JPH06181791A - 形質転換された大腸菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】下記のアミノ酸配列から成る蛋白質の製造方法
であって、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む
ＤＮＡを含有するベクターによって哺乳動物細胞を形質
転換し、該形質転換哺乳動物細胞を培養し、該形質転換
哺乳動物細胞が産生する蛋白質を分離精製することを特
徴とする、前記製造方法。 【表１】 【効果】天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子活性を
有する蛋白質を製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】背景技術 本発明は、一般に、造血促進因子及びかかる因子をコー
ドするポリヌクレオチドに関する。本出願は、詳しく
は、哺乳動物の多分化能性コロニー刺激因子、特にヒト
多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｐＧ‐ＣＳ
Ｆ）、その断片及びポリペプチド類縁体、並びにそれら
をコードするポリヌクレオチドに関する。

【０００２】ヒト血液生成（造血）系は、様々な白血球
（好中球、マクロファージ及び好塩基球／肥満細胞を含
む）、赤血球（エリスロサイト）及び凝血形成細胞（巨
核球／血小板）を補充する。平均的ヒト男性の造血系は
毎年 4.5×10¹¹のオーダーの顆粒球及び赤血球を産生す
ると推測されていたが、これは１年間で全体重に相当す
る。デキスターら、バイオエッセイズ、第 2巻、第 154
〜158 頁、1985年〔Ｄexter et al., ＢioＥssays, 2,
154-158 (1985)〕。

【０００３】少量の特定の造血促進因子は、少数の前駆
体“幹細胞”の各種血液細胞系への分化、これらの系の
著しい増殖及びこれらの系からの成熟血液細胞の最終的
分化の原因をなすと考えられている。造血促進因子は極
端に少量で存在しているため、これら因子の検出及び同
定は分析の仕方にかかっていたが、今までは人為的条件
下での培養細胞に対する刺激効果に基づき様々な因子の
中から区別できるにすぎなかった。その結果、多数の名
称が極めて少数の因子を表示するために考え出されてき
た。かかる混同が生じた例として、ＩＬ‐３，ＢＰＡ、
マルチ‐ＣＳＦ、ＨＣＧＦ，ＭＣＧＦ及びＰＳＦという
語は、すべて現在では同一のマウス造血促進因子に該当
すると考えられている頭字語である。メトカーフ、サイ
エンス、第 229巻、第16〜22頁、1985年〔Ｍetcalf, Ｓ
cience, 229，16-22 (1985)〕。更に、各種マウスの成
長調節糖タンパク質に関する、バージェスら、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第 252巻、
第1988頁、1977年〔Ｂurgess, et al., Ｊ. Ｂiol. Ｃ
hem., 252, 1988 (1977）〕、ダスら、ブラッド、第58
巻、第 600頁；1980年（Ｄas, et al., Ｂlood, 58, 60
0 (1980)〕；イーレら、ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー、第 129巻、第2431頁、1982年〔Ｉhle, et al.,
Ｊ. Ｉmmunol., 129，2431 (1982）〕、ニコラら、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第 258
巻、第9017頁、1983年〔Ｎicola, et al., Ｊ. Ｂiol.
Ｃhem., 258, 9017 (1983）〕、メトカーフら、インタ
ーナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、第30
巻、第 773頁、1982年〔Ｍetcalf,et al., Ｉnt. Ｊ.
Ｃancer, 30, 773 (1982)〕；及び、バージェスら、イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、第
26巻、第 647頁、1980年〔Ｂurgess, et al., Ｉnt.
Ｊ. Ｃancer, 26, 647 (1980)〕参照。

【０００４】組換え遺伝子技術の利用はこの混乱の中か
ら一定の秩序をもたらした。例えば、赤血球産生を促進
するヒトエリスロポエチンのアミノ酸及びＤＮＡ配列が
得られた〔1985年 6月20日に公開されたリン（Ｌin）の
ＰＣＴ出願公開第85/02610号明細書参照。〕。組換え方
法は、ヒト顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子の
ｃＤＮＡの単離に関しても利用された。リーら、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（ＵＳＡ）第82巻、第4360〜4364頁、1985年
〔Ｌee et al., Ｐroc. Ｎatl.Ａcad. Ｓci. （ＵＳ
Ａ）, 82, 4360-4364 （1985）〕及びウオンら、サイエ
ンス、第 228巻、第 810〜814 頁、1985年〔Ｗong et a
l., Ｓcience, 228，810-814 (1985)〕。更に、マウス
遺伝子のクローニングに関する、ヨコタら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（ＵＳＡ）、第81巻、第1070頁、1984年〔Ｙokot
a,et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳ
Ａ）, 81, 1070 (1984) 〕、ファングら、ネーチャー、
第 307巻、第 233頁、1984年〔Ｆung, et al., 307,233
(1984)〕及び、ゴーフら、ネーチャー、第 309巻、第
763頁、1984年〔Ｇough, et al., Ｎature, 309 , 763
(1984)〕、並びにヒトＭ‐ＣＳＦに関するカワサキら、
サイエンス、第 230巻、第 291頁、1985年〔Kawasakiet
al., Ｓcience, 230 ，291 (1985)〕参照。

【０００５】ヒト多分化能性コロニー刺激因子（ｈｐＣ
ＳＦ）又はプルリポエチンと称されるヒト造血促進因子
は、ヒト膀胱癌細胞系の培養液中に存在していることが
示された。この細胞系は5637と呼ばれて、米国菌寄託機
関（Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)、ロック
ビル、メリーランドにおいて制限条件付でＡＴＣＣ寄託
番号第ＨＴＢ‐９号として寄託されている。この細胞系
から精製されたｈｐＣＳＦは、ヒト骨髄前駆体細胞を用
いた分析において、すべての主な血液細胞系の産生につ
ながるような多分化能性前駆細胞の増殖及び分化を促進
することが報告された。ウェルトら、プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（ＵＳＡ）、第82巻、第1526〜1530頁、1985年〔Ｗelte
et al.,Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）,
82, 1526‐1530 (1985）〕。ｈｐＣＳＦの精製には、
（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 沈降、陰イオン交換クロマトグラフ
ィー（ＤＥＡＥセルロース、ＤＥ52）、ゲル濾過（Ａｃ
Ａ54カラム）、及びＣ18逆相高性能液体クロマトグラフ
ィーを利用していた。Ｃ18逆相ＨＰＬＣ画分において 2
つの活性ピークの 2番目に溶出するｈｐＣＳＦとして確
認されたタンパク質は、銀染色を用いるドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）での測定によれば、分子量（ＭＷ）18,000
を有すると報告された。ｈｐＣＳＦは、等電点5.5 を有
し〔ウェルトら、ジャーナル・オブ・セル・バイオケミ
ストリー、増刊第9A号、第116 頁、1985年（Ｗelte, et
al.,Ｊ. Ｃell Ｂiochem., Ｓupp 9Ａ, 116 (198
5)）〕、マウス骨髄単球性白血病細胞系ＷＥＨＩ‐３Ｂ
Ｄ⁺ に対して高分化能を有する〔ウェルトら、分子及
び細胞生物学のＵＣＬＡ討論会、ゲールら編集、ニュー
シリーズ、第28巻、1985年〔Ｗelte, et al., ＵＣＬＡ
Ｓymposia on Ｍolecular and Ｃellular Ｂiolog
y, Ｇale, et al., eds.,ＮewＳeries, 28 (1985))〕
ことが早期に報告された。予備研究では、ｈｐＣＳＦと
確認された因子はヒトＣＦＵ‐ＧＭ分析において最初の
7日間に顕著な顆粒球コロニー刺激活性を有することを
示している。

【０００６】ヒトＣＳＦ‐βと称されるもう 1つの因子
も、ヒト膀胱癌細胞系5637から単離されたが、未標識マ
ウスＧ‐ＣＳＦの場合と同一の用量応答関係においてＷ
ＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ⁺ 細胞との結合性に関しマウス ¹²⁵Ｉ
‐標識顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）の競合体
として記載されていた〔ニコラら、ネーチャー、第 314
巻、第 625〜628 頁、1985年（Ｎicola, et al.,Ｎatur
e, 314，625-628 （1985））〕。この用量応答関係は、
以前、未標識マウスＧ‐ＣＳＦに独特であって、Ｍ‐Ｃ
ＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ又はマルチ‐ＣＳＦのような因子に
は見られないと報告されていた〔ニコラら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（ＵＳＡ）、第81巻、第3765〜3769頁、1984年
（Ｎicola,et al.,Ｐroc.Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （Ｕ
ＳＡ）, 81, 3765‐3769 (1984))〕。ＣＳＦ‐β及びＧ
‐ＣＳＦはともに、それらがＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ⁺ 細胞
の分化を誘導する高い能力を有している点において、Ｃ
ＳＦ類の中では独特である（ニコラら、イムノロジー・
トゥデー、第５巻、第76〜80頁、1984年〔Ｎicola, et
al., Ｉmmunology Ｔoday， 5，76-80 (1984)〕）。高
濃度でＧ‐ＣＳＦは混合顆粒球／マクロファージコロニ
ー形成細胞を刺激するが（ニコラら、1984年、同上）、
このことは、ヒト骨髄培養物及びｈｐＣＳＦの14日間の
インキュベート後に顆粒球性、単球性、混合顆粒球／単
球性及び好酸球性のコロニー（ＣＦＵ‐ＧＥＭＭ）の出
現を示す予備実験結果と一致する。ＣＳＦ‐βもマウス
骨髄細胞使用分析において好中球性、顆粒球性のコロニ
ー形成を促進すると記載されていたが、この性質は因子
をＧ‐ＣＳＦとして同定するための基準とされた。これ
らの類似性から、ヒトＣＳＦ‐βはＧ‐ＣＳＦ（顆粒球
コロニー刺激因子）と同一視された（ニコラら、ネーチ
ャー、第 314巻、第 625〜 628頁、1985年〔Ｎicola, e
t al., Ｎature, 314 , 625-628 (1985)〕）。

【０００７】これらの共通の性質に基づけば、ニコラ
ら、同上のヒトＣＳＦ‐β及びウェルトら、同上のｈｐ
ＣＳＦは、適切にはヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激
因子（ｈｐＧ‐ＣＳＦ）と称される同一の因子であると
思われる。ｈｐＧ‐ＣＳＦの特徴づけ及び組換え産生
は、イン・ビトロ ＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ⁺ 白血病細胞数
を“全く正常な濃度”で完全に抑制するマウスＧ‐ＣＳ
Ｆの報告されている能力、並びに、マウスで確立された
移植骨髄白血病を抑制する粗製マウスＧ‐ＣＳＦ注射製
剤の報告されている能力からみて、特に望ましいであろ
う。メトカーフ、サイエンス、第229 巻、第 16〜22
頁、1985年〔Ｍetcalf, Ｓcience, 229, 16-22(198
5）〕参照。更に、サックス、サイエンティフィック・
アメリカン、第284巻、第１号、第40〜47頁、1986年
〔Ｓachs, Ｓcientific Ａmerican, 2848 (1), 40-47
(1986)〕参照。

【０００８】ｈｐＧ‐ＣＳＦが治療上重要であるとわか
り、したがって市販規模量の入手が必要となる限り、細
胞培養物からの単離では、十分な物質源を提供すること
は困難である。たとえば、ウェルトら（1985年、同上）
により天然ｈｐＣＳＦ単離物源として報告されたヒト膀
胱癌細胞系5637（ＡＴＣＣ ＨＴＢ９）等のヒト腫瘍バ
ンク細胞の商業的使用に対して制約が存在していること
は、注目される。

【０００９】発明の要旨 本発明によれば、ｈｐＧ‐ＣＳＦの全部又は一部をコー
ドするＤＮＡ配列が提供される。このような配列は、選
択された非哺乳動物宿主による発現に“好ましい”コド
ンの組込み、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断部
位の供与、及び、簡易的発現ベクターの組立てを容易に
する前端、後端又は中間部へのＤＮＡ配列の付加的供与
を含むことができる。本発明は更に、１以上のアミノ酸
残基の同一性又は位置に関して天然型と異なり、しかも
天然型の性質の一部又は全部を保有している、ｈｐＧ‐
ＣＳＦのポリペプチド類縁体又は誘導体（即ち、ｈｐＧ
‐ＣＳＦに特異的な残基のすべてまでは含有していない
削除類縁体、１以上の特異的残基が他の残基で置換され
ている〔Ｓer¹⁷〕ｈｐＧ‐ＣＳＦのような置換類縁体、
及び、１以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端又は
中間部分に付加している付加類縁体）の微生物発現をコ
ードするＤＮＡ配列を提供する。

【００１０】本発明の新規ＤＮＡ配列は、天然多分化能
性顆粒球コロニー刺激因子における一次構造配列の少な
くとも一部及び生物学的性質の１以上を有するポリペプ
チド産物の原核もしくは真核宿主細胞での発現を確実化
するために使用される配列を含有している。本発明のＤ
ＮＡ配列は、特に、 (a)表VII 及び表VIIIに示されたＤ
ＮＡ配列又はそれらの相補鎖、 (b)表VII のＤＮＡ配列
又はその断片と（本明細書記載のようなハイブリッド形
成条件下又はより厳格な条件下で）ハイブリッド形成す
るＤＮＡ配列、又は (c)遺伝コードの縮重がなければ表
VII のＤＮＡ配列とハイブリッド形成し得るＤＮＡ配列
をも含むものである。特に (b)に包含されるものとして
は、ｈｐＧ‐ＣＳＦの対立変異型及び／又は他の哺乳動
物種の多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードする
ゲノムＤＮＡ配列がある。特に (c)に包含されるものと
しては、ｈｐＧ‐ＣＳＦ、ｈｐＧ‐ＣＳＦの断片及びｈ
ｐＧ‐ＣＳＦ類縁体をコードする人工ＤＮＡ配列がある
が、このＤＮＡ配列には微生物宿主でのメッセンジャー
ＲＮＡの翻訳を促進するコドンを組込むことができる。
このような人工配列は、アルトン（Ａlton）らのＰＣＴ
出願公開第WO83/04053号の方法により容易に組立てるこ
とができる。

【００１１】更に本発明に包含されるものとしては、本
明細書の表VII 又は表VIIIの上部鎖ヒトｃＤＮＡ又はゲ
ノムＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡの一部によりコードさ
れたポリペプチド類、即ちトラモンタノら、ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ、第12巻、第5049〜5059頁、19
84年〔Ｔramontano, et al., Ｎucleic Ａcids Ｒe
s., 12, 5049-5059(1984)〕に記載された“相補的転
化タンパク質”がある。

【００１２】本発明は、対立変異体を含む天然ｈｐＧ‐
ＣＳＦにおける一次構造配列（即ち、アミノ酸残基の連
続配列）の一部もしくは全部、生物学的性質（例えば、
免疫学的性質及びイン・ビトロ生物学的活性）の１以
上、及び物性（例えば、分子量）を有する精製単離ポリ
ペプチド産物を提供する。これらのポリペプチドは、化
学合成操作又はゲノムもしくはｃＤＮＡのクローニング
もしくは遺伝子合成により得られる外来性ＤＮＡ配列の
原核もしくは真核宿主発現（例えば、細菌、酵母菌、高
等植物、昆虫及び哺乳動物細胞の培養による）の産物で
ある、ということによっても特徴づけられる。典型的な
酵母菌〔例えばサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓac
charomyces cerevisiae)〕又は原核生物〔例えば、エシ
ェリキア・コリ（Ｅscherichia coli)〕宿主細胞の産物
は、いずれの哺乳動物タンパク質とも会合していない。
脊椎動物（例えば、非ヒト哺乳動物及び鳥類）細胞にお
ける微生物発現産物は、いずれのヒトタンパク質とも会
合していない。用いられた宿主に応じて、本発明のポリ
ペプチドは、哺乳動物その他の真核生物の炭水化物でグ
リコシル化していてもよいし、非グリコシル化のままで
もよい。本発明のポリペプチドは、（-1位に）最初のメ
チオニンアミノ酸残基を有することもできる。

【００１３】更に本発明に包含されるものとしては、有
効量の本発明のポリペプチド産物と一緒に適切な希釈
剤、アジュバント及び／又は担体を含有する、ｈｐＧ‐
ＣＳＦ療法に使用される医薬組成物がある。

【００１４】本発明のポリペプチド産物は、固体組織及
び血液もしくは尿等の液体試料中におけるヒトｈｐＧ‐
ＣＳＦの検出及び定量に使用される試薬を提供するため
に、検出可能なマーカー物質と結合させることにより
“標識”する（例えば、 ¹²⁵Ｉで放射線標識する）こと
ができる。

【００１５】本発明のＤＮＡ産物は、検出可能なマーカ
ー（例えば、放射線標識及びビオチンのような非アイソ
トープ標識）で標識することもでき、しかも染色体地図
上のヒトｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子の位置及び／又はその関
連遺伝子群の位置をつきとめるためのＤＮＡハイブリッ
ド形成操作に用いることができる。それらはＤＮＡレベ
ルでのヒトｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子の異常を確認するため
にも使用され、隣接遺伝子及びそれらの異常を確認する
ための遺伝子マーカーとして使用することもできる。

【００１６】本発明のポリペプチド産物は、再生不良性
貧血のような造血障害の治療のために、単独で又は他の
造血因子もしくは薬物と一緒に使用される。それらは化
学療法又は放射線療法による造血障害の治療にも使用さ
れる。骨髄移植の成功率は、例えばｈｐＧ‐ＣＳＦの使
用により高められるであろう。創傷治癒熱傷治療及び細
菌性炎症治療にもｈｐＧ‐ＣＳＦが有効である。更に、
ｈｐＧ‐ＣＳＦは、白血病細胞を分化させると報告され
ている能力に基づき、白血病の治療にも使用される。ウ
ェルトら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第82巻、第15
26〜1530頁、1985年〔Ｗelte, et al.,Ｐroc. Ｎatl.
Ａcad. Ｓci.(ＵＳＡ），82, 1526-1530 (1985)〕及
びサックス（Ｓachs）、同上参照。

【００１７】本発明の多数の側面及び長所は、現在の好
ましい態様たる本発明の実例について説明した以下の詳
細な説明を斟酌することにより、当業者であれば明らか
になるであろう。

【００１８】詳細な説明 本発明によって、ｈｐＧ‐ＣＳＦのポリペプチド配列の
一部又は全部をコードするＤＮＡ配列が単離されかつ特
徴づけられた。

【００１９】下記の諸例は本発明の説明のために示され
たものであって、特に、ｈｐＧ‐ＣＳＦ ｃＤＮＡ及び
ゲノムクローンの同定に先立ち行なわれる操作、かかる
同定方法、並びに、配列決定、ｃＤＮＡ、ゲノム及び人
工遺伝子に基づく発現系の開発、及びかかる系での発現
ｈｐＧ‐ＣＳＦ及び類縁体産物の同定に関する。

【００２０】更に詳しくは、例１はｈｐＧ‐ＣＳＦのア
ミノ酸配列決定に関する。例２はコロニーハイブリッド
形成スクリーニング用ｃＤＮＡライブラリーの製造に関
する。例３はハイブリッド形成プローブの組立てに関す
る。例４は、ハイブリッド形成スクリーニング、陽性ク
ローンの同定、陽性ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列決定
及びポリペプチド一次構造配列（アミノ酸配列）情報の
作成に関する。例５はｈｐＧ‐ＣＳＦをコードするゲノ
ムクローンの同定及び配列決定に関する。例６は、大腸
菌優先（preference）コドンが用いられたｈｐＧ‐ＣＳ
Ｆをコードする人工遺伝子の組立てに関する。

【００２１】例７は、ｈｐＧ‐ＣＳＦをコードするＤＮ
Ａを組込んだ大腸菌形質転換ベクターの組立て方法、ｈ
ｐＧ‐ＣＳＦの原核生物発現におけるベクターの使用、
及び本発明の組換え産物の特性分析に関する。例８は、
システイン残基がｈｐＧ‐ＣＳＦをコードするＤＮＡで
の変異誘発により別の適切なアミノ酸残基で置換された
ｈｐＧ‐ＣＳＦ類縁体の産生方法に関する。例９は、陽
性ｃＤＮＡクローンから得たｈｐＧ‐ＣＳＦ類縁体をコ
ードするＤＮＡを組込んだベクターの組立て方法、ＣＯ
Ｓ‐１細胞形質転換のためのベクターの使用、及び形質
転換細胞の培養増殖に関する。例10は、本発明の組換え
ポリペプチド産物の物理的及び生物学的性質に関する。

【００２２】例 １ (A) 文献記載方法により得られた物質の配列決定 ｈｐＧ‐ＣＳＦ試料(3〜4 μｇ、ＳＤＳ銀染色‐ＰＡＧ
Ｅ純度85〜90％）は、ウェルトら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（ＵＳＡ）、第82巻、第1526〜1530頁、1985年〔Ｗelt
e, et al., Ｐroc.Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）,
82, 1526‐1530 (1985）〕に従い単離精製したものと
同様であって、スローン・ケタリング・インスティテュ
ート（ＳloanＫettering Ｉnstitute）、ニューヨー
ク、ニューヨーク州から入手した。

【００２３】このｈｐＧ‐ＣＳＦ試料のＮ末端アミノ酸
配列を、ＡＢ 407Ａ気相分析装置〔アプライド・バイオ
システムズ（Ａpplied Ｂiosystems)、フォスター市、
カリフォルニア〕を用いたミクロ配列分析により１号操
作（Ｒun #1)で決定し、下記表Ｉに掲示された配列情報
を得た。表Ｉ‐IVでは、単一文字コードが用いられてお
り、“Ｘ”は明確に決定されなかった残基を示し、括弧
内の残基は単に択一的又は推定的に示されたものであ
る。

【００２４】

【表２】 高いバックグランドが操作サイクル毎に存在したが、そ
の結果は表Ｉに報告されており、このことは試料がおそ
らく精製時の化学的残留物たる多くの汚染成分を有する
ことを示していた。配列を単に参照用として保存した。

【００２５】2号操作（Ｒun #2)では、第２試料(5〜6
μｇ、純度95％以下）は 1号操作と同様にスローン・ケ
タリングから入手し、配列決定操作は 1号操作と同様に
して実施した。この試料は、ウェルトら、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（ＵＳＡ）、第82巻、第1526〜1530頁、1985年の図
４を作成するために用いられた物質の同一ロットから得
たものである。結果は、表IIに示されている。

【００２６】

【表３】 更に多くの残基が同定されたが、 2号操作では、適当数
のプローブをｈｐＧ‐ＣＳＦ ＤＮＡ調査用に組立て得
るほど十分に長い明確な配列は得られなかった。表IIの
配列に基づきｃＤＮＡの単離を行なうためには、少なく
とも1536種類のプローブが必要であろうと計算された。
再度、試料の汚染が問題視された。

【００２７】このため、第３試料（ 3〜5 μｇ、純度40
％以下）を上記のようにスローン・ケタリングから入手
した。この調製物は、更に精製するために、ＳＤＳ‐Ｐ
ＡＧＥによる分離後、電気ブロット（electroblot)に付
した。この試料の配列分析ではデータが得られなかっ
た。

【００２８】(B) 修正方法により得られた物質の配列決
定 十分量の純粋物質を得て適切な最終的アミノ酸配列分析
を実施するため、スローン・ケタリングで産生されるも
のと同様の膀胱癌細胞系5637の細胞（サブクローンＩＡ
６）をイー・プラッツァー博士（Ｄr. Ｅ. Ｐlatzer）
から入手した。細胞を最初にフラスコ中のアイコブ（Is
cove′s)培地〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、グランドアイラ
ンド、ニューヨーク〕で培養し、集密化させた。集密化
時、培養物をトリプシン処理し、ローラーボトル中に播
種したが(1.5フラスコ／ボトル）、各ボトルは 5％ＣＯ
₂ 下で予め条件が整えられたアイコブ培地25mlを含有し
ていた。細胞を37℃，0.3rpmで一夜増殖させた。

【００２９】サイトデックス‐１（Ｃytodex‐1)ビーズ
〔ファルマシア（Ｐharmacia）、ウプサラ、スウェーデ
ン〕を洗浄し、下記操作により滅菌した。ビーズ 8ｇを
ボトルに加え、ＰＢＳ 400mlを加えた。ビーズを３時間
静かに攪拌して懸濁させた。ビーズを静置させた後、Ｐ
ＢＳを排出し、ビーズをＰＢＳで洗浄し、新鮮ＰＢＳを
加えた。ビーズを15分間オートクレーブで処理した。使
用前に、ビーズを、新鮮培地＋10％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）添加前にアイコブ培地＋10％ＦＣＳ中で洗浄し、処
理ビーズを得た。

【００３０】各ローラーボトルから30mlを除くすべての
培地を除去した後、新鮮培地＋10％ＦＣＳ30ml及び処理
ビーズ40mlをボトルに加えた。ボトルを 5％ＣＯ₂ 処理
し、すべての泡を吸引除去した。ボトルを、速度0.3rpm
に低下させる前、ローラー台に3rpmで 0.5時間載置し
た。３時間後、別のフラスコ内容物をトリプシン処理
し、ビーズ含有の各ローラーボトルに加えた。

【００３１】集密度40〜50％の時点でローラーボトル培
養物をＰＢＳ50mlで洗浄し、ＰＢＳ除去前10分間回転さ
せた。細胞を培地Ａ〔 0.2％ＦＣＳ、10^-8Ｍヒドロコル
チゾン、 2mMグルタミン、 100単位／mlペニシリン及び
100μｇ／mlストレプトマイシン含有アイコブ培地〕中
で48時間培養した。次いで、培養上澄を3000rpm で15分
間遠心分離して集め、−70℃で貯蔵した。培養物に10％
ＦＣＳ含有培地Ａを再度加え、48時間培養した。培地を
捨てた後、細胞を上記のようにＰＢＳで洗浄し、培地Ａ
中で48時間培養した。上澄を再度集め、上記のように処
理した。

【００３２】ＩＡ６細胞の培養培地約30リットルを、1
0,000Ｍ. Ｗ. 遮断装置をもつ２個のカセットを備えた
ミリポア・ペリコン（Ｍillipore Ｐellicon)ユニット
により、濾過速度約 200ml／min 及び保持速度約1000ml
/minで約 2リットルまで濃縮した。濃縮物を同一装置及
び同一流速により50mMトリス(pH7.8）約10リットルで透
析濾過した。透析濾過濃縮物を50mMトリス（pH7.8)で平
衡化された１リットルＤＥセルロースカラムに40ml/min
で添加した。添加後、カラムを50mMトリス(pH7.8)1リッ
トル、次いで50mM ＮａＣｌ含有50mMトリス(pH7.8）２
リットルにより同一速度で洗浄した。カラムを次いでＮ
ａＣｌ濃度が75mM，100mM, 125mM， 150mM， 200mM及び
300mM の６種の50mMトリス(pH7.5）１リットルで連続的
に溶出させた。画分（50ml）を集め、活性画分をプール
し、ＹＭ５膜装備アミコン（Ａmicon)限外濾過攪拌セル
ユニットで65mlに濃縮した。この濃縮物をＰＢＳで平衡
化された２リットルのＡｃＡ54ゲル濾過カラムに添加し
た。カラムを80ml／hrで操作し、10ml画分を集めた。活
性画分をプールし、Ｃ４高性能液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）カラムに直接添加した。

【００３３】容量 125〜850 mlで、タンパク質 1〜8 mg
を含有し、その約10％がｈｐＧ‐ＣＳＦである試料を、
流速 1〜4 ml／min でカラムに添加した。添加後、流速
1ml／min で80％２‐プロパノール中の 0.1Ｍ酢酸アン
モニウム（pH 6.0〜7.0)により洗浄した。１ml画分を集
め、タンパク質について220nm 、260nm 及び280nm でモ
ニターした。

【００３４】精製した結果、ｈｐＧ‐ＣＳＦ含有画分を
他のタンパク質含有画分から（80の画分中72及び73番目
の画分として）明確に分離した。ｈｐＧ‐ＣＳＦは純度
約80± 5％及び収率約50％で単離された(150〜300 μ
ｇ）。この精製物質 9μｇを 4号操作（Ｒun #4)アミノ
酸配列分析に使用し、タンパク質試料を非ポリブレンＴ
ＦＡ活性ガラス繊維板に付着させた。配列分析は、ヘウ
ィックら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー、第 256巻、第7990〜7997頁、1981年〔Hewick，
et al., Ｊ. Ｂiol. Ｃhem., 256, 7990-7997 (198
1)〕及びライ、アナリティカ・キミカ・アクタ、第 163
巻、第 243〜 248頁、1984年〔Ｌai，Ａnal.Ｃhim. Ａ
cta, 163 , 243-248 (1984)〕の方法に従い、ＡＢ 470
Ａ分析装置で実施した。４号操作の結果は表III に示さ
れている。

【００３５】

【表４】 ４号操作では、（表III の残基31に相当する）第31サイ
クルより先において、更に重要な配列情報は得られなか
った。長い明確な配列を得るために、５号操作（Ｒun #
5)においては、条件調整培地から精製されたｈｐＧ‐Ｃ
ＳＦ14μｇを45℃で１時間β‐メルカプトエタノール10
mlで還元し、次いで減圧下で完全に乾燥した。タンパク
質残基を次いで、ポリブレン化ガラス繊維板に付着させ
る前に 5％ギ酸に再溶解した。配列分析は上記 4号操作
と同様にして実施した。 5号操作の結果は表IVに示され
ている。

【００３６】

【表５】 表IVのアミノ酸配列は、下記ｈｐＧ‐ＣＳＦ ｃＤＮＡ
を得るためのプローブを組立てる上で、十分に長く（44
残基）かつ明確であった。

【００３７】例 ２ 目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的操作の中に
は、標的遺伝子の発現に基づき選択されたドナー細胞中
に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写から得られるプラス
ミド担持ｃＤＮＡ“ライブラリー”の調製が含まれる。
ポリペプチドのアミノ酸配列の実質的部分が公知である
場合には、“標的”ｃＤＮＡ中での存在が推定される配
列を複製した標識一重鎖ＤＮＡプローブ配列が、一重鎖
型に変性されたｃＤＮＡのクローンコピーに対して実施
されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作において使
用され得る。ワイスマン（Ｗeissman)ら、米国特許第
4,394,443号明細書、ウォレスら、ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、第６巻、第3543〜3557頁、1979年〔Ｗ
allace，et al., Ｎucleic Ａcids Ｒes., 6， 3543
‐3557 (1979）〕、レイスら、プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳ
Ａ）、第79巻、第3270〜3274頁、1982年〔Ｒeyes, et a
l., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 79,
3270-3274 (1982)〕、及びジェイ（Ｊaye)ら、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーサ、第11巻、第2325〜2335、19
83年参照。更に、診断実施時におけるＤＮＡ／ＤＮＡハ
イブリッド形成操作に関するファルコー（Ｆalkow)らの
米国特許第 4,358,535号明細書、及びコロニー及びプラ
ークハイブリッド形成技術に関するデービスら、“遺伝
子工学、高等細菌遺伝学のマニュアル”、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー〔Ｄavis, et al.,
“Ａ Ｍanual for Ｇenetic Ｅngineering, Ａdvance
d ＢacterialＧenetics ”，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌ
aboratory 〕・コールド・スプリング・ハーバー、ニュ
ーヨーク、1980年、第55〜58頁及び第 174〜176 頁参
照。

【００３８】完全ＲＮＡの定量的単離のためのグアニジ
ニウムチオシアネート操作〔チャーグウィンら、バイオ
ケミストリー、第18巻、第5294〜5299頁、1979年（Ｃhi
rgwin, et al., Ｂiochemistry, 18，5294-5299 (197
9)）〕により、全ＲＮＡを膀胱癌細胞系5637（ＩＡ６）
細胞約１ｇから抽出した。

【００３９】無菌ＲＮＡ水溶液はＩＡ６細胞由来の全Ｒ
ＮＡを含有していた。全ＲＮＡ溶液からメッセンジャー
ＲＮＡのみを得るため、溶液をオリゴデオキシチミジレ
ート〔オリゴ（ｄＴ）〕〔コラボレーティブ・リサーチ
社（Ｃollaborative Ｒesearch, Ｉnc.)、ウォルサ
ム、マサチューセッツ〕含有カラムに通した。メッセン
ジャーＲＮＡに特有のポリアデニル化（ポリＡ⁺ ）尾部
はカラムに付着するが、リボソームＲＮＡは溶出する。
かかる操作の結果、ポリアデニル化メッセンジャーＲＮ
Ａ（ポリＡ⁺ ｍＲＮＡ）約90μｇを単離した。単離され
たポリＡ⁺ メッセンジャーＲＮＡを、ｃＤＮＡ反応で使
用する前に、最終濃度４mMで 5分間室温で水酸化メチル
水銀〔アルファ・ベントロン（Ａlpha Ｖentron）、デ
ンバーズ、マサチューセッツ〕により前処理した。水酸
化メチル水銀処理は、翻訳を阻害するメッセンジャーＲ
ＮＡ自体の相互反応及びそれと汚染分子との相互反応を
抑制させた。ペイバーら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、第 258巻、第7636〜7642頁、19
79年〔Ｐayvar, et al., Ｊ. Ｂiol.Ｃhem., 258,763
6-7642 (1979)〕参照。

【００４０】オカヤマ操作法〔オカヤマら、モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー、第２巻、第 161
〜170 頁、1982年（Ｏkayama, et al., Ｍolcular & Ｃ
ellular Ｂiology, 2, 161-170 （1982))〕に従い、ｃ
ＤＮＡバンクをＩＡ６細胞から得たｍＲＮＡにより調製
した。ｃＤＮＡを次いでインキュベートして増幅用宿主
微生物大腸菌Ｋ‐12株ＨＢ 101に組込んだ。

【００４１】例 ３ 表IVのｈｐＧ‐ＣＳＦアミノ末端配列に基づき考え出さ
れたハイブリッド形成プローブは、各々が長さ23塩基で
3個のイノシン残基を有する24組のオリゴヌクレオチド
から構成されていた。プローブオリゴヌクレオチドをカ
ルザースら、ジェネティック・エンジニアリング、第 4
巻、第 1〜18頁、1982年〔（Ｃaruthers, et al., Ｇen
etic Ｅngineering, 4, 1-18(1982)〕の操作に従い製
造し、ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化（Ｋinasin
g)することによりｒ‐³²Ｐ ＡＴＰで標識した。表IVの
配列中残基23〜30のメッセンジャーＲＮＡに対応するプ
ローブオリゴヌクレオチドは、表Ｖに示されている。

【００４２】

【表６】 中立性をＩに付与したのは、タカハシら、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（ＵＳＡ）、第82巻、第1931〜1935頁、1985年〔Ｔ
akahashi, et al., Ｐroc.Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （Ｕ
ＳＡ）, 82, 1931‐1935 (1985）〕及びオーツカら、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第 2
60巻、第2605〜2608頁、1985年〔Ｏhtsuka, et al.,Ｊ.
Ｂiol. Ｃhem., 260, 2605-2608 (1985)〕の研究公
表に基づいていた。しかしながら、イノシンはＧ又はＴ
と塩基対形成した場合には脱安定化効果を有する。タカ
ハシらの場合では、イノシンは、それらが一群として平
均化してほぼ中立化するに到ることから、中立効果を有
するようである（例えば、 3個はＣと好ましく対形成し
たが、２個はＴと対形成し好ましくなかった）。

【００４３】ＧとのＩ塩基対形成効果を試験するため、
コントロール実験をＮ‐myc 遺伝子配列及びクローンを
用いて計画した。Ｎ‐myc 遺伝子から得た配列は、ｈｐ
Ｇ‐ＣＳＦプローブで規定されたものと同一の全体的Ｇ
及びＣ含有率を、各コドンの最初の２つの位置で有して
いた。したがって、Ｎ‐myc 試験プローブは、ｈｐＧ‐
ＣＳＦプローブと比較し、同一の長さであり、同一の相
対的位置にＩを含有し、しかも潜在的に同一の平均Ｔｍ
（62〜66℃、 3又は 4個のイノシン残基を含有している
ためではない）を有していた。

【００４４】２組のＮ‐myc 試験プローブを前記カルザ
ースらの操作に従い組立てた。表VIに示された第１組
は、以下のものを含んでいた； 1. 完全対合体の23量
体； 2.３個の３位Ｃが、Ｉを加えた場合に最悪のケー
スを生じるようにＩで置換されている； 3. ４個の３位
がＩで置換されている。第２組の試験プローブは、全体
的な中立的塩基対形成効果を与え得るイノシン塩基対の
よりランダムな配置を表わすために考え出された。表VI
に示された第２組は以下のものを含んでいた； 4.Ｃと
塩基対形成する２個のＩ及びＧ塩基対形成する１個のＩ
を有する； 5. Ｉ：Ｇ塩基対たるもう１個のＩを有する
4と同一である。

【００４５】

【表７】 Ｎ‐myc ＤＮＡ配列及びニワトリ成長ホルモンＤＮＡ配
列（陰性コントロール）を含有する５個のレプリカフィ
ルターを、ハイブリッド形成前に、減圧オーブン中80℃
で２時間焼いた。すべてのフィルターは、ハイブリッド
形成時間が６時間のみであること以外、ｈｐＧ‐ＣＳＦ
プローブに関して例４で記載されたように、ハイブリッ
ド形成した。フィルターを室温で３回しかる後45℃で１
回各々10分間洗浄した。フィルターをガイガーカウンタ
ーでモニターした。

【００４６】Ｎ‐myc プローブ３のフィルターは他の４
個のプローブフィルターと比較して非常に弱いシグナル
を発したため、それ以上洗浄しなかった。50℃で10分間
洗浄後、ガイガーカウンターは、プローブ 1を 100％標
準として、下記％シグナルを表示した：プローブ 2、20
％；プロープ 3（45℃）、2 ％；プローブ 4、92％；及
びプローブ5 、75％。55℃での洗浄後は、％が：プロー
ブ 2、16％；プローブ4、 100％；及びプローブ 5、80
％であった。60℃での最終洗浄では下記％を表示した：
プローブ 2、1.6 ％；プローブ 4、90％；及びプローブ
5、70％。

【００４７】このように、プローブ 2及び 4のように３
個のＩが存在する場合では、シグナルにおいて60倍まで
の差違が、理論的Ｔｍ（Ｉは計算に含まれていない）は
〔最悪のＩ塩基対形成例（プローブ2)及び比較的中立な
Ｉ塩基対形成例（プローブ4)に関して〕近いにもかかわ
らず観察される。

【００４８】Ｎ‐myc 試験ハイブリッド形成により得ら
れた標準化情報は、より厳格でない洗浄による結果が許
容され得る信頼度を測定するために、下記のように洗浄
及びｈｐＧ‐ＣＳＦハイブリッド形成のモニターに際し
て利用された。

【００４９】例 ４ ハナハンら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー、第 166巻、第557〜580 頁、1983年〔Ｈanahan,
et al., Ｊ. Ｍol. Ｂiol.，166 , 557-580(1983)〕の
操作に従い、例２で産生されたｃＤＮＡインサート（in
sert）との組換え体を含む細菌を、寒天プレート上に載
置された24個のニトロセルロースフィルター〔ミリポア
（Ｍillipore）、ベッドフォード、マサチューセッツ〕
に拡散した。プレートを次いでインキュベートして約 1
50,000個のコロニーを得たが、これを24個の他のニトロ
セルロースフィルターに移してレプリカ培養した。レプ
リカを明瞭なコロニーが出現するまでインキュベートし
た。フィルター上の細菌を、10分間水酸化ナトリウム
(0.5Ｍ）でわずかに飽和され、しかる後２分間トリス(1
Ｍ）でブロットされ、次いで10分間ＮａＣｌ(1.5Ｍ）含
有トリス(0.5Ｍ）でブロットされたワットマン3MM 紙上
で溶菌させた。フィルターがほぼ乾燥した後、それらを
核酸ハイブリッド形成前に減圧オーブン中80℃で２時間
焼いた。ウァールら、プロシーディングス・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第76巻、
第3683〜3687頁、1979年〔Ｗahl, et al., Ｐroc. Ｎ
atl.Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 76, 3683‐3687(197
9)〕、及びマニアティスら、セル、第81巻、第 163〜18
2 頁、1976年〔Ｍaniatis, et al.,Ｃell, 81, 163-18
2 (1976)〕。

【００５０】フィルターを10Ｘデンハード (Ｄenhardt)
0.2％ＳＤＳ及び６ＸＳＳＣ 750ml中65℃で２時間、前
ハイブリッド形成させた。フィルターを６ＸＳＳＣで洗
浄し、次いで４つをバッグに入れ、６ＸＳＳＣ及び10Ｘ
デンハード中で14時間ハイブリッド形成させた。50×10
⁶ cpm の³²Ｐ‐標識プローブ（オリゴヌクレオチド）を
有するバッグ当たり、溶液約15mlが入っていた。

【００５１】ハイブリッド形成後、フィルターを６ＸＳ
ＳＣ（１リットル／洗浄）中で３回室温で各々10分間洗
浄した。フィルターを次いで６ＸＳＳＣ１リットルによ
り、45℃15分間で１回洗浄した。フィルターを増強スク
リーン及びコダックＸＡＲ‐２フィルムにより−70℃で
２時間オートラジオグラフィーに付した。このオートラ
ジオグラフでは、５個の非常に強いシグナルを含む40〜
50個の陽性シグナルが検出された。

【００５２】最強の５個のシグナル及び別の５個の陽性
シグナルを含む領域をマスタープレートからこすり落と
し、同一条件下同一プローブ混合物を用いて二次スクリ
ーニングに移した。洗浄操作は、高温洗浄が55℃15分間
で各々２回、及びしかる後の60℃15分間で１回からなる
点で異なっていた。例３のＮ‐myc プローブ研究に基づ
き、二次スクリーニングでの最終洗浄温度を上げたが、
24個の23量体に関する凝集融解温度がＮ‐myc プローブ
の温度に近似した60〜68℃であったためである。２回目
の55℃での洗浄後、フィルターを湿潤させたままにし、
オートラジオグラフィーに付した。このオートラジオグ
ラフィーと、60℃での最終洗浄後同じ時間をかけた２回
目のオートラジオグラフィーとの比較では、10個の被試
クローンのうち２個だけが55℃〜60℃以上に昇温させた
場合にシグナルの実質的損失をうけないことが明らかに
なった。これら２個のクローンは、ほぼ同一の長さ及び
制限エンドヌクレアーゼパターンであることが後に示さ
れた。Ｐpo２と称される１個のクローンを配列決定のた
め選択した。

【００５３】上記操作で得られた組換えｈｐＧ‐ＣＳＦ
ｃＤＮＡクローンのＰpo２の配列決定は、サンガー
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第74巻、第5463〜54
67頁、1977年〔Ｓanger, et al.,Ｐroc. Ｎatl. Ａca
d. Ｓci. （ＵＳＡ）, 74，5463-5467 (1977)〕のジデ
オキシ法により達成された。一重鎖ＤＮＡファージＭ‐
13は、二重鎖ｃＤＮＡクローンの一重鎖ＤＮＡ鋳型を供
給するためのクローニングベクターとして使用した。サ
ンガーらの方法により、表VII に示されているようなア
ミノ酸翻訳を伴う配列及びポリペプチドコード領域の相
補鎖が明らかとなった。

【００５４】

【表８】

【００５５】

【表９】

【００５６】

【表１０】 表VII の下記特徴は顕著である。配列の５′末端には、
ポリＧｃＤＮＡリンカー配列に相当する塩基が示されて
いる。次いで約５個の塩基（“Ｎ”と表示されている）
が存在するが、その配列は前にある多数のＧのためにサ
ンガーらの方法によっては容易に明確に決定することが
できなかった。その後の配列は、ポリペプチドのリーダ
ー配列と推定される部分をコードする12個のコドンを表
わす。例１に記載されたｈｐＧ‐ＣＳＦ天然単離物のア
ミノ末端配列との対応により、ｈｐＧ‐ＣＳＦの推定的
“成熟”型における最初のスレオニン残基は＋１で示さ
れている。成熟ｈｐＧ‐ＣＳＦは、示された如く 174個
の残基を有することがその後示された。“停止”コドン
（ＯＰコドン、ＴＧＡ）の後に、約 856塩基の非翻訳
３′配列及びポリＡ“尾部”の多数のＡが続く。唯一の
ＨgiＡＩ及びＡpaＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位、
並びに２つのＳtuＩ部位（原核及び真核細胞発現系の組
立てに関して以下で説明されている）も表VII に示され
ている。ポリペプチド中におけるアスパラギン残基の欠
損のため、Ｎ‐グリコシル化のための明確な部位は存在
しない。３′非翻訳配列末端近くで下線が引かれた６個
の塩基は、潜在的ポリアデニル化部位を表わす。

【００５７】合計 450,000個のクローンの中から上記ハ
イブリッド形成操作により同定された２つの他のｃＤＮ
Ａクローンの各々が、転写開始部位以降の全リーダー配
列をコードするＤＮＡを含有していなかったことは、注
目に値する。なるほど、３つすべてのｈｐＧ‐ＣＳＦク
ローンは正確に同一部位の５′領域で集結しており、こ
のことは転写されたｍＲＮＡの二次構造がこの部位より
先のｃＤＮＡ形成を著しく阻害することを示唆してい
る。実際には、したがって、オカヤマら、モレキュラー
・アンド・セルラー・バイオロジー、第３巻、第 280〜
289 頁、1983年〔Ｏkayama,et al.,Ｍol. and Ｃell.
Ｂiol., 3, 280-289 (1983)〕に記載され、しかもウォ
ンら、サイエンス、第228 巻、第 810〜814 頁、1985年
〔Ｗong, et al., Ｓcience, 228, 810-814 (1985)〕
においてＧＭ‐ＣＳＦを単離するために現実に利用され
たｃＤＮＡ発現スクリーニングは、ｈｐＧ‐ＣＳＦ Ｄ
ＮＡの単離に簡単に利用することができなかったが、そ
の理由は、かかる単離系が通常被験クローン中における
全長のｃＤＮＡ転写体の存否に依存しているからであ
る。

【００５８】上記配列は、微生物宿主におけるｈｐＧ‐
ＣＳＦの直接的発現を確実化するには、困難である。か
かる発現を確実にするためｈｐＧ‐ＣＳＦコード領域に
は開始ＡＴＧコドンを加えるべきであり、しかもその配
列は適切なプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列の
制御下にある部位で形質転換ベクター中に挿入されるべ
きである。

【００５９】例 ５ この例では、前記例で単離されるようなｈｐＧ‐ＣＳＦ
コードｃＤＮＡを用いてゲノムクローンをスクリーニン
グした。λファージヒト胎児肝ゲノムライブラリー〔ロ
ーンら、セル、第15巻、第1157〜1174頁、1978年（Ｌaw
n, et al., Ｃell,15, 1157-1174 (1978)）の操作に従
い製造され、ティー・マニアティス（Ｔ. Ｍaniatis)か
ら入手した〕を、ＨgiＡＩ及びＳtuＩで切断単離された
２つのｈｐＧ‐ＣＳＦ ｃＤＮＡ断片（ＨgiＡＩ〜Ｓtu
Ｉ、 649塩基対；ＳtuＩ〜ＳtuＩ、 639塩基対）からな
るニック(nick)翻訳プローブを用いてスクリーニングし
た。合計約 500,000個のファージを12個のペトリ皿（15
cm）で培養し、プラークを取出し、ベントン／デビソン
（Ｂenton ／Ｄavison）操作法〔ベントンら、サイエン
ス、第196 巻、第 180頁、1977年（Ｂenton, et al.,Ｓ
cience, 196, 180(1977)）〕によりプローブとハイブ
リッド形成させた。合計12個の陽性クローンが観察され
た。二次スクリーニングにおけるオートラジオグラフィ
ーで最強シグナルを生じた３個のクローン(1〜3)を、 1
リットル培地中で増殖させ、放射線標識24量体オリゴヌ
クレオチド（γ‐³²Ｐ ＡＴＰでキナーゼ処理されてい
る）５′ＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＣＡＣＴ
ＧＴＧ３′を用いて制限酵素切断及びサザーンブロット
法（Ｓouthern blotting）により遺伝子地図を作成し
た。地図作成結果は、単離体1 及び3 が同一であって、
単離体2 がｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子の５′に付加した2000
個の塩基を含有することを示していた。したがって、ク
ローン2 を更に特徴づけるために使用した。クローン2
のＤＮＡをＥcoＲＩで切断して8500塩基対のｈｐＧ‐Ｃ
ＳＦ含有断片を得、これを次いでｐＢＲ322に組込んで
サブクローニングし、更に制限エンドヌクレアーゼ切
断、サザーンブロット法、Ｍ13サブクローニング及び配
列決定により遺伝子地図を作成した。得られた配列はVI
IIに示されたとおりである。

【００６０】

【表１１】

【００６１】

【表１２】

【００６２】

【表１３】

【００６３】

【表１４】

【００６４】

【表１５】 ｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子を含有するゲノムＤＮＡの制限エ
ンドヌクレアーゼ地図（約 3.4キロ塩基対）は図１で詳
細に記されている。図１で示された制限エンドヌクレア
ーゼは、ＮcoＩ，Ｎ；ＰstＩ，Ｐ；ＢamＨＩ，Ｂ；Ａpa
Ｉ，Ａ；ＸhoＩ，Ｘ；及びＫpnＩ，Ｋである。図の下方
の矢印は、ゲノム配列を得るために利用される配列決定
方法を示す。ボックス領域はｃＤＮＡクローン中の領域
であり、点線の端部ボックスはｃＤＮＡクローン中に存
在しないもののｍＲＮＡブロット法により同定された配
列を表わす。エキソン配列たるコード配列の同定をノー
ザン（Ｎorthern)ブロット法により実施した。エキソン
1 及び2 における推定的スプライス部位にまたがる24量
体オリゴヌクレオチドプローブ、５′ＣＡＧＣＡＧＣＴ
ＧＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＴ３′を、ノーザンブ
ロット法でｈｐＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡとハイブリッド形
成させた。得たブロットは、エキソン2 のオリゴヌクレ
オチドプローブの場合と同様のサイズ（1650塩基対以
下）のｍＲＮＡを示す。このデータは、表VIIIで示され
るＭet開始コドンを用いたｐＳＶ／ｇｈＧ‐ＣＳＦベク
ター（例９）によるｈｐＧ‐ＣＳＦの直接的発現能と一
緒に考え合わされた場合に、エキソン1 に含有されるコ
ード配列を規定する。エキソン 2〜5 は、ｈｐＧ‐ＣＳ
Ｆ遺伝子（表VII ）のｃＤＮＡクローン（Ｐpo２）にお
いて得られるコード配列により規定される。

【００６５】例 ６ この例は、ｈｐＧ‐ＣＳＦをコードしかつ大腸菌優先コ
ドンを含有する人工遺伝子の製造に関する。

【００６６】簡潔に述べると、用いられたプロトコール
は、全般的に、参考のため本明細書に包含される共有権
者アルトン（Ａlton）らのＰＣＴ公開第ＷＯ83／04053
号明細書の開示に示されているとおりであった。遺伝子
は、成分オリゴヌクレオチドが多数の二重鎖にまず集合
するように考えられ、二重鎖は次いで３つの別個のセク
ションにまとめられた。これらセクションは簡易な増幅
用として考えられ、増幅系から除去された後に、適切な
発現ベクター中に連続的に又は多数の断片結合を介して
まとめることができた。

【００６７】セクションＩ，II及びIII の構造は表IX〜
XIV に示されている。表IX及びＸに示されたセクション
Ｉの構造において、オリゴヌクレオチド 1〜14は７本の
二重鎖(1及び8 ； 2及び9 ； 3及び10； 4及び11； 5及
び12； 6及び13； 7及び14）にまとめられた。７本の二
重鎖を次いで結合し、表Ｘに示されるセクションＩを形
成した。表Ｘにおいて、セクションＩは増幅・発現ベク
ターとの結合及びセクションIIとの結合のために用いら
れる上流ＸbaＩ付着端及び下流ＢamＨＩ付着端を含有す
ることにも着目されるであろう。

【００６８】

【表１６】

【００６９】

【表１７】 表XI及びXII に示されるセクションIIの構造において、
オリゴヌクレオチド15〜30は８本の二重鎖（15及び23；
16及び24；17及び25；18及び26；19及び27；20及び28；
21及び29；22及び30）にまとめられた。これら８本の二
重鎖を次いで結合し、表XII に示されるセクションIIを
形成した。表XII で更に示されるように、セクションII
は増幅ベクターとの結合及びセクションＩとの結合のた
めに用いられる上流ＢamＨＩ付着端及び下流ＥcoＲＩ付
着端を有する。その下流端部近くでは、セクションIIは
最後の結合セクションII及びIII に用いられる下流Ｓst
Ｉ部位も有している。

【００７０】

【表１８】

【００７１】

【表１９】 最後に、セクションIII は表XIII及びXIV に示されてい
るように組立てられた。この組立てのために、オリゴヌ
クレオチド31〜42は６本の二重鎖（31及び37；32及び3
8；33及び39；34及び40；35及び41；36及び42）にまと
められた。６本の二重鎖を次いで結合し、表XIV に示さ
れるセクションIII を形成した。表XIV でも示されてい
るように、セクションIII は、増幅ベクター、及び少な
くともＥcoＲＩ末端の場合には発現ベクターとの結合の
ために用いられる上流ＢamＨＩ付着端及び下流ＥcoＲＩ
付着端を含有する。しかもセクションIII は、セクショ
ンII及びIII の最終的結合に用いられる上流ＳstＩ部位
を有している。

【００７２】

【表２０】

【００７３】

【表２１】 セクションＩで形成されたＸbaＩ〜ＢamＨＩ断片を、Ｘ
baＩ及びＢamＨＩで開環されたＭ13mp11ファージベクタ
ーに結合する。ベクターを次いでＢamＨＩ及びＥcoＲＩ
で切断することにより再開環し、次いでセクションIIで
形成されたＢamＨＩ〜ＥcoＲＩ断片と結合する。この段
階で、セクションＩ及びIIは適切な方向で結合された。
次いで別のＭ13mp11ベクターをＢamＨＩ〜ＥcoＲＩ切断
で開環し、しかる後セクションIII で形成されたＢamＨ
Ｉ〜ＥcoＲＩ断片と結合した。

【００７４】セクションＩ及びII含有ベクターをＸbaＩ
及びＳstＩで切断する。同様に、セクションIII 含有ベ
クターをＳstＩ及びＥcoＲＩで切断する。各々の切断で
得る2つの断片のうち小断片の両方を、事前にＸbaＩ及
びＥcoＲＩで開環されたプラスミドｐＣＦＭ1156に結合
する。この反応の生成物は表XVに示される連続ＤＮＡ配
列含有の発現プラスミドであって、そのＤＮＡ配列は大
腸菌翻訳開始用のアミノ末端メチオニンコドン（ＡＴ
Ｇ）をもつ完全ｈｐＧ‐ＣＳＦポリペプチドをコードし
ている。

【００７５】

【表２２】

【００７６】

【表２３】 いずれの適切なベクターもこのＤＮＡ発現のために使用
することができるが、発現プラスミドｐＣＦＭ1156はプ
ラスミドｐＣＦＭ836 から容易に組立てることができ、
その構造は公開欧州特許出願第 136,490号明細書に記載
されているｐＣＦＭ836 をまずＮdeＩで切断し、次いで
両方に存在するＮdeＩ部位が破壊されるようにＰolＩで
ブラント末端化する。次いで、ベクターをＣlaＩ及びＳ
acIIで切断して、存在するポリリンカーを除去し、しか
る後表XVI に示される代替ポリリンカーに結合する。こ
の代替ポリリンカーは、前記アルトンらの操作に従い組
立てることができる。なお、プラスミドｐＣＦＭ836
は、ｐＣＦＭ736 （後述）をＢamＨＩで切断し、下記の
断片を挿入することによって得られる。

【００７７】BamH I SstII BamHI ₅ ′_{-GATCCGCGGATAAATAAGTAAC-3} ′ 3′- GCGCCTATTTATTCATTGCTAG-5 ′ 発現ｐＣＦＭ1156プラスミドにおける発現制御はλＰ_L
プロモーターによるが、これ自体が（大腸菌株Ｋ12ΔＨ
trp から得られるような）Ｃ_I857リプレッサー遺伝子の
制御下にある。

【００７８】

【表２４】 例 ７ この例は、〔Ｍet^-1〕ｈｐＧ‐ＣＳＦコードＤＮＡ配列
によるｈｐＧ‐ＣＳＦポリペプチドの大腸菌発現に関す
る。使用された配列は、部分的に合成で、部分的にｃＤ
ＮＡ由来であった。使用された合成配列は大腸菌優先コ
ドンであった。

【００７９】表VII に示されたｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子含
有プラスミドＰpo２をＨgiＡＩ及びＳtuＩで切断して、
約 645塩基対の断片を得たが、この断片は５′末端の７
個のリーダー配列残基コドン及び３′非コード領域の約
100塩基対をもつ（表VII に示されるような）成熟ｈｐ
Ｇ‐ＣＳＦ遺伝子を含有していた。ＨgiＡＩ切断ではＰ
stＩ切断の場合と同一の５′の 4塩基付着端を残し、Ｓ
tuＩではブラント末端を残す。これにより、ＰstＩ及び
ブラント末端形成制限酵素ＨinｃIIで切断されたＭ13mp
8 （Ｒf)に断片を容易に挿入することができる。Ｍ13中
で増幅させた後、ｈｐＧ‐ＣＳＦ ＤＮＡをＡpaＩ及び
ＢamＨＩで切断することにより摘出したが、これはそれ
ぞれｈｐＧ‐ＣＳＦにおける+3〜+5残基コドン間にまた
がるＡpaＩ部位、及びＭ13mp8 制限ポリリンカーにおけ
るＨinｃII部位の“下流”のＢamＨＩ部位において切断
されたものである。ｈｐＧ‐ＣＳＦポリペプチドの大腸
菌発現を可能にするため、合成断片を下記表XVIIに示さ
れるように製造した。

【００８０】

【表２５】 表XVIIの分析から調べ得るように、リンカーは、ＡpaＩ
付着端、ｈｐＧ‐ＣＳＦアミノ末端の最初の 3個の残基
を特定するコドン（上記Ｍ13ＤＮＡのＡpaＩ消化で削除
されたＴhr¹ ，Ｐro² ，Ｌeu³ 指定コドンを回復させ、
かつ大腸菌中で優先的に発現するコドンを採用）、翻訳
開始ＡＴＧ、リボソーム結合部位を付与する24塩基対配
列、及びＸbaＩ付着端を有している。

【００８１】大腸菌発現用に使用される発現ベクター
は、1985年 4月10日に公開されたモリス（Ｍorris ）の
欧州特許出願第136,490 号明細書においてｐＣＦＭ536
として記載されたベクターである（更に、ｐＣＦＭ536
含有の大腸菌ＪＭ 103，ブタペスト条約に基づく寄託に
おける受託番号、ＡＴＣＣ39934 参照）。簡単にいえ
ば、まずプラスミドｐＣＦＭ536 をＸbaＩ及びＢamＨＩ
で切断した。上記ｈｐＧ‐ＣＳＦ断片（ＡpaＩ／ＢamＨ
Ｉ）及びリンカー（ＸbaＩ／ＡpaＩ）を次いでそれに結
合し、プラスミドｐ536 Ｐpo２を形成した。 プラスミ
ドｐ536 Ｐpo２を、Ｃ_I857遺伝子含有プラスミドｐＭＷ
１（ブタペスト条約に基づく寄託における受託番号、Ａ
ＴＣＣ No.39933)で予め形質転換された大腸菌ＡＭ 7株
のファージ耐性変異体に組込んだ。形質転換は、ｐＣＦ
Ｍ536 前駆体プラスミドに担持された抗生物質（ａｍ
ｐ）耐性マーカー遺伝子に基づき確認した。ＬＢブロス
（アンピシリン50μｇ／ml）中での細胞培養物を28℃に
維持し、Ａ₆₀₀ ＝0.5 の培養細胞増殖時において培養物
を温度42℃に３時間上げて、ｈｐＧ‐ＣＳＦ発現を誘導
した。培養物の最終ＯＤはＡ₆₀₀ ＝1.2 であった。

【００８２】形質転換細胞によるｈｐＧ‐ＣＳＦ発現レ
ベルは、クマシーブル一色素で染色されたＳＤＳポリア
クリルアミドゲルにより、総細胞タンパク質 3〜5 ％と
評価された。

【００８３】細胞をＪＳ‐4.2 ローター中3500×ｇで10
分間遠心分離して回収した。水中25％(w/v) の細胞をフ
レンチ・プレッシャー・セル（Ｆrench Ｐressure Ｃel
l)に10,000psi (700kg／cm² ）で３回通して破壊した。
破壊細胞懸濁液をＪＡ‐20ローター中10,000×ｇで15分
間遠心分離した。ペレットを水に再懸濁し、pH8.7 の1
％ラウリン酸50mMトリス中に総タンパク質濃度約 5mg／
mlで溶解させた。溶解ペレット物質を15,000×ｇで10分
間遠心分離し、上澄にＣｕＳＯ₄ を20mMまで加えた。１
時間後、この試料を、例１(B) の操作に従い精製するた
め、容量及び濃度を調整して、Ｃ４ＨＰＬＣカラムに充
填した。

【００８４】非有機物含有緩衝液中で調製された更に多
量のｈｐＧ‐ＣＳＦを得るために第二の精製法が開発さ
れた。この物質はイン・ビボ研究に適する。細胞ペース
ト 150ｇを 1mM ＤＴＴ約 600mlに再懸濁し、約7000ps
i (490kg／cm² ）でマントン・グアリン（Ｍanton Ｇua
lin)ホモジナイザーに 4回通した。破壊細胞懸濁液を1
0,000×ｇで30分間遠心分離し、ペレットを 1％デオキ
シコール酸、 5mMＥＤＴＡ、5mM ＤＴＴ及び 50mM トリ
スのpH 9の400 mlに再懸濁した。この懸濁液を室温で30
分間混合し、10,000×ｇで30分間遠心分離した。ペレッ
トを水約 400mlに再懸濁し、10,000×ｇで30分間遠心分
離した。ペレットを 2％ザルコシル及び50mMトリスpH8
の 100mlに溶解した。ＣｕＳＯ₄ を20μM まで加え、混
合物を室温で16時間撹拌し、しかる後、20,000×ｇで30
分間遠心分離した。上澄にアセトン300mlを加えた。こ
の混合物を氷上に20分間おき、しかる後5000×ｇで30分
間遠心分離した。ペレットをpH4 の 6Ｍグアニジン及び
40mM酢酸ナトリウムの 250mlに溶解し、平衡化された12
00mlのＧ‐25カラムに充填し、pH5.4 の20mM酢酸ナトリ
ウムで操作した。ｈｐＧ‐ＣＳＦピーク（約 400ml）を
プールし、pH5.4 の20mM酢酸ナトリウムで平衡化された
15mlのＣＭセルロースカラムに加えた。充填後、カラム
を60mlのpH5.4 の20mM酢酸ナトリウム及び25mM塩化ナト
リウムで洗浄し、しかる後カラムを 200mlのpH5.4 の20
mM酢酸ナトリウム及び37mM塩化ナトリウムで溶出させ
た。この溶出液 150mlを10mlに濃縮し、平衡化された 3
00mlのＧ‐75カラムに充填し、pH5.4 の20mM酢酸ナトリ
ウム及び 100mM塩化ナトリウムで操作した。ピーク画分
35mlをプールし、フィルター滅菌した。ｈｐＧ‐ＣＳＦ
の最終濃度は 1.5mg／mlであったが、ゲル分析で測定し
た場合純度95％以上であり、ｈｐＧ‐ＣＳＦ 0.5mgにつ
き発熱性物質を 0.5ng以下で含有していた。発熱性物質
レベルは、カブトガニ遊走細胞溶離物（ＬＡＬ）試験キ
ット〔エム・エー・バイオプロダクツ（Ｍ．Ａ. Ｂiopr
oducts）、ウォーカースビル、メリーランド〕により測
定した。

【００８５】例 ８ この例は、17，36，42，64及び74位に存在するシステイ
ン残基が各々適切なアミノ酸残基で置換されたｈｐＧ‐
ＣＳＦ類縁体を産生する組換え方法の利用に関する。

【００８６】1985年 2月28日に公開されたスーザ（Ｓou
za）らの公開ＰＣＴ出願第ＷＯ85/00817号明細書の特定
部位突然変異誘発は、下記表XVIII に示された大きさが
20〜23塩基の合成オリゴヌクレオチドを用いて、下記プ
ラスミドｐ536 Ｐpo２の〔Ｍet^-1〕コードＤＮＡ上で行
なわれた。オリゴヌクレオチド1 は〔Ｓer¹⁷〕ｈｐＧ‐
ＣＳＦコード遺伝子の形成が可能で、オリゴヌクレオチ
ド２は〔Ｓer³⁶〕ｈｐＧ‐ＣＳＦの形成が可能であっ
た。

【００８７】

【表２６】 ＣysからＳerへの限定的突然変異誘発は、鋳型としてｐ
536 Ｐpo２から単離されたＸbaＩ‐ＢamＨＩ ｈｐＧ‐
ＣＳＦ断片含有のＭ13mp10を用いて実施した。Ｃys‐Ｓ
er置換体含有の各Ｍ13mp10由来のＤＮＡをＸbaＩ及びＢ
amＨＩで処理した。得た断片を発現ベクターｐＣＦＭ74
6 に組込んでクローニングし、発現産物を例７のように
単離した。

【００８８】プラスミドｐＣＦＭ746 は、1985年 2月28
日に公開されたモリス（Ｍorris)の公開ＰＣＴ出願第Ｗ
Ｏ85/00829号明細書に記載されているように、ＣlaＩ及
びＢamＨＩでプラスミドｐＣＦＭ736 を切断し、存在す
るポリリンカーを除去し、下記ポリリンカーで置換する
ことにより組立てることができる。

【００８９】

【表２７】 なお、ｐＣＦＭ736 は、ｐＣＦＭ536(ＡＴＣＣ39934)か
ら、次の手順によりｐＣＦＭ636 を経由し、組立てるこ
とができる。まず、ｐＣＦＭ536 をＥcoＲＩ部分的切断
及びＳstＩ切断することにより、アンピシリン耐性遺伝
子配列及び安定化配列（par)を欠失させた後、ＥcoＲＩ
部位は、リンカーによってＡatII部位に変換する。一
方、プラスミドＴｎ5 （Beck等のGene, 19, p 327-336
（1982）あるいはAuerswald 等の Cold Spring Harbor
Symp.Quant.Biol.,45 p107-113 （1981）に全塩基配列
が示されている。）から、カナマイシン耐性遺伝子配列
を含むＳmaＩ／ＨinｄIII 断片領域を、ＳstＩリンカー
をＳmaＩ粘着末端に、且つＮdeＩリンカーをＨinｄIII
粘着末端に付加することにより、ＳstＩ／ＮdeＩ断片と
して得る。また、ｐＳＣ101 （受託番号、ATCC 37032）
から、par 遺伝子を含むＨinｃII／ＡvaＩ断片領域を、
ＨinｃII部位は最初にＳalＩリンカーで次いでＡatIIリ
ンカーで処理し、また、ＡvaＩ部位は最初にＢamＨＩリ
ンカーで次いでＮdeＩリンカーで処理し、ＡatII／Ｎde
Ｉ断片として得る。

【００９０】ｐＣＦＭ536 の大きな断片（ＡatII／Ｓst
Ｉ）、カナマイシン耐性遺伝子の断片（ＳstＩ／Ｎde
Ｉ）およびpar 遺伝子断片（ＡatII／ＮdeＩ）を混ぜ合
わせて結合し、ｐＣＦＭ636 が得られる。

【００９１】ｐＣＦＭ636 をＡatII及びＸbaＩにより切
断後、下記のＡatIIからＸbaＩまでの断片を挿入し、ｐ
ＣＦＭ736 を得る。

【００９２】 AatII ₅′_{- CAGATCCATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATA} 3′-TGCAGTCTAGGTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTAT ClaI XbaI _{AATACCACTGGCGGTGATAATGAGCACATCGATT-3}′ TTATGGTGACCGCCACTATTACTCGTGTAGCTAAGATC-5′ 本発明のＣys‐Ｓer（ＣysからＳerへの）類縁体の精製
操作において、細胞ペースト約10〜15ｇを１mM ＤＴＴ
40mlに再懸濁し、フレンチ・プレッシャー・セルに10,0
00psi (700kg／cm² ）で３回通した。破壊細胞懸濁液を
1000×ｇで30分間遠心分離した。ペレットをpH9 の 1％
ＤＯＣ， 5mMＥＤＴＡ， 5mM ＤＴＴ，50mMトリスに再
懸濁し、室温で30分間混合した。混合物を10,000×ｇで
30分間遠心分離し、Ｈ₂ Ｏ 40mlに再懸濁し、10,000×
ｇで30分間再遠心分離した。ペレットをpH8 の 2％ザル
コシル、50mM ＤＴＴ，50mMトリスの10mlに溶解した。
１時間混合後、混合物を20,000×ｇで30分間遠心分離し
て清澄化し、しかる後平衡化された 300mlのＧ‐75カラ
ムに充填し、pH8 の 1％ザルコシル、50mMトリスで操作
した。類縁体含有画分をプールし、少なくとも１日間空
気にさらして空気酸化させた。最終濃度は 0.5〜５mg／
mlの範囲であった。

【００９３】例 ９ この例において、哺乳動物細胞発現系は、ｈｐＧ‐ＣＳ
Ｆ ＤＮＡの活性ポリペプチド産物が哺乳動物細胞（Ｃ
ＯＳ‐１，ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐1650）中で発現されかつ
そこから分泌されるか否かを確認するために、工夫され
た。この系は、ウォンら、サイエンス、第228 巻、第 8
10〜815 頁、1985年〔Ｗong, et al.,Ｓcience, 228,
810-815 (1985)〕及びリーら、プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳ
Ａ）、第82巻、第4360〜4364頁、1985年〔Ｌee, et a
l., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci．（ＵＳＡ），82,
4360‐4364(1985)〕におけるヒトＧＭ‐ＣＳＦに属する
残基配列を有したリーダーポリペプチドの後に位置して
〔Ａla¹ 〕ｈｐＧ‐ＣＳＦをコードする、部分的合成部
分的ｃＤＮＡ由来構造体の発現分泌プロセッシングを介
して、ｈｐＧ‐ＣＳＦポリペプチド類縁体を分泌させる
ように考え出された。

【００９４】本発明のポリペプチド産物の予備的発現研
究のために使用される発現ベクターは、ウィルス性プロ
モーター／レギュレーターＤＮＡ配列の制御下で挿入外
来性ＤＮＡを哺乳動物細胞発現すると共に哺乳動物細胞
及び大腸菌の双方において自律複製するように考え出さ
れたｐＢＲ322 及びＳＶ40ＤＮＡの双方を組込んでいる
“シャトル（shuttle)”ベクターであった。大腸菌ＨＢ
101 に担持されたこのベクターｐＳＶＤＭ‐19は1985年
8月23日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン、12301 パークローン・ドライブ、ロックビル、メ
リーランドにブタペスト条約に基づいて寄託され、受託
番号ＡＴＣＣ第53241 号が付された。

【００９５】発現ベクター組立てに必要な具体的操作は
下記のとおりであった。リーダーコードＤＮＡ配列を下
記表XXに示したように合成した。

【００９６】

【表２８】 表XXに示されているように、配列は、ＨinｄIII 及びＡ
paＩ付着端、及びヒトＧＭ‐ＣＳＦの“リーダー”に属
する17個のアミノ酸残基のコドンを有している。アラニ
ン残基、プロリン残基及びロイシン残基を特定するコド
ンが続いている。プロリン及びロイシン残基はｈｐＧ‐
ＣＳＦの+2及び+3位に存在するアミノ酸の複製で、一方
アラニン残基はｈｐＧ‐ＣＳＦ以外のＧＭ‐ＣＳＦの開
始アミノ末端（+1）残基の複製である。スレオニンのア
ラニンによる置換は、ＧＭ‐ＣＳＦ分泌プロセッシング
に通常伴う細胞メカニズムによるＧＭ‐ＣＳＦリーダー
の適切な宿主細胞“プロセッシング・オフ（processing
off）”を促進させるために考え出された。

【００９７】プラスミドｐＳＶＤＭ‐19をＫpnＩで切断
し、その部位をクレノウ酵素でブラント末端化した。次
いでＤＮＡをＨinｄIII で切断した。得られる大断片を
表VII に示されるＨinｄIII ／ＰvuII断片（ＨinｄIII
断片及びＰvuIIでの部分的切断から得る２番目に大きな
断片としてプラスミドＰpo２から単離された）と混合し
て結合し、プラスミドｐＳＶ‐Ｐpo１を形成した。表XX
の人工ＧＭ‐ＣＳＦリーダー配列断片を次いで（Ｈinｄ
III 及びＡpaＩで切断後の）ｐＳＶ‐Ｐpo１に結合し、
プラスミドｐＳＶＧＭ‐Ｐpo１を得た。

【００９８】プラスミドｐＳＶＧＭ‐Ｐpo１ＤＮＡのリ
ン酸カルシウム沈降物（ 1〜5 μｇ）を、ウィグラー
ら、セル、第14巻、第 725〜731 頁、1978年〔Ｗigler,
et al.,Ｃell, 14, 725-731 (1978)〕に実質的に記載
されているようなＣＯＳ‐１細胞の２個の60mmプレート
に組込んだ。コントロールとして、プラスミドｐＳＶＤ
Ｍ‐19もＣＯＳ‐１細胞に組込んだ。組織培養上澄を形
質転換後５日目に回収し、ｈｐＧ‐ＣＳＦ活性について
試験した。培養上澄からの〔Ａla¹ 〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ収
量は、１〜2.5 μｇ／mlであった。

【００９９】ＣＯＳ‐１細胞における〔Ａla¹ 〕ｈｐＧ
‐ＣＳＦ産物コードプラスミドｐＳＶＧＭ‐Ｐpo１の上
首尾な発現の後、ヒトＧＭ‐ＣＳＦリーダー配列を含む
一方で、スレオニン残基（ｈｐＧ‐ＣＳＦの１位に元来
存在する）のコドンをその位置のアラニンのコドンに代
わって有する他のベクターを組立てた。簡単に言えば、
オリゴヌクレオチドが特定部位の突然変異誘発（ＳＤ
Ｍ）用に合成された（５′ＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡ
ＣＣＴＣＴＧＧＧ）。ｐＳＶＧＭ‐Ｐpo１におけるＨin
ｄIII ‐ＢamＨＩ ｈｐＧ‐ＣＳＦ断片をＳＤＭ用にＭ
13mp10と結合した。１位にＴhrコドンを有する新規合成
ｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子をＨinｄIII 及びＥcoＲＩで切断
して単離した。断片を次いで、同一の２つの制限エンド
ヌクレアーゼによる切断から得られたｐＳＶＤＭ‐19に
組込んで複製した。得られるベクターｐＳＶＧＭ‐Ｐpo
（Ｔhr）をＣＯＳ細胞に組込んで形質転換したが、培養
上澄中で測定されるｈｐＧ‐ＣＳＦの収量は 1〜5 μｇ
／mlの範囲であった。

【０１００】最後に、単離法が例５に記載されているゲ
ノム配列を用いて、ｈｐＧ‐ＣＳＦの哺乳動物細胞発現
用の発現ベクターを形成した。更に詳しくは、ｐＳＶＤ
Ｍ‐19をＫpnＩ及びＨinｄIII で切断し、大断片を表XX
I に示されるＨinｃIII 及びＮcoＩ粘着端含有合成リン
カーとの四者結合に使用した。エキソン 1含有ＮcoＩ‐
ＢamＨＩ断片はｐＢＲ322(8500ｈｐＧ‐ＣＳＦゲノムサ
ブクローン）から単離し、エキソン 2〜5 含有ＢamＨＩ
‐ＫpnＩ断片はプラスミドｐＢＲ322(8500ｈｐＧ‐ＣＳ
Ｆゲノムサブクローン）から単離した。得られる哺乳動
物発現ベクターｐＳＶ／ｇｈＧ‐ＣＳＦは形質転換ＣＯ
Ｓ細胞から 1〜2.5 μｇ／mlのｈｐＧ‐ＣＳＦを産生し
た。

【０１０１】

【表２９】 例 １０ この例は、本発明の組換えポリペプチド産物の物理的及
び生物学的性質に関する。

【０１０２】１．分子量 例７における大腸菌発現の組換えｈｐＧ‐ＣＳＦ産物は
（表VII の演繹的アミノ酸分析から予測されるように）
還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで測定した場合の見掛分子量が1
8.8キロダルトンであったが、一方例１で記載したよう
にして精製された天然単離体は見掛の分子量が19.6キロ
ダルトンであった。天然単離体と会合したＮ‐グリカン
類の存在は、表VII のｈｐＧ‐ＣＳＦ一次配列中にアス
パラギン残基が欠損していることから、実際上無視する
ことができ、したがって、操作はＯ‐グリカン類が天然
単離体及び非グリコシド組換え産物間の分子量差の原因
であるか否かを調べられるように工夫した。天然単離物
質約 5μｇをノイラミニダーゼ〔カルビオケム（Ｃalbi
ochem ）、ラホラ、カリフォルニア〕で処理し、試料0.
5 μｇを取出し、残留物質をＯ‐グリカナーゼ〔エンド
‐ｘ‐ｎ‐アセチルガラクトースアミニダーゼ、ジェン
ザイム（Ｇenzyme）、ボストン、マサチューセッツ〕4m
U と37℃でインキュベートした。一部をインキュベート
の 0.5，２及び４時間後に取出した。これら試料を大腸
菌由来組換え物質と並べてＳＤＳ‐ＰＡＧＥに付した。
ノイラミニダーゼ処理後、単離体の見掛分子量は19.6キ
ロダルトンから19.2キロダルトンに変わったが、このこ
とはシアル酸残基の離脱を示唆する。Ｏ‐グリカナーゼ
処理の２時間後、分子量は18.8キロダルトンに変わった
が、これは大腸菌由来物質の見掛分子量と一致する。ノ
イラミニダーゼ及びＯ‐グリカナーゼに対する炭水化物
構造体の感受性から判断すると炭水化物成分として下記
構造体が示唆される：Ｎ‐アセチルノイラミン酸‐α(2
-6) ガラクトースβ(1-3) Ｎ‐アセチルガラクトサミン
‐Ｒ（Ｒはセリン又はスレオニンである）。

【０１０３】２． ³Ｈ‐チミジン取込み ヒト骨髄細胞の増殖誘導を ³Ｈ‐チミジンの取込み増加
に基づき分析した。健康ドナー者のヒト骨髄をフィコー
ル‐ハイパック（Ｆicoll ‐Ｈypaque）(1.077ｇ／ml、
ファルマシア）による密度分離に付し、低密度細胞を10
％牛胎児血清及びグルタミンペニシリン・ストレプトマ
イシン含有のイスコブ培地〔Ｇibco（ギブコ）〕に懸濁
した。次いで、ヒト骨髄細胞 2×10⁴ 個を96個の平底ウ
ェルプレート中コントロール培地又は例７の組換え大腸
菌物質と一緒に37℃空気中 5％ＣＯ₂ で２日間インキュ
ベートした。試料を重複して分析したが、濃度は10,000
倍以上異なっていた。培養物に次いで ³Ｈ‐チミジン
〔ニュー・イングランド・ヌクレア（Ｎew Ｅngland
Ｎuclear）、ボスマン、マサチューセッツ〕 0.5μＣi
／ウェルを加えた。 ³Ｈ‐チミジン取込み量をベンチュ
アら、ブラッド、第61巻、第 781頁、1983年〔Ｖentua,
et al., Ｂlood, 61, 781 (1983)〕に記載されている
ように測定した。この分析において、ヒトｈｐＧ‐ＣＳ
Ｆ単離体は、コントロール上澄よりも約 4〜10倍高いレ
ベルで、ヒト骨髄細胞中に ³Ｈ‐チミジンを取込ませる
ことができる。例７の大腸菌由来のｈｐＧ‐ＣＳＦ物質
も同様の性質を有していた。

【０１０４】２回目のヒト骨髄細胞増殖研究は、例９で
製造された形質転換ＣＯＳ‐１細胞の培養培地を用いて
実施され、同様の結果を与えたが、このことはコードさ
れたポリペプチド産物が活性物質として培地中に実際に
分泌されることを意味する。 ３．ＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ⁺ 分化誘導 マウス骨髄単球性白血病細胞ＷＥＨＩ‐３ＢＤ⁺ の分化
を誘導する組換え大腸菌由来物質の能力を、メトカー
フ、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサ
ー、第25巻、第 225巻、1980年〔Ｍetcalf, Ｉnt. Ｊ．
Ｃancer, 25，225 (1980)〕に記載されているように、
半固体寒天培地中で分析した。組換えｈｐＧ‐ＣＳＦ産
物及び培地コントロールを30℃空気中 5％ＣＯ₂ で７日
間60個以下のＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ⁺ 細胞／ウェルと一緒
にインキュベートした。試料を24個の平底ウェルプレー
ト中でインキュベートしたが、濃度は2000倍以上異なっ
ていた。コロニーを未分化、部分的分化又は全部分化の
コロニーに分類し、コロニー数を顕微鏡で計測した。大
腸菌組換え物質は分化を誘導することが判明した。

【０１０５】４．ＣＦＵ‐ＧＭ，ＢＦＵ‐Ｅ及びＣＦＵ
‐ＧＥＭＭ分析 多分化能性ヒトＧ‐ＣＳＦ（ｈｐＧ‐ＣＳＦ）の天然単
離体及び組換え多分化能性ヒトＧ‐ＣＳＦ（ｈｐＧ‐Ｃ
ＳＦ）は、ヒト骨髄細胞を増殖かつ分化させることが判
明した。これらの活性は、ＣＦＵ‐ＧＭ〔ブロックスマ
イヤーら、エクスペリメンタル・ヘマトロジー、第 5
巻、第87頁、1971年（Ｂroxmeyer, et al., Ｅxp. Ｈem
atol., 5, 87 (1971））〕、ＢＦＵ‐Ｅ及びＣＦＵ‐Ｇ
ＥＭＭ試験法〔ルーら、ブラッド、第61巻、第250 頁、
1983年（Ｌu, et al., Ｂlood, 61, 250 (1983)）〕に
より、健康ヒトボランティアの低密度非付着性骨髄細胞
を用いて測定した。各々500 単位のｈｐＧ‐ＣＳＦ又は
ｒｈｐＧ‐ＣＳＦを用いたＣＦＵ‐ＧＭ，ＢＦＵ‐Ｅ及
びＣＦＵ‐ＧＥＭＭ生物学的活性の比較は、下記表XXII
に示されている。

【０１０６】すべてのコロニー分析は、低密度非付着性
骨髄細胞を用いて実施した。ヒト骨髄細胞をフィコール
ハイパック（密度 1.077ｇ／cm³ 、ファルマシア）によ
る密度分離に付した。低密度細胞を次いで牛胎児血清含
有のイスコブ修正ダルベッコ（Ｄulbecco)培地に再懸濁
し、ファルコン組織培養皿〔No.3003 、ベクトン・ディ
ケンソン（Ｂecton Ｄikenson)コッキーズビル、メリー
ランド〕上に付着させるために37℃で 1.5時間入れてお
いた。

【０１０７】

【表３０】 培地コントロールは、10％ＦＣＳ、 0.2mMヘミン及び組
換えエリスロポエチン1単位含有イスコブ修正ダルベッ
コ培地であった。

【０１０８】ＣＦＵ‐ＧＭ分析の場合では、標的細胞
は、補充マッコイ（ＭｃＣoy） 5Ａ培地及び10％熱不活
化牛胎児血清を含有する 0.3％寒天培地 1ml中 1×10⁵
個で培養した。培養７日目、培養物のコロニー（凝集物
当たり細胞数40以上）について計数し、形態を観察し
た。コロニー数は、４個の同一プレートから測定される
平均±ＳＥＭとして示されている。

【０１０９】ＢＦＵ‐Ｅ及びＣＦＵ‐ＧＥＭＭ分析の場
合では、細胞(1×10⁵ ）をイスコブ修正ダルベッコ培地
〔ギブコ（Ｇibco）〕、 0.8％メチルセルロース、30％
牛胎児血清、0.05nM２‐メルカプトエタノール、 0.2mM
ヘミン及び組換えエリスロポエチン 1単位の混合物 1ml
に加えた。皿を 5％ＣＯ₂ 及び 5％Ｏ₂ 湿気雰囲気中で
インキュベートした。レミング・バイオインスツルメン
ツ（Ｒeming Ｂioinstruments)〔シラキュース（Ｓyrac
cuse）、ニューヨーク〕の酸素減少器により低酸素圧に
した。コロニーをインキュベート14日後に計測した。コ
ロニー数は、２個の同一プレートから測定される平均±
ＳＥＭとして示されている。

【０１１０】ＣＦＵ‐ＧＭ分析で形成されたコロニー
は、すべて、クロロアセテートエステラーゼ陽性でかつ
非特異的エステラーゼ（α‐ナフチルアセテートエステ
ラーゼ）陰性であることが判明し、顆粒球型のコロニー
と一致した。天然ｈｐＧ‐ＣＳＦ及びｒｈｐＧ‐ＣＳＦ
は双方とも、ＣＦＵ‐ＧＭ分析における連続希釈により
分析した場合、約１×10⁸ Ｕ／mg純粋タンパク質の特異
的活性を有することが判明した。表XXIIのＢＦＵ‐Ｅ及
びＣＦＵ‐ＧＥＭＭデータは、３つの別個の実験を表示
しており、天然ｈｐＧ‐ＣＳＦに関し過去に報告された
データと類似する。ｒｈｐＧ‐ＣＳＦが大腸菌中で産生
されていることから、極めて純粋でありかつ他の潜在的
哺乳動物成長因子を含有しないことに注目することは重
要である。このように、ｒｈｐＧ‐ＣＳＦは、組換えエ
リスロポエチンの存在下で加えられた場合に、混合コロ
ニー形成（ＣＦＵ‐ＧＥＭＭ）及びＢＦＵ‐Ｅを補助す
ることができる。

【０１１１】５．細胞結合試験 ＷＥＨＩ‐３Ｂ（Ｄ⁺ ）細胞及び新たに診断された白血
病患者のヒト白血球は¹²⁵Ｉ‐標識マウスＧ‐ＣＳＦに
結合するが、この結合は未標識Ｇ‐ＣＳＦ又はヒトＣＳ
Ｆ‐βの添加により競合させることができる、と過去に
報告された。ヒト及びマウスの白血球に対して ¹²⁵Ｉ‐
ｈｐＧ‐ＣＳＦの結合に競合する天然ｈｐＧ‐ＣＳＦ及
びｒｈｐＧ‐ＣＳＦの能力に関し試験した。高度に精製
された天然ｈｐＧ‐ＣＳＦ（純度95％以上、１μｇ）が
ヨウ素化〔デジェドーら、アナリティカル・バイオケミ
ストリー、第 127巻、第 143頁、1982年（Ｔejedor, et
al., Ａnal. Ｂiochem., 127, 143 (1982))〕され、
ゲル濾過及びイオン交換クロマトグラフィーにより反応
物から分離された。天然 ¹²⁵Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦの比活
性は約 100μＣi ／μｇタンパク質であった。マウスＷ
ＥＨＩ‐３Ｂ（Ｄ⁺）及び２種のヒト未梢血骨髄白血病
細胞（ＡＮＬＬ、１つはＭ４、他はＭ５Ｂとして分類さ
れる）を ¹²⁵Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦとの結合能について試
験した。

【０１１２】マウス及び新しく得たヒトの未梢血骨髄白
血病細胞をＰＢＳ／ 1％ＢＳＡで３回洗浄した。ＷＥＨ
Ｉ‐３Ｂ（Ｄ⁺ ）細胞(5×10⁶ 個）又は新鮮白血病細胞
(3×10⁶ 個）を、各種濃度（容量：10μl ）の未標識ｈ
ｐＧ‐ＣＳＦ，ｒｈｐＧ‐ＣＳＦ又はＧＭ‐ＣＳＦの存
在又は非存在下、及び ¹²⁵Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦ（約100,
000cpm又は１ng）の存在下、ＰＢＳ／ 1％ＢＳＡ(100μ
l ）中0 ℃90分間 2連でインキュベートした（総容量：
120 μl ）。細胞を次いで 350μl プラスチック製遠心
管中の氷冷ＦＣＳ 200μl に再懸濁して積層し、遠心分
離（1000×ｇ；１分間）した。ペレットを管端部切断に
より集め、ペレット及び上澄を別々にガンマカウンター
〔パッカード（Ｐackard）〕で計測した。

【０１１３】特異的結合量（cpm)は、競合物の非存在下
における総結合量（２連の平均）‐100 倍過剰の未標識
ｈｐＧ‐ＣＳＦの存在下における結合量（非特異結合
量）（cpm)として計算した。非特異的結合量は、最大
で、ＷＥＨＩ‐３Ｂ（Ｄ⁺ ）細胞の場合が2503cpm ，Ａ
ＮＬＬ（Ｍ４）の細胞の場合が1072cpm ，ＡＮＬＬ（Ｍ
５Ｂ）細胞の場合が1125cpm であった。実験１及び２は
同一の ¹²⁵Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦ調製物を用いて異なる日
に実施したが、ｈｐＧ‐ＣＳＦ2000単位の場合の阻害率
においては内部的一貫性を示す。得られたデータは下記
表XXIII に示されている。

【０１１４】

【表３１】 表XXIII で示されているように、 ¹²⁵Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳ
ＦはＷＥＨＩ‐３Ｂ（Ｄ⁺ ）白血病細胞との結合性を示
した。結合は、ＧＭ‐ＣＳＦではなく未標識天然ｈｐＧ
‐ＣＳＦ又はｒｈｐＧ‐ＣＳＦにより用量依存的に阻害
された。しかも、ヒト骨髄単球性白血病細胞（ＡＮＬ
Ｌ，Ｍ４）に対する天然ｈｐＧ‐ＣＳＦの結合も観察さ
れた。これら細胞への結合性は、液体培養物中の天然ｈ
ｐＧ‐ＣＳＦに応じて、形態学的に判断されるマクロフ
ァージへの分化と比較される。別の患者の単球性白血病
細胞（ＡＮＬＬ，Ｍ５Ｂ）との天然 ¹²⁵Ｉ‐ｈｐＧ‐Ｃ
ＳＦの結合性の欠如は、特定の白血病が特異的に発現し
たか、又はｈｐＧ‐ＣＳＦに対するレセプターを欠くこ
とを示唆する。天然ｈｐＧ‐ＣＳＦと同様に天然 ¹²⁵Ｉ
‐標識‐ｈｐＧ‐ＣＳＦの結合に対して競合するｒｈｐ
Ｇ‐ＣＳＦの能力は、レセプターが十分等しく両型を認
識することを示唆する。

【０１１５】白血病細胞との天然 ¹²⁵Ｉ‐標識ｈｐＧ‐
ＣＳＦの結合性を証明するこれらの研究は、培養物中で
急性前骨髄性白血病（Ｍ３）の第１患者及び急性骨髄芽
球性白血病（Ｍ２）の第２患者から得た低密度骨髄球の
顆粒球及び単球への分化を誘導する天然ｈｐＧ‐ＣＳＦ
の能力と対比される。各患者からの細胞を、培地単独で
又はｒｈｐＧ‐ＣＳＦ 1×10⁵ 単位存在下で、４日間培
養した。培地単独でインキュベートされたＭ３コントロ
ール培養物からの細胞は前骨髄球のままであったが、一
方ｒｈｐＧ‐ＣＳＦの存在下で培養された細胞は、後骨
髄球、巨大杆状核型‐分葉核型好中球及び単球からなる
骨髄型成熟細胞を示した。この患者での現実の分化は、
100個の細胞について、コントロールの場合が 100％前
骨髄球であり、ｒｈｐＧ‐ＣＳＦ処理細胞の場合が22％
芽球＋前骨髄球、 7％骨髄球、35％後骨髄球、20％杆状
核型＋分葉核型好中球、14％単球及び 2％マクロファー
ジであった。注目されるのは、多形核顆粒球の１つが顕
著なアウエル小体をまだ有していたという事実である
が、このことは少なくともこの細胞が白血病系のクロー
ンに属する分化細胞であることを示唆する。骨髄芽球性
白血病（Ｍ２）の第２患者からの細胞もｒｈｐＧ‐ＣＳ
Ｆの存在又は非存在下で４日間培養した。培地単独で培
養されたＭ２細胞の視覚分析では、大きな“芽球様”細
胞を示したが、そのうちのいくつかは核小体を有してい
た。Ｍ２細胞のいくつかは、ｒｈｐＧ‐ＣＳＦで処理し
た場合に、好中球の中心にアウエル小体が残った成熟分
葉核型好中球に分化したが、このことは白血病系のクロ
ーンに属する細胞で生じる分化を示唆した。形態学的に
評価された細胞100 個の実際の分化では、コントロール
細胞は 100％芽球からなることが示された。ｒｈｐＧ‐
ＣＳＦ処理細胞は、43％芽球、 1％骨髄球、15％後骨髄
球、28％杆状核型＋分葉核型好中球、 2％前単球及び11
％単球からなっていた。白血病細胞が、また 4つの異な
る濃度(5×10³ ， 1×10⁴ 、 2.5×10⁴ 及び 5×10⁴ Ｕ
／ml、データ示さず）のｒｈｐＧ‐ＣＳＦ存在下で分化
に関して試験された。試験されたｒｈｐＧ‐ＣＳＦの最
低濃度(5×10³ Ｕ／ml）の場合であっても、Ｍ３（50
％）及びＭ２（37％）白血病細胞の著しい分化が生じた
（細胞は骨髄球以上に分化した）。

【０１１６】６．免疫試験 免疫試験用のポリクローナル抗体を産生するために使用
された抗原は、例１(B) で調製されたようにしてヒト膀
胱癌細胞系5637（ＩＡ6)から精製された多分化能性Ｇ‐
ＣＳＦであった。この物質は、ポリアクリルアミドゲル
の硝酸銀染色に基づき、純度85％と判定された。 6週令
Ｂalb ／Ｃマウスを抗原の多部位注射により免疫した。
抗原をＰＢＳに再懸濁し、等量のフロイント（Ｆreund)
完全アジュバントで乳化させた。投与量は抗原 5〜7 μ
ｇ／マウス／注射であった。追加免疫注射は、等量のフ
ロイント不完全アジュバントで乳化された同量の抗原で
18日後に投与した。 4日後、マウス血清を採取し、ヒト
多分化能性Ｇ‐ＣＳＦに特異的な抗体について試験し
た。

【０１１７】ホルダー中のダイナテック・イムロンII・
リムーバウェル（Ｄynatech ＩmmulonII Removawell）
ストリップ〔ダイナテック・ラボラトリー社（Ｄynatec
k Ｌab., Ｉnc.)、アレクサンドリア、バージニア〕を
pH9.2 の50mM炭酸‐重炭酸緩衝液中のｈｐＧ‐ＣＳＦ 5
μｇ／mlで被覆した。ウェルを容量50μl 中の0.25μｇ
で被覆した。抗原被覆プレートを室温で２時間及び 4℃
で一夜インキュベートした。溶液を捨て、プレートを 5
％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で30分間インキュベートして、反
応表面を保護した。この溶液を捨て、希釈された免疫前
血清又は試験血清をウェルに加え、室温で２時間インキ
ュベートした。血清は 1％ＢＳＡ含有のpH7.0 のＰＢＳ
で希釈した。血清溶液を捨て、プレートをワッシュ・ソ
ルーション（Ｗash Solution）（ＫＰＬ、ゲイザースブ
ルグ、メリーランド）で３回洗浄した。pH7.0 の 1％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳ50μl 中の放射性ヨウ素化ウサギ抗マウ
スＩｇＧ（ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ）約20
0,000 cpm を各々のウェルに加えた。室温で 1.5時間イ
ンキュベートした後、溶液を捨て、プレートをワッシュ
・ソルーションで５回洗浄した。ウェルをホルダーから
取外し、ベックマン5500ガンマカウンターで計測した。
高力価マウス血清は、 1：100 希釈時において、相当す
る免疫前血清よりも12倍以上高い反応性を示した。

【０１１８】大腸菌由来ｈｐＧ‐ＣＳＦの免疫学的性質
は、哺乳動物細胞由来ｈｐＧ‐ＣＳＦに特異的な高力価
マウス血清に対する反応性により測定した。純度90％の
大腸菌由来タンパク質0.25μｇを容量50μl のイムロン
IIリムーバウェルに被覆し、マウス血清を上記のように
分析した。

【０１１９】高力価マウス血清は、 1：100 希釈時にお
いて、相当する免疫前血清よりも24倍高い反応性を大腸
菌由来物質に対して示した。

【０１２０】７．セリン類縁体生物学的試験 例８で製造された〔Ｓer¹⁷〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ，〔Ｓe
r³⁶〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ，〔Ｓer⁴²〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ，
〔Ｓer⁶⁴〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ及び〔Ｓer⁷⁴〕ｈｐＧ‐ＣＳ
Ｆ産物を、 ³Ｈ‐チミジン取込み、ＣＦＵ‐ＧＭ及びＷ
ＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ⁺ 分析によりｈｐＧ‐ＣＳＦ活性に関
し分析した。各分析において、〔Ｓer¹⁷〕類縁体は天然
構造組換え分子の活性に匹敵する活性を有していた。他
の類縁体は、 ³Ｈ‐チミジン取込み分析では 1／100 の
活性、ＣＦＵ‐ＧＭ分析では 1／250 の活性、及びＷＥ
ＨＩ‐３Ｂ Ｄ⁺ 分析では 1／500 の活性を有してい
た。このデータは、36，42，64及び74位のシステインが
十分な生物学的活性のために必要であるという考え方を
支持する。

【０１２１】８．イン・ビボ生物学的試験 アルゼット（Ａlzet^R ）浸透圧ポンプ〔アルゼット社
（Ａlzet Ｃorp.) パロ・アルト（Ｐalo Ａlto)、カリ
フォルニア；モデル2001〕を内在型右頚静脈血管カテー
テルに連結し、７匹の雄性シリアンゴールデンハムスタ
ーの皮下に植込んだ。４つのポンプは緩衝液〔20mM酢酸
ナトリウム（pH5.4 ）及び37mM塩化ナトリウム〕及び大
腸菌由来ｈｐＧ‐ＣＳＦ 1.5mg／mlを含有し、３つは緩
衝液のみを含有していた。浸透圧ポンプに必要な排出速
度は、７日目まで 1μl ／hrであった。ポンプ植込み後
３日目において、４匹の処理ハムスターの平均顆粒球数
は３匹の（緩衝液）コントロールの場合より６倍高く、
顆粒球数増加は総白血球が４倍増加したことに反映され
ていた。赤血球数は処理により変化しなかった。これら
の結果は、組換え物質が哺乳動物において顆粒球の産生
及び／又は放出を特異的に高めることを示している。

【０１２２】ｈｐＧ‐ＣＳＦの天然対立型に加え、本発
明ではｈｐＧ‐ＣＳＦのポリペプチド類縁体及びｈｐＧ
‐ＣＳＦ断片のような他のｈｐＧ‐ＣＳＦ産物も包含す
る。上記アルトンらの出願公開（ＷＯ／83／04053)の操
作に従い、１以上の残基の同一性又は位置に関し本明細
書で記載されたものとは異なる（例えば、置換、端部及
び中間部付加、並びに削除）一次構造をもつポリペプチ
ドの微生物での発現をコードする遺伝子を容易に考えか
つ製造することができる。一方、ｃＤＮＡ及びゲノム遺
伝子の修正は、周知の特定部位突然変異誘発法によって
容易に実施することができ、しかもそれらの類縁体及び
誘導体を産生するために利用することができる。このよ
うな産物はｈｐＧ‐ＣＳＦの生物学的性質のうち少なく
とも１つを有するが、他の点では異なる可能性がある。
例えば、考えられる本発明の産物としては、例えば削除
により短縮された産物、加水分解に対しより安定な産物
（したがって、天然体よりも顕著な又は持続性の効果を
有する可能性がある）、１以上の潜在的Ｏ‐グリコシル
化部位を削除して修正された産物（酵母菌産生産物に関
しより高い活性を有するようになる）、１以上のシステ
イン残基が削除され又はアラニンもしくはセリン残基等
で置換され、しかも微生物系から活性型でより容易に単
離され得る産物、又は、１以上のチロシン残基がフェニ
ルアラニンで置換され、しかも標的細胞上のｈｐＧ‐Ｃ
ＳＦレセプターにいくぶん容易に結合し得る産物があ
る。更には、ｈｐＧ‐ＣＳＦの連続アミノ酸配列又は二
次構造の一部のみを複製したポリペプチド断片も包含さ
れるが、この断片は１つの活性（例えば、レセプター結
合性）を有するが、他の活性（例えば、コロニー増殖刺
激活性）を有しない可能性がある。本発明のいずれの１
以上の産物が、治療的効用〔ウァイラントら、ブルー
ト、第44巻、第 173〜175 頁、1982年（Ｗeiland, eta
l., Ｂlut, 44, 173-175 (1982)）参照〕又はｈｐＧ‐
ＣＳＦ拮抗作用分析のような他の関連における効用をも
つために、活性が必ずしも必要とされないことは注目に
値する。競合的拮抗剤は、例えばｈｐＧ‐ＣＳＦの過剰
産生時に非常に有用である可能性がある。

【０１２３】本発明の他の側面によれば、ｈｐＧ‐ＣＳ
Ｆポリペプチドをコードする本明細書に記載されたＤＮ
Ａ配列は、天然産物単離体の分析的プロセッシングにも
かかわらず今まで得られていなかったこの哺乳動物タン
パク質のアミノ酸配列に関して、それが情報を提供する
ことから、価値がある。ＤＮＡ配列は、様々な組換え技
術によるｈｐＧ‐ＣＳＦの大規模な微生物での合成を実
施するために使用される産物としても著しい価値があ
る。その他に、本発明により提供されるＤＮＡ配列は、
新規かつ有用なウイルス性または環状プラスミドＤＮＡ
ベクター、新規かつ有用な形質転換及び感染転換された
(transfected) 微生物原核及び真核及び真核宿主細胞
（細菌、酵母菌細胞及び哺乳動物の培養細胞を含む）、
ｈｐＧ‐ＣＳＦ及びその関連産物の発現が可能なかかる
微生物宿主細胞の新規かつ有用な培養増殖方法を開発す
るために使用される。本発明のＤＮＡ配列は、ｈｐＧ‐
ＣＳＦ及び関連タンパク質をコードするヒトゲノムＤＮ
Ａ並びに他の哺乳動物種のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配
列を単離するための標識プローブとして使用される、極
めて適切な物質でもある。ＤＮＡ配列は、（例えば、昆
虫細胞中での）タンパク質合成の様々な代替的方法又は
ヒト及び他の哺乳動物における遺伝子療法にも使用する
ことができる。本発明のＤＮＡ配列は、ｈｐＧ‐ＣＳＦ
及びｈｐＧ‐ＣＳＦ産物の大規模産生用の真核細胞“宿
主”として機能し得る遺伝子転換哺乳動物種を開発する
ためにも使用し得る、と期待されている。一般的には、
パルミターら、サイエンス、第 222巻、第4625号、第 8
09〜814 頁、1983年〔Ｐalmiter,et al., Ｓcience, 2
22(4625), 809-814 (1983)〕参照。

【０１２４】本発明のｈｐＧ‐ＣＳＦ断片及びポリペプ
チド類縁体の応用例の中には、天然タンパク質、糖タン
パク質及び核タンパク質中に存在するアミノ酸配列を実
質的に複製した合成ペプチドの免疫学的活性に関する報
告がある。更に詳しくは、比較的低分子量のポリペプチ
ドは、ウィルス抗原、ポリペプチドホルモンその他のよ
うな生理学的に重要なタンパク質の免疫反応と時間及び
程度が類似した免疫反応に関係することが示された。こ
のようなポリペプチドの免疫反応の中には、免疫学的に
活性な動物における特異的抗体産生の賦活化が含まれ
る。例えば、レーナーら、セル、第23巻、第 309〜310
頁、1981年〔Ｌerner, et al., Ｃell,23, 309-310
（1981）〕、ロスら、ネーチャー、第 294巻、第 654〜
656 頁、1981年〔Ｒoss, et al., Ｎature, 294, 654
‐656 （1981）〕、ワルターら、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｕ
ＳＡ）、第77巻、第5197〜5200頁、1980年〔Ｗalter, e
t al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ),
77 , 5197-5200 (1980) 〕、ラーナーら、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（ＵＳＡ）、第78巻、第3403〜3407頁、1981年、ワ
ルターら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第78巻、第48
82〜4886頁、1981年；ウォン（Ｗong)ら、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（ＵＳＡ）、第78巻、第7412〜7416頁、1981年；グ
リーン（Ｇreen）ら、セル、第28巻、第 477〜487 頁、
1982年；ニッグ（Ｎigg)ら、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳ
Ａ）、第79巻、第5322〜5326頁、1982年；バロン（Ｂar
on) ら、セル、第28巻、第 395〜404 頁、1982年；ドリ
ーズマン（Ｄreesman)ら、ネーチャー、第 295巻、第18
5〜160 頁、1982年；及びラーナー、サイエンティフィ
ック・アメリカン、第248 巻、第 2号、第66〜74頁、19
83年〔Ｌerner, Ｓcintific Ａmerican, 248, No.2,
66-74(1983) 〕参照。更に、ペプチドホルモンの二次構
造をほぼ有するもののそれらの一次構造配列を有してい
ない合成ペプチドの生物学的及び免疫学的活性に関す
る、カイザーら、サイエンス、第 223巻、第 249〜255
頁、1984年〔Ｋaiser, et al., Ｓcience, 223, 249
-255 (1984）〕参照。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子の部分的な制限エンド
ヌクレアーゼ地図である。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年７月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】 形質転換された大腸菌

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正内容】

【表１】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００１】背景技術 本発明は、一般に、造血促進因子及びかかる因子をコー
ドするポリヌクレオチド並びにかかるポリヌクレオチド
で形質転換された細胞に関する。本発明は、詳しくは、
哺乳動物の多分化能性コロニー刺激因子、とくにヒト多
分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｐＧ−ＣＳＦ）、
その断片及びポリペプチド（タンパク質）類縁体、並び
にそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。造血
促進因子とは、血液細胞前駆体の分化・増殖を促進する
活性を有するものである。該活性は、一般には、骨髄細
胞を標的とした半固型培地を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏの
アッセイにおいて、血液細胞のコロニー形成を促進する
活性として示されるものであるが、本明細書中にも示さ
れているように、^３Ｈ−チミジン取込み分析における骨
髄細胞増殖活性、あるいは、白血病細胞等の分化誘導活
性としても捉えられ得るものである。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００９】発明の要旨 本発明によれば、実質的に表１に示されたアミノ酸配列
を有し、血液細胞前駆体の分化・増殖を促進する活性を
有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡで
形質転換された大腸菌が提供される。ここで、“実質的
に表１に示されたアミノ酸配列を有し”とは、該タンパ
ク質が、１以上のアミノ酸残基の同一性又は位置に関し
て天然型ｈｐＧ−ＣＳＦと異なり、しかも血液細胞前駆
体の分化・増殖を促進する活性を保有している、ｈｐＧ
−ＣＳＦのポリペプチド類縁体又は誘導体（即ち、ｈｐ
Ｇ−ＣＳＦに特異的な残基のすべてまでは含有していな
い削除類縁体、１以上の特異的残基が他の残基で置換さ
れている置換類縁体、及び、１以上のアミノ酸残基がポ
リペプチドの末端又は中間部分に付加している付加類縁
体）も包含することを示すものである。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５４】

【表８】

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８１】大腸菌発現用に使用される発現ベクター
は、１９８５年４月１０日に公開されたモリス（Ｍｏｒ
ｒｉｓ）の欧州特許出願第１３６，４９０号明細書にお
いてｐＣＦＭ５３６として記載されたベクターである
（更に、ｐＣＦＭ５３６含有の大腸菌ＪＭ１０３，ブタ
ペスト条約に基づく寄託における受託番号、ＡＴＣＣ３
９９３４参照）。簡単にいえば、まずプラスミドｐＣＦ
Ｍ５３６をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断した。上記ｈ
ｐＧ−ＣＳＦ断片（ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ）及びリンカ
ー（ＸｂａＩ／ＡｐａＩ）を次いでそれに結合し、プラ
スミドｐ５３６Ｐｐｏ２を形成した。プラスミドｐ５３
６Ｐｐｏ２を、Ｃ１８５７遺伝子含有プラスミドｐＭＷ
１（ｐＭＷ１含有の大腸菌ＪＭ１０３、ブタペスト条約
に基づく寄託における受託番号、ＡＴＣＣ Ｎｏ，３９
９３３）で予め形質転換された大腸菌ＡＭ７株のファー
ジ耐性変異体に組込んだ。形質転換は、ｐＣＦＭ５３６
前駆体プラスミドに担持された抗生物質（ａｍｐ）耐性
マーカー遺伝子に基づき確認した。ＬＢプロス（アンピ
シリン５０μｇ／ｍｌ）中での細胞培養物を２８℃に維
持し、Ａ_６００＝０．５の培養細胞増殖時において培養
物を温度４２℃に３時間上げて、ｈｐＧ−ＣＳＦ発現を
誘導した。培養物の最終ＯＤはＡ_６００＝１．２であっ
た。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９７】プラスミドｐＳＶＤＭ−１９をＫｐｎＩで
切断し、その部位をクレノウ酵素でブラント末端化し
た。次いでＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断した。得られ
る大断片を表ＶＩＩに示されるＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｖｕ
ＩＩ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ断片及びＰｖｕＩＩでの部分
的切断から得るｈｐＧ−ＣＳＦコード領域を完全に含む
２番目に大きな断片としてプラスミドＰｐｏ２から単離
された）と混合して結合し、プラスミドｐＳＶ−Ｐｐｏ
１を形成した。表ＸＸの人工ＧＭ−ＣＳＦリーダー配列
断片を次いで（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断後
の）ｐＳＶ−Ｐｐｏ１に結合し、プラスミドｐＳＶＧＭ
−Ｐｐｏ１を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のアミノ酸配列から成る蛋白質の製
   造方法であって、該アミノ酸配列をコードする塩基配列
   を含むＤＮＡを含有するベクターによって哺乳動物細胞
   を形質転換し、該形質転換哺乳動物細胞を培養し、該形
   質転換哺乳動物細胞が産生する蛋白質を分離精製するこ
   とを特徴とする、前記製造方法。 【表１】