JPH0331437B2 - - Google Patents

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請求の範囲 １ 下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（ただし、染色体由来でかつイントロンを含む塩
基配列を除く）を含むDNA。 【表】 背景技術 本発明は、一般に、造血促進因子及びかかる因
子をコードするポリヌクレオチドに関する。本出
願は、詳しくは、哺乳動物の多分化能性コロニー
刺激因子、特にヒト多分化能性顆粒球コロニー刺
激因子（hpG−CSF）、その断片及びポリペプチ
ド類縁体、並びにそれらをコードするポリヌクレ
オチドに関する。 ヒト血液生成（造血）系は、様々な白血球（好
中球、マクロフアージ及び好塩基球／肥満細胞を
含む）、赤血球（エリスロサイト）及び凝血形成
細胞（巨核球／血小板）を補充する。平均的ヒト
男性の造血系は毎年4.5×10¹¹のオーダーの顆粒
球及び赤血球を産生すると推測されていたが、こ
れは１年間で全体重に相当する。デキスターら、
バイオエツセイズ、第２巻、第154〜158頁、1985
年〔Dexter et al.、BioEssays、２、154−158
（1985）〕。 少量の特定の造血促進因子は、少数の前駆体
“幹細胞”の各種血液細胞系への分化、これらの
系の著しい増殖及びこれらの系からの成熟血液細
胞の最終的分化の原因をなすと考えられている。
造血促進因子は極端に少量で存在しているため、
これら因子の検出及び同定は分析の仕方にかかつ
ていたが、今までは人為的条件下での培養細胞に
対する刺激効果に基づき様々な因子の中から区別
できるにすぎなかつた。その結果、多数の名称が
極めて少数の因子を表示するために考え出されて
きた。かかる混同が生じた例として、IL−３、
BPA、マルチ−CSR、HCGF、MCGF及びPSF
という語は、すべて現在では同一のマウス造血促
進因子に該当すると考えられている頭字語であ
る。メトカーフ、サイエンス、第229巻、第16〜
22頁、1985年〔Metcalf、Science、229、16−22
（1985）〕。更に、各種マウスの成長調節糖タンパ
ク質に関する、バージエスら、ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、第252巻、
第1988頁、1977年〔Burgess、et al.、J.Biol.
Chem.、252、1988（1977）〕、ダスら、ブラツド、
第58巻、第600頁；1980年（Das、et al.、
Blood、58、600（1980）〕；イーレら、ジヤーナ
ル・オブ・イムノロジー、第129巻、第2431頁、
1982年〔Ihle、et al.、J.Immunol.、129、2431
（1982）〕、ニコラら、ジヤーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー、第258巻、第9017頁、
1983年〔Nicolaet al.、J.Biol.Chem.、258、
9017（1983）〕、メトカーフら、インターナシヨナ
ル・ジヤーナル・オブ・キヤンサー、第30巻、第
773頁、1982年〔Metcalf、et al.、Int.J.Cancer、
30、773（1982）〕；及び、バージエスら、インター
ナシヨナル・ジヤーナル・オブ・キヤンサー、第
26巻、第647頁、1980年〔Burgess、et al.、Int.
J.Cancer、26、647（1980）〕参照。 組換え遺伝子技術の利用はこの混乱の中から一
定の秩序をもたらした。例えば、赤血球産生を促
進するヒトエリスロポエチンのアミノ酸及び
DNA配列が得られた〔1985年６月20日に公開さ
れたリン（Lin）のPCT出願公開第85／02610号
明細書参照。〕。組換え方法は、ヒト顆粒球−マク
ロフアージコロニー刺激因子のcDNAの単離に関
しても利用された。リーら、プロシーデイング
ス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（USA）第82巻、第4360〜4364頁、1985
年〔Lee et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）、
82、4360−4364（1985）〕及びウオンら、サイエン
ス、第228巻、第810〜814頁、1985年〔Wong et
al.、Science、228、810−814（1985）〕。更に、マ
ウス遺伝子のクローニングに関する、ヨコタら、
プロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（USA）、第81巻、第
1070頁、1984年〔Yokota、et al.、Proc.Natl.
Acad.Sci.（USA）、81、1070（1984）〕、フアング
ら、ネーチヤー、第307巻、第233頁、1984年
〔Fung、et al.、307、233（1984）〕及び、ゴーフ
ら、ネーチヤー、第309巻、第763頁、1984年
〔Gough、et al.、Nature、309、763（1984）〕、並
びにヒトＭ−CSFに関するカワサキら、サイエン
ス、第230巻、第291頁、1985年〔Kawasaki et
al.、Science、230、291（1985）〕参照。 ヒト多分化能性コロニー刺激因子（hpCSF）
又はプリルポエチンと称されるヒト造血促進因子
は、ヒト膀胱癌細胞系の培養液中に存在している
ことが示された。この細胞系は5637と呼ばれて、
米国菌寄託機関（American Type Culture
Collection）、ロツクビル、メリーランドにおい
て制限条件付でATCC寄託番号第HTB−９号と
して寄託されている。この細胞系から精製された
hpCSFは、ヒト骨髄前駆体細胞を用いた分析に
おいて、すべての主な血液細胞系の産生につなが
なるような多分化能性前駆細胞の増殖及び分化を
促進することが報告された。ウエルトら、プロシ
ーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（USA）、第82巻、第1526〜
1530頁、1985年〔Welte et al.、 Proc.Natl.
Acad.Sci.（USA）、82、1526−1530（1985）〕。
hpCSFの精製には、（NH₄）₂SO₄沈降、陰イオン
交換クロマトグラフイー（DEAEセルロース、
DE52）、ゲル濾過（AcA54カラム）、及びC18逆
相高性能液体クロマトグラフイーを利用してい
た。C18逆相HPLC画分において２つの活性ピー
クの２番目に溶出するhpCSFとして確認された
タンパク質は、銀染色を用いるドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）−ポリアクリルアミド電気泳動
（PAGE）での測定によれば、分子量（MW）
18000を有すると報告された。hpCSFは、等電点
5.5を有し〔ウエルトら、ジヤーナル・オブ・セ
ル・バイオケミストリー、増刊第9A号、第116
頁、1985年（Welte、et al.、J.Cell Biochem.、
Supp 9A、116（1985））〕、マウス骨髄単球性白血
病細胞系WEHI−3B D⁺に対して高分化能を有す
る〔ウエルトら、分子及び細胞生物学のUCLA討
論会、ゲールら編集、ニユーシリーズ、第28巻、
1985年〔Welte、et al.、UCLA Symposia on
Molecular and Cellular Biology、Gale、et
al.、eds.、New Series、28（1985））〕ことが早
期に報告された。予備研究では、hpCSFと確認
された因子はヒトCFU−GM分析において最初の
７日間に顕著な顆粒球コロニー刺激活性を有する
ことを示している。 ヒトCSF−βと称されるもう１つの因子も、ヒ
ト膀胱癌細胞系5637から単離されたが、未標識マ
ウスＧ−CSFの場合と同一の用量応答関係におい
てWEHI−3B D⁺細胞との結合性に関しマウス
¹²⁵I−標識顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）
の競合体として記載されていた〔ニコラら、ネー
チヤー、第314巻、第625〜628頁、1985年
（Nicola、et al.、Nature、314、625−628
（1985））〕。この用量応答関係は、以前、未標識マ
ウスＧ−CSFに独特であつて、Ｍ−CSF、GM−
CSF又はマルチ−CSFのような因子には見られな
いと報告されていた〔ニコラら、プロシーデイン
グス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（USA）、第81巻、第3765〜3769頁、
1984年（Nicola、et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）、81、3765−3769（1984））〕。CSF−β及
びＧ−CSFはともに、それらがWEHI−3B D⁺細
胞の文化を誘導する高い能力を有している点にお
いて、CSF類の中では独特である（ニコラら、イ
ムノロジー・トウデー、第５巻、第76〜80頁、
1984年〔Nicola、et al.、Immunology Today、
５、76−80（1984）〕）。高濃度でＧ−CSFは混合顆
粒球／マクロフアージコロニー形成細胞を刺激す
るが（ニコラら、1984年、同上）、このことは、
ヒト骨髄培養物及びhpCSFの14日間のインキユ
ベート後に顆粒球性、単球性、混合顆粒球／単球
性及び好酸球性のコロニー（CFU−GEMM）の
出現を示す予備実験結果と一致する。CSF−βも
マウス骨髄細胞使用分析において好中球性、顆粒
球性のコロニー形成を促進すると記載されていた
が、この性質は因子をＧ−CSFとして同定するた
めの基準とされた。これらの類似性から、ヒト
CSF−βはＧ−CSF（顆粒球コロニー刺激因子）
と同一視された（ニコラら、ネーチヤー、第314
巻、第625〜628頁、1985年〔Nicola、et al.、
Nature、314、625−628（1985）〕）。 これらの共通の性質に基づけば、ニコラら、同
上のヒトCSF−β及びウエルトら、同上の
hpCSFは、適切にはヒト多分化能性顆粒球コロ
ニー刺激因子（hpG−CSF）と称される同一の因
子であると思われる。hpG−CSFの特徴づけ及び
組換え産生は、イン・ビトロWEHI−3B D⁺白血
病細胞数を“全く正常な濃度”で完全に抑制する
マウスＧ−CSFの報告されている能力、並びに、
マウスで確立された移植骨髄白血病を抑制する粗
製マウスＧ−CSF注射製剤の報告されている能力
からみて、特に望ましいであろう。メトカーフ、
サイエンス、第229巻、第16〜22頁、1985年
〔Metcalf、Science、229、16−22（1985）〕参照。
更に、サツクス、サイエンテイフイツク・アメリ
カン、第284巻、第１号、第40〜47頁、1986年
〔Sachs、Scientific American、2848(1)、40−47
（1986）〕参照。 hpG−CSFが治療上重要であるとわかり、した
がつて市販規模量の入手が必要となる限り、細胞
培養物からの単離では、十分な物質源を提供する
ことは困難である。たとえば、ウエルトら（1985
年、同上）により天然hpCSF単離物源として報
告されたヒト膀胱癌細胞系5637（ATCC HTB9）
等のヒト腫瘍バンク細胞の商業的使用に対して制
約が存在していることは、注目される。 発明の要旨 本発明によれば、hpG−CSFの全部又は一部を
コードするDNA配列が提供される。このような
配列は、選択された非哺乳動物宿主による発現に
“好ましい”コドンの組込み、制限エンドヌクレ
アーゼ酵素による切断部位の供与、及び、簡易的
発現ベクターの組立てを容易にする前端、後端又
は中間部へのDNA配列の付加的供与を含むこと
ができる。本発明は更に、１以上のアミノ酸残基
の同一性又は位置に関して天然型と異なり、しか
も天然型の性質の一部又は全部を保有している、
hpG−CSFのポリペプチド類縁体又は誘導体（即
ち、hpG−CSFに特異的な残基のすべてまでは含
有していない削除類縁体、１以上の特異的残基が
他の残基で置換されている〔Ser¹⁷〕hpG−CSF
のような置換類縁体、及び、１以上のアミノ酸残
基がポリペプチドの末端又は中間部分に付加して
いる付加類縁体）の微生物発現をコードする
DNA配列を提供する。 本発明の新規DNA配列は、天然多分化能性顆
粒球コロニー刺激因子における一次構造配列の少
なくとも一部及び生物学的性質の１以上を有する
ポリペプチド産物の原核もしくは真核宿主細胞で
の発現を確実化するために使用される配列を含有
している。本発明のDNA配列は、特に、(a)表
及び表に示されたDNA配列又はそれらの相補
鎖、(b)表のDNA配列又はその断片と（本明細
書記載のようなハイブリツド形成条件下又はより
厳格な条件下で）ハイブリツド形成すDNA配列、
又は(c)遺伝コードの縮重がなければ表のDNA
配列とハイブリツド形成し得るDNA配列をも含
むものである。特に(b)に包含されるものとして
は、hpG−CSFの対立変異型及び／又は他の哺乳
動物種の多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコ
ードするゲノムDNA配列がある。特に(c)に包含
されるものとしては、hpG−CSF、hpG−CSFの
断片及びhpG−CSF類縁体をコードする人工
DNA配列があるが、このDNA配列には微生物宿
主でのメツセンジヤーRNAの翻訳を促進するコ
ドンを組込むことができる。このような人工配列
は、アルトン（Alton）らのPCT出願公開第
W083／04053号の方法により容易に組立てること
ができる。 更に本発明に包含されるものとしては、本明細
書の表又は表の上部鎖ヒトcDNA又はゲノム
DNA配列に相補的なDNAの一部によりコードさ
れたポリペプチド類、即ちトラモンタノら、ヌク
レイツク・アシツズ・リサーチ、第12巻、第5049
〜5059頁、1984年〔Tramontano、et al.、
Nucleic Acids Res.、12、5049−5059（1984）〕
に記載された“相補的転化タンパク質”がある。 本発明は、対立変異体を含む天然hpG−CSFに
おける一次構造配列（即ち、アミノ酸残基の連続
配列）の一部もしくは全部、生物学的性質（例え
ば、免疫学的性質及びイン・ビトロ生物学的活
性）の１以上、及び物性（例えば、分子量）を有
する精製単離ポリペプチド産物を提供する。これ
らのポリペプチドは、化学合成操作又はゲノムも
しくはcDNAのクローニングもしくは遺伝子合成
により得られる外来性DNA配列の原核もしくは
真核宿主発現（例えば、細菌、酵母菌、高等植
物、昆虫及び哺乳動物細胞の培養による）の産物
である、ということによつても特徴づけられる。
典型的な酵母菌〔例えばサツカロマイセス・セレ
ビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）〕又は原
核生物〔例えば、エシエリキア・コリ
（Escherichia coli）〕宿主細胞の産物は、いずれ
の哺乳動物タンパク質とも会合していない。脊椎
動物（例えば、非ヒト哺乳動物及び鳥類）細胞に
おける微生物発現産物は、いずれのヒトタンパク
質とも会合していない。用いられた宿主に応じ
て、本発明のポリペプチドは、哺乳動物その他の
真核生物の炭水化物でグリコシル化していてもよ
いし、非グリコシル化のままでもよい。本発明の
ポリペプチドは、（−１位に）最初のメチオニン
アミノ酸残基を有することもできる。 更に本発明に包含されるものとしては、有効量
の本発明のポリペプチド産物と一緒に適切な希釈
剤、アジユバント及び／又は担体を含有する、
hpG−CSF療法に使用される医薬組成物がある。 本発明のポリペプチド産物は、固体組織及び血
液もしくは尿等の液体試料中におけるヒトhpG−
CSFの検出及び定量に使用される試薬を提供する
ために、検出可能なマーカー物質と結合させるこ
とにより“標識“する（例えば、 ¹²⁵Iで放射線
標識する）ことができる。 本発明のDNA産物は、検出可能なマーカー
（例えば、放射線標識及びビオチンのような非ア
イソトープ標識）で標識することもでき、しかも
染色体地図上のヒトhpG−CSF遺伝子の位置及
び／又はその関連遺伝子群の位置をつきとめるた
めのDNAハイブリツド形成操作に用いることが
できる。それらはDNAレベルでのヒトhpG−
CSF遺伝子の異常を確認するためにも使用され、
隣接遺伝子及びそれらの異常を確認するための遺
伝子マーカーとして使用することもできる。 本発明のポリペプチド産物は、再生不良性貧血
のような造血障害の治療のために、単独で又は他
の造血因子もしくは薬物と一緒に使用される。そ
れらは化学療法又は放射線療法による造血障害の
治療にも使用される。骨髄移植の成功率は、例え
ばphG−CSFの使用により高められるであろう。
創傷治癒熱傷治療及び細菌性炎症治療にもhpG−
CSFが有効である。更に、hpG−CSFは、白血病
細胞を分化させると報告されている能力に基づ
き、白血病の治療にも使用される。ウエルトら、
プロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（USA）、第82巻、第
1526〜1530頁、1985年〔Welte、et al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）、82、1526−1530（1985）〕
及びサツクス（Sachs）、同上参照。 本発明の多数の側面及び長所は、現在の好まし
い態様たる本発明の実例について説明した以下の
詳細な説明を斟酌することにより、当業者であれ
ば明らかになるであろう。 【図面の簡単な説明】 図は、ゲノム配列を得るために利用された配列
決定方法を示す矢印を含む、hpG−CSF遺伝子の
部分的な制限エンドヌクレアーゼ地図である。 詳細な説明 本発明によつて、hpG−CSFのポリペプチド配
列の一部又は全部をコードするDNA配列が単離
されかつ特徴づけられた。 下記の諸例は本発明の説明のために示されたも
のであつて、特に、hpG−CSF cDNA及びゲノ
ムクローンの同定に先立ち行われる操作、かかる
同定方法、並びに、配列決定、cDNA、ゲノム及
び人工遺伝子に基づく発現系の開発、及びかかる
系での発現hpG−CSF及び類縁体産物の同定に関
する。 更に詳しくは、例１はhpG−CSFのアミノ酸配
列決定に関する。例２はコロニーハイブリツド形
成スクリーニング用cDNAライブラリーの製造に
関する。例３はハイブリツド形成プローブの組立
てに関する。例４は、ハイブリツド形成スクリー
ニング、陽性クローンの同定、陽性cDNAクロー
ンのDNA配列決定及びポリペプチド一次構造配
列（アミノ酸配列）情報の作成に関する。例５は
hpG−CSFをコードするゲノムクローンの同定及
び配列決定に関する。例６は、大腸菌優先
（preference）コドンが用いられたhpG−CSFを
コードする人工遺伝子の組立てに関する。 例７は、hpG−CSFをコードするDNAを組込
んだ大腸菌形質転換ベクターの組立て方法、hpG
−CSFの原核生物発現におけるベクターの使用、
及び本発明の組換え産物の特性分析に関する。例
８は、システイン残基がhpG−CSFをコードする
DNAでの変異誘発により別の適切なアミノ酸残
基で置換されたhpG−CSF類縁体の産生方法に関
する。例９は、陽性cDNAクローンから得たhpG
−CSF類縁体をコードするDNAを組込んだベク
ターの組立て方法、COS−１細胞形質転換のた
めのベクターの使用、及び形質転換細胞の培養増
殖に関する。例10は、本発明の組換えポリペプチ
ド産物の物理的及び生物学的性質に関する。 例 １ (A) 文献記載方法により得られた物質の配列決定 hpG−CSF試料（３〜4μｇ、SDS銀染色−
PAGE純度85〜90％）は、ウエルトら、プロシ
ーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（USA）、第82巻、第
1526〜1530頁、1985年〔Welte、et al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）、82、1526−1530
（1985）〕に従い単離精製したものと同様であつ
て、スローン・ケタリング・インステイテユー
ト（Sloan Kettering Institute）、ニユーヨー
ク、ニユーヨーク州から入手した。 このhpG−CSF試料のＮ末端アミノ酸配列
を、AB407A気相分析装置〔アプライド・バイ
オシステムズ（Applied Biosystems）、フオス
ター市、カリフオルニア〕を用いたミクロ配列
分析により１号操作（Run＃１）で決定し、下
記表に掲示された配列情報を得た。表−
では、単一文字コードが用いられており、“Ｘ”
は明確に決定されなかつた残基を示し、括弧内
の残基は単に択一的又は推定的に示されたもの
である。 表 １ Ｋ −Ｐ−Ｌ−Ｇ−５ Ｐ −Ａ−Ｓ−Ｋ−Ｌ−10 Ｋ −Ｑ−（Ｇ，Ｖ，Ｓ）−Ｇ−Ｌ−15 Ｘ −Ｘ−Ｘ 高いバツクグランドが操作サイクル毎に存在し
たが、その結果は表に報告されており、このこ
とは試料がおそらく精製時の化学的残留物たる多
くの汚染成分を有することを示していた。配列を
単に参照用として保存した。 ２号操作（Run＃２）では、第２試料（５〜6μ
ｇ、純度95％以下）は１号操作と同様にスロー
ン・ケタリングから入手し、配列決定操作は１号
操作と同様にして実施した。この試料は、ウエル
トら、プロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（USA）、第82
巻、第1526〜1530頁、1985年の図４を作成するた
めに用いられた物質の同一ロツトから得たもので
ある。結果は、表に示されている。 表 １ Ｔ −Ｐ−Ｌ−Ｇ−５ Ｐ −Ａ−Ｓ−(S)−Ｌ−10 Ｐ −Ｑ− (S) Ｘ−Ｍ− (L) （Ｍ）− 15 Ｘ −Ｋ−(R)−Ｘ−Ｘ−15 (R) −(L)−Ｘ−Ｘ 更に多くの残基が同定されたが、２号操作で
は、適当数のプローブをhpG−CSF DNA調査用
に組立て得るほど十分に長い明確な配列は得られ
なかつた。表の配列に基づきcDNAの単離を行
なうためには、少なくとも1536種類のプローブが
必要であろうと計算された。再度、試料の汚染が
問題視された。 このため、第３試料（３〜5μｇ、純度40％以
下）を上記のようにスローン・ケタリングから入
手した。この調製物は、更に精製するために、
SDS−PAGEによる分離後、電気ブロツト
（electroblot）に付した。この試料の配列分析で
はデータが得られなかつた。 (B) 修正方法により得られた物質の配列決定 十分量の純粋物質を得て適切な最終的アミノ
酸配列分析を実施するため、スローン・ケタリ
ングで産生されるものと同様の膀胱癌細胞系
5637の細胞（サブクローンIA6）をイー・プラ
ツツアー博士（Dr.E.Platzer）から入手した。
細胞を最初にフラスコ中のアイコブ
（Iscove′s）培地〔ギブコ（GIBCO）、グランド
アイランド、ニユーヨーク〕で培養し、集密化
させた。集密化時、培養物をトリプシン処理
し、ローラーボトル中に播種したが（1.5フラ
スコ／ボトル）、各ボトルは５％CO₂下で予め
条件が整えられたアイコブ培地25mlを含有して
いた。細胞を37℃、0.３rpmで一夜増殖させ
た。 サイトデツクス−１（Cytodex−１）ビーズ
〔フアルマシア（Pharmacia）、ウプサラ、ス
ウエーデン〕を洗浄し、下記操作により滅菌し
た。ビーズ８ｇをボトルに加え、PBS400mlを
加えた。ビーズを３時間静かに撹拌して懸濁さ
せた。ビーズを静置させた後、PBSを排出し、
ビーズをPBSで洗浄し、新鮮PBSを加えた。
ビーズを15分間オートクレーブで処理した。使
用前に、ビーズを、新鮮培地＋10％牛胎児血清
（FCS）添加前にアイコブ培地＋10％FCS中で
洗浄し、処理ビーズを得た。 各ローラーボトルから30mlを除くすべての培
地を除去した後、新鮮培地＋10％FCS30ml及び
処理ビーズ40mlをボトルに加えた。ボトルを５
％CO₂処理し、すべての泡を吸引除去した。ボ
トルを、速度0.3rpmに低下させる前、ローラ
ー台に3rpmで0.5時間載置した。３時間後、別
のフラスコ内容物をトリプシン処理し、ビーズ
含有の各ローラーボトルに加えた。 集密度40〜50％の時点でローラーボトル培養
物をPBS50mlで洗浄し、PB除去前10分間回転
させた。細胞を培地Ａ〔0.2％FCS、10^-8Mヒド
ロコルチゾン、2mMグルタミン、100単位／ml
ペニシリン及び100μｇ／mlストレプトマイシ
ン含有アイコブ培地〕中で48時間培養した。次
いで、培養上澄を3000rpmで15分間遠心分離し
て集め、−70℃で貯蔵した。培養物に10％FCS
含有培地Ａを再度加え、48時間培養した。培地
を捨てた後、細胞を上記のようにPBSで洗浄
し、培地Ａ中で48時間培養した。上澄を再度集
め、上記のように処理した。 IA6細胞の培養培地約30リツトルを、
10000M.W.遮断装置をもつ２個のカセツトを
備えたミリポア・ペリコン（Millipore
Pellicon）ユニツトにより、濾過速度約200
ml／min及び保持速度約1000ml／minで約２リ
ツトルまで濃縮した。濃縮物を同一装置及び同
一流速により50ｍＭトリス（PH7.8）約10リツ
トルで透析濾過した。透析濾過濃縮物を50ｍＭ
トリス（PH7.8）で平衡化された１リツトルDE
セルロースカラムに40ml／minで添加した。添
加後、カラムを50ｍＭトリス（PH7.8）１リツ
トル、次いで50ｍＭ NaCl含有50ｍＭトリス
（PH7.8）２リツトルにより同一速度で洗浄し
た。カラムを次いでNaCl濃度が75ｍＭ、100ｍ
Ｍ、125ｍＭ、150ｍＭ、200ｍＭ及び300ｍＭの
６種の50ｍＭトリス（PH7.5）１リツトルで連
続的に溶出させた。画分（50ml）を集め、活性
画分をプールし、YM5膜装備アミコン
（Amicon）限外濾過撹拌セルユニツトで65ml
に濃縮した。この濃縮物をPBSで平衡化され
た２リツトルのAcA54ゲル濾過カラムに添加
した。カラムを80ml／hrで操作し、10ml画分を
集めた。活性画分をプールし、C4高性能液体
クロマトグラフイー（HPLC）カラムに直接添
加した。 容量125〜850mlで、タンパク質１〜８mlを含
有し、その約10％がhpG−CSFである試料を、
流速１〜４ml／minでカラムに添加した。添加
後、流速１ml／minで80％２−プロパノール中
の0.1M酢酸アンモニウム（PH6.0〜7.0）により
洗浄した。１ml画分を集め、タンパク質につい
て220nｍ、260nｍ及び280nｍでモニターした。 精製した結果、hpG−CSF含有画分を他のタ
ンパク質含有画分から（80の画分中72及び73番
目の画分として）明確に分離した。hpG−CSF
は純度約80±５％及び収率約50％で単離された
（150〜300μｇ）。この精製物質9μｇを４号操作
（Run＃４）アミノ酸配列分析に使用し、タン
パク質試料を非ポリブレンTFA活性ガラス繊
維板に付着させた。配列分析は、ヘウイツク
ら、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第256巻、第7990〜7997頁、1981年
〔Hewick、et al.、J.Biol.Chem.、256、7990
−7997（1981）〕及びライ、アナリテイカ・キミ
カ・アクタ、第163巻、第243〜248頁、1984年
〔Lai、Anal.Chim.Acta、163、243−248
（1984）〕の方法に従い、AB470A分析装置で実
施した。４号操作の結果は表に示されてい
る。 表 Thr−Pro−Leu−Gly−５ Pro −Ala−Ser−Ser−Leu−10 Pro −Gln−Ser−Phe−15 Leu −Leu−Lys−（Lys）−Leu−（Glu）−20 Glu −Val−Arg−Lys−Ile−25 （Gln） −Gly−Val−Gly−Ala−30 Ala −Leu−Ｘ−Ｘ− ４号操作では、（表の残基31に相当する）第
31サイクルより先において、更に重要な配列情報
は得られなかつた。長い明確な配列を得るため
に、５号操作（Run＃５）においては、条件調整
培地から精製されたhpG−CSF14μｇを45℃で１
時間β−メルカプトエタノール10mlで還元し、次
いで減圧下で完全に乾燥した。タンパク質残基を
次いで、ポリブレン化ガラス繊維板に付着させる
前に５％ギ酸に再溶解した。配列分析は上記４号
操作と同様にして実施した。５号操作の結果は表
に示されている。 表 Thr−Pro−Leu−Gly−５ Pro 15−Ala−Ser−Ser−Leu−10 Pro 20−Gln−Ser−Phe−Leu−Leu −Lys−Cys−Leu−Glu−Gln−Val−Arg−Lys−Ile
−25 Gln 35−Gly−Asp−Gly−Ala−30 Ala40 −Leu−Gln−Phe−Lys−Leu−Gly−Ala−Thr−Tyr
−Lys−Val−Phe−Ser−Thr −45 （Arg） −（Phe）−（Met）−Ｘ− 表のアミノ酸配列は、下記hpG−CSFcDNA
を得るためのプローブを組立てる上で、十分に長
く（44残基）かつ明確であつた。 例 ２ 目的のcDNA配列を単離するための標準的操作
の中には、標的遺伝子の発現に基づき選択された
ドナー細胞中に豊富に存在するmRNAの逆転写
から得られるプラスミド担持cDNA“ライブラリ
ー”の調製が含まれる。ポリペプチドのアミノ酸
配列の実質的部分が公知である場合には、“標的”
cDNA中での存在が推定される配列を複製した標
識一重鎖DNAプローブ配列が、一重鎖型に変性
されたcDNAのクローンコピーに対して実施され
るDNA／DNAハイブリツド形成操作において使
用され得る。ワイスマン（Weissman）ら、米国
特許第4394443号明細書、ウオレスら、ヌクレイ
ツク・アシツズ・リサーチ、第６巻、第3543〜
3557頁、1979年〔Wallace、et al.、Nucleic
Acids Res.、６、 3543−3557（1979）〕、レイス
ら、プロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（USA）、第79巻、
第3270〜3274頁、1982年〔Reyes、et al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）、79、3270−3274
（1982）〕、及びジエイ（Jaye）ら、ヌクレイツ
ク・アシツズ・リサーサ、第11巻、第2325〜
2335、1983年参照。更に、診断実施時における
DNA／DNAハイブリツド形成操作に関するフア
ルコー（Falkow）らの米国特許第4358535号明
細書、及びコロニー及びプラークハイブリツド形
成技術に関するデービスや、“遺伝子工学、高等
細菌遺伝学のマニユアル”、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー〔Davis、et al.、
“Ａ Manual for Genetic Engineering、
Advanced Bacterial Genetics”、Cold Spring
Harbor Laboratory〕・コールド・スプリング・
ハーバー、ニユーヨーク、1980年、第55〜58頁及
び第174〜176頁参照。 完全RNAの定量的単離のためのグアニジウム
チオシアネート操作〔チヤーグウインら、バイオ
ケミストリー、第18巻、第5294〜5299頁、1979年
（Chirgwin、et al.、Biochemistry、18、5294−
5299（1979））〕により、全RNAを膀胱癌細胞系
5637（IA6）細胞約１ｇから抽出した。 無菌RNA水溶液はIA6細胞由来の全RNAを含
有していた。全RNA溶液からメツセンジヤー
RNAのみを得るため、溶液をオリゴデオキシチ
ミジレート〔オリゴ（dT）〕〔コラボレーテイ
ブ・リサーチ社（Collaborative Research、
Inc.）、ウオルサム、マサチユーセツツ〕含有カ
ラムに通した。メツセンジヤーRNAに特有のポ
リアデニル化（ポリA⁺）尾部はカラムに付着す
るが、リボソームRNAは溶出する。かかる操作
の結果、ポリアデニル化メツセンジヤーRNA（ポ
リA⁺mRNA）約90μｇを単離した。単離された
ポリA⁺メツセンジヤーRNAを、cDNA反応で使
用する前に、最終濃度４ｍＭで５分間室温で水酸
化メチル水銀（アルフア・ベントロン（Alpha
Ventron）、デンバーズ、マサチユーセツツ〕に
より前処理した。水酸化メチル水銀処理は、翻訳
を阻害するメツセンジヤーRNA自体の相互反応
及びそれと汚染分子との相互反応を抑制させた。
ペイバーら、ジヤーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、第258巻、第7636〜7642頁、
1979年〔Payvar、et al.、J.Biol.Chem.、258、
7636−7642（1979）〕参照。 オカヤマ操作法〔オカヤマら、モレキユラー・
アンド・セルラー・バイオロジー、第２巻、第
161〜170頁、1982年（Okayama、et al.、
Molcular＆Cellular Biology、２、161−170
（1982））〕に従い、cDNAバンクをIA6細胞から
得たmRNAにより調製した。cDNAを次いでイ
ンキユベートして増幅用宿主微生物大腸菌Ｋ−12
株HB101に組込んだ。 例 ３ 表のhpG−CSFアミノ末端配列に基づき考え
出されたハイブリツド形成プローブは、各々が長
さ23塩基で３個のイノシン残基を有する24組のオ
リゴヌクレオチドから構成されていた。プローブ
オリゴヌクレオチドをカルザースら、ジエネテイ
ツク・エンジニアリング、第４巻、第１〜18頁、
1982年〔（Caruthers、et al.、Genetic
Engineering、４、１−18（1982）〕の操作に従い
製造し、ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
（Kinasing）することによりｒ− ³²P ATPで標
識した。表の配列中残基23〜30のメツセンジヤ
ーRNAに対応するプローブオリゴヌクレオチド
は、表に示されている。 表 hpG−CSFプローブ ⁵′GC IGC ICC Ａ ＧTC ICC Ｔ ＣTG Ｇ Ａ ＴAT Ｔ ＣTT³′ 中立性をに付与したのは、タカハシら、プロ
シーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（USA）、第82巻、第1931
〜1935頁、1985年〔Takahashi、et al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）、82、1931−1935（1985）〕
及びオーツカら、ジヤーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、第260巻、第2605〜2608頁、
1985年〔Ohtsuka、et al.、J.Biol.Chem.、260、
2605−2608（1985）〕の研究公表に基づいていた。
しかしながら、イノシンはＧ又はＴと塩基対形成
した場合には脱安定化効果を有する。タカハシら
の場合では、イノシンは、それらが一群として平
均化してほぼ中立化するに到ることから、中立効
果を有するようである（例えば、３個はＣと好ま
しく対形成したが、２個はＴと対形成し好ましく
なかつた）。 ＧとのＩ塩基対形成効果を試験するため、コン
トロール実験をＮ−myc遺伝子配列及びクローン
を用いて計画した。Ｎ−myc遺伝子から得た配列
は、hpG−CSFプローブで規定されたものと同一
の全体的Ｇ及びＣ含有率を、各コドンの最初の２
つの位置で有していた。したがつて、Ｎ−myc試
験プローブは、hpG−CSFプローブと比較し、同
一の長さであり、同一の相対的位置にを含有
し、しかも潜在的に同一の平均Tm（62〜66℃、
３又は４個のイノシン残基を含有しているためで
はない）を有していた。 ２組のＮ−myc試験プローブを前記カルザース
らの操作に従い組立てた。表に示された第１組
は、以下のものを含んでいた；1.完全対合体の23
量体；2.3個の３位Ｃが、を加えた場合に最悪
のケースを生じるようにで置換されている；
3.4個の３位がで置換されている。第２組の試
験プローブは、全体的な中立的塩基対形成効果を
与え得るイノシン塩基対のよりランダムな配置を
表わすために考え出された。表に示された第２
組は以下のものを含んでいた；4.Cと塩基対形成
する２個のＩ及びＧ塩基対形成する１個のを有
する；5.I：Ｇ塩基対たるもう１個のを有する
４と同一である。 【表】 Ｎ−mycDNA配列及びニワトリ成長ホルモン
DNA配列（陰性コントロール）を含有する５個
のレプリカフイルターを、ハイブリツド形成前
に、減圧オーブン中80℃で２時間焼いた。すべて
のフイルターは、ハイブリツド形成時間が６時間
のみであること以外、hpG−CSFプローブに関し
て例４で記載されたように、ハイブリツド形成し
た。フイルターを室温で３回しかる後45℃で１回
各々10分間洗浄した。フイルターをガイガーカウ
ンターでモニターした。 Ｎ−mycプローブ３のフイルターは他の４個の
プローブフイルターと比較して非常に弱いシグナ
ルを発したため、それ以上洗浄しなかつた。50℃
で10分間洗浄後、ガイガーカウンターは、プロー
ブ１を100％標準として、下記％シグナルを表示
した：プローブ２、20％；プローブ３（45℃）、２
％；プローブ４、92％；及びプローブ５、75％。
55℃での洗浄後は、％が：プローブ２、16％；プ
ローブ４、100％；及びプローブ５、80％であつ
た。60℃での最終洗浄では下記％を表示した：プ
ローブ２、1.6％；プローブ４、90％；及びプロ
ーブ５、70％。 このように、プローブ２及び４のように３個の
が存在する場合では、シグナルにおいて60倍ま
での差違が、理論的Tm（は計算に含まれてい
ない）は〔最悪の塩基対形成例（プローブ２）
及び比較的中立な塩基対形成例（プローブ４）
に関して）近いにもかかわらず観察される。 Ｎ−myc試験ハイブリツド形成により得られた
標準化情報は、より厳格でない洗浄による結果が
許容され得る信頼度を測定するために、下記のよ
うに洗浄及びhpG−CSFハイブリツド形成のモニ
ターに際して利用された。 例 ４ ハナハンら、ジヤーナル・オブ・モレキユラ
ー・バイオロジー、第166巻、第557〜580頁、
1983年〔Hanahan、et al.、J.Mol.Biol.、166、
557−580（1983）〕の操作に従い、例２で産生され
たcDNAインサート（insert）との組換え体を含
む細菌を、寒天プレート上に載置された24個のニ
トロセルロースフイルター〔ミリポア
（Millipore）、ベツドフオード、マサチユーセツ
ツ〕に拡散した。プレートを次いでインキユベー
トして約150000個のコロニーを得たが、これを24
個の他のニトロセルロースフイルターに移してレ
プリカ培養した。レプリカを明瞭なコロニーが出
現するまでインキユベートした。フイルター上の
細菌を、10分間水酸化ナトリウム（0.5M）でわ
ずかに飽和され、しかる後２分間トリス（1M）
でブロツトされ、次いで10分間NaCl（1.5M）含
有トリス（0.5M）でブロツトされたワツトマン
3MM紙上で溶菌させた。フイルターがほぼ乾燥
した後、それらを核酸ハイブリツド形成前に減圧
オーブン中80℃で２時間焼いた。ウアールら、プ
ロシーデイングス・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（USA）、第76巻、第3683〜3687
頁、1979年〔Wahl、et al.、Proc.Natl.Acad.
Sci.（USA）、76、3683−3687（1979）〕、及びマニ
アテイスら、セル、第81巻、第163〜182頁、1976
年〔Maniatiset al.、Cell、81、163−182
（1976）〕。 フイルターを10Xデンハード（Denhardt）0.2
％SDS及び6XSSC750ml中65℃で２時間、前ハイ
ブリツド形成させた。フイルターを6XSSCで洗
浄し、次いで４つをバツグに入れ、6XSSC及び
10Xデンハード中で14時間ハイブリツド形成させ
た。50×10⁶cpmの ³²P−標識プローブ（オリゴ
ヌクレオチド）を有するバツグ当たり、溶液約15
mlが入つていた。 ハイブリツド形成後、フイルターを6XSSC（１
リツトル／洗浄）中で３回室温で各々10分間洗浄
した。フイルターを次いで6XSSC1リツトルによ
り、45℃15分間で１回洗浄した。フイルターを増
強スクリーン及びコダツクXAR−２フイルムに
より−70℃で２時間オートラジオグラフイーに付
した。このオートラジオグラフでは、５個の非常
に強いシグナルを含む40〜50個の陽性シグナルが
検出された。 最強の５個のシグナル及び別の５個の陽性シグ
ナルを含む領域をマスタープレートからこすり落
とし、同一条件下同一プローブ混合物を用いて二
次スクリーニングに移した。洗浄操作は、高温洗
浄が55℃15分間で各々２回、及びしかる後の60℃
15分間で１回からなる点で異なつていた。例３の
Ｎ−mycプローブ研究に基づき、二次スクリーニ
ングでの最終洗浄温度を上げたが、24個の23量体
に関する凝集融解温度がＮ−mycプローブの温度
に近似した60〜68℃であつたためである。２回目
の55℃での洗浄後、フイルターを湿潤させたまま
にし、オートラジオグラフイーに付した。このオ
ートラジオグラフイーと、60℃での最終洗浄後同
じ時間をかけた２回目のオートラジオグラフイー
との比較では、10個の被試クローンのうち２個だ
けが55℃〜60℃以上に昇温させた場合にシグナル
の実質的損失をうけないことが明らかになつた。
これら２個のクローンは、ほぼ同一の長さ及び制
限エンドヌクレアーゼパターンであることが後に
示された。Ppo2と称されら１個のクローンを配
列決定のため選択した。 上記操作で得られた組換えhpG−CSFcDNAク
ローンのPpo2の配列決定は、サンガーら、プロ
シーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（USA）、第74巻、第5463
〜5467頁、1977年〔Sanger、et al.、Proc.Natl.
Acad.Sci.（USA）、74、5463−5467（1977）〕のジ
デオキシ法により達成された。一重鎖DNAフア
ージＭ−13は、二重鎖cDNAクローンの一重鎖
DNA鋳型を供給するためのクローニングベクタ
ーとして使用した。サンガーらの方法により、表
に示されているようなアミノ酸翻訳を伴う配列
及びポリペプチドコード領域の相補鎖が明らかと
なつた。 【表】 【表】 表の下記特徴は顕著である。配列の5′末端に
は、ポリGcDNAリンカー配列に相当する塩基が
示されている。次いで約５個の塩基（“Ｎ”と表
示されている）が存在するが、その配列は前にあ
る多数のＧのためにサンガーらの方法によつては
容易に明確に決定することができなかつた。その
後の配列は、ポリペプチドのリーダー配列と推定
される部分をコードする12個のコドンを表わす。
例１に記載されたhpG−CSF天然単離物のアミノ
末端配列との対応により、hpG−CSFの推定的
“成熟”型における最初のスレオニン残基は＋１
で示されている。成熟hpG−CSFは、示された如
く174個の残基を有することがその後示された。
“停止”コドン（OPコドン、TGA）の後に、約
856塩基の非翻訳3′配列及びポリＡ“尾部”の多数
のＡが続く。唯一のHgiA及びApa制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位、並びに２つのStu部
位（原核及び真核細胞発現系の組立てに関して以
下で説明されている）も表に示されている。ポ
リペプチド中におけるアスパラギン残基の欠損の
ため、Ｎ−グリコシル化のための明確な部位は存
在しない。3′非翻訳配列末端近くで下線が引かれ
た６個の塩基は、潜在的ポリアデニル化部位を表
わす。 合計450000個のクローンの中から上記ハイブリ
ツド形成操作により同定された２つの他のcDNA
クローンの各々が、転写開始部位以降の全リーダ
ー配列をコードするDNAを含有していなかつた
ことは、注目に値する。なるほど、３つすべての
hpG−CSFクローンは正確に同一部位の5′領域で
集結しており、このことは転写されたmRNAの
二次構造がこの部位より先のcDNA形成を著しく
阻害することを示唆している。実際には、したが
つて、オカヤマら、モレキユラー・アンド・セル
ラー・バイオロジー、第３巻、第280〜289頁、
1983年〔Okayama、et al.、Mol.and Cell.
Biol.、３、280−289（1983）〕に記載され、しか
もウオンら、サイエンス、第228巻、第810〜814
頁、1985年〔Wong、et al.、Science、228、810
−814（1985）〕においてGM−CSFを単離するた
めに現実に利用されたcDNA発現スクリーニング
は、hpG−CSF DNAの単離に簡単に利用するこ
とができなかつたが、その理由は、かかる単離系
が通常被験クローン中における全長のcDNA転写
体の存否に依存しているからである。 上記配列は、微生物宿主におけるhpG−CSFの
直接的発現を確実化するには、困難である。かか
る発現を確実にするためhpG−CSFコード領域に
は開始ATGコドンを加えるべきであり、しかも
その配列は適切なプロモーター／レギユレーター
DNA配列の制御下にある部位で形質転換ベクタ
ー中に挿入されるべきである。 例 ５ この例では、前記例で単離されるようなhpG−
CSFコードcDNAを用いてゲノムクローンをスク
リーニングした。λフアージヒト胎児肝ゲノムエ
ライブラリー〔ローンら、セル、第15巻、第1157
〜1174頁、1978年（Lawn、et al.、Cell、15、
1157−1174（1978））の操作に従い製造され、テイ
ー・マニアテイス（T.Maniatis）から入手した〕
を、HgiAI及びStuIで切断単離された２つのhpG
−CSF cDNA断片（HgiAI〜StuI、649塩基対；
StuI〜StuI、639塩基対）からなるニツク（nick）
翻訳プローブを用いてスクリーニングした。合計
約500000個のフアージを12個のペトリ皿（15cm）
で培養し、プラークを取出し、ベントン／デビソ
ン（Benton／Davison）操作法〔ベントンら、
サイエンス、第196巻、第180頁、1977年
（Benton、et al.、Science、196、130（1977））〕
によりプローブとハイブリツド形成させた。合計
12個の陽性クローンが観察された。二次スクリー
ニングにおけるオートラジオグラフイーで最強シ
グナルを生じた３個のクローン（１〜３）を、１
リツトル培地中で増殖させ、放射線標的24量体オ
リゴヌクレオチド（γ− ³²P ATPでキナーゼ処
理されている）
5′CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3′を用
いて制限酵素切断及びサザーンブロツト法
（Southern blotting）により遺伝子地図を作成し
た。地図作成結果は、単離体１及び３が同一であ
つて、単離体２がhpG−CSF遺伝子の5′に付加し
た2000個の塩基を含有することを示していた。し
たがつて、クローン２を更に特徴づけるために使
用した。クローン２のDNAをEcoRIで切断して
8500塩基対のhpG−CSF含有断片を得、これを次
いでpBR322に組込んでサブクローニングし、更
に制限エンドヌクレアーゼ切断、サザーンブロツ
ト法、M13サブクローニング及び配列決定により
遺伝子地図を作成した。得られた配列はに示さ
れたとおりである。 【表】 【表】 hpG−CSF遺伝子を含有するゲノムDNAの制
限エンドヌクレアーゼ地図（約3.4キロ塩基対）
図１で詳細に記されている。図１で示された制限
エンドヌクレアーゼは、NcoI、Ｎ；PstI、Ｐ；
BamHI、Ｂ；ApaI、Ａ；XhoI、Ｘ；及びKpn、
Ｋである。図の下方の矢印は、ゲノム配列を得る
ために利用される配列決定方法を示す。ボツクス
領域はcDNAクローン中の領域であり、点線の端
部ボツクスはcDNAクローン中に存在しないもの
のmRNAブロツト法により固定された配列を表
わす。エキソン配列たるコード配列の同定をノー
ザン（Northern）ブロツト法により実施した。
エキソン１及び２における推定的スプライス部位
にまたがる24量体オリゴヌクレオチドプローブ、
5′CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3′を、
ノーザンブロツト法でhpG−CSF mRNAとハイ
ブリツド形成させた。得たブリツトは、エキソン
２のオリゴヌクレオチドプローブの場合と同様の
サイズ（1650塩基対以下）のmRNAを示す。こ
のデータは、表で示されるMet開始コドンを用
いたpSVGM−Ppo1ベクター（例９）によるhpG
−CSFの直接的発現能と一緒に考え合わされた場
合に、エキソン１に含有されるコード配列を規定
する。エキソン２〜５は、hpG−CSF遺伝子（表
）のcDNAクローン（Ppo2）において得られ
るコード配列により規定される。 例 ６ この例は、hpG−CSFをコードしかつ大腸菌優
先コドンを含有する人工遺伝子の製造に関する。 簡潔に述べると、用いられたプロトコールは、
全般的に、参考のため本明細書に包含される共有
権者アルトン（Alton）らのPCT公開第WO83／
04053号明細書の開示に示されているとおりであ
つた。遺伝子は、成分オリゴヌクレオチドが多数
の二重鎖にまず集合するように考えられ、二重鎖
は次いで３つの別個のセクシヨンにまとめられ
た。これらセクシヨンは簡易な増幅用として考え
られ、増幅系から除去された後に、適切な発現ベ
クター中に連続的に又は多数の断片結合を介して
まとめることができた。 セクシヨン、及びの構造は表〜に
示されている。表及びに示されたセクシヨン
の構造において、オリゴヌクレオチド１〜14は
７本の二重鎖（１及び８；２及び９；３及び10；
４及び11；５及び12：６及び13；７及び14）にま
とめられた。７本の二重鎖を次いで結合し、表
に示されるセクシヨンを形成した。表におい
て、セクシヨンは増幅・発現ベクターとの結合
及びセクシヨンとの結合のために用いられる上
流Xba付着端及に下流BamHI付着端を含有す
ることにも着目されるであろう。 【表】 【表】 表及びに示されるセクシヨンの構造
において、オリゴヌクレオチド15〜30は８本の二
重鎖（15及び23；16及び24；17及び25；18及び
26；19及び27；20及び28；21及び29；22及び30）
にまとめられた。これら８本の二重鎖を次いで結
合し、表に示されるセクシヨンを形成し
た。表で更に示されるように、セクシヨン
は増幅ベクターとの結合及びセクシヨンとの結
合のために用いられる上流BamHI付着端及び下
流EcoRI付着端を有する。その下流端部近くで
は、セクシヨンは最後の結合セクシヨン及び
に用いられる下流Sst部位も有している。 【表】 【表】 最後に、セクシヨンは表Ｘ及びＸに示さ
れているように組立てられた。この組立てのため
に、オリゴヌクレオチド31〜42は６本の二重鎖
（31及び37；32及び38；33及び39；34及び40；35
及び41；36及び42）にまとめられた。６本の二重
鎖を次いで結合し、表Ｘに示されるセクシヨン
を形成した。表Ｘでも示されているように、
セクシヨンは、増幅ベクター、及び少なくとも
EcoR末端の場合には発現ベクターとの結合の
ために用いられる上流BamH付着端及び下流
EcoR付着端を含有する。しかもセクシヨン
は、セクシヨン及びの最終的結合に用いられ
る上流Sst部位に有している。 【表】 【表】 セクシヨンで形成されたXba〜BamH
断片を、Xba及びBamHで開環された
M13mp11フアージベクターに結合する。ベクタ
ーを次いでBamH及びEcoRで切断すること
により再開環し、次いでセクシヨンで形成され
たBamH〜EcoR断片と結合する。この段階
で、セクシヨン及びは適切な方向で結合され
た。次いで別のM13mp11ベクターをBamH〜
EcoR切断で開環し、しかる後セクシヨンで
形成されたBamH〜EcoR断片と結合した。 セクシヨン及び含有ベクターをXba及び
Sstで切断する。同様に、セクシヨン含有ベ
クターをSst及びEcoRで切断する。各々の切
断で得る２つの断片のうち小断片の両方を、事前
にXba及びEcoRIで開環されたプラスミド
pCFM1156に結合する。この反応の生成物は表
XVに示される連続DNA配列含有の発現プラス
ミドであつて、そのDNA配列は大腸菌翻訳開始
用のアミノ末端メチオニンコドン（ATG）をも
つ完全hpG−CSFポリペプチドをコードしてい
る。 【表】 いずれの適切なベクターもこのDNA発現のた
めに使用することができるが、発現プラスミド
pCFM1156はプラスミドpCFM836から容易に組
立てることができ、その構造は公開欧州特許出願
第136490号明細書に記載されているpCFM836を
まずNdeIで切断し、次いで両方に存在するNdeI
部位が破壊されるようにPolIでブラント末端化す
る。次いで、ベクターをCla及びSacで切断
して、存在するポリリンカーを除去し、しかる後
表に示される代替ポリリンカーに結合する。
この代替ポリリンカーは、前記アルトンらの操作
に従い組立てることができる。なお、プラスミド
pCFM836は、pCFM736（後述）をBamHで切
断し、下記の断片を挿入することによつて得られ
る。 BamHI SstII BamHI 5′−GATCCGCGGATAAATAAGTAAC−3′ 3′−GCGCCTATTTATTCATTGCTAG−5′ 発現pCFM1156プラスミドにおける発現制御は
λP_Lプロモーターによるが、これ自体が（大腸菌
株K12ΔHtrpから得られるような）C_I1857リプレ
ツサー遺伝子の制御下にある。 【表】 例 ７ この例は、〔Met^-1〕hpG−CSFコードDNA配
列によるhpG−CSFポリペプチドの大腸菌発現に
関する。使用された配列は、部分的に合成で、部
分的にcDNA由来であつた。使用された合成配列
は大腸菌優先コドンであつた。 表に示されたhpG−CSF遺伝子含有プラスミ
ドPpo2をHgiA及びStuで切断して、約645塩
基対の断片を得たが、この断片は5′末端の７個の
リーダー配列残基コドン及び3′非コード領域の約
100塩基対をもつ（表に示されるような）成熟
hpG−CSF遺伝子を含有していた。HgiA切断
ではPst切断の場合と同一の5′の４塩基付着端
を残し、Stuではプラント末端を残す。これに
より、Pst及びブラント末端形成制限酵素Hinc
で切断されたM13mp8（Rf）に断片を容易に挿
入することができる。M13中に増幅させた後、
hpG−CSF DNAをApa及びBamHで切断す
ることにより摘出したが、これはそれぞれhpG−
CSFにおける＋３〜＋５残基コドン間にまたがる
Apa部位、及びM13mp8制限ポリリンカーにお
けるHinc部位の“下流”のBamH部位にお
いて切断されたものである。hpG−CSFポリペプ
チドの大腸菌発現を可能にするため、合成断片を
下記表に示されるように製造した。 【表】 表の分析から調べ得るように、リンカー
は、Apa付着端、hpG−CSFアミノ末端の最初
の３個の残基を特定するコドン（上記M13DNA
のApa消化で削除されたThr¹、Pro²、Leu³指
定コドンを回復させ、かつ大腸菌中で優先的に発
現するコドンを採用）、翻訳開始ATG、リボソー
ム結合部位を付与する24塩基対配列、及びXba
付着端を有している。 大腸菌発現用に使用される発現ベクターは、
1985年４月10日に公開されたモリス（Morris）
の欧州特許出願第136490号明細書において
pCFM536として記載されたベクターである（更
に、pCFM536含有の大腸菌JM103、ブタペスト
条約に基づく寄託における受託番号、
ATCC39934参照）。簡単にいえば、まずプラスミ
ドpCFM536をXba及びBamHで切断した。
上記hpG−CSF断片（Apa／BamH）及びリ
ンカー（Xba／Apa）を次いでそれに結合
し、プラスミドp536Ppo2を形成した。 プラスミドp536Ppo2を、C_I857遺伝子含有プラ
スミドpMW1（ブタペスト条約に基づく寄託にお
ける受託番号、ATCC No.39933）で予め形質転
換された大腸菌AM7株のフアージ耐性変異体に
組込んだ。形質転換は、pCFM536前駆体プラス
ミドに担持された抗生物質（amp）耐性マーカー
遺伝子に基づき確認した。LBブロス（アンピシ
リン50μｇ／ml）中での細胞培養物を28℃に維持
し、A₆₀₀＝0.5の培養細胞増殖時において培養物
を温度42℃に３時間上げて、hpG−CSF発現を誘
導した。培養物の最終ODはA₆₀₀＝1.2であつた。 形質転換細胞によるhpG−CSF発現レベルは、
クマシーブルー色素で染色されたSDSポリアクリ
ルアミドゲルにより、総細胞タンパク質３〜５％
と評価された。 細胞をJS−4.2ローター中3500×ｇで10分間遠
心分離して回収した。水中25％（Ｗ／Ｖ）の細胞
をフレンチ・プレツシヤー・セル（French
Pressure Cell）に10000psi（700Kg／cm²）で３回
通して破壊した。破壊細胞懸濁液をJA−20ロー
ター中10000×ｇで15分間遠心分離した。ペレツ
トを水に再懸濁し、PH8.7の１％ラウリン酸50ｍ
Ｍトリス中に総タンパク質濃度約５mg／mlで溶解
させた。溶解ペレツト物質を15000×ｇで10分間
遠心分離し、上澄にCuSO₄を20ｍＭまで加えた。
１時間後、この試料を、例１(B)の操作に従い精製
するため、容量及び濃度を調整して、C4HPLC
カラムに充填した。 非有機物含有緩衝液中で調製された更に多量の
hpG−CSFを得るために第二の精製法が開発され
た。この物質はイン・ビボ研究に適する。細胞ペ
ースト150ｇを１ｍＭ DTT約600mlに再懸濁し、
約7000psi（490Kg／cm²）でマントン・グアリン
（Manton Gualin）ホモジナイザーに４回通し
た。破壊細胞懸濁液を10000×ｇで30分間遠心分
離し、ペレツトを１％デオキシコール酸、５ｍＭ
EDTA、５ｍＭ DTT及び50ｍＭトリスのPH
９の400mlに再懸濁した。この懸濁液を室温で30
分間混合し、10000×ｇで30分間遠心分離した。
ペレツトを水約400mlに再懸濁し、10000×ｇで30
分間遠心分離した。ペレツトを２％ザルコシル及
び50ｍＭトリスPH８の100mlに溶解した。CuSO₄
を20μMまで加え、混合物を室温で16時間撹拌
し、しかる後、20000×ｇで30分間遠心分離した。
上澄にアセトン300mlを加えた。この混合物を氷
上に20分間おき、しかる後5000×ｇで30分間遠心
分離した。ペレツトをPH４の6Mグアニジン及び
40ｍＭ酢酸ナトリウムの250mlに溶解し、平衡化
された1200mlのＧ−25カラムに充填し、PH5.4の
20ｍＭ酢酸ナトリウムで操作した。hpG−CSFピ
ーク（約400ml）をプールし、PH5.4の20ｍＭ酢酸
ナトリウムで平衡化された15mlのCMセルロース
カラムに加えた。充填後、カラムを60mlのPH5.4
の20ｍＭ酢酸ナトリウム及び25ｍＭ塩化ナトリウ
ムで洗浄し、しかる後カラムを200mlのPH5.4の20
ｍＭ酢酸ナトリウム及び37ｍＭ塩化ナトリウムで
溶出させた。この溶出液150mlを10mlに濃縮し、
平衡化された300mlのＧ−75カラムに充填し、PH
5.4の20ｍＭ酢酸ナトリウム及び100ｍＭ塩化ナト
リウムで操作した。ピーク画分35mlをプールし、
フイルター滅菌した。hpG−CSFの最終濃度は、
1.5mg／mlであつたが、ゲル分析で測定した場合
純度95％以上であり、hpG−CSF0.5mgにつき発
熱性物質を0.5ng以下で含有していた。発熱性物
質レベルは、カブトガニ遊走細胞溶離物（LAL）
試験キツト〔エム・エー・バイオプロダクツ
（M.A.Bioproducts）、ウオーカースビル、メリー
ランド〕により測定した。 例 ８ この例は、17、36、42、64及び74位に存在する
システイン残基が各々適切なアミノ酸残基で置換
されたhpG−CSF類縁体を産生する組換え方法の
利用に関する。 1985年２月28日に公開されたスーザ（Souza）
らの公開PCT出願第WO85／00817号明細書の特
定部位突然変異誘発は、下記表に示された大
きさが20〜23塩基の合成オリゴヌクレオチドを用
いて、下記プラスミドp536Ppo2の〔Met^-1〕コ
ードDNA上で行なわれた。オリゴヌクレオチド
１は〔Ser¹⁷〕hpG−CSFコード遺伝子の形成が
可能で、オリゴヌクレオチド２は〔Ser³⁶〕hpG
−CSFの形成が可能であつた。 【表】 CysからSerへの限定的突然変異誘発は、鋳型
としてp536Ppo2から単離されたXba−BamH
hpG−CSF断片含有のM13mp10を用いて実
施した。Cys−Ser置換体含有の各M13mp10由来
のDNAをXba及びBamHで処理した。得た
断片を発現ベクターpCFM746に組込んでクロー
ニングし、発現産物を例７のように単離した。 プラスミドpCFM746は、1985年２月28日に公
開されたモリス（Morris）の公開PCT出願第
WO85／00829号明細書に記載されているように、
Cla及びBamHでプラスミドpCFM736を切
断し、存在するポリリンカーを除去し、下記ポリ
リンカーで置換することにより組立てることがで
きる。 【表】 なお、pCFM736は、pCFM536（ATCC39934）
から、次の手順によりpCFM636を経由し、組立
てることができる。まず、pCFM536をEcoR部
分的切断及びSst切断することにより、アンピ
シリン耐性遺伝子配列及び安定化配列（par）を
欠失させた後、EcoR部位は、リンカーによつ
てAat部位に変換する。一方、プラスミドTn5
（Beck等のGene、19、p327−336（1982）あるい
はAuerswald等のCold Spring Harbor Symp.
Quant.Biol.、45 p107−113（1981）に全塩基配
列が示されている。）から、カナマイシン耐性遺
伝子配列を含むSma／Hind断片領域を、Sst
リンカーをSma粘着末端に、且つNdeリン
カーをHind粘着末端に付加することにより、
Sst／Nde断片として得る。また、pSC101
（受託番号、ATCC37032）から、par遺伝子を含
むHinc／Ava断片領域を、Hinc部位は最
初にSalリンカーで次いでAatリンカーで処
理し、また、Ava部位は最初にBamHリン
カーで次いでNdeリンカーで処理し、Aat／
Nde断片として得る。 pCFM536の大きな断片（Aat／Sst）、カ
ナマイシン耐性遺伝子の断片（Sst／Nde）
およびpar遺伝子断片（Aat／Nde）を混ぜ
合わせて結合し、pCFM636が得られる。 pCFM636をAat及びXbaにより切断後、
下記のAatからXbaまでの断片を挿入し、
pCFM736を得る。 【表】 本発明のCys−Ser（CysからSerへの）類縁体の
精製操作において、細胞ペースト約10〜15ｇを１
ｍＭ DTT40mlに再懸濁し、フレンチ・プレツ
シヤー・セルに10000psi（700Kg／cm²）で３回通し
た。破壊細胞懸濁液を1000×ｇで30分間遠心分離
した。ペレツトをPH９の１％DOC、５ｍＭ
EDTA、５ｍＭ DTT、50ｍＭトリスに再懸濁
し、室温で30分間混合した。混合物を10000×ｇ
で30分間遠心分離し、H₂O40mlに再懸濁し、
10000×ｇで30分間再遠心分離した。ペレツトを
PH８の２％ザルコシル、50ｍＭ DTT、50ｍＭ
トリスの10mlに溶解した。１時間混合後、混合物
を20000×ｇで30分間遠心分離して清澄化し、し
かる後平衡化された300mlのＧ−75カラムに充填
し、PH８の１％ザルコシル、50ｍＭトリスで操作
した。類縁体含有画分をプールし、少なくとも１
日間空気にさらして空気酸化させた。最終濃度は
0.5〜５mg／mlの範囲であつた。 例 ９ この例において、哺乳動物細胞発現系は、hpG
−CSF DNAの活性ポリペプチド産物が哺乳動物
細胞（COS−１、ATCC CRL−1650）中で発現
されかつそこから分泌されるか否かを確認するた
めに、工夫された。この系は、ウオンら、サイエ
ンス、第228巻、第810〜815頁、1985年〔Wong、
et al.、Science、228、810−815（1985）〕及びリ
ーら、プロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（USA）、第82
巻、第4360〜4364頁、1985年〔Lee、et al.、
Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）、82、4360−4364
（1985）〕におけるヒトGM−CSFに属する残基配
列を有したリーダーポリペプチドの後に位置して
〔Ala¹〕hpG−CSFをコードする、部分的合成部
分的cDNA由来構造体の発現分泌プロセツシヨン
グを介して、hpG−CSFポリペプチド類縁体を分
泌させるように考え出された。 本発明のポリペプチド産物の予備的発現研究の
ために使用される発現ベクターは、ウイルス性プ
ロモーター／レギユレーターDNA配列の制御下
で挿入外来性DNAを哺乳動物細胞発現すると共
に哺乳動物細胞及び大腸菌の双方において自律複
製するように考え出されたpBR322及び
SV40DNAの双方を組込んでいる“シヤトル
（shuttle）”ベクターであつた。大腸菌HB101に
担持されたこのベクターpSVDM−19は1985年８
月23日にアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレ
クシヨン、12301パークローン・ドライブ、ロツ
クビル、メリーランドにブタペスト条約に基づい
て寄託され、受託番号ATCC第53241号が付され
た。 発現ベクター組立てに必要な具体的操作は下記
のとおりであつた。リーダーコードDNA配列を
下記表に示したように合成した。 【表】 表に示されているように、配列は、Hind
及びApa付着端、及びヒトGM−CSFの“リ
ーダー”に属する17個のアミノ酸残基のコドンを
有している。アラニン残基、プロリン残基及びロ
イシン残基を特定するコドンが続いている。プロ
リン及びロイシン残基はhpG−CSFの＋２及び＋
３位に存在するアミノ酸の複製で、一方アラニン
残基はhpG−CSF以外のGM−CSFの開始アミノ
末端（＋１）残基の複製である。スレオニンのア
ラニンによる置換は、GM−CSF分泌プロセツシ
ングに通常伴う細胞メカニズムによるGM−CSF
リーダーの適切な宿主細胞“プロセツシング・オ
フ（processing off）”を促進させるために考え
出された。 プラスミドpSVDM−19をKpnで切断し、そ
の部位をクレノウ酵素でブラント末端化した。次
いでDNAをHindで切断した。得られる大断片
を表に示されるHind／Pvu断片（Hind
断片及びPvuでの部分的切断から得る２番目に
大きな断片としてプラスミドPpo2から単離され
た）と混合して結合し、プラスミドpSV−Ppo1
を形成した。表の人工GM−CSFリーダー配
列断片を次いで（Hind及びApaで切断後の）
pSV−Ppo1に結合し、プラスミドpSVGM−
Ppo1を得た。 プラスミドpSVGM−Ppo1DNAのリン酸カル
シウム沈降物（１〜5μｇ）を、ウイグラーら、
セル、第14巻、第725〜731頁、1978年〔Wigler、
et al.、Cell、14、725−731（1978）〕に実質的に
記載されているようなCOS−１細胞の２個の60
mmプレートに組込んだ。コントロールとして、プ
ラスミドpSVDM−19もCOS−１細胞に組込ん
だ。組織培養上澄を形質転換後５日目に回収し、
hpG−CSF活性について試験した。培養上澄から
の〔Ala¹〕hpG−CSF収量は、１〜2.5μｇ／mlで
あつた。 COS−１細胞における〔Ala¹〕hpG−CSF産物
コードプラスミドpSVGM−Ppo1の上首尾な発
現の後、ヒトGM−CSFリーダー配列を含む一方
で、スレオニン残基（hpG−CSFの１位に元来存
在する）のコドンをその位置のアラニンのコドン
に代わつて有する他のベクターを組立てた。簡単
に言えば、オリゴヌクレオチドが特定部位の突然
変異誘発（SDM）用に合成された
（5′CAGCATCTCTACACCTCTGGG）。
pSVGM−Ppo1におけるHind−BamH
hpG−CSF断片をSDM用にM13mp10と結合し
た。１位にThrコドンを有する新規合成hpG−
CSF遺伝子をHind及びEcoRで切断して単離
した。断片を次いで、同一の２つの制限エンドヌ
クレアーゼによる切断から得られたpSVDM−19
に組込んで複製した。得られるベクターpSVGM
−Ppo（Thr）をCOS細胞に組込んで形質転換し
たが、培養上澄中で測定されるhpG−CSFの収量
は１〜5μｇ／mlの範囲であつた。 最後に、単離法が例５に記載されているゲノム
配列を用いて、hpG−CSFの哺乳動物細胞発現用
の発現ベクターを形成した。更に詳しくは、
pSVDM−19をKpn及びHindで切断し、大
断片を表に示されるHinc及びNco粘
着端含有合成リンカーとの四者結合に使用した。
エキソン１含有Nco−BamH断片はpBR322
（8500hpG−CSFゲノムサブクローン）から単離
し、エキソン２〜５含有BamH−Kpn断片
はプラスミドpBR322（8500hpG−CSFゲノムサブ
クローン）から単離した。得られる哺乳動物発現
ベクターpSV／ghG−CSFは形質転換COS細胞か
ら１〜2.5μｇ／mlのhpG−CSFを産生した。 表 HindIII ⁵′AGCTTCCAACAC AGGTTGTGGTAC⁵′ Nco 例 10 この例は、本発明の組換えポリペプチド産物の
物理的及び生物学的性質に関する。 １ 分子量 例７における大腸菌発現の組換えhpG−CSF
産物は（表の演繹的アミノ酸分析から予測さ
れるように）還元SDS−PAGEで測定した場合
の見掛分子量が18.8キロダルトンであつたが、
一方例１で記載したようにして精製された天然
単離体は見掛の分子量が19.6キロダルトンであ
つた。天然単離体と会合したＮ−グリカン類の
存在は、表のhpG−CSF一次配列中にアスパ
ラギン残基が欠損していることから、実際上無
視することができ、したがつて、操作はＯ−グ
リカン類が天然単離体及び非グリコシド組換え
産物間の分子量差の原因であるか否かを調べら
れるように工夫した。天然単離物質約5μｇの
ノイラミニダーゼ〔カルビオケム
（Calbiochem）、ラホラ、カリフオルニア〕で
処理し、試料0.5μｇを取出し、残留物質をＯ−
グリカナーゼ〔エンド−ｘ−ｎ−アセチルガラ
クトースアミニダーゼ、ジエンザイム
（Genzyme）、ボストン、マサチユーセツツ〕
４ｍＵと37℃でインキユベートした。一部をイ
ンキユベートの0.5、２及び４時間後に取出し
た。これら試料を大腸菌由来組換え物質と並べ
てSDS−PAGEに付した。ノイラミニダーゼ処
理後、単離体の見掛分子量は19.6キロダルトン
から19.2キロダルトンに変わつたが、このこと
はシアル酸残基の離脱を示唆する。Ｏ−グリカ
ナーゼ処理の２時間後、分子量は18.8キロダル
トンに変わつたが、これは大腸菌由来物質の見
掛分子量と一致する。ノイラミニダーゼ及びＯ
−グリカナーゼに対する炭水化物構造体の感受
性から判断すると炭水化物成分として下記構造
体が示唆される：Ｎ−アセチルノイラミン酸−
α（２−６）ガラクトースβ（１−３）Ｎ−アセ
チルガラクトサミン−Ｒ（Ｒはセリン又はスレ
オニンである）。 ２ ³H−チミジン取込み ヒト骨髄細胞の増殖誘導を ³H−チミジンの
取込み増加に基づき分析した。健康ドナー者の
ヒト骨髄をフイコール−ハイパツク（Ficoll−
Hypaque）（1.077ｇ／ml、フアルマシア）によ
る密度分離に付し、低密度細胞を10％牛胎児血
清及びグルタミンペニシリン・ストレプトマイ
シン含有のイスコブ培地〔Gibco（ギブコ）〕に
懸濁した。次いで、ヒト骨髄細胞２×10⁴個を
96個の平底ウエルプレート中コントロール培地
又は例７の組換え大腸菌物質と一緒に37℃空気
中５％CO₂で２日間インキユベートした。試料
を重複して分析したが、濃度は10000倍以上異
なつていた。培養物に次いで ³H−チミジン
〔ニユー・イングランド・ヌクレア（New
England Nuclear）、ボスマン、マサチユーセ
ツツ〕0.5μCi／ウエルを加えた。 ³H−チミジ
ン取込み量をベンチユアら、ブラツド、第61
巻、第781頁、1983年〔Ventua、et al.、
Blood、61、781（1983）〕に記載されているよ
うに測定した。この分析において、ヒトhpG−
CSF単離体は、コントロール上澄よりも約４〜
10倍高いレベルで、ヒト骨髄細胞中に ³H−チ
ミジンを取込ませることができる。例７の大腸
菌由来のhpG−CSF物質も同様の性質を有して
いた。 ２回目のヒト骨髄細胞増殖研究は、例９で製
造された形質転換COS−１細胞の培養培地を
用いて実施され、同様の結果を与えたが、この
ことはコードされたポリペプチド産物が活性物
質として培地中に実際に分泌されることを意味
する。 ３ WEHI−3B D⁺分化誘導 マウス骨髄単球性白血病細胞WEHI−3B D⁺
の分化を誘導する組換え大腸菌由来物質の能力
を、メトカーフ、インターナシヨナル・ジヤー
ナル・オブ・キヤンサー、第25巻、第225巻、
1980年〔Metcalf、Int.J.Cancer、25、225
（1980）〕に記載されているように、半固体寒天
培地中で分析した。組換えhpG−CSF産物及び
培地コントロールを30℃空気中５％CO₂で７日
間60個以下のWEHI−3B D⁺細胞／ウエルと一
緒にインキユベートした。試料を24個の平底ウ
エルプレート中でインキユベートしたが、濃度
は2000倍以上異なつていた。コロニーを未分
化、部分的分化又は全部分化のコロニーに分類
し、コロニー数を顕微鏡で計測した。大腸菌組
換え物質は分化を誘導することが判明した。 ４ CFU−GM、BFU−Ｅ及びCFU−GEMM分
析 多分化能性ヒトＧ−CSF（hpG−CSF）の天
然単離体及び組換え多分化能性ヒトＧ−CSF
（hpG−CSF）は、ヒト骨髄細胞を増殖かつ分
化させることが判明した。これらの活性は、
CFU−GM〔ブロツクスマイヤーら、エクスペ
リメンタル・ヘマトロジー、第５巻、第87頁、
1971年（Broxmeyer、et al.、Exp.Hematol.、
５、87（1971））〕、BFU−Ｅ及びCFU−GEMM
試験法〔ルーら、ブラツド、第61巻、第250頁、
1983年（Lu、et al.、Blood、61、250
（1983））〕により、健康ヒトボランテイアの低
密度非付着性骨髄細胞を用いて測定した。各々
500単位のhpG−CSF又はrhpG−CSFを用いた
CFU−GM、BFU−Ｅ及びCFU−GEMM生物
学的活性の比較は、下記表に示されてい
る。 すべてのコロニー分析は、低密度非付着性骨
髄細胞を用いて実施した。ヒト骨髄細胞をフイ
コールハイパツク（密度1.077ｇ／cm³、フアル
マシア）による密度分離に付した。低密度細胞
を次いで牛胎児血清含有のイスコブ修正ダルベ
ツコ（Dulbecco）培地に再懸濁し、フアルコ
ン組織培養皿〔No.3003、ベクトン・デイケンソ
ン（Becton Dikenson）コツキーズビル、メ
リーランド〕上に付着させるために37℃で、
1.5時間入れておいた。 【表】 培地コントロールは、10％FCS、0.2ｍＭヘ
ミン及び組換えエリスロポエチン１単位含有イ
スコブ修正ダルベツコ培地であつた。 CFU−GM分析の場合では、標的細胞は、補
充マツコイ（McCoy）5A培地及び10％熱不活
化牛胎児血清を含有する0.3％寒天培地１ml中
１×10⁵個で培養した。培養７日目、培養物の
コロニー（凝集物当たり細胞数40以上）につい
て計数し、形態を観察した。コロニー数は、４
個の同一プレートから測定される平均±SEM
として示されている。 BFU−Ｅ及びCFU−GEMM分析の場合で
は、細胞（１×10⁵）をイスコブ修正ダルベツ
コ培地〔ギブコ（Gibco）〕、0.8％メチルセルロ
ース、30％牛胎児血清、0.05nM2−メカルプト
エタノール、0.2ｍＭヘミン及び組換えエリス
ロポエチン１単位の混合物１mlに加えた。皿ヲ
５％CO₂及び５％のO₂湿気雰囲気中でインキユ
ベートした。レミング・バイオインスツルメン
ツ（Reming Bioinstruments）〔シラキユース
（Syraccuse）、ニユーヨーク〕の酸素減少器に
より低酸素圧にした。コロニーをインキユベー
ト14日後に計測した。コロニー数は、２個の同
一プレートから測定される平均±SEMとして
示されている。 CFU−GM分析で形成されたコロニーは、す
べて、クロロアセテートエステラーゼ陽性でか
つ非特異的エステラーゼ（α−ナフチルアセテ
ートエステラーゼ）陰性であることが判明し、
顆粒球型のコロニーと一致した。天然hpG−
CSF及びrhPG−CSFは双方とも、CFU−GM
分析における連続希釈により分析した場合、約
１×10⁸U／mg純粋タンパク質の特異的活性を
有することが判明した。表のBFU−Ｅ
及びCFU−GEMMデータは、３つの別個の実
験を表示しており、天然hpG−CSFに関し過去
に報告されたデータと類似する。rhpG−CSF
が大腸菌中で産生されていることから、極めて
純粋でありかつ他の潜在的哺乳動物成長因子を
含有しないことに注目することは重要である。
このように、rhpG−CSFは、組換えエリスロ
ポエチンの存在下で加えられた場合に、混合コ
ロニー形成（CFU−GEMM）及びBFU−Ｅを
補助することができる。 ５ 細胞結合試験 WEHI−3B（D⁺）細胞及び新たに診断された
白血病患者のヒト白血球は ¹²⁵I−標識マウス
Ｇ−CSFに結合するが、この結合な未標識Ｇ−
CSF又はヒトCSF−βの添加により競合させる
ことができる、と過去に報告された。ヒト及び
マウスの白血球に対して ¹²⁵I−hpG−CSFの結
合に競合する天然hpG−CSF及びrhpG−CSF
の能力に関し試験した。高度に精製された天然
hpG−CSF（純度95％以上、1μｇ）がヨウ素化
〔デジエドーら、アナリテイカル・バイオケミ
ストリー、第127巻、第143頁、1982年
（Tejedor、et at.、Anal.Biochem.、127、143
（1982））〕され、ゲル濾過及びイオン交換クロ
マトグラフイーにより反応物から分離された。
天然 ¹²⁵I−hpG−CSFの比活性は約100μCi／μ
ｇタンパク質であつた。マウスWEH−3B
（D⁺）及び２種のヒト末梢血骨髄白血病細胞
（ANLL、１つはM4、他はM5Bとして分類さ
れる）を ¹²⁵I−hpG−CSFとの結合能について
試験した。 マウス及び新しく得たヒトの末梢血骨髄白血
病細胞をPBS／１％BSAで３回洗浄した。
WEH−3B（D⁺）細胞（５×10⁶個）又は新鮮
白血病細胞（３×10⁶個）を、各種濃度（容
量：10μ）の未標識hpG−CSF、rhpG−CSF
又はGM−CSFの存在又は非存在下、及び ¹²⁵I
−hpG−CSF（約100000cpm又は1ng）の存在
下、PBS／１％BSA（100μ）中０℃90分間２
連でインキユベートした（総容量：120μ）。
細胞を次いで350μプラスチツク製遠心管中
の氷冷FCS200μに再懸濁して積層し、遠心
分離（1000×ｇ；１分間）した。ペレツトを管
端部切断により集め、ペレツト及び上澄を別々
にガンマカウンター〔パツカード（Packard）〕
で計測した。 特異的結合量（cpm）は、競合物の非存在下
における総結合量（２連の平均）−100倍過剰の
未標識hpG−CSFの存在下における結合量（非
特異結合量）（cpm）として計算した。非特異
的結合量は、最大で、WEH−3B（D⁺）細胞
の場合が2503cpm、ANLL（M4）の細胞の場合
が1072cpm、ANLL（M5B）細胞の場合が
1125cpmであつた。実験１及び２は同一の ¹²⁵I
−hpG−CSF調製物を用いて異なる日に実施し
たが、hpG−CSF2000単位の場合の阻害率にお
いては内部的一貫性を示す。得られたデータは
下記表に示されている。 【表】 表で示されているように、 ¹²⁵I−hpG
−CSFはWEH−3B（D⁺）白血病細胞との結
合性を示した。結合は、GM−CSFではなく未
標識天然hpG−CSF又はrhpG−CSFにより用
量依存的に阻害された。しかも、ヒト骨髄単球
性白血病細胞（ANLL、M4）に対する天然
hpG−CSFの結合も観察された。これら細胞へ
の結合性は、液体培養物中の天然hpG−CSFに
応じて、形態学的に判断されるマクロフアージ
への分化と比較される。別の患者の単球性白血
病細胞（ANLL、M5B）との天然 ¹²⁵I−hpG
−CSFの結合性の欠如は、特定の白血病が特異
的に発現したか、又はhpG−CSFに対するレセ
プターを欠くことを示唆する。天然hpG−CSF
と同様に天然 ¹²⁵I−標識−hpG−CSFの結合に
対して競合するrhpG−CSFの能力は、レセプ
ターが十分等しく両型を認識することを示唆す
る。 白血病細胞との天然 ¹²⁵I−標識hpG−CSFの
結合性を証明するこれらの研究は、培養物中で
急性前骨髄性白血病（M3）の第１患者及び急
性骨髄芽球性白血病（M2）の第２患者から得
た低密度骨髄球の顆粒球及び単球への分化を誘
導する天然hpG−CSFの能力と対比される。各
患者からの細胞を、培地単独で又はrhpG−
CSF1×15⁵単位存在下で、４日間培養した。培
地単独でインキユベートされたM3コントロー
ル培養物からの細胞は前骨髄球のままであつた
が、一方rhpG−CSFの存在下で培養された細
胞は、後骨髄球、巨大杆状核型−分葉核型好中
球及び単球からなる骨髄型成熟細胞を示した。
この患者での現実の分化は、100個の細胞につ
いて、コントロールの場合が100％前骨髄球で
あり、rhpG−CSF処理細胞の場合が22％芽球
＋前骨髄球、７％骨髄球、35％後骨髄球、20％
杆状核型＋分葉核型好中球、14％単球及び２％
マクロフアージであつた。注目されるのは、多
形核顆粒球の１つが顕著なアウエル小体をまだ
有していたという事実であるが、このことは少
なくともこの細胞が白血病系のクローンに属す
る分化細胞であることを示唆する。骨髄芽球性
白血病（M2）の第２患者からの細胞もrhpG−
CSFの存在又は非存在下で４日間培養した。培
地単独で培養されたM2細胞の視覚分析では、
大きな“芽球様”細胞を示したが、そのうちの
いくつかは核小体を有していた。M2細胞のい
くつかは、rhpG−CSFで処理した場合に、好
中球の中心にアウエル小体が残つた成熟分葉核
型好中球に分化したが、このことは白血病系の
クローンに属する細胞で生じる分化を示唆も
た。形態学的に評価された細胞100個の実際の
分化では、コントロール細胞は100％芽球から
なることが示された。rhpG−CSF処理細胞は、
43％芽球、１％骨髄球、15％後骨髄球、28％杆
状核型＋分葉核型好中球、２％前単球及び11％
単球からなつていた。白血病細胞が、また４つ
の異なる濃度（５×10³、１×10⁴、2.5×10⁴及
び５×10⁴U／ml、データ示さず）のrhpG−
CSF存在下で分化に関して試験された。試験さ
れたrhpG−CSFの最低濃度（５×10³U／ml）
の場合であつても、M3（50％）及びM2（37％）
白血病細胞の著しい分化が生じた（細胞は骨髄
球以上に分化した）。 ６ 免疫試験 免疫試験用のポリクローナル抗体を産生する
ために使用された抗原は、例１(B)で調製された
ようにしてヒト膀胱癌細胞系5637（IA6）から
精製された多分化能性Ｇ−CSFであつた。この
物質は、ポリアクリルアミドゲルの硝酸銀染色
に基づき、純度85％と判定された。６週令
Balb／Ｃマウスを抗原の多部位注射により免
疫した。抗原をPBSに再懸濁し、等量のフロ
イント（Freund）完全アジユバントで乳化さ
せた。投与量は抗原５〜7μｇ／マウス／注射
であつた。追加免疫注射は、等量のフロイント
不完全アジユバントで乳化された同量の抗原で
18日後に投与した。４日後、マウス血清を採取
し、ヒト多分化能性Ｇ−CSFに特異的な抗体に
ついて試験した。 ホルダー中のダイナテツク・イムロン・リ
ム−バウエル（Dynatech Immulon
Removawell）ストリツプ〔ダイナテツク・ラ
ボラトリー社（Dynateck Lad.、Inc.）、アレ
クサンドリア、バージニア〕をPH9.2の50ｍＭ
炭酸−重炭酸緩衝液中のhpG−CSF5μｇ／mlで
被覆した。ウエルを容量50μ中の0.25μｇで被
覆した。抗原被覆プレートを室温で２時間及び
４℃で一夜インキユベートした。溶液を捨て、
プレートを５％BSA含有PBS中で30分間イン
キユベートして、反応表面を保護した。この溶
液を捨て、希釈された免疫前血清又は試験血清
をウエルに加え、室温で２時間インキユベート
した。血清は１％BSA含有のPH7.0のPBSで希
釈した。血清溶液を捨て、プレートをワツシ
ユ・ソルーシヨン（Wash Solution）（KPL、
ゲイザースブルグ、メリーランド）で３回洗浄
した。PH7.0の１％BSA含有PBS50μ中のヨ
ウ素化ウサギ抗マウスIgG（NEN、ボストン、
マサチユーセツツ）約200000cpmを各々のウエ
ルに加えた。室温で1.5時間インキユベートし
た後、溶液を捨て、プレートをワツシユ・ソル
ーシヨンで５回洗浄した。ウエルをホルダーか
ら取外し、ベツクマン5500ガンマカウンターで
計測した。高力価マウス血清は、１：100希釈
時において、相当する免疫前血清よりも12倍以
上高い反応性を示した。 大腸菌由来hpG−CSFの免疫学的性質は、哺
乳動物細胞由来hpG−CSFに特異的に高力価マ
ウス血清に対する反応性により測定した。純度
90％の大腸菌由来タンパク質0.25μｇを容量50μ
のイムロンリム−バウエルに被覆い、マウ
ス血清を上記のように分析した。 高力価マウス血清は、１：100希釈時におい
て、相当する免疫前血清よりも24倍高い反応性
を大腸菌由来物質に対して示した。 ７ セリン類縁体生物学的試験 例８で製造された〔Ser¹⁷〕hpG−CSF、
〔Ser³⁶〕hpG−CSF、〔Ser⁴²〕hpG−CSF、
〔Ser⁶⁴〕hpG−CSF及び〔Ser⁷⁴〕hpG−CSF産
物を、 ³H−チミジン取込み、CFU−GM及び
WEH−3B D⁺分析によりhpG−CSF活性に
関し分析した。各分析において、〔Ser¹⁷〕類縁
体は天然構造組換え分子の活性に匹敵する活性
を有していた。他の類縁体は、 ³H−チミジン
取込み分析では1/100の活性、CFU−GM分析
では1/250と活性、及びWEH−3B D⁺分析
では1/500の活性を有していた。このデータは、
36、42、64及び74位のシステインが十分な生物
学的活性のために必要であるという考え方を支
持する。 ８ イン・ビボ生物学的試験 アルゼツト（Alzet^R）浸透圧ポンプ〔アルゼ
ツト社（Alzet Corp.）パロ・アルト
（PaloAlto）、カリフオルニア；モデル2001〕
を内在型右頚静脈血管カテーテルに連結し、７
匹の雄性シリアンゴールデンハムスターの皮下
に植込んだ。４つのポンプは緩衝液〔20ｍＭ酢
酸ナトリウム（PH5.4）及び37ｍＭ塩化ナトリ
ウム〕及び大腸菌由来hpG−CSF1.5mg／mlを
含有し、３つの緩衝液のみを含有していた。浸
透圧ポンプに必要な排出速度は、７日目まで
1μ／hrであつた。ポンプ植込み後３日目に
おいて、４匹の処理ハムスターの平均顆粒球数
は３匹の（緩衝液）コントロールの場合より６
倍高く、顆粒球数増加は総白血球が４倍増加し
たことに反映されていた。赤血球数は処理によ
り変化しなかつた。これらの結果は、組換え物
質が哺乳動物において顆粒球の産生及び／又は
放出を特異的に高めることを示している。 hpG−CSFの天然対立型に加え、本発明では
hpG−CSFのポリペプチド類縁体及びhpG−CSF
断片のような他のhpG−CSF産物を包含する。上
記アルトンらの出願公開（WO／83／04053）の
操作に従い、１以上の残基の同一性又は位置に関
し本明細書で記載されたものとは異なる（例え
ば、置換、端部及び中間部付加、並びに削除）一
次構造をもつポリペプチドの微生物での発現をコ
ードする遺伝子を容易に考えかつ製造することが
できる。一方、cDNA及びゲノム遺伝子の修正
は、周知の特定部位突然変異誘発法によつて容易
に実施することができ、しかもそれらの類縁体及
び誘導体を産生するために利用することができ
る。このような産物はhpG−CSFの生物学的性質
のうち少なくとも１つの有するが、他の点では異
なる可能性がある。例えば、考えられる本発明の
産物としては、例えば削除により短縮された産
物、加水分解に対しより安定な産物（したがつ
て、天然体よりも顕著な又は持続性の効果を有す
る可能性がある）、１以上の潜在的Ｏ−グリコシ
ル化部位を削除して修正された産物（酵母菌産生
産物に関しより高い活性を有するようになる）、
１以上のシステイン残基が削除され又はアラニン
もしくはセリン残基等で置換され、しかも微生物
系から活性型でより容易に単離され得る産物、又
は、１以上のチロシン残基がフエニルアラニンで
置換され、しかも標的細胞上のhpG−CSFレセプ
ターにいくぶん容易に結合し得る産物がある。更
には、hpG−CSFの連続アミノ酸配列又は二次構
造の一部のみを複製したポリペプチド断片も包含
されるが、この断片は１つの活性（例えば、レセ
プター結合性）を有するが、他の活性（例えば、
コロニー増殖刺激活性）を有しない可能性があ
る。本発明のいずれの１以上の産物が、治療的効
用〔ウアイラントら、ブルート、第44巻、第173
〜175頁、1982年（Weiland、et al.、Blut、44、
173−175（1982））参照〕又はhpG−CSF拮抗作用
分析のような他の関連における効用をもつため
に、活性が必ずしも必要とされないことは注目に
値する。競合的拮抗剤は、例えばhpG−CSFの過
剰産生時に非常に有用である可能性がある。 本発明の他の側面によれば、hpG−CSFポリペ
プチドをコードする本明細書に記載されたDNA
配列は、天然産物単離体の分析的プロセツシング
にもかかわらず今まで得られていなかつたこの哺
乳動物タンパク質のアミノ酸配列に関して、それ
が情報を提供することから、価値がある。DNA
配列は、様々な組換え技術によるhpG−CSFの大
規模な微生物での合成を実施するために使用され
る産物としても著しい価値がある。その他に、本
発明により提供されるDNA配列は、新規かつ有
用なウイルス性または環状プラスミドDNAベク
ター、新規かつ有用た形質転換及び感染転換され
た（transfected）微生物原核及び真核及び真核
宿主細胞（細菌、酵母菌細胞及び哺乳動物の培養
細胞を含む）、hpG−CSF及びその関連産物の発
現が可能なかかる微生物宿主細胞の新規かつ有用
な培養増殖方法を開発するために使用される。本
発明のDNA配列は、hpG−CSF及び関連タンパ
ク質をコードするヒトゲノムDNA並びに他の哺
乳動物種のcDNA及びゲノムDNA配列を単離す
るための標識プローブとして使用される、極めて
適切な物質でもある。DNA配列は、（例えば、昆
虫細胞中での）タンパク質合成の様々な代替的方
法又はヒト及び他の哺乳動物における遺伝子療法
にも使用することができる。本発明のDNA配列
は、hpG−CSF及びhpG−CSF産物の大規模産生
用の真核細胞“宿主”として機能し得る遺伝子転
換哺乳動物種を開発するためにも使用し得る、と
期待されている。一般的には、パルミターら、サ
イエンス、第222巻、第4625号、第809〜814頁、
1983年〔Palmiter、et al.、Science、222
（4625）、809−814（1983）〕参照。 本発明のhpG−CSF断片及びポリペプチド類縁
体の応用例の中には、天然タンパク質、糖タンパ
ク質及び核タンパク質中に存在するアミノ酸配列
を実質的に複製した合成ペプチドの免疫学的活性
に関する報告がある。更に詳しくは、比較的低分
子量のポリペプチドは、ウイルス抗原、ポリペプ
チドホルモンその他のような生理学的に重要なタ
ンパク質の免疫反応と時間及び程度が類似した免
疫反応に関係することが示された。このようなポ
リペプチドの免疫反応の中には、免疫学的に活性
な動物における特異的抗体産生の賦活化が含まれ
る。例えば、レーナーら、セル、第23巻、第309
〜310頁、1981年〔Lerner、et al.、Cell、23、
309−310（1981）〕、ロスら、ネーチヤー、第294
巻、第654〜656頁、1981年〔Ross、et al.、
Nature、294、654−656（1981）〕、ワルターら、
プロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（USA）、第77巻、第
5197〜5200頁、1980年〔Walter、et al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）、77、5197−5200
（1980）〕、ラーナーら、プロシーデイングス・オ
ブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（USA）、第78巻、第3403〜3407頁、1981年、ワ
ルターら、プロシーデイングス・オブ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス（USA）、第
78巻、第4882〜4886頁、1981年；ウオン
（Wong）ら、プロシーデイングス・オブ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（USA）、第78巻、第7412〜7416頁、1981年；グ
リーン（Green）ら、セル、第28巻、第477〜487
頁、1982年；ニツグ（Nigg）ら、プロシーデイ
ングス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（USA）、第79巻、第5322〜5326頁、
1982年；バロン（Baron）ら、セル、第28巻、第
395〜404頁、1982年；ドリーズマン
（Dreesman）ら、ネーチヤー、第295巻、第185
〜160頁、1982年；及びラーナー、サイエンテイ
フイツク・アメリカン、第248巻、第２号、第66
〜74頁、1983年〔Lerner、Scintific American、
248、No.２、66−74（1983）〕参照。更に、ペプチ
ドホルモンの二次構造をほぼ有するもののそれら
の一次構造配列を有していない合成ペプチドの生
物学的及び免疫学的活性に関する、カイザーら、
サイエンス、第223巻、第249〜255頁、1984年
〔Kaiser、et al.、Science、223、249−255
（1984）〕参照。