CN101812135B - 具有高效升血小板作用的融合蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有高效升血小板作用的融合蛋白，所述融合蛋白由两个串联在一起的TPO模拟肽和一个人生长激素分子构成。所述融合蛋白能显著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，减少用量、降低毒副作用。本发明可以大大减少治疗周期和治疗时间，并且所述融合蛋白升血小板的效果更显著。所述融合蛋白用于药物制剂可用于治疗多种原发性或继发性血小板减少症等疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与基因工程制药领域，具体涉及一种能促血小板生成的具有高效升血小板作用的融合蛋白及其制备方法。
背景技术
血小板在机体生命活动中发挥着重要作用，血小板减少可引起出血、感染，甚至危及生命。随着社会的发展，血小板减少症患者越来越多见，资料表明，绝大多数血小板减少症的发生都是由于血小板生成障碍所致。血小板的前体是巨核细胞，其生成过程遵循造血干细胞典型的阶段式分化模式：骨髓造血干细胞-早期髓系共同祖细胞-巨核/红系祖细胞-巨核祖细胞-巨核细胞-血小板。可见，巨核细胞增殖分化在血小板的生成过程中发挥着重要角色。
研究表明，血小板生成素(TPO)是巨核细胞增殖分化和血小板生成过程中最重要的调控因子，它又称为巨核细胞生长与发育因子(MGDF)。体内外实验证实，TPO通过结合并激活其受体-c-Mpl而发挥促进巨核细胞增殖分化和血小板生成的作用。c-Mpl是I型细胞因子受体超家族的一员，主要表达于巨核系各分化阶段的细胞。然而，由于一种通过基因工程制备并经聚乙二醇化的功能型TPO在临床试用过程中有诱导产生中和性TPO抗体的现象，因此，至今美国FDA都未批准重组人TPO进入临床。在这种情况下，人们不得不寻找并研发新一代的升血小板药物。
TPO模拟肽(TMP)是一种与天然TPO完全不同源但生物活性却十分相似的短肽，总共只有14个氨基酸残基组成(Cwirla SE et al，Science，1997，276：1696-1699)。体外实验证实，该短肽与TPO受体-c-Mpl有着很高的亲和力，并能够刺激TPO细胞依赖株(Ba/F3/c-Mpl)增殖与分化。研究表明，当两个c-Mpl形成同源二聚体时才能有效激活其下游信号通路。因此，与单个TPO模拟肽相比，两个串联TPO模拟肽的促血小板生成活性更突出(Cwirla SE et al，Science，1997，276：1696-1699)。但由于TPO模拟肽分子量非常小，无论是单个还是两个串联的TPO模拟肽在体内的代谢排除都很快，因而使其在体内的应用受到限制。
生长激素(GH)是一种具有广泛生理功能的生长调节因子，由于它可以有效动员并刺激造血干和多系造血祖细胞(包括巨核系祖细胞)的增殖与分化，目前国内外的一些单位已经尝试将重组人生长激素(rhGH)用于治疗肿瘤化/放疗所引起的全血细胞减少(Sirohi B et al，Bone Marrow Transplant，2007，39：115-120)。已知，生长激素生物学功能的发挥主要是通过其受体-GHR介导完成，而且GHR也是I型细胞因子受体超家族的一员。GHR与TPO受体c-Mpl所激活的信号通路一样，都需要有蛋白激酶JAK2的参与和反馈调节。因此，GHR与c-Mpl信号通路之间可能会存在着一定的交叉对话和相互调节作用。
已经授权的发明专利ZL200510057217.7，我们将单个TPO模拟肽与人生长激素分子进行融合，通过基因工程方法制备出重组融合蛋白rTMP-GH。由于TPO模拟肽可以识别并结合巨核细胞表面的TPO受体c-Mpl，因此，在该融合蛋白中单个TPO模拟肽主要是发挥靶向引导人生长激素分子至巨核细胞的作用。由于单个TPO模拟肽只能结合一个c-Mpl，所以不能有效激活其受体信号通路，使得rTMP-GH融合蛋白主要通过人生长激素分子发挥升血小板作用，其生物利用低，作为药剂时用量大、毒副作用较大。
发明内容
本发明的目的是提供一种能促血小板生成的具有高效升血小板作用的融合蛋白及其制备方法，该融合蛋白由两个串联的TPO模拟肽和一个人生长激素分子构成，能显著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，作为药剂时用量小、毒副作用小。本发明可以大大减少治疗周期和治疗时间，并且所述融合蛋白升血小板的效果更显著。
本发明的技术方案是：
具有高效升血小板作用的融合蛋白，由两个串联的TPO模拟肽和一个人生长激素分子组成。其中，两个TPO模拟肽的氨基酸序列相同，均由14个氨基酸组成(序列表SEQ ID NO：1)；人生长激素分子则是由191个氨基酸组成(序列表SEQ ID NO：2)。
所述融合蛋白的两个TPO模拟肽可以通过C-C端(尾-尾)串联，也可以通过C-N端(尾-头)串联，而且在两个TPO模拟肽之间设有3-15个氨基酸组成的桥接肽，其中以Pro-Ser-Gly-Pro 4个氨基酸组成的桥接肽为优选。
所述融合蛋白的两个TPO模拟肽的串联体与人生长激素分子之间设有3-15个氨基酸组成的桥接肽，其中以Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 6个氨基酸组成的桥接肽为优选。
所述由两个串联的TPO模拟肽和一个人生长激素分子组成的融合蛋白有四种组成形式，第一种形式是两个TPO模拟肽尾-头相连形成的TPO模拟肽串联体位于融合蛋白的N-末端，人生长激素位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO：3)；第二种形式是两个TPO模拟肽尾-尾相连形成的TPO模拟肽串联体位于融合蛋白的N-末端，人生长激素位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO：4)；第三种形式是人生长激素位于融合蛋白的N-末端，两个TPO模拟肽尾-头相连形成的TPO模拟肽串联体位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO：5)；第四种形式是人生长激素位于融合蛋白的N-末端，两个TPO模拟肽尾-尾相连形成的TPO模拟肽串联体位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO：6)；其中优选的是前两种形式。
编码本发明融合蛋白的DNA序列(序列表SEQ ID NO：7-10)和携带该DNA序列的重组表达载体。
制备、表达本发明所述融合蛋白的方法，其中表达本发明融合蛋白的宿主可以是细菌、酵母及哺乳动物细胞等，其中优选的是大肠杆菌；对于重组表达的本发明融合蛋白可以通过多种方法从相应的细胞培养物中进行提取、纯化，这些方法包括离心、超滤及液相层析等技术，其中液相层析又包括了离子交换、疏水和分子筛等层析技术。
本发明所述融合蛋白可以与药物载体一起组成药物制剂使用，这些药物载体包括水、盐水、糖类等。由本发明融合蛋白制成的药物制剂优选的是含水液体制剂和含水量低于10％或不含水的冻干制剂，这些药物制剂可以通过静脉输注或注射(包括皮下和肌肉注射)进行给药。
本发明采用两个TPO模拟肽的串联体与人生长激素分子进行融合，TPO模拟肽串联体不仅可以发挥靶向结合巨核细胞的作用，而且还能同时激活两个相临的c-Mpl，从而有效激活TPO受体信号通路，即两个c-Mpl形成的同源二聚体能有效激活其下游信号通路，刺激巨核细胞增殖分化和生成血小板。此外，激活的TPO受体信号通路还可以通过交叉对话与GHR信号通路进行相互调节，从而使两者在促进巨核细胞增殖分化和血小板生成方面的作用得到协同加强。由于两个串联的TPO模拟肽可以更有效地激活其受体和下游信号通路，因此，本发明所述由两个串联TPO模拟肽与人生长激素分子构成的融合蛋白(TMP2-hGH融合蛋白)与单个TPO模拟肽和人生长激素分子构成的融合蛋白(TMP-GH融合蛋白)相比较，在促巨核细胞增殖分化方面的作用会更加突出，升血小板的效果将更显著。动物实验表明，本发明所述的TMP2-hGH融合蛋白与TMP-GH融合蛋白相比，TMP2-hGH融合蛋白可以提前6天的时间使急性放射损伤小鼠外周血血小板水平恢复至正常值的70％。本发明可以大大减少治疗周期和治疗时间，为抢救危重病人赢得宝贵的时间。
本发明有益效果是：
1、两个串联的TPO模拟肽能够有效激活巨核系细胞表面的TPO受体c-Mpl，从而启动TPO受体依赖的促巨核细胞增殖分化和血小板生成反应；而生长激素分子可以通过结合并激活其自身受体GHR，从而启动非TPO受体依赖方式的促巨核细胞增殖分化和血小板生成反应。此外，TPO受体与GHR信号通路之间还会通过交叉对话进行相互调节和协同加强作用。因此，本发明的融合蛋白具有强效的促巨核细胞增殖分化和血小板生成作用。
2、通过与人生长激素分子进行融合，可以使两个TPO模拟肽串联体的分子量显著增加，从而延长其在体内的生物半排期，提高其在体内的作用效果。
3、通过与TPO模拟肽进行融合，可以使人生长激素分子靶向作用于巨核细胞，从而显著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，作为药剂时用量小、毒副作用小。
本发明的融合蛋白用于制备治疗药物制剂可用于治疗多种原发性或继发性血小板减少症等疾病，这些疾病包括再生障碍性贫血、白血病、淋巴瘤、原发性血小板减少性紫癜、慢性肾病、急性放射病、肿瘤放化疗引起的血小板减少等。
下面用实施例来进一步说明本方明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
附图说明：
图1为pBV220/TMP2-hGH重组质粒的构建；
图2为纯化所得TMP2-hGH融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；
图3为TMP2-hGH融合蛋白的升血小板活性分析结果。
具体实施方式
材料和试剂：
1.Pyrobest TM DNA Polymerase PCR试剂盒(Takara公司产品，中国大连)
2.QIAprep Spin质粒提取试剂盒(QIAGEN公司，美国)
3.DNA胶回收试剂盒(Omega公司，美国)
4.T4DNA连接酶试剂盒(Takara公司产品，中国大连)
5.EcoR I、Sal I限制性核酸内切酶(New England BioLabs公司产品，美国)
6.pMD-hGH质粒(本室保存)
7.质粒载体pBV220(由中国预防医学科学院病毒研究所提供)
8.大肠杆菌DH5α(本室保存，其构建方法参见申请号为200510057217.7发明专利)
9.氨苄青霉素(Roche公司产品，德国)
10.尿素、MgSO4(上海生工生物工程公司)
11.SP阳离子层析柱、Q阴离子层析柱、Supdex 75层析柱(GE公司产品，美国)
12.酵母提取物、胰蛋白胨(Oxford公司产品，美国)
13.LB培养基
酵母提取物 5g
胰蛋白胨 10g
NaCl 10g
溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸气灭菌。
14.发酵培养基
酵母提取物 20g
胰蛋白胨 10g
KH2PO4 2.3g
Na2HPO4 13g
甘油 20g
溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸气灭菌。
15.包涵体洗涤液
TRIS 20mM
EDTA 10mM
TRITON X-100 0.5％
16.重组TMP-hGH融合蛋白(构建过程见申请号为200510057217.7的发明专利)
实施例1：重组表达质粒pBV220/TMP2-hGH的构建及鉴定
(1)首先获得编码一个TPO模拟肽与人生长激素的融合蛋白(TMP-hGH)的基因序列：
以含有人生长激素的质粒pMD-hGH(本室保存，其构建方法参见申请号为200510057217.7发明专利)为模板，通过PCR扩增将编码TPO模拟肽和桥接肽的DNA序列加载到hGH的N-末端。所用PCR引物序列如下：
P1：5′-att gag gga cca aca tta cgt cag tgg ctg gct gca cgt gct ccaggt tct ggt tct ggt ttc cca act att cca ctg agt c-3′
P2：5′-gca ggt cga cat tta gaa gcc aca cga ccc ttc-3′
在P1中黑体部分为编码TPO模拟肽(序列表SEQ ID NO1)的核苷酸序列，斜体部分为编码桥接肽Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly的核苷酸序列，3′-末端正规体部分为人生长激素的上游特异性引物序列。在P2中下画线部分为内切酶Sal I的识别位点，3′-末端正规体部分为人生长激素的下游特异性引物序列。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。
如图1所示，以pMD-hGH质粒DNA为模板，以P1和P2为上、下游引物进行PCR扩增。PCR扩增条件如下：第一阶段95℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环32次；第三阶段72℃延伸5分钟，10℃放置10分钟。所获得PCR产物经琼脂糖电泳检测为650bp左右，回收PCR产物。
(2)pBV220/TMP2-hGH重组质粒的获得：
如图1所示，以上一步所得PCR产物为模板，通过再次PCR扩增将编码第二个TPO模拟肽和桥接肽的编码序列加载至TMP-hGH的N-末端。所用PCR引物序列如下：
P3：5′-gag gaa ttc atc gaa ggt cct act ctg aga cag tgg ctg gctgca cgt gct cca tct ggt cca att gag gga cca aca tta cg-3′
P2：5′-gca ggt cga cat tta gaa gcc aca cga ccc ttc-3′
在P3中下画线部分为EcoR I酶切位点识别序列，黑体部分为编码TPO模拟肽(序列表SEQ ID NO1)的核苷酸序列，加框部分为翻译起始密码子序列，斜体部分为编码桥接肽Pro-Ser-Gly-Pro的核苷酸序列，3′-末端正规体部分为编码第一个TPO模拟肽的N-端部分氨基酸的DNA序列。在P2中下画线部分为内切酶Sal I的识别位点，3′-末端正规体部分为人生长激素的下游特异性引物序列。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。
PCR扩增反应条件同前，胶回收所得PCR产物并进行EcoR I和Sal I双酶切。酶切后的PCR产物与经EcoR I和Sal I双酶切后的质粒载体pBV220进行连接，连接产物通过电转化法转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。挑菌并培养过夜，提取质粒DNA，经EcoR I和Sal I双酶切后可见700bp左右DNA片段出现。对此重组质粒进行序列测定，测序结果表明在pBV220质粒的EcoR I和Sal I位点之间插入有与序列信息表SEQ ID NO7碱基序列一致的DNA片段。该重组质粒命名为pBV220/TMP2-hGH，其表达的融合蛋白N端为两个串联的TPO模拟肽，C端为人生长激素，在第一个TPO模拟肽与第二个TPO模拟肽之间有Pro-Ser-Gly-Pro进行连接，在第二个TPO模拟肽与人生长激素之间有Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly进行连接。
实施例2：TMP2-hGH融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
(1)高表达TMP2-hGH融合蛋白的阳性菌株筛选：
挑取至少10个转化有pBV220/TMP2-hGH重组质粒的DH5α大肠杆菌单克隆，接种于含有2ml LB培养基的摇菌管中，32℃恒温摇床振荡培养过夜，次日取100ul过夜菌按1∶10比例接种于新鲜LB培养基中，32℃恒温摇床振荡培养24小时，之后更换温度至42℃进行诱导表达5小时。12000rpm离心2分钟收菌，700MPa进行高压匀浆破菌，12000rpm离心20分钟提取包涵体蛋白，包涵体洗涤液洗涤包涵体蛋白，然后用含6N尿素的20mM TRIS缓冲液(PH8.0)溶解包涵体，样品进行12％SDS-PAGE电泳。选择蛋白表达水平表达最高的菌株为后续发酵的种子菌。
(2)工程菌发酵：将筛选出的种子菌株划线接种于LB平板，挑取外观优良的单个菌落接种于10ml LB培养基，37℃恒温摇床振荡培养8小时，之后将10ml培养液按1∶10比例放大至100ml LB培养基进行培养，37℃恒温摇床振荡培养8小时后再次放大至1L LB培养基进行培养，37℃继续振荡培养8小时，然后按1∶10比例接种至装有10L发酵培养基的15L发酵罐中(B.Braun公司，德国)进行发酵。发酵罐中加入10g MgSO4，酵温度控制在32℃，发酵5小时后，调节温度至42℃进行诱导表达5小时。
(3)TMP2-hGH融合蛋白的纯化：按前述方法离心收取菌体，并提取发酵菌包涵体蛋白，用含6N尿素的20mM TRIS缓冲液(pH8.0)溶解包涵体，然后用含1N尿素的20mM TRIS缓冲液(pH8.0)透析12小时以复性目的蛋白，复性后样品上SP阳离子柱以吸附杂蛋白，使融合蛋白流穿，收集含有融合蛋白的流穿液并上Q阴离子柱，使目的蛋白吸附，用0.1N Nacl洗脱融合蛋白，洗脱峰收集液随后上Supdex 75分子筛层析柱，收集并获得纯化后的融合蛋白。上述纯化所得融合蛋白经12％SDS-PAGE电泳检测可见大小为26KD的单一蛋白带(图2)。HPLC显示为单一蛋白峰，纯度大于98％。
实施例3：TMP2-hGH融合蛋白的升血小板活性测定
(1)复制血小板减少症小鼠实验动物模型：以BALB/c小鼠为实验对象，60Coγ射线5Gy全身一次性照射实验小鼠，复制辐射损伤致血小板减少症动物模型(这种情况常见于急性放射病和肿瘤放疗所致的血小板减少症)。
(2)实验分组：实验动物分三组
第一组照射后给予重组TMP2-hGH融合蛋白治疗，100ug/kg/d，皮下注射，连续用7天；
第二组照射后给予重组TMP-hGH治疗，100ug/kg/d，皮下注射，连续用7天；
第三组为生理盐水对照组。
(3)方法与结果：照射后7天开始小鼠尾静脉取血，每次取血10ul，于西南医院血液科血球计数仪上进行血小板计数分析。结果发现，本发明融合蛋白TMP 2-hGH可以显著抑制受照射小鼠外周血血小板的减少，其升高血小板的速度和幅度显著优于融合蛋白TMP-hGH(图3)。各组小鼠外周血血小板计数恢复至70％正常水平的时间分别为：本发明融合蛋白TMP2-hGH治疗组为照后第16天，TMP-hGH治疗组为照射后第22天，生理盐水对照组为照后第26天。可见，与TMP-GH相比，本发明TMP2-hGH融合蛋白可以提前6天时间使急性放射损伤小鼠外周血血小板水平恢复至正常值的70％。
结论：本发明所述TMP2-hGH融合蛋白与TMP-hGH融合蛋白相比较，本发明所述融合蛋白升血小板活性更强，能显著提高其在促血小板生成方面的生物利用度，减少用量、降低毒副作用。所述TMP2-hGH融合蛋白可以大大减少治疗周期和治疗时间，并且升血小板的效果更显著，更适用于治疗原发性和继发性血小板减少症疾病。
序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学
<120>具有高效升血小板作用的融合蛋白及其制备方法
<130>
<160>10
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>TPO模拟肽的氨基酸序列
<400>1
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
1 5 10
<210>2
<211>191
<212>PRT
<213>人生长激素的氨基酸序列
<400>2
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu
20 25 30
Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu
35 40 45
Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr
50 55 60
Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu
65 70 75
Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
80 85 90
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala
95 100 105
Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly
110 115 120
Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr
125 130 135
Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
140 145 150
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys
155 160 165
Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val
170 175 180
Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
185 190
<210>3
<211>229
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>融合蛋白-1的氨基酸序列，其中两个TPO模拟肽尾-头相连的串联体位于融合蛋白的N-末端，人生长激素位于融合蛋白的C-末端。在两个TPO模拟肽之间有Pro-Ser-Gly-Pro进行连接，在第二个TPO模拟肽与人生长激素之间有Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly进行连接
<400>3
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Pro
1 5 10 15
Ser Gly Pro Lle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala
20 25 30
Arg Ala Pro Gly Ser Gly Ser Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser
35 40 45
Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
50 55 60
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro
65 70 75
Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu
80 85 90
Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr
95 100 105
Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu
110 115 120
Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe
125 130 135
Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
140 145 150
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
155 160 165
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr
170 175 180
Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu
185 190 195
Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys
200 205 210
Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly
215 220 225
Ser Cys Gly Phe
<210>4
<211>229
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>序列特征：融合蛋白-2的氨基酸序列，其中两个TPO模拟肽尾-尾相连的串联体位于融合蛋白的N-末端，人生长激素位于融合蛋白的C-末端。在两个TPO模拟肽之间有Pro-Ser-Gly-Pro进行连接，在第二个TPO模拟肽与人生长激素之间有Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly进行连接。
<400>4
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Pro
1 5 10 15
Ser Gly Pro Ala Arg Ala Ala Leu Trp Gln Arg Leu Thr Pro Gly
20 25 30
Glu Ile Pro Gly Ser Gly Ser Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser
35 40 45
Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
50 55 60
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro
65 70 75
Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu
80 85 90
Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr
95 100 105
Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu
110 115 120
Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe
125 130 135
Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
140 145 150
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
155 160 165
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr
170 175 180
Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu
185 190 195
Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys
200 205 210
Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly
215 220 225
Ser Cys Gly Phe
<210>5
<211>229
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>序列特征：融合蛋白-3的氨基酸序列，其中两个TPO模拟肽尾-头相连的串联体位于融合蛋白的C-末端，人生长激素位于融合蛋白的N-末端。在两个TPO模拟肽之间有Pro-Ser-Gly-Pro进行连接，在第一个TPO模拟肽与人生长激素之间有Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly进行连接。
<400>5
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu
20 25 30
Pne Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu
35 40 45
Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr
50 55 60
Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu
65 70 75
Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
80 85 90
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala
95 100 105
Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly
110 115 120
Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr
125 130 135
Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
140 145 150
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys
155 160 165
Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val
170 175 180
Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Pro Gly Ser Gly
185 190 195
Ser Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg
200 205 210
Ala Pro Ser Gly Pro Lle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu
215 220 225
Ala Ala Arg Ala
<210>6
<211>229
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>序列特征：融合蛋白-4的氨基酸序列，其中两个TPO模拟肽尾-尾相连的串联体位于融合蛋白的C-末端，人生长激素位于融合蛋白的N-末端。在两个TPO模拟肽之间有Pro-Ser-Gly-Pro进行连接，在第一个TPO模拟肽与人生长激素之间有Pro-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly进行连接。
<400>6
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu
20 25 30
Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu
35 40 45
Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr
50 55 60
Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu
65 70 75
Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
80 85 90
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala
95 100 105
Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly
110 115 120
Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr
125 130 135
Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
140 145 150
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys
155 160 165
Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val
170 175 180
Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Pro Gly Ser Gly
185 190 195
Ser Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg
200 205 210
Ala Pro Ser Gly Pro Ala Arg Ala Ala Leu Trp Gln Arg Leu Thr
215 220 225
Pro Gly Glu Ile
<210>7
<211>693
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>编码融合蛋白-1(SEQ ID NO：3)的DNA序列
<400>7
atgatcgaag gtcctactct gagacagtgg ctggctgcac gtgctccatc tggtccaatt 60
gagggaccaa cattacgtca gtggctggct gcacgtgctc caggttctgg ttctggtttc 120
ccaactattc cactgagtcg cctgttcgat aacgcgatgc tgcgtgcgca tcgtctgcac 180
caactggctt tcgacactta ccaggagttc gaagaagcat acatcccgaa agaacagaaa 240
tacagcttcc ttcagaaccc acagacctcg ttgtgtttct ctgaaagtat cccgacccct 300
tctaaccgcg aagagaccca gcagaaatcg aaccttgaac tgcttcgtat ctcgctgctt 360
ctcattcagt cgtggctgga gccagtacag ttcctgcgtt cggttttcgc aaactcactg 420
gtttacggtg cgtctgacag taacgtttac gacctgctga aagaccttga agaagggatc 480
cagaccctga tgggtcgcct ggaagatggt tcaccacgca ctggtcagat cttcaaacag 540
acttactcca aattcgatac taactctcat aacgatgatg ctctgctgaa aaactacggc 600
ctgctgtact gtttccgtaa agatatggat aaagttgaaa ctttcctgcg tatcgttcag 660
tgtcgttctg ttgaagggtc gtgtggcttc taa 693
<210>8
<211>693
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>编码融合蛋白-2(SEQ ID NO：4)的DNA序列
<400>8
atgatcgaag gtcctactct gagacagtgg ctggctgcac gtgctccatc tggtccagct 60
cgtgcagctc tgtggcagcg tttaacacca ggagagattc caggttctgg ttctggtttc 120
ccaactattc cactgagtcg cctgttcgat aacgcgatgc tgcgtgcgca tcgtctgcac 180
caactggctt tcgacactta ccaggagttc gaagaagcat acatcccgaa agaacagaaa 240
tacagcttcc ttcagaaccc acagacctcg ttgtgtttct ctgaaagtat cccgacccct 300
tctaaccgcg aagagaccca gcagaaatcg aaccttgaac tgcttcgtat ctcgctgctt 360
ctcattcagt cgtggctgga gccagtacag ttcctgcgtt cggttttcgc aaactcactg 420
gtttacggtg cgtctgacag taacgtttac gacctgctga aagaccttga agaagggatc 480
cagaccctga tgggtcgcct ggaagatggt tcaccacgca ctggtcagat cttcaaacag 540
acttactcca aattcgatac taactctcat aacgatgatg ctctgctgaa aaactacggc 600
ctgctgtact gtttccgtaa agatatggat aaagttgaaa ctttcctgcg tatcgttcag 660
tgtcgttctg ttgaagggtc gtgtggcttc taa 693
<210>9
<211>693
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>编码融合蛋白-3(SEQ ID NO：5)的DNA序列
<400>9
atgttcccaa ctattccact gagtcgcctg ttcgataacg cgatgctgcg tgcgcatcgt 60
ctgcaccaac tggctttcga cacttaccag gagttcgaag aagcatacat cccgaaagaa 120
cagaaataca gcttccttca gaacccacag acctcgttgt gtttctctga aagtatcccg 180
accccttcta accgcgaaga gacccagcag aaatcgaacc ttgaactgct tcgtatctcg 240
ctgcttctca ttcagtcgtg gctggagcca gtacagttcc tgcgttcggt tttcgcaaac 300
tcactggttt acggtgcgtc tgacagtaac gtttacgacc tgctgaaaga ccttgaagaa 360
gggatccaga ccctgatggg tcgcctggaa gatggttcac cacgcactgg tcagatcttc 420
aaacagactt actccaaatt cgatactaac tctcataacg atgatgctct gctgaaaaac 480
tacggcctgc tgtactgttt ccgtaaagat atggataaag ttgaaacttt cctgcgtatc 540
gttcagtgtc gttctgttga agggtcgtgt ggcttcccag gttctggttc tggtatcgaa 600
ggtcctactc tgagacagtg gctggctgca cgtgctccat ctggtccaat tgagggacca 660
acattacgtc agtggctggc tgcacgtgct taa 693
<210>10
<211>693
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>编码融合蛋白-4(SEQ ID NO：6)的DNA序列
<400>10
atgttcccaa ctattccact gagtcgcctg ttcgataacg cgatgctgcg tgcgcatcgt 60
ctgcaccaac tggctttcga cacttaccag gagttcgaag aagcatacat cccgaaagaa 120
cagaaataca gcttccttca gaacccacag acctcgttgt gtttctctga aagtatcccg 180
accccttcta accgcgaaga gacccagcag aaatcgaacc ttgaactgct tcgtatctcg 240
ctgcttctca ttcagtcgtg gctggagcca gtacagttcc tgcgttcggt tttcgcaaac 300
tcactggttt acggtgcgtc tgacagtaac gtttacgacc tgctgaaaga ccttgaagaa 360
gggatccaga ccctgatggg tcgcctggaa gatggttcac cacgcactgg tcagatcttc 420
aaacagactt actccaaatt cgatactaac tctcataacg atgatgctct gctgaaaaac 480
tacggcctgc tgtactgttt ccgtaaagat atggataaag ttgaaacttt cctgcgtatc 540
gttcagtgtc gttctgttga agggtcgtgt ggcttcccag gttctggttc tggtatcgaa 600
ggtcctactc tgagacagtg gctggctgca cgtgctccat ctggtccagc tcgtgcagct 660
ctgtggcagc gtttaacacc aggagagatt taa 693
Claims (10)
1.一种具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于该融合蛋白由两个串联在一起的TPO模拟肽和一个人生长激素分子组成，所述TPO模拟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于人生长激素的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于两个TPO模拟肽通过C-C端串联或通过C-N端串联。
4.根据权利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于两个串联的TPO模拟肽位于该融合蛋白的N-末端，人生长激素位于该融合蛋白的C-末端；或两个串联的TPO模拟肽位于该融合蛋白的C-末端，人生长激素位于该融合蛋白的N-末端。
5.根据权利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于两个串联的TPO模拟肽之间以及TPO模拟肽与人生长激素分子之间均设有3-15个柔性氨基酸组成的桥接肽。
6.编码权利要求1-5所述的融合蛋白的DNA序列。
7.包含权利要求7所述的DNA序列的重组表达载体。
8.制备权利要求1-5所述的融合蛋白的方法，包括将权利要求7所述的重组表达载体转化、转染或转导宿主细胞，分离、纯化所述融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于原核表达为大肠杆菌，真核表达为酵母。
10.根据权利要求1所述的具有高效升血小板作用的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白可以用于治疗多种原发性和继发性血小板减少症。
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2009
- 2009-11-11 CN CN2009101914540A patent/CN101812135B/zh active Active
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| 王崧 等.重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究.《第三军医大学学报》.2008,第30卷(第21期), * |
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