CN102102104A

CN102102104A - 一种多活性肽的串联dna、构建方法、表达载体

Info

Publication number: CN102102104A
Application number: CN 201010546969
Authority: CN
Inventors: 马海乐; 李云亮; 任晓锋; 黄六容; 曲文娟
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2011-06-22

Abstract

本发明多活性肽的串联DNA、构建方法、表达载体。提供了编码乳源性降血压肽CEI-12和CEI-7的串联DNA，其具有如SEQIDNO1所示的核苷酸序列。及含有串联DNA的表达载体pET30a-CEI-12,7。本发明还提供了构建上述两种降血压肽串联DNA的方法，该方法将编码降血压肽CEI-12和CEI-7的核苷酸序列交替串联3次，该核苷酸序列对应的氨基酸序列可在胰蛋白酶作用下重新酶解成CEI-12和CEI-7两个多肽片段。本发明利用pET-30a较小的His标签片断融合表达交替串联3次CEI-12和CEI-7多肽，增加了重组蛋白中目的多肽所占的比例，大大增加表达效率和减小了小肽的分离难度。

Description

一种多活性肽的串联DNA、构建方法、表达载体

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体地说涉及构建一种多活性肽串联DNA，利用其表达载体制备所述多活性肽的方法，和所述的多活性肽的医学用途。

背景技术

生物活性肽是蛋白质中天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。

在治疗原发性高血压药物研究中，目前已从天然食物蛋白质中分离出了具有降血压功能的生物活性肽，此类活性肽则是通过抑制血浆和血管内皮细胞血管紧张素酶（Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE）的活性，达到降低血压的目的。因其降血压效果明显、安全无毒副作用，已成为活性肽研究的热点。现在已陆续从多种动植物原料及下脚料中，如蝮蛇蛇毒、沙丁鱼、乳酪、大豆豆粕、发酵豆奶、玉米渣胶、原蛋白（参见：黄家音. 等人，食品与发酵工业，32: 81-86（2006））等分离出了多种具有降血压功能的活性多肽。

目前从牛乳蛋白酶解产物中发现了多种具有降血压功能的多肽，其中研究比较多的是多肽CEI-12（Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Glu-Val-Phe-Gly-Lys）、多肽CEI-5（Phe-Phe-Val-Ala-

Pro）、多肽CEI-7（Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg）、多肽CEI-β7（Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg）等（参见：董开发．等人，中国食品学报，4:86-90（2004））具有良好的降血压效果。

由于牛乳蛋白酶解产物为多肽混合物，种类繁多，活性差异很大，真正具有高活性的多肽的产率并不很高，对此分离纯化是活性富集的重要操作，但实践证明要达到对高活性多肽有效的分离纯化非常困难，成本大幅度增高。因此酶解产物很难成为制备高活性降血压药物的原料，限制了该产业的深入发展。

生物工程技术的快速发展为克服上述问题，实现活性肽的高效制备提供了可能。利用工程菌高效表达单一活性肽在抗菌肽、肿瘤抑制肽等的应用（参见：胡学军．等人，中国生物化学与分子生物学报，18（3）: 287-292（2002）；马洪星．等人，国际遗传学杂志，30: 169-172（2007）。），已经取得了成功。在对乳源性降血压肽CEI-12研究中，有研究者使用较大的融合蛋白（分子量为29 kDa左右）融合表达未串联的12个氨基酸CEI-12序列（分子量为1.3 kDa左右），表达效率极低（参见：Lv，G.S．等人，J．Dairy Sci．，86:1927-1931（2003）），同时因为牛乳蛋白酶解产物为多肽混合物，包含了多种高活性多肽成分，仅仅利用工程菌表达其中单一活性肽可能达不到很好的降血压效果。因此研究构建利用较小的融合蛋白标签融合表达两种或两种以上串联降血压肽基因，以期提高降血压肽表达效率和降血压活性，就显得很有必要。目前利用工程菌表达乳源性降血压活性肽的研究很少，利用工程菌同时表达两种或两种以上的降血压肽的研究更未见报道。

发明内容

本发明以两种乳源性降血压肽的制备为例，说明多活性肽的交替串联DNA的构建与表达。

本发明的第一方面提供了编码两种乳源性降血压肽CEI-12和CEI-7的串联DNA，该基因具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。

本发明的第二方面提供了构建上述两种降血压肽串联DNA的方法，该方法将编码降血压肽CEI-12和CEI-7的核苷酸序列交替串联3次，该核苷酸序列对应的氨基酸序列可在胰蛋白酶作用下重新酶解成CEI-12和CEI-7两个多肽片段。

本发明的第三方面提供了含有上述两种降血压肽串联DNA的表达载体pET30a-CEI-12,7。

本发明的优点是：利用pET-30a上较小的His标签片断融合表达交替串联3次CEI-12和CEI-7多肽，增加了重组蛋白中目的多肽所占的比例，大大增加表达效率和减小了小肽的分离难度。

附图说明

图1显示了大肠杆菌BL21-MF3A3菌落PCR电泳图，说明该工程菌的质粒插入了大小为120bp左右目的基因；其中注：1、pET-30a⁺目的基因，2、pET-30a空载体，3、Marker；

图2显示了大肠杆菌BL21-MF3A3表达产物SDS-PAGE电泳图，说明该工程菌成功表达了大小为12kDa左右的目的蛋白；其中注：1、蛋白质Marker，2、BL21-MF3A3（不加IPTG诱导），3、BL21-MF3A3（加IPTG诱导），4、BL21-MF3A3（加IPTG诱导）超声破碎上清，5、BL21-MF3A3（加IPTG诱导）超声破碎沉淀；

图3显示了原发性高血压大鼠灌胃一定量的乳源性降血压肽CEI-12和CEI-7混合肽血压变化图，说明了本发明制备的CEI-12和CEI-7混合肽具有很好的降血压效果。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

从下面给出的说明结合附图，本发明的上面和其他目的和特征将变得明了。

实施例１：两种乳源性降血压肽CEI-12和CEI-7串联DNA设计与合成

a、两种乳源性降血压肽CEI-12和CEI-7串联多肽序列设计

本发明涉及的乳源性降血压肽CEI-12（SEQ ID NO3）和CEI-7（SEQ ID NO4）分别对应于牛乳α-酪蛋白23-34的残基序列和牛乳β-酪蛋白的177-183残基序列。CEI-12和CEI-7的N段氨基酸残基分别为Lys和Arg，同为胰蛋白酶的酶切位点，将CEI-12和CEI-7的氨基酸序列交替串联3次，在所得氨基酸序列的N段添加Asp- Asp- Asp- Asp-Lys序列，序列如SEQ ID NO2所示。

b、两种乳源性降血压肽CEI-12和CEI-7串联多肽基因设计

将所得氨基酸序列（SEQ ID NO2）根据大肠杆菌（Escherichia coli）BL-21菌株密码子偏爱性转化成核苷酸序列并在3’端添加TAATAATAA序列和BamHⅠ限制性内切酶识别序列GGATCC，在5’端添加KpnⅠ 限制性内切酶识别序列GGTACC，所得核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

实施例2：表达载体pUC18-CEI-12,7的构建及大肠杆菌BL21-MF3A3工程菌的构建

a、实施例1所设计的核苷酸序列SEQ ID NO1由上海旭冠生物技术发展有限公司合成得到，克隆至pUC18（购自Novagen公司），酶切位点为KpnⅠ和BamHⅠ，将此重组载体命名为pUC18-CEI-12,7，转入大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α（购自Novagen公司）。

b、将含有pUC18-CEI-12,7的大肠杆菌DH5α提取质粒，进行KpnⅠ和BamHⅠ（购自TaKaRa公司）双酶切，回收200bp左右的片段。

c、对表达载体pET-30a（购自Novagen公司）进行KpnⅠ和BamHⅠ（购自TaKaRa公司）双酶切，回收大片段。

d、将步骤b所得具有粘性末端的回收片段与步骤c中回收的大片段相连，转入DH5α菌株，利用常规菌落PCR获得克隆子，引物为5'-ACGACTCACTATAGGGGAATTGTGA-3'和5'-CGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCA-3'（上海生工生物工程有限公司合成），结果如图1所示。

e、将步骤d获得的克隆子送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果与设计一致。

f、将测序正确的克隆子提取质粒，命名为pET30a-CEI-12,7，转入大肠杆菌（Escherichia coli）BL-21（购自Novagen公司），将这样制备的转化体命名为“大肠杆菌BL21-MF3A3”。该菌种于2010年8月19日在中国武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为Escherichai coli BL21-MF3A3 CCTCC NO: M 2010204。

实施例3：两种乳源性降血压肽CEI-12和CEI-7串联多肽的表达和检测

将实例2获得的大肠杆菌BL21-MF3A3按体积比为1%接种量接种于50mL含卡那霉素Kan（50μg/mL）的 LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0）中，37℃、200r·min^-1恒温摇床培养至OD600为1.5时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度 1mmol·L^–1，28℃诱导 12 h，5000r ·min^-1离心收集菌体，将菌体反复冻溶3次，在PBS缓冲溶液（pH为7.0）进行超声破碎（300W，2s/2s，2min），8000r ·min^-1离心取沉淀，溶于8mL上柱缓冲溶液，通过活化的Ni-柱（购自Novagen公司）纯化得到His标记的重组蛋白，进行SDS-PAGE电泳，如图2所示。电泳表明在大肠杆菌诱导后目的蛋白主要存在于大肠杆菌超声破碎液离心后的沉淀中，分子量大小为12kDa左右，与设计的分子量大小吻合。

实施例4：两种乳源性降血压肽CEI-12和CEI-7串联多肽酶切纯化

将实施例2所述方法制备的经冷冻干燥的重组蛋白充分溶解6M尿素中，加入两倍体积pH8.0的0.1%肠激酶溶液(购自Novagen公司)，37℃温浴8h，进行活化的Ni-柱（购自Novagen公司））纯化去除His标记融合标签，制得去融合标签的串联多肽，将所得到的串联多肽溶液加入一倍体积pH8.0的0.1%(w/v)胰蛋白酶(购自Sigma公司），37℃温浴8h，，通过截留分子量7000Da的透析袋（购自上海欧伟达仪器科技有限公司）去除肠激酶和胰蛋白酶，透过液经浓缩后用CELLUFINE GH-25柱（购自CHISSO公司）脱盐得到纯化的多肽，经考马斯亮蓝法检测CEI-12和CEI-7混合多肽的表达量为0.2g·L ^– 1。

实施例5：混合多肽CEI-12和CEI-7活性检测

活性检测所用混合多肽CEI-12和CEI-7按照实施例3和实施例4方法制备。

a. 混合多肽CEI-12和CEI-7体外活性检测

体外活性检测采用Vermeirssen等改进的以FAPGG为血管紧张素Ⅰ模拟物的分光光度法，如表1，测得混合多肽CEI-12和CEI-7的IC₅₀值为0.012g/L，活性高于CEI-12（IC₅₀值为0.099g/L）和CEI-7（IC₅₀值为0.036g/L）其中单独任意一种（参见：Richard J. F．等人，J Nutr，134(4): 980- 988.(2004)）。

表1 ACE抑制活性的测定操作参数

	空白孔（μL）	样品孔（μL）
			ACE（0.1U/mL）	10	10
FAPGG（mmol/L）¹	50	50
			基质缓冲液²	40	0
混合多肽（CEI-12和CEI-7）	0	40

注：1.FAPGG（1.0mmol/L）：取3.994mg FAPGG加基质缓冲液，定容至10mL，溶解混合，置4℃避光放置；2.基质缓冲液：HEPES 1.910g，NaCl 1.755g，用双蒸馏水溶解后，用NaOH调到pH8.3，再补充水到100mL，置4℃备用。

b. 混合多肽CEI-12和CEI-7体内活性检测

实验材料为：SPF级10周龄雄性原发性高血压模型Wistar大鼠20只，体重180~240 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司。实验结果如图3所示。实验结果显示，不同剂量给药后在4h至6h，舒张压有大幅下降，其中中剂量组在4h血压下降值最大，达到32mmHg，此剂量对原发性高血压大鼠良好的降血压效果。

Claims

1.一种多活性肽的串联DNA，该基因具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。

2.一种多活性肽的串联DNA的构建方法，将编码降血压肽CEI-12和CEI-7的核苷酸序列交替串联3次，该核苷酸序列对应的氨基酸序列可在胰蛋白酶作用下重新酶解成CEI-12和CEI-7两个多肽片段。

3.含有权利要求1所述的多活性肽的串联DNA的表达载体pET30a-CEI-12,7。