CN101362797A

CN101362797A - 一种血小板生成素模拟肽、制备及其应用

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Publication number: CN101362797A
Application number: CNA2008102007391A
Authority: CN
Inventors: 张绪瑛; 吴自荣; 刘雯; 黄静; 孙昭; 汪洋
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2008-09-28
Filing date: 2008-09-28
Publication date: 2009-02-11

Abstract

本发明涉及一种血小板生成素模拟肽及其制备和其在升高外周血血小板数及在制备治疗血小板减少症的药物中的用途，属于生物工程技术领域。本发明提供的血小板生成素模拟肽在AF 12505的氨基酸序列两端添加半胱氨酸，利用两个半胱氨酸残基形成二硫键，将线性肽转变为环肽，在保留AF 12505与受体高亲和性的基础上，利用环肽的稳定性，增强该模拟肽的半衰期，从而提高其生物活性。该新型模拟肽具有明显的升高外周血血小板数目的活性，可以治疗由放化疗引起的血小板减少症，具有良好的临床使用价值。

Description

一种血小板生成素模拟肽、制备及其应用

技术领域

本发明涉及一种血小板生成素模拟肽及其制备和其在升高外周血血小板数及在制备治疗血小板减少症的药物中的用途，使用该模拟肽可以有效的升高外周血中血小板的数目，并可治疗多种原因引起的血小板减少症。属于生物工程技术领域。

背景技术

血小板减少症是一种常见的血液病，是临床上治疗恶性血液疾病和肿瘤中遇到的重要问题之一，当肿瘤患者受到集中的化疗和放疗后，骨髓都将受到不同程度的抑制。骨髓抑制及其并发的贫血、粒细胞减少和血小板减少是造成患者死亡的主要因素，也是临床上限制放、化疗剂量，提高疗效的主要障碍。当人血小板计数在20×10⁹/L以下时，极易发生颅内出血、内脏大出血等致命性出血。目前，血小板输注是严重血小板减少症的标准治疗方法，对骨髓抑制治疗所导致的一过性血小板减少症疗效肯定。

尽管血小板输注疗效肯定，但血小板保存时间短、供血来源缺乏、花费较高且可能发生同种异体免疫反应、感染、输血相关移植物抗宿主病(GVHD)等，从而限制了血小板输注的临床应用。目前临床上已用重组的EPO、GCSF、GM-CSF改善由于化疗引发的贫血和粒细胞减少，然而目前还没有一种能有效改善放化疗后血小板减少的药物。

血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是作用于巨核细胞系分化发育的特异性造血因子，是最早阶段巨核细胞和血小板分化发育最重要的生理性调节因子。[Promotion of megakaryocytop rogenior expansion and differentiation by the c-Mp 1ligand thrombopoietin.Nature，1994，369：568～571.]TPO是目前发现的唯一全程参与巨核细胞增殖和分化的最基本的生长因子。TPO可显著减轻和缩短接受骨髓抑制性治疗的小鼠所出现的血小板减少症的程度和时间，作用与剂量相关，未见严重副反应发生，血小板形态和功能未见异常。尽管在正常动物体内TPO主要影响血小板生成，但在骨髓抑制状况下对红细胞和中性粒细胞生成也有促进作用，并和G-CSF有协同效应。鉴于肿瘤化疗常引起多种血细胞减少，造成严重副作用，TPO与其它造血因子(如G-CSF)合并使用可有效地加快骨髓恢复，从而支持大剂量化疗，提高抗肿瘤疗效。

TPO模拟肽是与TPO具有相似功能但不具同源结构的小分子物质，因活性高、开发代价小、且不具免疫原性等优点而受到青睐。1997年，Cwirla等从丝状噬菌体展示肽库中筛选到高活性的TPO模拟肽AF 12505。该14肽为线性肽，结构式为IEGPTLRQWLAARA，具有刺激TPO依赖性细胞株Ba/F3-mpl的增殖功能，EC₅₀为400nmol/L[Peptide agonist of the thrombopoietin receptor aspotient as the nature cytokine.Science，1997，276：1696.]。但是，该结构的活性肽存在生物学活性偏低，半衰期短的不足，难以满足实际需要。

发明内容

本发明的第一个目的是提出一种新型的活性提高的血小板生成素模拟肽，该模拟肽的分子结构为：

该模拟肽在AF 12505的氨基酸序列两端添加半胱氨酸，利用两个半胱氨酸残基形成二硫键，将线性肽转变为环肽，期望在保留AF 12505与受体高亲和性的基础上，利用环肽的稳定性，增强该模拟肽的半衰期，从而提高其生物活性。该新型模拟肽具有明显的升高外周血血小板数目的活性，可以治疗由放化疗引起的血小板减少症，具有良好的临床使用价值。

本发明的第二个目的是提供上述模拟肽的制备方法。该模拟肽可通过固相化学合成方法制备，技术成熟，成本低，适宜普及使用。

固相化学合成法在制备少于40个氨基酸的小肽工艺十分成熟，具有快速、纯化简便、成本低等优点。本发明的技术方案选用固相化学合成法按该模拟肽的氨基酸序列合成线性肽，再用氧化剂氧化两端的半胱氨酸形成二硫键，从而获得环肽。其中，氧化剂可选用铁氰化钾、碘、三氟乙酸铊、DMSO等，本发明优选DMSO氧化法。

现详细说明本发明的技术方案。

一种血小板生成素模拟肽的固相化学合成方法，其特征在于，具体操作步骤：

(1)需用的带保护基的氨基酸单体共有11个，它们是：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH，其中缩写表示：

Fmoc：9—芴基甲氧羰基

Trt：三苯甲基，即trityl

OtBu：叔丁基酯

tBU：叔丁基，即tert-butyl；

(2)需用的仪器设备及试剂

仪器：SYMPHONY型12通道多肽合成仪，型号：SYMPHONY，美国产品；

试剂：N—甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨基吡啶，即Dimethylaminopyridine/DMF N，N—二异丙基乙胺，即N，N-diisopropylethylamine/NMP，HBTU100mmol/0.5M HOBT in DMF N，N—二环己基碳二亚胺，即N，N-Dicyclohexylcarbodiimide/NMP，

其中：DMF为N，N—二甲基甲酰胺

NMP为N—甲基吡咯烷酮

HOBT为1—羟基苯并三唑

HBTU为2—(1氢苯并三唑基)——四甲基脲六氟磷酸盐，即2—(1H—benzotriazole-y1-1，3，3-tetramethyl-Uronium hexafluorophosphate；

(3)操作

第一步多肽树脂的合成

当多肽C末端为羧基时，选择王氏树脂，当多肽C末端为酰胺时，选择常规氨基树脂。

以0.25mmol规模为例，称取王氏树脂或常规氨基树脂0.25g，置入SYMPHONY型12通道多肽合成仪上的反应器中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按模拟肽的氨基酸序列，从C—端向N—端排列在所述的合成仪中，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，25℃下，进行脱Fmoc保护、活化、连接，然后再进行下一轮循环，如此完成合成，得到带侧链保护基的多肽树脂，在所述的合成仪上吹干、称重；

第二步脱保护基及切断树脂

将第一步得到的带侧链保护基的多肽树脂置于具塞三角烧瓶，加入下列裂解试剂：

然后在30℃下，电磁搅拌反应2小时，过滤，收集滤液，树脂用三氟乙酸洗涤，合并收集液与洗涤液，加入乙醚产生沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤，干燥，得粗品；

第三步线性模拟肽的分离纯化及冷冻干燥

将第二步得到的粗品用制备型HPLC进行分离纯化，再经冷冻干燥，得线性模拟肽产品。

第四步模拟肽环肽的制备

用醋酸水溶解多肽，稀释到多肽浓度为0.1-2.5mg/ml，优选浓度为0.5-0.8mg/ml。最终醋酸的浓度为1-10％，优选浓度为3-5％。用碳酸氨调节PH值到6。加DMSO(10-20％体积)在25℃，反应2-3天，(HPLC或Ellman test监测)。稀释最终溶液到TFA为0.05％，乙腈为5％。HPLC反相柱除掉DMSO和其他杂质，再经冷冻干燥，得环肽产品。

本发明的第三个目的是提出该模拟肽在升高外周血血小板数目及在制备治疗血小板减少症药物中的应用。以昆明种小鼠为受试对象，用卡铂和⁶⁰Co γ射线辐射分别模拟化疗和放疗引起的血小板减少症。当卡铂用量为100mg/kg-150mg/kg，⁶⁰Co γ射线辐射剂量为4Gy-6Gy时，均能造成血小板减少症。用该模拟肽进行治疗，给药方式为腹腔注射或皮下注射或静脉注射。当给药量为50ug/kg-250ug/kg时，均能提高外周血中血小板数，表明这种模拟肽能使血小板数量升高，治疗放化疗引起的血小板减少症，其功能较为明确和单一，从而降低了产生副作用的危险性，因而有可能作为一种小肽药物用于血小板减少症的治疗。

本发明第四个目的是提出一种药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的模拟肽，及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体是指稀释剂和pH调节剂等药学上常用的辅料，包括各种单糖、双糖、多糖、各种电解质、各种溶剂等及其它们的混合物。例如甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、羟乙基淀粉、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、磷酸钠、碳酸钠、醋酸钠、注射用水、丙二醇、乙醇、甘油、聚乙二醇等。最优组合物是活性成分、甘露醇、葡萄糖、乳酸或蔗糖、氯化钠、注射用水、盐酸。本发明所指的药物组合物其剂型包括：注射液或粉针剂。按照药学领域常规方法制备，例如使用活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。活性成分用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是1—100ug/kg体重，优选5—50ug/kg，可以用等渗葡萄糖注射液或氯化钠注射液稀释后一次或多次静脉滴注施用。

本发明的优点在于将线性肽通过两个半胱氨酸残基氧化形成二硫键而转变为环肽。生物活性环肽能形成限制性构象，与相应线性肽相比在生物体内具有更好的抗酶解和抗化学降解的能力，因而增强了小肽的稳定性，延长了小肽的半衰期，从而表现出更好的生物学活性。实验结果表明，当给药量为≤50ug/kg/天时，可以显著升高外周血血小板数目，与原线性肽AF 12505相比，生物学活性有显著提高，同时，药效时间也有所延长，显示出高于国内其他血小板生成素模拟肽类小肽的活性。

此外，本发明使用DMSO氧化该模拟肽的两个半胱氨酸获得环肽。DMSO是一种温和的氧化剂，毒性极低，本身具有消炎、止痛、镇静、促进伤口愈合作用。DMSO作为氧化剂参与二硫键形成过程中，其副产物为CH₃SCH₃和水，这两者极易挥发，故具有反应条件温和，选择性高，副反应少，反应后纯化方便，产率高，成本低的优点。因此，只需用固相化学合成法制备该模拟肽的单体形式，序列仅为16个氨基酸，生产步骤少，生产成本低，且在后续处理过程中不存在检测内毒素等问题，具有快速、纯化简便的优点。

附图说明

图1显示的是模拟肽环肽与线性肽活性之间的比较，其中n＝6，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001环肽与线性肽比较。

图2显示的是药物对由卡铂引起的模拟化疗的血小板减少症的作用，其中n＝6，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001与损伤组比较。

图3显示的是药物对由⁶⁰Co γ射线辐射引起的模拟放疗的血小板减少症的作用，其中n＝6，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001与损伤组比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。在附图中：

材料：

动物：昆明小鼠，雌性，体质量20±1g，由第二医科大学实验动物中心提供。

药品与试剂：注射用卡铂(Carboplatin)由山东齐鲁制药厂生产。

仪器：倒置相差显微镜(OLYMPUS公司生产)。

将原始数据输入Microsoft Excel中，用Student t进行各组间差异显著性检验。

实施例1.模拟肽的制备1

固相化学合成法合成本发明的模拟肽，该模拟肽的分子结构式为Seq IDNo.1，C末端为酰胺，操作步骤如下：

第一步多肽树脂的合成

以0.25mmol规模为例，称取王氏树脂0.25g，置入SYMPHONY型12通道多肽合成仪上的反应器中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按模拟肽的氨基酸序列，从C—端向N—端排列在所述的合成仪中，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，25℃下，由计算机程序控制自动进行脱Fmoc保护、活化、连接，然后再进行下一轮循环，如此完成合成，得到带侧链保护基的多肽树脂，在所述的合成仪上吹干、称重；

第二步脱保护基及切断树脂

第三步线性模拟肽的分离纯化及冷冻干燥

第四步模拟肽环肽的制备

用醋酸水溶解多肽，稀释到多肽浓度为0.1mg/ml，最终醋酸的浓度为1％。用碳酸氨调节PH值到6。加DMSO(10-20％体积)在25℃，反应2-3天，(HPLC或Ellman test监测)。稀释最终溶液到TFA为0.05％，乙腈为5％。HPLC反相柱除掉DMSO和其他杂质，再经冷冻干燥，得环肽产品，经检测，得率为25.7％。

实施例2.模拟肽的制备2

第一至第三步操作同实施例1。

第四步模拟肽环肽的制备

用醋酸水溶解多肽，稀释到多肽浓度为2.5mg/ml，最终醋酸的浓度为10％。用碳酸氨调节PH值到6。加DMSO(10-20％体积)在25℃，反应2-3天，(HPLC或Ellman test监测)。稀释最终溶液到TFA为0.05％，乙腈为5％。HPLC反相柱除掉DMSO和其他杂质，再经冷冻干燥，得环肽产品，经检测，得率为19.6％。

实施例3.模拟肽的制备3

第一至第三步操作同实施例1。

第四步模拟肽环肽的制备

用醋酸水溶解多肽，稀释到多肽浓度为0.7mg/ml，最终醋酸的浓度为4％。用碳酸氨调节PH值到6。加DMSO(10-20％体积)在25℃，反应2-3天，(HPLC或Ellman test监测)。稀释最终溶液到TFA为0.05％，乙腈为5％。HPLC反相柱除掉DMSO和其他杂质，再经冷冻干燥，得环肽产品，经检测，得率为38.5％。

实施例4.模拟肽环肽与线性肽的生物学活性的比较

按实施例3分别制备模拟肽环肽及线性肽。以昆明种小鼠为受试对象，注射前将小鼠按血小板数平均分为3组(对照组、环肽低剂量组、环肽高剂量组、线性肽低剂量组和线性肽高剂量组)，每组6只小鼠。给药组连续3天腹腔注射，给药浓度为低剂量组50ug/kg、高剂量组500ug/kg，对照组注射生理盐水。在给药第5天由尾静脉取血，检测血小板数，结果见图1。

由图1可以看出，无论低剂量组还是高剂量组，环肽的活性都大于线性肽的活性，其中，环肽低剂量组的血小板数比线性肽低剂量组高13％，高剂量组的血小板数提高了28％。此外，环肽低剂量组药效可持续5天，高剂量组药效可持续9天，均长于线性肽。

实施例5.模拟肽对卡铂引起的模拟化疗的血小板减少症的作用

用实施例3中制备的模拟肽治疗由卡铂引起的血小板减少症。以昆明种小鼠为受试对象，注射前将小鼠按血小板数平均分为3组(对照组、损伤组、给药组)，每组6只小鼠。损伤组和给药组于第0天一次性腹腔注射卡铂，浓度为100mg/kg，对照组注射生理盐水。随后，给药组连续5天腹腔注射，给药浓度为250ug/kg/d，其余两组注射生理盐水。分别在给药7、9、12、16、19和22天由尾静脉取血，检测血小板数，结果见图2。

由图2可以看出，用卡铂作为血小板生成抑制剂，一次性腹腔注射后，循环血小板数逐渐降低，7、9、12、16、19、22天的血小板数分别约为对照组的40％、18％、7％、28％、40％、70％，最低值出现在第12天，说明成功模拟了化疗的血小板减少症。用药物进行治疗，给药组的血小板数均高于损伤组，分别是损伤组的1.3、1.6、3.3、2.2、1.7、1.4倍，于第22天提前恢复正常血小板值。

实施例6.模拟肽对 ⁶⁰ Coγ射线辐射引起的模拟放疗的血小板减少症的作用

用实施例3中制备的模拟肽治疗由⁶⁰Coγ射线辐射引起的血小板减少症。以昆明种小鼠为受试对象，辐射前将小鼠按血小板数平均分为3组(对照组、损伤组、给药组)。损伤组和给药组于第0天一次性给予全身致死剂量⁶⁰Coγ射线辐射，吸收剂量为5Gy，吸收剂量率为1Gy/min。随后，给药组在辐射后2h及第2-5天连续4天腹腔注射15肽，给药浓度为250ug/kg/d，其余两组注射生理盐水。分别在给药9、11、13、15、18、20和22天由尾静脉取血，检测血小板数，结果见图3。

由图3可以看出，小鼠接受全身致死剂量⁶⁰Coγ射线辐射后，循环血小板数逐渐降低，5、7、9、12、15、18、21天的血小板数分别约为对照组的68％、27％、16％、42％、55％、79％、82％，最低值出现在第9天，说明成功模拟了放疗的血小板减少症。用药物进行治疗，给药组的血小板数从第7天开始均高于损伤组，分别是损伤组的1.3、2.1、1.6、1.5、1.2、1.3倍，于第21天提前恢复正常血小板值，证明该药物可以明显提高血小板含量，治疗由于放疗引起的血小板减少症。

实施例7 模拟肽冻干粉针的制备

取250mg模拟肽，加适量注射用水溶解，加入甘露醇20g搅拌均匀，以盐酸调节至pH5，60℃保温20分钟，加注射用水至1000ml，无菌条件下，用0.22um微孔滤膜过滤，分装于5ml西林瓶中，每瓶1ml，冷冻干燥，轧盖即可。

实施例8 模拟肽注射液的制备

取250mg模拟肽，加适量注射用水溶解，加入氯化钠4.5g搅拌均匀，以盐酸调节至pH5，60℃保温20分钟，加注射用水至2000ml，无菌条件下，用0.22um微孔滤膜过滤，分装于曲颈安培瓶中，每瓶2ml，熔封，100℃流通蒸汽灭菌30分钟。

本发明涉及的模拟肽氨基酸序列有以下1条。现详细示于以下序列表。

序列表

<110>华东师范大学

<120>一种血小板生成素模拟肽、制备及其应用

<160>1

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>合成构建体

<220>

<221>DISULFID FROM 1 TO 16

<400>1

Claims

1.一种血小板生成素模拟肽，其特征在于分子结构为：

2.如权利要求1所述的血小板生成素模拟肽的制备方法，采用固相化学合成法，其特征在于步骤如下：

第一步：合成多肽树脂，先将王氏树脂或氨基树脂置入合成仪，再将带保护基的氨基酸单体按照权利要求1所述的血小板生成素模拟肽的氨基酸序列，从C—端向N—端排列在合成仪中，在25℃下，进行脱Fmoc保护、活化、连接，然后反复循环，合成得到带侧链保护基的多肽树脂；

第二步：脱保护基及切断树脂，将第一步制备的带侧链保护基的多肽树脂进行裂解反应后，经过滤，沉淀洗涤，干燥，得到模拟肽粗品，分离纯化，冷冻干燥，得线性模拟肽；

第三步：模拟肽环肽的制备，用醋酸水溶解多肽，加入DMSO，25℃氧化2-3天，HPLC反相柱除掉DMSO和其他杂质，再经冷冻干燥，得血小板生成素模拟肽。

3.如权利要求2所述的血小板生成素模拟肽的制备方法，其特征在于第一步中所述的带保护基的氨基酸单体为Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp-OH或者Fmoc-L-Ala-OH中的任意一种。

4.如权利要求1所述的血小板生成素模拟肽在制备治疗血小板减少症的药物中的应用。

5.如权利要求4所述的血小板生成素模拟肽的应用，其特征在于血小板减少症为由化疗药物引起的血小板的降低，或者由放射治疗引起的血小板的降低。

6.如权利要求4所述的血小板生成素模拟肽的应用，其特征在于血小板减少症的药物剂型为注射用药物。

7.如权利要求4所述的血小板生成素模拟肽的应用，其特征在于将血小板生成素模拟肽与医药学上可接受的载体组成药物组合物。