CN1911957A - 降血压肽的串联多肽、表达载体、多核苷酸序列及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为降血压肽的串联多肽、表达载体、多核苷酸序列及应用。本发明的串联多肽是由2－11个如下降血压肽单体首尾串联而成的氨基酸序列：Lys－Val－Leu－Pro－Val－Pro，所述降血压肽单体之间由胰蛋白酶的酶切位点连接起来。本发明的多核苷酸序列为编码本发明的串联多肽的多核苷酸序列。本发明的方法采用基因工程重组技术，采用本发明的多核苷酸序列来表达降血压肽的串联多肽，从而获得降血压肽单体。本发明成功实现了小分子降血压肽在微生物工程菌中的高效表达，制得的降血压肽具有高体内降血压活性，为降血压肽保健食品和药物等产品的市场化提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种降血压肽的串联多肽、编码该串联多肽的多核苷酸序列、表达载体以及所述多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产降血压肽中的应用。
背景技术
高血压由于高患病率和严重并发症而成为当前危害人类身体健康和生活质量的主要疾病。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)能通过抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性而达到抑制血压升高的作用，但目前用于临床治疗高血压的药物易产生不良反应和副作用。源于食物的降血压肽(AHP)具有降血压效果明显，同时对血压正常者无明显降压作用和无毒副作用等优点，已成为抗高血压药物研究的热点之一。目前，AHP主要通过酶解法从天然蛋白中分离纯化获得，但由于特异性蛋白酶筛选繁琐、分离纯化工艺复杂、产量低等问题而难以产业化。利用基因工程技术生产降血压肽可能克服这些问题，而且不受原料来源的限制，生产周期短，下游分离纯化工艺简单，便于进行大规模生产因此，具有广阔的发展前景。目前，利用基因工程技术高效成功制备降血压肽在国内外鲜见报道。因为降血压肽为小分子肽，利用基因工程重组技术制备降血压肽，存在着小分子肽在微生物工程菌中表达率低及易降解的问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于针对小分子肽在微生物工程菌中表达率低及易降解的问题，提供一种降血压肽的串联多肽。
本发明的第二个目的在于为了表达本发明的降血压肽的串联多肽，提供一种编码本发明串联多肽的多核苷酸序列。
本发明的第三个目的在于将本发明的多核苷酸序列应用于基因工程重组技术表达生产降血压肽。
本发明的第四个目的在于提供一种含本发明的多核苷酸序列的重组载体。
本发明的串联多肽，是由2-11个如下降血压肽单体首尾串联而成的氨基酸序列：Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro，所述降血压肽单体之间由胰蛋白酶的酶切位点连接起来。所述胰蛋白酶的酶切位点为Lys↓或Arg↓。
本发明将降血压肽单体串联起来组建串联多肽是为了提高降血压肽在大肠杆菌表达系统中的表达量，而且较不易降解。
本发明的串联多肽优选由6个降血压肽单体用胰蛋白酶酶切位点Arg↓连接构成的串联多肽，即优选氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO：5所述的氨基酸序列，具体如下：
Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro。
本发明中的降血压肽单体，也即序列表中SEQ ID NO：7所述的氨基酸序列，是发明人从文献报道的各种具有降血压活性的多肽中筛选并进行活性验证后选择出来的：
(1)从文献报道的具有降血压活性多肽的初步筛选和分析：
分析文献报道的各种降血压肽序列的体外活性即对ACE的抑制活性，和体内活性即喂食高血压大鼠SHR后降压效果，来选择高活性的AHP。
Maeno等从β-酪蛋白分离出的AHP(KVLPVPQ，IC50＞1000μmol/L)用胰腺消化酶消化后，分离得到的AHP(其氨基酸序列为KVLPVP)IC50达5μmol/L，用1mg/kg体重的剂量喂养原发性高血压大鼠(SHR)，其血压平均降低32.2mmHg，表明具很高的体内外活性，不易被消化酶消化；该序列C-端为脯氨酸，序列中非极性氨基酸含量高，基本符合Cheung等总结的高活性降血压肽的结构特点。据此，初步筛选出具有KVLPVP氨基酸序列的AHP作为用于基因工程方法表达的降血压肽单体。
(2)高活性降血压肽单体的活性验证：
为验证本发明选择出的降血压肽(KVLPVP)的高活性，申请人采用固相多肽合成(SPPS)方法合成KVLPVP序列，经过人工胃液、人工肠液依次酶解作用，测定最终酶解物对ACE的抑制率，结果表明，水解前后抑制率变化不大，说明该肽抗胃液和肠液消化能力较强，不易被胃液和肠液进一步水解。因此，确定降血压肽单体(KVLPVP)作为用于基因工程方法表达的降血压肽单体。
为了表达本发明的串联多肽，本发明将串联多肽的氨基酸序列按照偏爱密码子转换成编码该串联多肽的多核苷酸序列，从而实现本发明的第二个目的。
发明人将本发明的串联多肽的氨基酸序列按照偏爱密码子翻译成的多核苷酸序列定义为AHP-N，两个降血压肽单体串联的N为2，三个降血压肽单体串联的N为3，其余的依次类推。
本发明的多核苷酸序列，优选编码SEQ ID NO：5所述的串联多肽的多核苷酸序列，也即编码串联数为6的串联多肽的多核苷酸序列。
将本发明的多核苷酸序列通过本领域熟知的基因工程技术，来表达生产降血压肽。
将本发明的串联多肽的氨基酸序列，按照偏爱密码子(如大肠杆菌偏爱密码子、酵母菌偏爱密码子等等)翻译成多核苷酸序列，化学合成该多核苷酸序列后，通过本领域熟知的基因工程技术，可构建各种原核表达载体、真核表达载体和穿梭质粒载体，并转化原核、真核生物以得到表达。具体过程可如下所述：
化学合成双链目的基因AHP-N片段，根据选定的表达载体的多克隆酶切位点，合成时在AHP-N序列的5’端和3’端加上可连接到载体上的限制性酶切位点和终止密码子，例如，在5’端加上BamHI位点，在3’端加上SalI位点。并克隆至高拷贝质粒例如PUC19质粒中，转入宿主菌例如大肠杆菌DH5α中保存。
扩增培养并提取含目的基因的高拷贝质粒，同时扩增培养并提取表达载体，克隆质粒和表达载体分别经过双酶切，割胶分别回收目的基因片段和表达载体片段，将目的基因片段和表达载体片段用T4DNA连接酶连接，即构建了含有DNA序列AHP-N的重组载体，例如图1所示的重组质粒pGEX-4T-2::AHP-N。把获得的重组载体转化宿主菌，例如大肠杆菌BL21，获得用来表达AHP-N多肽的转化子。
将扩繁后的工程菌诱导，诱导产物用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切后，用反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，纯化得到的降血压肽单体经氨基酸序列分析，其序列为KVLPVP表明利用基因工程方法成功制备降血压肽。RP-HPLC纯化降血压肽的最佳条件为：乙腈浓度12％(v/v)，三氟乙酸浓度0.05％(v/v)，洗脱速度1.0mL/min。
发明人分别将2-11个降血压肽单体用胰蛋白酶的酶切位点Arg↓串联起来构成系列氨基酸序列，并全部化学合成了对应于这些串联多肽的系列多核苷酸序列，并依次构建了含有不同降血压肽串联数的系列工程菌BL21/pGEX-4T-2::AHP-N，分别扩繁这些工程菌后，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，诱导产物用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切后，用RP-HPLC纯化测定单体AHP含量，结果表明6个降血压肽单体串联起来表达，表达量最大，达到400mg/L。
本发明的重组载体，是含有本发明的任何一种多核苷酸序列的重组载体。本发明的重组载体通过本领域熟知的技术构建，如上所述。
本发明人成功构建出降血压肽基因并实现在工程菌中高效表达，经动物体内实验表明，表达的降血压肽具有与天然降血压肽相同的降血压效果，所制备的降血压肽有望开发为具有降血压作用的功能性食品和抗高血压药物。
本发明的技术效果在于：本发明构建了串联多肽及编码它的多核苷酸序列及重组载体，并采用基因工程重组技术成功实现了小分子降血压肽在微生物工程菌中的高效表达，表达的融合蛋白经过特异性胰蛋白酶酶解和进一步分离纯化，制得的降血压肽与从天然乳源蛋白中提取的AHP一样，具有高体内降血压活性。本发明构建了串联多肽及编码它的多核苷酸序列，采用基因工程重组技术表达生产降血压肽还克服了酶解法制备降血压肽存在的特异性蛋白酶筛选繁琐、分离纯化工艺复杂、产量低等问题，而且生产不受原料限制，能进行工厂化自动化大规模生产，降低了生产成本，为降血压肽保健食品和药物等产品的市场化提供了技术支持。
附图说明
图1是本发明实施例中重组表达载体的构建过程图。
具体实施方式
实施例一：2个降血压肽单体串联的AHP-2多肽大肠杆菌表达系统的构建及表达
将两个降血压肽单体KVLPVP用胰蛋白酶酶切位点Arg↓连接构成2拷贝的串联多肽(十三肽)，该串联多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所述，具体如下：
Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro
1 5 10
选择pGEX-4T-2(购自Amersham公司)作为该串联十三肽的融合蛋白表达载体，根据大肠杆菌偏爱密码子，将十三肽的氨基酸序列转化成如序列表中SEQ ID NO：1所述的多核苷酸序列，即AHP-2：
aaagtgctgc cggtgccgcg taaagtgctg ccggtgccg 39，
并在该多核苷酸序列的5’端加上BamHI酶切位点GGATCC，在3’端加上加上终止密码子TGA和SalI位点酶切位点GTCGAC，最终设计成如下多核苷酸序列：
GGATCCAAAG TGCTGCCGGT GCCGCGTAAA GTGCTGCCGG TGCCGTGAGG GTCGAC 56，
化学合成双链该多核苷酸序列，并克隆到高拷贝质粒pUC19中，得到含目的基因的克隆载体pUC19::AHP-2，将该载体转化宿主菌DH5α中保存。
按图1所示构建重组表达载体pGEX-4T-2::AHP-2。将重组表达载体pGEX-4T-2::AHP-2转化大肠杆菌E.coli BL21，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养，挑取单菌落进行重组质粒鉴定。双酶切、PCR以及基因测序结果均表明成功构建了重组表达载体pGEX-4T-2::AHP-2。
将构建的基因工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2::AHP-2)液体培养至对数期OD值1.5，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L诱导表达6小时，诱导产物GST融合蛋白(GST-AHP-2)用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切后，用RP-HPLC纯化测定单体AHP含量，结果表明2个降血压肽单体串联起来表达，表达量达到142mg/L。
实施例二：6个降血压肽单体串联的AHP-6多肽大肠杆菌表达系统的构建及表达
将六个降血压肽单体KVLPVP用胰蛋白酶酶切位点(Arg↓)连接构成6拷贝的串联多肽(四十一肽)，该串联多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所述，具体如下：
Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val
1 5 10 15
Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro
20 25 30
Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro
35 40
选择pGEX-4T-2作为表达载体，根据大肠杆菌偏爱密码子，将四十一肽的氨基酸序列转化成序列表中SEQ ID NO：2所述的多核苷酸序列，即AHP-6：
aaagtgctgc cggtgccgcg taaagtgctg ccggtgccgc gtaaagtgct gccggtgccg 60
cgtaaagtgc tgccggtgcc gcgtaaagtg ctgccggtgc cgcgtaaagt gctgccggtg 120
ccg 123
并在该多核苷酸序列的5’端加上BamHI酶切位点GGATCC，在3’端加上终止密码子TGA和SalI位点酶切位点GTCGAC，最终设计成如下多核苷酸序列：
GGATCCAAAG TGCTGCCGGT GCCGCGTAAA GTGCTGCCGG TGCCGCGTAA AGTGCTGCCG 60
GTGCCGCGTA AAGTGCTGCC GGTGCCGCGT AAAGTGCTGC CGGTGCCGCG TAAAGTGCTG 120
CCGGTGCCGT GAGGGTCGAC 140
化学合成双链该多核苷酸序列，并克隆到高拷贝质粒pUC19中，得到含目的基因的克隆载体pUC19::AHP-6，将该载体转化宿主菌DH5α中保存。
按图1所示构建重组表达载体pGEX-4T-2::AHP-6。将重组表达载体pGEX-4T-2::AHP-6转化大肠杆菌E.coli BL21，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养，挑取单菌落进行重组质粒鉴定。双酶切、PCR以及基因测序结果均表明成功构建了重组表达载体pGEX-4T-2::AHP-6。
将构建的基因工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2::AHP-6)液体培养至对数期OD值1.5，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L诱导表达6小时，诱导产物GST融合蛋白(GST-AHP-6)用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切后，用RP-HPLC纯化测定单体AHP含量，结果表明6个降血压肽单体串联起来表达，表达量达到400mg/L。
经正交实验、摇瓶实验和电泳分析，对工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2::AHP-6)表达GST融合蛋白(GST-AHP-6)的培养基和在最优培养基中的发酵工艺进行了优化。工程菌最优发酵培养基成分质量配比为：胰蛋白胨2.6％，酵母抽提物1.9％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，KCl 4mmol/L，MgCl2 10mmol/L；最佳培养及诱导条件为：温度30℃，起始pH7.0，装液量5％(v/v)，接种量5％(v/v)，培养至OD600值1.5，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导6小时。在此优化条件下，可溶性GST-AHP-6表达量达1.9g/L，总GST-AHP-6表达量2.5g/L，可溶性GST-AHP-6占总GST-AHP-6的76％。
通过正交实验、电泳分析和HPLC方法，对降血压肽的分离纯化工艺进行了优化研究。细胞破碎的最佳方法及条件为：每克湿菌体悬于3mL 1×PBS中，加溶菌酶至终浓度1mg/mL，冰上放置30分钟，-70℃反复冻融7次，加20％(v/v)Triton X-100至终浓度1％(v/v)，温和混合30分钟，分别加入DNase和RNase至终浓度5μg/mL，4℃震荡温育10分钟，12000g离心10分钟，收集上清液。GST-AHP-6亲和层析最佳条件：上柱量4mg(GST-AHP-6)/mL(凝胶体积)，上柱流速1.5mL/min，上柱1次，上样结束用1×PBS洗脱杂蛋白至紫外检测仪检测吸光值OD280不变为止，用1倍柱床体积还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，反应10分钟，收集洗脱液，重复3次，在此条件下融合蛋白吸附量达3.86mg/mL(medium bed)，GST-AHP-6回收率达96.5％。GST-AHP-6融合蛋白经胰蛋白酶和羧肽酶顺序酶解后，1mg的GST-AHP-6能得到100μg的AHP。反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化降血压肽的最佳条件：乙腈(CAN)浓度12％(v/v)，三氟乙酸(TFA)浓度0.05％(v/v)，洗脱速度1.0mL/min；或选择ACN浓度12％(v/v)，TFA浓度0.03％(v/v)，洗脱速度0.8mL/min，在这两个条件下纯化都可实现完全分离。
实施例三：11个降血压肽单体串联的AHP-11多肽大肠杆菌表达系统的构建及表达
将十一个降血压肽单体KVLPVP用胰蛋白酶酶切位点(Arg↓)连接构成11拷贝的串联多肽(七十六肽)，该串联多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所述，具体如下：
Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val
1 5 10 15
Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro
20 25 30
Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro
35 40 45
Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys
50 55 60
Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro
65 70 75
选择pGEX-4T-2(购自Amersham公司)作为该串联七十六肽的融合蛋白表达载体，根据大肠杆菌偏爱密码子，将七十六肽的氨基酸序列转化成序列表中SEQ ID NO：3所述的多核苷酸序列，即AHP-11：
aaagtgctgc cggtgccgcg taaagtgctg ccggtgccgc gtaaagtgct gccggtgccg 60
cgtaaagtgc tgccggtgcc gcgtaaagtg ctgccggtgc cgcgtaaagt gctgccggtg 120
ccgcgtaaag tgctgccggt gccgcgtaaa gtgctgccgg tgccgcgtaa agtgctgccg 180
gtgccgcgta aagtgctgcc ggtgccgcgt aaagtgctgc cggtgccg 228
并在该多核苷酸序列的5’端加上BamHI酶切位点GGATCC，在3’端加上加上终止密码子TGA和SalI位点酶切位点GTCGAC，最终设计成如下多核苷酸序列：
GGATCCAAAG TGCTGCCGGT GCCGCGTAAA GTGCTGCCGG TGCCGCGTAA AGTGCTGCCG 60
GTGCCGCGTA AAGTGCTGCC GGTGCCGCGT AAAGTGCTGC CGGTGCCGCG TAAAGTGCTG 120
CCGGTGCCGC GTAAAGTGCT GCCGGTGCCG CGTAAAGTGC TGCCGGTGCC GCGTAAAGTG 180
CTGCCGGTGC CGCGTAAAGT GCTGCCGGTG CCGCGTAAAG TGCTGCCGGT GCCGTGAGGG 240
TCGAC 245
化学合成双链该多核苷酸序列，并克隆到高拷贝质粒pUC19中，得到含目的基因的克隆载体pUC19::AHP-11，将该载体转化宿主菌DH5α中保存。
按图1所示构建重组表达载体pGEX-4T-11::AHP-2。将重组表达载体pGEX-4T-2::AHP-11转化大肠杆菌E.coli BL21，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养，挑取单菌落进行重组质粒鉴定。双酶切、PCR以及基因测序结果均表明成功构建了重组表达载体pGEX-4T-2::AHP-11。
将构建的基因工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2::AHP-11)液体培养至对数期OD值1.5，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L诱导表达6小时，诱导产物GST融合蛋白(GST-AHP-11)用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切后，用RP-HPLC纯化测定单体AHP含量，结果表明11个降血压肽单体串联起来表达，表达量达到322mg/L。
实施例四：基因工程制备的降血压肽在动物体内的降血压肽效果实验。
采用本发明构建的降血压肽的串联多肽及多核苷酸序列通过基因工程重组技术表达生产的降血压肽单体喂食原发性高血压大鼠(SHR)实验表明，给药剂量为300μg/kg(体重)时，AHP对SHR具有显著性降压效果(P＜0.05)，4小时后降压幅度达35.0±21.3mmHg；给药剂量为600μg/kg(体重)时，有极显著降压效果(P＜0.01)，4小时后降低幅度达61.0±31.8mmHg；给药4小时后血压降至最低点，此后趋于稳定，药效可持续24小时以上，36小时后，血压开始回升，至42小时血压基本恢复到给药前水平。而AHP对血压正常大鼠(WKY)无显著的降血压作用。表明，制备的降血压肽与从天然乳源蛋白中提取的AHP一样，具有高体内降血压活性。
序列表
<110>深圳职业技术学院
<120>降血压肽的串联多肽、表达载体、多核苷酸序列及应用
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Artificial Sequence
<400>1
aaagtgctgc cggtgccgcg taaagtgctg ccggtgccg 39
<210>2
<211>123
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Artificial Sequence
<400>2
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cgtaaagtgc tgccggtgcc gcgtaaagtg ctgccggtgc cgcgtaaagt gctgccggtg 120
ccg 123
<210>3
<211>228
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Artificial Sequence
<400>3
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ccgcgtaaag tgctgccggt gccgcgtaaa gtgctgccgg tgccgcgtaa agtgctgccg 180
gtgccgcgta aagtgctgcc ggtgccgcgt aaagtgctgc cggtgccg 228
<210>4
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Artificial Sequence
<400>4
Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro
1 5 10
<210>5
<211>41
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Artificial Sequence
<400>5
Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val
1 5 10 15
Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro
20 25 30
Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro
35 40
<210>6
<211>76
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Artificial Sequence
<400>6
Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val
1 5 10 15
Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro
20 25 30
Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro
35 40 45
Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro Arg Lys
50 55 60
Val Leu Pro Val Pro Arg Lys Val Leu Pro Val Pro
65 70 75
<210>7
<211>6
<212>PRT
<213>普通牛种(Bos taurus)
<400>7
Lys Val Leu Pro Val Pro
1 5
Claims (7)
1.一种降血压肽的串联多肽，是由2-11个如下降血压肽单体首尾串联而成的氨基酸序列：
Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro，
所述降血压肽单体之间由胰蛋白酶的酶切位点连接起来。
2.根据权利要求1所述的降血压肽的串联多肽，其特征在于其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：5所述的氨基酸序列。
3.一种编码权利要求1所述的串联多肽的多核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸序列，其特征在于为编码SEQID NO：5所述的串联多肽的多核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产降血压肽中的应用。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产降血压肽中的应用，其特征在于：表达生产降血压肽的微生物为原核微生物。
7.一种重组载体，含有权利要求3所述的任何一种多核苷酸序列。
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2006
- 2006-08-16 CN CN 200610062169 patent/CN1911957A/zh active Pending
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