CN1101403C - 粒细胞集落刺激因子的制备 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种G-CSF的制备方法，包括构建一种特征为：A.缺陷一系列特殊蛋白酶，以保证分泌出的蛋白不被降解；B.具有较脆弱的细胞外膜，可使分泌出的蛋白能够通过低渗冻融的办法释放出来；的大肠杆菌基因工程菌，菌体发酵培养，纯化分泌出的G-CSF等步骤。
Description
本发明涉及多肽药物的制备，特别是涉及G-CSF的制备，具体地说是采用基因重组技术制备分泌型人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的方法。该方法包括G-CSF基因工程菌的构建、菌体发酵培养、蛋白纯化等过程。采用该方法制备G-CSF，工艺简单、稳定，适于工业化生产，生产出的产品，其结构及生物活性与天然G-CSF完全一致。人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种能够促进中性粒细胞增殖与分化，维持人体正常免疫功能的重要造血因子。早在70年代，人们发现体外组织细胞培养上清、器官提取物及某些能在体外长期生长的细胞系，能产生一些刺激白细胞前体增殖、分化形成集落的活性物质，并称之为集落刺激因子(Colony stimulating factor CSF)。1977年，人们首次从小鼠肺组织条件培养液中分离纯化出能够刺激粒细胞和巨噬细胞集落形成，分子量为单一成份的糖蛋白，并将其命名为GM-CSF(Burgess et al，1977.)1983年，Nicola等人又从经细胞内毒素刺激过的小鼠肺组织条件培养液中分离出一种能特异地刺激粒细胞集落形成的CSF，并命名为G-CSF(Nicola et al，1983)。1985年，Welte首次纯化出人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(Welte etal，1985)，不久，Souza等人又克隆出其基因，并将其成功地在E.Coli中表达。E.Coli中表达的重组G-CSF分子虽不带多糖，却具有与天然G-CSF完全相同的体外生物学活性(Souza etal，1986)。80年代中期以来，随着G-CSF基因的克隆及其在体外表达的成功，人们得以对其分子结构及生物学功能进行广泛深入的研究，并于90年代初将其正式应用于临床，治疗包括化疗放疗所致中性粒细胞减少，骨髓移植，骨髓异常增生综合症(MDS)，再生障碍性贫血所致中性粒细胞减少，AIDS病等病症。G-CSF的发现与临床应用被称为本世纪药物研究的第三个里程碑。由于G-CSF具有巨大的临床应用价值，采用先进的基因工程技术进行生产，降低生产成本，提高产品质量显得十分重要。目前G-CSF在大肠杆菌中表达所采用的是包含体技术，它将G-CSF先在大肠杆菌中表达成不具生物活性的包含体，然后通过包含体复性过程，使之恢复成具有生物学活性的形态，这一过程耗时长，工艺复杂，收率低，产品N-末端比天然产物多一个蛋氨酸，其稳定性及生物学活性均不如天然产物。通过反复研究，我们发明了在大肠杆菌中分泌表达G-CSF的独特技术。这套技术工艺简单，回收率高，生产成本低，周期短，所得G-CSF与天然G-CSF具有完全一致的蛋白一级序列。它稳定性好，且具有与天然产物同等的生物学活性，解决了现有技术中存在的问题。本发明提供了一种以特殊的大肠杆菌菌系为载体的的表达用工程菌，这种工程菌具有如下特点：(1)它的部分蛋白酶基因被突变，因而使得某些易于被大肠杆菌降解的蛋白产物得以保护；(2)它的外膜较一般大肠杆菌更易破裂，因而纯化目标蛋白时，有利于目标蛋白从菌体中的释放。在表达质粒的构建方面，具有如下特点：(1)在目标蛋白基因前加入了大肠杆菌蛋白的分泌信号肽。这一信号肽在目标蛋白的翻译时可与目标蛋白形成融合蛋白，并可使目标蛋白从细胞内转运到细菌内外膜之间的细胞间质中，并在转运的过程中使细菌信号肽自动切除，最终在细胞间质中获得具有天然生物学活性和蛋白一级序列的目标蛋白。(2)采用一类启动子，这类启动子的强度应该是随着发酵的不断进行而逐步加强，这是因为分泌型最重要的特点是能够将目标蛋白正确地折叠成天然构象，而蛋白折叠过程需要一定的时间，因此细菌生长时应控制启动子启动速度，保证目标蛋白产生的速度与其折叠的速度能够相匹配。本发明还提供一种采用分泌型技术，并以上述表达工程菌为菌株生产G-CSF的方法。本方法的技术关键之一是控制较低的发酵温度，采用该技术可以提高发酵产量，也可使分泌速度减慢，使分泌出的蛋白都具有正确的构象和较高的生物学活性，同时也降低蛋白被降解的机率；本方法的技术关键之二是在蛋白提纯时，首先采用低温低渗的办法破坏细菌外膜(不破坏细菌内膜)，使分泌出的蛋白释放到缓冲液中，由于细胞膜未被破坏，故细菌体内的大量杂蛋白及DNA等都可以从一开始就与目标蛋白分离.此后，采用(NH4)2SO4沉淀结合等电点沉淀的办法，能够去除大量杂蛋白，并使目标蛋白的纯度接近70％，量后，依次使用分子筛层析；阳离子交换柱层析；脱盐；阴离子交换柱层析的纯化办法，获得纯度＞99％的G-CSF。产品活性及稳定性达到天然G-CSF的水平。本发明的实施步骤如下：步骤一，表达质粒的构建1.G-CSF基因的克隆hG-CSFcDNA可以采用RT-PCR法制备。2.表达载体的构建根据表达载体克隆位点的要术，5’端和3’端PCR引物中分别设计相应的酶切位点，5’端引物在酶切位点后与G-CSF的cDNA起始核苷酸之间是一段细菌蛋白信号肽的寡聚核苷酸，引物设计时应注意顺序设计，最终应使得信号肽的最后一个密码子与G-CSF的N-F末端第一个氨基酸的密码子紧密连，翻译时能够行成一个信号肽与G-CSF的融合蛋白。在这一表达质粒中，应采用一类特殊启动子，这类启动子强度应该是随着发酵的不断进行而加强，这是因为分泌型最重要的特长是能够将目标蛋白正确地折叠成天然的构象，而蛋白折叠过程需要一定的时间，因此细菌生长时应控制启动子启动速度，保证目标蛋白产生的速度与其折叠的速度能相匹配。对T7，Lac及热敏启动子，它们一旦被启动，强度及即非常强，并迅速地产生大量目标蛋白，这些目标蛋白通常来不及正常折叠，因此，在这些体系中表达的蛋白大部分以包含体形式存在。步骤二、表达用工程菌的构建应选用一种适合于表达分泌型蛋白质的大肠杆菌K12系列菌种，这种菌种其外膜相对较为脆弱，易于在纯化时通过简单的物理化学处理将储存在外膜内的蛋白释放出来，而在此过程中其内膜又不应被破坏，对这些菌种应采用同源重组的办法除去一系列蛋白酶，以使得G-CSF在表达后不会被降解。步骤三，G-CSF工程菌的发酵1、发酵培养基发酵培养基应根据所选用的启动子不同而确定配方，如采用trp启动子时应选择含色氨酸较低的培养基，若采用phoA启动子，则应选择低磷培养基。2、发酵温度发酵培养温度的选择应同时考虑到目标蛋白在细胞间质中的稳定性，同时，又要兼顾培养时间和蛋白表达速度，在同样条件下，应使培养时间尽量缩短，以缩短目标蛋白暴露在细胞间质中的蛋白酶的时间，蛋白表达速度应使得表达速度、目标蛋白折叠速度及目标蛋白从内膜转运到细胞间质中的时间相互匹配，从而使得所有表达出的蛋白都能以正常的空间构象分泌到细胞间质中，以包含体形式存在的蛋白最少。3、溶氧条件溶氧是控制目标蛋白表达的关键环节之一，为使表达出的目标蛋白都尽可能多的分泌到细胞间质中，应尽可能使细菌保持充分的有氧代谢生长状况，因此，在分泌型表达时，维持尽可能大的DO2，充分满足细菌生产所需要的氧气是非常重要的。4、PH值不同的PH值对于G-CSF表达没有直接影响试验发现，在较低PH时，表达出的蛋白基本没有聚合，而在较高PH时，可见有少量蛋白聚合物，宜选择在不影响细菌生长的前提下以较低的PH作为培养的PH值。步骤四，蛋白纯化1，裂解菌体分泌型G-CSF主要分泌在大肠杆菌外膜与内膜之间的细胞间质中(periplasm，95％左右)，因此在裂解菌体时应考虑如何只破碎细胞外膜而不影响内膜，从而可以最大限度地提取出所有分泌出的G-CSF，而又不受细胞内杂蛋白(尤其是蛋白酶)及核酸的影响，实验证明，采用低渗冻融能有效地抽提出分泌出的G-CSF(收率＞90％)而又不影响细胞内膜。低渗溶液的PH可以是酸性或碱性，体积一般为菌体湿重量的7-8倍。2，盐析蛋白纯化起始时所考虑的办法通常是盐析，这样可以非常简单迅速地除去大量的杂蛋白，G-CSF是一种疏水性很强的蛋白质，对无机盐非常敏感，而这种敏感性又随不同的PH而有所不同。在盐析时，我们考虑到这一特殊因素采取了二步盐析的办法，分别采用不同种类的无机盐，并在不同PH下进行盐析，盐析后，沉淀中G-CSF的纯度可达到70％左右，并除去了大量的色素分子。3，精制纯品盐析后的G-CSF样品中，仍有不少杂质，主要为色素、杂蛋白、核酸及热源。在设计层析精纯时，可以选用不同的介质，以除去不同类型的杂质，同时也要考虑不同介质使用的先后次序，以便最大限度地提高层析的收率，减少中间步骤。经过反复实验，我们采用分子筛，阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，脱盐等纯化方法。分子筛柱主要用于分离高分子量的杂蛋白及部分热源；离子交换树脂用于除去另一些杂蛋白、核酸，热源及残余的少许杂蛋白。这样的纯化组合，中间步骤少，纯化率高，收率可达35％左右，最后纯度可达99％，具有很高的工业生产价值。以下为实施例，本发明的实施例不应作为对本发明的限制
实施例：-，质粒PSTII构建方法我们用于构建表达质粒的起始质粒为PSTII，其结构包括性磷酸酶启动子(PhoA)，翻译增强子序列，SD序列，TET抗性基因，复制起点及用于分泌用的信号肽基因序列，它来源于细菌内毒素蛋白STII其氨基酸顺为：M K K N I A F L L A S I A T N A A Y2，表达用质粒PGCSF/W3110的构建(1)G-CSFcDNA的克隆G-CSFcDNA可以采用RT-PCR法制备(2)G-CSF cDNA的扩增采用PCR法，PCR引物设计的方法为：根据表达载体克隆位点的要求，在5’端和3’端PCR引物中分别设计mlul和BamHI2个酶切位点，5’端引物在mluI位点后与rhGCSFcDNA起始核苷酸之间是-，段STII信号肽的寡聚核苷酸，其顺序与在质粒PSTII中对应的顺序(5个寡聚核苷酸)完全一。这样在克隆后信号肽的序列以完全恢复。另外3’端PCR引物在BamHI点前设计有-SalI切点用于克隆，具体序列如下：Bakward primer(5’端PCR引物)：5’ ACCTAG ACT AC GGA TCC AAC GATGTC GAC TCA GGG CTG GGC AAGGTG
BamHI SalI GCSF C-端GCG3’(3)表达载体的构建扩增合成的rhG-CSF cDNA及质粒PSTII均经BamHI酶切消化后进行连接转化DH5a感受态，通过筛选，获得中间质粒PG-CSF1。中间质粒PG-CSF1用SpeI和SalI消化得到含G-CSF及STII信号肽的片断，PHGH用SpeI和XhoI消化得到含Tet抗性基因，碱性磷酸酶动子以及P15复制起点Ori的片断，将二个片断用连接酶连接，转化DH5a感受态通过筛选，获得最终表达用质粒PG-CSF.pG-CSF转化W3110感受态后即获得表达工程菌PG-CSF/W3110二，G-CSF的生产制造1发酵培养基我们选用发酵用培养为半合成培养基，其配方为：(1)MgSO4·7H2O 18g(2)无机盐混合物NaH2PO4·2H2O 13.5g
K2HPO4·3H2O 33g
(NH4)2SO4 70g(3)葡萄糖 15g
蛋白胨 54g
酵母粉 75g(4〕微量元素液
FeCl3·6H2O 27g
CoCl3·6H2O 2g
H3BO5 2g
Na2MoO4·2H2O 7g
ZnSO4·7H2O 8g
CuSO4·5H2O 8g
MnSO4·H2O 5g
1M HCl 100ml
加水至1L，取15ml使用发酵期间不断流加50％葡萄糖。2、培养条件
(1)温度：初期为37℃，后逐步降为30℃。
(2)溶氧：我们在发酵过程中，始终使DO2处于25％左右，为此须具备如下条件：
a.随时增加通气量，特别在细菌进入对数期后；
b.保持较低葡萄糖浓度，使得细菌生长不致过快，尤其在对数期，应控制加入的葡萄糖的量；
c.提高搅拌转速。起始时由于细菌密度较低，不宜用过高转速，进入对数期后，DO2迅速下降，增加转速可以与增加通气量配合，使DO2不致降得过低；在对数期后期，虽然细菌代谢减慢，但由于菌体密度大，故亦需一直维系较高的转速。
(3)PH值；6.2-6.93、菌体的收集G-CSF一般在细菌生长到对数期的后期时开始表达(12小时左右)，但由于表达速度较馒，故应在对数期后维持细菌的不断生长(不少于12小时左右)，使表达能不断地进行，增加表达率。在27小时后，部分菌体开始死亡，培养基PH开始缓慢上升，此时应尽快离心收集菌体。我们采用CEPA连续型离心机，4℃，2万转，20分钟后离心过程即全部完毕，立即将菌体置于-80℃冰柜中。为保证菌体能迅速地深度冷冻应将菌体压成片状，冷冻24小时以上。4、冻融裂解菌体我们采用8℃的10mM TRIS.PH8.0缓冲液，体积为菌体湿重量的7-8倍。在较温和搅拌条件下搅拌2小时，用连续型离心机离心，4℃，2万转，30分钟，收集上清，电泳检查可发现上清液中GCSF纯度已达40％左右，在残渣中基本没有G-CSF。
5、盐析
(1)硫酸铵沉淀我们采用饱和度为45％的硫酸铵，保证回收绝大数G-CSF而又不沉淀出过多杂蛋白。离心后，沉淀中G-CSF的纯度可达到55％左右，并除去了大量色素分子。
(2)氯化钠沉淀收集硫酸铵沉淀，G-CSF溶解后，再加入氯化钠调至2M，离心收集沉淀。离心后，沉淀中G-CSF的纯度可达到70％左右。
6、精制纯品
(1)分子筛纯化我们采用5.0*100cm的Sephacry1 S-100柱，缓冲液为10mMHAC-NaAc，0.05M NaCl，PH4.0，上样体积约3％，流速120ml/h，纯化的样品中目的蛋白含量占90％左右。
(2)CMSepharose采用5*40cm柱，床体积约200ml，上样缓冲液10mM Hac，pH4.0，0.05MNaCl，样品全吸附在柱上，用10mM HAc，pH4.0，0.16MNaCl洗脱出杂蛋白后，改用0.25MNaCl将GCSF峰洗出，洗出峰的纯度可达越95％左右。
(3)DEAF-Sepharose-EF将CM-Sepharose洗脱出的蛋白用G25脱盐后，直接上DEA-Sepharose-FF(5*20cm柱，柱体积200ml)，GCSF直接流穿。
7、产品纯度鉴定
(1)银染SDS-PAGE采用氨银法，经扫描鉴定纯度可达99％。
(2)分子筛HPIC，采用ProteinPAK125柱，纯度为100％。
(3)生物活性鉴定采用NSF-60细胞株进行鉴定，并与进口G-CSF(Filgrastim，Kirin-Amgen)进行比较，可见其比活达2.2*10U/mg。超过Felgrastim约1.5倍。
(4)N-末端鉴定采用Edmam降解法，结果证实与天然G-CSF完全一致。
PSTII的克隆方法：1、PCR clone bacterial phosphatse(alkaline)phoA promoter
Primer
BACKWARD5’TCT AGTATA CAG
GAA TTC AAC TTC TCC ATA CTT TGG ATA AGG 3’
EcoRl
FORWARD5’GTA GCG ATA TTC
ACT AGT TAC AAA TAC ATT AAA AAA TAA AAA CAAAGC Spe I2、Scheme
primer1
2 ClaI
SpeI primer3 primer4
Primer15’
CT AGT
ATG AAA AAG AAT ATC GCA TTT CTT GCA TCT ATG TTC
SpeI Met
Primer25’GTT TTT TC ATT GCT ACA AAT GCC TAT GCA
AT 3’
Primer35’AAT AGA AA AAC GAA CAT AGA TGC AAG AAG AAA TGC GAT ATT CT TTTCAT A3’
Primer4
5’CG AT TGC ATA GGC ATT GT AGC3’
Claims (5)
1.一种大肠杆菌菌株，其保藏编号为：CCTCC NO.98007。
2.权利要求1所述的大肠杆菌菌株，内含一种蛋白表达质粒，该质粒可将人G-CSF蛋白分泌到大肠杆菌细胞外膜与内膜之间的细胞间质中。
3.权利要求2所述的大肠杆菌菌株，其特征在于：培养后分泌出的人G-CSF，经纯化，其N-末端95％以上不被降解，生物学活性不低于2.2×108U/mg，纯度通过HPLC方法及银染SDS-PAGE方法鉴定不低于99％。
4.用权利要求1所述的大肠杆菌菌株制备人G-CSF的方法，其特征在于：
a.构建权利要求1所述的基因工程菌，
b.菌体发酵培养，
c.纯化分泌出的人G-CSF蛋白。
5.权利要求2所述的大肠杆菌中所含的蛋白表达质粒。
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Address after: 130012 No. 72 Tianhe street, hi tech Industrial Development Zone, Jilin, Changchun Patentee after: Jinsai Drug Co., Ltd., Changchun Address before: 130012 No. 72 Tianhe street, hi tech Industrial Development Zone, Jilin, Changchun Patentee before: Changchun Genscience Pharmaceuticals Co., Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 130012 No. 72 Tianhe street, hi tech Industrial Development Zone, Jilin, Changchun Patentee after: Changchun Genscience Pharmaceuticals Co., Ltd. Address before: 130012 No. 72 Tianhe street, hi tech Industrial Development Zone, Jilin, Changchun Patentee before: Jinsai Drug Co., Ltd., Changchun |
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| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20030212 |
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| CX01 | Expiry of patent term |