CN1252836A

CN1252836A - 修饰的羧肽酶

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Publication number: CN1252836A
Application number: CN98802877.8A
Authority: CN
Inventors: U·莫坦森; K·欧莱森; H·斯坦尼科; S·B·索兰森; K·布莱丹姆
Original assignee: CALSBERG LABORATORY
Current assignee: CALSBERG LABORATORY
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2000-05-10
Also published as: AU6513398A; JP2001513638A; US5985627A; AU740742B2; US20010010923A1; WO1998038285A2; WO1998038285A3; CA2281879A1; EP0966526A2

Abstract

本发明涉及对含有具有带正电侧链的P₁氨基酸的肽底物进行转酰胺基作用的方法。根据本发明修饰羧肽酶Y以替换S₁亚位点中的至少一个具有带负电侧链的氨基酸。并且,修饰的羧肽酶Y可包含在S₁’、S₂和/或S₃亚位点中的替换的氨基酸以适应特殊肽底物的需要。

Description

修饰的羧肽酶

发明背景：

一种生产肽，特别是药用肽的优选方法是借助遗传工程。然而，通过重组技术生产肽有特殊的限制。例如，因为遗传密码不包括非天然存在的L-氨基酸、D-氨基酸、放射性氨基酸和其它可检测到的标记，所以带有这些修饰的重组多肽的生产是困难的。

并且，通常在体内形成的天然氨基酸修饰如C末端酰胺基团转换难以在体外形成。因为这些翻译后修饰常常产生肽最强或最长的作用形式，所以它们是对于药用最需要和最理想的形式。对许多多肽而言，C末端酰胺化作用对生物活性是重要的。然而，大规模活性多肽生产的重组表达系统并不易于进行所需要的C末端修饰。

已知羧肽酶可催化转肽反应，产生C末端酰胺化的多肽。然而，野生型羧肽酶对许多多肽的C末端酰胺化作用是无用的。例如，野生型羧肽酶固有的底物特异性限制了使用此酶可修饰的多肽种类。

特别地，羧肽酶Y表现出对含有次末位非极性残基的多肽的强烈偏爱。含有具有带正电侧链的次末位氨基酸的底物不能由羧肽酶Y有效转酰基。例如，水解底物FA-Arg-Ala-OH比水解底物FA-Leu-Ala-OH慢500倍。遗憾的是，许多药学上重要的多肽包括生长激素释放因子(GRF)或胰高血糖素样肽(GLP1)的氨基酸序列都含有具有带正电侧链的次末位或最末位氨基酸，使得羧肽酶Y的转酰胺基作用在商业上不实用。

尽管已知的一些突变羧肽酶对大量肽底物有增强的水解活性，但是对大量突变羧肽酶的研究证明在具有增强的水解活性的突变体和具有增强的转酶胺基活性的突变体之间没有特异的联系。例如，尽管来自微紫青霉的羧肽酶S1能有效水解含有碱性P₁残基的肽底物，但是酶并不能对它们有效地发挥转肽作用。引自Breddam，Carlsberg Res.Commun.，53(5)：309-320(1988)。

提供对序列上包含具有带正电侧链的次末位氨基酸(P₁)的肽底物有增强的转酰基活性的修饰羧肽酶是十分有用的。

发明概述：

本发明提供修饰的羧肽酶和转酰胺基的方法。修饰的羧肽酶和方法有效地改善羧肽酶Y对序列中包含具有带正电侧链的次末位氨基酸(P₁)的肽底物的转酰基活性。

本发明的修饰的羧肽酶包含在其S₁亚位点(Subsite)的至少一个氨基酸替换。导致与天然羧肽酶相比在S₁亚位点更多的负电荷。典型地，这通过用具有带负电侧链的氨基酸残基替换具有中性或带正电侧链的氨基酸残基来实现。S₁亚位点内用于引入负电荷的优选位点的实例包括L178、W312、N241和L245位。具有带负电氨基酸侧链的氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。修饰的羧肽酶Y也可包含其它突变，例如在一个或多个羧肽酶的S₁’，S₂和S₃亚位点的氨基酸残基替换。这些额外的修饰能进一步增强对特殊底物的转酰基作用，并使底物和亲核物质适应转酰胺反应。

本发明的方法包括在修饰的羧肽酶Y的参与下使肽底物与亲核物质反应。适当的亲核物质的实例包括烷基胺、苯甲基胺和氨基酸的α-氨基。氨基酸亲核物质可以酸、酯或酰胺形式含有α-羧化物。优选地，将肽底物在pH约6.3至约6.7与亲核物质和修饰的羧肽酶Y一起温育。

本发明的另一方面包括含有至少一个用具有带负电侧链的氨基酸替换的氨基酸残基N241和L245的修饰的羧肽酶Y。优选地，修饰的羧肽酶Y也包含在S₁亚位点内的其它替换，最优选地在L178和/或W312位。修饰的羧肽酶Y可进一步包含在一个或多个羧肽酶亚位点S₁’、S₂和S₃内氨基酸残基处的氨基酸替换。

本发明的修饰的羧肽酶对重组肽，特别是含有具有带正电侧链的次末位氨基酸的肽的翻译后修饰特别有用。然而，可以理解通过重组技术之外的方法产生的肽可以按照本发明的方法进行转酰胺基作用。发明详述：

本发明的修饰的羧肽酶设计为改善或增强含有带正电次末位氨基酸残基的肽底物的转酰胺基作用。优选修饰的羧化酶是从已知的丝氨酸或半胱氨酸羧肽酶如羧肽酶Y衍生而来。

为易于理解本发明，将首先提供与本发明相关的所用术语的简短讨论。术语：

本公开使用Schechter等，1967，Biochem.Biophys.Res.Commun.27：157-162中的术语来描述肽底物上和羧肽酶活性位点内不同氨基酸残基位置。

根据Schechter等的术语，肽底物的氨基酸残基用字母“P”表示。底物中肽键切割(即“切割点”)N末端侧的氨基酸用P_n…P₃、P₂、P₁表示，其中P_n表示离切割点最远的氨基酸残基。肽底物中切割点C末端侧的氨基酸残基用P’₁、P’₂、P₃’…P_n’表示，其中P_n’表示离切割点最远的氨基酸残基。因此，要切割的键(即“切割点”)是P₁…P₁’键。因为羧肽酶仅切割C末端的次末位残基间的多肽键，所以羧肽酶的底物仅包括C末端侧P₁’位的残基(即没有P₂’，P₃’等残基)。羧肽酶底物氨基酸的基本结构式如下：

P_n------P₃---P₂---P₁-----P₁’

羧肽酶的“活性位点”可分为多个底物结合亚位点。羧肽酶底物结合亚位点的表示与肽底物氨基酸残基的表示方法类似。但是，羧肽酶的结合亚位点用字母“S”表示并且可包括一个以上氨基酸残基。在切割点N端位点的氨基酸残基的底物结合位点标记为S_n…S₃、S₂、S₁。切割点羧基侧的氨基酸的底物结合亚位点用S₁’表示。因此，在羧肽酶中，S₁’亚位点与肽底物的“离去基团”和进入的亲核物质相互作用。描述羧肽酶底物结合位点的基本结构式是：

S_n------S₃---_S2---S₁---S₁’

S₁结合位点结合肽底物的次末位氨基酸P₁的侧链。S₂结合位点与相邻氨基酸残基P₂的侧链相互作用。同样的，S₃结合位点与P₃残基的侧链相互作用。

如此处所用的，亲核物质是向电子受体提供一对电子，在此例中是肽底物次末位氨基酸残基的α-羧化基团酰基碳，以形成共价键的分子。适当的亲核物质包括氨基酸、氨基酸衍生物如氨基酸酯和氨基酸酰胺、酰胺如氨或苯甲基胺。适合用于本方法的化合物的一个特异基团包含可切割的亲核物质(在转酰胺基反应之后的步骤中)以产生缺乏衍生于亲核物质的残基并具有C末端羧酰胺的肽。实例包括可通过光解作用(solvalysis)、溶剂分解作用、还原作用、重排作用、水解或氧化作用切割的亲核物质，如那些在美国专利号5,580,751中公开的那些物质，在此引用作为参考。应当指出底物肽的次末位氨基酸在C末端残基已从转酰胺基产物上切割下来后成为最末位残基。

本发明包括从已知的丝氨酸或半胱氨酸羧肽酶衍生的“修饰的羧肽酶”，其中已用不同氨基酸替换某些氨基酸残基以提供能改善转酰胺基作用的羧肽酶。“改善的转酰胺基作用”可通过测量得到的氨解比例(fa)来检验。

因为氨解的低比例可能是由于转酰胺基产物通过水解降解，所以修饰的羧肽酶与相应的天然羧肽酶相比有高至少约0.1的氨解比例(fa)是更优选的。

另一个有用的酶效力测量标准是K_N(app)，即达到fa_最大/2时的酶浓度。K_N(app)描述了亲核物质的表观结合常数。因为竞争性水解反应主要在离去基团仍结合于酶上时发生，所以K_N(app)是优选的。转酰胺基作用：

本发明的修饰羧肽酶与相应的羧肽酶相比能改善在P₁亚位点具有带正电氨基酸残基的肽底物的转酰胺基作用。如此处所用的，“转酰基作用”是其中离去基团替换为亲核物质的反应。转酰基反应包括转酰基作用和转肽反应。“转肽作用”，如此处所用的，在氨基酸或氨基酸衍生物作用为离去基团并且亲核物质是氨基酸或氨基酸衍生物如氨基酸酯或氨基酸酰胺时发生。“转酰胺基作用”包括转肽作用，其中在亲核物质和肽底物之间形成酰胺键。但是，在转酰胺基反应中，亲核物质不必需是氨基酸。基本转酰基反应如下所示：

根据本发明，肽底物可在修饰的羧肽酶的参与下与亲核物质反应以形成其中亲核物质通过酰胺键与肽底物P₁残基的α-羧基连接的产物。通过丝氨酸羧肽酶进行的C末端酰基化作用是两步反应。在第一步中，酶攻击C末端肽键，置换P₁’“离去基团”并在肽底物P₁残基和酶之间形成酰基键。此中间产物称为“酰基-酶中间体”。在适当亲核物质的参与下，在适当条件下，酶使亲核物质加入到切割的肽底物上以产生酰基化的转肽产物。可以确信，亲核物质与酰基-酶中间体的羧基结合并从酰基-酶中间体将酶替换下来。以这种方式，使亲核物质与肽底物的羧基基团连接。或者，酰基-酶中间体可能通过水脱酰基以产生水解产物。本发明的修饰的羧肽酶设计为优先产生多于水解产物的酰基化转肽产物。

图解I，如下所示，是羧肽酸催化的转酰胺基反应的图示，其中E代表游离酶；S代表底物；ES为酶底物复合物；EAP代表有结合的离去基团的酰基-酶中间体，其中A是酰基成分，P是离去基团；EA是酰基酶；N代表亲核物质；并且AN代表所需的氨解产物。

图解I

如图解I中所示的，水解可以在转酰胺基作用中的两个阶段发生。酰基-酶中间体可以被水解，从酶上释放出酰基成分和离去基团，而没有所需的氨解产物产生。目前认为水解主要发生在转酰胺基反应中的这一点上。或者，酰基-酶可能在离去基团从酰基-酶中间体上解离后水解。修饰的羧肽酶：

本发明的修饰羧肽酶设计为与天然的丝氨酸或半胱氨基羧肽酶相比改善或增强肽底物的转酰胺基作用。对天然羧肽酶修饰的基础是在肽底物和酶的活性位点之间提供“最佳匹配”。进行修饰时考虑的因素包括减少空间阻碍和减少水接近酰基-酶中间体的机会。

具体地，修饰的羧肽酶设计为通过用具有带负电侧链的氨基酸替换S₁亚位点的氨基酸残基来改善或增强含有带正电次末位氨基酸残基的肽底物的转酰胺基作用。除了在P₁位带正电残基，为增强在P₃位含有带正电氨基酸的肽底物的转酰胺基作用，可进行第二次替换，其中在S₃亚位点或另一能与肽底物P₃残基相互作用的亚位点内的残基用具有带负电侧链的氨基酸残基替换。对于在P₂位具有丙氨酸残基的肽底物，羧肽酶S₂亚位点内的残基可以用具有疏水侧链的氨基酸残基替换。具体地，修饰的羧肽酶可用于改善生长激素释放因子(GRF)前体或胰高血糖样肽(GLP)前体的转酰胺基作用。GRF(1-44)，GLP1(1-36)-Xaa和GLP(7-36)-Xaa的序列如下所示，其中Xaa是作用为离去基团的C-末端氨基酸残基。Xaa残基通常具有不带电的氨基酸侧链，并且优选地是丙氨酸残基。GRF(1-43)-Xaa[SEQ ID NO：1]：

Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-XaaGLP1(1-36)-Xaa[SEQ ID NO：2]

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-XaaGLP1(7-36)-Xaa[SEQ ID NO：3]

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa

为制备本发明的修饰的羧肽酶，可进行点特异诱变以替换天然羧肽酶活性位点中的氨基酸残基。具体地，可进行点特异诱变以用带负电氨基酸残基替换S₁亚位点内的氨基酸残基。为进一步增强修饰的羧肽酶的转酰胺基活性，可在S₂，S₃或S₁’亚位点内对氨基酸残基进行其它替换。并且，转酰胺基作用优选地在pH约6.3到约6.7进行以进一步增强反应效率。S₁亚位点内的替换：

羧肽酶的S₁亚位点与肽底物的C末端次末位残基相互作用。通常，S₁亚位点在决定羧肽酶的底物特异性方面起重要作用。这对于羧肽酶Y尤其正确。

本发明的第一方面涉及对含有带正电次末位氨基酸残基的肽底物进行转酰胺基作用的方法。根据本发明，在羧肽酰的S₁亚位点内引入具有带负电侧链的氨基酸以制备对含有带正电P₁残基的肽底物具有增强的转酰胺基活性的羧肽酶。

术语“具有带负电侧链的氨基酸”用于本发明的上下文中时，包括L-氨基酸和氨基酸衍生物如氨基酸酯或氨基酸酰胺。合适的具有带负电侧链的氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。

在一个实施方案中，在羧肽酶Y的S₁亚位点内的N241、L245、L178或W312位的至少一个位置引入具有带负电侧链的氨基酸。更优选的替换的实施例包括N241D、N241E、L245D、L245E、L178D、L178E、W312D和W312E。

S₁亚位点内用于增强转酰胺基作用的其它替换包括L178A、L178S和W312L。在L178位用丙氨酸或丝氨酸替换亮氨酸或在312位用亮氨酸替换色氨酸，导致原有氨基酸残基替换为体积更小的残基或极性更强的残基。可以确信，体积更小的残基的引入可通过减少空间阻碍增强转酰胺基作用。S₁结合位点的大小因此而扩大从而可改善含有相对长侧链的P₁氨基酸残基如精氨酸或赖氨酸的肽的转酰胺基作用。极性残基如丝氨酸也能为带电的P₁残基提供更有利的环境。S₁’亚位点内的替换：

本发明的修饰羧肽酶对特异肽底物的转酰胺基作用可通过替换天然羧肽酶S₁’亚位点中的氨基酸残基得到进一步增强。在转酰胺基反应中，S₁’亚位点与进入的亲核物质和肽底物的离去基团的相互作用。因为认为竞争性水解反应主要在离去基团仍与酶结合时发生。所以S₁’亚位点内增加离去基团从酰基-酶中间体上解离的速率和/或降低离去基团仍结合酶时水的进入的替换将通过减少竞争性水解反应来增加氨解产物的比例。优选地，这些替换对亲核物质与肽底物的结合没有不利影响。

S₁’亚位点内可能进行有效替换的位置包括T60、F64、L267、L272、S297和M398。这些残基限定了羧肽酶Y的S₁’侧链结合口袋。其它适于替换的残基包括Y49、N51、E65和E145。这些残基在S₁’亚位点内形成氢键网。下列突变的羧肽酶与野生型羧肽酶相比对于更大的，疏水的离去基团如亮氨酸残基表现出所得氨基产物比例的改善：T60A、T60W、T60Y、T60D、M398G、M398A、M398V、M398I、M398L、M398F、M398Y、M398C、M398N和M398E。对于以下突变，观察到最显著的改善：T60Y、M398V、M398I、M398L、M498F、M398Y、M398C和M398E。多种替换如T60、M398和/或N51进一步增强用突变酶获得的氨解产物的比例。S₂亚位点内的替换

使用在S₂亚位点内有替换的羧肽酶可进一步增强修饰的羧肽酶对含P₂丙氨酸残基的肽底物的活性。因为羧肽酶的S₂亚位点在P₂与底物残基相互作用，所以在S₂亚位点内引入疏水性残基如苯丙氨酸或丙氨酸补充了肽底物并能增强羧肽酶对底物的转酰胺基作用。具体地，含P₂丙氨酸的底物的转酰胺基作用可以通过包含以下替换的突变羧肽酶而得到增强：E296F、S297A、N303A和N303F。S₃亚位点内的替换：

除了在S₁亚位点内引入带负电荷残基，在P₁和P₃均含有带正电荷残基的肽底物的转酰胺基作用可通过引入第二个替换得到进一步增强，如在S₃亚位点或其它能与肽底物P₃残基相互作用的位置内的带负电荷残基。可以确信，引入第二个带负电荷残基可减少在肽底物上两个碱性氨基酸残基之间对S₁亚位点内带负电荷残基的竞争。

优选地，在S₃亚位点或能与肽底物P₃残基相互作用的位置内如在N241、N242、L245或A246位引入带负电氨基酸残基。适当的替换的实例包括N241D、N241E、N242D、N242E、L245D、L245E、A246D和A246E。N241和L245位看来与底物肽上的P₃和P₁残基相互作用。增强转酰基作用的其它修饰：

尽管羧肽酶Y能在较宽的pH范围(从约pH到pH10)对肽底物进行转酰胺基作用，但是进行转酰胺基反应的pH会影响羧肽酶的底物或产物偏爱性。为提高转酰胺基作用的产率，pH应该使酶偏爱肽底物胜过偏爱产物。转酰胺基反应的最适pH依赖于肽底物、亲核物质和所需产物而有所不同。一般而言，转酰胺基反应最适于在pH约5.5与约8.5之间进行。已经发现，使用在L178和M398位含有替换(L178S+M398L)的修饰羧肽酶对肽底物的转酰胺基作用优选地在pH约6.3到约6.7进行。

并且，获得的氨解比例可通过增加可利用的亲核物质的浓度来提高。定点诱变：

根据本发明的方法，已知的丝氨酸或半胱氨酸羧肽酶的突变可通过点特异诱变来实现。点特异诱变需要知道羧肽酶的DNA序列和编码底物结合位点氨基酸密码子的位置。编码羧肽酶Y的PRC1基因的DNA序列和限制酶图谱及DNA序列的来源在Valls等，细胞，48：887-889(1987)中得到描述。

在活性位点内的氨基酸如那些在S₁、S₁’、S₂和S₃亚位点内的氨基酸可通过改变已知的羧肽酶的DNA序列中编码氨基酸的密码子来修饰。根据本发明，修饰的DNA序列包括编码羧肽酶活性位点内氨基酸的一个或多个密码子。优选地，羧肽酶的修饰涉及与已知的丝氨酸或半胱氨酸羧肽酶活性位点中密码子编码的氨基酸不同的氨基酸的密码子的替换。优选地，替换涉及编码羧肽酶S₁、S₁’、S₂或S₃结合亚位点内的氨基酸的密码子。氨基酸的密码子为本领域技术人员所熟知。

点特异诱变可通过在所述密码子位置掺入含有突变或修改的密码子的寡核苷酸来完成。可以使用如Maniatis等《分子克隆指南》(1989)中所述的其它点特异诱变方法。优选的将寡核苷酸掺入编码已知羧肽酶的DNA序列的方法包括聚合酶链式反应(PCR)和标准的克隆技术。

含有修饰密码子的寡核苷酸可以通过标准方法包括自动合成获得。自动合成DNA的方法为本领域技术人员所熟知。

合成的寡核苷酸一旦形成，就将其掺入已知的羧肽酶DNA序列的框架中。合成寡核苷酸的插入可通过用至少一种限制性内切酶切割使靶位点内的DNA序列缺失，接着通过将合成的寡核苷酸连接入原始DNA序列缺失的位点而实现。合适的限制性内切酶可通过检查靶位点周围的核苷酸序列和要插入到该位点的合成寡核苷酸的大小来决定。限制性酶的识别序列为本领域技术人员所熟知，并且酶的适当组合可容易地由本领域技术人员选出。修饰的羧肽酶的表达；

在优选的形式中，羧肽酶Y S₁亚位点内氨基酸的密码子得到修饰以编码具有带负电侧链的氨基酸如谷氨酸或天冬氨酸。为实现羧肽酶中氨基酸的替换，使用已知的定点诱变方法突变编码羧肽酶的基因以表达所需的替换的氨基酸。

编码羧肽酶Y的PRC1基因可从质粒pTSY3获得，pTSY3可从在Rockville，MD的美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到，保藏号为75580。包含所需的替换的序列，即在对应于天然密码子的位点包含氨基酸替换的密码子的寡核苷酸可通过例如自动DNA合成的方法合成。PCR技术可用于将替换掺入羧肽酶Y的基因中。

然后将修饰的DNA序列掺入载体以进行筛选和表达。适当的载体包括酵母细菌穿梭载体YEp24、pRA21ABAM、pYSP1、pTSY2、pRA21和pYSP32。修饰的DNA序列用已知的如Maniatis等，同上述和Nielsen等，Appl.Microbiol.Biotechnol.33：307(1990)中所述的标准方法掺入载体中。

将载体导入合适的宿主细胞以进行筛选和表达。合适的宿主细胞包括细菌如大肠杆菌和酵母如酿酒酵母。优选的宿主细胞包括具有等基因的vp1突变、δ-prc1突变和ura3突变的酿酒酵母菌株。特别优选的宿主是如上所引用的Nielsen等所述的具有导致活性羧肽酶Y分泌的vp1突变的酿酒酵母菌株。优选的载体是质粒pTSY，它是如上所述的带有含有在PRC1启动子控制下的PRC1基因的3.2kb DNA插入片段的酵母细菌穿梭载体YEp24。

合适的宿主细胞通过一些标准方法进行转化，包括用磷酸钙、氯化择。通过用如上所引用的Nielsen等所述的标准方法检测转化细胞水解肽底物的能力，来筛选转化的酵母细胞产生的突变羧肽酶活性。

一旦转化的细胞得到选择和扩增，修饰的羧肽酶可用标准方法如高效液相层析和亲和层析来纯化。使用修饰的羧肽酶对底物的转酰胺基作用：

本发明也提供使用修饰的羧肽酶以亲核物质对肽底物转酰胺基的方法。本发明的修饰羧肽酶设计为改善含有带正电次末位氨基酸残基的肽底物的转酰胺基作用。

转酰胺基作用一般在水缓冲溶液中进行。优选的缓冲液包含50mMHEPES和5mM EDTA pH7.5或50mM CHES和5mM EDTA pH9.5。重要的是所选缓冲液不能在转酰胺基反应中作用为亲核物质。

转酰胺基作用产物的生产一般通过高效液相层析或其它适当的分析技术来监测。反应通过加入酸性溶液使反应混合物的pH下降到约pH1-3而终止。或者，反应可通过加入酶抑制剂如苯甲基磺酰氟(PMSF)或二异丙基氟磷酸(DFP)而终止。转酰胺基产物可通过反相层析、疏水作用层析、离子交换层析或高效液相层析从反应混合物分离。

或者，转酰胺基反应在有机溶剂中进行。对转酰胺基作用合适的有机溶剂包括二甲基亚砜(DMSO)、N，N’-二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺和其它类似溶剂。有机溶剂中转酰胺基作用的方法学在Bongers等Int.J.Peptide Protein Res.，40：268(1992)中得到描述。

在水溶液中转酰胺基的一个实施例中，肽底物GRF(1-44)-Ala溶于5％醋酸溶液中。亲核物质如亮氨酰胺溶于50mM HEPES，5mMEDTA至500mM终浓度。每950μl亲核物质溶液加入25μl GRF(1-44)-Ala溶液，并且20℃时pH为7.5。每毫升溶液加入溶于25μl水中的修饰羧肽酶如L178S+M398L+N51Q修饰羧肽酶Y至混合物中，得达到约0.002到0.07mg/ml酶浓度。反应通过高效液相层析监测并在没有其它产物形成时通过加入一倍体积的2.5％三氟乙酸来中止。

在另一实施例中，肽底物GLP1(7-36)-Ala溶于5％醋酸溶液中。亲核物质O-硝基苯甘氨酰胺(“ONPGA”)溶于50mM HEPES，50mMEDTA至250mM终浓度。每950μl亲核物质溶液加入25μl的40mM GLP1中。亲核物质O-硝基苯甘氨酰胺(“ONPGA”)溶于50mM HEPES，50mMEDTA至250mM终浓度。每950μl亲核物质溶液加入25μl的40mM GLP1(7-36)-Ala溶液，并且pH在20℃时为7.5。每毫升溶液加入溶于25μl水中的修饰羧肽物如L178S+M398L+N51Q修饰羧肽酶至混合物中，得到约0.002到0.07mg/ml的酶浓度。反应后接着进行高效液相层析并在没有其它产物形成时通过加入一倍体积的2.5％三氟乙酸来中止。

转肽反应的反应产物GLP1(7-36)-ONPGA可通过光解作用切割。将溶于12.5ml甲醇中的GLP1(7-36)-ONPGA加入80mM NaHSO₃(12.5ml)中并且pH用5N NaOH调节到9.5。然后反应混合物用N₂清洗15分钟，随后用SP200灯在氮气环境下光解。然后分别在光解后0、30、60和120分钟提取样品进行分析。用高效液相层析分析每一样品，将结果与对照样品比较。

此处公开的对羧肽酶的任何修饰适用于上述两种转酰胺基反应的任意一个。修饰的羧肽酶包含其中将带负电氨基酸残基引入S₁亚位点中，优选地178位的替换。合适的替换包括L178D或E。优选地，修饰的羧肽酶进一步包含在S₁’亚位点优选地在M398位的替换。合适的替换包括M398L。并且，修饰的羧肽酶可进一步包含引入能与肽底物P₃位如241位或245位带正电氨基酸残基相互作用的具有带负电侧链的氨基酸残基的替换。用于对GRF前体进行转酰胺基的羧肽酶优选地在S₂亚位点含有疏水性替换以增强羧肽酶与P₂丙氨酸残基的相互作用。

实施例：

本发明将通过下列实施例进一步得到说明。这些实施例并不意味着限制前面描述中已充分说明的本发明的范围。本发明观念内的变化对本领域技术人员是明显的。实施例1：方法：

用于这些研究的突变羧肽酶基本上按照公开的PCT专利申请号WO95/20039中所述的步骤通过定点诱变产生。一般而言，使用合成的编码氨基酸替换的寡核苷酸制备突变的酶。

转酰胺基反应基本上按照PCT申请WO95/20039中所述的进行。一般而言，方法包括将亲核物质(H-Leu-NH₂，除非另有说明)溶于50mMHEPES，5mM EDTA并调节pH到7.5。将5μl肽底物(8mM Bz-G-A-R-A-R-A-OH，除非另外说明，在甲醇中)加入190μl亲核物质溶液中，然后加5μl酶，得到0.2mM底物浓度。

反应过程中，从反应混合物取出20μl等分样品并将其加入50μl的1％三氟乙酸中以中止反应。反应物的成分通过高效液相层析使用装有C-18 Waters Novapac 4μ反相柱和0.1％三氟乙酸中不同乙腈梯度的Waters高效液相层析测定。在254nm处测到分离，使得可以从总的峰面积直接对产物定量。反应混合物的成分在反应过程中至少测定两次，第一次是在底物在反应中消耗了20～50％(优选地35％)时，第二次是肽底物消耗了50-90％(优选地80％)时。

酸水解之后收集反应产物并用Pharmacia Alpha Plus分析仪通过氨基酸分析加以鉴定。进一步的鉴定通过真正标准的化合物的混合层析法进行。

氨解比例(fa)表示为形成的氨解产物与所有形成产物的总和之间的比率。未消耗的底物未计算在内。表1羧肽酶Y和S₁突变体在含P₁位丙氨酸的底物的转肽作用中的氨解比例(fa)。

酶 t [N] S P fa(分钟) (mM) (％) (％)
酶 t [N] S P fa(分钟) (mM) (％) (％)	野生型 29400 375 86 0.7 0.05
L178A 112 375 18 37 0.45L178S 40 375 16 37 0.72L178D 130 375 23 62 0.81	野生型 29400 375 86 0.7 0.05
	N241E 78 50 50 13 0.27L245E 110 50 50 3.5 0.07L245E 1100 375 50 10 0.18
W312L 82 375 48 3.6 0.07W312N 24 375 35 15 0.23W312D 37 375 32 6 0.15
	L178S+W312N 55 375 20 50 0.63L178D+W312N 83 375 25 57 0.71L178D+W312D 43 375 31 49 0.71
L245E+W312N 6100 375 50 7 0.20

t＝分析时间反应用2mM底物于pH7.5进行[E]＝0.1mg/mlN＝亲核物质(H-Leu-NH₂)S＝底物(Bz-G-A-R-A-R-A-OH)P＝产物(Bz-G-A-R-A-R-L-NH₂)以及fa＝氨解比例

从得到的较低的氨解比例(fa＝0.05)可以看出，野生羧肽酶Y不能有效地用亮氨酰胺亲核物质催化在P₁含精氨酸残基的肽底物的转肽作用。相反，用丙氨酸、丝氨酸成天冬氨酸替换178位亮氨酸或用天冬酰胺或天冬氨酸替换312位色氨酸使获得的氨解比例大幅上升。用带负电氨基酸残基如谷氨酸替换241位上的精氨酸，在375mM亲核物质浓度时显著增加获得的氨解比例。并且，带负电氨基酸残基如谷氨酸在245位的替换也使氨解比例上升。突变组合包括在L178和W312位或L245和W312位上的替换，也表现出氨解比例的显著升高。实施例2：方法：

点特异突变如实施例1中所述的进行以产生下面所用的S₁’突变体。

转酰胺基反应如实施例1中所述的进行。表2用S₁’突变的羧肽酶Y对FA-Ala-Xaa-OH与H-Gly-NH进行转肽反应的氨解比例(fa)

FA-Ala-Xaa-OH底物的P₁’
FA-Ala-Xaa-OH底物的P₁’	酶 Ala Val Leu Met Phe
野生型 0.90 0.16 0.20 0.18 0.04T60A 0.91 0.44 0.32 0.16 0.12T60V 0.94 0.29 0.15 0.17 0.08T60L 0.91 0.17 0.13 0.08 0.24T60F 0.85 0.15 0.17 0.21 0.12T60W 0.93 0.39 0.45 0.49 0.47T60M 0.78 0.15 0.03 0.01 0.18T60C 0.92 0.27 0.19 0.15 0.08T60Y 0.90 0.43 0.66 0.58 0.51T60D 0.87 0.53 0.25 0.15 0.15T60E 0.82 0.33 0.05 0.07 0.02	酶 Ala Val Leu Met Phe
	M398G 0.93 0.42 0.59 0.83 0.66M398A 0.93 0.65 0.84 0.89 0.84M398V 0.93 0.81 0.91 0.83 0.86M398I 0.93 0.87 0.91 0.83 0.75M398L 0.96 0.81 0.88 0.71 0.27M398F 0.87 0.83 0.85 0.86 0.85M398Y 0.90 0.89 0.90 0.90 0.92M398C 0.93 0.52 0.75 0.65 0.64M398N 0.92 0.52 0.36 0.70 0.11M398E 0.92 0.82 0.84 0.74 0.71M398R 0.48 0.26 0.16 0.33 0.11
T60F+M398F 0.86 0.73 0.86 0.82 0.66T60A+M398L 0.92 0.91 0.94 0.72 0.52T60Y+M398L 0.92 0.89 0.95 0.93 0.87T60D+M398L 0.89 0.90 0.89 0.66 0.62T60A+M398Y 0.80 0.81 0.83 0.83 0.81T60Y+M398Y 0.74 0.74 0.77 0.76 0.75T60D+M398Y 0.70 0.71 0.75 0.72 0.56

反应条件：0.2mM FA-Ala-Xaa-OH底物，1.9M H-Gly-NH₂亲核物质，50mM HEPES，5mM EDTA，pH7.5，室温

从表2中的数据可以看出，在转肽反应中，野生型羧肽酶Y对在P₁’位含丙氨酸作为离去基因的肽底物有非常强和狭窄的偏爱性。在羧肽酶Y S₁’亚位点内T60和M398位的氨基酸替换拓宽了羧肽酶的特异性，使氨解比例在其它氨基酸(如缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸)作为离去基因时上升。从表中可以看出，取决于离去基因，不同替换对氨解比例有不同效应。亮氨酸作为离去基因时，T60位的替换如T60A、T60W或T60Y在氨解比例的提高方面最有效。并且，M398位上的替换在亮氨酸作为离去基团时对氨解比例有显著效应。增强用羧肽酶Y和含亮氨酸作为离去基团的底物的转肽作用的M398位上的替换的实例包括M398A、M398V、M398G、M398I、M398L、M398F、M398Y、M398C、M398N和M398E。同时在T60和M398位替换进一步改善以亮氨酸为离去基团的底物的氨解比例，包括：T60F+M398F、T60A+M398L、T60Y+M398I、T60D+M398L、T60A+M398Y、T60Y+M318Y和T60D+M398Y。实施例3方法：

点特异诱变按实施例1所述的进行以产生下面所述的特异替换突变体。转酰胺基反应按实施例1中所述的进行。

在下面的表3中，K_N(app)代表fa为最大值的一半时亲核物质的浓度(亲核物质解离常数的测量值)。fa_max是在酶与亲核物质饱合时可能获得的最高fa。表3用双替换突变体时FA-Ala-OBzl与H-Leu-NH₂的转肽反应。

酶 K_N(app)(mM) fa
酶 K_N(app)(mM) fa	野生型 0.98^b 0.95^a
T60A 1.1^c 0.92^aT60V 1.2^b 0.97^aT60L 2.3^c 1.0^bT60F 0.75^b 0.98^aT60Y 1.0^b 0.95^aT60W 5.4^b 0.96^aT60C 0.88^a 0.98^aT60M 3.4^c 0.98^bT60D 1.5^c 0.94^bT60E 2.0^b 0.94^a	野生型 0.98^b 0.95^a
	M398G 1.6^a 0.95^aM398A 0.83^a 0.93^aM398V 1.43^b 0.87^aM398I 0.91^b 0.94^aM398L 1.2^b 1.0^aM398F 2.3^b 0.96^aM398Y 5.2^c 0.78^bM398C 0.74^b 0.95^aM398N 1.2^c 0.83^aM398E 0.93^a 0.97^aM398R 9.9^c 0.39^b
T60A+M398L 1.0^b 0.99^aT60Y+M398L 1.7^c 1.0^aT60D+M398L 2.0^b 1.0^aT60A+M398Y 9.1^b 0.97^aT60Y+M398Y 5.4^b 0.99^aT60D+M398Y 9.2^c 0.89^a

称为a的数值标准差是±0-3％，而标为b的表示±3-10％的偏差，标为c的表示±10％-30％。底物＝FA-Ala-OBzl(0.2mM)，亲核物质＝H-Leu-NH₂，pH＝7.5。

K_N(app)表示达到fa_max/2时亲核物质的浓度并因此描述了亲核物质的表观结合常数。因为认为竞争性水解反应是在离去基团仍然与酰基-酶中间体结合时发生的，所以低K_N(app)是优选的。

在图3中，下列突变体在K_N(app)降低时表现fa_max上升：T60F、T60C和M2398。其它突变体如T60V、T60L、T60F、T60W、T60C、T60M、M298L和M398F表现fa_max和K_N(app)的同时上升。实施例4：方法：

点特异诱变按实施例1中所述的进行以产生下述的特异突变体。转酰胺基反应按实施例1中所述的进行。表4：Bz-G-A-R-A-R-X-OH在pH7.5底物消耗50％时的转肽反应

酶离去基团 t(分钟) fa P_max
酶离去基团 t(分钟) fa P_max	野生型 A ca.110000 ＜0.05 0V nd ＜0.05 0I nd ＜0 05 0M nd ＜0.05 0L nd ＜0.05 0
L178S S 790 0.65 0.38A 14 0.73 0.63V 40 0 0I 26 0 0M 28 0 0L 2.1 0.01 0.01
	N51Q-L178S A 34 0.72 0.60V 194 0.62 ndI 211 0.62 ndM 211 0.51 ndL 23 0.20 0.18
L178S-M398L A 41 0.77 ＞0.48V 30 0.45 ndI 33 0.54 ndM 17 0.17 ndL 1 0.39 ＞0.39
	N51Q-L178S+M398L A 24 0.87 ＞0.67V 168 0.82 ndI 129 0.82 ndM 84 0.75 ndL 52 0.76 ＞0.73
T60Y-L178S+M389L S 3400 0.18 0.09A 1200 0.68 0.43V 1100 0.60 0.38I 460 0.72 0.53M 730 0.50 0.39L 360 0.72 0.53
	N51Q+M398L A 3200 0.18 ＞0.07V nd nd ndI nd nd ndM nd nd ndL 3500 0.10 ＞0.04

反应条件：2mM Bz-G-A-R-A-R-X-OH底物；375mM H-Leu-NH₂亲核物质；[E]＝0.1mg/mL，pH＝7.5；P_max＝峰产品产量(peak product yield)

表4中的数据证明底物的转肽作用比率受离去基团性质的影响。S₁’亚位点内N51和M398位的替换增强对特定离去基团的转肽作用。例如，用下列突变体增加亮氨酸作为离去基团时的氨解比例：T60Y+L178S+M2398L和N51Q+L178S+M398L。并且，峰产品产量通过野生型突变体在L178、M398、N51或T60Y位的替换从0开始得到增强。L178S含有S₁内的突变。当与S₁’内的替换如M398L或T60Y和M398L或N51Q和M398L结合时，以亮氨酸为离去基团的氨解比例显著上升，分别从0.01上升到0.39、0.71和0.76。并且，峰产品产量也有相应上升，分别从0.01上升到0.39、0.53和0.73。实施例5：方法：

点特异诱变按实施例1中所述的进行以产生下列特异突变体。转酰胺基反应按实施例1中所述的进行。表5：Bz-G-A-R-A-R-X-OH于pH6.5在底物消耗50％时的转肽反应

酶离去基团 t(分钟) fa P_max
酶离去基团 t(分钟) fa P_max	L178S S 108 0.34 0.63A 34 0.79 0.74L 17 0.03 0.03
N51Q+L178S A 31 0.87 0.78L 19 0.28 0.26	L178S S 108 0.34 0.63A 34 0.79 0.74L 17 0.03 0.03
N51Q+L178S A 31 0.87 0.78L 19 0.28 0.26	L178S+M398L A 53 0.92 0.48L 19 0.54 0.54
N51Q+L178S+M398L A 194 0.91 0.70L 36 0.84 0.80	L178S+M398L A 53 0.92 0.48L 19 0.54 0.54
N51Q+L178S+M398L A 194 0.91 0.70L 36 0.84 0.80	T60Y+L178S+M398L A 540 0.70 0.49L 270 0.60 0.51
N52Q+T60Y+L178S+ A 1900 0.77 0.72M398LL 780 0.65 0.57	T60Y+L178S+M398L A 540 0.70 0.49L 270 0.60 0.51

反应条件：2mM Bz-G-A-R-A-X-OH底物；750mM H-Leu-NH₂亲核物质；[E]＝0.1mg/ml，pH 6.5；P_max＝峰产品产量。

表5中的数据表明在S₁和S₁’亚位点内含有替换的羧肽酶突变体在pH 6.5时得到的氨解比例得到增加(与表4中的pH 7.5相比)。例如，以亮氨酸作为离去基团，突变体N51Q+L178S的fa从0.20上升到0.28，P_max从0.18上升到0.26。实施例6：方法：

点特异诱变按实施例1中所述的进行以产生下述特异突变体。转酰胺基反应按前面实施例所述的进行。表6：Bz-G-A-R-A-R-A-OH和FA-Arg-Ala-OH的转酰胺基作用

底物 [S]＝2mM
底物 [S]＝2mM		酶 Bz-G-A-R-A-R-A-OH	FA-Arg-Ala-OH
fa t_1/2 P_maxL178S 0.77 66 0.61L178S+M398L 0.91 85 ndN241D 0.15 168 0.09N241D+W312N 0.17 97 0.13N241D+W312A 0.28 76 0.20N241D+W312L 0.05 28 0.05N241D+W312F 0.24 40 0.17N241E 0.47 200 0.25N241E^* 0.43 94 0.25L245E 0.20 610 0.09W312D 0.16 170 0.08	fa t_1/2 P_max0.89 32 0.76.99 26 0.900.85 2100 0.560.74 82 0.580.80 21 0.720.50 11 0.370.70 73 0.580.92 62 nd0.70 900 0.490.83 88 0.730.77 68 0.67	酶 Bz-G-A-R-A-R-A-OH	FA-Arg-Ala-OH

^*[s]＝0.2mM亲核物质＝H-Leu-NH₂[N]＝375mMpH＝7.5[E]＝0.1mg/mL

对于含有带正电荷P₁氨基酸残基如精氨酸的肽底物的转肽反应，S₁(L178S)和S₁’(M398L)亚位点中氨基酸残基的同时替换使在P₁含有带正电荷氨基酸残基的肽底物的所得氨解比例和峰产品产量显著上升。并且，在S₁亚位点如N241、L245或W312中带负电荷氨基酸残基如天冬氨酸或谷氨酸的替换也导致fa和P_max的上升。

本说明书中所有公开文献和专利申请表明了与本发明相关的本领域普通技术人员的水平。所有公开文献和专利申请在此相同程度地引用作为参考，就如每个单独的公开文献或专利申请具体并独立地作为参考。

本发明已参考各个具体并优选的实施方案和技术得到描述。然而，应当理解在保持本发明的精神和范围之下可进行多种变化和修饰。

序列表(1)基本信息(i)申请人：CARLSBERG实验室(ii)本发明题目：修饰的羧肽酶(iii)序列数：3(iv)联系地址：

(A)收信人：Merchant，Gould，Smith，Edell，Welter &

Schmidt

(B)街道：3100 Norwest Center，90 South 7th Street

(C)城市：Minneapolis

(D)州：MN

(E)国家：美国

(F)ZIP：55402(v)计算读取形式

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM兼容机

(C)操作系统：DOS

(D)软件：FastSEQ for Windows 2.0版(vi)日前申请资料：

(A)申请号：未指定

(B)申请日：1998年2月27日

(C)分类：(vii)优先申请资料：

(A)申请号：o8/807,263

(B)申请日：1997年2月28日(viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：Kettelberger，Denise M

(B)登记号：33,924

(C)参考/著录号：8648.71WO 01(ix)电信信息：

(A)电话：612-332-5300

(B)传真：612-332-9081

(C)电报：(2)有关SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：44个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：1Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln1 5 10 15Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly

20 25 30Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Xaa

35 40(2)有关SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：37个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val1 5 10 15Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu

20 25 30Val Lys Gly Arg Xaa

35(2)有关SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：31个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa

20 25 30

Claims

1.一种用于对含有具有带正电侧链的P₁氨基酸残基的肽底物进行转酰胺基作用的方法，此方法包括：

在修饰的羧肽酶Y的参与下使肽底物与亲核物质反应，其中修饰的羧肽酶包含至少一个在S₁亚位点中使用具有带负电侧链的氨基酸的替换。

2.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶包含至少一个在氨基酸残基L178、W312、N241或L245处的替换。

3.权利要求2的方法，其中L178、W312、N241或L245中的至少一个由天冬氨酸或谷氨酸替换。

4.权利要求1的方法，其中亲核物质包括氨基酸酯或氨基酸酰胺。

5.权利要求4的方法，其中亲核物质包括Leu-OH、Leu-OR或Leu-NRR’。

6.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶包含至少一个在S₁’、S₂或S₃亚位点中的替换的氨基酸。

7.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶进一步包含至少一个选自N51Q、T60W、T60Y、T60A、M398L、M398G、M398A、M398V、M398I、M398F、M398Y、M398C、M398N和M398E的S₁’亚位点中的替换。

8.权利要求7的方法，其中修饰的羧肽酶进一步包含在S₁’亚位点中的两个或多个氨基酸替换。

9.权利要求8的方法，其中S₁’亚位点中的两个或多个替换包括至少一个T60位的替换和至少一个M398位的替换。

10.权利要求9的方法，其中T60位的替换是T60F、T60L、T60Y或T60D。

11.权利要求9的方法，其中M398位的替换是M398F、M398L或M398Y。

12.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶进一步包含在S₂亚位点中的至少一个氨基酸替换。

13.权利要求12的方法，其中S₂亚位点中的替换是在E296、S297或N303位的至少其中之一中。

14.权利要求12的方法，其中S₂亚位点中的替换是E296F、S297A、N303A或N303F。

15.权利要求12的方法，其中肽底物在P₂包含丙氨酸残基。

16.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶Y进一步包含至少一个能与具有带正电侧链的肽底物P₃残基相互作用的氨基酸残基的第二个替换。

17.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶包含至少一个能与肽底物P₃残基相互作用的氨基酸残基的第二个替换，其中第二个替换引入具有带负电侧链的氨基酸。

18.权利要求16的方法，其中第二个替换是在N241、N242、L245或A246位的至少其中之一中。

19.权利要求1的方法，其中反应是在约pH6.3到约pH6.7进行。

20.修饰的羧肽酶Y，包含在N241或N245位的至少其中之一中的替换的氨基酸，其中替换的氨基酸有带负电的侧链。

21.权利要求20的修饰的羧肽酶，进一步包含至少一个在S₁’、S₂或S₃亚位点中的替换的氨基酸残基。

22.权利要求20的修饰的羧肽酶，进一步包含在L178或W312位的至少其中之一中的替换的氨基酸残基。

23.权利要求20的修饰的羧肽酶，进一步包含替换L178S和M398L。