KR920008378B1

KR920008378B1 - 인간 인슐린 유사 성장 인자-i의 정제방법

Info

Publication number: KR920008378B1
Application number: KR1019900023102A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 강일구
Original assignee: 주식회사 럭키; 최근선
Priority date: 1990-12-31
Filing date: 1990-12-31
Publication date: 1992-09-26
Also published as: KR920012437A

Abstract

내용 없음.

Description

인간 인슐린 유사 성장 인자-I의 정제방법

제1도는 본 발명의 인간 인슐린 유사 성장인자-I을 각각 본 발명의 정제단계에 따라 SDS-폴리아크릴아마이드겔 상에 나타낸 것으로, 제1레인과 제6레인은 단백질 마커이고, 제2레인은 배지에 분비된 인간 인슐린 유사 성장인자-I을 함유한 전체 효모 단백질을 나타낸 것이며, 제3레인은 CM 음이온교환수지로 정제한 인간 인슐린 유사 성장인자 -I이고, 제4레인은 DE 양이온교환수지로 정제한 인간 인슐린 유사 성장인자-I이며, 제5레인은 S-100겔 여과크로마토그래피를 통과시켜 정제된 인간인슐린 유사 성장인자-I이다.

본 발명은 인간 인슐린 유사 성장인자-I(Insulin-like Growth Factor-I, IGF-I, 이하 ＂IGF-I＂)의 정제 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전공학적인 방법에 의해 효모에서 대량 발현된 순도 낮은 인간 인슐린 유사 성장인자-I을 고순도의 인간 인슐린 유사 성장인자로 정제하는 방법에 관한 것이다.

인간 인슐린-유사 성장인자-I(IGF-I 혹은 Somatomedin-C. Salmon, W.D.et al., J. Lab. Clin. Med. 49,825(1957) : Daughaday et al., Nature, 235, 107(1972) : Rinderknect. E. et al., Rroc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 73, 4379(1976) : Rinderknecht, E. et al. J. Biol. Chem. 253,2769(1978))은 70개의 아미노산으로 구성된 염기성의 폴리펩타이드 호르몬으로 인간의 혈장에서 추출된 것을 기초로 하여 여러 연구자들에 의해 이미 그 성질이 밝혀져 있다. (Liberti. J.P.et al, J Biol, Chem., 255.1823 (1980), Svoboda. M.E.et al. Biochemistry 19, 790(1980))

이 성장인자는 성장 호르몬의 작용을 중재하는 역할(Vanwyk, J.J. et al. Recent. Progr. Horn. Res, 38, 259 (1974))을 하는데 특히 소마토트로핀(Somatotropin)의 성장 촉진 작용들의 대부분에 관여(Klapper, D.G. et al, Endocrinology, 112, 2215(1983))하고 있고, 이 성장 인자의 결합시 레이론형(Laron-type) 난쟁이증이 생긴다는 보고가 있다(Laron, Z., Ergeb., Inn. Med. Kinderhelikd., 51.117(1984)). 주로 간에서 생성되는 것으로 알려져 있는 이 폴리펩타이드(Phillips, L.S. et al., Endocrinology, 98, 606-614(1976))는 난쟁이의 치료등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나(Robinson, I.C.A.F. et al. Nature. 326(9) 549(1987))생체내에 극미량이 존재하기 때문에(Vacster, R.C., Abvances in Clinical Chemistry, 25,49)실질적인 활용이 어려웠다. 의료용으로 사용되는 인슐린 유사 성장인자-I는 혈장으로부터 순수 정제시 보통 100리터 혈장당 1㎎미만이 정제되기 때문에 그 희구성으로 인해 사용이 제한되어 왔으나 합성을 통해 얻은 성장인자도 원래의 것과 생물학적 및 면역학적으로 동일한 것으로 알려져 있다(Vanwyk et al, P.N.A.S., 81, 740(1984))

종래, 인간 인슐린 유사 성장인자-I의 대량 생산방법으로 폴리펩티드의 화학적인 합성에 의한 방법(Li. C.H. et al, Proc. Natl.Acad.Sci., 80,2216(1983))이나 대장균을 숙주로 한 유전자 재조합법(Buell, G., Nucleic Acids Res., 13(6), 1923(1985)), 혹은 효모를 숙주로 하여 배지내로 인간 IGF-I을 분비하도록 하는 방법(Elliott et al., J.Prot.Chem.,9(1), 95-104,(1990))등이 이용되어 왔으나 뷰엘의 방법은 인간 IGF-I을 대장균체 내에서 발현시킴으로써 정제에 어려움이 따르고 대장균 자체의 내독소에 의한 오염을 제거하기 어려우며, 라이 등의 방법은 합성된 폴리펩티드의 정제후 그 생리활성도를 회복시키기 어렵다는 문제점이 있었으며 또한 엘리트의 방법의 경우는 정제과정중 고농도의 요소를 사용하여야 하므로 정제 비용이 많이 든다는 단점과 정제과정 상 불편함이 있고 요소의 불안정성으로 단백질의 변성이 일어날 가능성이 있다.

본 발명자들은 효모를 숙주로 하여 재조합 인간 IGF-I을 배지내에 분비하도록 하므로써 상기와 같은 3차 구조상의 문제나 내독소의 문제를 해결하고 요소를 사용하지 않는 정제과정을 단순화한 발명을 출원하였는바, 상기의 경우는 종래 발명이 가지는 3차 구조상의 문제나 내독소에 의한 오염문제 등은 근본적으로 해소하였고 정제방법도 간편화하였으나, 조정제 및 농축과정에서 염화나트륨의 직사 농도 기울기에 의해 인간 IGF-I를 정제하는 것은 용출된 인간 IGF-I으로부터 염화나트륨을 별도로 제거해야하는 문제가 있다.

이에 본 발명은 상기의 문제점들을 극복하고 생산된 인간 IGF-I을 정제하는데 있어 보다 간편화된 방법으로 고순도의 목적단백질을 대량으로 제공할 수 있는 인간 IGF-I의 정제방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 인간 인슐린 유사 성장 인자-I의 제조방법으로, 보다 상세하게는 인간 IGF-I유전자를 가진 효모를 최소 영양배지 내에서 배양하여 얻은 종자 배양액을 인간 IGF-1이 배지속으로 분비되도록 2％의 포도당, 각각 0.01％의 아데닌 및 유라실을 포함하는 영양배지에서 배양하여 이를 10밀리몰 pH5.6 인산완충액으로 평형시킨 음이온 교환수지 컬럼에 통과시킨 후 완충용액으로 세척하여 280nm에서 완충용액의 흡광도가 0이 되게 한 다음, 염화나트륨 용액으로 용출시켜 인간 IGF-I을 함유하는 분획을 수합하고 다시 10밀리몰 트리스 완충용액으로 평형시킨 DE53 양이온 교환수지 컬럼을 통과시킨 다음 YM3 한외여과막을 이용하여 5밀리리터까지 농축한 후 이를 미리 식염을 함유시킨 인산완충용액으로 평행시킨 S-100 겔 여과컬럼을 통과하여 정제하는 인간 IGF-I의 정제방밥에 있어서, 염화나트륨 농도 구배 대신에 pH9.5 탄산나트룸 완충액을 사용하는 인간 IGF-I의 정제방법인 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 인간 IGF-I 유전자를 가진 효모를 최소 영양 배지 내에서 배양하여 얻은 종자 배양액을 2％의 포도당, 각각 0.01％의 아데닌 및 유라실을 포함하는 영양배지에서 배양하여 인간 IGF-I을 배지속으로 분비시키고 이를 한외여과막을 이용하여 농축하고 인산완충액에서 투석한 후, 10밀리몰 pH5.6 인산완충액으로 평형시킨 CM-세파로스 음이온 교환수지 컬럼에 통과시켜 이를 같은 완충액으로 세척하여 280nm에서 완충용액의 흡광도가 0이 되게 한 다음, 탄산나트륨 완충용액(pH9.5)으로 용출시켜 인간 IGF-I을 함유하는 분획을 수합하고, 다시 10밀리몰 트리스 완충용액으로 평행시킨 DE53 양이온 교환수지컬럼을 통과시킨 다음 YM3 한외여과막을 이용하여 5밀리리터까지 농축한 후 이를 식염을 함유시킨 인산완충용액으로 평행시킨 S-100 겔 여과컬럼을 통과하여 고순도의 인간 IGF-I를 대량 정제하는 보다 간편하고 단순화된 인간 IGF-I의 정제방법인 것이다.

상기 실시예에 의해 정제된 인간 IGF-I에 대해 각 단계에서 마다 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시하여 그 결과를 제1도에 나타내었다. 제1레인과 제6레인은 표준 분자량의 단백질 마커이며 제2레인은 정제되지 않은 효모 단백질이고 제3레인은 CM-세파로스 컬럼을 통과 시킨 후의 시료이고 제4레인은 DE53 양이온 교환수지를 통과시킨 후의 시료이며 제5레인은 S-100 겔 여과 컬럼을 통과시킨 후의 시료로써, 제1도에 나타난 바와 같이 각 정제 단계마다 인간 IGF-I에 해당하는 단백질 띠가 분명하고 정제 단계가 계속됨에 따라 그 띠가 더욱 선명한데 이는 정제 단계가 계속 될수록 인간 IGF-I의 순도가 높아짐을 나타낸다.

본 발명에 의한 정제 방법은 기존의 방법보다 공정의 간편화 및 고순도의 제품을 저가로 제공하여 국민보건에 이바지 할 것으로 기대된다.

이하 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예]

1. 인간 IGF-I의 배지내로의 분비

유전자 재조합법에 의해 인슐린 유사 성장인자-I을 분비하도록 형질전환된 효모(본 출원인의 선출원 특허 제90-16821호, 인간 IGF-I 유전자 : 1990년 12월 28일자 특허출원 인간 IGF-I 발현벡터 (pYLBC-A/G-αF-IGF-1))를 50ml의 효모 최소 영양배지에서 1일동안 배양하여 얻은 종자 배양액을 2％의 포도당, 아데닌 및 유라실 각각 0.01％가 포함된 영양배지에서 3일동안 배양하여 인간 IGF-I을 배지속으로 분비하도록 하는데 배양의 최적온도는 30℃로 유지하도록 하며, 용존 산소량은 20％이상을 유지토록 한다.

2. 조정제 및 농축

상기 실시예 1에서 얻어진 IGF-I을 함유하는 배양액 1ℓ를 한계 분자량 3.000달톤인 한외여과막 YM3(Amicon U.S.A.)을 이용하여 100밀리리터까지 농축하고 반응물을 한계 분자량 3.000달톤인 투석막을 이용하여 40배의 10밀리몰 pH 5.6의 인산완충액에 대해 투석한다. 얻어진 농축액을 미리 10밀리몰 pH 5.6의 인산완충액으로 평형시킨 CM-세파로스 음이온 교환수지(Pharmacia, U.S.A.)컬럼에 통과시키고 이를 같은 완충액으로 충분히 씻어 흘러 나오는 완충액의 흡광도가 280nm에서 0이 되게 한 다음, 이를 반응온도를 4℃로 유지시키면서 10밀리몰의 탄산나트륨 완충액(pH9.5)으로 용출시켜 인간 IGF-I을 함유하는 분획을 수합한다. 이때, 컬럼은 2.5㎝×20㎝인 것을 사용하였으며, 용출액의 양은 500ml, 인간 IGF-I을 함유하는 분획의 양은 200ml, 포함된 인간 IGF-I의 양은 10 내지 20밀리그람 정도, 순도 85％이상의 인간 IGF-I을 함유하는 분획을 얻었다.

3. 양이온 교환수지에 의한 정제

상기 실시예 2에서 얻어진 인간 IGF-I을 함유하는 분획 200밀리리터를 미리 10밀리몰 pH8.0 트리스 완충용액으로 평형시킨 DE53 양이온 교환수지(Whatman)컬럼에 통과 시키고 같은 완충액으로 충분히 씻어 흘러 나오는 완충액의 흡광도가 280nm에서 0이 되게 한 다음, 반응온도를 4℃로 유지시키면서 0부터 500밀리몰의 염화나트륨을 함유하는 같은 완충액으로 용출시켜 인간 IGF-I을 함유하는 분획을 수합한다. 이때, 컬럼은 2.5㎝×20㎝의 것을 사용하였으며, 용출액의 양은 500ml였고, 인간 IGF-I은 함유하는 분획의 양은 염화나트륨 농도 100밀리몰 내지 150밀리몰에 걸쳐 140ml였고, 포함된 인간 IGF-I의 양은 9 내지 18㎎정도였으며 이 단계를 거쳐 순도 90 내지 95％의 인간 IGF-I 분획을 얻었다.

4. S-100 겔 여과 컬럼에 의한 정제

상기 실시예 3에서 얻어진 IGF-I 140밀리리터를 YM3 한외여과막(Amicon U.S.A.)을 이용하여 5밀리리터까지 농축한 후, 식염을 함유하는 인산완충액으로 먼저 평형시킨 S-100(Pharmacia U.S.A.)겔 여과 컬럼을 이용하여 정제한다. 사용된 컬럼은 2.5㎝×100㎝였고 유속은 1밀리리터/분로 하여 30밀리리터 정도의 분획을 수합하였으며, 함유된 인간 IGF-I의 양은 8 내지 16밀리그람 정도로 순도 98％이상의 인간 IGF-I을 포함하는 분획을 얻었다.

이때, 반응온도는 4℃를 유지하도록 한다.

Claims

인간 인슐린 유사 성장인자-1유전자를 가진 효모를 최소 영양배지 내에서 배양하여 얻은 종자 배양액을 2％의 포도당, 각각 0.01％의 아데닌 및 유라실을 포함하는 영양배지에서 배양하여 인간 인슐린 유사 성장인자-I을 배지속으로 분비시키고 이를 10밀리몰 pH5.6 인산완충액으로 평형시킨 음이온 교환수지 컬럼에 통과시켜 이를 같은 완충용액으로 세척하여 280nm에서 완충용액의 흡광도가 0이 되게 한 다음, 염화나트륨용액으로 용출시켜 인간 인슐린 유사 성장인자-I을 함유하는 분획을 수합하고, 다시 10밀리몰트리스 완충용액으로 평형시킨 DE53 양이온 교환수지컬럼을 통과시킨 다음, YM3 한외여과막을 이용하여 5밀리리터까지 농축한 후 이를 미리 식염을 함유시킨 인산완충용액으로 평형시킨 S-100 겔 여과컬럼을 통과하여 정제하는 인간 인슐린 유사 성장인자-I의 정제방법에 있어서, 염화나트륨 농도 구배 대신에 pH 9.5 탄산나트륨 완충액을 사용하여 인간 인슐린 유사 성장인자-I을 용출시키는 것임을 특징으로 하는 인간 인슐린 유사 성장인자-1의 정제방법.
제1항에 있어서, 상기 탄산나트륨 완충액은 식염을 함유시킨 것으로 겔에 대한 흡착을 최소화하며 인간 인슐린 유사 성장 인자 -I을 용출시킨 후 별도의 과정을 거치지 않고 직접 사용 가능하도록 하는 것임을 특징으로 하는 인간 인슐린 유사 성장인자-1의 정제방법.