー（例えば、
放射線標識及びビオチンのような非アイソトープ標識）
で標識することもでき、しかも染色体地図上のヒトhpG
−CSF遺伝子の位置及び／又はその関連遺伝子群の位置
をつきとめるためのDNAハイブリッド形成操作に用いる
ことができる。それらはDNAレベルでのヒトhpG−CSF遺
伝子の異常を確認するためにも使用され、隣接遺伝子及
びそれらの異常を確認するための遺伝子マーカーとして
使用することもできる。

本発明のポリペプチド産物は、再生不良性貧血のよう
な造血障害の治療のために、単独で又は他の造血因子も
しくは薬物と一緒に使用される。それらは化学療法又は
放射線療法による造血障害の治療にも使用される。骨髄
移植の成功率は、例えばhpG−CSFの使用により高められ
るであろう。創傷治癒熱傷治療及び細菌性炎症治療にも
hpG−CSFが有効である。更に、hpG−CSFは、白血病細胞
を分化させると報告されている能力に基づき、白血病の
治療にも使用される。ウェルトら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（USA）、第82巻、第1526〜1530頁、1985年〔Welte,et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），82,1526−1530（198
5）〕及びサックス（Sachs）、同上参照。

本発明の多数の側面及び長所は、現在の好ましい態様
たる本発明の実例について説明した以下の詳細な説明を
斟酌することにより、当業者であれば明らかになるであ
ろう。

詳細な説明本発明によって、hpG−CSFのポリペプチド配列の一部
又は全部をコードするDNA配列が単離されかつ特徴づけ
られた。

下記の諸例は本発明の説明のために示されたものであ
って、特に、hpG−CSF cDNA及びゲノムクローンの同定
の先立ち行なわれる操作、かかる同定方法、並びに、配
列決定、cDNA、ゲノム及び人工遺伝子に基づく発現系の
開発、及びかかる系での発現hpG−CSF及び類縁体産物の
同定に関する。

更に詳しくは、例１はhpG−CSFのアミノ酸配列決定に
関する。例２はコロニーハイブリッド形成スクリーニン
グ用cDNAライブラリーの製造に関する。例３はハイブリ
ッド形成プローの組立てに関する。例４は、ハイブリッ
ド形成スクリーニング、陽性クローンの同定、陽性cDNA
クローンのDNA配列決定及びポリペプチド一次構造配列
（アミノ酸配列）情報の作成に関する。例５はhpG−CSF
をコードするゲノムクローンの同定及び配列決定に関す
る。例６は、大腸菌優先（preference）コドンが用いら
れたhpG−CSFをコードする人工遺伝子の組立てに関す
る。

例７は、hpG−CSFをコードするDNAを組込んだ大腸菌
形質転換ベクターの組立て方法、hpG−CSFの原核生物発
現におけるベクターの使用、及び本発明の組換え産物の
特性分析に関する。例８は、システイン残基がhpG−CSF
をコードするDNAでの変異誘発により別の適切なアミノ
酸残基で置換されたhpG−CSF類縁体の産生方法に関す
る。例９は、陽性cDNAクローンから得たhpG−CSF類縁体
をコードするDNAを組込んだベクターの組立て方法、COS
−１細胞形質転換のためのベクターの使用、及び形質転
換細胞の培養増殖に関する。例10は、本発明の組換えポ
リペプチド産物の物理的及び生物学的性質に関する。

例１（Ａ）文献記載方法により得られた物質の配列決定 hpG−CSF試料（３〜４μｇ、SDS銀染色−PAGE純度85
〜90％）は、ウェルトら、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（USA）、
第82巻、第1526〜1530頁、1985年〔Welte,et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA），82,1526−1530（1985）〕に従
い単離精製したものと同様であって、スローン・ケタリ
ング・インスティテュート（Sloan Kettering Instit
ute）、ニューヨーク、ニューヨーク州から入手した。

このhpG−CSF試料のＮ末端アミノ酸配列を、AB 407A
気相分析装置〔アプライド・バイオシステムズ（Applie
d Biosystems）、フォスター市、カリフォルニア〕を
用いたミクロ配列分析により１号操作（Run＃１）で決
定し、下記表Ｉに掲示された配列情報を得た。表Ｉ−IV
では、単一文字コードが用いられており、“X"は明確に
決定されなかった残基を示し、括弧内の残基は単に択一
的又は推定的に示されたものである。

高いバックグランドが操作サイクル毎に存在したが、
その結果は表Ｉに報告されており、このことは試料がお
そらく精製時の化学的残留物たる多くの汚染成分を有す
ることを示していた。配列を単に参照用として保存し
た。

２号操作（Run＃２）では、第２試料（５〜６μｇ、
純度95％以下）は、１号操作と同様にスローン・ケタリ
ングから入手し、配列決定操作は１号操作と同様にして
実施した。この試料は、ウェルトら、プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（USA）、第82巻、第1526〜1530頁、1985年の図４を作
成するために用いられた物質の同一ロットから得たもの
である。結果は、表IIに示されている。

更に多くの残基が同定されたが、２号操作では、適当
数のプローブをhpG−CSF DNA調査用に組立て得るほど
十分に長い明確な配列は得られなかった。表IIの配列に
基づきcDNAの単離を行なうためには、少なくとも1536種
類のプローブが必要であろうと計算された。再度、試料
の汚染が問題視された。

このため、第３試料（３〜５μｇ、純度40％以下）を
上記のようにスローン・ケタリングから入手した。この
調製物は、更に精製するために、SDS−PAGEによる分離
後、電気ブロット（electroblot）に付した。この試料
の配列分析ではデータが得られなかった。

（Ｂ）修正方法により得られた物質の配列決定十分量の純粋物質を得て適切な最終的アミノ酸配列分
析を実施するため、スローン・ケタリングで産生される
ものと同様の膀胱癌細胞系5637の細胞（サブクローンIA
6）をイー・プラッツァー博士（Dr.E.Platzer）から入
手した。細胞を最初にフラスコ中のアイコブ（Iscove′
ｓ）培地〔ギブコ（GIBOC）、グランドアイランド、ニ
ューヨーク〕で培養し、集密化させた。集密化時、培養
物をトリプシン処理し、ローラーボトル中に藩種したが
（1.5フラスコ／ボトル）、各ボトルは５％CO₂下で予め
条件が整えられたアイコブ培地25mlを含有していた。細
胞を37℃,0.3rpmで一夜増殖させた。

サイトデックス−１（Cytodex−１）ビーズ〔ファル
マシア（Pharmacia）、ウプサラ、スウェーデン〕を洗
浄し、下記操作により滅菌した。ビーズ8gをボトルに加
え、PBS400mlを加えた。ビーズを３時間静かに攪拌して
懸濁させた。ビーズを静置させた後、PBSを排出し、ビ
ーズをPBSで洗浄し、新鮮PBSを加えた。ビーズを15分間
オートクレーブで処理した。使用前に、ビーズを、新鮮
培地＋10％牛胎児血清（FCS）添加前にアイコブ培地＋1
0％FCS中で洗浄し、処理ビーズを得た。

各ローラーボトルから30mlを除くすべての培地を除去
した後、新鮮培地＋10％FCS30ml及び処理ビーズ40mlを
ボトルに加えた。ボトルを５％CO₂処理し、すべての泡
を吸引除去した。ボトルを、速度0.3rpmに低下させる
前、ローラー台に3rpmで0.5時間載置した。３時間後、
別のフラスコ内容物をトリプシン処理し、ビース含有の
各ローラーボトルに加えた。

集密度40〜50％の時点でローラーボトル培養物をPBS5
0mlで洗浄し、PBS除去前10分間回転させた。細胞を培地
Ａ〔0.2％FCS、10^-8Mヒドロコルチゾン、2mMグルタミ
ン、100単位/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマ
イシン含有アミコブ培地〕中で48時間培養した。次い
で、培養上澄を3000rpmで15分間遠心分離して集め、−7
0℃で貯蔵した。培養物に10％FCS含有培地Ａを再度加
え、48時間培養した。培地を捨てた後、細胞を上記のよ
うにPBSで洗浄し、培地Ａ中で48時間培養した。上澄を
再度集め、上記のように処理した。

IA6細胞の培養培地約30リットルを、10,000M.W.遮断
装置をもつ２個のカセットを備えたミリポア・ペリコン
（Millipore Pellicon）ユニットにより、濾過速度約2
00ml/min及び保持速度約1000ml/minで約２リットルまで
濃縮した。濃縮物を同一装置及び同一流速により50mMト
リス（pH7.8）約10リットルで透析濾過した。透析濾過
濃縮物を50mMトリス（pH7.8）で平衡化された１リット
ルDEセルロースカラムに40ml/minで添加した。添加後、
カラムを50mMトリス（pH7.8）１リットル、次いで50mM
NaCl含有50mMトリス（pH7.8）２リットルにより同一
速度で洗浄した。カラムを次いでNaCl濃度が75mM,100m
M,125mM,150mM,200mM及び300mMの６種の50mMトリス（pH
7.5）１リットルで連続的に溶出させた。画分（50ml）
を集め、活性画分をプールし、YM5膜装備アミコン（Ami
con）限外濾過攪拌セルユニットで65mlに濃縮した。こ
の濃縮物をPBSで平衡化された２リットルのAcA54ゲル濾
過カラムに添加した。カラムを80ml/hrで操作し、10ml
画分を集めた。活性画分をプールし、C4高性能液体クロ
マトグラフィー（HPLC）カラムに直接添加した。

容量125〜850mlで、タンパク質１〜8mgを含有し、そ
の約10％がhpG−CSFである試料を、流速１〜4ml/minで
カラムに添加した。添加後、流速1ml/minで80％２−プ
ロパノール中の0.1M酢酸アンモニウム（pH6.0〜7.0）に
より洗浄した。1ml画分を集め、タンパク質について220
nm、260nm及び280nmでモニターした。

精製した結果、hpG−CSF含有画分を他のタンパク質含
有画分から（80の画分中72及び73番目の画分として）明
確に分離した。hpG−CSFは純度約80±５％及び収率約50
％で単離された（150〜300μｇ）。この精製物質９μｇ
を４号操作（Run＃４）アミノ酸配列分析に使用し、タ
ンパク質試料を非ポリブレンTFA活性ガラス繊維板に付
着させた。配列分析は、ヘウィックら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、第256巻、第7990
〜7997頁、1981年〔Hewick,et al.,J.Biol.Chem.,256,7
990−7997（1981）〕及びライ、アナリティカ・キミカ
・アクタ、第163巻、第243〜248頁、1984年〔Lai,Anal.
Chim.Acta,163,243−248（1984）〕の方法に従い、AB47
0A分析装置で実施した。４号操作の結果は表IIIに示さ
れている。

４号操作では、（表IIIの残基31に相当する）第31サ
イクルより先において、更に重要な配列情報は得られな
かった。長い明確な配列を得るために、５号操作（Run
＃５）においては、条件調整培地から精製されたhpG−C
SF14μｇを45℃で１時間β−メルカプトエタノール10ml
で還元し、次いで減圧下で完全に乾燥した。タンパク質
残基を次いで、ポリブレン化ガラス繊維板に付着させる
前に５％ギ酸に再溶解した。配列分析は上記４号操作と
同様にして実施した。５号操作の結果は表IVに示されて
いる。

表IVのアミノ酸配列は、下記hpG−CSF cDNAを得るた
めにプローブを組立てる上で、十分に長く（44残基）か
つ明確であった。

例２目的のcDNA配列を単離するための標準的操作の中に
は、標的遺伝子の発現に基づき選択されたドナー細胞中
に豊富に存在するmRNAの逆転写から得られるプラスミド
担持cDNA“ライブラリー”の調製が含まれる。ポリペプ
チドのアミノ酸配列の実質的部分が公知である場合に
は、“標的"cDNA中での存在が推定される配列を複製し
た標識一重鎖DNAプローブ配列が、一重鎖型に変性され
たcDNAのクローンコピーに対して実施されるDNA/DNAハ
イブリッド形成操作において使用され得る。ワイスマン
（Weissman）ら、米国特許第4,394,443号明細書、ウォ
レスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第６巻、
第3543〜3557頁、1979年〔Wallaec,et al.,Nucleic Ac
ids Res.,６,3543−3557（1979）〕、レイスら、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス（USA）、第79巻、第3270〜3274頁、1982
年〔Reyes,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），79,32
70−3274（1982）〕、及びジェイ（Jaye）ら、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ、第11巻、第2325〜2335、19
83年参照。更に、診断実施時におけるDNA/DNAハイブリ
ッド形成操作に関するファルコー（Falkow）らの米国特
許第4,358,535号明細書、及びコロニー及びプラークハ
イブリッド形成技術に関するデービスら、“遺伝子工
学、高等細菌遺伝学のマニュアル”、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー〔Davis,et al.,“Ａ M
anual for Genetic Engineering,Advanced Bacterial
Genetics",Cold Spring Harbor Laboratory〕・コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1980年、第
55〜58頁及び第174〜176頁参照。

完全RNAの定量的単離のためのグアニジニウムチオシ
アネート操作〔チャーグウィンら、バイオケミストリ
ー、第18巻、第5294〜5299頁、1979年（Chirgwin,et a
l.,Biochemistry,18,5294−5299（1979））〕により、
全RNAを膀胱癌細胞系5637（IA6）細胞約1gから抽出し
た。

無菌RNA水溶液はIA6細胞由来の全RNAを含有してい
た。全RNA溶液からメッセンジャーRNAのみを得るため、
溶液をオリゴデオキシチミジレート〔オリゴ（dT）〕
〔コラボレーティブ・リサーチ社（Collaborative Res
earch,Inc.）ウォルサム、マサチューセッツ〕含有カラ
ムに通した。メッセンジャーRNAに特有のポリアデニル
化（ポリA⁺）尾部はカラムに付着するが、リボソームRN
Aは溶出する。かかる操作の結果、ポリアデニル化メッ
センジャーRNA（ポリA⁺mRNA）約90μｇを単離した。単
離されたポリA⁺メッセンジャーRNAを、cDNA反応で使用
する前に、最終濃度4mMで５分間室温で水酸化メチル水
銀〔アルファ・ベントロン（Alpha Ventron）、デンバ
ーズ、マサチューセッツ〕により前処理した。水酸化メ
チル水銀処理は、翻訳を阻害するメッセンジャーRNA自
体の相互反応及びそれと汚染分子との相互反応を抑制さ
せた。ペイパーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、第258巻、第7636〜7642頁、1979年〔P
ayvar,et al.,J.Biol.Chem.,258,7636−7642（1979）〕
参照。

オカヤマ操作法〔オカヤマら、モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー、第２巻、第161〜170頁、19
82年（Okayama,et al.,Molcular ＆ Cellular Biology,
２,161−170（1982））〕に従い、cDNAバンクをIA6細胞
から得たmRNAにより調製した。cDNAを次いでインキュベ
ートして増幅用宿主微生物大腸菌Ｋ−12株HB 101に組
込んだ。

例３表IVのhpG−CSFアミノ末端配列に基づき考え出された
ハイブリッド形成プローブは、各々が長さ23塩基で３個
のイノシン残基を有する24組のオリゴヌクレオチドから
構成されていた。プローブオリゴヌクレオチドからカル
ザースら、ジェネティック・エンジニアリング、第４
巻、第１〜18頁、1982年〔（Caruthers,et al.,Genetic
Engineering,４,1−18（1982）〕の操作に従い製造
し、ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化（Kinasing）
することによりｒ−³²P ATPで標識した。表IVの配列中
残基23〜30のメッセンジャーRNAに対応するプローブオ
リゴヌクレオチドは、表Ｖに示されている。

中立性をＩに付与したのは、タカハシら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（USA）、第82巻、第1931〜1935頁、1985年〔Tak
ahashi,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），82,1931
−1935（1985）〕及びオーツから、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー、第260巻、第2605〜260
8頁、1985年〔Ohtuka.et al.,J.Biol.Chem.,260,2605−
2608（1985）〕の研究公表に基づいていた。しかしなが
ら、イノシンはＧ又はＴと塩基対形成した場合には脱安
定化効果を有する。タカハシらの場合では、イノシン
は、それが一群として平均化してほぼ中立化するに到る
ことから、中立効果を有するようである（例えば、３個
はＣと好ましく対形成したが、２個はＴと対形成し好ま
しくなかった）。

ＧとのＩ塩基対形成効果を試験するため、コントロー
ル実験をＮ−myc遺伝子配列及びクローンを用いて計画
した。Ｎ−myc遺伝子から得た配列は、hpG−CSFプロー
ブで規定されたものと同一の全体的Ｇ及びＣ含有率を、
各コドンの最初の２つの位置で有していた。したがっ
て、Ｎ−myc試験プローブは、hpG−CSFプローブと比較
し、同一の長さであり、同一の相対的位置にＩを含有
し、しかも潜在的に同一の平均Tm（62〜66℃、３又は４
個のイノシン残基を含有しているためではない）を有し
ていた。

２組のＮ−myc試験プローブを前記カルザースらの操
作に従い組立てた。表VIに示された第１組は、以下のも
のを含んでいた;1.完全対合体の23量体;2.3個の３位Ｃ
が、Ｉを加えた場合に最悪のケースを生じるようにＩで
置換されている;3.4個の３位がＩで置換されている。第
２組の試験プローブは、全体的な中立的塩基対形成効果
を与え得るイノシン塩基対のよりランダムな配置を表わ
すために考え出された。表VIに示された第２組は以下の
ものを含んでいた;4.Cと塩基対形成する２個のＩ及びＧ
塩基対形成する１個のＩを有する;5.I:G塩基対たるもう
１個のＩを有する４と同一である。

表 VI Ｎ−myc試験プローブ 1.⁵′CAC AAC TAT GCC GCC CCC TCC CC³′ 2.⁵′CAC AAC TAT GCI GCC CCI TCI CC³′ 3.⁵′CAI AAC TAT GCI GCC CCI TCI CC³′ 4.⁵′AAC GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC³′ 5.⁵′AAI GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC³′ Ｎ−myc DNA配列及びニワトリ成長ホルモンDNA配列
（陰性コントロール）を含有する５個のレプリカフィル
ターを、ハイブリッド形成前に、減圧オーブン中80℃で
２時間焼いた。すべてのフィルターは、ハイブリッド形
成時間が６時間のみであること以外、hpG−CSFプローブ
に関して例４で記載されたように、ハイブリッド形成し
た。フィルターを室温で３回しかる後45℃で１回各々10
分間洗浄した。フィルターをガイガーカウンターでモニ
ターした。

Ｎ−mycプローブ３のフィルターは他の４個のプロー
プフィルターと比較して非常に弱いシグナルを発したた
め、それ以上洗浄しなかった。50℃で10分間洗浄後、ガ
イガーカウンターは、プロープ１を100％標準として、
下記％シグナルを表示した：プローブ２、20％；プロー
ブ３（45℃）、２％；プローブ４、92％；及びプローブ
５、75％。55℃での洗浄後は、％が：プローブ２、16
％；プローブ４、100％；及びプローブ５、80％であっ
た。60℃での最終洗浄では下記％を表示した：プローブ
２、1.6％；プローブ４、90％；及びプローブ５、70
％。

このように、プローブ２及び４のように３個のＩが存
在する場合では、シグナルにおいて60倍までの差違が、
理論的Tm（Ｉは計算に含まれていない）は〔最悪のＩ塩
基対形成例（プローブ２）及び比較的中立なＩ塩基対形
成例（プローブ４）に関して〕近いにもかかわらず観察
される。

Ｎ−myc試験ハイブリッド形成により得られた標準化
情報は、より厳格でない洗浄による結果が許容され得る
信頼度を測定するために、下記のように洗浄及びhpG−C
SFハイブリッド形成のモニターに際して利用された。

例４ハナハンら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー、第166巻、第557〜580頁、1983年〔Hanahan,e
t al.,J.Mol.Biol.,166,557−580（1983）〕の操作に従
い、例２で産生されたcDNAインサート（insert）との組
換え体を含む細菌を、寒天プレート上に載置された24個
のニトロセルロースフィルター〔ミリポア（Millipor
e）、ベッドフォード、マサチューセッツ〕に拡散し
た。プレートを次いでインキュベートして約150,000個
のコロニーを得たが、これを24個の他のニトロセルロー
スフィルターに移してレプリカ培養した。レプリカを明
瞭なコロニーが出現するまでインキュベートした。フィ
ルター上の細菌を、10分間水酸化ナトリウム（0.5M）で
わずかに飽和され、しかる後２分間トリス（1M）でブロ
ットされ、次いで10分間NaCl（1.5M）含有トリス（0.5
M）でブロットされたワットマン3MM紙上で溶菌させた。
フィルターがほぼ乾燥した後、それらを核酸ハイブリッ
ド形成前に減圧オーブン中80℃で２時間焼いた。ウァー
ルら、プロシーディングス・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（USA）、第76巻、第3683〜3687頁、1
979年〔Wahl,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），76,
3683−3687（1979）〕、及びマニアティスら、セル、第
81巻、第163〜182頁、1976年〔Maniatis,et al.,Cell,8
1,163−182（1976）〕。

フィルターを10Xデンハード（Denhardt）0.2％SDS及
び6XSSC750ml中65℃で２時間、前ハイブリッド形成させ
た。フィルターを6XSSCで洗浄し、次いで４つバッグに
入れ、6XSSC及び10Xデンハード中で14時間ハイブリッド
形成された。50×10⁶cpmの³²P−標識プロープ（オリゴ
ヌクレオチド）を有するバッグ当たり、溶液約15mlが入
っていた。

ハイブリッド形成後、フィルターを6XSSC（１リット
ル／洗浄）中で３回室温で各々10分間洗浄した。フィル
ターを次いで6XSSC1リットルにより、45℃15分間で１回
洗浄した。フィルターを増強スクリーン及びコダックXA
R−２フィルムにより−70℃で２時間オートラジオグラ
フィーに付した。このオートラジオグラフでは、５個の
非常に強いシグナルを含む40〜50個の陽性シグナルが検
出された。

最強の５個のシグナル及び別の５個の陽性シグナルを
含む領域をマスタープレートからこすり落とし、同一条
件下同一プローブ混合物を用いて二次スクリーニングに
移した。洗浄操作は、高温洗浄が55℃15分間で各々２
回、及びしかる後の60℃15分間で１回からなる点で異な
っていた。例３のＮ−mycプローブ研究に基づき、二次
スクリーニングでの最終洗浄温度を上げたが、24個の23
量体に関する凝集融解温度がＮ−mycプローブの温度に
近似した60〜68℃であったためである。２回目の55℃で
の洗浄後、フィルターを湿潤させたままにし、オートラ
ジオグラフィーに付した。このオートラジオグラフィー
と、60℃での最終洗浄後同じ時間をかけた２回目のオー
トラジオグラフィーとの比較では、10個の被試クローン
のうち２個だけが55℃〜60℃以上に昇温させた場合にシ
グナルの実質的損失をうけないことが明らかになった。
これら２個のクローンは、ほぼ同一の長さ及び制限エン
ドヌクレアーゼパターンであることが後に示された。Pp
o2と称される１個のクローンを配列決定のため選択し
た。

上記操作で得られた組換えhpG−CSF cDNAクローンのP
po2の配列決定は、サンガーら、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（US
A）、第74巻、第5463〜5467頁、1977年〔Sanger,et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），74,5463−5467（197
7）〕のジデオキシ法により達成された。一重鎖DNAファ
ージＭ−13は、二重鎖cDNAクローンの一重鎖DNA鋳型を
供給するためのクローニングベクターとして使用した。
サンガーらの方法により、表VIIに示されているような
アミノ酸翻訳を伴う配列及びポリペプチドコード領域の
相補鎖が明らかとなった。

表VIIの下記特徴は顕著である。配列の５′末端に
は、ポリGcDNAリンカー配列に相当する塩基が示されて
いる。次いで約５個の塩基（“N"と表示されている）が
存在するが、その配列は前にある多数のＧのためにサン
ガーらの方法によっては容易に明確に決定することがで
きなかった。その後の配列は、ポリペプチドのリーダー
配列と推定される部分をコードする12個のコドンを表わ
す。例１に記載されたhpG−CSF天然単離物のアミノ末端
配列との対応により、hpG−CSFの推定的“成熟”型にお
ける最初のスレオーン残基は＋１で示されている。成熟
hpG−CSFは、示された如く174個の残基を有することが
その後示された。“停止”コドン（OPコドン、TGA）の
後に、約856塩基の非翻訳３′配列及びポリＡ“尾部”
の多数のＡが続く。唯一のHgiA I及びApa I制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位、並びに２つのStu I部位（原核
及び真核細菌発現系の組立てに関して以下で説明されて
いる）も表VIIに示されている。ポリペプチド中におけ
るアスパラジン残基の欠損のため、Ｎ−グリコシル化の
ための明確な部位は存在しない。３′非翻訳配列末端近
くで下線が引かれた６個の塩基は、潜在的ポリアデニル
化部位を表わす。

合計450,000個のクローンの中から上記ハイブリッド
形成操作により同定された２つの他のcDNAクローンの各
々が、転写開始部位以降の全リーダー配列をコードする
DNAを含有していなかったことは、注目に値する。なる
ほど、３つすべてのhpG−CSFクローンは正確に同一部位
の５′領域で集結しており、このことは転写されたmRNA
の二次構造がこの部位より先のcDNA形成を著しく阻害す
ることを示唆している。実際には、したがって、オカヤ
マら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ
ー、第３巻、第280〜289頁、1983年〔Okayama,et al.,M
ol.and Cell.Biol.,３,280−289（1983）〕に記載さ
れ、しかもウォンら、サイエンス、第228巻、第810〜81
4頁、1985年〔Wong,et al.,Science,228,810−814（198
5）〕においてGM−CSFを単離するために現実に利用され
たcDNA発現スクリーニングは、hpG−CSF DNAの単離に
簡単に利用することができなかったが、その理由は、か
かる単離系が通常被験クローン中における全長のcDNA転
写体の存否に依存しているからである。

上記配列は、微生物宿主におけるhpG−CSFの直接的発
現を確実化するには、困難である。かかる発現を確実に
するためhpG−CSFコード領域には開始ATGコドンを加え
るべきであり、しかもその配列は適切なプロモーター／
レギュレーターDNA配列の制御下にある部位で形質転換
ベクター中に挿入されるべきである。

例５この例では、前記例で単離されるようなhpG−CSFコー
ドcDNAを用いてゲノムクローンをスクリーニングした。
λファージヒト胎児肝ゲノムライブラリー〔ローンら、
セル、第15巻、第1157〜1174頁（Lawn,et al.,Cell,15,
1157−1174（1978））の操作に従い製造され、ティー・
マニアティス（T.Maniatis）から入手した〕を、HgiA I
及びStu Iで切断単離された２つのhpG−CSF cDNA断片
（HgiA I〜Stu I、649塩基対;Stu I〜Stu I、639塩基
対）からなるニック（nick）翻訳プローブを用いてスク
リーニングした。合計約500,000個のファージを12個の
ペトリ皿（15cm）で培養し、プラークを取出し、ベント
ン／デビソン（Benton/Davison）操作法〔ベントンら、
サイエンス、第196巻、第180頁、1977年（Benton,et a
l.,Science,196,180（1977））〕によりプローブとハイ
ブリッド形成させた。合計12個の陽性クローンが観察さ
れた。二次スクリーニングにおけるオートラジオグラフ
ィーで最強シグナルを生じた３個のクローン（１〜３）
を、１リットル培地中で増殖させ、放射線標識24量体オ
リゴヌクレオチド（γ−³²P ATPでキナーゼ処理されて
いる）５′CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGT3′を用いて制限酵
素切断及びサザーンブロット法（Southern blotting）
により遺伝子地図を作成した。地図作成結果は、単離体
１及び３が同一であって、単離体２がhpG−CSF遺伝子の
５′に付加した2000個の塩基を含有することを示してい
た。したがって、クローン２を更に特徴づけるために使
用した。クローン２のDNAをEcoR Iで切断して8500塩基
対のhpG−CSF含有断片を得、これを次いでpBR322に組込
んでサブクローニングし、更に制限エンドヌクレアーゼ
切断、サザーンブロット法、M13サブクローニング及び
配列決定により遺伝子地図を作成した。得られた配列は
VIIIに示されたとおりである。

hpG−CSF遺伝子を含有するゲノムDNAの制限エンドヌ
クレアーゼ地図（約3.4キロ塩基対）は図１で詳細に記
されている。図１で示された制限エンドヌクレアーゼ
は、Nco I,N;Pst I,P;BamH I,B;Apa I,A;Xho I,X;及びK
pn,Kである。図の下方の矢印は、ゲノム配列を得るため
に利用される配列決定方法を示す。ボックス領域はcDNA
クローン中の領域であり、点線の端部ボックスはcDNAク
ローン中に存在しないもののmRNAブロット法により同定
された配列を表わす。エキソン配列たるコード配列の同
定をノーザン（Northern）ブロット法により実施した。
エキソン１及び２における推定的スプライス部位にまた
がる24量体オリゴヌクレオチドプローブ、５′CAGCAGCT
GCAGGGCCATCAGCTT3′を、ノーザンブロット法でhpG−CS
F mRNAとハイブリッド形成させた。得たブロットは、
エキソン２のオリゴヌクレオチドプローブの場合と同様
のサイズ（1650塩基対以下）のmRNAを示す。このデータ
は、表VIIIで示されるMet開始コドンを用いたpSVGM−Pp
o1ベクター（例９）によるhpG−CSFの直接的発現能と一
緒に考え合わされた場合に、エキソン１に含有されるコ
ード配列を規定する。エキソン２〜５は、hpG−CSF遺伝
子（表VII）のcDNAクローン（Ppo2）において得られる
コード配列による規定される。

例６この例は、hpG−CSFをコードしかつ大腸菌優先コドン
を含有する人工遺伝子の製造に関する。

簡潔に述べると、用いられたプロトコールは、全般的
に、参考のため本明細書に包含される共有権者アルトン
（Alton）らのPCT公開第WO83/04053号明細書の開示に示
されているとおりであった。遺伝子は、成分オリゴヌク
レオチドが多数の二重鎖にまず集合するように考えら
れ、二重鎖は次いで３つの別個のセクションにまとめら
れた。これらセクションは簡易な増幅用として考えら
れ、増幅系から除去された後に、適切な発現ベクター中
に連続的に又は多数の断片結合を介してまとめることが
できた。

セクションI,II及びIIIの構造は表IX〜XIVに示されて
いる。表IX及びＸに示されたセクションＩの構造におい
て、オリゴヌクレオチド１〜14は７本の二重鎖（１及び
8;2及び9;3及び10;4及び11;5及び12;6及び13;7及び14）
にまとめられた。７本の二重鎖を次いで結合し、表Ｘに
示されるセクションＩを形成した。表Ｘにおいて、セク
ションＩは増幅・発現ベクターとの結合及びセクション
IIとの結合のために用いらる上流Xba I付着端及び下流B
amH I付着端を含有することにも着目されるであろう。

表XI及びXIIに示されるセクションIIの構造におい
て、オリゴヌクレオチド15〜30は８本の二重鎖（15及び
23;16及び24;17及び25;18及び26;19及び27;20及び28;21
及び29;22及び30）にまとめられた。これら８本の二重
鎖を次いで結合し、表XIIに示されるセクションIIを形
成した。表XIIで更に示されるように、セクションIIは
増幅ベクターとの結合及びセクションＩとの結合のため
に用いられる上流BamH I付着端及び下流EcoR I付着端を
有する。その下端部近くでは、セクションIIは最後の結
合セクションII及びIIIに用いられる下流Sst I部位も有
している。

最後に、セクションIIIは表XIII及びXIVに示されてい
るように組立てられた。この組立てのために、オリゴヌ
クレオチド31〜42の６本の二重鎖（31及び37;32及び38;
33及び39;34及び40;35及び41;36及び42）にまとめられ
た。６本の二重鎖を次いで結合し、表XIVに示されるセ
クションIIIを形成した。表XIVでも示されているよう
に、セクションIIIは、増幅ベクター、及び少なくともE
coR I末端の場合には発現ベクターとの結合のために用
いられる上流BamH I付着端及び下流EcoR I付着端を含有
する。しかもセクションIIIは、セクションII及びIIIの
最終的結合に用いられる上流Sst I部位を有している。

セクションＩで形成されたXba I〜BamH I断片を、Xba
I及びBamH Iで開環されたM13mp11ファージベクターに
結合する。ベクターを次いでBamH I及びEcoR Iで切断す
ることにより再開環し、次いでセクションIIで形成され
たBamH I〜EcoR I断片と結合する。この段階で、セクシ
ョンＩ及びIIは適切な方向で結合された。次いで別のM1
3mp11ベクターをBamH I〜EcoR I切断で開環し、しかる
後セクションIIIで形成されたBamH I〜EcoR I断片と結
合した。

セクションＩ及びII含有ベクターをXba I及びSst Iで
切断する。同様に、セクションIII含有ベクターをSst I
及びEcoR Iで切断する。各々の切断で得る２つの断片の
うち小断片の両方を、事前にXba I及びEcoR Iで開環さ
れたプラスミドpCFM1156に結合する。この反応の生成物
は表XVに示される連続DNA配列含有の発現プラスミドで
あって、そのDNA配列は大腸菌翻訳開始用のアミノ末端
メチオニンコドン（ATG）をもつ完全hpG−CSFポリペプ
チドをコードしている。

いずれの適切なベクターもこのDNA発現のために使用
することができるが、発現プラスミドpCFM1156はプラス
ミドpCFM836から容易に組立てることができ、その構造
は公開欧州特許出願第136,490号明細書に記載されてい
るpCFM836をまずNde Iで切断し、次いで両方に存在する
Nde I部位が破壊されるようにPol Iでブラント末端化す
る。次いで、ベクターをCla I及びSac IIで切断して、
存在するポリリンカーを除去し、しかる後表XVIに示さ
れる代替ポリリンカーに結合する。この代替ポリリンカ
ーは、前記アルトンらの操作に従い組立てることができ
る。なお、プラスミドpCFM836は、pCFM736（後述）をBa
mH Iで切断し、下記の断片を挿入することによって得ら
れる。

BamH I Sst II BamH I ５′−GATCCGCGGATAAATAAGTAAC−３′ ３′− GCGCCTATTTATTCATTGCTAG−５′ 発現pCFM1156プラスミドにおける発現制御はλP_Lプロ
モーターによるが、これ自体が（大腸菌株12ΔHtrpから
得られるような）C_I857リプレッサー遺伝子の制御下に
ある。

例７この例は、〔Met^-1〕hpG−CSFコードDNA配列によるhp
G−CSFポリペプチドの大腸菌発現に関する。使用された
配列は、部分的に合成で、部分的にcDNA由来であった。
使用された合成配列は大腸菌優先コドンであった。

表VIIに示されたhpG−CSF遺伝子含有プラスミドPpo2
をHgiA I及びStu Iで切断して、約645塩基対の断片を得
たが、この断片は５′末端の７個のリーダー配列残基コ
ドン及び３′非コード領域の約100塩基対をもつ（表VII
に示されるような）成熟hpG−CSF遺伝子を含有してい
た。HgiA I切断ではPst I切断の場合と同一の５′の４
塩基付着端を残し、Stu Iではブラント末端を残す。こ
れにより、PstI及びブラント末端形成制限酵素Hinc II
で切断されたM13mp8（Rf）に断片を容易に挿入すること
ができる。M13中で増幅させた後、hpG−CSF DNAをApa
I及びBamH Iで切断するこのにより摘出したが、これは
それぞれhpG−CSFにおける＋３〜＋５残基コドン間にま
たがるApa I部位、及びM13mp8制限ポリリンカーにおけ
るHinc II部位の“下流”のBamH I部位において切断さ
れたものである。hpG−CSFポリペプチドの大腸菌発現を
可能にするため、合成断片を下記表XVIIに示されるよう
に製造した。

表XVIIの分析から調べ得るように、リンカーは、Apa
I付着端、hpG−CSFアミノ末端の最初の３個の残基を特
定コドン（上記M13DNAのApa I消化で削除されたThr¹,Pr
o²,Leu³指定コドンを回復させ、かつ大腸菌中で優先的
に発現するコドンを採用）、翻訳開始ATG、リボソーム
結合部位を付与する24塩基対配列、及びXba I付着端を
有している。

大腸菌発現用に使用される発現ベクターは、1985年４
月10日に公開されたモリス（Morris）の欧州特許出願第
136,490号明細書においてpCFM536として記載されたベク
ターである（更に、pCFM536含有の大腸菌JM103,ブタペ
スト条約に基づく寄託における受託番号、ATCC39934参
照）。簡単にいえば、まずプラスミドpCFM536をXba I及
びBamH Iで切断した。上記hpG−CSF断片（Apa I/BamH
I）及びリンカーXba I/Apa I）を次いでそれに結合し、
プラスミドp536Ppo2を形成した。

プラスミドp536Ppo2を、C_I857遺伝子含有プラスミドp
MW1（pMW1含有の大腸菌JM103、ブタプスト条約に基づく
寄託における受託番号、ATCC No.39933）で予め形質転
換された大腸菌AM7株のファージ耐性変異体に組込ん
だ。形質転換は、pCFM536前駆体プラスミドに担持され
た抗生物質（amp）耐性マーカー遺伝子に基づき確認し
た。LBブロス（アンピシリン50μg/ml）中での細胞培養
物を28℃に維持し、A₆₀₀＝0.5の培養細胞増殖時におい
て培養物を温度42℃に３時間上げて、hpG−CSF発現を誘
導した。培養物の最終ODはA₆₀₀＝1.2であった。

形質転換細胞によるhpG−CSF発現レベルは、クマシー
ブル一色素で染色されたSDSポリアクリルアミドゲルに
より、総細胞タンパク質３〜５％と評価された。

細胞をJS−4.2ローター中3500×ｇで10分間遠心分離
して回収した。水中25％（w/v）の細胞をフレンチ・プ
レッシャー・セル（French Pressure Cell）に10,000p
si（700kg/cm²）で３回通して破壊した。破壊細胞懸濁
液をJA−20ローター中10,000×ｇで15分間遠心分離し
た。ペレットを水に再懸濁し、pH8.7の１％ラウリン酸5
0mMトリス中に総タンパク質濃度約5mg/mlで溶解させ
た。溶解ペレット物質を15,000×ｇで10分間遠心分離
し、上澄にCuSO₄を20mMまで加えた。１時間後、この試
料を、例１（Ｂ）の操作に従い精製するため、容量及び
濃度を調整して、C4HPLCカラムに充填した。

非有機物含有緩衝液中で調製された更に多量のhpG−C
SFを得るために第二の精製法が開発された。この物質は
イン・ビボ研究に適する。細胞ペースト150gを1mM DTT
約600mlに再懸濁し、約7000psi（490kg/cm²）でマント
ン・グアリン（Manton Gualin）ホモジナイザーに４回
通した。破壊細胞懸濁液を10,000×ｇで30分間遠心分離
し、ペレットを１％デオキシコール酸、5mM EDTA、5mM
DTT及び5mMトリスのpH9の400mlに再懸濁した。この懸濁
液を室温で30分間混合し、10,000×ｇで30分間遠心分離
した。ペレットを水約400mlに再懸濁し、10,000×ｇで3
0分間遠心分離した。ペレットを２％ザルコシル及び5mM
トリスpH8の100mlに溶解した。CuSO₄を20μＭまで加
え、混合物を室温で16時間撹拌し、しかる後、20,000×
ｇで30分間遠心分離した。上澄にアセトン300mlを加え
た。この混合物を氷上に20分間おき、しかる後5000×ｇ
で30分間遠心分離した。ペレットをpH4の6Mグアニジン
及び40mM酢酸ナトリウムの250mlに溶解し、平衡化され
た1200mlのＧ−25カラムに充填し、pH5.4の20mM酢酸ナ
トリウムで操作した。hpG−CSFピーク（約400ml）をプ
ールし、pH5.4の20mM酢酸ナトリウムで平衡化された15m
lのCMセルロースカラムに加えた。充填後、カラムを60m
lのpH5.4の20mM酢酸ナトリウム及び25mM塩化ナトリウム
で洗浄し、しかる後カラムを200mlのpH5.4の20mM酢酸ナ
トリウム及び37mM塩化ナトリウムで溶出させた。この溶
出液150mlを10mlに濃縮し、平衡化された300mlのＧ−75
カラムに充填し、pH5.4の20mM酢酸ナトリウム及び100mM
塩化ナトリウムで操作した。ピーク画分35mlをプール
し、フィルター滅菌した。hpG−CSFの最終濃度は、1.5m
g/mlであったが、ゲル分析で測定した場合純度95％以上
であり、hpG−CSF0.5mgにつき発熱性物質を0.5ng以下で
含有していた。発熱性物質レベルは、カブトガニ遊走細
胞溶離物（LAL）試験キット〔エム・エー・バイオプロ
ダクツ（M.A.Bioproducts）、ウォーカースビス、メリ
ーランド〕により測定した。

例８この例は、17,36,42,64及び74位に存在するシステイ
ン残基が各々適切なアミノ酸残基で置換されたhpG−CSF
類縁体を産生する組換え方法の利用に関する。

1985年２月28日公開されたスーザ（Souza）らの公開P
CT出願第WO85/00817号明細書の特定部位突然変異誘発
は、下記表XVIIIに示された大きさが20〜23塩基の合成
オリゴヌクレオチドを用いて、下記プラスミドp536Ppo2
の〔Met^-1〕コードDNA上で行なわれた。オリゴヌクレオ
チド１は〔Ser¹⁷〕hpG−CSFコード遺伝子の形成が可能
で、オリゴヌクレオチド２は〔Ser³⁶〕hpG−CSFの形成
が可能であった。

CysからSerへの限定的突然変異誘発は、鋳型としてp5
36Ppo2から単離されたXba I−BamH I hpG−CSF断片含
有のM13mp10を用いて実施した。Cys−Ser置換体含有の
各M13mp10由来のDNAをXba I及びBamH Iで処理した。得
た断片を発現ベクターpCFM746に組込んでクローニング
し、発現産物を例７のように単離した。

プラスミドpCFM746は、1985年２月28日に公開された
モリス（Morris）の公開PCT出願第WO85/00829号明細書
に記載されているように、Cla I及びBamH Iでプラスミ
ドpCFM736を切断し、存在するポリリンカーを除去し、
下記ポリリンカーで置換することにより組立てることが
できる。

なお、pCFM736は、pCFM536（ATCC39934）から、次の
手順によりpCFM636を経由し、組立てることができる。
まず、pCFM536をEcoR I部分的切断及びSst I切断するこ
とにより、アンピシリン耐性遺伝子配列及び安定化配列
（par）を欠失させた後、EcoR I部位は、リンカーによ
ってAat II部位に変換する。一方、プラスミドTn5（Bec
k等のGene,19,p327−336（1982）あるいはAuerswald等
のCold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,45p107−113
（1981）に全塩基配列が示されている。）から、カナマ
イシン耐性遺伝子配列を含むSma I/Hind III断片領域
を、Sst IリンカーをSma I粘着末端に、且つNde Iリン
カーをHind III粘着末端に付加することにより、Sst I/
Nde I断片として得る。また、pSC101（受託番号、ATCC3
7032）から、par遺伝子を含むHinc II/Ava I断片領域
を、Hinc II部位は最初にSal Iリンカーで次いでAat II
リンカーで処理し、また、Ava I部位は最初にBamH Iリ
ンカーで次いでNde Iリンカーで処理し、Aat II/Nde I
断片として得る。

pCFM536の大きな断片（Aat II/Sst I）、カナマイシ
ン耐性遺伝子の断片（Sst I/Nde I）およびpar遺伝子断
片（Aat II/Nde I）を混ぜ合わせて結合し、pCFM636が
得られる。

pCFM636をAat II及びXba Iにより切断後、下記のAat
IIからXba Iまでの断片を挿入し、pCFM736を得る。

本発明のCys−Ser（CysからSerへの）類縁体の精製操
作において、細胞ペースト約10〜15gを1mM DTT40mlに
再懸濁し、フレンチ・プレッシャー・セルに10,000psi
（700kg/cm²）で３回通した。破壊細胞懸濁液を1000×
ｇで30分間遠心分離した。ペレットをpH9の１％DOC,5mM
EDTA,5mM DTT,50mMトリスに再懸濁し、室温で30分間
混合した。混合物を10,000×ｇで30分間遠心分離し、H₂
O40mlに再懸濁し、10,000×ｇで30分間再遠心分離し
た。ペレットをpH8の２％ザルコシル、50mM DTT,50mM
トリスの10mlに溶解した。１時間混合後、混合物を20,0
00×ｇで30分間遠心分離して清澄化し、しかる後平衡化
された300mlのＧ−75カラムに充填し、pH8の１％ザルコ
シル、50mMトリスで操作した。類縁体含有画分をプール
し、少なくとも１日間空気にさらして空気酸化させた。
最終濃度は0.5〜5mg/mlの範囲であった。

例９この例において、哺乳動物細胞発現系は、hpG−CSF
DNAの活性ポリペプチド産物が哺乳動物細胞（COS−1,AT
CC CRL−1650）中で発現されかつそこから分泌される
か否かを確認するため、工夫された。この系は、ウォン
ら、サイエンス、第228巻、第810〜815頁、1985年〔Won
g,et al.,Science,228,810−815（1985）〕及びリー
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（USA）、第82巻、第4360〜4364
頁、1985年〔Lee,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A），82,4360−4364（1985）〕におけるヒトGM−CSFに
属する残基配列を有したリーダーポリペプチドの後に位
置して〔Ala¹〕hpG−CSFをコードする、部分的合成部分
的cDNA由来構造体の発現分泌プロセッシングを介して、
hpG−CSFポリペプチド類縁体を分泌させるように考え出
された。

本発明のポリペプチド産物の予備的発現研究のために
使用される発現ベクターは、ウィルス性プロモーター／
レギュレーターDNA配列の制御下で挿入外来性DNAを哺乳
動物細胞発現すると共に哺乳動物細胞及び大腸菌の双方
において自律複製するように考え出されたpBR322及びSV
40DNAの双方を組込んでいる“シャトル（shuttle）”ベ
クターであった。大腸菌HB101に担持されたこのベクタ
ーpSVDM−19は1985年８月23日にアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション、12301パークローン・ドラ
イブ、ロックビル、メリーランドにブタペスト条約に基
づいて寄託され、受託番号ATCC第53241号が付された。

発現ベクター組立てに必要な具体的操作は下記のとお
りであった。リーダーコードDNA配列を下記表XXに示し
たように合成した。

表XXに示されているように、配列は、Hind III及びAp
a I付着端、及びヒトGM−CSFの“リーダー”に属する17
個のアミノ酸残基のコドンを有している。アラニン残
基、プロリン残基及びロイシン残基を特定するコドンが
続いている。プロリン及びロイシン残基はhpG−CSFの＋
２及び＋３位に存在するアミノ酸の複製で、一方アラニ
ン残基はhpG−CSF以外のGM−CSFの開始アミノ末端（＋
１）残基の複製である。スレオニンのアラニンによる置
換は、GM−CSF分泌プロセッシングに通常伴う細胞メカ
ニズムによるGM−CSFリーダーの適切な宿主細胞”プロ
セッシング・オフ（processing off）”を促進させるた
めに考え出された。

プラスミドpSXDM−19をKpn Iで切断し、その部位をク
レノウ酵素でブラント末端化した。次いでDNAをHind II
Iで切断した。得られた大断片を表VIIに示されるHind I
II/Pvu II断片（Hind III断片及びPvu IIでの部分的切
断から得る２番目の大きな断片としてプラスミドPp02か
ら単離された）と混合して結合し、プラスミドpSV−Ppo
1を形成した。表XXの人工GM−CSFリーダー配列断片を次
いで（Hind III及びApa Iで切断後の）pSV−Ppo1に結合
し、プラスミドpSVGM−Ppo1を得た。

プラスミドpSVGM−Ppo1DNAのリン酸カルシウム沈降物
（１〜５μｇ）を、ウィグラーら、セル、第14巻、第72
5〜731頁、1978年〔Wigler,et al.,Cell,14,725−731
（1978）〕に実質的に記載されているようなCOS−１細
胞の２個の60mmプレートに組込んだ。コントロールとし
て、プラスミドpSVGM−19もCOS−１細胞に組込んだ。組
織培養上澄を形質転換後５日目に回収し、hpG−CSF活性
について試験した。培養上澄からの〔Ala¹〕hpG−CSF収
量は、１〜2.5μg/mlであった。

COS−１細胞における〔Ala¹〕hpG−CSF産物コードプ
ラスミドpSVGM−Ppo1の上首尾な発現の後、ヒトGM−CSF
リーダー配列を含む一方で、スレオニン残基（hpG−CSF
の１位に元来存在する）のコドンをその位置のアラニン
のコドンに代わって有する他のベクターを組立てた。簡
単に言えば、オリゴヌクレオチドが特定部位の突然変異
誘発（SDM）用に合成された（５′CAGCATCTCTACACCTCTG
GG）。pSVGM−Ppo1におけるHind III−BamH I hpG−CS
F断片をSDM用にM13mp10と結合した。１位にThrコドンを
有する新規合成hpG−CSF遺伝子をHind III及びEcoR Iで
切断して単離した。断片を次いで、同一の２つの制限エ
ンドヌクレアーゼによる切断から得られたpSVDM−19に
組込んで複製した。得られるベクターpSVGM−Ppo（Th
r）をCOS細胞に組込んで形質転換したが、培養上澄中で
測定されるhpG−CSFの収量は１〜５μg/mlの範囲であっ
た。

最後に、単離法が例５に記載されているゲノム配列を
用いて、hpG−CSFの哺乳動物細胞発現用の発現ベクター
を形成した。更に詳しくは、pSVDM−19をKpn I及びHind
IIIで切断し、大断片を表XXIに示されるHinc III及びN
co I粘着端含有合成リンカーとの四者結合に使用した。
エキソン１含有Nco I−BamH I断片はpBR322（8500hpG−
CSFゲノムサブクローン）から単離し、エキソン２〜５
含有BamH I−Kpn I断片はプラスミドpBR322（8500hpG−
CSFゲノムサブクローン）から単離した。得られる哺乳
動物発現ベクターpSV/ghG−CSFは形質転換COS細胞から
１〜2.5μg/mlのhpG−CSFを産生した。

表 XXI Hind III^５ ′AGCTTCCAACAC AGGTTGTGGTAC⁵′ Nco I 例10 この例は、本発明の組換えポリペプチド産物の物理的
及び生物学的性質に関する。

1.分子量例７における大腸菌発現の組換えhpG−CSF産物は（表
VIIの演繹的アミノ酸分析から予測されるように）還元S
DS−PAGEで測定した場合の見掛分子量が18.8キロダルト
ンであったが、一方例１で記載したようにして精製され
た天然単離体は見掛の分子量が19.6キロダルトンであっ
た。天然単離体と会合したＮ−グリカン類の存在は、表
VIIのhpG−CSF一次配列中にアスパラギン残基が欠損し
ていることから、実際上無視することができ、したがっ
て、操作はＯ−グリカン類が天然単離体及び非グリコシ
ド組換え産物間の分子量差の原因であるか否かを調べる
ように工夫した。天然単離物質約５μｇをノイラミニダ
ーゼ〔カルビオケム（Calbiochem）、ラホラ、カリフォ
ルニア〕で処理し、試料0.5μｇを取出し、残留物質を
Ｏ−グリカナーゼ〔エンド−ｘ−ｎ−アセチルガラクト
ースアミニダーゼ、ジェンザイム（Genzyme）、ボスト
ン、マサチューセッツ〕4mUと37℃でインキュベートし
た。一部をインキュベートの0.5,2及び４時間後に取出
した。これら試料を大腸菌由来組換え物質と並べてSDS
−PAGEに付した。ノイラミニターゼ処理後、単離体の見
掛分子量は19.6キロダルトンから19.2キロダルトンに変
わったが、このことはシアル酸残基の離脱を示唆する。
Ｏ−グリカナーゼ処理の２時間後、分子量は18.8キロダ
ルトンに変わったが、これは大腸菌由来物質の見掛分子
量と一致する。ノイラミニダーゼ及びＯ−グリカナーゼ
に対する炭水化物構造体の感受性から判断すると炭水化
物成分として下記構造体が示唆される:N−アセチルノイ
ラミン酸−α（２−６）ガラクトースβ（１−３）Ｎ−
アセチルガラクトサミン−Ｒ（Ｒはセリン又はスレオニ
ンである）。

2.³H−チミジン取込みヒト骨髄細胞の増殖誘導を³H−チミジンの取込み増加
に基づき分析した。健康ドナー者のヒト骨髄をフィコー
ル−ハイパック（Ficoll−Hyapaque）（1.077g/ml、フ
ァルマシア）による密度分離に付し、低密度細胞を10％
牛胎児血清及びグルタミンペニシリン・ストレプトマイ
シン含有のイスコブ倍地〔Gibco（ギブコ）〕に懸濁し
た。次いで、ヒト骨髄細胞２×10⁴個を96個の平底ウェ
ルプレート中コントロール培地又は例７の組換え大腸菌
物質と一緒に37℃空気中５％CO₂で２日間インキュベー
トした。試料を重複して分析したが、濃度は10,000倍以
上異なっていた。培養物に次いで³H−チミジン〔ニュー
・イングランド・ヌクレア（New England Nuclea
r）、ボスマン、マサチューセッツ〕0.5μCi/ウェルを
加えた。³H−チミジン取込み量をベンチュアら、ブラッ
ド、第61巻、第781頁、1983年〔Ventua,et al.,Blood,6
1,781（1983）〕に記載されているように測定した。こ
の分析において、ヒトhpG−CSF単離体は、コントロール
上澄よりも約４〜10倍高いレベルで、ヒト骨髄細胞中に
³H−チミジンを取込ませることができる。例７は大腸菌
由来のhpG−CSF物質も同様の性質を有していた。

２回目のヒト骨髄細胞増殖研究は、例９で製造された
形質転換COS−１細胞の培養培地を用いて実施され、同
様の結果を与えたが、ことことはコードされたポリペプ
チド産物が活性物質として培地中に実際に分泌されるこ
とを意味する。

3.WEHI−3B D⁺分化誘導マウス骨髄単球性白血病細胞WEHI−3B D⁺の分化を誘
導する組換え大腸菌由来物質の能力を、メトカーフ、イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、第
25巻、第225巻、1980年〔Metcalf,Int.J.Cancer,25,225
（1980）〕に記載されているように、半固体寒天培地中
で分析した。組換えhpG−CSF産物及び培地コントロール
を30℃空気中５％CO₂で７日間60個以下のWEHI−3B D⁺
細胞／ウェルと一緒にインキュベートした。試料を24個
の平底ウェルプレート中でインキュベートしたが、濃度
は2000倍以上異なっていた。コロニーを未分化、部分的
分化又は全部分化のコロニーに分類し、コロニー数を顕
微鏡で計測した。大腸菌組換え物質は分化を誘導するこ
とが判明した。

4.CFU−GM,BFU−Ｅ及びCFU−GEMM分析多分化能性ヒトＧ−CSF（hpG−CSF）の天然単離体及
び組換え多分化能性ヒトＧ−CSF（hpG−CSF）は、ヒト
骨髄細胞を増殖かつ分化させることが判明した。これら
の活性は、CFU−GM〔ブロックスマイヤーら、エクスペ
リメンタル・ヘマトロジー、第５巻、第87頁、1971年
（Broxmeyer,et al.,Exp.Hematol.,５,87（197
1））〕、BFU−Ｅ及びCFU−GEMM試験方〔ルーら、ブラ
ッド、第61巻、第250頁、1983年（Lu,et al.,Blood,61,
250（1983））〕により、健康ヒトボランティアの低密
度非付着骨髄細胞を用いて測定した。各々500単位のhpG
−CSF又はrhpG−CSFを用いたCFU−GM,BFU−Ｅ及びCFU−
GEMM生物学的活性の比較は、下記表XXIIに示されてい
る。

すべてのコロニー分析は、低密度非付着性骨髄細胞を
用いて実施した。ヒト骨髄細胞をフィコールハイパック
（密度1.077g/cm³、ファルマシア）による密度分離に付
した。低密度細胞を次いで牛胎児血清含有のイスコブ修
正ダルベッコ（Dulbecco）培地に再懸濁、ファルコン組
織培養皿〔No.3003、ベクトン・ディケンソン（Becton
Dikenson）コッキーズビル、メリーランド〕上に付着さ
せるために37℃で1.5時間入れておいた。

培地コントロールは、10％FCS、0.2mMヘミン及び組換
えエリスロポエチン１単位含有イスコブ修正ダルベッコ
培地であった。

CFU−GM分析の場合では、標的細胞は、補充マッコイ
（McCoy）5A培地及び10％熱不活性牛胎児血清を含有す
る0.3％寒天培地1ml中１×10⁵個で培養した。培養７日
間、培養物のコロニー（凝縮物当たり細胞数40以上）に
ついて計数し、形態を観察した。コロニー数は、４個の
同一プレートから測定される平均±SEMとして示されて
いる。

BFU−Ｅ及びCFU−GEMM分析の場合では、細胞（１×10
⁵）をイスコブ修正ダルベッコ培地〔ギブコ（Gibc
o）〕、0.8％メチルセルロース、30％牛胎児血清、0.05
nM2−メルカプトエタノール、0.2mMヘミン及び組換えエ
リスロポエチン１単位の混合物1mlに加えた。皿を５％C
O₂及び５％O₂湿気雰囲気中でインキュベートした。レミ
ング・バイオインスツルメンツ（Reming Bioinstrument
s）〔シラキュース（Syraccese）、ニューヨーク〕の酸
素減少器により低酸素圧にした。コロニーをインキュベ
ート14日後に計測した。コロニー数は、２個の同一プレ
ートから測定される平均±SEMとして示されている。

CFU−GM分析で形成されたコロニーは、すべて、クロ
ロアセテートエステラーゼ陽性でかつ非特異的エステラ
ーゼ（α−ナフチルアセテートエステラーゼ）陰性であ
ることが判明し、顆粒球型のコロニーと一致した。天然
hpG−CSF及びrhpG−CSFは双方とも、CFU−GM分析におけ
る連続希釈により分析した場合、約１×10⁸U/mg純粋タ
ンパク質の特異的活性を有することが判明した。表XXII
のBFU−Ｅ及びCFU−GEMMデータは、３つの別個の実験を
表示しており、天然hpG−CSFに関し過去に報告されたデ
ータと類似する。rhpG−CSFが大腸菌中で産生されてい
ることから、極めて純粋でありかつ他の潜在的哺乳動物
成長因子を含有しないことに注目することは重要であ
る。このように、rhpG−CSFは組換えエリスロポエチン
の存在下で加えられた場合に、混合コロニー形成（CFU
−GEMM）及びBFU−Ｅを補助することができる。

5.細胞結合試験 WEHI−3B（D⁺）細胞及び新たに診断された白血病患者
のヒト白血球は¹²⁵I−標識マウスＧ−CSFに結合する
が、この結果は未標識Ｇ−CSF又はヒトCSF−βの添加に
より競合させることができる、と過去に報告された。ヒ
ト及びマウスの白血球に対して¹²⁵I−hpG−CSFの結合に
競合する天然hpG−CSF及びrhpG−CSFの能力に関し試験
した。高度に精製された天然hpG−CSF（純度95％以上、
１μｇ）がヨウ素化〔デジェドーら、アナリティカル・
バイオケミストリー、第127巻、第143頁、1982年（Teje
dor,et al.,Anal.Biochem.,127,143（1982））〕され、
ゲル濾過及びイオン交換クロマトグラフィーにより反応
物から分離された。天然¹²⁵I−hpG−CSFの比活性は約10
0μCi/μｇタンパク質であった。マウスWEHI−3B（D⁺）
及び２種のヒト末梢血骨髄白血病細胞（ANLL、１つはM
4、他はM5Bとして分類される）を¹²⁵I−hpG−CSFとの結
合能について試験した。

マウス及び新しく得たヒトの末梢血骨髄白血病細胞を
PBS/1％BSAで３回洗浄した。WEHI−3B（D⁺）細胞（５×
10⁶個）又は新鮮白血病細胞（３×10⁶個）を、各種濃度
（容量:10μ）の未標識hpG−CSF,rhpG−CSF又はGM−C
SFの存在又は非存在下、及び¹²⁵I−hpG−CSF（約100,00
0cpm又は1ng）の存在下、PBS/1％BSA（100μ）中０℃
90分間２連でインキュベートした（総容量:120μ）。
細胞を次いで350μプラスチック製遠心管中の氷冷FCS
200μに再懸濁して積層し、遠心分離（1000×g;1分
間）した。ペレットを管端部切断により集め、ペレット
及び上澄を別々にガンマカウンター〔パッカード（Pack
ard）〕で計測した。

特異的結合量（cpm）は、競合物の非存在下における
総結合量（２連の平均）−100倍過剰の未標識hpG−CSF
の存在下における結合量（非特異結合量）（cpm）とし
て計算した。非特異的結合量は、最大で、WEHI−3B
（D⁺）細胞の場合が2503cpm,ANLL（M4）の細胞の場合が
1072cpm,ANLL（M5B）の細胞の場合が1125cpmであった。
実験１及び２は同一の¹²⁵I−hpG−CSF調製物を用いて異
なる日に実施したが、hpG−CSF200単位の場合の阻害率
においては内部均一慣性を示す。得られたデータは下記
表XXIIIに示されている。

表XXIIIに示されているように、¹²⁵I−hpG−CSFはWEH
I−3B（D⁺）白血病細胞との結合性を示した。結合は、G
M−CSFではなく未標識天然hpG−CSF又はrhpG−CSFによ
り用量依存的に阻害された。しかも、ヒト骨髄単球性白
血病細胞（ANLL,M4）に対する天然hpG−CSFの結合も観
察された。これら細胞への結合性は、液体培養物中の天
然hpG−CSFに応じて、形態学的に判断されるマクロファ
ージへの分化と比較される。別の患者の単球性白血病細
胞（ANLL,M5B）との天然¹²⁵I−hpG−CSFの結合性の欠如
は、特定の白血病が特異的に発現したか、又はhpG−CSF
に対するレセプターを欠くことを示唆する。天然hpG−C
SFと同様に天然¹²⁵I−標識−hpG−CSFの結合に対して競
合するrhpG−CSFの能力は、レセプターが十分等しく両
型を認識することを示唆する。

白血病細胞との天然¹²⁵I−標識−hpG−CSFの結合性を
証明するこれらの研究は、培養物中で急性前骨髄性白血
病（M3）の第１患者及び急性骨髄芽球性白血病（M2）の
第２患者から得た低密度骨髄球の顆粒球及び単球への分
化を誘導する天然hpG−CSFの能力と対比さる。各患者か
らの細胞を、培地単独で又はrhpG−CSF1×10⁵単位存在
下で、４日間培養した。培地単独でインキュベートされ
たM3コントロール培養物からの細胞は前骨髄球のままで
あったが、一方rhpG−CSFの存在下で培養された細胞
は、後骨髄球、巨大杆状核型−分葉核型好中球及び単球
からなる骨髄型成熟細胞を示した。この患者での現実の
分化は、100個の細胞について、コントロールの場合が1
00％前骨髄球であり、rhpG−CSF処理細胞の場合が22％
芽球＋前骨髄球、７％骨髄球、35％後骨髄球、20％杆状
核型＋分葉核型好中球、14％単球及び２％マクロファー
ジであった。注目されるのは、多形核顆粒球の１つが顕
著なアウエル小体をまだ有していたという事実である
が、このことは少なくともこの細胞が白血病系のクロー
ンに属する分化細胞であることを示唆する。骨髄芽球性
白血病（M2）の第２患者からの細胞もrhpG−CSFの存在
又は非存在下で４日間培養した。培地単独で培養された
M2細胞の視覚分析では、大きな“芽球様”細胞を示した
が、そのうちのいくつかは核小体を有していた。M2細胞
のいくつかは、rhpG−CSFで処理した場合に、好中球の
中心にアウエル小体が残った成熟分葉核型好中球に分化
したが、このことは白血病系のクローンに属する細胞で
生じる分化を示唆した。形態学的に評価された細胞100
個の実際の分化では、コントロール細胞は100％芽球か
らなることが示された。rhpG−CSF処理細胞は、43％芽
球、１％骨髄球、15％後骨髄球、25％杆状核型＋分葉核
型好中球、２％前単球及び11％単球からなっている。白
血病細胞が、また４つの異なる濃度（５×10³,1×10⁴、
2.5×10⁴及び５×10⁴U/ml、データ示さず）のrhpG−CSF
存在化で分化に関して試験された。試験されたrhpG−CS
Fの最低濃度（５×10³U/ml）の場合であっても、M3（50
％）及びM2（37％）白血病細胞の著しい分化が生じた
（細胞は骨髄球以上に分化した）。

6.免疫試験免疫試験用のポリクローナル抗体を産生するために使
用された抗原は、例１（Ｂ）で調製されたようにしてヒ
ト膀胱癌細胞系5637（I A6）から精製された多分化性能
Ｇ−CSFであった。この物質は、ポリアクリルアミドゲ
ルの硝酸銀染色に基づき、純度85％と判定された。６週
令Balb/Cマウスを抗原の多部位注射により免疫した。抗
原をPBSに再懸濁し、等量のフロイント（Freund）完全
アジュバントで乳化させた。投与量は抗原５〜７μg/マ
ウス／注射であった。追加免疫注射は、等量のフロイン
ト不完全アジュバントで乳化された同量の抗原で18日後
に投与した。４日後、マウス血清を採取し、ヒト多分化
能性Ｇ−CSFに特異的な抗体について試験した。

ホルダー中のダイナテック・イムロンII・リムーバウ
ェル（Dynatech Immulon II Removawell）ストリップ
〔ダイナテック・ラボラトリー社（（Dynateck Lab.,In
c.）、アレクサンドリア、バージニア〕をpH9.2の50mM
炭酸−重炭酸緩衝液中のhpG−CSF5μg/mlで被覆した。
ウェルを容量50μ中の0.25μｇで被覆した。抗原被覆
プレートを室温で２時間及び４℃で一夜インキュベート
した。溶液を捨て、プレートを５％BSA含有PBS中で30分
間インキュベートして、反応表面を保護した。この溶液
を捨て、希釈された免疫前血清又は試験血清をウェルに
加え、室温で２時間インキュベートした。血清は１％BS
A含有のpH7.0のPBSで希釈した。血清溶液を捨て、プレ
ートをワッシュ・ソルーション（Wash Solution）（KP
L、ゲイザースブルグ、メリーランド）で３回洗浄し
た。pH7.0の１％BSA含有PBS50μ中のヨウ素化ウサギ
抗マウスIgG（NEN、ボストン、マスチューセッツ）約20
0,000cpmを各々のウェルに加えた。室温で1.5時間イン
キュベートした後、溶液を捨て、プレートをワッシュ・
ソルーションで５回洗浄した。ウェルをホルダーから取
外し、ベックマン5500ガンマカウンターで計測した。高
力価マウス血清は、1:100希釈時において、相当する免
疫前血清よりも12倍以上高い反応性を示す。

大腸菌由来hpG−CSFの免疫学的性質は、哺乳動物細胞
由来hpG−CSFに特異的な高力価マウス血清に対する反応
性により測定した。純度90％の大腸菌由来タンパク質0.
25μｇを容量50μのイムロンIIリムーバウェルに被覆
き、マウス血清を上記のように分析した。

高力価マウス血清は、1:100希釈時において、相当す
る面積前血清よりも24倍高い反応性を大腸菌由来物質に
対して示した。

7.セリン類縁体生物学的試験例８で製造された〔Ser¹⁷〕hpG−CSF,〔Ser³⁶〕hpG−
CSF,〔Ser⁴²〕hpG−CSF,〔Ser⁶⁴〕hpG−CSF及び〔Se
r⁷⁴〕hpG−CSF産物を、³H−チミジン取込み、CFU−GM及
びWEHI−3B D⁺分析によりhpG−CSF活性に関し分析し
た。各分析において、〔Ser¹⁷〕類縁体は天然構造組換
え分子の活性に匹敵する活性を有していた。多の類縁体
は、³H−チミジン取込み分析では1/100の活性、CFU−GM
分析では1/250の活性、及びWEHI−3B D⁺分析では1/500
の活性を有していた。このデータは、36,42,64及び74位
のシステインが十分な生物学的活性のために必要である
という考え方を支持する。

8.イン・ビボ生物学的試験アルゼット（Alzet^R）浸透圧ポンプ〔アルゼット社
（Alzet Corp.）パロ・アルト（Palo Alto）、カリフ
ォルニア；モデル2001〕を内在型右頚静脈血管カテーテ
ルに連結し、７匹の雄性シリアンゴールデンハムスター
の皮下に植込んだ。４つのポンプは緩衝液〔20mM酢酸ナ
トリウム（pH5.4）及び37mM塩化ナトリウム〕及び大腸
菌由来hpG−CSF1.5mg/mlを含有し、３つは緩衝液のみを
含有していた。浸透圧ポンプに必要な排出速度は、７日
目まで１μ/hrであった。ポンプ植込み後３日目にお
いて、４匹の処理ハムスターの平均顆粒球数は３匹の
（緩衝液）コントロールの場合より６倍高く、顆粒球数
増加は総白血球が４倍増加したことに反映されていた。
赤血球数は処理により変化しなかった。これらの結果
は、組換え物質が哺乳動物において顆粒球の産生及び／
又は放出を特異的に高めることを示している。

hpG−CSFの天然対立型に加え、本発明ではhpG−CSFの
ポリペプチド類縁体及びhpG−CSF断片のような他のhpG
−CSF産物も包含する。上記アルトンらの出願公開（WO/
83/04053）の操作に従い、１以上の残基の同一性又は位
置に関し本明細書で記載されたものとは異なる（例え
ば、置換、端部及び中間部付加、並びに削除）一時構造
をもつポリペプチドの微生物での発現をコードする遺伝
子を容易に考えかつ製造することができる。一方、cDNA
及びゲノム遺伝子の修正は、周知の特定部位突然変異誘
発法によって容易に実施することができ、しかもそれら
の類縁体及び誘導体を産生するために利用することがで
きる。このような産生はhpG−CSFの生物学的性質のうち
少なくとも１つを有するが、他の点では異なる可能性が
ある。例えば、考えられる本発明の産物としては、例え
ば削除により短縮された産物、加水分解に対しより安定
な産物（したがって、天然体よりも顕著な又は持続性の
効果を有する可能性がある）、１以上の潜在的Ｏ−グリ
コシル化部位を削除して修正された産物（酵母菌産生産
物に関しより高い活性を有するようになる）、１以上の
システイン残基が削除され又はアラニンもしくはセリン
残基等で置換され、しかも微生物系から活性型でより容
易に単離され得る産物、又は、１以上のチロシン残基が
フェニルアラニンで置換され、しかも標的細胞上のhpG
−CSFレセプターにいくぶん容易に結合し得る産物があ
る。更には、hpG−CSFの連続アミノ酸配列又は二次構造
の一部のみを複製したポリペプチド断片も包含される
が、この断片は１つの活性（例えば、レセプター結合
性）を有するが、他の活性（例えば、コロニー増殖刺激
活性）を有しない可能性がある。本発明のいずれの１以
上の産物が、治療的効用〔ウァイラントら、ブルート、
第44巻、第173〜175頁、1982年（Wuiland,et al.,Blut,
44,173−175（1982））参照〕又はhpG−CSF拮抗作用分
析のような他の関連における効用をもつために、活性が
必ずしも必要とされないことに注目に値する。競合的拮
抗剤は、例えばhpG−CSFの過剰産生時に非常に有用であ
る可能性がある。

本発明の他の側面によれば、hpG−CSFポリペプチドを
コードする本明細書に記載されたDNA配列は、天然産物
単離体の分析的プロセッシングにもかかわらず今まで得
られていなかったこの哺乳動物タンパク質のアミノ酸配
列に関して、それが情報を提供することから、価値があ
る。DNA配列は、様々な組換え技術によるhpG−CSFの大
規模な微生物での合成を実施するために使用される産物
としても著しい価値がある。その他に、本発明により提
供されるDNA配列は、新規かつ有用なウイルス性または
環状プラスミドDNAベクター、新規かつ有効な形質転換
及び感染転換された（transfected）微生物原核及び真
核及び真核宿主細胞（細菌、酵母菌細胞及び哺乳動物の
培養細胞を含む）、hpG−CSF及びその関連産物の発現が
可能なかかる微生物宿主細胞の新規かつ有用な培養増殖
方法を開発するために使用される。本発明のDNA配列
は、hpG−CSF及び関連タンパク質をコードするヒトゲノ
ムDNA並びに他の哺乳動物種のcDNA及びゲノムDNA配列を
単離するための標識プローブとして使用される、極めて
適切な物質でもある。DNA配列は、（例えば、昆虫細胞
中での）タンパク質合成の様々な代替的方法又はヒト及
び他の哺乳動物における遺伝子療法にも使用することが
できる。本発明のDNA配列は、hpG−CSF及びhpG−CSF産
物の大規模産生用の真核細胞“宿主”として機能し得る
遺伝子転換哺乳動物を開発するためにも使用し得る、と
期待されている。一般的には、パルミターら、サイエン
ス、第222巻、第4625号、第809〜814頁、1983年〔Palmi
ter,et al.,Science,222（4625）,809−814（1983）〕
参照。

本発明のhpG−CSF断片及びポリペプチド類縁体の応用
例の中には、天然タンパク質、糖タンパク質及び核タン
パク質中に存在するアミノ酸配列を実質的に複製した合
成ペプチドの免疫学的活性に関する報告がある。更に詳
しくは、比較的低分子量のポリペプチドは、ウィルス抗
原、ポリペプチドホルモンその他のような生理学的に重
要なタンパク質の免疫反応と時間及び程度が類似した免
疫反応に関係することが示された。このようなポリペプ
チドの免疫反応の中には、免疫学的に活性な動物におけ
る特異的抗体産生の賦活化が含まれる。例えば、レーナ
ーら、セル、第23巻、第309〜310頁、1981年〔Lernar,e
t al.,Cell,23,309−310（1981）〕、ロスら、ネーチャ
ー、第294巻、第654〜656頁、1981年〔Ross,et al.,Nat
ure,294,654−656（1981）〕、ワルターら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（USA）、第77巻、第5197〜5200頁、1980年〔Wal
ter,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），77,5197−52
00（1980）〕、ラーナーら、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（US
A）、第78巻、第3403〜3407頁、1981年、ワルターら、
プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（USA）、第78巻、第4882〜4886頁、1
981年；ウォン（Wong）ら、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（US
A）、第78巻、第7412〜7416頁、1981年グリーン（Gree
n）ら、セル、第28巻、第477〜487頁、1982年；ニッグ
（Nigg）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（USA）、第79巻、第532
2〜5326頁、1982年；バロン（Baron）ら、セル、第28
巻、第395〜404頁、1982年；ドリーズマン（Dreesman）
ら、ネーチャー、第295巻、第185〜160頁、1982年；及
びラーナー、サイエンティフィック・アメリカン、第24
8巻、第２号、第66〜74頁、1983年〔Lerner,Scintific
American,248,No.2,66−74（1983）〕参照。更に、ペ
プチドホルモンの二次構造をほぼ有するもののそれらの
一次構造配列を有していない合成ペプチドの生物学的及
び免疫学的活性に関する、カイザーら、サイエンス、第
223巻、第249〜255頁、1984年〔Kaiser,et al.,Scienc
e,223,249−255（1984）〕参照。

【図面の簡単な説明】

第１図は、hpG−CSF遺伝子の部分的な制限エンドヌクレ
アーゼ地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のアミノ酸配列において、１つ以上の
アミノ酸残基が置換されており、且つヒト多分化能性顆
粒球コロニー刺激因子活性を有するタンパク質。
【請求項２】＋36、＋42、＋64および＋74位のアミノ酸
残基がCys残基であることを特徴とする請求項１に記載
のタンパク質。
【請求項３】下記のアミノ酸配列に対して１つ以上のア
ミノ酸残基が置換されており、且つヒト多分化能性顆粒
球コロニー刺激因子活性を有するタンパク質の製造方法
であって、該タンパク質をコードする塩基配列を有する
発現ベクターで形質転換された細菌を培養し、該タンパ
ク質を分離精製することを特徴とする、前記方法。
【請求項４】前記タンパク質が、＋36、＋42、＋64およ
び＋74位のアミノ酸残基がCys残基であることを特徴と
する請求項３に記載の製造方法。