JPH0231675A - 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 背景技術 本発明は、一般に、造血促進因子及びかかる因子をコー
ドするポリヌクレオチドに関する。本出願は、詳しくは
、哺乳動物の多分化能性コロニ刺激因子、特にヒト多分
化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ）、そ
の断片及びポリペプチド類縁体、並びにそれらをコード
するポリヌクレオチドに関する。

ヒト血液生成（造血）系は、様々な白血球（好中球、マ
クロファージ及び好塩基球／肥満細胞を含む）、赤血球
（エリスロサイト）及び凝血形成細胞（巨核球／血小板
）を補充する。平均的ヒト男性の造血系は毎年４．５ｘ
　１０”のオーダーの顆粒球及び赤血球を産生ずると推
測されていたが、これは１年間で全体重に相当する。デ
キスターら、バイオエッセイズ、第２巻、第１５４〜１
５８頁、１９８５年（Ｄｅｘｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　
　Ｂ　ｉｏｌ：５ｓａｙｓ、　２．　１５４−１５８　
　（１９８５））　　。

少Ｒの特定の造血促進因子は、少数の前駆体゛′幹細胞
″の各種血液細胞系への分化、これらの系の著しい増殖
及びこれらの系からの成熟血液細胞の最終的分化の原因
をなすと考えられている。

造血促進因子は極端に少量で存在しているため、これら
因子の検出及び同定は分析の仕方にかかつていたが、今
までは人為的条件下での培Ｎ細胞に対する刺激効果に基
づき様々な因子の中から区別できるにすぎなかった。そ
の結果、多数の名称が極めて少数の因子を表示するため
に考え出されてきた。かかる混同が生じた例として、Ｉ
Ｌ−３゜ＳＰＡ、マルチ−Ｃ３Ｒ，ＨＣＧＦ、ＭＣＧＦ
及びＰＳＦという語は、すべて現在では同一のマウス造
血促進因子に該当すると考えられている頭字語である。

メ］−カーフ、サイエンス、第２２９巻、第１６〜２２
頁、１９８５年（Ｍ　ｅｔｃａｌｆ、　　３　ｃｉｅｎ
ｃｅ、　　２２９゜１６−２２　（１９８５））。更に
、各種マウスの成長調節糖タンパク質に関する、バージ
ニスら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、第２５２巻、第１９８８頁、１９７７年（Ｂｕｒ
ｇｅｓｓ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　　２５２．１９８８　（
１９７７）　）　、ゲスら、ブラッド１．第５８巻、第
６００頁；　１９８０年（［）ａｓｅｔ　ａｌ、、　３
　ｆｏｏｄ、　５８．６００　（１９８０））　；イー
レら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、第１２９巻、
第２４３１頁、１９８２年（Ｉ　ｈｌｅ、　ｅｔ　ａｌ
、　　　ＪＩ　ｍｍｕｎｏｌ、、　１２９．２４３１　
（１９８２）　）　、二コラら、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリ、第　２５８巻、第９０１７
頁、１９８３年（Ｎ　１ｃｏｌａ、　　ｅｔａ！、、　
　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　２５８．９０ｉ７
　（１９８３）　）、メトカーフら、インターナショナ
ル・ジャーナル・オブ・キＶンサー、第３０巻、第７７
３頁、１９８２年（Ｍｅｔｃａｌｒ、　ｅｔ　ａｌ、、
　　Ｉ　ｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　　３０７７３　
（１９８２））　：及び、バージニスら、インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、第２６巻、第
　６４７頁、１９８０年（３ｕｒｇｅｓｓ、　　ｅｔ　
ａｌ、、　　ｌ　ｎｔＪ、　Ｃａｎｃｅｒ、　　２６．
６４７　（１９８０））参照。

組換え遺伝子技術の利用はこの混乱の中から一定の秩序
をもたらした。例えば、赤血球産生を促進するヒトエリ
スロボエチンのアミノ酸及びＤＮＡ配列が得られた（　
１９８５年６月２０日に公開されたリン＜　Ｌ　ｉｎ）
のＰＯＴ出願出願公開第８５１０２６丹クロファージコ
ロニー刺激因子のｃＤＮＡの単離に関しても利用された
。リ−ら、プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）第８２巻、第４
３６０〜４３６４頁、１９８５年（　ｌ　ｅｅ　ｅｔ　
ａｔ．、　　Ｐ　ｒｏｃ．　　Ｎ　ａｔｌ，Ａ　ｃａｄ
。

Ｓｃｉ．　（　ＬＪ　ＳＡ　）　、　８２．　４３６０
−４３６４　（　１９８５）　）及びウオンら、サイエ
ンス、第２２８巻、第８１０〜８１４　頁、１９８５年
（Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　　３ｃｉｅｎｃｅ、　　
２２８゜８１０−８１４　（１９８５））。更に、マウ
ス遺伝子のクローニングに関する、ヨコタら、プロシー
デインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス（ＵＳＡ）　、第８１巻、第１０７０頁、１９
８４年（ＹＯｋＯｔａ、　ｅｔａ＋、、　　Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ、　　ＡｃａｄＳｃｉ、　　（ＵＳＡ）　
、　８１．１０７０　（１９８４）　）　、ファングら
、ネーチャー、第３０７巻、第２３３頁、１９８４年（
Ｆｕｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　３０７．２３３　（１９
８４））及び、ゴー７ら、ネーチャー、第３０９巻、第
７６３頁、１９８４年（Ｇｏｕｇｈ、　ｅｔ　ａｔ、、
　Ｎａｔｕｒｅ、　３０９　、７６３（１９８４））、
並びにヒトＭ−Ｃ８Ｆに関するカワサキら、サイエンス
、第２３０巻、第２９１頁、１９８５年（Ｋａｗａｓａ
ｋ　ｉｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０　、
２９１　（１９８５））参照。

ヒト多分化能性コロニー刺激因子（ｈｐｃｓＦ）又はブ
ルリボエチンと称されるヒト造血促進因子は、ヒト膀胱
癌細胞系の培養液中に存在している。

ことが示された。この細胞系は５６３７と呼ばれて、米
国菌寄託礪関（Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ（：、　ｏｌ　Ｉｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル
、メリーランドにおいて制限条件付でＡＴＣＣ寄託番号
第ＨＴＢ−９号として寄託されている。この細胞系から
精製されたｈｐＣ３Ｆは、ヒト骨髄前駆体細胞を用いた
分析において、すべての主な血液細胞系の産生につなが
るような多分化能性前駆細胞の増殖及び分化を促進する
ことが報告された。ウェルトら、プロシーデインゲス・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｕ
ＳＡ）、第８２巻、第１５２６〜１５３０頁、１９８５
年（Ｗｅｌｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　　ｐｒｏｃＮａｔｌ
、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（ＬＪＳＡ）、　８
２．１５２６−１５３０　（１９８５）　）。ｈｐｃｓ
Ｆの精製には、（ＮＨ４）２Ｓ０４沈降、陰イオン交換
クロマトグラフィー（ＤＥＡＥセルロース、ＤＥ５２）
、ゲル濾過（ＡｃＡ５４カラム）、及び０１８逆相高性
能液体クロマトグラフィーを利用していた。０１８逆相
ＨＰＬＣ画分において２つの活性ピークの２番目に溶出
するｈｐＣ８Ｆとして確認されたタンパク質は、銀染色
を用いるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアク
リルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）での測定によれば、分
子量（ＭＷ）１８、０００を有すると報告された。ｈｌ
）Ｃ８Ｆは、等電点５．５を有し〔ウェルトら、ジャー
ナル・オブ・セル・バイオケミストリー、増刊第９Ａ号
、第１１６頁、１９８５年（Ｗｅｌｔｅ、　ｅｔ　ａｌ
、、　　Ｊ、　　Ｃｅ１ｌＢ＋ｏｃｈｅｍ、、　　５ｕ
ｐｐ　　９Ａ、　１１６　（１９８５））　）　、ｖウ
ス骨髄単球性白血病細胞系ＷＥ）−ＩＩ−３Ｂ　　Ｄ”
に対して高分化能を有する〔ウェルトら、分子及び細胞
生物学のＵＣＬＡ討論会、ゲールら編集、ニューシリー
ズ、第２８巻、１９８５年（Ｗｅｌｔｅ、　ｅｔａｌ、
、　　ｔＪＣＩＡ３ｙｍｐｏｓｉａｏｎ　　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　３ｉｏｌｏｇｙ、　
Ｇａ１ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　　ｅｄｓ、、ＮｅｖＳｅｒ
ｉｅｓ、　　２８　（１９８５）））ことが早期に報告
サレタ。

予備研究では、ｈｐｃｓｔ”と確認された因子はヒトＣ
ＦＵ−ＧＭ分析において最初の７日間に顕著な顆粒球コ
ロニー刺激活性を有することを示している。

ヒトＣ３Ｆ−βと称されるもう　１つの因子も、ヒト膀
胱癌細胞系５６３１から単離されたが、未標識マウスＧ
−Ｃ３Ｆの場合と同一の用量応答関係においてＷＥＨＩ
−３Ｂ　　Ｄ＋細胞との結合性に閏しマウス　　Ｉ−標
識顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ８Ｆ）の競合体とし
て記載されていた（二コラら、ネーチャー、第３１４巻
、第６２５〜６２８頁、１９８５年（Ｎ　１ｃｏｌａ、
　　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、　　３１４゜６２５
−６２８　　（１９８５）　）　）。この用量応答関係
は、以前、未標識マウスＧ　−Ｃ８Ｆに独特であって、
Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ８Ｆ又はマルチ−〇ＳＦのような
因子には見られないと報告されていた〔ニコラら、プロ
シーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス（ＵＳＡ）　、第８１巻、第３７６５〜３
７６９頁、１９８４年（Ｎ　１ｃｏｌａ、　　ｅｔ　ａ
ｔ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　３ｃｉ、　　
（ＵＳＡ）、　８１３７６５−３７６９　（１９８４）
））。Ｃ３Ｆ−β及びＧ−Ｃ８Ｆはともに、それらがＷ
ＥＨＩ−３８Ｄ＋細胞の分化を誘導する高い能力を有し
ている点において、Ｃ８Ｆ類の中では独特であるにコラ
ら、イムノロジー・トウデー、第５巻、第７６〜８０頁
、１９８４年（Ｎ　１ｃｏｌａ、　ｅｔ　ａｔ、、　　
ｌ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ。

５、７６−８０　（１９８４））　）。高濃度でＧ−Ｃ
８Ｆは混合顆粒球／マクロファージコロニー形成細胞を
刺激するがにコラら、１９８４年、同上）、このことは
、ヒト骨髄培養物及びｈｌ）Ｃ３Ｆの１４日間のインキ
ュベート後に顆粒球性、単球性、混合顆粒球／単球性及
び好酸球性のコロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の出現を示
す予備実験結果と一致する。。

Ｃ３Ｆ−βもマウス骨髄細胞使用分析において好中球性
、顆粒球性のコロニー形成を促進すると記載されていた
が、この性質は因子をＧ−ＣＳＦとして同定するための
基準とされた。これらの類似性から、ヒトＣ３Ｆ−βは
Ｇ−Ｃ８Ｆ（顆粒球コロニー刺激因子）と同一視された
にコラら、ネーチャー、第３１４巻、第６２５〜６２８
頁、１９８５年（Ｎｉｃｏｌａ、　ｅｔ　ａｔ、、　　
Ｎａｔｕｒｅ、　　３１４　、６２５−６２８（１９８
５））　）。

これらの共通の性質に基づけば、ニコラら、同上のヒト
Ｃ３Ｆ−β及びウェルトら、同上のｈｐＣ８Ｆは、適切
にはヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｌ）Ｇ
−Ｃ８Ｆ）と称される同一の因子であると思われる。ｈ
ｌ）Ｇ−Ｃ８Ｆの特徴づけ及び組換え産生は、イン・ビ
トロＷＥＨＩ−３８Ｄ＋白血病ｍ胞数を″全く正常な濃
度”で完全に抑制するマウスＧ−Ｃ８Ｆの報告されてい
る能力、並びに、マウスで確立された移植骨髄白血病を
抑制する粗製マウスＧ−Ｃ８Ｆ注射製剤の報告されてい
る能力からみて、特に望ましいであろう。メトカーフ、
サイエンス、第２２９巻　　第１６〜２２頁、１９８５
年（Ｍ　ｅｔｃａｌｆＳ　ｃｉｅｎｃｅ、　２２９．１
６−２２　（１９８５）　）参照。更に、サックス、サ
イエンティフィック・アメリカン、第２８４巻、第１号
、第４０〜４１頁、１９８６年（３ａｃｈｓ。

５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　　２８４
８　（１）、　　４Ｏ−４７（１９８６）　）参照。

ｈｌ）Ｇ−Ｃ８Ｆが治療−ヒ重要であるとわかり、した
がって市販規模量の入手が必要となる限り、細胞培養物
からの単離では、十分な物質源を提供することは困難で
ある。たとえば、ウェルトら（１９８５年、同上）によ
り天然ＭＣ３Ｆ単離物源として報告されたヒト膀胱癌細
胞系５６３７　（Ａ　Ｔ　ＣＣＨＴＢ９）等のヒト腫瘍
バンク細胞の商業的。

使用に対して制約が存在していることは、注目される。

発明の要旨 本発明によれば、ｈｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆの全部又は−部をコ
ードするＤＮＡ配列が提供される。このような配列は、
選択された非哺乳動物宿主による発現に゛好ましい”コ
ドンの組込み、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断
部位の供与、及び、簡易的発現ベクターの組立てを容易
にする前端、後端又は中間部へのＤＮＡ配列の付加的供
与を含むことができる。本発明は更に、１以上のアミノ
酸残塁の同−性又は位置に関して天然型と異なり、しか
も天然型の性質の一部又は全部を保有している、ｈ　ｐ
Ｇ　−Ｃ３Ｆのポリペプチド類縁体又は誘導体（即ち、
ｈｐＧ−Ｃ３Ｆに特異的な残基のすべてまでは含有して
いない削除類縁体、１以上の特異的残基が他の残基で置
換されている（　Ｓ　ｅｒ１７）ｈｐＧ−Ｃ８Ｆのよう
な置換類縁体、及び、１以上のアミノ酸残基がポリペプ
チドの末端又は中間部分に付加している付加類縁体）の
微生物発現をコードするＤＮＡ配列を提供する。

本発明の新規ＤＮＡ配列は、天然多分化能性顆粒球コロ
ニー刺激因子における一次構造配列の少なくとも一部及
び生物学的性質の１以上を有するポリペプチド産物の原
核もしくは真核宿主細胞での発現を確実化するために使
用される配列を含有している。本発明のＤＮＡ配列は、
特に、（ａ）表ＶＩ及び表■に示されたＤＮＡ配列又は
それらの相補鎖、（ｂ）表■のＤＮＡ配列又はその断片
と（本明細書記載のようなハイブリッド形成条件下又は
より厳格な条件下で）ハイブリッド形成するＤＮＡ配列
、又は（Ｃ）遺伝コードの縮重がなければ表■のＤＮＡ
配列とハイブリッド形成し得るＤＮＡ配列をも含むもの
である。特に　（ｂ）に包含される。

ものとしては、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆの対立変異型及び／又は
他の哺乳動物穏の多分化能性顆粒球コロニー刺激因子を
コードするゲノムＤＮＡ配列がある。

特に　（Ｃ）に包含されるものとしては、ｈｐＧ−Ｃ３
Ｆ、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆの断片及びｈｐＧ−Ｃ８Ｆ類縁体を
コードする人よりＮＡ配列があるが、このＤＮＡ配列に
は微生物宿主でのメツセンジャーＲＮＡの翻訳を促進す
るコドンを組込むことができる。このような人工配列は
、アルドン（Ａ　１ｔｏｎ）らのＰＣＴ出願公開第ＷＯ
３３１０４０５３号の方法により容易に組立てることが
できる。

更に本発明に包含されるものとしては、本明細占の表ｖ
Ｉ又は表■の上部鎖ヒトｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列
に相補的なりＮＡの一部によりコードされたポリペプチ
ド類、即ちトラモンタノら、ヌクレイツク・アシツズ・
リサーチ、第１２巻、第５０４９〜５０５９頁、１９８
４年（Ｔｒａｍｏｒ＋ｔａｎｏ、　　ａｔ　ａＮ　ｕｃ
ｌｅｉｃ　　Ａ　ｃｉｄｓ　　ＲｅＳ、　　　１２　　
５０４９−５０５９（１９８４））に記載された゛相補
的転化タンパク質″がある。

本発明は、対立変異体を含む天然ｈｐＧＣ８Ｆにおける
一次構造配列（即ち、アミノ酸残基の連続配列）の一部
もしくは全部、生物学的性質（例えば、免疫学的性質及
びイン・ビトロ生物学的活性）の１以上、及び物性（例
えば、分子量）を有する精製単離ポリペプチド産物を提
供する。

これらのポリペプチドは、化学合成操作又はゲノムもし
くはｃＤＮＡのクローニングもしくは遺伝子合成により
得られる外来性ＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿主Ｕ環
（例えば、細菌、酵母菌、高等植物、昆虫及び哺乳動物
細胞の培養による）の産物である、ということによって
も特徴づけられる。典型的な酵母菌（例えばサツカロマ
イセス・セレビシアエ（３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　）　。

又は原核生物（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅ　５ｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ））宿主細胞の産物は、い
ずれの哺乳動物タンパク質とも会合していない。を推動
物（例えば、非ヒト韻乳動物及び鳥類）細胞における微
生物発現産物は、いずれのヒトタンパク質とも会合して
いない。用いられた宿主に応じて、本発明のポリペプチ
ドは、哺乳動物その他の真核生物の炭水化物でグリコジ
ル化していてもよいし、非グリコジル化のままでもよい
。本発明のポリペプチドは、（−１位に）Ｒ初のメチオ
ニンアミノ酸残基を有することもできる。

更に本発明に包含されるものとしては、有効口の本発明
のポリペプチド産物と一緒に適切な希釈剤、アジュバン
ト及び／又は担体を含有する、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ療法に使
用される医薬組成物がある。

本発明のポリペプチド産物は、固体組織及び血液もしく
は尿等の液体試料中におけるヒトＭ）Ｇ−Ｃ８Ｆの検出
及び定量に使用される試薬を提供するために、検出可能
なマーカー物質と結合させることにより゛標識″する（
例えば、１２５Ｉで放射線標識する）ことができる。

本発明のＤＮＡ産物は、検出可能なマーカー（例えば、
放射線標識及びビオチンのような非アイソトープ標識）
で標識することもでき、しかも染色体地図上のヒトｈｐ
Ｇ−Ｃ３Ｆ３１？伝子の位置及び／又はその関連遺伝子
群の位置をつきとめるためのＤＮＡハイブリッド形成操
作に用いることができる。それらはＤＮＡレベルでのヒ
トｈｐＧＣ８Ｆ遺伝子の異常を確認するためにも使用さ
れ、隣接遺伝子及びそれらの異常をＷ１認するための遺
伝子マーカーとして使用することもできる。

本発明のポリペプチド産物は、再生不良性貧血のような
造血障害の治療のために、単独で又は他・の造血因子も
しくは薬物と一緒に使用される。それらは化学療法又は
放射線療法による造血障害の治療にも使用される。骨髄
移植の成功率は、例えばｈｐＧ−Ｃ３Ｆの使用により高
められるであろう。創傷治辻熱傷治療及び細菌性炎症治
療にもｈ　ｐＧ　−Ｃ８Ｆが有効である。更に、ｈｐＧ
−Ｃ３Ｆは、白血病細胞を分化させると報告されている
能力に基づき、白血病の治療にも使用される。

ウェルトら、プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第８２巻、
第１５２６〜１５３０頁、１９８５年（Ｗｅｌｔｅ、　
ｅｔａｔ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ、　　３ｃｉ、（ＵＳＡ）　。

８２、１５２６−１５３０　（１９８５））及びサック
ス（３ａｃｈｓ）、同上参照。

本発明の多数の側面及び長所は、現在の好ましい態様た
る本発明の実例について説明した以下の詳細な説明を剛
的することにより、当業者であれば明らかになるであろ
う。

詳細な説明 本発明によって、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆのポリペプチド配列の
一部又は全部をコードするＤＮＡ配列が単離されかつ特
徴づけられた。

下記の諸例は本発明の説明のために示されたちノテあッ
テ、特に、ｈｐＧ−ｃｓ＋”　　ＣＤＮＡ及びゲノムク
ローンの同定に先立ち行なわれる操作、かかる同定方法
、並びに、配列決定、ＣＤＮＡ。

ゲノム及び人工遺伝子に基づく発現系の開発、及びかか
る系での発現ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ及び類縁体産物の同定に関
する。

更に詳しくは、例１はＭＧ−Ｃ８Ｆのアミノ酸配列決定
に関する。例２はコロニーハイブリッド形成スクリーニ
ング用ｃＤＮ△ライブラリーの製造に関する。ｌＡ３は
ハイブリッド形成プローブの組立てに関する。例４は、
ハイブリッド形。

成スクリーニング、陽性クローンの同定、陽性ＣＤＮＡ
クローンのＤＮＡ配列決定及びポリペプチド−次構造配
列（アミノ酸配列）情報の作成に関する。例５はｈｐＧ
−Ｃ８Ｆをコードするゲノムクローンの同定及び配列決
定に関する。例６は、大腸菌優先（ｐｒｅｒｅｒｅｎｃ
ｅ＞コドンが用いられたｈｐＧ−Ｃ３Ｆをコードする人
工遺伝子の組立てに関する。

例７は、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆを一＋−ＦするＤＮＡを組込ん
だ大腸菌形質転換ベクターの組立て方法、ｈｐＧ−Ｃ３
Ｆの原核生物発現におけるベクターの使用、及び本発明
の組換え産物の特性分析に関する。例８は、システィン
残基がｈｐＧ−Ｃ８ＦをコードするＤＮＡでの変異誘発
により別の適切ケアミノ酸残基で置換されたｈｐＧ−Ｃ
８Ｆ類縁体の産生方法に関する。例９は、陽性ＣＤＮＡ
りＯ−ンから１ｑたＭ）Ｇ−Ｃ３Ｆ類縁体をコードする
ＤＮＡを組込んだベクターの組立て方法、Ｃ０８−１細
胞形質転換のためのベクターの使用、及び形質転換細胞
の培養増殖に関する。例１０は、本発明の組換えポリペ
プチド産物の物理的及び生物学的性質に関する。

例　　　　１ （Ａ）　　　　　方法により　られた物　の配列決定 ｈ　ｐＧ　−Ｃ８Ｆ試料（３〜４μび、ＳＤＳ銀染色−
ＰＡＧＥ純度８５〜９０％）は、ウェルトら、プロシー
デインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス（ＵＳＡ）　、第８２巻、第１５２６〜１５３
０頁、１９８５年（Ｗｅｌｔｅ、　　ｅｔ　ａｔ、、　
　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（ＵＳＡ）
、　８２．１５２６−１５３０　（１９８５）　）に従
い単離精製したものと同様であって、スローン・ケタリ
ング・インスティテユート（３１ｏａｎ　　Ｋ　ｅｔｔ
ｅｒｉｎｇ　　ｌ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　、二：Ｌ　−
一ヨーク、ニューヨーク州から入手した。

このｈｐＧ−Ｃ８Ｆ試料のＮ末端アミノ酸配列を、ＡＢ
４０７Ａ気相分析装置（アプライド・バイオシステムズ
（Ａ　ｐｐｌｉｃｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォ
スター市、カリフォルニア）を用いたミクロ配列分析に
より１号操作（Ｒｕｎ１１）で決定し、下記表■に掲示
された配列情報を得た。表Ｉ−ｒＶでは、単一文字コー
ドが用いられており、パＸ″は明確に決定されなかった
残基を示し、括弧内の残基は単に択−的又は推定的に示
されたものである。

表１ に二Ｐ−Ｌ−Ｇ−Ｐ−Ａ−５−に−Ｌ−に−Ｑ−（Ｇ、
Ｖ、５）−Ｇ−Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｘ高いバックグランドが操
作サイクル毎に存在したが、その結果は表Ｉに報告され
ており、このことは試料がおそらく精製時の化学的残留
物たる多くの汚染成分を有することを示していた。配列
を単に参照用として保存した。

２号操作（Ｒｕｎ１２）では、第２試料（５〜６μ９、
純度９５％以下）は１号操作と同様にスローン・ケタリ
ングから入手し、配列決定操作は１号操作と同様にして
実施した。この試料は、ウェルトら、プロシーデインゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（ＩＪｓＡ）、第８２巻１．第１５２６〜１５３０頁、
１９８５年の図４を作成するために用いられた物質の同
一ロットから得たものである。

結果は、表■に示されている。

表■ 更に多くの残基が同定されたが、２号操作では、適当数
のプローブをｈｐＧ−Ｃ３Ｆ　　ＤＮＡ調査用に組立て
得るほど十分に長い明確４「配列は得ら。

れなかった。表■の配列と基づきｃＤＮＡの単離を行な
うためには、少なくとも１５３６種類のプローブが必要
であろうと計算された。再度、試料の汚染が問題視され
た。

このため、第３試料（３〜５μグ、純度４０％以下）を
上記のようにスローン・ケタリングから入手した。この
調製物は、更に特製するために、５ＤＳ−ＰＡＧＥによ
る分離後、電気プロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）に
付した。この試料の配列分析ではデータが得られなかっ
た。

（Ｂ）修正方法により得られた物　の配　決定→分量の
純粋物質を得て適切な最終的アミノ酸配列分析を実施す
るため、スローン・ケタリングで産生されるものと同様
の膀胱癌細胞系５６３７の細胞（サブクローンＩＡ６）
をイー・ブラッツァー博士（Ｄ　ｒ、　　Ｅ　、　Ｐ　
１ａＬｚｅｒ）から入手した。細胞を最初にフラスコ中
のアイコブ（ｌ　５ｃｏｖｅ’ｓ）培地〔ギブコ（ＧＩ
ＢＣ○）、グランドアイランド、ニューヨーク〕で培養
し、集密化させた。集密化時、培養物をトリプシン処理
し、ローラーボトル中に播種したが（１，５フラスコ／
ボトル）、各ボトルは５％ＣＯ２下で予め条件が整えら
れたアイコブ培地２５威を含有していた。細胞を３７℃
、　０．３ｒｐｍで一夜増殖させた。

サイトデックスー１（Ｃｙｔｏｄｅｘ−１）ビーズ〔フ
ァルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）　、ウプサラ、ス
ウェーデン〕を洗浄し、下記操作により滅菌した。ビー
ズ８ｇをボトルに加え、ＰＢＳ４００ｄを加えた。

ビーズを３時間静かに撹拌して懸濁させた。ビーズを静
置させた後、ＰＢＳを排出し、ビーズをＰＢＳで洗浄し
、新鮮ＰＢＳを加えた。ビーズを１５分間オートクレー
ブで処理した。使用前に、ビーズを、新鮮培地＋１０％
牛脂児血清（Ｆｅ２）添加萌にアイコブ培地＋１０％Ｆ
Ｃ８中で洗浄し、処２理ビーズを得た。

各ローラーボトルから３０ｄを除くすべての培地を除去
した復、新鮮培地＋１０％Ｆ　ＣＳ　３０Ｉｒｒ１及び
処理ビーズ４０戒をボトルに加えた。ボトルを５％ＣＯ
２処理し、すべての泡を吸引除去した。ボトルを、速度
０．３ｐｐｍに低下させる前、ローラー台に３ｒｐｍで
０．５時間載置した。３時間後、別のフラスコ内容物を
トリプシン処理し、ビーズ含有の各ローラーボトルに加
えた。

実密度４０〜５０％の時点でローラーボトル培養物をＰ
　Ｂ　Ｓ　５０ｄで洗浄し、ＰＢＳ除去前１０分間回転
させた。細胞を培地Ａ　（０，２％ＦＣ８，１０−８Ｍ
ヒドロコルチゾン、２ｍＨグルタミン、１００単位／ｄ
ペニシリン及び１００μｇ／ｄストレブ＋％　ｐイシン
含有アイコブ培地〕中で４８時間培養した。次いで、培
養上澄を３００Ｏｒｐｍで１５分間達心弁離して集め、
−７０℃で貯蔵した。培養物に１０％ＦＣ８含有培地八
を再度加え、４８時間培養した。培地を捨てた後、細胞
を上記のようにＰＢＳで洗浄し、培地Ａ中で４８時間培
養した。上澄を再度集め、上記のように処理した。

ＩＡ６細胞の培養培地約３０リツトルを、１０，０００
Ｍ、Ｗ、遮断装置をもつ２個のカセットを備えたミリボ
ア・ベリコン（Ｍ　１ｌｌｉｐｏｒｅ　　ｐｅｌｌｉｃ
ｏｎ）ユニットにより、濾過速度的２００７／ｍｉｎ及
び保持速度的１０００ｄ／ｍｉｎで約２リツトルまで濃
縮した。

ｃｉ縮物を同−装置及び同一流速により５０ｍＨトリス
（ρ８７．８）約１０リツトルで透析濾過した。透析濾
過濃縮物を５０ｍＨトリス（ｐＨ７，８）で平衡化され
た１リツトルＤＥセルロースカラムに４０ｄ／ｍｉｎで
添加した。添加後、カラムを５０ｍＨトリス（ｐＨ７，
８）１リツトル、次いで５０ｍＨＮａＣ，Ｑ含有５０ｍ
Ｈトリス（ｐＨ７，８）２リツトルにより同一速度で洗
？争した。カラムを次いでＮａＣｊＪＨ度が７５ｍＨ，
１００ｍＭ、　１２５ｍＭ、　　１５０゜ａＨ，２００
ｎＨ及び３００ＩＩＩＨの６種の５０１１ＩＨトリス（
ｐＨ７，５）１リツトルで連続的に溶出させた。画分（
５０ｄ　＞を集め、活性画分をプールし、ＹＭ５膜装備
アミコン（Ａ　ｍ１ｃｏｎ）限外濾過Ｉｊ！拌セルユニ
ットで６５ｍに濃縮した。この濃縮物をＰＢＳで平衡化
された２リツトルのＡＣＡ５４ゲル濾過カラムに添加し
た。

カラムを８０ｍｅ　／　ｈｒで操作し、１０７画分を集
めた。

活性画分をプールし、Ｃ４高性能液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）カラムに直接添加した。

容良１２５〜８５０　ｄで、タンパク質１〜８■を含有
し、その約１０％がＭＧ−Ｃ８Ｆである試料を、流速１
〜４　ｄ／ｉｉｎでカラムに添加した。添加後、流速１
ｄ／ｍｉｎで８０％２−プロパツール中の０．１Ｍ酢酸
アンモニウム（ｐＨ６，０〜７．０）により洗浄した。

ｉ　ｍ９画分を集め、タンパク質について２２０ｔ＋＋
ｎ　１２６０ｎｍ及び２８０ｎｎ＋でモニターした。

精製した結果、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ含有画分を他のタンパク
質含有画分から（８０の両分中７２及び７３番目の両分
として）明確に分離した。ｈｐＧＣ８Ｆは純度的８０±
５％及び収率約５０％で単離された（１５０〜３００μ
９）。この精製物質９μ３を４号操作（Ｒｕｎ＃４）ア
ミノ酸配列分析に使用し、タンパク質試料を非ポリブレ
ンＴＦＡ活性ガラス繊維板に付着させた。配列分析は、
ヘライックら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリ、第２５６巻、第７９９０〜７９９７頁、１９
８１年（Ｈｅｗｔｃｋ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　
２５６．　７９９０−７９９７（１９８１）　）及びラ
イ、アナリティカ・キミカ°アクタ、第　１６３巻、第
　２４３〜２４８頁、１９８４年（ｌ　ａｉ。

Ａｎａｌ、　　Ｃｈｉｍ、　　Ａｃｔａ、　　１６３　
、２４３−２４８　（１９８４））の方法に従い、ＡＢ
４７０Ａ分析装置で実施した。

４号操作の結果は表■に示されている。

表■ Ｔｈｒ　−９１０−Ｌｅｕ　−Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ　−Ａ
ｌａ　−Ｓｅｔ　−ＳｅＴ：　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｇ
ｉｎ　−Ｓｅｒ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｌ
ｙｓ　−（Ｌｙｓ）　−Ｌｅｕ　−（Ｇｌｕ）　−Ｇｌ
ｕ　−２５３゜ Ｖａｌ　−Ａｔｇ　−Ｌｙｓ−工１ｅ−（Ｇｌｎ）−Ｇ
ｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ　−Ａｌａ　−Ａ１．、−Ｌ
ｅｕ　　−Ｘ ４号操作では、（表■の残基３１に相当する）第３１サ
イクルより先において、更に重要な配列情報は得られな
かった。長い明確な配列を得るために、５号操作（Ｒｕ
ｎ＃５）においては、条件調整培地から精製されたｈｐ
Ｇ−Ｃ３Ｆ１４μ９を４５℃で１時間β−メルカプトエ
タノール１０ｄで還元し、次いで減圧下で完全に乾燥し
た。タンパク質残基を次いで、ポリブレン化ガラス繊維
板に付着させる前に５％ギ酸に再溶解した。配列分析は
上記４号操作と同様にして実施した。５号操作の結果は
表■に示されている。

表■ Ｔｈｅ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ　−Ｇａｙ　−Ｐｒｏ　、
−Ａｌａ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｔ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　
−Ｇｌｎ　＋　Ｓｅｒ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ
　−Ｌｙｓ　−Ｃ１／１−　Ｌｅｕ　−ＧＬｕ　−Ｇｌ
ｎ−２５３゜ Ｖａｌ　−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　７エ１ｅ　−Ｇｉｎ　−
、Ｇｌｙ　−Ａｓｐ　−Ｇａｙ　−Ａｌａ　−Ａｌａ　
−・　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
゜Ｌｅｕ　−Ｇｉｎ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　
−Ｇｌｙ　−Ａｌａ　−Ｔｈｒ　−Ｔｙｒ　−Ｌｙｓ　
−Ｖａｌ　　−Ｐｈｅ　　−Ｓｅｒ　　−Ｔｈｒ　　−
（Ａｒｇ）　　−（Ｐｈｅ）　　−（Ｍｅヒ）　−Ｘ−
表■のアミノ酸配列は、下記ｈＤＧ−Ｃ３ＦＣＤＮＡを
得るためのプローブを組立てる上で、十分に長り（４４
残基）かつ明確であった。

例　　　　２ 目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的操作の中に
は、標的遺伝子の発現に基づき選択されたドナー細胞中
に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写から得られるプラス
ミド担持ＣＤＮＡ″゛ライブラリー″の調製が含まれる
。ポリペプチドのアミノ酸配列の実質的部分が公知であ
る場合には、゛標的”ｃＤＮＡ中での存在が推定される
配列を複製した標識−重鎮ＤＮＡプローブ配列が、−重
鎮型に変性されたｃＤＮＡのクローンコピーに対して実
施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作において
使用され１ｑる。ワイスマン（Ｗ　ｅｉｓｓｍａｎ）ら
、米国特許第４．３９４．４４３＠明細書、ウォレスら
、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第６巻、第３５
４３〜３５５７頁、１９７９年（Ｗａｌｌａｃｅ。

ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　
Ｒｅｓ、、　　６．　　３５４３−３５５７　（１９７
９）　）　、レイスら、プロシーデインゲス・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・ザイエンス（ＵＳＡ）　
、第７９巻、第３２７０〜３２７４頁、１９８２年（Ｒ
ｅｙｅｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ
、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃ１．　（ＵＳＡ）、■、　３２７０−３２７４　（
１９８２））　、及びジエイ（Ｊ　ａｙｅ）ら、ヌクレ
イツク・アシッズ・リサーチ、第１１巻、第２３２５〜
２３３５．１９８３年参照。

更に、診断実施時におけるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
形成操作に関するファルコ−（Ｆａｌｋｏｗｌらの米国
特許第４．３５８．５３５号明細書、及びコロニ及びプ
ラークハイブリッド形成技術にＩ！１するデービスら、
゛遺伝子工学、高等細菌遺伝学のマニュアル″、コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｑａｖｉｓ
、　ｅｔ　ａｌ、、　　”Ａ　　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ
ＧｅｌｌＧｔｌＣＥ　ｎ（ｌｉｎｅｅｒｌｎ（１，Δｄ
ｖａｎｃｅｄ　Ｂ　ａｃｔｅｒ＋ａ＋。

Ｑｅｎｅｔｉｃｓ　”　、　Ｃｏ１ｄ　３ｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　）・コールド・
スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、１９８０年、第
５５〜５８頁及び第１７４〜１７６頁参照。

完全ＲＮＡの定量的単離のためのグアニジニウムチオシ
アネート操作〔チャーブウィンら、バイオケミストリー
、第１８巻、第５２９４〜５２９９頁、１９７９年（Ｃ
ｈｉｒｇｗｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、　　１８゜５２９４−５２９９　（１９７
９））　）により、全ＲＮＡを膀胱癌細胞系５６３７　
（ｌΔ６）細胞約１ｇから抽出した。

無菌ＲＮＡ水溶液はＩＡ６細胞由来の全ＲＮΔを含有し
ていた。全ＲＮＡｆｆ１液からメツセンジャーＲＮＡの
みを得るため、溶液をオリゴデオキシヂミジレート〔オ
リゴ（ｄＴ））（コラボレーティブ・リサーチ社（Ｃｏ
ｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｃ暑
、つＡ）Ｌ／４ｊム、マサチューセッツ〕含有カラムに
通した。メツセンジャーＲＮＡに特有のポリアデニル化
（ポリＡ”　）尾部はカラムに付着するが、リポソーム
ＲＮＡは溶出する。かかる操作の結果、ポリアデニル化
メツセンジャーＲＮＡ（ポリＡ＋ｍＲＮＡ）約９０μ３
を単離した。単離されたポリＡ＋メツセンジャーＲＮＡ
を、ＣＤＮＡ反応で使用する前に、最終濃度４ｍＨで５
分間空温で水酸化メチル水銀〔アルファ・ペントロン（
Ａ　１ｐｈａ　　Ｖ　ｅｎｔｒｏｎ）　、デンバーズ、
マサチューセッツ〕により前処理した。水酸化メチル水
銀処理は、翻訳を阻害するメツセンジャーＲＮＡ自体の
相互反応及びそれと汚染分子との相互反応を抑制させた
。ベイバーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第２５８巻、第７６３６〜７６４２頁、１
９７９年（ｐａｙｖａｒ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、
　　ＢｉｏｌＣｈｅｍ、、　　２５８．７６３６−７６
４２　（１９７９））　参照。

オカセマ操作法〔オカヤマら、モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー、第２巻、。

第１６１〜１７０頁、１９８２年（Ｑｋａｙａｍａ、　
ｅｔ　ａｔ。

Ｍｏ１ｃｕｌａｒ　　＆　　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、　　２，１６１−１７０（１９８２）））
に従い、ｃＤＮＡバンクをＩＡ６細胞から得たｍＲＮＡ
により［７した。ｃＤＮＡを次いでインキュベートして
増幅用宿主微生物大腸菌に一１２株ＨＢ　１０１に組込
んだ。

例　　　　３ 表ＩＶのｈｌ）Ｇ−Ｃ８Ｆアミン末端配列に基づき考え
出されたハイブリッド形成プローブは、各々が長さ２３
塩基で３個のイノシン残基を有する２４組のオリゴヌク
レオチドから構成されていた。プローブオリゴヌクレオ
チドをカルザースら、ジエネティック・エンジニアリン
グ、第４巻、第１〜１８頁、１９８２年（（Ｃａｒｕｔ
ｈｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＧｅｎｅＮｃＥ　ｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ、　　４．１−１８（１９８２））の探
信に従い製造し、ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
（Ｋ　ｉｎａｓｉｎｇ）することによりｒ−”２Ｐ　　
ＡＴＰで標識した。表Ｉｖの配列中残基２３〜３０のメ
ツセンジャーＲＮＡに対応するプローブオリゴヌクレオ
チドは、表Ｖに示されている。

表Ｖ ｈｐＧ−ＣＳＦプローブ 中立性を工に付与したのは、タカハシら、プロシーデイ
ンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス（ＵＳＡ）、第８２巻、第１９３１〜１９３５頁、
１９８５年（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　
　ＰｒｏｃＮａ口、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（
ＵＳＡ）、　８２．１９３１１９３５　（１９８５）　
）及びオーツカら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、第２６０巻、第２６０５〜２６０８頁
、１９８５年（Ｑｈｔｓｕｋａ、　ａｔ　ａｌ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　　２６０．２６０
５−２６０８　（１９８５））　−の研究公表に基づい
ていた。しかしながら、イノシンはＧ又はＴと塩基対形
成した場合には膜安定化効果を有する。タカハシらの場
合では、イノシンは、それらが−群として平均化してほ
ぼ中立化するに到ることから、中立効果を有するようで
ある（例えば、３個はＣと好ましく対形成したが、２個
は王と対形成し好ましくなかった）。

Ｇとの■塩基対形成効果を試験“するため、コントロー
ル実験をＮ　−ｍｙｃ　遺伝子配列及びクローンを用い
て計画した。Ｎ　−ｍｙｃ　遺伝子から得た配列は、ｈ
ｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆプローブで規定されたものと同一の全体
的Ｇ及びＣ含有率を、各コドンの最初の２つの位置で有
していた。したがって、Ｎ−ｍｙｃ試験プローブは、ｈ
ｐＧ−Ｃ３Ｆプローブと比較し、同一の長さであり、同
一の相対的位置にＩを含有し、しかも潜在的に同一の平
均Ｔｍ（６２〜６６℃、３又は４個のイノシン残基を含
有しているためではない）を有していた。

２組のＮ　−ｍｙｃ試験プローブを前記力ルザースらの
操作に従い組立てた。表■に示された第１組は、以下の
ものを含んでいた；１．完全対合体の２３組体：２，３
個の３位置が、■を加えた場合に最悪のケースを生じる
ようにＩで置換されている；３．４個の３位がＩで置換
されている。第２組の試験プローブは、全体的な中立的
塩基対形成効果を与え得るイノシン塩基対のよりランダ
ムな配置を表わすために考え出された。表■に示された
第２組は以下のものを含んでいた；４．Ｃと塩基対形成
する２個のＩ及びＧ塩基対形成する１個のＩを有する：
　５□　■：Ｇ塩基対たるもう１個のＩを有する４と同
一である。

表■ Ｎ−、ｍｙｃ試験ブロー、ブ ”’ＣＡＣＡＡＣＴＡＴ　ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣ
Ｃ””ＣＡＣＡＡＣＴＡＴ　ＧＣＣＣＣＣＣＣ工ＴＣＩ
　ＣＣ””ＣＡＩＡＡＣＴＡ’ｌ’　ＧＣＩ　ＧＣＣＣ
口ＴＣＩ：　ＣＣ””ＡＡＣＧＡＧ　ＣＴＧτＧＩ　Ｇ
ＧＣＡＧＩ　ＣＣＺ　ＧＣ””ＡＡＩ　ＧＡＧ　ＣＴＧ
　ＴＧＩ　ＧＧＣＡＧＩ　ＣＣＩ　ＧＣ”Ｎ−ｍｙｃＤ
ＮＡ配列及びニワトリ成長ホルモンＤＮＡ配列（陰性コ
ントロール）を含有する５個のレプリカフィルターを、
ハイブリッド形成前に、減圧オーブン中８０℃で２時間
焼いた。すべてのフィルターは、ハイブリッド形成時間
が６時間のみであること以外、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆプローブ
に関して例４で記載されたように、ハイブリッド形成し
た。フィルターを室温で３回しかる後４５℃で１回各々
１０分間洗浄した。フィルターをガイガーカウンターで
モニターした。

Ｎ　−ｍｙｃプローブ３のフィルターは他の４個のプロ
ーブフィルターと比較して非常に弱いシグナルを発した
ため、それ以上洗浄しなかった。５０℃で１０分間洗浄
後、ガイガーカウンターは、プローブ１を、１００％標
準として、下記％シグナルを表示したニブローブ２．２
０％ニブローブ３（４５℃）、２％；プローブ４．９２
％；及びプローブ５．７５％。

５５℃での洗浄後は、％がニブローブ２．１６％ニブロ
ーブ４．１（１０％：及びプローブ５．８０％であった
。６０℃での最終洗浄では下記％を表示したニブローブ
２．１．６％；プローブ４．９０％；及びプローブ５．
７０％。

このように、プローブ２及び４のように３個の■が存在
する場合では、シグナルにおいて６０培ま。

での差違が、理論的Ｔｍ（ＩＧ、ｔｆｆｌ算に含まれて
いない）は（最悪の！塩基対形成例（プローブ２）及び
比較的中立な■塩基対形成例（プローブ４）に関して）
近いにもかかわらず観察される。

Ｎ　−ｍｙｃ試験ハイブリッド形成により得られた標準
化情報は、より厳格でない洗浄による結果が許容され得
る信頼度を測定するために、下記のように洗浄及びｈ　
ｐＧ　−Ｃ８Ｆハイブリッド形成のモニターに際して利
用された。

例　　　　４ ハナハンら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー、第１６６巻、第５５７〜５８０頁、１９８３年
　〔ト１ａｎａｈａｎ、　　　ｅｔ　　ａｔ、、　　　
Ｊ　　、　　　Ｍｏ１．　　　Ｂ　　！０１６６　、５
５７−５８０　（１９８３））の操作に従い、例２で産
生されたｃＤＮＡインサート（ｉｎｓｅｒｔ）との組換
え体を含む細菌を、寒天プレート上に載置された２４個
のニトロセルロースフィルター〔ミリボア（Ｍ　１ｌｌ
ｉｐｏｒｅ）　、へｙ　ドア　ｔ　−ｔ’、マサチュー
セッツ）に拡散した。プレートを次いでインキュベート
して約１５０．０００個のコロニーを得たが、これを２
４個の他のニトロセルロースフィルターに移してレプリ
カ培養した。レプリカを明瞭なコロニが出現するまでイ
ンキュベートした。フィルター上の細菌を、１０分間水
酸化ナトリウム（０，５Ｍ　）でわずかに飽和され、し
かる後２分間トリス（１Ｍ）でプロットされ、次イテ１
０分間Ｎ　ａ　Ｃｊ　（１，５Ｍ　）含有トリス（０，
５Ｍ）でプロットされたワットマン３８Ｈ紙上で溶菌さ
せた。フィルターがほぼ乾燥した後、それらを核酸ハイ
ブリッド形成前に減圧オーブン中８０℃で２時間焼いた
。ウアールら、プロシーデインゲス・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）　、第７６巻、第
３６８３〜３６８７頁、１９７９年（Ｗａｈｌ、　ｅｔ
　ａｌ、、　　ｐｒｏｃ、Ｎａ口Ａｃａｄ、　　３ｃｉ
、　　（ＵＳＡ）　、　７６、３６８３−３６８７（１
９７９））　、及びマニアティスら、セル、第８１巻、
第１６３〜１８２頁、１９７６年（ＭａｎｉａＮｓ、　
ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ、　　８１．１６３−１８２　（１９７６））
。

フィルターを１０×デンハード（Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔ）
　０．２％ＳＤＳ及び６ＸＳＳＣ７ｓＯｒｎ！中６５℃
で２時間、前ハイブリッド形成させた。フィルターを６
ｘｓｓｃで洗浄し、次いで４つをバッグに入れ、６ＸＳ
ＳＣ及び１０Ｘデンハード中で１４時間ハイブリッド形
成させた。５０Ｘ　１０　　ｃｐｍの３２Ｐ−標識プロ
ーブ（オリゴヌクレオチド）を有するバッグ当たり、溶
液的１５１Ｒ１が入っていた。

ハイブリッド形成後、フィルターを６ＸＳＳＣ（１リツ
トル／洗浄）中で３回ｖ温で各々１０分間洗浄した。フ
ィルターを次いで６ＸＳＳ０１リツトルにより、４５℃
１５分間で１回洗浄した。フィルターを増強スクリーン
及びコダックＸＡＲ−２フィルムにより一７０℃で２時
間オートラジオグラフィーに付した。このオートラジオ
グラフでは、５個の非常に強いシグナルを含む４０〜５
０個の陽性シグナルが検出された。

最強の５個のシグナル及び別の５個の陽性シグナルを含
む領域をマスタープレートからこすり落とし、同一条件
下同一プローブ混合物を用いて二次スクリーニングに移
した。洗浄操作は、高温洗浄が５５℃１５分間で各々２
回、及びしかる後の６０°Ｃ１５分間で１回からなる点
で異なっていた。例３のＮ　−ｍｙｃプローブ研究に基
づき、二次スクリーニングでの最終洗浄温度を上げたが
、２４個の２３量体に関する凝集融解温度がＮ　−ｍｙ
ｃプローブの温度に近似した６０〜６８℃であったため
である。２回目の５５℃での洗浄後、フィルターを湿潤
さ往たままにし、オートラジオグラフィーに付した。こ
のオートラジオグラフィーと、６０℃でのＲ終洗浄後同
じ時間をかけた２回目のオートラジオグラフィーとの比
較では、１０個の被試クローンのうち２個だけが５５℃
〜６０℃以上に昇温させた場合にシグナルの実質的損失
をうけないことが明らかになった。

これら２個のクローンは、はぼ同一の長さ及び制限エン
ドヌクレアーゼパターンであることが後に示された。Ｐ
ｐｏ２と称される１個のクローンを配列決定のため選択
した。

上記操作で得られた組換えｈｐＧ−Ｃ３ＦＣＤＮＡクロ
ーンのＰｐｏ２の配列決定は、サンガーら、プロシーデ
インゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（ＬＩＳＡ）　、第７４巻、第５４６３〜５４６
７頁、１９１７年（Ｓａｎｇｅｒ、　　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、
　　（ＵＳＡ）、　７４゜５４６３−５４６７　（１９
７７））のジデオキシ法により達成された。−重鎖ＤＮ
ＡファージＭ−１３は、二重鎖ＣＤＮＡクローンの一重
鎖ＤＮＡｖｒ型を供給するためのり［１−ニングベクタ
ーとして使用した。サンガーらの方法により、表■に示
されているようなアミノ酸翻訳を伴う配列及びポリペプ
チドコード領域の相補鎖が明らかとなった。

ｏｈｚ 山ｃＪＱ ｅｃ５（Ｊ −べ− ロυロ クロ０ Ｑｃ５υ ｏｏｕ −ＣＪＣ５ Ｑ＋ＣＪ○ ＩＴｃＪＱ 〉１くト ｈｆ−Ｉ＜ ｓｊ＜ｔ−＋ Ｊ：ＵＯ −＜ト ＡＪＣ５ＬＩ　　　１ａｃＪＬｌ　　　コＣ０ａＩｈ＜
　　　−＋ＣＪ（ｊ　　　ａｌｌ−１＜工く８　　＜口
ｕ　　　１ＪｃＪＣ５ 拒Ｕ本Ｈ本■ Ｉ：（ｊυ　　　　１１１ＣＪＣ５ｈｕｅＦ４　（？　
　　、−１ｔＪ　Ｃ５＋ｕ　Ｃ５（Ｊ（５（Ｊｕ　　く
口ｃＪ　　　切くト ＋１１（ＪＬＩ ＜口Ｑ Ｉ：Ｃ５ｔ） 喝０り　　マｏＱＱ ＋−ＩＣＪ（ｊ　　Ｆ＋ｕｃＪｕ ＜り〇　−山ＣＪＣ５ く ト く 二８呂　＝諭旨　１？ミ　　Ｓ試り ＜ｖｃＪＬＩＣＪＣ）　　　＞口ＣＪ　　　ｔｊｃＪ’
１Ｊｏ−ＣＪ　Ｃ５Ｃ３ｊ：ｌ　Ｃ５ＣＪ　　Ｃ１＞Ｌ
ｌ　（Ｊ　　Ｃ１＃○ローｌｌ＋＠４＜１＋′ＩＱ−（
鯖−ＱＱ　さ−く８ｓ＞ｔｓｃＪ　、−＋ｑｕｃ　　、
−＋ｏｕｕ　　、−＋工ｕ。

日　　　　ｈｕｏ　　　　　Ｃ５ Ｃ５ｔｐｈｈｈ −ト　　　　ロ　　　　υ　　　　Ｑ （Ｉｊｆｎ＜ＣＪ ｈｈｕ＊ｈ Ｃ４（Ｊ（Ｊ！−１ｃ５ しＣＪＣ５ 切くト ＜ｃｐｕ 口、ｓ−＋＜　　　　　ｐｏｕ　　　　　Ｃ（：ｌＬｌ
　　　　　＞ｏｕ＋ｎ＜ｈ　　　ａｓｈ＜　　　−＜ｌ
−１−１（５（Ｊベロｕ　　　ｑｕｅ　　　ｏｕａ　　
　ｑｏｕｃ５ｏｕ　　　　　ｏｏｕ　　　　　ｔｎ＜ｈ
　　　　　ｏｕｃｐ二定Ｅ　二８８　　ピ８８　喘を乏
　層　８　ゴ　モ　　淀ｏｏａ　　　＜ｕｏ　　　＜ｏ
ｔｓ　　　＞＜ｓ○　　ぺ　　ｕｏｈｃ：１ｃ５ｕ　　
　　ａｒｅｕ　　　　ｃｐｕｏ　　　　ｏ＋ｕｕ　　　
　ｈ　　　　ｕ　　　　＜　　　　ｈ　　　　ｈ句−＜
　　　ｔｌｌｐ（Ｉａ（ｊ（Ｊ　　　Ｍ（５θ　　ｕｕ
ｔｔ＜’ｕｔ−ｉｕｏ　　　ｘに？　　　＜ＵＣ２＜（
Ｊｕ　　　ｈ　　　＜　　　ｈ　　　ｈ　　　ｈ表■の
下記特徴は顕著である。配列の５′末端には、ポリＧｃ
ＤＮＡリンカー配列に相当する塩基が示されている。次
いで約５個の塩基（“Ｎ　ＩＴと表示されている）が存
在するが、その配列は前にある多数のＧのためにサンガ
ーらの方法によっては容易に明確に決定することができ
なかった。

その後の配列は、ポリペプチドのリーダー配列と推定さ
れる部分をコードする１２個のコドンを表わす。例１に
記載されたｈｐＧ−Ｃ８Ｆ天然単離物のアミノ末端配列
との対応により、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆの推定的“成熟”型に
おける最初のスレオニン残基は＋１で示されている。成
熟ｈｐＧ−Ｃ８Ｆは、示された如り１７４個の残基を有
することがその後足された。“停止”コドン（ＯＰコド
ン、ＴＧＡ）の後に、約８５６塩基の非翻訳３′配列及
びポリＡ″゛尾部パの多数のＡが続く。唯一のＨＯｉＡ
Ｉ及びＡＤａＩ制限エンドヌクレアーピ認識部位、並び
に２つの５ｔｕＩ部位（原核及び真核細胞発現系の組立
てに関して以下で説明されている）も表■に示されてい
る。ポリペプヂド中におけるアスパラギン残基の欠損の
ため、Ｎ−グリコジル化のための明確な部位は存在しな
い。３′非翻訳配列末端近くで下線が引かれた６個のＭ
Ａ基は、潜在的ポリアデニル化部位を表わす。

合計４５０，０００個のクローンの中から上記ハイブリ
ッド形成操作により同定された２つの他のｃＤＮ△クロ
ーンの各々が、転写開始部位以降の全リーダー配列をコ
ードするＤＮＡを含有していなかったことは、注目に値
する。なるほど、３つすべてのｈｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆクロー
ンは正確に同一部位の５′領域で集結しており、このこ
とは転写されたｍＲＮＡの二次構造がこの部位より先の
ｃＤＮΔ形成を著しく阻害することを示唆している。実
際には、したがって、オカヤマら、モレキ。

ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、第３巻、第
２８０〜２８９頁、１９８３年（Ｏｋａｙａｍａ、　ｅ
ｔ　ａＭｏｌ、　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、、
　　３．２８０−２８９　（１９８３））に記載され、
しかもウオンら、サイエンス、第２２８巻、第８１０〜
８１４頁、１９８５年（Ｗｏｎｔ、　ｅｔａｔ、、　　
５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．８１０−８１４　（１９
８５））においてＧＭ−Ｃ８Ｆを単離するために現実に
利用されたｃＤＮＡ発現スクリーニングは、ｈｐＧ−Ｃ
３Ｆ　　ＤＮＡの単離に簡単に利用することができなか
ったが、その理由は、かかる単離系が通常被験クローン
中における全長のＣＤＮＡ転写体の存否に依存している
からである。

上記配列は、微生物宿主におけるｈｐＧＣ８Ｆの直接的
発現を確実化するには、困難である。かかる発現を確実
にするためｈ　ｐＧ　−Ｃ８Ｆコード領域には開始ＡＴ
Ｇコドンを加えるべきであり、しかもその配列は適切な
プロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列の制御下にあ
る部位で形質転換ベクター中に挿入されるべきである。

例　　　　５ この例では、前記例で単離されるようなｈｐＧＣ８Ｆコ
ードｃＤＮＡを用いてゲノムクローンをスクリーニング
した。λファージヒト胎児肝ゲノムライブラリー〔ロー
ンら、セル、第１５巻、第１１５７〜１１７４頁、１９
７８年（Ｌ　ａｗｎ　　ｅｔ　ａｔ、　　　Ｃｅ１１１
５、１１５７−１１７４　（１９７８））の操作に従い
製造され、ティー・マニアティス（Ｔ　、　Ｍ　ａｎｉ
ａｔｉｓ）から入手した〕を、ＨａｉＡＩ及び３ｔｕＩ
で切断単離された２つのｈｐＧ−Ｃ８Ｆ　　ｃＤＮＡ断
片（Ｈｃ＋ｉＡＩ〜Ｓｔｕ■、６４９塩基対；　Ｓ　ｔ
ｕＩ　〜Ｓ　ｔｕＩ、６３９塩基対）からなるニック（
ｎｉｃｋ）翻訳プローブを用いてスクリーニングした。

合計的５００．０００個の７１−ジを１２個のベトリ皿
（１５ＣＩｎ）で培養し、プラークを取出し、ベントン
／デビソン（Ｂ　ｅｎｔｏｎ　／。

Ｄａｖｉｓｏｎ）操作法（ベントンら、サイエンス、第
１９６巻、第１８０頁、１９７７年（Ｂｅｎｔｏｎ、　
ｅｔ　ａｌＳｃｉｅｎｃｅ、　　１９６．１８０　（１
９７７））　）によりプローブとハイブリッド形成させ
た。合計１２個の陽性クローンが観察された。二次スク
リーニングにおけるオートラジオグラフィーで最強シグ
ナルを生じた３個のり凸−ン（１〜３）を、１リツトル
培地中で増殖させ、放射線標識２４１体オリゴヌクレオ
ヂド（γ−Ｐ　　ＡＴＰでキナーゼ処理されている）５
’　ＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＣＡＣＴＧＴ
Ｇ３’　を用いて制限Ｍ素切断及びサザーンプロット法
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎａ）　１．：より
遺伝子地図を作成した。地図作成結果は、単離体１及び
３が同一であって、甲離体２がｈｐＧ−ｃＳＦ３立伝子
の５′に付加した２０００個の塩基を含有することを示
していた。したがって、クローン２を更に特徴づけるた
めに使用した。クローン２のＤＮＡをＥＣ０ＲＩで切断
して８５００塩基対のｈ　ｐＧ　−Ｃ８Ｆ含有断片を得
、これを次いでＩ）　Ｂ　Ｒ３２２に組込んでサブクロ
ーニングし、更に制限エンドヌクレアーゼ切断、サザー
ンプロット法、Ｍ１３サブクロニング及び配列決定によ
り遺伝子地図を作成した。得られた配列は■に示された
とおりである。

１ＩＤＧ−Ｃ８Ｆ３１伝子を含有するゲノムＤＮＡの制
限エンドヌクレアーゼ地図（約３．４キロ塩基対）は図
１で詳細に記されている。図１で示された制限エンドヌ
クレアーぜは、ＮＣ０Ｉ　、　Ｎ　：　Ｐｓｔｌ、Ｐ　
；　ＢａｍＨｌ、Ｂ　：Ａｐａｌ、Ａ　：Ｘｈｏｌ、Ｘ
　：及びＫｐｎ、にである。図の下方の矢印は、ゲノム
配列を得るために利用される配列決定方法を示す。

ボックス領域はＣＤＮＡクローン中の領域であり、点線
の端部ボックスはｃＤＮＡりＯ−ン中に存在しないもの
のｍＲＮＡプロット法により同定された配列を表わす。

エキソン配列たるコード配列の同定をノーザン（Ｎｏｒ
ｔｈｅｒｎ）プロット法により実施した。エキソン１及
び２における推定的スプライス部位にまたがる２４３体
オリゴヌクレオチドプローブ、５’　ＣＡＧＣＡＧＣＴ
ＧＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＴ３’　を、ノーサン
プロット法でｈｐＧ−Ｃ３Ｆ　　ｍＲＮＡとハイブリッ
ド形成させた。得たプロットは、エキソン２のオリゴヌ
クレオチドプローブの場合と同様のサイズ（ｌＧ５０塩
基対以下）のｍＲＮＡを示す。このデータは、表■で示
されるＭｅｔ開始コドンを用いたｐｓＶＧＭ−Ｐｐｏ１
ベクター（例９）によるｈｐＧ−Ｃ８Ｆの直接的発現能
と一緒に考え合わされた場合に、エキソン１に含有され
るコード配列を規定する。

エキソン２〜５は、ｈ　ｐＧ　−Ｃ８Ｆ遺伝子（表■）
のＣＤＮＡクローン（Ｐｐｏ２）において得られるコー
ド配列により規定される。

例　　　　に の例は、ｈｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆをコードしかつ大腸菌優先コ
ドンを含有する人工遺伝子の製造に関する。

簡漂に述べると、用いられたプロトコールは、全般的に
、参考のため本明細書に包含される共有権者７／Ｌ、ト
ン（Ａｌｔｏｎ）らのＰＣＴ公聞第ＷＯ。

８３／　０４０５３号明細書の開示に示されているとお
りであった。遺伝子は、成分オリゴヌクレオチドが多数
の二重鎖にまず集合するように考えられ、二重鎖は次い
で３つの別個のセクションにまとめられた。これらセク
ションは簡易な増幅用として考えられ、増幅系から除去
された後に、適切な発現ベクター中に連続的に又は多数
の断片結合を介してまとめることができた。

セクションＩ、ＩＦ及び■の構造は表ＩＸ−・Ｘ■に示
されている。表■及びＸに示されたセクションエの構造
において、オリゴヌクレオチド１〜１４は７本の二重鎖
（１及び８；２及び９；３及び１０：４及び１１：５及
び１２：６及び１３ニア及び１４）にまとめられた。７
本の二ｆｆ１ｌを次いで結合し、表Ｘに示されるセクシ
ョン■を形成した。表Ｘにおいて、セクションエは増幅
・発現ベクターとの結合及びセクション■との結合のた
めに用いられる上流ＸｂａＩ付着端及び下流ＢａｍＨＩ
付着端を含有することにも着目されるであろう。

表■ ＥＣｈｐＧ−Ｃ３ＦＤＮＡセクション１ＧＡＴＣＣＣＡ
ＪＧＡＧλＡ’ｆ’ＧＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴ表ＸＩ及び
Ｘ■に示されるセクション■の構造において、オリゴヌ
クレオチド１５〜３０は８本の二重鎖（１５及び２３；
１６及び２４；１７及び２５：１ｇ及び２６：１９及び
２７　；　２０及び２８；２１及び２９　；　２２及び
３０）にまとめられた。これら８本の二重鎖を次いで結
合し、表Ｘ■に示されるセクション■を形成した。

表Ｘ■で更に示されるように、セクション■は増幅ベク
ターとの結合及びセクション■との結合のために用いら
れる上流Ｂａ１ｌｌＨＩ付着端及び下流ＥｃｏＲＩ付着
端を有する。その下流端部近くでは、セクション■は最
後の結合セクション■及び■に用いられる下流３Ｓｔ工
部位も有している。

表ＸＩ ＥＣｈｐＧ−Ｃ５ＦＤＮＡセクシヨン■最後に、セクシ
ョン■は表ＸＩ及びＸＩＶに示されているように組立て
られた。この組立てのために、オリゴヌクレオチド３１
〜４２は６本の二重鎖（３１及び３７：３２及び３８；
３３及び３９；３４及び４０：３５及び４１　：　３６
及び４２）にまとめられた。６本の二重鎖を次いで結合
し、表Ｘ　［Ｖに示されるセクション■を形成した。表
ＸｒＶでも示されているように、セクション■は、増幅
ベクター、及び少なくともＥＣ０ＲＩ末端の場合には発
現ベクターとの結合のために用いられる１流ＢａｍＨＩ
Ｎ着端及び下流ＥＣ０ＲＩ付着端を含有する。しかもセ
クション■は、セクション■及び■の最終的結合に用い
られる上流５ＳｔＩ部位を有している。

表Ｘ■ ＥＣｈｐＧ−ＣＳＦＤＮＡセクション■ＭＴＴＣＴＡＴ
ＴＡＣＧＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＡＣＧセクション
■で形成されたＸｂａ■〜ＢａｍＨＩ断片を、ＸｂａＩ
及びＢａ１ｌｌＨＩで開環されたＭ　１３ｍｐ１１ファ
ージベクターに結合する。ベクターを次いで３ａｍｌ−
ＩＩ及びＥＣ０ＲＩで切断することにより再開環し、次
いでセクション■で形成された３ａｍＨＩ〜ＥＣ０ＲＩ
断片と結合する。この段階で、セクション■及び■は適
切な方向で結合された。次いで別０）　Ｍ　１３ｍｐ１
１ベクターをＢａｍＨＩ〜ＥＣＯＲＩ切断で開環し、し
かる後セクション■で形成された３ａｍＨＩ　〜Ｅｃｏ
ＲＩ断片と結合した。

セクション■及び■含有ベクターをＸｂａＩ及び５Ｓｔ
Ｉで切断する。同様に、セクション■含有ベクターを３
ｓｔ■及びＥｃｏＲＩで切断する。各々の切断で得る２
つの断片のうち小断片の両方を、事前にＸｂａＩ及びＥ
Ｃ０ＲＩで開環されたプラスミド１）ＣＦＭ１１５６に
結合する。この反応の生成物は表Ｘｖに示される連続Ｄ
ＮＡ配列含有の発現プラスミドであって、そのＤＮＡ配
列は大腸菌翻訳開始用のアミン末端メチオニンコドン（
ＡＴＧ）をもつ完全ｈｐＧ−Ｃ８Ｆポリペプチドをコー
ドしている。

りｌζ １．ＩＱ ＜Ｑ Ｐ４＜　　　　：１口 ｌａ！−＋　　　　　ａ＋ｌ−＋ ＞Ｃ！＋　　　　ｔＪｃＪ いずれの適切なベクターもこのＤＮＡ発現のために使用
することができるが、発現プラスミドｐＣＦＭ１１５６
はプラスミドｐＣＦＭ８３６から容易に組立てることが
でき、その構造は公開欧州特許出願第１３６．４９０号
明細書に記載されている１）ＣＦＭ８３６をまずＮｄｅ
Ｉで切断し、次いで両方に存在するＮｄｅＩ部位が破壊
されるようにＰｏｌｌでプラント末端化する。次いで、
ベクターをＣ１ａ工及び５ａｃｌＩで切断して、存在す
るポリリンカーを除去し、しかる後表ＸＶＩに示される
代替ポリリンカーに結合する。この代替ポリリンカーは
、前記アルドンらの操作に従い組立てることができる。

なお、プラスミドρＣＦ　Ｍ　８３６は、ＯＣＦ　Ｍ　
７３６（後述）をＢａ１ｌｌＨＩで切断し、下記の断片
を挿入することによって１ｑられる。

ＢａｍＨＩ　５ｓｔｌｌ　　　　　　　ＢａｍＨＩ３°
−ＧＡＴＣＣＧＣＧＧＡＴＡＡＡＴＡＡＧＴＡＡＣ−３
’３−　　　ＧＣＧＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＧＣ
Ｔ＾Ｇ−５′発現ｐ　ＣＦ　Ｍ　１１５６ブラスミドに
おける発現制御はλＰ、プロモーターによるが、これ自
体が（大腸菌株に１２ΔＨｔｒｐから得られるような）
Ｃリブレツサー遺伝子の制御下にある。

例　　　　７ この例は、（Ｍｅｔ”）ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ：＋−ＦＤＮＡ
配列によるＭｌＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドの大腸菌発現に
関する。使用された配列は、部分的に合成で、部分的に
ＣＤＮＡ由来であった。使用された合成配列は大腸菌優
先コドンであった。

表■に示されたｈｐＧ−Ｃ８Ｆ遺伝子含有プラスミドＰ
ｐｏ２をＨａｉＡＩ及びＳｔｕ工で切断して、約６４５
塩基対の断片を得たが、この断片は５′末端の７個のリ
ーダー配列残基コドン及び３′非コード領域の約１００
１ｇ基対をもつ（表■に示されるような）成熟ｈｐＧ−
Ｃ８Ｆ遺伝子を含有していた。Ｈｇ１ＡＩ切断ではＰｓ
ｔＩ切断の場合と同一の５′の４塩基付着端を残し、Ｓ
ｔｕ工ではプラント末端を残す。これにより、ＰｓｔＩ
及びプラント末端形成制限酵素Ｈｉｎｃ　ＩＩで切断さ
れたＭ　１３ｍｐ８（Ｒｆ）に断片を容易に挿入するこ
とができる。Ｍ。

１３中で増幅させた後、ＭＧ−Ｃ３Ｆ　　ＤＮＡをＡｐ
ａＩ及びＢａｍＨＩで切断することにより摘出したが、
これはそれぞれｈｐＧ−Ｃ８Ｆにおける＋３〜＋５残基
コドン間にまたがるＡｐａＩ部位、及びＭ　１３ｍｐ８
制限ポリリンカーにおける）−１ｉｎｃ　ｌ［部位の°
゛下流″のＢａｍＨＩ部位において切断されたものであ
る。ｈ　ｐＧ　−Ｃ８Ｆポリペプチドの大腸菌発現を可
能にするため、合成断片を下記衣Ｘ■に示されるように
製造した。

表Ｘ■ ｂａＩ 表ＸＶ［の分析から調べ得るように、リンカ−は、ＡＩ
）ａＩ付着端、ｈｌ）Ｇ−Ｃ８Ｆ７ミ／末端ノ最初の３
個の残基を特定するコドン（上記Ｍ１３ＤＮＡのＡＩ）
ａＩ消化で削除されたＴｈｒｌ、　Ｐｒｏ２しｅｕ３指
定コドンを回復させ、かつ大腸菌中で優先的に発現する
コドンを採用）、翻訳開始ＡＩＧ、リポソーム結合部位
を付与する２４塩基対配列、及びＸｂａＩ付着端を有し
ている。

大腸菌発現用に使用される発現ベクターは、１９８５年
４月１０日に公開されたモリス（Ｍｏｒｒ＋ｓ　）の欧
州特許出願第１３６．４９０号明細書においてｐＣＦＭ
５３６として記載されたベクターである（更に、ｐＣＦ
Ｍ５３６含有の大腸菌ＪＩＶ１１０３．ブタペスト条約
に基づく寄託における受託番号、Ａ　Ｔ　ＣＣ３９９３
４参照）。簡単にいえば、まずプラスミドｐＣＦＭ５３
ＧをＸｂａ工及びＢａ１ｌｌＨＩで切断した。上記ｈｐ
Ｇ−Ｃ３Ｆ断片（Ａ　ｐａＩ　／　１３　ａｍｌ−１゜
■）及びリンカ−（ＸｂａＩ／ＡｐａＩ）を次イテそれ
に結合し、プラスミドｐ５３６　Ｐｐｏ２を形成した。

プラスミドｐ５３６　Ｐｐｏ２を、Ｃ１８５□選伝子含
有プラスミドｐＭＷ１　（ブタベスト条約に基づく寄託
における受託番号、Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ、３９９３３）で
予め形質転換された大腸菌ＡＭ　７株の７７一ジ耐性変
異体に組込んだ。形質転換は、ｐＣＦＭ５３６前駆体プ
ラスミドに担持された抗生物１ｉ（ａｍｐ）耐性マーカ
ー遺伝子に基づき確認した。ＬＢブロス（アンピシリン
５０μｇ／ｒｎｌ）中での細胞培養物を２８℃に維持し
、Ａ　　　＝０．５の培養細胞Ｊ？ｉ殖時において培養
物を温度４２℃に３時間上げて、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ発現を
銹導した。培養物の最終ＯＤはＡ６ｏｏ＝１．２であツ
タ。

形質転換細胞（よるｈｐＧ−Ｃ８Ｆ発現レベルは、クマ
シーブルー色素で染色されたＳＤＳポリアクリルアミド
ゲルにより、総細胞タンパク質３〜５％と評価された。

細胞をＪ　Ｓ　−４，２０−ター中３５００ｘりで１０
分間遠心分離して回収した。水中２５％（Ｗ／Ｖ）の細
胞をフレンチ・プレッシャー・セル（Ｆ　ｒｅｎｃｈＰ
ｒｅｓｓｕｒｅ　Ｃｅ１ｌ）にｉｏ、ｏｏｏｐｓｉ　　
（７００ｈ／ｃｎ）で３回通して破壊した。破壊細胞懸
濁液をＪＡ−２０ローター中１０，０００ｘ　ｇで１５
分間遠心分離した。ベレットを水に再懸濁し、ｐＨ８，
７の１％ラウリン酸５０ｍＨトリス中に総タンパク質濃
度約５ｍ９／ｒｄで溶解さヒた。溶解ベレット物質を１
５，０ＯＯｘ　ｇで１０分間遠心分離し、上澄にＣａＳ
Ｏ３を２０　ｍ　Ｎまで加えた。１時間後、この試料を
、例１（Ｂ）の操作に従い精製するため、容量及び濃度
を調整して、Ｃ４ＨＰＬＣカラムに充填した。

非有曙物含有緩衝液中で調製された更に多ｍのｈｐＧ−
Ｃ３Ｆを得るために第二の精製法が開発された。この物
質はイン・ビボ研究に適する。細。

胞ペースト　１５０９を１ｍＨＤＴＴ約６００ｄに再懸
濁し、約７０００ｐｓｉ　（４９（Ｈ！９／ＣＩｉ＞で
マントン・グアリン（Ｍａｎｔｏｎ　Ｇｕａｌｉｎ）ホ
モジナイザーに４回通した。破１［胞懸濁液を１０，０
ＯＯＸ　ｇで３０分間遠心分離し、ベレットを１％デオ
キシコール酸、５ｍＨＥＤＴＡ、５ｍＨＤＴＴ及び５０
ｍＨｌ−リスのｐＨ９の４００　ｄに再懸濁した。この
懸濁液を室温で３０分間混合し、１０，０ＯＯＸ　’ｊ
で３０分間遠心分離した。ベレットを水約４００ｍに再
懸濁し、ｉｏ、ｏｏｏｘ　ｙで３０分間遠心分離した。

ベレットを２％ザルコシル及び５０ｍＨ’ｔ−リスｐＨ
８の１００ｄに溶解した。ｃＵＳ０４を２０μＨまで加
え、混合物を室温で１６時間攪拌し、しかる後、２０，
０ＯＯＸ　’Ｊで３０分間遠心分離した。上澄にアセト
ン３００ｄを加えた。この混合物を氷上に２０分間おき
、しかる後５０００Ｘ　９で３０分間遠心分離した。ベ
レットをｐＨ４の６Ｍグアニジン及び４０ｍ）ｌ酢酸ブ
トリウムの２５０−に溶解し、平衡化された１２００ｍ
１のＧ−２５カラムに充填し、ｐＨ５，４の２０ｍＨ酢
酸ナトリウムで操作した。ｈｐＧ−Ｃ８Ｆビーク（約４
００ｒｄ　”）をプールし、ｐＨ５，４の２０ｍＨ酢酸
ナトリウムで平衡化された１、５ｄの０Ｍセルロースカ
ラムに加えた。充填後、カラムを６０ｄのｐＨ５，４の
２０　ｍ　Ｎ酢酸ナトリウム及び２５ｍ）Ｉ塩化ナナト
リウム洗浄し、しかる後カラムを２０１Ｊｄの１）１１
５．４の２０ｍＨ酢酸ナトリ°ウム及び３７ｍＨ塩化ナ
トリウムで溶出させた。この溶出液１５０ｄを１０ｄに
濃縮し、平衡化された３００ｄのＧ−７５カラムに充填
し、ｐｔ＋ｓ、４の２゜ＩＩＨ酢酸ナトリウム及び１０
０ｍＨＪｆｆｉ化ナトリウムで操作した。ピーク画分３
５−をプールし、フィルター滅菌した。ｈ　ｏＧ　−Ｃ
３Ｆの最終濃度は１．５〃ヴ／ｄであったが、ゲル分析
で測定した場合純度９５％以上であり、ｈ　ｐＧ　−Ｃ
８Ｆ　０．５ｍ’Ｊニツキ発熱性物質を０．５ｎｇ以下
で含有していた。発熱性物質レベルは、カブトガニ遊走
細胞溶離物（ＬＡＬ）試。

験キット〔エム・ニー・バイオプロダクツ（Ｍ。

Ａ　、３１ｏｐｒｏｄｕｃｔＳ）　、ウォーカースピル
、メリーランド〕により測定した。

例　　　　８ この例は、１７．３６．４２．６４及び７４位に存在す
るシスティン残基が各々適切なアミノ酸残基で置換され
たｈｐＧ−Ｃ８Ｆ類縁体を産生ずる組換え方法の利用に
関する。

１９８５年２月２８日に公開されたスー’Ｊ”（Ｓｏｕ
ｚａ）らの公開ＰＣＴ出願第Ｗ　Ｏ８５１００８１７号
明細書の特定部位突然変異誘発は、下記衣Ｘ■に示され
た大きさが２０〜２３塩基の合成オリゴヌクレオチドを
用イテ、下記プラスミドｐ５３６　ＰｐＯ２の（Ｍ　ｅ
ｔ−１）コードＤＮＡ上で行なわれた。オリゴヌクレオ
チド１は（Ｓｅｒ１７）ｈｌ）Ｇ−Ｃ３Ｆコード遺伝子
の形成が可能で、オリゴヌクレオチド２は〔５ｅｒ３６
〕ｈ　ｐＧ　−Ｃ８Ｆの形成が可能であった。

オリゴヌク レオチド 表Ｘ■ 配　　　　列 ５’−ＣＴＧ　ＣＴＣＡＡＧ　ＴＣＣＴＴＡ　ＧＡＧ　
ＣＡＡ　ＧＴ−３’５’−ＧＡＧ菖Ｇ　ＣＴＧτＣ’ｓ
’　ＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡ−３’５’−ＴＡＣＭＧ　Ｃ
ＴＧ　ＴＣＣＣＡＣＣＣＣＧＡＧ−３’５’−ＴＧＡ　
　ＧＣＡ　　ＧＣＴ　　ＣＣＣＣＣＡ　　ＧＣＣＡＧ−
３１５’−ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＧＣＴＣＣＴ’ｒＧ　Ａ
ＧＣＣＡＡ−３’ＣｙｓからＳｅｒへの限定的突然変異
誘発は、ＭＷとＬＴｐ５３６　Ｐｐｏ２がら＊ｉされた
ＸｂａＩＢａｍＨＩ　　ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ断片含有のＭ　
１３＋ｎｐｌＯを用いて実施した。ｃｙｓ−ｓｅｐ置換
体含有の各Ｍ　１３ｍｐ１０山来のＤＮＡをｘｂａ工及
びＢａｍＨＩで処理した。得た断片を発現ベクターｐＣ
Ｆ　Ｍ　７４６に組込んでクローニングし、発現産物を
ＰＡ７のよう。

に単離した。

プラスミドｐＣＦ　Ｍ　７４６は、１９８５年２月２８
日に公開されたモリス（ｌｙｌ　ｏｒｒｉｓ）の公開Ｐ
ＣＴ出願第Ｗ　Ｏ８５１００８２９号明細書に記載され
ているように、Ｃ１ａ工及びＢａｍＨＩでプラスミドｐ
ＣＦ　Ｍ　７３６を切断し、存在するポリリンカーを除
去し、下記ポリリンカーで置換することにより組立てる
ことができる。

表ＸＩＸ なお、ｐＣＦＭ７３６は、ｐＣＦ　Ｍ　５３’６（ΔＴ
ＣＣ３９９３４）から、次の手順によりＩ）ＣＦＭ１３
３（ｉを経由し、組立てることができる。まず、ｐＣＦ
Ｍ５３ＧをＥＣｏＲＩ部分的切断及びＳｓｔ工切断する
ことにより、アンピシリン耐性遺伝子配列及び安定化配
列（ｐａｒ）を欠失させた後、ＥＣｏＲＩ部位は、リン
カ−によってＡａｔＩＩ部位に変換する。一方、プラス
ミドＴｎ５（Ｂｅｃｋ等のＧｅｎｅ、　１９．　ｐ　３
２７−３３６（１９８２）あるいはＡＵｅｒＳＷａｌｄ
等のＣｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、
Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、、４５　ｐ１０７−１１３　（
１９８１）に全塩基配列が示されている。）から、カナ
マイシン耐性遺伝子配列を含むＳｍａ工／　Ｈｉｎｄ　
ｍ断片領域を、ＳＳ【ニリンカーを３ｍａ工粘着末端に
、且つＮｄｅｌニリンカーを＠　ｉｎｄ　Ｉ［Ｉ粘着末
端に付加することにより、Ｓ　ｓｔｌ　／　Ｎ　ｄｅＩ
断片として得る。また、１）ＳＣ１０１’（受託番号、
ＡＴＣＣ３７０３２）から、ｐａｒ　４伝子を含むＨｉ
ｎｃ　ＩＩ　／ΔｖａＩ断片領域を、Ｈ＋ｎｃ　ｆｆ部
位は最初に３ａｌニリンカーで次いでＡａｔＩＩリンカ
−で処即し、また、ＡＶａ■部位は最初にＢａｍＨＩリ
ンカ−で次いでＮｄ○ニリンカーで処理し、ＡａｔＩＩ
／ＮｄｅＩ断片として得る。

１）　ＣＦ　Ｍ　５３６の大きな断片（Ａａｔ［／５Ｓ
ｔＩ　）、カナマイシン耐性遺伝子の断片（ＳｓｔＩ／
ＮｄｃＩ）ａよびｐａｒｉ伝子断片（ＡａｔＩ［／Ｎｄ
ｅＩ）を混じ合わせて結合し、ｐＣＦＭ６３６が得られ
る。

ｐＣＦ　Ｍ　６３６をＡａｔＩ［及びＸｂａＩにより切
断後、下記のＡａｔ■からＸｂａＩまでの断片を挿入し
、ｐＣＦ　Ｍ　７３６を得る。

ＡａｔＩ１ 本発明のＣｙｓ−８ｅｐ（ＣｙＳからＳｅｐへの）類縁
体の精製操作において、細胞ペースト約１０〜１５ｇを
１　ｍＨＤ　Ｔ　７４０ｍに再懸濁し、フレンチ・プレ
ッシャー・セルに１０，０ＯＯｐｓｉ　（７００に’ｌ
／ｃｉ）で３回通した。破壊ｍ胞懸濁液を１００ＯＸ　
７で３０分間遠心分離した。ベレットをｐ１１９の１％
Ｄ　ＯＣ、５ｍＨＥＤ下Ａ、　　５ｍＨＤＴＴ、　５０
ｍ）Ｉトリスに再懸濁し、空温で３０分間混合した。混
合物を１０，０００ｘりで３０分間遠心分雛し、８２０
４０ｄに再懸濁し、１０．０ＯＯｘ　ｇで３０分間再遠
心分離した。ベレットをｐ１１８の２％ザルコシル、５
０ｍＨＤＴＴ、　５０ｍＨｔ−リスの１０ｄに溶解した
。１時間混合後、混合物を２０．０ＯＯｘ　９で３０分
間遠心分離して清澄化し、しかる後平衡化された３００
−のＧ−７５カラムに充填し、ｐ１１８の１％プルコシ
ル、５０ｍＨトリスで操作した。

類縁体含有画分をプールし、少なくとも１日間空気にさ
らして空気酸化させた。最終濃度は０．５〜５　ｍ９　
／　ｄの範囲であった。

例　　　　９ この例において、哺乳動物細胞発現系は、ｈｐＧ−Ｃ８
Ｆ　　ＤＮＡの活性ポリペプチド産物が吐乳動物細胞（
ＣＯ８−１，ＡＴＣＣＣＲＬ。

１６５０）中で発現されかつそこから分泌されるか否か
を確認するために、工夫された。この系は、ウオンら、
サイエンス、第２２８巻、第８１０〜８１５　頁、１９
８５年（Ｗｏｎｏ、　　ｅｔ　ａｔ、、　　５ｃｉｅｎ
ｃｅ２２８　、８１０−８１５　（１９８５））及びり
−ら、ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）　、第８２巻、第４
３６０〜４３６４頁、１９８５年（ｌｅｅ、−ｅｔ　ａ
ｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（Ｕ　Ｓ　Ａ　）　、　８
２．４３６０−４３６４（１９８５））におけるヒトＧ
Ｍ−Ｃ３Ｆに届する残基配列を有したリーダーポリペプ
チドの後に位置して（Ａｌａ’　）ｈｐＧ−Ｃ３Ｆをコ
ートする、部分的合成部分的ｃＤＮＡ由来構造体の発現
分泌プロセッシングを介して、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆポリペプ
チド類縁体を分泌させるように考え出された。

本発明のポリベブブド産物の予備的発現研究のために使
用される発現ベクターは、ウィルス性プロモーター／レ
ギュレーターＤＮＡ配列の制御下で挿入外来性ＤＮＡを
吐乳動物細胞発現すると共に浦乳動物細胞及び大腸菌の
双方において自律複製するように考え出されたｌ）　Ｂ
　Ｒ３２２及び５Ｖ４０ＤＮＡの双方を組込んでいる゛
′ラシャル（５ｌＩＵｔｔ　Ｉｅ）”ベクターであった
。大腸菌Ｈ８１０１に担持されたこのベクターｐＳＶＤ
Ｍ　−１９Ｌ、ｔ１９８５年８月２３日にアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パーク
ローン・ドライブ、ロックビル、メリーランドにブタベ
スト条約に基づいて寄託され、受託番号ＡＴＣＣ第５３
２４１号が付された。

発現ベクター組立てに必要な具体的操作は下記のとおり
であった。リーダーコードＤＮＡ配グ１を下記表ＸＸに
示したように合成した。

表　ＸＸ ＝１７ ＲｌｎｄＩＩＩ　　　　　　　　　　　ＭＣヒ　Ｔｒｐ
５’　　−Ａ　ＧＣＴ　ＴＣＣＭＣＡＣＣＡＴＧ　ＴＧ
Ｇコ’　　−ＡＧＧ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＴＡＣＡＣＣＬ
ｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ＶａｌＣＴＧ　　ＣＡＧ　　ＡＧ
ＣＣＴＧ　　ＣＴＧ　　ＣＴＣＴＴＧ　　ＧＧＣＡＣＴ
　ＧＴＧＧＡＣＧＴＣＴＣＧ　　ＧＡＣＧＡＣＧＡＧ　
　ＡＡＣＣＣＧ　　ＴＧＡ　　ＣＡＣ−１千１ Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｓｅｅ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌｉ　Ｐ
ｒｏ　ＬｅｕＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴ　　ＧＣ
Ａ　　ＣＣＣＣＴＧ　　ＧＧＣＧ　　−３’ＣＧＧ　　
ＡＣＧ　　ＴＣＧ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＣＧＴ　ＧＧＧ　
ＧＡＣ〒５′担四工 表ＸＸに示されているように、配列は、Ｈｉｎｄｌ及び
ＡｐａＩ付’４’ｆａ、及びヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの゛′リ
ーダーパに屈する１７飼のアミノ酸残基のコドンを有し
ている。アラニン残基、プロリン残り及びロイシン残す
を特定するコドンが続いＣいる。

プロリン及びロイシン残基はｈｐＧ−Ｃ３Ｆの＋２及び
１３位に存在するアミノ酸の？！２製で、一方アラニン
残基はＭ）Ｇ−Ｃ８Ｆ以外のＧＭ−Ｃ３Ｆの開始アミノ
末端（＋１）残基の複製である。スレオニンのアラニン
による置換は、ＧＭ−Ｃ８Ｆ分泌プロセッシングに通常
伴う細胞メカニズムによるＧＭ−Ｃ８Ｆリーダーの適切
な宿主細胞“プロセッシング・オフ（ｐｒｏｃｅｓｓｉ
ｎｇ　ｏＮ）”を促進させるために考え出された。

プラスミドｐＳＶＤＭ−１９をＫｌ］ｎＩテ切断し、そ
の部位をフレノウ酵素でプラント末端化した。次いでＤ
ＮＡを）（ｉｎｄｌ［ｌで切断した。得られる大断片を
表■に示されるＨ　ｉｎｄ　ｍ／　ＰＶＬＩＩＩ断片（
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片及びｐｖｕ［での部分的切断から
得る２番目に大ぎな断片としＣプラスミドＰｐｏ２から
単離された）と混合して結合し、プラスミドｐＳＶ−Ｐ
ＤＯ１を形成した。表ＸＸの人工ＧＭＣ３Ｆリーダー配
列断片を次いで（Ｈｉｎｄ　■及びＡｐａＩで切断後の
）　ｐｓｖ　−Ｐｐｏｌ　ニ結合し、プラスミドｐＳＶ
ＧＭ−ＰＤＯ１を得た。

プラスミドｐｓＶＧＭ−ＰｐｏＩ　ＤＮＡのリン酸カル
シウム沈降物（１〜５μ８）を、ウィグラーら、セル、
第１４巻、第１２５〜１３１頁、１９７８年（Ｗｉｇｌ
ｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、　　１４．７２５−
７３１　（１９７８））に実質的に記載されているよう
なＣＯ３−１細胞の２個の６０ｍプレートに組込んだ。

コントロールトシテ、７５ス−：ドｐｓＶＤＭ−１９も
ＣＯ３−１細胞に組込んだ。組織培養上澄を形質転換後
５８目に回収し、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ活性について試験した
。培養上澄からの（Ａｌａｌ）ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ収ヱは、
１〜２．５μ９／ｍｆｌであった。

ｃｏｓ　−ｉ細胞における（Ａｌａ’）ｈｐＧＣ３Ｆ産
物コードプラスミドｐＳＶＧＭ−Ｐｐｏｌの上首尾な発
現の後、ヒトＧ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆリーダー配列を含む一
方で、スレオニン残基（ｈｐＧ−Ｃ８Ｆの１位に元来存
在する）のコドンをその位置のアラニンのコドンに代わ
って有する他のベクターを組立てた。簡単に言えば、オ
リゴヌクレオチドが特定部位の突然変異誘発（ＳＤＭ）
用に合成された（５’　ＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣ
ＣＴＣＴＧＧＧ）。ｐＳＶＧＭ−Ｐｔ＋ｏ１におけるＨ
ｉｎｄｌ［［−ＢａｍＨＩ　　ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ断片をＳ
ＤＭ用にＭ　１３ｍｐｌＯと結合した。１位にＴｈｒコ
ドンを有する新規合成ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ遺伝子をＨｉｎｄ
　Ｉ［［及びＥＣＯＲ工で切断して単離した。断片を次
いで、同一の２つの制限エンドヌクレアーゼによる切断
から得られたｐＳＶＤＭ−１９に組込んで複製した。

得られるベクターｐｓＶＧＭ　−Ｐｐｏ（Ｔｈｒ）をＣ
ｏＳ細胞に組込んで形質転換したが、培養上澄中で測定
されるｈｐａ−ｃｓ＋”の収量は１〜５μ７／ｄの範囲
であった。

最後に、単離法が例５に記載されているゲノム配列を用
いて、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆの哺乳動物細胞発現用の発現ベク
ターを形成した。更に詳しくは、。

ｐＳＶＤＭ−１９をＫｐｎＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ　テ
切断し、大断片を表ＸＸＩに示されるＨｉｎｃ　Ｉｌｌ
及びＮｃｏＩ粘着端粘着金含有合成リンカ囲者結合に使
用した。

エキラン１含有ＮｃｏＩ　−ＢａｍＨＩ断片はｐＢＲ３
２２（８５００ｈ　ｌ）　Ｇ　−ＣＳ　Ｆゲノムサブク
ローン）かう１１１１Ｌ、エキラン２〜５含有ＢａｍＨ
Ｉ　−ＫｐｎＩ断片はプラスミドｐＢＲ３２２（８５０
０ｈ　ｐＧ　−Ｃ８Ｆゲノムサブクローン）から単離し
た。得られる哺乳動物発現ベクターｐＳＶ／ＱｈＧ−Ｃ
８Ｆは形質転換ｃｏｓｉ胞から１−２．５Ｈｇ／ｒｄの
ｈｃｌＧＣ３Ｆを産生した。

表ＸＸＩ Ｎｅｏ工 例　　　　１０ この例は、本発明の組換えポリペプチド産物の物理的及
び生物学的性質に関する。

１、分子量 例７における大腸菌発現の組換えｈｐＧ−Ｃ８Ｆ産物は
（表■の演経的アミノ酸分析から予測されるように）還
元ＳＤＳ　−ＰＡＧＥで測定した場合の見掛分子量が１
８．８キロダルトンであったが、一方例１で記載したよ
うにして精製された天然単離体は見社）の分子量が１９
．６キロダル１〜ンであった。天然単離体と会合したＮ
−グリカン類の存在は、表■のｈＤＧ−Ｃ８Ｆ−次配列
中にアスパラギン残基が欠損していることから、実際上
無視することができ、したがって、操作は○−グリカン
類が天然単離体及び非グリコシド組換え産物間の分子Ｍ
差の原因であるか否かを調べられるように工夫した。天
然単離物質約５μ３をノイラミニダーゼ〔カルビオケム
（（：、　ａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ラホラ、カリフォル
ニア）で処理し、試料０．５μ９を取出し、残留物質を
０−グリカナーゼ（エンド−Ｘ−ｎ−アセチルガラクト
ースアミニダーゼ、ジエンザイム（Ｇ　ｅｎｚｙｍｅ）
　、ボストン、マサチューセッツ）　４ｍ１ｌと３７℃
でインキュベートした。一部をインキュベートのｏ、ｓ
、　２及び４時間後に取出した。

これら試料を大腸菌由来組換え物質と並べてＳＤＳ　−
ＰＡＧＥに付した。ノイラミニダーゼ処理後、単離体の
見掛分子量は１９．６キロダルトンから１９．２キＯダ
ル１−ンに変わったが、このことはシアル酸残基の離脱
を示唆する。０−グリカナーゼ処理の２時間後、分子量
は１８．８キロダルトンに変わったが、これは大腸菌由
来物質の見掛分子量と一致する。ノイラミニダーＵ及び
Ｏ−グリカナーゼに対する炭水化物構造体の感受性から
判断すると炭水化物成分として下記構造体が示唆される
：Ｎアセチルノイラミン酸−α（２−６）ガラクトース
β（１−３）　Ｎ−７セチルガラクトサミンーＲ（Ｒは
セリン又はスレオニンである）。

２．３Ｈ−チミジン取込み ヒト骨髄細胞の増殖誘導を３Ｈ−チミジンの取込み増加
に基づき分析した。健康ドナー者のヒト骨髄をフィコー
ル−ハイバック（１”　１ｃｏｌｌＨＶＩ）ａＱｕｅ）
　（１，０７７ｙ／ａ＋ｅ、ファルマシア）による密度
分離に付し、低密度細胞を１０％牛脂児血清及びグルタ
ミンペニシリン・ストレプトマイシン含有のイスコブ培
地（Ｇｉｂｃｏ（ギブコ）〕に懸濁した。次いで、ヒト
骨髄細胞２Ｘ　１０４個を９６個の平底ウェルプレート
中コントロール培地又は例７の組換え大腸菌物質と一緒
に３７℃空気中５％Ｃｏ２で２日間インキュベートした
。試料を一重複して分析したが、濃度は１０，０００倍
以上異なっていた。培養物に次いで３Ｈ−チミジン〔ニ
ュー・イングランド・ヌクレア（Ｎ　ｅｗ　　Ｅ　ｒ＋
ｏｌａｎｄ　　Ｎ　ｕｃｌｅａｒ）、ボスマン、マサチ
ューセッツ〕０，５μＣｉ／ウェルを加えた。３Ｈ−チ
ミジン取込み団をベンチュアら、ブラッド、第６１巻、
第１８１頁、１９８３年（Ｖｅｎｔｕａ、　ｅｔ　ａｌ
、、　　Ｂｌｏｏｄ、　６１．７８１　（１９８３））
に記載されているように測定した。この分析において、
ヒトｈｐＧ−Ｃ８Ｆ単離体は、コントロール上澄よりも
約４〜１０倍高いレベルで、ヒト骨髄細胞中に３Ｈ−チ
ミジンを取込ませることができる。例７の大腸菌由来の
ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ物質も同様の性質を有していた。

２回目のヒト骨髄細胞増殖研究は、例９で製造された形
質転換ＣＯ３−１４！８胞の培養培地を用いて実施され
、同様の結果を与えたが、このことはコードされたポリ
ペプチド産物が活性物質として培地中に実際に分泌され
ることを意味する。

３、ＷＥＨＩ−３Ｂ　　Ｄ＋分化誘導 マウス骨髄単球性白血病細胞ＷＥＨＩ−３８Ｄ＋の分化
を誘＠する組換え大腸菌由来物質の能力を、メトカーフ
、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー
、第２５巻、第２２５巻、１９８０年（Ｍ　ｅｔｃａｌ
ｆ、　　Ｉ　ｎｔ、　　Ｊ　、　　Ｃａｎｃｅｒ、　　
２５゜２２５　（１９８０））に記載されているように
、半固体寒天培地中で分析した。組換えｈｐＧ−Ｃ３Ｆ
産物及び培地コントロールを３０℃空気中５％ｃＯ２で
７日間６０個以下のＷＥＨＩ−３Ｂ　　Ｄ＋細胞／ウェ
ルと一緒にインキュベートした。試料を２４個の平底ウ
ェルプレート中でインキュベートしたが、濃度は２００
０倍以上異なっていた。コロニーを未分化、部分的分化
又は全部分化のコロニーに分類し、コロニー数を顕微鏡
で計測した。大腸菌組換え物質は分化を誘導することが
判明した。

４、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ　−ＧＥＭＭ
分析 多分化能性ヒトＧ−Ｃ８Ｆ　（ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ）の天然
単離体及び組換え多分化能性ヒトＧ−Ｃ３Ｆ　（ｈｐＧ
−Ｃ８Ｆ）は、ヒト骨髄細胞を増殖かつ分化させること
が判明した。これらの活性は、ＣＦＵ−ＧＭ（ブロック
スマイヤーら、エクスベリメンタル・ヘマトロジー、第
５巻、第８７頁、１９７１年（［３ｒｏｘｍｅｙｅｒ、
　ｅｔ　ａｌ、、　　ＥＸｐ、　　Ｈｅｍａｔｏｌ。

５　、８７　（１９７１）　’）　）　、Ｂ　Ｆ　Ｕ　
−Ｅ及びＣＦＵＧＥＭＭ試験法〔ルーら、ブラッド、第
６１巻、第２５０　頁、１９８３年（ＬＬＩ　　ｅｔ　
ａｌ、、　　３１ｏｏｄ　　６１２５０　（１９８３）
）　）により、健庫ヒトボランティアの低密度非付着性
骨髄細胞を用いて測定した。各々ＳＯＯ単位のｈｐＧ−
ｃｓＦ又はｒｈｐＧ−Ｃ８Ｆを用いたＣＦＵ−ＧＭ、Ｂ
ＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ生物学的活性の比較は、
下記表ＸＸ■に示されている。

すべてのコロニー分析は、低密度非付着性骨髄細胞を用
いて実施した。ヒト骨髄細胞をフィコールハイバック（
密度１．０７７ｇ／　ｃｍ　３、ファルマシア）による
密度分離に付した。低密度細胞を次いで牛胎児血清含有
のイスコブ修正ダルベツコ（［）　ｕｌｂｅｃｃｏ）培
地に再懸濁し、ファルコン組織培養［１１（Ｎｏ、３０
０３　、ベクトン・ディケンソン（３ｅｃｔｏｎ　［）
　１ｋｅｎｓｏｎ）コッキーズビル、メリーランド〕上
に付着させるために３７℃で１．５時間入れておいた。

表ＸＸ■ ＣＰＵ−ＧＭ　　　ＢＦＵ−Ｅ　　　　ＣＰＵ−０２Ｍ
Ｍ培地　　　　Ｏ±０　２６±１　０±０天然 ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ　　８３±５．４　８３±６．７４±０
ｒｈｐＧ二Ｃ３Ｐ　　　８７±５　　　　８１±０．１
　　６　±２培地コントロールは、１０％Ｆ　ＣＳ　、
　　０．２ｍＭヘミン及び組換えエリスＯボエチン１単
位含有イスコブ修正ダルベツコ培地であった。

ＣＦＵ−ＧＭ分析の場合では、標的細胞は、補充マツコ
イ（ＭｃＣｏＹ）５Ａ培地及び１０％熱不活化牛脂児血
清を含有する０、３％寒天培地１ｄ中１×１０５個で培
養した。培養７日日、培養物のコロニー（凝集物当たり
細胞数４０以上）について計数し、形態を観察した。コ
ロニー数は、４個の同一プレートから測定される平均±
ＳＥＭとして示されている。

ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ分析の場合では、細胞
（１ｘ１０５）をイスコブ修正ダルベツコ培地〔ギブコ
（Ｇｉｂｃｏ）　）、０．８％メチルセルロース、３０
％牛脂児血清、０．０５ｎＨ２−メルカプトエタノール
、０．２ｍＭヘミン及び組換えエリスロボエチン１単位
の混合物ＩＭ！ｌに加えた。皿を５％ＣＯ２及び５％ｏ
２湿気雰囲気中でインキュベートした。

レミング・バイオインスッルメンツ（Ｒｅｍｉｎｇ３　
ｉｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）　（シラキュース（Ｓ　
ＶｒａＣＣＬＩＳｅ）、ニューヨーク〕の酸素減少器に
より低酸素圧にした。コロニーをインキュベート１４日
後に計測した。

コロニー数は、２個の同一プレートから測定される平均
±ＳＥＭとして示されている。

ＣＦＵ−ＧＭ分析で形成されたコロニーは、すべて、ク
ロロアセテートニステラーｔ＝ｉ性でかつ非特異的エス
テラーゼ（α−ナフチルアセテートエステラーピ）陰性
であることが判明し、顆粒球型のコロニーと一致した。

天然ｈｐＧ−ｃｓ＋”及びｒｈｐＧ−Ｃ８Ｆは双方とも
、ＣＦＵ−ＧＭ分析における連続希釈により分析した場
合、約１×１０８Ｕ／ｍ３純秤タンパク質の特異的活性
を有することが判明した。表ＸＸＩＩのＢＦＵ−Ｅ及び
ＣＦＵ−ＧＥＭＭデータは、３つの別個の実験を表示し
ており、天然ｈｐＧ−Ｃ８Ｆに関し過去に報告されたデ
ータと類似する。ｒｈｐＧ−Ｃ８Ｆが大腸菌中で産生さ
れていることから、極めて純粋でありかつ他の潜在的哺
乳動物成長因子を含有しないことに注目することは重要
である。このように、ｒｈｐＧ−Ｃ８Ｆは、組換えエリ
スロボエチンの存在下で加えられた場合に、混合コロニ
形成（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）及びＢＦＵ、−Ｅを補助する
ことができる。

５、細胞結合試験 ＷＥＨＩ　−３８（Ｄ”　）細胞及び新たに診断された
白血病患者のヒト白血球は　　■−標識マウスＧ−Ｃ３
Ｆに結合するが、この結合は未標識Ｇ−Ｃ３Ｆ又はヒト
Ｃ５Ｆ−βの添加により競合させることができる、と過
去に報告された。ヒト及びマ・クスの白血球に対して　
　（−ｈｐＧＣ３Ｆの結合に競合する天然ｈ　ｐＧ　−
Ｃ３Ｆ及びｒｈｐＧ−Ｃ３Ｆの能力に関し試験した。高
度に精製された天然ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ（純度９５％以上、
１μｇ）がヨウ素化〔デジエト−ら、アナリティカル・
バイオケミストリー、第１２７巻、第１４３頁、１９８
２年（Ｔｅｊｅｄｏｒ、　ａｔ　ａｔ、、　　△ｎａ１
．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ１２７、　１４３　（１９８２）
））され、ゲル濾過及びイオン交換クロマトグラフィー
により反応物から分離された。天然　　１−ＭＧ−Ｃ８
Ｆの比活性は約１００μＣｉ／μ３タンパク質であった
。マウスＷＥＨＩ　−３８（Ｄ”　）及び２種のと１・
末梢血骨髄白面病細胞（Ａ　Ｎ　Ｌ　Ｌ、１つはＭ４、
他はＭ５Ｂとして分類される）を　　Ｔ−ｈｐＧ−Ｃ３
Ｆとの結合能について試験した。

マウス及び新しく　ｔｑたヒトの末梢血骨髄白血病細胞
をＰＢＳ／　１％ＢＳＡで３回洗浄した。

ＷＥＨ＋−３１３（Ｄ”　）細胞（５ｘ　１０６個）又
は新鮮白血病細胞（３Ｘ　１０６個）を、各種濃度（容
吊：１０μＪ）の未標識ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ、ｒｈｐＱ−Ｃ
３Ｆ又はＧＭ−Ｃ８Ｆの存在又は非存在下、及び　　　
Ｉ−ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ（約１００．　ＯＯＯｃｐｍ又は１
ｒ＋ｃ＋）の存在下、ＰＢＳ／　１％Ｂ　Ｓ　Ａ　（１
００μＮ　＞中０℃９０分間２連でインキュベートした
（総容量：１２０μｍ）。細胞を次いで３５０μｍプラ
スチック製遠心管中の氷冷ＦＣ８２００μｐに再＠濁し
て積層し、遠心弁＠　（１０００Ｘ　９　：　１分間）
した。ベレットを管端部切断により集め、ペレット及び
上澄を別々にガンマカウンター〔パラカード（Ｐａｃｋ
ａｒｄ）　）　Ｔ計測シタ。

特異的結合ｆｆ１（ｃｏＩｌｌ）は、競合物の非存在下
における総結合ｆｆ１（２連の平均）−１００倍過剰の
未標識ｈｌ）Ｇ−Ｃ８Ｆの存在下における結合Ｒ（非特
異結合量）　　（ｃｐＩｌｌ）として計算した。非特異
結合量は、最大で、ＷＥ）ｌ　Ｉ　−３８（Ｄ”　）細
胞の場合が２５０３ｃｐｍ　、　ＡＮ　Ｌ、　Ｌ　（Ｍ
４　）の細胞の場合が１１０７２ｃｐ　、　ＡＮＬＬ　
（Ｍ２Ｓ）細胞の場合が１１２５ｃｐｍであった。実験
１及び２は同一の　　ＩｈｐＧ−Ｃ８Ｆ調製物を用いて
異なる日に実施したが、ｈｌ）Ｇ−Ｃ８Ｆ２０００単位
の場合の阻害率においては内部的一貫性を示す、ｍられ
たデータは下記衣ＸＸ［［［に示されている。

表ＸＸ■で示されているように、　　Ｉ−ＭＵＧ−Ｃ８
ＦはＷＥＨＩ　−３８（Ｄ”　）白血病細胞との結合性
を示した。結合は、ＧＭ　−Ｃ８Ｆではなく未標識天然
ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ又はｒｈｐＧ−Ｃ３Ｆにより用０依存的
に阻害された。しかも、ヒト骨髄単球性白血病細胞（Ａ
ＮＬＬ、Ｍ４）に対する天然ｈｐＧ−Ｃ８Ｆの結合も観
察された。

これら細胞への結合性は、液体培養物中の天然ｈ　ｐａ
　−Ｃ３Ｆに応じて、形態学的に判断されるマクロファ
ージへの分化と比較される。別の愚者の中球性白血病細
胞（八ＮＬＬ、Ｍ５Ｂ）との天然　　１−ｈｐＧ−Ｃ８
Ｆの結合性の欠如は、特定の白血病が特異的に発現した
か、又はｈｐＧ−Ｃ３Ｆに対するレセプターを欠くこと
を示唆する。

天然ｈｌ）Ｇ−Ｃ８Ｆと同様に天然　　■−標識−ｈｐ
Ｇ−Ｃ８Ｆの結合に対して競合するｒｈｐＱ−Ｃ８Ｆの
能力は、レセプターが十分等しく両型を認識することを
示唆する。

白血病細胞との天然　　■−標識ｈｐＧＣ８Ｆの結合性
を証明するこれらの研究は、培養物中で急性性骨髄性白
血病（Ｍ３）の第１患名及び急性骨髄芽球性白血病（Ｍ
２）の第２患者から（ｑだ低密度骨髄法の顆粒球及び単
球への分化を誘導する天然ｈｐＧ−Ｃ３Ｆの能力と対比
される。

各患者からの細胞を、培地単独で又はｒｈｐＧＣ８Ｆ　
　１ｘ１０”単位存在下で、４日間培養した。

培地単独でインキヱベートされたＭ３コントロール培養
物からの細胞は前骨髄球のままであったが、一方ｒｈｃ
＋Ｇ−Ｃ３Ｆの存在下で培養された細胞は、後骨髄球、
巨大）■状核型−分葉核型好中球及び中球からなる骨髄
型成熟細胞を示した。この患者での現実の分化は、・１
００個の細胞について、コントロールの場合が１００％
前骨髄球であり、ｒ　ｈ　ｐＧ　−Ｃ３Ｆ処ｙＪ！細胞
の場合が２２％芽球十前骨髄球、７％骨髄球、３５％後
骨髄球、２０％杆状核型十分葉核型好中球、１４％単球
及び２％マクロファージであった。注目されるのは、多
形核顆粒球の１つが顕著なアラニル小体をまだ有してい
たという事実であるが、このことは少なくともこの細胞
が白血病系のクローンに属する分化細胞であることを示
唆する。骨髄芽球性白血病（Ｍ２）の第２患者からの細
胞もｒｈｐＧ−Ｃ８Ｆの存在又は非存在下で４日間培養
した。培地単独で培養されたＭ２細胞の視覚分析では、
大きな゛芽球様″細胞を示したが、そのうちのいくつか
は核小体を有していた。Ｍ２細胞のいくつかは、ｒｈｐ
Ｇ−Ｃ３Ｆで処理した場合に、好中球の中心にアラニル
小体が残った成熟分葉核型好中球に分化したが、このこ
とは白血病系のクローンに屈する細胞で生じる分化を示
唆した。形態学的に評価された細胞１００個の実際の分
化では、］ントロール細胞は１００％芽球からなること
が示された。ｒｈｐＧ−Ｃ８Ｆ処理細胞は、４３％芽球
、１％骨髄球、１５％ｖ２骨髄球、２８％杆状核型十分
葉核型好中球、２％前単球及び１１％単球からなってい
た。白血病細胞が、また４つの異なる濃度（５Ｘ　１０
　　、　　ＩＸ　１０’２．５Ｘ　１０４及び５Ｘ１０
４ＬＪ／ｄ、データ示さず）のｒｈｐＧ−Ｃ８Ｆ存在下
で分化に関して試験された。試験されたｒｈｐＧ−Ｃ３
Ｆの最低濃度（５×１０３Ｕ／Ｉｄ、）の場合であって
も、Ｍ３（５０％）及びＭ２（３７％）白血病細胞の著
しい分化が生じたく細胞は骨髄法以上に分化した）。

６、免疫試験 免疫試験用のポリクローナル抗体を産生ずるために使用
された抗原は、例１（Ｂ）で調製されたようにしてヒト
膀胱癌細胞系５６３７　（Ｔ、Ａ　６）から精製された
多分化能性Ｇ−Ｃ８Ｆであった。この物質は、ポリアク
リルアミドゲルの硝酸銀染色に基づき、純度８５％と判
定された。６連合３ａｌｂ／Ｃマウスを抗原の多部位注
射により免疫した。抗原をＰＢＳに再懸濁し、等信のフ
ロイント（Ｆ　ｒｅｕｎｄ）完全アジュバン］へで乳化
させた。投与量は抗原５〜７μび／マウス／注射であっ
た。追加免疫注射は、等（６）のフロイント不完全アジ
ュバントで乳化された同發の抗原で１８日後に投与した
。４日後、マウス血清を採取し、ヒト多分化能性Ｇ−Ｃ
３Ｆに特異的な抗体について試験した。

ホルダー中のダイナチック・イムロン■・リムーバウェ
ル（［）ｙｎａｔｅｃｈ　Ｊｍｍｕｌｏｎ［Ｒｅｍｏｖ
ａｗｅｌｌ）ストリップ〔ダイナチック・ラボラトリ−
社（Ｄｙｎａｔｅｃｋ　ｌ　ａｂ、　、　　ｌ　ｎｃ、
　）、アレク４Ｊ　”、ｙドリア、バージニア〕をｐｔ
＋９．２の５０　ｍ　Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液中のｈ　ｐ
Ｇ　−Ｃ８Ｆ　５埒／ｄで被覆した。ウェルを容量５０
成中の０．２５屑で被覆した。抗原被覆プレートを窄温
で２時間及び４℃で−夜インキュベトした。溶液を捨て
、プレートを５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で３０分間インキ
ュベートして、反応表面を保護した。この溶液を捨て、
希釈された免疫萌血清又は試験血清をウェルに加え、室
温で２時間インキュベートした。血清は１％ＢＳＡ含有
のｐＨ１，０のＰＢＳで希釈した。血清溶液を捨て、プ
レートをワラシュ・ツルージョン（Ｗａｓｈ　５ｏｌｕ
ｔｉｏｎ）（ＫＰＬ、グイザースブルグ、メリーランド
）で３回洗浄した。ｐｌ＋７．０の１％ＢＳＡ含有Ｐ　
Ｂ　Ｓ　５０ρ中のヨウ素化ウサギ抗マウスＩＱＧ（Ｎ
ＥＮ、ボストン、マサヂューセッツ）約２０００００　
Ｃ１）Ｉｌｌを各々のウェルに加えた。室温で１．５時
間インキュベートした後、溶液を捨て、プレートをワラ
シュ・ツルージョンで５回洗浄した。ウェルをホルダー
から取外し、ベックマン５５００ガンマカウンターで４
測した。高力価マウス血清は、１：１００希釈時におい
て、相当する免疫前血清よりも１２倍以上高い反応性を
示した。

大腸菌由来ｈｐＧ−Ｃ８Ｆの免疫学的性質は、哺乳動物
細胞由来ＭＧ−Ｃ３Ｆに特異的な高力価マウス血清に対
する反応性により測定した。純度９０％の大腸菌由来タ
ンパク質０．２５１１ｇを容量５ｏｐｉのイムロン■リ
ムーバウェルに被覆し、マウス血清を上記のように分析
した。

高力価マウス血清は、１：１００希釈時において、相当
する免疫前面漬よりも２４倍高い反応性を大腸菌由来物
質に対して示した。

７、セリン類縁体生物学的試験 例８で製造された（Ｓｅｒ１７）　ｈ　ｐＧ　−Ｃ８Ｆ
。

（Ｓｅｒ　　）ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ、（Ｓｅｒ４２）ｈｐＧ
−Ｃ８Ｆ、（Ｓｅｐ　　）ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ及び（Ｓｅｒ
７４）ｈｌ）Ｇ−Ｃ８Ｆ産物を、３Ｈ−チミジン取込み
、ＣＦＵ−ＧＭ及びＷＥＨｒ−３８ｒ）＋分析ニョリｈ
ｐＧ−Ｃ３Ｆ活性に関し分析した。各分析において、（
Ｓ　Ｑｒ１７）類縁体は天然構造組換え分子の活性に匹
敵する活性を有していた。他の類縁体は、３日−チミジ
ン取込み分析では１／　１００の活性、ＣＦＵ−ＧＭ分
析では１／２５０の活性、及びＷＥＨＩ−３８Ｄ＋分析
では１／　５００の活性を有していた。このデータは、
３６．４２．６４及び７４位のシスティンが十分な生物
学的活性のために必要であるという考え方を支持する。

８、イン・ビボ生物学的試験 アルゼット（Ａ　ＩｚｅｔＲ）　ｙ送圧ポンプ〔アルゼ
ット社（Ａ　＋ｚｅｔ　　Ｃ０ｒｌ）、　）パロ・アル
ド（ｐａｌＯＡ　１ｔｏ）、カリフォルニア；モデル２
００１　）を内在型右傾静脈血管カテーテルに連結し、
７匹の雄性シリアンゴールデンハムスターの皮下に植込
んだ。

４つのポンプは緩衝液（２０ｍＨＭ酸ナトリウム（ｐ１
１５．４）及び３７ｍＨ塩化プトリウム〕及び大腸菌由
来ｈ　ｐＧ　−Ｃ３Ｆ　　１．５Ｉｎｇ／ｆＩｌを含有
し、３つはｔｌＪ衝液のみを含有していた。浸透圧ポン
プに必要な排出速度は、７日目まで１ｍ／ｈｒであった
。ポンプ植込み後３日目において、４匹の処理ハムスタ
ーの平均顆粒球数は３匹の（緩衝液）コントロールの場
合より６倍高く、顆粒球数増加は総白血球が４倍増加し
たことに反映されていた。赤血球数は処理により変化し
なかった。これらの結果は、組換え物質が哺乳動物にお
いて顆粒球の産生及び／又は放出を特異的に高めること
を示している。

ｈｐＧ−Ｃ３Ｆの天然対立型に加え、本発明ではｈｐＧ
−Ｃ８Ｆのポリペプチド類縁体及びｈｐＧ−Ｃ８Ｆ断片
のような他のｈＤＧ−Ｃ３Ｆ産物も包含する。上記アル
ドンらの出願公開（Ｗ○／　８３／　０４０５３）の操
作に従い、１以上の残基の同−性又は位置に関し本明細
書で記載されたものとは異なる（例えば、置換、端部及
び中間部付加、並びに削除）−次椛造なもつポリペプチ
ドの微生物での発現をコードする遺伝子を容易に考えか
つ製造することができる。一方、ｃＤＮＡ及びゲノム遺
伝子の修正は、周知の特定部位突然変異誘発法によって
容易に実施することができ、しかもそれらの類縁体及び
誘導体を産生ずるために利用することができる。このよ
うな産物はｈｐＧ−Ｃ８Ｆの生物学的性質のうち少なく
とも１つを有するが、他の点では責なる可能性がある。

例えば、考えられる本発明の産物としては、例えば削除
により短縮された産物、加水分解に対しより安定な産物
（したがって、天然体よりも顕著な又は持続性の効果を
有する可能性がある）、１以上の潜在的Ｏ−グリコジル
化部位を削除して修正された産物（酵母菌産生産物に関
しより高い活性を有するようになる）、１以上のシステ
ィン残基が削除され又はアラニンもしくはセリン残基等
で置換され、しかも微生物系から活性型でより容易に単
離され得る産物、又は、１以上のチロシン残基がフェニ
ルアラニンで置換され、しかも標的細胞上のｈｐＧ−Ｃ
８Ｆレセプターにいくぶん容易に結合し得る産物がある
。更には、ｈＤＧ−Ｃ３Ｆの連続アミノ酸配列又は二次
構造の一部のみを複製したポリペプチド断片も包含され
るが、この断片は１つの活性（例えば、レセプター結合
性）を有するが、他の活性（例えば、コロニー増殖刺激
活性）を有しない可能性がある。本発明のいずれの１以
上の産物が、治療的効用〔ウアイラン１−ら、ブルート
、第４４巻、第１７３〜１７５頁、１９８２年（Ｗｃｉ
ｌａｎｄ　　ａｔａｔ、、　Ｂｌｕｔ、　　４４．１７
３−１７５　（１９８２））参照〕又はｈｐＧ−Ｃ８Ｆ
拮抗作用分析のような他の関連における効用をもつため
に、活性が必ずしも必要とされないことは注目に値する
。競合的拮抗剤は、例えばｈｐＧ−Ｃ８Ｆの過剰産生詩
にオ帛°に有用である可能性がある。

本発明の他の側面によれば、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆポリペプチ
ドをコードする本明細書に記載されたＤＮＡ配列は、天
然産物単離体の分析的プロセッシングにもかかわらず今
まで得られていなかったこの…ｉ乳動物タンパク質のア
ミノ酸配列に関して、それが情報を提供することから、
価値がある。

ＤＮＡ配列は、様々な組換え技術によるｈｐＧ−Ｃ３Ｆ
の大規模な微生物での合成を実施するために使用される
産物としても著しい価値がある。その他に、本発明によ
り提供されるＤＮＡ配列は、新規かつ有用なウィルス性
または環状プラスミドＤＮＡベクター、新規かつ有用な
形質転換及び感染転換された（ｔｒａｎｓｒｅｃｔｅｃ
＋）微生物原核及び真核及び真核宿主細胞（細菌、Ｐｆ
母菌細胞及び哺乳動物の培養細胞を含む）、ｈｐＧ−Ｃ
８Ｆ及びその関連産物の発現が可能なかかる微生物宿主
細胞の新規かつ有用なｊ８養増殖方法を開発するために
使用される。本発明のＤＮＡ配列は、ｈｐＧＣ８Ｆ及び
関連タンパク質をコードするヒトゲノムＤＮＡ並びに他
の補乳動物種のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列を申離す
るだめの標識プローブとして使用される、極めて適切な
物質でもある。

ＤＮＡ配列は、（例えば、昆虫細胞中での）タンパク質
合成の様々な代替的方法又はヒト及び他の哺乳動物にお
ける遺伝子療法にも使用することができる。本発明のＤ
ＮＡ配列は、ｈｐＧ−Ｃ８Ｆ及びｈｐＧ−Ｃ８Ｆ産物の
大規模産生用の真核細胞゛宿主″として機能し得る遺伝
子転換哺乳動珈秒を開発するためにも使用し得る、と期
待されている。一般的には、バルミターら、１ｆイエン
ス、第　２２２巻、第４６２５号、第　＆０９〜８１４
買、１９８３年（Ｐ　ａｌｍｉｔｅｒ、　　ｅｔ　　ａ
ｌ、、　　　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、　　　２２２（４６２
５）８０９−８１４　（１９８３））参照。

本発明のｈｐＧ−Ｃ３Ｆ断片及びポリペブヂド類縁体の
応用例の中には、天然タンパク質、糖タンパク質及び核
タンパク質中に存在するアミノ酸配列を実質的に複製し
た合成ペプチドの免疫学的活性に関する報告がある。更
に詳しくは、比較的低分子ｍのポリペプチドは、ウィル
ス抗原、ポリペプチドホルモンその他のような生理学的
に重要なタンパク質の免疫反応と時間及び程度が類似し
た免疫反応に関係することが示された。このようなポリ
ペプチドの免疫反応の中には、免疫学的に活性な動物に
おける特異的抗体産生の賦活化が含まれる。例えば、レ
ーナーら、セル、第２３巻、第３０９〜３１０頁、１９
８１年（１−ｅｒｎｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ、　　２３．３０９−３１０　　（１９８１）
　）　、０スら、ネーヂャー、第２９４巻、第６５４へ
６５６頁、１９８１年（ＲＯ３Ｓ　　ｅｔａｌ、　　Ｎ
ａｔｕｒｅ　　２９４　６５４−６５６（４９８１＞　
）　、ワルターら、プロシーデインゲス・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第７
７巻、第５１９７〜５２００頁、１９８０年（Ｗａｌｔ
ｅｒ、　　ｅｔａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、
　　△ｃａｄＳｃ＋、　　（ＵＳＡ）、　　７７　、　
５１９７−５２００　　（１９８０）　　）　、ラーナ
ーら、プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サーｒエンス（ＩＪｓＡ）、第７８巻、第
３４０３〜３４ｏ７頁、１９８１年、ワルターら、プロ
シーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス（ＵＳＡ）、第７８巻、第４８８２〜４８
８Ｇ頁、１９８１年；ウォン（Ｗ　０ｎ（１）ら、プロ
シーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス（ＵＳＡ）、第７８巻、第７４１２へ７４
１６頁、１９８１年ニゲリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、セル
、第２８巻、第４７７〜４８７頁、１９８２年；ニック
＜　Ｎ　ｉｇｏ）ら、プロシーデインゲス・Ａブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第
７９巻、第５３２２〜５３２６頁、１９８２年；バ［１
ン（Ｂ　ａｒｏｎ）ら、セル、第２８巻、第３９５〜４
０４頁、１９８２年；ドリーズマン（［）　ｒｅｅｓｍ
ａｎｌら、ネーチャ、第２９５巻、第１８５〜１６０頁
、１９８２年：及びラーナー、サイエンティフィック・
アメリカン、第２４８巻、第　２号、第６６〜７４頁、
１９８３年（ｌ　ｅｒｎｅｒ３ｃｉｎｔｉｒｉｃ　　Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ、　　２４８．　　ＮＧ２．　６１３−
７４（１９８３））参照。更に、ペプチドホルモンの二
次構造をほぼ有するもののそれらの一次構造配列を有し
ていない合成ベブヂドの生物学的及び免疫学的活性に関
する、カイザーら、サイエンス、第２２３巻、第２４９
へ２５５頁、１９８４年（Ｋａｉｓｅｒ　　ｅｔ　　ａ
Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２２３．２４９−２５５　（１９８
４）　）参照。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｈｐＧ−Ｃ３Ｆ遺伝子の部分的な制限エンド
ヌクレアーゼ地図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 【遺伝子配列があります】
2. （２）下記のアミノ酸配列からなるポリペプチドの製造
   方法であって、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を
   有するＤＮＡを含む発現ベクターで原核細胞を形質転換
   し、該形質転換原核細胞を培養し、該ポリペプチドを分
   離精製することを特徴とする、前記製造方法。 【遺伝子配列があります】
3. （３）前記原核細胞が￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥であることを特
   徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。
4. （４）前記塩基配列が大腸菌優先コドンを含むことを特
   徴とする特許請求の範囲第３項に記載の方法。
5. （５）前記塩基配列が下記のものであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第４項に記載の方法。 【遺伝子配列があります】
6. （６）前記塩基配列が下記のものであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第４項に記載の方法。 【遺伝子配列があります】