NO318755B1

NO318755B1 - Anvendelse av et hpG-CSF-polypeptid til fremstilling av et medikament for a stanse proliferasjon av leukemiceller

Info

Publication number: NO318755B1
Application number: NO20032250A
Authority: NO
Inventors: Lawrence M Souza
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Priority date: 1985-08-23
Filing date: 2003-05-19
Publication date: 2005-05-02
Also published as: JP2527365B2; CA1341537C; US5830705A; IL79805A0; IL79805A; EP0237545A4; FI871700A0; US4810643A; CN1020924C; DE3650788T2; EP0237545B2; FI871700A; JP2952203B2; JP2000279185A; FI20010334A; ES2001883A6; NO2003008I1; MX9202992A; NO20032250L; JP2660179B2

Description

Bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et hpG-CSF-polypeptid som omfatter sekvensen angitt i tabell VII, til fremstilling av et medikament for å stanse proliferasjon av leukemiceller.

Det humane bloddannende (hematopoietiske) system er-statter forskjellige hvite blodlegemer (deriblant neutrofiler, makrofager og basofiler/mast-celler), røde blodlegemer (erythrocytter) og klump-dannende celler {megakaryocyter/blodplater). Det bloddannende system hos det gjennomsnittlige menneske av hankjønn er blitt anslått å produsere i størrelsesorden 4,5 x 10 granulocytter og eryhtrocytter hvert år, noe som er ekvivalent med en årlig erstatning av den samlede kropps-vekt. Dexter et al., BioEssays, 2, 154-158 (1985).

Det antas at små mengder av bestemte vekstfaktorer for bloddannelse er ansvarlig for differensieringen av et lite antall forløper-"stamceller" til de forskjellige blodcelle-linjene, for den voldsomme formeringen av disse linjene, og for den endelige differensiering av ferdig utviklede blod-celler fra disse linjene. Ettersom vekstfaktorene for bloddannelse er tilstede i svært små mengder, har påvisningen og identifikasjonen av disse faktorene vært basert på en lang rekke prøver som hittil bare skjelner mellom de forskjellige faktorer på grunnlag av stimulerende virkninger på dyrkede celler under kunstige betingelser. Som et resultat av dette,

har et stort antall navn blitt laget for å betegne et mye mindre antall faktorer. Som et eksempel på den resulterende forvirring, er uttrykkene IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF

og PSF alle kortord som nå antas å gjelde for en enkelt murin vekstfaktor for bloddannelse. Metcalf, Science, 229, 16-22,

(1985). Se ogsåBurgess et al., J. Biol. Chem., 252, 1988

(1977), Das et al., Blood, 58, 600 (1980), Ihle et al.,

J. Immunol., 129, 2431 (1982),Nicola et al., J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983), Metcalf et al., Int. J. Cancer, 30, 773,

(1982) og Burgess et al., Int. J. Cancer, 26, 647 (1980),

som vedrører forskjellige murine vekstregulerende glycoproteiner.

Anvendelsen av rekombinante genetiske teknikker har bragt en viss orden i dette kaoset. F.eks. har man oppnådd aminosyre- og DNA-sekvensene for human erythropoietin som stimulerer produksjonen av erythrocytter. (Se Lin, PCT publisert søknad nr. 85/02610, publisert 2.0. juni 1985). Rekombinante metoder er også blitt anvendt for isolering av cDNA

for en human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor.

Se Lee et al., Proe. Nati.Acad. Sei. ( USA), 82, 4360-4364

(1985) og Wong et al., Science, 228, 810-814 (1985). Se også xokota et al., Proe. Nati.Acad. Sei. ( USA), 81, 1070 (1984), Fung et al.. Nature, 307, 233 (1984) og Gough et al., Nature, 309, 763 (1984) vedrørende kloning av murine gener, samt Kawasaki et al.. Science, 230, 291 (1985) vedrørende human-M-CSF.

En human vekstfaktor for bloddannelse kalt human kolonistimulerende faktor med flere forskjellige virkninger (hpCSF) eller pluripoietin, er blitt påvist å være tilstede i dyrknings-mediet til en human carcinomcellelinje fra urinblære betegnet 5637 og deponert under restriktive betingelser ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland som A.T.C.C de-poneringsnr. HTB-9. Den hpCSF som renses fra denne cellelinje, er blitt rapportert å stimulere formering og differensiering av forløperceller med flere forskjellige virkninger som fører til produksjonen av alle de viktigste blodcelletypene, i prøver hvor det brukes human benmarg-forløperceller. Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1530 (1985). Ved rensing av hpCSF ble det brukt: (NH^)jSO^-utfelling, anionbytterkromatografi (DEAE-cellulose, DE52), gelfiltrering (AcA54-kolonne) og C18 væskekromatografi i omvendt fase med høy yteevne. Et protein identifisert som hpCSF som elueres i den andre av to aktivitetstopper i fraksjoner fra C18 HPLC i omvendt fase, ble angitt å ha en molekylvekt (MW) på 18.000 bestemt ved hjelp av natriumdodecylsulfat (SDS)-polyacrylamid-gelelektroforese (PAGE) under anvendelse av sølvfarging.

hpCSF ble tidligere angitt å ha et isoelektrisk punkt på 5,5

[Welte et al., J. Cell. Biochem., Supp 9A, 116 (1985)] og en høy differenseriengsaktivitet for den myelomonocyttiske leukemicellelinje WEHI-3B D<+>fra mus [Welte et al., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Gale et al.,

utg. , New Series, 2B^ r (1985)]. Foreløpige undersøkelser indikerer at faktoren identifisert som hpCSF i overveiende grad har granulocytt-kolonistimulerende aktivitet i løpet av de første 7 dagene i en human CFU-GM-prøve.

En annen faktor, betegnet human CSF-[3, er også blitt isolert fra human urinblære carcinomcellelinje 5637 og er blitt beskrevet som en konkurrent til murin<125>1-merket granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF) når det gjelder binding til WEHI-3B D<+->celler i et doseresponsforhold som er identisk med forholdet til umerket murin G-CSF [Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985)]-Dette doseresponsforhold var tidligere blitt rapportert å være enestående for umerket murin G-CSF og ikke å finnes hos slike faktorer som M-CSF, GM-CSF eller multi-CSF [Nicola et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 81, 3765-3769 (1984)]. CSF-(3 og G-CSF er også enestående blant CSF-er ved at de deler en høy grad av evne til å indusere differensiering av WEHI-3B D +-celler. Nicola et al., Immuno-logy Today, J5, 76-80 (1984) . Ved høye konsentrasjoner stimulerer G-CSF blandede granulocytt/makrofag-kolonidannende celler [Nicola et al., (1984) supra], noe som er i overensstemmelse med foreløpige resultater som indikerer frem-komsten av granulocyttiske, ntonocyttiske, blande granulocy-tiske/monocyttiske og eosinofile kolonier (CFU-GEMM) etter 14 dagers inkubasjon av humane benmargkulturer med hpCSF. CSF-|3 er også blitt angitt å stimulere dannelse av neutrofile granulocyttiske kolonier i prøver hvor det ble anvendt benmargceller fra mus, en egenskap som har vært et kriterium for identifikasjon av en faktor som en G-CSF. På grunnlag av disse likheter, er human CSF-p blitt identifisert med G-CSF (granulocyttisk kolonistimulerende faktor). Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985).

På grunnlag av de felles egenskaper synes det som om human SCF-|3 ifølge Nicola et al., supra, og hpCSF ifølge Welte et al., supra, er den samme faktor som passende kunne refereres til som en human granulocytt-kolonistimulerende faktor (hpG-CSF). Karakterisering og rekombinant produksjon av hpG-CSF ville være særlig ønskelig på bakgrunn av den rapporterte egenskap hos murin G-CSF til å undertrykke en in vitro WEHI-3B 3<+>leukemisk cellepopulasjon fullstendig ved "helt normale konsentrasjoner", og den rapporterte egenskap

'hos rå, injiserte preparater av murin G-CSF til å undertrykke etablerte transplanterte myeloid-leukemier i mus. Metcalf, Science, 229, 16-22 (1985). Se også Dachs Scientific American, 284 ( 1) , 40-47 (1986).

I den utstrekning hpG-CSF kan vise seg å være terapeutisk betydningsfull og således trengs å være tilgjenge-■lig i mengder i kommersiell skala, er det usannsynlig at isolering fra cellekulturer kan utgjøre en adekvat material-

kilde. Det er f.eks. verd å legge merke til at det fore-

ligger restriksjoner mot kommersiell bruk av celler fra human tumorbank, slik som den humane urinblære-carcinomcellelinje 5637 (A.T.C.C. HTB9) som er blitt angitt som kilder for naturlige hpCSF-isolater iWelte et al. (1985 supra).

Oppsummering av oppfinnelsen

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes anvendelse av et hpG-CSF-polypeptid som omfatter sekvensen angitt i tabell VII, til fremstilling av et medikament for å stanse proliferasjon av leukemiceller.

Farmasøytiske preparater som omfatter effektive mengder av polypeptidprodukter sammen med egnede fortynningsmidler, hjelpe-stoffer og/eller bærere, fremstilt ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen, kan anvendes i hpG-CSF-terapi.

Polypeptidproduktene kan "merkes" ved tilknytning til et påvisbart markørstoff (f.eks. merkes radioaktivt med<125>I), hvor-ved det fåes reagenser som kan brukes ved påvisning og kvantifi-sering av human hpG-CSF i faste vev- og væskeprøver, slik som blod eller urin. DNA-produkter kan også merkes med påvisbare markører (slik som radioaktive markører og ikke-isotopiske mark-ører, slik som bioitin), og anvendes i fremgangsmåter for DNA-hybridisering for å lokalisere stillingen til det humane hpG-CSF-gen og/eller stillingen til en nær beslektet genfamilie i et kromosomkart. De kan også brukes til å identifisere feil i det humane hpG-CSF-gen på DNA-nivået og brukes som genmarkør for å

identifisere nabogener og feil i disse.

Polypeptidproduktene kan alene eller sammen med andre faktorer for bloddannelse eller legemidler, være anvendbar ved behandlingen av feil i bloddannelsen, slik som aplastisk anemi. De kan også være anvendbar ved behandlingen av mangler i bloddannelsen som oppstår av kjemoterapi eller av stråleterapi. F.eks. kan vellykketheten ved benmargstransplantasjon økes ved anvendelse av hpG-CSF. Sårhelende behandling av brannskade og behandling av bakteriebetennelse kan også dra nytte av anvendelse av hpG-CSF. I tillegg kan hpG-CSF også være nyttig ved behandlingen av leukemier basert på en rapportert evne til å differensiere leukemiceller. Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei.

( USA), 82, 1526-1530 (1985) og Sachs, supra.

En rekke aspekter og fordeler ved oppfinnelsen vil være åpenbare for fagfolk innen teknikken ut fra den nærmere beskrivelse nedenunder som gir illustrasjoner på for tiden foretrukne utførelsesformer.

Kort beskrivelse av tegningene

Figuren er et partielt restriksjonsendonukleasekart over hpG-CSF-genet ledsaget av piler som viser den sekvenserings-strategi som er brukt for å komme frem til genomsekvensen.

Nærmere beskrivelse

DNA-sekvenser som koder for en del av eller hele polypep-tidsekvensen til hpG-CSF, er blitt isolert ogkarakterisert.

De følgende eksempler er gitt for å illustrere grunnlaget for oppfinnelsen, og er spesielt rettet mot sekvenseringen, ut-viklingen av ekspresjonssystemer basert på cDNA, genomgener og fremstilte gener, og verifikasjon av ekspresjon av hpG-CSF og analoge produkter i slike systemer.

Nærmere bestemt er eksempel 1 rettet mot hybridiserings-screening, identifikasjon av positive kloner, DNA-sekvensering av en positiv cDNA-klon og frembringelsen av informasjon vedrørende primær polypeptidstrukturkonformasjon (aminosyresekvens). Eksempel 2 er rettet mot fremgangsmåter for konstruksjon av en E. coli transformasjonsvektor som omfatter hpG-CSF-kodende DNA, bruken av vektoren i prokaryot ekspresjon av hpG-CSF, og analyse av egenskaper til rekombinante produkter som anvendes ifølge opp finnelsen. Eksempel 3 er rettet mot fremgangsmåter for frembring-else av analoger av hpG-CSF hvor cysteinrester er erstattet med en annen egnet aminosyrerest ved hjelp av mutagenese utført på DNA som koder for hpG-CSF. Eksempel 4 vedrører fysiske og biologiske egenskaper hos rekombinante polypeptidprodukter som brukes ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

i Ifølge fremgangsmåten til Hanahan et al., J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983), ble bakterier som inneholdt rekombinanter med cDNA-innskudd spredd ut på 24 nitrocellulosefiltere (Millipore<®>, Bedford, Massachusetts) lagt på agarplater. Platene ble deretter inkubert slik at det ble etablert omtrent 150.000 kolonier som ble replikautplatet på 24 andre nitrocellulosefiltere. Replikaene ble inkubert inntil utydelige kolonier kom til syne. Bakteriene på filtrene ble lysert på ark av Whatman 3 mm papir såvidt mettet med natriumhydroxyd (0,5M) i 10 minutter, deretter blottet med Tris (IM) i 2 minutter etterfulgt av blotting med Tris (0,5M) som inneholdt NaCl (1,5M) i 10 minutter. Da filtrene var nesten tørre, ble de varmet opp i 2 timer ved 80°C

i en vakuumovn før nukleinsyrehybridisering. [Wahl et al.,

Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 76, 3683-3687 (1979) ] og Mania-tiset al., Cell, 81, 163-182 (1976).

Filtrene ble forhybridisert i 2 timer ved 65°C i 750

ml 10X Denhardfs, 0,2% SDS og 6X SSC. Filtrene ble skylt i 6X SSC, deretter ble fire plassert i en pose og hybridisert i 14 timer i 6X SSC og 10X Denhardt<*>s. Det var omtrent 15 ml oppløsning pr. pose som inneholdt 50 x 10 6 cpm<32->P-merket probe (oligonukleotider).

Etter hybridisering ble filtrene vasket tre ganger i

6X SSC (1 liter/vask) ved værelsetemperatur i 10 minutter hver. Filtrene ble så vasket to ganger ved 45°C i 15 minutter hver, en gang ved 50°C i 15 minutter og en gang ved 55°C i 15 minutter under anvendelse av 1-litervolumer i 6X SSC. Filtrene ble autoradiografert i 2 timer ved -70°C under anvendelse av et forsterkergitter og Kodak<®>XAR-2-film. På den autoradio-graf ble det påvist 40 - 50 positive signaler, deriblant 5 svært sterke signaler.

Områdene som inneholdt de fem sterkeste signalene og ytterligere fem positive områder ble avskrapet fra master-platene og på nytt platet ut for en andre screening under anvendelse av den samme probeblanding under de samme betingelser. Vaskefremgangsmåten adskilte seg ved at høytemperatur-vaskingene besto av to ved 55°C i 15 minutter hver og deretter en ved 60°C i 15 minutter. Basert på N-myc-probeunder-søkelse! ble sluttemperaturene ved vasking

i den andre screening økt fordi aggregatsmeltepunktet tor de 24 23-merer var 60 - 68°C, det samme som for N-myc-probene. Like etter den andre vasking ved 55°C ble filtrene etterlatt fuktige og det ble utført en autoradiografering. Sammenligning av denne autoradiografering med den andre autoradiografering utført for et lignende tidsrom etter en sluttvasking ved 60°C, viste at bare to av de ti klonene som ble testet, ikke led av et vesentlig tap i signal når man økte fra 55 til 60°C. Disse to klonene ble senere vist å ha nesten identiske lengder og restriksjonsendonukleasemønstere. En klon betegnet Ppo2 ble valgt ut for sekvensering.

Sekvensering av den rekombinante hpG-SCF-cDNA-klon, Ppo2, oppnådd ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor ble ut-ført ved hjelp av dideoxymetoden til Sanger et al-, Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 74, 5463-5467 (1977). Den énkjedede DNA-fag M-13 ble brukt som en kloningsvektor for å skaffe tilveie énkjedede DNA-templater fra de dobbeItkjedede cDNA-kloner. Metoden til Sanger et al. avslørte den sekvens som er gjengitt i tabell VII ledsaget av dens aminosyretranslasjon og en komplementær kjede i det polypeptidkodende område.

Følgende kjennetegn ved sekvensen ifølge tabell VII

er verd å merke seg. Ved 5'-enden i sekvensen er det vist baser svarende til de i poly G cDNA-linkeren. Det oppstår så ca. 5 baser (betegnet som "N") med en sekvens som ikke lett kunne bestemmes éntydig ved hjelp av metoden til Sanger et al. på grunn av de mange G-er som går forut. Sekvensen legger deretter for dagen en serie på 12 kodoner som koder for en del av en antatt ledersekvens for polypeptidet. Basert på samsvarhet med N-aminosekvensen i naturlige isolater av hpCSF^

er den første threoninrest i den an-

tatt "ferdige" form av hpG-CSF angitt ved +1. Ferdig hpG-CSF viser seg deretter å omfatte 174 rester som angitt. Etter "stopp"-kodonet (OP-kodonet, TGA) kommer det omtrent 856 baser av en ikke-translatert 3"-sekvens og flere A-er av poly A "halen". Unike HgiAi- og Apal-restriksjonsendonukleaser-gjenkjenningssteder, samt to Stul-steder (omtalt nedenunder når det gjelder konstruksjon av prokaryote og eukaryote ekspresjonssystemer) er også betegnet i tabell VII. På grunn av mangel på asparaginrester i polypeptidet, er det ingen klare steder for N-glycosylering. De understrekede 6 baser nær enden av den 3'-ikke-translaterte sekvens utgjør et potensielt polyadenyleringssted.

Det er verd å merke seg at hver av to ytterligere cDNA-kloner identifisert ved hjelp av hybridiseringsfrem-gangsmåtene beskrevet ovenfor, fra et samlet antall på 450.000 kloner, unnlot å ta opp DNA som koder for hele ledersekvensen fra transkripsjonsinitieringsstedet og fremover. Faktisk terminerte alle tre hpG-SCF-klonene i 5"-området nøyaktig på samme tid, noe som indikerer at sekundærstrukturen til den transkriberte mRNA på ugunstig måte hindrer cDNA-dannelse utenfor dette sted. Som en sak av praktisk betydning, kunne derfor slik cDNA-ekspresjonsscreening som beskrevet i Okayama et al., Mol, and Cell. Biol., _3'280-289 (1983), og som faktisk anvendes for å isolere GM-CSF i Wong et al., Science, 228, 810-814 (1985), kunne ikke lett ha vært anvendt til isolering av hpCSF-DNA ettersom slike isoleringssystemer vanligvis beror på tilstedeværelsen av en cDNA-transkript i full lengde i de analyserte kloner.

Sekvensen ovenfor er ikke lett mottagelig for sikring av direkte ekspresjon av hpG-CSF i en mikrobevert. For å sikre slik ekspresjon, bør det hpG-CSF-kodehde område være forsynt med et første ATG-kodon og sekvensen bør være innskutt i en transformasjonsvektor på et sted som er under kontroll av en egnet promoter/regulator-DNA-sekvens.

Eksempel 2

Dette eksempel vedrører ekspresjon i E. coli av et hpG-CSF-polypeptid ved hjelp av en DNA-sekvens som koder for [Met""'']-hpCSF. Den anvendte sekvens var delvis syntetisk og delvis cDNA-avledet. I den syntetiske sekvens ble det brukt E. coli preferansekodoner.

Plasmid Ppo2 som inneholder hpG-CSF-genet vist i tabell VII, ble oppløst medHgiAl og Stul slik at man fikk et fragment med omtrent 645 basepar inkludert genet for ferdig hpCSF (som vist i tabell VII) med syv av ledersekvens-kodonene i 5'-enden og 100 basepar av 3<1->ikke-kodende område. HgiAI-oppIøsninq etterlot en klebrig 5'-ende med 4 baser som er identisk med det som fåes med Pstl, og Stul etterlot en stump ende. Dette muliggjorde hurtig innskudd av fragmentet i M13 mp8 (Rf) kuttet med Pstl og med restriksjonsenzymet HincII som gir stumpe ender. Etter forsterkning i M13, ble hpG-CSF-DNA tatt ut ved oppløsning med Apal og BamHI som kutter henholdsvis vedApal-stedet og strekker seg over kodonene for restene +3 til +5 i hpCSF, og ved et BamHI-sted "nedstrøms" fra HincII-stedet i M13 mp8 restriksjons-linkeren. For å muliggjøre ekspresjon i E. coli av hpG-CSF-polypeptidet, ble det fremstilt et syntetisk fragment som angitt i tabell XVII nedenunder.

Som det kan bestemmes ut fra analyse av tabell XVII, omfatter linkeren en Apal klebrig ende, kodoner som angir de første tre restene i aminoenden av hpG-CSF ("gjeninnsetter"

12 3

de Thr -, Pro Leu -spesifiserende kodoner fjernet etter

Apal-oppløsning av M13-DNA beskrevet ovenfor og som anvender kodoner som fortrinnsvis uttrykkes i E. coli), et translasjons-initierings-ATG, en sekvens med 24 basepar som gir et ribosom-bindende sted og en Xbal klebrig ende.

Ekspresjonsvektoren som ble anvendt for ekspresjon i E. coli, var den som er beskrevet som pCFM536 i europeisk patentsøknad nr. 176 490, publisert 10. april 1975. (Se også A.T.C.C. 39974, E. coli JM103 som inneholder pCFM536). I korte trekk ble plasmid pCFM536 opløst med Xbal og BamHI. hpG-CSF-fragmentet ( Apal/ BamHI) og linkeren ( Xbal/ Apal) beskrevet ovenfor ble deretter ligert inn slik at det ble dannet et plasmid betegnet p536Ppo2.

Plasmid p536Ppo2 ble transformert inn i en fag-resi-stent variant av E. coliAM7-stammen som tidligere var blitt transformert med plasmid pMWl (A.T.C.C. nr. 39933) som inneholder et CI 857-gen. Transformasjon ble bekreftet på grunnlag av markørgenet for antibiotisk (amp)-resistens som bæres på pCFM536 forløperplasmidet. Kulturer av celler i LB dyrknings-væske (ampicillin 50 ug/ml) ble holdt ved 28°C og etter vekst av celler i kultur tilA600 = 0,5, ble hpCSF-ekspresjon indu-sert ved å øke dyrkningstemperaturen til 42°C i 3 timer. Den endelige O.D. i kulturen var A600 = 1,2.

Ekspresjonsnivået for hpG-CSF i de transformerte celler ble bestemt på en SDS-polyacrylamidgel farget med "coomassie blue"-fargestoff til 3 - 5% av det totale cellulære protein.

Cellene ble innhøstet ved sentrifugering ved 3500 g

i 10 minutter i en JS-4.2-sentrifuge. Celler ved 25% (vekt/ volum) i vann ble brudt ned ved å passere tre ganger gjennom en "French Pressure Cell" ved 10.000 p.s.i. Suspensjonen av nedbrudte celler ble sentrifugert ved 10.000 g i 15 minutter i en JA-20-sentrifuge.PeHeten ble på nytt oppslemmet i vann og oppløseliggjort ved ca. 5 mg/ml totalt protein i 1% laurin-syre, 50 mM Tris, pH 8,7. Det oppløseliggjorte pelletmateriale ble sentrifugert ved 15.000 g i 10 minutter og det ble tilsatt 20 mM CuS04til supernatanten. Etter 1 time ble denne prøven fylt på en C4 HPLC-kolonne for rensing.

En andre rensingsfremgangsmåte ble utviklet for å gi større mengder hpG-CSF formulert i en buffer uten organiske forbindelser. Dette materiale er egnet for in vivo under-søkelser. 150 g cellemasse ble på nytt oppslemmet i ca. 600 ml 1 mM DTT og sendt fire ganger gjennom en Manton Gualin homogenisator ved ca. 7000 PSI. Suspensjonen av nedbrudte celler ble sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter og pelleten ble på nytt oppslemmet i 400 ml 1% deoxycholat (DOC), 5 mM EDTA, 5mM DTT og 50 mMTris, pH 9. Denne suspensjon ble blandet ved væreIsetemperatur i 30 minutter og sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter.Pelleten ble på nytt oppslemmet i ca. 400 ml vann og sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløseliggjort i 100 ml 2% "Sarkosyl" og 50 mM

ved pH 8. CuS04 ble tilsatt til 20 um og blandingen ble omrørt i 16 timer ved værelsetemperatur og deretter sentrifugert ved 20.000 g i 30 minutter. Til supernatanten ble det tilsatt 300 ml aceton. Denne blanding ble plassert på is i 30 minutter og deretter sentrifugert ved 5000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløst i 250 ml 6 M guanidin og 40 mM natriumacetat ved pH 4, og sendt over en 1200 ml G-25-kolonne ekvilibrert og betjent med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. hpG-CSF-toppen (ca. 400 ml) ble slått sammen og tilført en 15 ml CM-cellu-losekolonne ekvilibrert med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. Etter påfylling ble kolonnen vasket med 60 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 25mM natriumklorid, og deretter ble kolonnen eluert med 200 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 37 mM natriumklorid. 150 ml av dette elueringsmiddel ble oppkonsentrert til 10 ml og tilført en 300 ml G-75-. kolonne ekvilibrert og betjent med 20 mM natriumacetat og 100 mM natriumklorid ved pH 5,4. Toppfraksjonene som utgjorde 35 ml, ble slått sammen og filtersterilisert. Sluttkonsentra-sjonen av hpG-CSF var 1,5 mg/ml, var mer enn 95% ren bestemt ved analyse på en gel og inneholdt mindre enn 0,5 mg pyrogen pr. 0,5 mg hpG-CSF. Pyrogennivået ble bestemt ved å bruke et prøvesett for "Limulus Amebocyte Lysate" (LAL) (M.A. Bio-products, Walkersville, Maryland).

Eksempel 3

Dette eksempel vedrører bruken av rekombinante metoder for å generere analoger av hpG-CSF hvor tilstedeværende cysteinrester i posisjonene 17r 36, 42, 64 og 74 individuelt ble erstattet med en passende aminosyrerest.

Stedrettede mutagenesefremgangsmåter ifølge Souza et al., publisert PCT patentsøknad nr. WO85/00817, publisert 28. februar 1985, ble utført på (Met~<1>3-kodende DNA fra plasmid p536Ppo2, beskrevet nedenunder, ved å bruke syntetiske oligonukleotider som varierte i størrelse fra 20 til 23 baser, slik som vist i tabell XVIIInedenunder. Oligonukleotid nr.

1 ga dannelse av et gen som koder for [Ser<17>]hpG-CSF, oligonukleotid nr. 2 ga dannelse av [Ser<36>]hpG-CSF, osv.

De mot Cys til Ser stedrettede mutageneserestriksjoner ble utført ved å bruke M13 mplO med et Xbal- BamHI hpG-CSF-fragment isolert fra p536Ppo2 som et templat. DNA fra hver M13 mplO-klon inneholdende enCys-Ser-substitusjon ble behandlet med Xbal og BamHI. Det resulterende fragment ble klonet inn i ekspresjonsvektor pCFM746 og ekspresjonspro-dukter ble isolert som i eksempel 2.

Plasmidet pCFM746 kan konstrueres ved å spalte et plasmid pCFM736 (konstruksjonen av dette fra deponerte og ålment tilgjengelige materialer er beskrevet i Morris, publisert PCT patentsøknad nr. WO85/00829, publisert 28. februar 1985) med Clal og BamHI for å fjerne en tilstedeværende polylinker, og ved å bytte ut følgende polylinker.

Ved en rensefremgangsmåte for Cys-Ser-analoger ble

ca. 10 - 15 g cellemasse på nytt oppslemmet i 40 ml 1 mM DTT og sendt 3 ganger gjennom en "Prench Pressure Cell" ved 10.000 psi. Suspensjonen av nedbrutte celler ble sentrifugert ved 1000 g i 30 minutter. Pelleten ble på nytt oppslemmet i 1% DOC, 5 mM EDTA,

5 mM DTT, 50 mM Tris, pH 9 og fikk blandes i 30 minutter ved væreIsetemperatur. Blandingen ble sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter, på nytt oppslemmet i 40 ml H20 og resentrifu-gert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløst i 10

ml 2% "Sarkosyl", 50 mM DDT, 50 mM Tris, pH 8. Etter blanding i 1 time ble blandingen klaret ved sentrifugering ved 20.000

g i 30 minutter og deretter tilført en 300 ml G-75-kolonne ekvilibrert og betjent med 1% "Sarkosyl, 50 mM Tris, pH 8. Fraksjoner som inneholdt analogen, ble slått sammen og fikk oxyderes i luft ved henstand med eksponering mot luft i minst 1 dag. Sluttkonsentrasjonene varierte fra 0,5 til 5 mg/ml.

Eksempel 4

Dette eksempel vedrører fysiske og biologiske egenskaper hos rekombinante polypeptidprodukter som brukes ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen.

1. Molekylvekt

Rekombinante hpG-CSF-produkter fra E. coli-ekspresjon

som i eksempel 2 hadde en tilsynelatende molekylvekt på

18,8 kD når de ble bestemt i reduserende SDS-PAGE (som ville bli forutsagt fra den utledede aminosyreanalyse i tabell

VII, mens naturlige, rensete isolater hadde en

tilsynelatende molekylvekt på 19,6 kD. Tilstede-

værelsen av N-glycaner forbundet med de naturlige isolater kunne effektivt utelukkes på grunnlag av mangelen på asparaginrester i primærsekvensen til hpG-CSF i tabell VII, og det ble derfor stilt opp en fremgangsmåte for å bestemme om 0-glycaner var ansvarlige for molekylvektforskjeller mellom naturlige isolater og de ikke-glycosylerte rekombinante produkter. Omtrent 5 ug av materialet fra det naturlige isolat ble behandlet med neuraminidase (Calbiochem., LaJolla, Cali-fornia) , en 0,5 ug prøve ble fjernet og det gjenværende materiale ble inkubert med 4 mU 0- Glycanase (endo-x-n-acetyl-galactoseaminidase, Genzyme, Boston, Massachusetts) ved 37°C. Aliquoter ble fjernet etter en halv, 2 og 4 timer med inku-bering. Disse prøvene ble underkastet SDS-PAGE side om side med det rekombinante materiale avledet fra E. coli. Etter neuraminidasebehandling skiftet den tilsynelatende molekylvekt til isolatet fra 19,6 kD til 19,2 kD, noe som tyder på fjerning av en sialinsyrerest. Etter 2 timers behandling med O-glycanase skiftet molekylvekten til 18,8 kD, identisk med den tilsynelatende molekylvekt for det materiale som er avledet fra E. coli. Carbohydratstrukturens følsomhet overfor neuraminidase og O-glycanase antyder følgende struktur for carbohydratbestanddelen: N-acetylneuraminsyre-a(2-6)(galac-tose-(3-(1-3)-N-acetylgalactosamin-R, hvor R er serin eller threonin.

2. Opptak av ^ H- thymidin

Formeringsinduksjon av humane benmargceller ble under-søkt på grunnlag av økt innlemmelse av<3>H-thymidin. Human benmarg fra friske donorer ble utsatt for en densitetskutt med Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharmacia) og celler med lav densitet ble oppslemmet i Iscove's medium (GIBCO) som inneholdt 10% bovint fosterserum og glutamin "pen-strep". Deretter ble 2 x 10 4 humane benmargceller inkubert med enten kontrollmedium eller det rekombinante E. coli materiale fra eksempel 2 i 96 flatbunnede brønnplater ved 37°C i 5% C02i luft i 2 dager. Prøvene ble undersøkt in duplo og konsentra sjonen varierte over et område på 10.000 ganger. Kulturer ble deretter pulset i 4 timer med0,5 uCi/brønn med<3>H-thymidin (New England Nuclear, Boston, Massachusetts). Opp-taket av<3>H-thymidin ble målt som beskrevet i Ventua et al., Blood, 61, 781 (1983). I denne prøven kan humane hpG-CSF-isolater indusere<3>H-thymidin-innlemmelse i humane benmargceller ved nivåer på omtrent 4-10 ganger høyere enn kon-trollsupernatanter. E. Coli-avledet hpG-CSF-materiale

hadde lignende egenskaper.

En andre undersøkelse av human benmargcelle-

formering ble utført ved å bruke dyrkningsmedium fra<i>itransfiserte COS-1-celler og ga lignende

resultater, noe som indikerte at kodede polypeptidprodukter faktisk ble utskilt i dyrkningsmedium som aktive stoffer.

3. WEHI- 3B D<+>differensieringsinduksjon

Kapasiteten til rekombinante E. coli avledede materialer når det gjelder å indusere differensiering av den murine myelomocyttiske leukemi-cellelinjeWEHI-3B D<+>ble undersøkt i halvfast agarmedium som beskrevet i Metcalf, Int. J. Cancer , 25, 225 (1980). Det rekombinante hpG-CSF-produkt og mediekontroller ble inkubert med ca. 60 WEHI-3B D celler/ brønn ved 37°C i 5% C02i luft i 7 dager. Prøvene ble inkubert i 24 flatbunnede brønnplater og konsentrasjonen varierte over et område på 2000 ganger. Koloniene ble klassifisert som ikke-differensierte, delvis differensierte eller fullstendig differensierte, og kolonicelletellinger ble utført mikroskopisk. E. coli rekombinantmateriale ble funnet å indusere differensiering.

4. CFU- GM-, BFU-E- og CFU- GEMM- analyser

Na.turligé isolater av human G-CSF (hpG-CSF) med flere forskjellige virkninger og det rekombinante humane G-CSF (rhpG-CSF) med flere forskjellige virkninger ble funnet å forårsake at humane benmargceller formerer seg og differen-sieres. Disse aktivitetene ble målt i CFU-GM [Broxmeyer et al., Exp. Hematol., 5, 87, (1971] BFU-E- og CFU-GEMM-analyser [Lu et al., Blood, 61, 250 (1983)] under anvendelse av lavdensitets, ikke-vedhengende benmargceller fra friske humane frivillige. En sammenligning av de biologiske virkninger av CFU-GM, BFU-E og CFU-GEMM under anvendelse av enten 500 enheter hpG-CSF eller rhgG-CSF er vist i tabell XXII nedenunder.

Alle kolonianalysene ble utført med lavdensitets ikke-vedhengende benmargceller. Humane benmargceller ble utsatt for en densitetskutt med Ficoll-Hypaque (densitet, 1,077 g/ cm 3,Pharmacia).Lavdensitetscellene ble deretter på nytt oppslemmet i Iscove's modifiserte Dulbecco's medium som inneholdt kalvefosterserum og plassert for binding på Falcon vevkultur-plater (Nr. 3003, Becton Dickenson, Cockeysvillé, MD.) il-l/2 time ved 37°C.

Mediumkontroll besto avlscove<*>s modifiserte Dulbecco's medium pluss 10% FCS, 0,2 mM hemin og 1 enhet rekombinant erythropoietin.

For CUF-GM-analysen ble målceller platet ut ved

1 x IO<5>i 1 ml 0,3% agardyrkningsmedium som omfattet supplert McCoy's 5A medium og 10% varmeinaktivert kalvefosterserum. Kulturer ble bedømt med hensyn på kolonier (mer enn 40 celler pr. aggregat) og morfologi bestemt på dag 7 av dyrkingen. Antallet kolonier er vist som middelverdien - SEM bestemt fra plater in kvadrupel.

For BFU-E- og CFU-GEMM-analysene ble celler (lx 10<5>) tilsatt til en 1 ml blanding av Iscove's modifiserte Dul-becco's medium (GIBCO), 0,8% ethylcellulose, 30% kalvefosterserum, 0,05 nM 2-mercaptoethanol, 0,2 mM hemin og 1 enhet rekombinant erythropoietin. Plater ble inkubert i en fuktet atmosfære av 5% CO^og 5% 0^. Lav oxygenspenning ble oppnådd ved å bruke et oxygenreduksjonsapparat fra Reming Bioinstru-ments (Syracuse, N.Y.). Kolonier ble bedømt etter 14 dagers inkubasjon. Antallet kolonier er vist som gjennomsnitts-verdien - SEM, som bestemt ut fra plater in duplo.

Kolonier dannet i CFU-GM-analysen ble alle funnet å være kloracetatesterasepositive og ikke-spesifikk esterase (a-nafthylacetatesterase)-negative, i overensstemmelse med at koloniene er granulocytter av type. Både naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF ble funnet å ha en spesifikk aktivitet på omtrent 1 x 10 Q E/mg rent protein når de ble analysert ved hjelp av seriefortynning i en CFU-GEMM-prøve. BFU-E- og CFU-GEMM-dataene i tabell XXII er representative for tre separate for-søk og svarende til de data som er rapportert tidligere for naturlig hpG-CSF. Det er viktig å legge merke til at rhpG-CSF er svært rent og fritt for andre potensielle pattedyr-vekstfaktorer i kraft av fremstillingen i E. coli. Således er rhpG-CSF i stand til å understøtte blandet kolonidannelse (CFU-FEMM) og BFU-E når det tilsettes i nærvær av rekombinant erythropoietin.

5. Prøver på cellebinding

Det ble tidligere rapportert at WEHI-3B(D+)-celler og humane leukemiceller fra nydiagnostiserte leukemier vil binde<125>I-merket murin G-CSF og at denne binding kan gjøres fullstendig ved tilsetning av umerket G-CSF eller human CSF-p. Evnen til naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF når det gjelder

125

å konkurrere for binding av I-hpG-CSF til humane og murine leukemiceller, ble testet. Sterkt renset naturlig hpG-CSF (mer enn 95% rent, 1 ug) ble jodert [Tejedor et al.. Anal. Biochem., 127, 143 (1982)] og ble separert fra reaktanter ved hjelp av gelfiltrering og ionebytterkromatografi. Den

125

spesifikke aktivitet til den naturlige I-hpG-CSF var omtrent uCi/ug protein. Murin WEHI-3B(D<+>) og to humane myeloid-leukemicellepreparater fra perifert blod (ANLL, en klassifisert som M4, den andre som M5B) ble testet med henyn på evne til å binde<125>I-hpG-CSF.

De murine og nylig erholdte humane myeloidleukemi-celler fra perifert blod ble vasket tre ganger med PBS/1% BSA. WEHI-3B(D<+>)-celler (5 x IO<6>) eller nye leukemiceller

(3 x IO<6>) ble inkubert in duplo i PBS/1% BSA{100 ul) i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner (volum: 10 ul) med umerket hpG-CSF, rhpG-CSF eller GM-CSF, og i nærvær av I-hpG-CSF (omtrent 100.000 cpm eller 1 ng) ved 0 C

i 90 minutter (totalt volum: 120 yl). Cellene ble deretter på nytt oppslemmet og lagt opp på 200 pl iskald FCS i et 350 pl sentrifugerer av plast og sentrifugert (1000 g, 1 minutt). Pelleten ble samlet opp ved å kutte av enden av røret og pellet og supernatant telt hver for seg i en -y-teller (Packard) .

Spesifikk binding (cpm) ble bestemt som total binding

i fravær av en konkurrent (gjennomsnitt av duplikater) minus binding (cpm) i nærvær av 100 gangers overskudd umerket hpG-CSF (ikke-spesifikk binding). Den ikke-spesifikke binding var maksimalt 2503 cpm for WEHI-3B(D<+>)-celler, 1072

cpm for ANLL (M4)-celler og 1125 cpm for ÅNLL (M5B)-celler. Forsøk 1 og 2 ble utført på forskjellige dager under an-

125

vendelse av det samme preparat av I-hpG-CSF og gir inn-byrdes overensstemmelse i den prosentvise inhibering som fåes for 2000 enheter hpG-CSF. Erholdte data er gjengitt i tabell XXIII nedenunder.

125

Som vist i tabell XXIII, oppviste I-hpG-CSF binding til WEHI-3B(D<+>) leukemiceller. Bindingen ble inhibert på en doseavhengig måte ved hjelp av umerket naturlig hpG-CSF

eller rhpG-CSF, men ikke med GM-CSF. I tillegg ble binding av naturlig hpG-CSF til humane myelomonocyttiske leukemiceller {ANLL, M4) iakttatt. Bindingen til disse cellene ble sammenlignet med hensyn på respons med naturlig hpG-CSF i væskekul-turer ved differensiering til ferdige makrofager bedømt ved

125

hjelp av morfologi. Fraværet av binding av naturlig I-hpG-CSF til monocyttiske leukemiceller fra en annen pasient (ANLL,

M5B) antyder at visse leukemier differensielt kan uttrykke eller mangle reseptorer for hpG-CSF. Evnen til rhpG-CSF når det gjelder å konkurrere for binding av naturlig<125>I-hpG-CSF på samme måte som naturlig hpG-rCSF,antyder at reseptorene gjenkjenner begge formene like godt.

Disse undersøkelsene som viser bindingen av naturlig

125 ..

I-merket hpG-CSF til leukemiceller, ble sammenlignet i kultur ved hjelp av naturlig hpG-CSF<*>s evne til å indusere granulocyttisk og monocyttisk differensiering av benmargceller med lav densitet erholdt fra en pasient med en akutt promyelocyttisk leukemi (M3) og en andre pasient med en akutt myeloblastisk leukemi (M2). Celler fra hver pasient ble dyrket i 4 dager i medium alene eller i nærvær av 1 x 10<5>enheter rhpG-CSF. Celler fra M3-kontrollkulturene inkubert i medium alene var fortsatt promyelocyttisk av type; mens celler dyrket i nærvær av rhpG-CSF oppviste ferdige celler av myeloid-typen inkludert en metamyelocytt, "giant band"-form og segmenterte neutrofiler og monocytt. De faktiske forskjeller for denne pasienten, på 100 celler evaluert for kontrollen, 100% promyelocytter, og for de behandlede rhpG-CSF-celler, 22% blåster pluss promyelocytter, 7% myelocytter, 35% metamyelocytter, 20% "band"-former pluss segmenterte neutrofiler, 14% monocytter og 2% makrofager. Det bør legges merke til det faktum at en av de polymorfonukleære granulocytter fortsatt inneholdt en fremtredende Auer-stav, hvilket tyder på at i det minste denne cellen utgjorde en differensiert celle som tilhører den leukemiske klon. Celler fra den andre pasienten med en myeloblastisk leukemi (M2) ble også dyrket i 4 dager i nærvær eller fravær av rhpG-CSF. Visuell analyse av M2-celler dyrket i medium alene avslørte store "blast-lignende" celler, hvorav noen hadde nukleoler. Noen av M2-cellene differensierte, når de ble behandlet med rhpG-CSF, til ferdig segmenterte neutrofiler med rester av Auer-staver i sentrumsneutrofilen, noe som tyder på at differensiering har oppstått i en celle som tilhører den leukemiske klon. Den faktiske differensiering av 100 celler evaluert morfo-logisk avslørte at kontrollceller besto av 100% blastceller. rhpG-CSF-behandlede celler besto av 43% blastceller, 1% myelocytter, 15% metamyelocytter. 28% "Band"-former pluss segmenterte neutrofiler, 2% promonocytter og 11% monocytter. Leukemicellen ble også undersøkt med hensyn på differens-lering ved 4 andre konsentrasjoner av rhpG-CSF (5 x 10 3), 1 x IO<4>, 2,5 x IO<4>og 5 x IO<4>E/ml, data ikke vist). Selv ved den laveste konsentrasjon av rhpG-CSF som ble testet (5 x IO<3>E/ml), var det signifikant differensiering (celler differensierte utover myelocytter) av M3-(50%) og M2-(37%) leukemiceller.

6. Immunologisk analyse

For å fremstille polyklonale antistoffer for bruk

ved immunologisk analyse, var det antigen som ble anvendt, G-CSF med flere forskjellige virkninger renset fra den

humane urinblære-carcinomcelleiinje 5637 (1A6).

Dette materiale ble bedømt til å være 85% rent

basert på sølvnitratfarging av polyacrylamidgeler. 6

uker gamle Balb/C-mus ble immunisert med subkutane injek-sjoner av antigen på flere steder. Antigenet ble på nytt oppslemmet i PBS og emulgert med like store volumdeler Freund's komplette hjelpestoff. Dosen var 5 - 7 ug antigen pr. mus pr. injeksjon. En forsterkningsimmunisering ble administrert 18 dager senere med den samme mengde antigen emulgert med et like stort volum Freund's ukomplette hjelpestoff. 4 dager senere ble det tatt ut museserum for å teste med hensyn på

det antistoff som er spesifikt for human G-CSF med flere forskjellige virkninger.

"Dynatech Immulon II Removawell"-stripper

i holdere (DynateckLab., Inc., Alexandria, Virginia) ble belagt med 5 ug/ml hpG-CSF i 50 mM carbonat/bicarbonat-buffer, pH 9,2. Brønner ble belagt med 0,25 ug i et volum på 50 ul. Antigenbelagte plater ble inkubert 2 timer ved værelsetemperatur og over natten ved 4°C. Oppløsningen ble dekantert og platene ble inkubert i 30 minutter med PBS som inneholdt 5% BSA for å blokkere den reaktive overflate. Denne oppløsning ble dekantert og de fortynnede preimmun- eller testsera ble tilsatt til brønnene og det ble inkubert i 2 timer ved værelsetemperatur. Sera ble fortynnet med PBS, pH 7,0, som inneholdt 5% BSA. Serumoppløsningen ble dekantert og platene ble vasket tre ganger med "Wash Solution" (KPL, Gaithers-burg, Maryland). Omtrent 200.000 cpm jodert kanin-anti-mus-IgG (NEN, Boston, Massachusetts) i 50 ul PBS, pH 7,0, som inneholdt 1% BSA, ble tilsatt til hver brønn. Etter inku-bering i 1 - 1/2 time ved værelsetemperatur ble oppløsningen dekantert og platene ble vasket 5 ganger med "Wash Solution". Brønner ble fjernet fra holder og helt i en Beckman 5500 t~teller. Høy-titrede museserum oppviste mer enn 12 ganger høyere reaktivitet enn de tilsvarende preimmunsera ved en fortynning på 1:100.

De immunologiske egenskaper til hpG-CSF avledet fra

E. coli ble bestemt ved hjelp av reaktivitet til høy-titret museserum som er spesifikt for pattedyrcelleavledet hpG-CSF. 0,25 ug 90% rent protein avledet fra E. coli ble belagt på "Immulon IIRemovawells" i et volum på 50 ul og museserum ble analysert som beskrevet ovenfor.

Høytitrede musesera oppviste 24 ganger høyere reaktivitet mot materiale avledet fra E. coli enn de tilsvarende preimmunsera ved en fortynning på 1:100.

7. Biologiske analyser av Serin- analoger

[Ser<17>]hpG-CSF-, [Ser<36>]hpG-CSF-, [Ser<42>lh<p>G-CSF-, [Ser<64>]h<p>G-CSF- og [Ser<74>]hpG-CSF-produkter

. ble analysert med hensyn på hpG-CSF-aktivitet i<3>H-thymidin-opptaks-, CFU-GM- og WEHI3BD<+->prøver.I hver prøve hadde [ser 17]-analogen en aktivitet som var sammenlignbar med aktiviteten til rekombinante molekyler med den naturlig fore-

kommende struktur. De gjenværende analoger hadde i størrelses-orden 100 ganger mindre aktivitet i H-thymidin-opptaksprøven, 250 ganger mindre aktivitet i CFU-GM-prøven og 500 ganger mindre aktivitet i WEHI-3B D<+->prøven. Disse data understøtter forslaget om at cysteiner i stillingen 36, 42, 64 og 74 kan være nødvendig for full biologisk aktivitet.

8. In vivo biologisk analyse

Osmotiske pumper av type "Alzet" (Alzet Corp., Palo Alto, CA; Model 2001) ble tilknyttet innsatte katetere i den høyre halsvene som var implantert subkutant i 7 syriske gull-hamstere av hankjønn. 4 av pumpene inneholdt en buffer [20 mM natriumacetat (pH 5,4) og 37 mM natriumklorid] og 1,5 mg/ml hpG-CSF avledet fra E. coli, mens 3 inneholdt buffer alene. Den pumpehastighet som var påkrevet for de osmotiske pumpene, var 1 pl/time i opp til 7 dager. På den tredje dag etter im-plantering av pumpene var det gjennomsnittlige granulocytt-tall for de 4 behandlede hamstere 6 ganger høyere enn for de 3 (buffer) kontrollene, og det økte granulocy.tt-tall ble gjenspeilet i en 4 ganger økning i totalt antall lymfocytter. Erythrocytt-tall var uforandret etter behandlingen. Disse resultatene indikerer at det rekombinante materiale gir en spesifikk økning i produksjon og/eller frigivelse av granulocytter i et pattedyr.

I tillegg til de naturlig forekommende allel-

former av hpG-CSF, omfattes også andre hpG-

CSF-produkter, slik som polypeptidanaloger av hpG-CSF og fragmenter av hpG-SCF. Ved å følge fremgangsmåten ifølge den ovenfor angitte publiserte søknad fra Alton et al., (W0/83/ 04053), kan man lett utforme og fremstille gener som koder for mikrobiell ekspresjon av polypeptider med primærkonfor-masjoner som adskiller seg fra konformasjonene som her er angitt når det gjelder identiteten av eller plasseringen av én eller flere rester (f.eks. substitusjoner, terminale og mellomliggende addisjoner og "deletions"). Alternativt kan modifikasjoner av cDNA og genomgener lett utføres ved hjelp av velkjente stedsrettede mutageneseteknikker, og anvendes til å frembringe analoger og derivater derav. Slike produkter ville ha mifist én av de biologiske egenskapene til hpG-CSF, men kan være forskjellig med hensyn til andre. Som eksempler omfatter tilsiktede produkter de som er blitt for-

kortet ved f.eks. "deletions"; eller de som er mer stabile overfor hydrolyse (og derfor kan ha mer uttalte eller langvarige virkninger enn naturlig forekommende produkter); eller de som er blitt endret for å fjerne ett eller flere potensielle steder for O-glycosylering (som kan resultere i høyere aktiviteter for gjærproduserte produkter); eller som har én eller flere cysteinrester fjernet eller erstattet med, f.eks. alanin- eller serinrester, og er potensielt lettere

å isolere i aktiv form fra mikrobesystemer; eller som har én eller flere tyrosinrester erstattet med fenylalanin og kan binde mer eller mindre lett til hpG-CSF-reseptorer på målceller- Også omfattet er polypeptidfragmenter som dupli-kerer bare en del av den kontinuerlige aminosyresekvens eller sekundære konformasjoner i hpG-CSF, fragmenter som kan ha én aktivitet (f.eks. reseptorbinding) og ikke andre (f.eks. kolonivekststimulerende aktivitet). Det er verd å merke seg at aktiviteten ikke er nødvendig for at ett eller flere av produktene ifølge oppfinnelsen skal ha terapeutisk utnyttbar-het [se Weiland et al., Blut, 44, 173-175 (1982)] eller ut-nyttbarhet i andre sammenhenger, slik som i prøver på hpG-CSF-antagonisme. Konkurrerende antagonister kan være svært nyttige i f.eks. tilfeller med overproduksjon av hpG-CFS.

Ifølge et annet aspekt er den DNA-sekvens

■ som her er beskrevet og som koder for hpG-

CSF-polypeptider, verdifull med hensyn til den informasjon som tilveiebringes vedrørende aminosyresekvensen til pattedyr-proteinet som hittil har vært utilgjengelig til tross for analytisk bearbeiding av isolater av naturlig forekommende produkter. DNA-sekvensene er også påfallende verdifulle som produkter som kan brukes til å bevirke mikrobiell syntese av hpG-CSF i stor skala ved hjelp av en rekke forskjellige rekombinante teknikker. Sagt på en annen måte så er DNA-sekvenser tilveiebragt, som er anvendbare når

det gjelder å frembringe nye og nyttige virale og ringformede plasmid-DNA-vektorer, nye og nyttige transformerte og transfi-

serte mikrobielle prokaryote og eukaryote vertceller (inkludert bakterie- og gjærceller og pattedyrceller dyrket i kultur), og nye og nyttige metoder for vekst i kultur av slike mikrobe-vertceller som er i stand til å gi ekspresjon av hpG-CSF og

■dets beslektede produkter. DNA-sekvensene er også ; påfallende egnede materialer for bruk som merkede prober ved isolering av hpG-CSF og beslektede protein-kodende human genom-DNA, samt cDNA- og genom-DNA-sekvenser fra andre pattedyrarter. DNA-sekvenser kan også være anvendbare ved forskjellige alternative fremgangsmåter for proteinsyntese (f.eks. i insektceller), eller ved genetisk terapi av mennesker og andre pattedyr. DNA-sekvensene forventes å være anvendbare ved utvikling av transgenetiske pattedyr-

arter som kan tjene som eukaryote "verter" for fremstilling av hpG-CSF og hpG-CSF-produkter i større mengder. Det vises generelt til Palmiter et al., Science, 224( 4625), 809-814

(1983) .

Anvendbare på hpG-CSF-fragmentene og polypeptid-analogene er rapporter vedrørende den immunologiske aktivitet til syntetiske peptider som i vesentlig grad dupli-kerer aminosyresekvensen som finnes i naturlig forekommende proteiner, glycoproteiner og nukleoproteiner. Nærmere bestemt er forholdsvis lavmolekylære polypeptider blitt påvist å delta i immunreaksjoner som i varighet og utstrekning er lik med immunreaksjonene til fysiologisk signifikante proteiner, slik som virusantigener, polypeptidhormoner og lignende. Inkludert blant immunreaksjonene til slike polypeptider er fremkallingen av dannelse av spesifikke antistoffer i immunologisk aktive dyr. Se f.eks. Lerner et al., Cell, 23, 309-

310 (1981); Ross et al., Nature, 294, 654-656 (1981); Walter et al., Proe. Nati.Acad. Sei ( USA), 77, 5197-5200 (1980);

Lerner et al., Proe. Nati. Acad. Sei ( USA), 78, 3403-3407

(1981) ; Walter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 78, 4882-4886 (1981); Wong et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 78, 7412-7416 (1981); Green et al., Cell, 28, 477-487 (1982);

Nigg et al., Proe. Nati. Acad, Sei. ( USA), 79, 5322-5326

(1982) ; Baron et al., Cell, 28, 395-404 (1982); Dreesman et al.,

Nature, 295, 185-160 (1982) og Kerner et al.. Scientific American, 248, nr. 2, 66-74 (1983). Se også Kaiser et al., Science, 2 23', 249-255 (1984) vedrørende biologiske og immunologiske virkninger av syntetiske peptider som omtrentlig deler sekundærstrukturer hos peptidhormoner, men ikke be-høver å dele deres primære strukturkonformasjon.

Claims

1. Anvendelse av et hpG-CSF-polypeptid som omfatter sekvensen angitt i tabell VII, til fremstilling av et medikament for å stanse proliferasjon av leukemiceller.

2. Anvendelse av hpG-CSF-polypeptidet ifølge krav 1, hvor hpG-CSF er en modifisert hpG-CSF valgt fra gruppen bestående av: [Ser<17>] hpG-CSF, [Ala<1>] hpG-CSF, [Ser<36>] hpG-CSF, [Ser<42>] hpG-CSF, [Ser" ] hpG-CSF, [Ser<74>] hpG-CSF, [Met"1 ] hpG-CSF, [Met"<1>, Ser17 ] hpG-CSF, [Met"<1>, Ser36 ] hpG-CSF, [Met"<1>, Ser42 ] hpG-CSF, [Met"<1>, Ser64 ] hpG-CSF og [Met"<1>, Ser<74>1 hpG-CSF,

3. Anvendelse av hpG-CSF-polypeptidet ifølge krav I, hvor hpG-CSF er kjennetegnet ved DNA-sekvensen som koder for aminosyresekvensen 1-174 i tabell VII, med en ytterligere metionylrest i -l-stillingen.