JP2001513638A - 修飾されたカルボキシペプチダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 正に荷電した側鎖を有するＰ₁アミノ酸残基を持つペプチド基質をアミド転移するための方法が提供される。本発明によれば、Ｓ₁サブサイト中に、負に荷電した側鎖を有する少なくとも１つのアミノ酸を置換するように、カルボキシペプチダーゼＹを修飾する。さらに、この修飾されたカルボキシペプチダーゼＹは、特定のペプチド基質に適合させるために、Ｓ₁'、Ｓ₂および／またはＳ₃サブサイト中に置換されたアミノ酸残基を含むことができる。

Description

【発明の詳細な説明】 修飾されたカルボキシペプチダーゼ 発明の背景 ペプチド、特に医薬用途のためのペプチドの好ましい製造方法は、遺伝子工学 による。しかし、組換え法によるペプチドの製造には特別の制限がある。例えば 、遺伝暗号には、非天然のＬ-アミノ酸、Ｄ-アミノ酸、放射活性アミノ酸および 他の検出可能なラベルが含まれないので、このような修飾を有する組換えペプチ ドの製造は困難である。 さらに、インビボで常法により行われるＣ-末端アミド基置換などの天然アミ ノ酸修飾を、インビトロで行うのは困難である。これらの翻訳後修飾は、最も強 力または最も長期に作用する形態のペプチドを与えることが多いので、これらが 医薬用途に最も必要とされ、かつ望ましい形態である。多くのペプチドに対して 、Ｃ-末端アミド化は生物学的活性にとって重要である。しかし、活性ペプチド の大量生産のための組換え発現系は、この必要なＣ-末端修飾を容易に行うこと ができない。 カルボキシペプチダーゼ酵素は、ペプチド転移反応を触媒し、Ｃ-末端アミド 化されたペプチドを与えることが知られている。しかし、野生型カルボキシペプ チダーゼ酵素は、多くのペプチドのＣ-末端アミド化に有用ではない。例えば、 野生型カルボキシペプチダーゼの固有の基質特異性は、この酵素を用いて修飾し うるペプチドの種類を制限する。 特に、カルボキシペプチダーゼＹは、末端から２番目の非極性残基を有するペ プチドに対して強い優先性を示す。正に荷電した側鎖を有する末端から２番目の アミノ酸を持つ基質は、カルボキシペプチダーゼＹによって効率的にアシル転移 (トランスアシル化)されない。例えば、基質ＦＡ-Arg-Ala-ＯＨは、基質ＦＡ-Le u-Ala-ＯＨよりも約５００倍遅く加水分解される。残念なことに、多くの薬学的 に重要なペプチド[成長ホルモン放出因子(ＧＲＦ)またはグルカゴン様ペ プチド(ＧＬＰ１)を含む]のアミノ酸配列は、正に荷電した側鎖を有する末端か ら２番目または末端のアミノ酸を持ち、カルボキシペプチダーゼＹによるアミド 転移を商業的に実施不可能にしている。 いくつかの突然変異体カルボキシペプチダーゼが増強された加水分解活性を種 々のペプチド基質に有することが知られているが、多くの突然変異体カルボキシ ペプチダーゼ酵素の研究は、増強された加水分解活性を有する突然変異体と増強 されたアミド転移活性を有する突然変異体の間に特別の関係が存在しないことを 示す。例えば、ペニシリウム・ジャンチネラム(Penicillium janthinellum)由来 のカルボキシペプチダーゼＳ１は、塩基性Ｐ₁残基を有するペプチド基質を効率 的に加水分解することができるが、この酵素はこれら基質を効率的にペプチド転 移しない[Breddam，Carlsberg Res．Commun.，53(5):309-320(1988)]。 正に荷電した側鎖を有する末端から２番目のアミノ酸(Ｐ₁)が配列に含まれて いるペプチド基質のアシル転移のための、改善された活性を有する修飾されたカ ルボキシペプチダーゼを提供することは、極めて有用であろう。 発明の要約 修飾されたカルボキシペプチダーゼおよびアミド転移法が本発明において提供 される。この修飾されたカルボキシペプチダーゼおよび方法は、正に荷電した側 鎖を有する末端から２番目のアミノ酸(Ｐ₁)が配列に含まれているペプチド基質 のアシル転移のためのカルボキシペプチダーゼＹの活性を効率的に改善する。 本発明の修飾されたカルボキシペプチダーゼは、そのＳ₁サブサイトに少なく とも１つのアミノ酸置換を含み、これにより、天然カルボキシペプチダーゼと比 較してＳ₁サブサイトにより陰性の電荷が得られる。通常、これは、中性または 正に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸 残基で置換することによって達成される。負の電荷を導入するためのＳ₁サブサ イト中の好ましい位置の例には、位置Ｌ１７８、Ｗ３１２、Ｎ２４１およびＬ２ ４５が含まれる。負に荷電したアミノ酸側鎖を有するアミノ酸の例には、アスパ ラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。また、修飾されたカルボキシペプチダ ーゼＹは、他の突然変異、例えば、１またはそれ以上のカルボキシペプチダーゼ Ｓ₁'、Ｓ₂およびＳ₃サブサイト中のアミノ酸残基における置換が含まれる。これ ら追加の修飾は、特定の基質のアミド転移をさらに増強することができ、アミド 転移反応のための求核試薬および基質の順応を助けることができる。 本発明の方法は、修飾されたカルボキシペプチダーゼＹの存在下に、ペプチド 基質を求核試薬と反応させることを包含する。適当な求核試薬の例には、アルキ ルアミン、ベンジルアミンおよびアミノ酸のα-アミノ基が含まれる。アミノ酸 求核試薬は、酸、エステルまたはアミドの形態でα-カルボキシレート基を有す ることができる。ペプチド基質を、修飾されたカルボキシペプチダーゼＹおよび 求核試薬とｐＨ約６.３〜６.７でインキュベートするのが好ましい。 本発明の別の態様には、負に荷電された側鎖を有するアミノ酸で置換された少 なくとも１つのアミノ酸残基Ｎ２４１またはＬ２４５を持つ、修飾されたカルボ キシペプチダーゼＹが含まれる。また、この修飾されたカルボキシペプチダーゼ Ｙは、好ましくはＳ₁サブサイト中に追加の置換を含み、最も好ましくは位置Ｌ １７８および／またはＷ３１２に追加の置換を含む。この修飾されたカルボキシ ペプチダーゼＹは、１またはそれ以上のカルボキシペプチダーゼサブサイトＳ₁' 、Ｓ₂およびＳ₃中のアミノ酸残基においてアミノ酸置換をさらに含むことができ る。 本発明の修飾されたカルボキシペプチダーゼは、組換えペプチド、特に正に荷 電した側鎖を有する末端から２番目のアミノ酸残基を持つペプチドの翻訳後修飾 に特に有用である。しかし、組換え法以外の手段によって製造されたペプチドを 本発明の方法に従ってアミド転移させうることは理解されるであろう。 発明の詳細な説明 本発明の修飾されたカルボキシペプチダーゼは、正に荷電した末端から２番目 のアミノ酸残基を有するペプチド基質のアミド転移を改善または増強するように 設計する。この修飾されたカルボキシペプチダーゼは、既知のセリンまたはシス テインカルボキシペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼＹから誘導する のが好ましい。本発明の理解を容易にするために、本発明に関連して用いる方法 の簡単な説明を最初に挙げる。方法 本明細書の開示は、カルボキシペプチダーゼ酵素の活性部位中およびペプチド 基質上の種々のアミノ酸残基の位置を説明するために、Schechterら[Biochem.Bi ophys.Res.Commun．27:157-162(1967)]の用語を用いる。 Schechterらの用語によれば、ペプチド基質のアミノ酸残基を文字「Ｐ」で表 す。切断されるペプチド結合(「切断部位」)のＮ-末端側にある基質のアミノ酸 は、Ｐ_n、...、Ｐ₃、Ｐ₂、Ｐ₁と表す(Ｐ_nは切断部位から最も遠いアミノ酸残基 である)。切断部位のＣ-末端側にあるペプチド基質のアミノ酸残基は、Ｐ₁'、Ｐ₂ '、Ｐ₃'、...、Ｐ_n'と表す(Ｐ_n'は切断部位から最も遠いアミノ酸残基である) 。従って、切断される結合(「切断部位」)はＰ₁-Ｐ₁'結合である。カルボキシペ プチダーゼは、Ｃ-末端残基と末端から２番目の残基の間のペプチド結合を切断 するのみであるので、カルボキシペプチダーゼ酵素のための基質は、Ｃ-末端側 のＰ₁'位に残基を含むのみである(即ち、Ｐ₂'、Ｐ₃'などの残基は存在しない)。 カルボキシペプチダーゼの基質のアミノ酸に対する一般式は次の通りである： Ｐ_n-----Ｐ₃---Ｐ₂---Ｐ₁---Ｐ₁' カルボキシペプチダーゼ酵素の「活性部位」は、複数の基質結合サブサイトに 分けることができる。カルボキシペプチダーゼの基質結合部位の命名は、ペプチ ド基質のアミノ酸残基の命名に類似している。しかし、カルボキシペプチダーゼ の結合サブサイトは、文字「Ｓ」で表され、１を超えるアミノ酸残基を含むこと ができる。切断部位のＮ-末端側にあるアミノ酸の基質結合部位は、Ｓ_n、...、 Ｓ₃、Ｓ₂、Ｓ₁と表す。切断部位のカルボキシ側にあるアミノ酸の基質結合サブ サイトは、Ｓ₁'と表す。従って、カルボキシペプチダーゼにおいて、このＳ₁'サ ブサイトは、入来する求核試薬およびペプチド基質の「脱離基」と相互作用する 。カルボキシペプチダーゼの基質結合部位を示すための一般式は次の通りである ： Ｓ_n-----Ｓ₃---Ｓ₂---Ｓ₁---Ｓ₁' このＳ₁結合部位は、ペプチド基質の末端から２番目のアミノ酸Ｐ₁の側鎖に結 合する。Ｓ₂結合部位は、隣接するアミノ酸残基Ｐ₂の側鎖と相互作用する。同様 に、Ｓ₃結合部位はＰ₃残基の側鎖と相互作用する。 本発明において使用する「求核試薬」とは、電子対を電子受容体(この場合、 ペプチド基質の末端から２番目のアミノ酸残基の、α-カルボキシレート基のア シル炭素)に供与して共有結合を形成する分子である。適当な求核試薬には、ア ミノ酸；アミノ酸誘導体、例えばアミノ酸エステルおよびアミノ酸アミド；アミ ド、例えばアンモニア；またはベンジルアミンが含まれる。本発明の方法におい て使用するのに適する化合物の１つの特定の群には、切断可能(アミド転移反応 に続く工程において)な求核試薬であって、求核試薬に由来する残基を欠き、か つＣ-末端カルボキシアミドを有するペプチドを生成する求核試薬が含まれる。 その例には、光分解、加溶媒分解、還元、転位、加水分解または酸化によって切 断しうる求核試薬、例えば米国特許No．5,580,751(この文献は、本明細書の一部 を構成する)）に記載されている求核試薬が含まれる。基質ペプチドの末端から ２番目の残基は、Ｃ-末端残基がアミド転移生成物から切断された後に、末端残 基になることに注意すべきである。 本発明は、改善されたアミド転移が可能なカルボキシペプチダーゼを与えるよ うにある種のアミノ酸残基が異なるアミノ酸で置換された、既知のセリンまたは システインカルボキシペプチダーゼに由来する「修飾されたカルボキシペプチダ ーゼ」を包含する。「改善されたアミド転移」は、得られるアミノリシスの割合 (fa)を測定することによってモニターすることができる。 低いアミノリシスの割合は、加水分解によるアミド転移生成物の分解によると も考えられるので、修飾されたカルボキシペプチダーゼは、対応する天然のカル ボキシペプチダーゼと比較したときに、少なくとも約０.１大きいアミノリシス の割合(fa)を有する。 酵素効率の別の有用な測定値は、Ｋ_N(app)、即ち、fa_max／２に到達する濃度 である。Ｋ_N(app)は求核試薬の見掛けの結合定数を示す。加水分解を完結する反 応が主に起こり、一方、脱離基は酵素になお結合しているので、低いＫ_N(app)が 好ましい。アミド転移 本発明の修飾されたカルボキシペプチダーゼは、対応する天然のカルボキシペ プチダーゼと比較したときに、Ｐ₁サブサイトに正に荷電したアミノ酸残基を有 するペプチド基質のアミド転移を改善することができる。本明細書において使用 する「アシル転移」とは、脱離基が求核試薬に代えて交換される反応である。ア シル転移反応には、アミド転移およびペプチド転移反応が含まれる。本明細書に おいて使用する「ペプチド転移」は、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が脱離基と して作用し、求核試薬がアミノ酸またはアミノ酸誘導体(例えば、アミノ酸エス テルまたはアミノ酸アミド)であるときに起こる。「アミド転移」には、求核試 薬とペプチド基質の間にアミド結合が形成されているペプチド転移が含まれる。 しかし、アミド転移反応においては、求核試薬は必ずしもアミノ酸でなくてもよ い。 一般的なアシル転移反応を以下に示す： 本発明に従い、ペプチド基質を、修飾されたカルボキシペプチダーゼの存在下 に求核試薬と反応させて、求核試薬がアミド結合によってペプチド基質のＰ₁残 基のα-カルボキシル基に結合した生成物を得る。セリンカルボキシペプチダー ゼによるペプチドのＣ-末端アミド化は２工程反応である。第１工程において、 酵素がＣ-末端ペプチド結合を攻撃し、Ｐ₁'「脱離基」を移動させ、ペプチド基 質のＰ₁残基と酵素の間にアシル結合を生成させる。この中間体は「アシル−酵 素中間体」と呼ばれる。適当な条件下で適当な求核試薬の存在下に、酵素は、切 断されたペプチド基質に求核試薬を付加させ、アミド化されたペプチド転移生成 物を与える。求核試薬は、アシル−酵素中間体のカルボキシル基を攻撃し、アシ ル−酵素中間体から酵素を移動させるものと考えられる。このようにして、求核 試薬はペプチド基質のカルボキシル基に結合することになる。また、このアシル −酵素中間体を水によって脱アシル化して加水分解生成物を得ることもできる。 本発明の修飾されたカルボキシペプチダーゼは、加水分解生成物よりもアミド化 ペプチド転移生成物を優先的に生成するように設計される。 以下に示す反応式Ｉは、カルボキシペプチダーゼ触媒されたアミド転移反応を 図式的に示すものである[反応式中、Ｅは遊離酵素であり；Ｓは基質であり；Ｅ Ｓは酵素基質複合体であり；ＥＡＰは脱離基が結合したアシル−酵素中間体(こ こで、Ａはアシル成分であり、Ｐは脱離基である)であり；ＥＡはアシル酵素で あり；Ｎは求核試薬であり；ＡＮは所望のアミノリシス生成物である]。 反応式Ｉ 反応式Ｉに示すように、加水分解は、アミド転移中に２段階で起こることがで きる。アシル−酵素中間体を加水分解して、所望のアミノリシス生成物を生成さ せることなく、酵素からアシル成分および脱離基を放出させることができる。現 在のところ、アミド転移反応中のこの時点で加水分解が主に起こっているものと 考えられる。また、アシル−酵素は、脱離基がアシル−酵素中間体から引抜かれ た後に加水分解されることができる。 修飾されたカルボキシペプチダーゼ 本発明の修飾されたカルボキシペプチダーゼは、天然のセリンまたはシステイ ンカルボキシペプチダーゼと比較して、ペプチド基質のアミド転移を改善または 増強するように設計される。天然カルボキシペプチダーゼに対する修飾の基本は 、ペプチド基質と酵素の活性部位の間の「最良の適合」を提供することである。 修飾を行うときに考慮される因子には、立体障害の減少およびアシル−酵素中間 体への水の接近の減少が含まれる。 特に、修飾されたカルボキシペプチダーゼは、Ｓ₁サブサイトのアミノ酸残基 を負に荷電した側鎖を有するアミノ酸で置換することによって、正に荷電した末 端から２番目のアミノ酸残基を有するペプチド基質のアミド転移を改善または増 強するように設計される。Ｐ₁の正に荷電した残基に加えて、Ｐ₃位に正に荷電し たアミノ酸を有するペプチド基質のアミド転移を増強するために、Ｓ₃サブサイ トまたは他のサブサイト位置(ペプチド基質のＰ₃残基と相互作用することができ る)中の残基を、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基で置換する。Ｐ₂位にア ラニン残基を有するペプチド基質のためには、カルボキシペプチダーゼのＳ₂サ ブサイト中の残基を、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基で置換することができる 。特に、修飾されたカルボキシペプチダーゼを用いて、成長ホルモン放出因子( ＧＲＦ)前駆体またはグルカゴン様ペプチド(ＧＬＰ)前駆体のアミド転移を改善 することができる。ＧＲＦ(１−４４)、ＧＬＰ１(１−３６)−XaaおよびＧＬＰ( ７−３６)−Xaaの配列を以下に示す(配列中、Xaaは脱離基として働くＣ-末端ア ミノ酸残基である)。このXaa残基は荷電していないアミノ酸側鎖を有するのが普 通であり、アラニン残基であるのが好ましい。 ＧＲＦ(１−４３)−Xaa[配列番号１]： ＧＬＰ１(１−３６)−Xaa[配列番号２]： ＧＬＰ１(７−３６)−Xaa[配列番号３]： 本発明の修飾されたカルボキシペプチダーゼを製造するために、部位特異的な 突然変異誘発を行って、天然カルボキシペプチダーゼの活性部位内でアミノ酸残 基を置換することができる。具体的には、部位特異的な突然変異誘発を行って、 Ｓ₁サブサイト中のアミノ酸残基を、負に荷電したアミノ酸残基で置換すること ができる。修飾されたカルボキシペプチダーゼのアミド転移活性をさらに増強す るために、Ｓ₂、Ｓ₃またはＳ₁'サブサイト内のアミノ酸残基に追加の置換を行う 。さらに、アミド転移反応を、好ましくはｐＨ約６.３〜６.７で行って、この反 応の効率をさらに増強する。 Ｓ₁サブサイト中の置換 カルボキシペプチダーゼ酵素のＳ₁サブサイトは、ペプチド基質の末端から２ 番目のＣ-末端側の残基と相互作用する。多くの場合、このＳ₁サブサイトは、カ ルボキシペプチダーゼの基質特異性の決定に重要な役割を果たす。これは、特に カルボキシペプチダーゼＹの場合に当てはまる。 本発明の第１の態様は、正に荷電した末端から２番目のアミノ酸残基を有する ペプチド基質をアミド転移させるための方法に関する。本発明によれば、負に荷 電した側鎖を有するアミノ酸を、カルボキシペプチダーゼのＳ₁サブサイトに導 入して、正に荷電したＰ₁残基を有するペプチド基質に対して増強されたアミド 転移活性を有するカルボキシペプチダーゼを得る。 本発明に関連して用いる「負に荷電した側鎖を有するアミノ酸」なる用語には 、Ｌ-アミノ酸およびアミノ酸誘導体、例えばアミノ酸エステルまたはアミノ酸 アミドが含まれる。負に荷電した側鎖を有する適当なアミノ酸の例には、アスパ ラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。 １つの態様において、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸は、カルボキシペプ チダーゼＹのＳ₁サブサイト内の少なくとも１つの位置、Ｎ２４１、Ｌ２４５、 Ｌ１７８またはＷ３１２に導入される。好ましい置換の例には、Ｎ２４１Ｄ、Ｎ ２４１Ｅ、Ｌ２４５Ｄ、Ｌ２４５Ｅ、Ｌ１７８Ｄ、Ｌ１７８Ｅ、Ｗ３１２Ｄおよ びＷ３１２Ｅが含まれる。 アミド転移を増強するためのＳ₁サブサイト内の別の置換には、Ｌ１７８Ａ、 Ｌ１７８ＳおよびＷ３１２Ｌが含まれる。１７８位のロイシンに代えてアラニン またはセリンを置換するか、または３１２位のトリプトファンに代えてロイシン を置換すると、本来のアミノ酸残基を、より小さい嵩の残基またはより極性の残 基で置換することになる。より小さい嵩の残基の導入は、立体障害の減少によっ てアミド転移を増強するものと考えられる。これによりＳ₁結合部位の大きさが 大きくなり、比較的長い側鎖を有するＰ₁アミノ酸残基(例えば、アルギニンまた はリシン)を持つペプチドのアミド転移を改善する。また、極性残基(例えば、セ リン)は、荷電したＰ₁残基のためのより好ましい環境を与えることができる。 Ｓ₁'サブサイト中の置換 本発明の修飾されたカルボキシペプチダーゼによる特異的ペプチド基質のアミ ド転移を、天然カルボキシペプチダーゼのＳ₁'サブサイト中のアミノ酸残基の置 換によってさらに増強することができる。アミド転移反応において、このＳ₁'サ ブサイトは、入来する求核試薬およびペプチド基質の脱離基と相互作用する。脱 離基が酵素になお結合したまま加水分解反応の完結が主に起こると考えられるの で、脱離基がなお結合したままで、水の接近を減少させ、そして／またはアシル −酵素中間体からの脱離基の解離速度を増加させるＳ₁'サブサイト中の置換は、 加水分解反応の完結の低下によって得られるアミノリシスの割合を増加させるで あろう。 有効な置換を行うことができるＳ₁'サブサイト内の位置には、Ｔ６０、Ｆ６４ 、Ｌ２６７、Ｌ２７２、Ｓ２９７およびＭ３９８が含まれる。これらの残基は、 カルボキシペプチダーゼＹのＳ₁'側鎖結合ポケットを規定する。置換のための他 の適当な残基には、Ｙ４９、Ｎ５１、Ｅ６５およびＥ１４５が含まれる。これら の残基は、Ｓ₁'サブサイト内の水素結合ネットワークを構成する。以下に挙げる 突然変異カルボキシペプチダーゼは、野生型カルボキシペプチダーゼと比較した ときに、比較的大きい疎水性脱離基(例えば、ロイシン残基)に対して得られるア ミノリシスの割合の改善を示した：Ｔ６０Ａ、Ｔ６０Ｗ、Ｔ６０Ｙ、Ｔ６０Ｄ、 Ｍ３９８Ｇ、Ｍ３９８Ａ、Ｍ３９８Ｖ、Ｍ３９８１、Ｍ３９８Ｌ、Ｍ３９８Ｆ、 Ｍ３９８Ｙ、Ｍ３９８Ｃ、Ｍ３９８ＮおよびＭ３９８Ｅ。最も劇的な改善は、以 下に挙げる突然変異体で観察された：Ｔ６０Ｙ、Ｍ３９８Ｖ、Ｍ３９８１、Ｍ３ ９８Ｌ、Ｍ３９８Ｆ、Ｍ３９８Ｙ、Ｍ３９８ＣおよびＭ３９８Ｅ。複数の置換、 例 えばＴ６０、Ｍ３９８および／またはＮ５１における置換は、突然変異酵素を用 いて得られるアミノリシスの割合をさらに増強した。 Ｓ₂サブサイト中の置換 修飾されたカルボキシペプチダーゼの活性を、Ｓ₂サブサイト中に置換を有す るカルボキシペプチダーゼを用いて、Ｐ₂アラニン残基を有するペプチド基質に 対してさらに増強することができる。カルボキシペプチダーゼのＳ₂サブサイト はＰ₂の基質残基と相互作用するので、Ｓ₂サブサイト中への疎水性残基(例えば 、フェニルアラニンまたはアラニン)の導入は、ペプチド基質を補足し、カルボ キシペプチダーゼによる基質のアミド転移を増強することができる。特に、Ｐ₂ アラニンを有する基質のアミド転移を、以下の置換を含む突然変異カルボキシペ プチダーゼによって高めることができる：Ｅ２９６Ｆ、Ｓ２９７Ａ、Ｎ３０３Ａ およびＮ３０３Ｆ。 Ｓ₃サブサイト中の置換 Ｓ₁サブサイト中への負に荷電した残基の導入に加えて、第２の置換(例えば、 Ｓ₃サブサイトまたはペプチド基質のＰ₃残基と相互作用しうる他の位置における 負に荷電した残基)を導入することによって、Ｐ₁およびＰ₃の両方に正に荷電し た残基を有するペプチド基質のアミド転移をさらに増強することができる。第２ の負に荷電した残基の導入は、Ｓ₁サブサイト中の負に荷電した残基に対するペ プチド基質上の２つの塩基性アミノ酸残基の間の競合を減少させることができる と考えられる。 好ましくは、負に荷電したアミノ酸残基を、Ｓ₃サブサイト中またはペプチド 基質のＰ₃残基と相互作用しうる位置中、例えばＮ２４１、Ｎ２４２、Ｌ２４５ およびＡ２４６位に導入する。適当な置換の例には、Ｎ２４１Ｄ、Ｎ２４１Ｅ、 Ｎ２４２Ｄ、Ｎ２４２Ｅ、Ｌ２４５Ｄ、Ｌ２４５Ｅ、Ａ２４６ＤおよびＡ２４６ Ｅが含まれる。Ｎ２４１およびＬ２４５位は、基質ペプチド上のＰ₃およびＰ₁の 両残基と相互作用するようである。 アシル転移を増強するための他の修飾 カルボキシペプチダーゼＹは、広いｐＨ範囲(約ｐＨ４〜約ｐＨ１０)にわたっ てペプチド基質をアミド転移させることができるが、アミド転移反応を行うｐＨ は、カルボキシペプチダーゼ酵素の基質または生成物優先性に影響を与えること がある。アミド転移の収率を改善するためには、酵素が生成物よりもペプチド基 質に好都合であるようなｐＨであるべきである。アミド転移反応の最適ｐＨは、 ペプチド基質、求核試薬および所望の生成物に依存して変化するであろう。通常 は、アミド転移反応をｐＨ約５.５〜８.５で行うのが最適である。Ｌ１７８およ びＭ３９８の位置に置換を有する修飾されたカルボキシペプチダーゼ酵素(Ｌ１ ７８Ｓ＋Ｍ３９８Ｌ)を用いるペプチド基質のアミド転移は、ｐＨ約６.３〜６. ７で行うのが好ましいことがわかった。 さらに、得られるアミノリシスの割合は、使用する求核試薬の濃度を高めるこ とによって増加させることができる。 部位指向性の突然変異誘発 本発明の方法に従って、既知のセリンまたはシステインカルボキシペプチダー ゼの突然変異を、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。部位特異 的突然変異誘発は、カルボキシペプチダーゼのＤＮＡ配列および基質結合部位の アミノ酸をコードしているコドンの位置についての知識を必要とする。カルボキ シペプチダーゼＹをコードしているＰＲＣ１遺伝子のＤＮＡ配列および制限地図 ならびにこのＤＮＡ配列の供給源は、Vallsら[Cell，48:887-889(1987)]に記載 されている。 活性部位中のアミノ酸、例えばＳ₁、Ｓ₁'、Ｓ₂およびＳ₃サブサイト中のアミ ノ酸を、既知のカルボキシペプチダーゼのＤＮＡ配列中のアミノ酸をコードして いるコドンを変えることによって修飾することができる。本発明によれば、修飾 されたＤＮＡ配列には、カルボキシペプチダーゼの活性部位内のアミノ酸をコー ドしているコドンが含まれる。好ましくは、カルボキシペプチダーゼの修飾には 、既知のセリンまたはシステインカルボキシペプチダーゼの活性部位中のコドン によってコードされているアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードしているコドン の置換が含まれる。好ましくは、この置換には、カルボキシペプチダーゼのＳ₁ 、Ｓ₁'、Ｓ₂またはＳ₃結合サブサイト中のアミノ酸をコードしているコドンが含 ま れる。アミノ酸のコドンは当業者には既知である。 部位特異的な突然変異誘発は、選択したコドン位置に突然変異または修飾コド ンを含むオリゴヌクレオチドを導入することによって行うことができる。Maniat isら[A Guide to Molecular Cloning(1989)]の記載のように、部位特異的突然変 異誘発の他の方法を用いることができる。既知のカルボキシペプチダーゼをコー ドしているＤＮＡ配列中にオリゴヌクレオチドを導入するための好ましい方法に は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)および通常のクローニング法が含まれる。 修飾されたコドンを含むオリゴヌクレオチドは、自動合成を含む通常の方法に よって得ることができる。自動ＤＮＡ合成のための方法は、当業者には既知であ る。 生成させた後、合成オリゴヌクレオチドを、枠内で既知のカルボキシペプチダ ーゼのＤＮＡ配列中に導入する。合成オリゴヌクレオチドの挿入は、少なくとも １つの制限エンドヌクレアーゼで切断して標的部位内のＤＮＡ配列を削除し、次 いで、本来のＤＮＡ配列が削除された部位に合成オリゴヌクレオチドを連結する ことによって行うことができる。適当な制限エンドヌクレアーゼは、標的部位の 周辺のヌクレオチド配列を調べることによって、およびこの部位に挿入する合成 オリゴヌクレオチドの大きさによって決定することができる。制限酵素の認識配 列は当業者には既知であり、適当な酵素の組合せは当業者なら容易に選択するこ とができる。 修飾されたカルボキシペプチダーゼの発現 好ましい態様においては、カルボキシペプチダーゼＹのＳ₁サブサイト中のア ミノ酸のコドンを、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸(例えば、グルタミン酸 またはアスパラギン酸)をコードするように修飾する。カルボキシペプチダーゼ 中のアミノ酸の置換を行うため、部位指向性突然変異誘発の既知の方法を用いて 、カルボキシペプチダーゼをコードしている遺伝子を突然変異させ、所望の置換 されたアミノ酸を発現させる。 カルボキシペプチダーゼＹをコードしているＰＲＣ１遺伝子は、受託番号No． 75580のもとでAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ：Rockville，MD） から入手可能なプラスミドｐＴＳＹ３から得ることができる。所望の置換された 配列を含むオリゴヌクレオチド、即ち、天然コドンに対応する部位にアミノ酸置 換のためのコドンを含むオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成によって 合成する。ＰＣＲ法を用いてカルボキシペプチダーゼＹ遺伝子中に置換を導入す ることができる。 次いで、修飾されたＤＮＡ配列をベクター中に導入して選択および発現に供す る。適当なベクターには、酵母-細菌シャトルベクターであるＹＥｐ２４、ｐＲ Ａ２１ΔＢＡＭ、ｐＹＳＰ１、ｐＴＳＹ３、ｐＲＡ２１およびｐＹＳＰ３２が含 まれる。修飾されたＤＮＡ配列は、Maniatisら(上記)およびNielsenら[Appl.Mic robiol.Biotechnol.，33:307(1990)]に記載されているような既知の常法によっ てベクター中に導入する。 ベクターを、選択および発現のための適当な宿主細胞中に導入する。適当な宿 主細胞には、大腸菌などの細菌およびS.cerevisiaeなどの酵母が含まれる。好ま しい宿主細胞には、アイソジェニック(isogenic)vp１突然変異、delta-prc１突 然変異およびura３突然変異を有するS.cerevisiae株が含まれる。特に好ましい 宿主はvp１突然変異を有するS.cerevisiae株であり、これはNielsenら(上記)の 記載のように活性なカルボキシペプチダーゼＹを分泌する。好ましいベクターは プラスミドｐＴＳＹであり、これは、上記のＰＲＣ１プロモーターの制御下にあ るＰＲＣ１遺伝子を含む３.２kbのＤＮＡ挿入体を有する酵母-細菌シャトルベク ターＹＥｐ２４である。 適当な宿主細胞を常法により形質転換する。これら方法には、リン酸カルシウ ム、塩化カルシウムまたは酢酸リチウムにコンピテントな細胞を用いる形質転換 、マイクロインジェクション法および電気穿孔法が含まれる。形質転換された細 胞を、大腸菌の場合には抗生物質耐性の存在に基づいて、また、酵母の場合には ＵＲＡ３の存在に基づいて選択する。Nielsenら(上記)の記載のような常法を用 いて、形質転換された酵母細胞がペプチド基質を加水分解しうることを検出する ことによって、形質転換された酵母細胞を、突然変異カルボキシペプチダーゼ活 性 の産生についてスクリーニングする。 形質転換された細胞を選択および増幅した後に、修飾されたカルボキシペプチ ダーゼを、例えば高速液体クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグ ラフィーなどの常法を用いて精製することができる。 修飾されたカルボキシペプチダーゼを用いる基質のアミド転移 また本発明は、修飾されたカルボキシペプチダーゼを用いてペプチド基質を求 核試薬でアミド転移させる方法を提供するものである。本発明の修飾されたカル ボキシペプチダーゼは、正に荷電した末端から２番目のアミノ酸残基を有するペ プチド基質のアミド転移を改善するように設計される。 通常、アミド転移は緩衝水溶液中で行う。好ましい緩衝溶液は、５０ｍＭ Ｈ ＥＰＥＳおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ７.５)または５０ｍＭ ＣＨＥＳおよび５ ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ９.５)を含む。選択した緩衝液がアミド転移反応中に求核試 薬として作用しえないことが重要である。 アミド転移生成物の産生を、通常はＨＰＬＣまたは他の適当な分析法によって モニターする。酸溶液を添加して反応混合物のｐＨを約１〜３に低下させること によって反応を停止させる。別の方法によれば、フェニルメタンスルホニルフル オリド(ＰＭＳＦ)またはジイソプロピルフルオロホスフェート(ＤＦＰ)などの酵 素阻害剤を添加することによって反応を停止させることができる。アミド転移生 成物は、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン 交換クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣによって反応混合物から分離することが できる。 また、アミド転移反応を有機溶媒中で行う。アミド転移のための適当な有機溶 媒には、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、Ｎ,Ｎ'-ジメチルアセトアミド、ジ メチルホルムアミドおよび他の同様の溶媒が含まれる。有機溶媒中でのアミド転 移のための方法は、Bongersら[Int.J.Peptide Protein Res.，40:268(1992)]に 記載されている。 水溶液中でのアミド転移のための１つの例においては、ペプチド基質ＧＲＦ( １−４４)−Alaを５％酢酸溶液中に溶解する。ロイシンアミドなどの求核試 薬を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解して５００ｍＭの最終濃 度にする。ＧＲＦ(１−４４)−Alaの４０ｍＭ溶液(２５μｌ)を求核試薬溶液(９ ５０μl)に添加し、ｐＨ７.５、２０℃にする。修飾されたカルボキシペプチダ ーゼ、例えば、Ｌ１７８Ｓ＋Ｍ３９８Ｌ＋Ｎ５１Ｑ修飾化カルボキシペプチダー ゼＹを、混合物に２５μlの水／ml溶液で添加する(約０.００２〜０.０７mg/ml の酵素濃度が得られる)。反応をＨＰＬＣを用いてモニターし、追加の生成物が 生成しなくなったときに１容量の２.５％トリフルオロ酢酸を添加することによ って停止させる。 別の実施例において、ペプチド基質ＧＬＰ１(７−３６)−Alaを５％酢酸溶液 中に溶解する。求核試薬Ｏ-ニトロフェニルグリシンアミド(「ＯＮＰＧＡ」)を 、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解して２５０ｍＭの最終濃度に する。ＧＬＰ１(７−３６)−Alaの４０ｍＭ溶液(２５μl)を求核試薬溶液(９５ ０μｌ)に添加し、ｐＨ７.５、２０℃にする。修飾されたカルボキシペプチダー ゼ、例えば、Ｌ１７８Ｓ＋Ｍ３９８Ｌ＋Ｎ５１Ｑ修飾化カルボキシペプチダーゼ Ｙを、混合物に２５μlの水／ml溶液で添加する(約０.００２〜０.０７mg/mlの 酵素濃度が得られる)。反応をＨＰＬＣで追跡し、追加の生成物が生成しなくな ったときに１容量の２.５％トリフルオロ酢酸を添加することによって停止させ る。 ペプチド転移反応の反応生成物ＧＬＰ１(７−３６)−ＯＮＰＧＡを、光分解に よって切断することができる。メタノール(１２.５ml)中のＧＬＰ１(７−３６) −ＯＮＰＧＡを８０ｍＭ NaHSO₃(１２.５ml)に添加し、５Ｎ NaOHでｐＨを９.５ に調整する。次いで、この反応混合物にＮ₂を１５分間導入し、続いて、ＳＰ２ ００ランプを用いて窒素雰囲気下で光分解する。この光分解に続いて０、３０、 ６０および１２０分の時点で分析用試料を抽出する。各試料をＨＰＬＣを用いて 分析し、結果を対照試料と比較する。 本明細書中に開示したカルボキシペプチダーゼに対するいずれかの修飾が、上 記した２つのアミド転移反応のどちらかに使用するのに適している。修飾された カルボキシペプチダーゼは、負に荷電したアミノ酸残基がＳ₁サブサイト中に、 好ましくは１７８位に導入された置換を含む。適当な置換には、Ｌ１７８Ｄまた はＥが含まれる。好ましくは、修飾されたカルボキシペプチダーゼは、Ｓ₁'サブ サイトに、好ましくはＭ３９８位にさらに置換を含む。適当な置換には、Ｍ３９ ８Ｌが含まれる。さらに、修飾されたカルボキシペプチダーゼは、ペプチド基質 のＰ₃位の、例えば２４１または２４５位の正に荷電したアミノ酸残基と相互作 用しうる負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を導入するための置換を含む。 ＧＲＦ前駆体をアミド転移するために使用するカルボキシペプチダーゼは、好ま しくは、カルボキシペプチダーゼとＰ₂アラニン残基との相互作用を増強するた めに、Ｓ₂サブサイトに疎水性置換を有する。 実施例 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、上記 で詳しく説明した本発明の範囲の限定を意味するものではない。本発明の概念の 範囲内の変更は当業者に明白である。 実施例１ 方法： これら研究において用いた突然変異カルボキシペプチダーゼ酵素を、実質的に ＰＣＴ特許出願公開No．WO95/20039に記載の方法に従い、部位指向性突然変異誘 発によって調製した。通常、アミノ酸置換をコードするように合成したオリゴヌ クレオチドを用いて突然変異酵素を調製した。 通常、ＰＣＴ出願公開WO95/20039に記載のようにして、アミド転移反応を行っ た。通常、この方法は、求核試薬(他に示すことがなければＨ-Leu-ＮＨ₂)を５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解すること、およびｐＨ７.５に調整 することを含んでいた。ペプチド基質(他に示すことがなければメタノール中の ８ｍＭ Bz-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ａ-Ｒ-Ａ-ＯＨ)(５μl)を求核試薬溶液(１９０μl)に添加 し、次いで酵素(５μl)を添加し、０.２ｍＭの基質濃度を得た。 反応中に反応混合物から試料(２０μl)を採取し、これを１％トリフルオロ酢 酸(５０μl)に添加して反応を停止させた。Ｃ-１８ Waters Novapac ４μ逆相カ ラムを装備したWaters ＨＰＬＣおよび種々の勾配の０.１％トリフルオロ酢酸中 のアセトニトリルを用いるＨＰＬＣによって、反応物質組成を測定した。分 離を２５４nmでモニターし、積分ピーク面積から生成物を直接定量した。反応混 合物の組成は、反応中に少なくとも２回測定した。１回目は、基質の２０〜５０ ％(好ましくは３５％)が反応で消費されたときであり、２回目は、ペプチド基質 の５０〜９０％(好ましくは８０％)が消費されたときである。 反応生成物を集め、Pharmacia Alpha Plus分析機を用いて酸加水分解後のアミ ノ酸分析によって同定した。さらに別の同定を、真正の標準化合物の同時クロマ トグラフィーによって得た。 アミノリシス割合(fa)を、生成したアミノリシス生成物と生成した全生成物の 合計の間の比として表した。未消費の基質は、計算において無視した。 表１：Ｐ₁にアルギニンを有する基質のペプチド転移におけるカルボキシペプ チダーゼＹおよびＳ₁突然変異体のアミノリシス割合(fa) 反応は、２ｍＭの基質を用いてｐＨ７.５で行った。 ｔ＝検定の時間 [Ｅ]=０.１mg/ml Ｎ＝求核試薬(Ｈ-Leu-ＮＨ₂) Ｓ＝基質(Bz-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ａ-Ｒ-Ａ-ＯＨ) Ｐ＝生成物(Bz-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ａ-Ｒ-Ｌ-ＮＨ₂) fa＝アミノリシスの割合 得られる低いアミノリシス割合(fa＝０.０5)からわかるように、野生型カルボ キシペプチダーゼＹは、ロイシンアミド求核試薬による、Ｐ₁にアルギニンアミ ノ酸残基を有するペプチド基質のペプチド転移を効率的に触媒しなかった。対照 的に、１７８位のロイシンに代えてアラニン、セリンまたはアスパラギン酸を置 換するか、または３１２位のトリプトファンに代えてアスパラギンまたはアスパ ラギン酸を置換すると、得られるアミノリシス割合の大きな増加が得られた。２ ４１位のアルギニンに代えてグルタミン酸などの負に荷電したアミノ酸残基を置 換すると、３７５ｍＭの求核試薬濃度で得られるアミノリシス割合が有意に増加 した。さらに、２４５位にグルタミン酸などの負に荷電したアミノ酸残基を置換 すると、アミノリシス割合の増加が得られた。また、Ｌ１７８とＷ３１２位また はＬ２４５とＷ３１２位の置換を含む組合せ突然変異体も、アミノリシス割合の 有意の増加を示した。 実施例２ 方法： 実施例１の記載のように部位特異的突然変異誘発を行って、以下において使用 するＳ₁突然変異体を得た。 実施例１の記載のようにアミド転移反応を行った。 表２：Ｓ₁'突然変異カルボキシペプチダーゼＹを用いるＨ-Gly-ＮＨによるＦＡ- Ala-Xaa-ＯＨのペプチド転移のアミノリシス割合(fa)反応条件：０.２ｍＭのＦＡ-Ala-Xaa-ＯＨ基質、１.９ＭのＨ-Gly-ＮＨ₂求核試 薬、５０ｍＭのＭＥＰＥＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.５、室温 表２のデータからわかるように、ペプチド転移反応において、野生型カルボキ シペプチダーゼＹは、Ｐ₁'位に脱離基としてアラニンを有するペプチド基質に対 して非常に強力かつ狭い選択性を有する。カルボキシペプチダーゼＹのＳ₁'サブ サイト内のＴ６０およびＭ３９８位のアミノ酸の置換は、カルボキシペプチダー ゼの特異性を広くし、脱離基としての他のアミノ酸残基(例えば、バリン、ロイ シン、メチオニンおよびフェニルアラニン)に対するアミノリシス割合を増加さ せた。表からわかるように、種々の置換は、脱離基に依存してアミノリシス割合 に異なる効果を有していた。脱離基としてのロイシンに対しては、Ｔ６０位の置 換、例えばＴ６０Ａ、Ｔ６０ＷまたはＴ６０Ｙがアミノリシス割合の増加に最も 効果的であった。また、Ｍ３９８位の置換は、ロイシンが脱離基であるときに、 アミノリシス割合にさらに劇的な効果を有していた。脱離基としてロイシンを有 する基質およびカルボキシペプチダーゼＹを用いるペプチド転移を増強したＭ３ ９８における置換の例には、Ｍ３９８Ａ、Ｍ３９８Ｖ、Ｍ３９８、Ｍ３９８１、 Ｍ３９８Ｌ、Ｍ３９８Ｆ、Ｍ３９８Ｙ、Ｍ３９８Ｃ、Ｍ３９８ＮおよびＭ３９８ Ｅが含まれる。Ｔ６０およびＭ３９８の両位置における置換は、脱離基としてロ イシンを有する基質に対するアミノリシス割合をさらに改善した。これらは、Ｔ ６０Ｆ＋Ｍ３９８Ｆ、Ｔ６０Ａ＋Ｍ３９８Ｌ、Ｔ６０Ｙ＋Ｍ３９８Ｌ、Ｔ６０Ｄ ＋Ｍ３９８Ｌ、Ｔ６０Ａ＋Ｍ３９８Ｙ、Ｔ６０Ｙ＋Ｍ３９８ＹおよびＴ６０Ｄ＋ Ｍ３９８Ｙである。 実施例３ 方法： 実施例１の記載のように部位特異的突然変異誘発を行って、以下に記載する特 異的置換突然変異体を得た。実施例１の記載のようにアミド転移反応を行った。 以下の表３において、Ｋ_N(app)は、faが最大値の半分である求核試薬の濃度を 示す(求核試薬の解離定数の測定)。fa_maxは、求核試薬による酵素の飽和におい て得られる最も高い可能なfaである。 表３：二重置換の突然変異体を用いるＨ−Leu-ＮＨ₂によるＦＡ-Ala-OBzlのペプ チド転移 _aでマークした値の標準偏差は±０〜３％であり、^b は±３〜１０％の偏差を示し、^c は±１０〜３０％を示す。 基質＝ＦＡ-Ala-OBz1(０.２ｍＭ)、 求核試薬＝Ｈ-Leu-ＮＨ₂、 ｐＨ＝７.５。 Ｋ_N(app)は、Fa_max／２に到達する濃度を示し、従って求核試薬の見掛け結合 定数を示す。脱離基がアシル−酵素中間体に結合したままで加水分解反応の完結 が起こると考えられるので、低いＫ_N(app)が好ましい。 表３において、以下の突然変異体：Ｔ６０Ｆ、Ｔ６０ＣおよびＭ３９８Ｅがfa_max の増加とＫ_N(app)の低下を示した。他の突然変異体、例えば、Ｔ６０Ｖ、Ｔ ６０Ｌ、Ｔ６０Ｆ、Ｔ６０Ｗ、Ｔ６０Ｃ、Ｔ６０Ｍ、Ｍ３９８ＬおよびＭ３９８ Ｆは、fa_maxとＫ_N(app)の両方の増加を示した。 実施例４ 方法： 実施例１の記載のように部位特異的突然変異誘発を行って、以下に記載する特 異的突然変異体を得た。実施例１の記載のようにアミド転移反応を行った。 表４：５０％基質消費におけるｐＨ７.５でのBz-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ａ-Ｒ-Ｘ-ＯＨのペプ チド転移反応条件：２ｍＭのBz-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ａ-Ｒ-Ｘ-ＯＨ基質、３７５ｍＭのＨ-Leu-ＮＨ₂ 求核試薬、[Ｅ]＝０.１mg/ml、ｐＨ７.５、Ｐ_max＝ピークの生成物収率。 表４のデータは、基質のペプチド転移の速度が脱離基の性質によって影響を受 けたことを示す。Ｓ₁'サブサイト内のＮ５１およびＭ３９８位の置換は、特定の 脱離基のペプチド転移を増強した。例えば、脱離基としてのロイシンに対するア ミノリシス割合は、以下の突然変異体：Ｔ６０Ｙ＋Ｌ１７８Ｓ＋Ｍ３９８Ｌおよ びＮ５１Ｑ＋Ｌ１７８Ｓ＋Ｍ３９８Ｌによって改善された。さらに、ピークの生 成物収率は、Ｌ１７８、Ｍ３９８、Ｎ５１またはＴ６０Ｙ位の置換によって、野 生型を用いたときの０から増強された。Ｌ１７８ＳはＳ₁中に突然変異を含んで いる。Ｓ₁'中の置換と組合せると、例えばＭ３９８ＬまたはＴ６０ＹおよびＭ３ ９８ＬまたはＮ５１ＱおよびＭ３９８Ｌと組合せると、脱離基としてロイシンを 用いて得られるアミノリシス割合が、０.０１からそれぞれ０.３９、０.７１お よび０.７６に大きく増強された。さらに、０.０１からそれぞれ０.３９、０.５ ３および０.７３へのピーク生成物収率における対応する増加が存在した。 実施例５ 方法： 実施例１の記載のように部位特異的突然変異誘発を行って、以下に記載する特 異的突然変異体を得た。実施例１の記載のようにアミド転移反応を行った。 表５：５０％基質消費におけるｐＨ６.５でのBz-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ａ-Ｒ-Ｘ-ＯＨのペ プチド転移 反応条件：２ｍＭのBz-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ａ-Ｒ-Ｘ-ＯＨ基質、７５０ｍＭのＨ-Leu- ＮＨ₂求核試薬、[Ｅ]＝０.１mg/ml、ｐＨ６.５、Ｐ_max＝ピークの生成物収率。 表５のデータは、Ｓ₁およびＳ₁'サブサイト内に置換を含むカルボキシペプチ ダーゼ突然変異体について、得られるアミノリシス割合がｐＨ６.５で増強され ることを示す(表４におけるｐＨ７.５と比較して)。例えば、脱離基としてロイ シンを用いると、突然変異体Ｎ５１Ｑ＋Ｌ１７８Ｓのfaは０.２０から０.２８に 増加し、Ｐ_maxは０.１８から０.２６に増加した。 実施例６ 方法： 実施例１の記載のように部位特異的突然変異誘発を行って、以下に記載する特 異的突然変異体を得た。先の実施例の記載のようにアミド転移反応を行った。 表６：Bz-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ａ-Ｒ-Ａ-ＯＨおよびＦＡ-Arg-Ala-ＯＨのアミド転移 *[Ｓ]＝０.２ｍＭ 求核試薬＝Ｈ-Leu-ＮＨ₂ [Ｎ]＝３７５ｍＭ ｐＨ＝７.５ [Ｅ]＝０.１mg/ml 正に荷電したＰ₁アミノ酸残基(例えばアルギニン)を有するペプチド基質のペ プチド転移のためには、Ｓ₁(Ｌ１７８Ｓ)およびＳ₁'(Ｍ３９８Ｌ)サブサイトの 両方におけるアミノ酸残基の置換が、Ｐ₁に正に荷電したアミノ酸残基を有する 基質に対して、得られるアミノリシス割合およびピーク生成物収率の両方の有意 の増加を与えた。さらに、Ｓ₁サブサイト(例えば、Ｎ２４１、Ｌ２４５またはＷ ３１２)における、負に荷電したアミノ酸残基(例えば、アスパラギン酸またはグ ルタミン酸)の置換も、faおよびＰ_maxの増加を与えた。 本明細書中に挙げた全ての出版物および特許出願は、本発明が関連している技 術分野の当業者のレベルを示すものである。全ての出版物および特許出願は、同 じ内容で本明細書の一部を構成する。 本発明を種々の特定の好ましい態様および方法に関連して説明した。しかし、 本発明の思想および範囲内で多くの変形および修飾を行いうることを理解すべき である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 ステニッケ，ヘニング アメリカ合衆国92109カリフォルニア州サ ンディエゴ、ジュエル・ストリート3982番 (72)発明者 セレンセン，ステーン・ベ デンマーク、デーコー―2680ソールレズス トラン、ウグレヴァイ15番 (72)発明者 ブレッダム，クラウス デンマーク、デーコー―4000ロスキレ、オ ーステズ、アガートフテン31番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．正に荷電した側鎖を有するＰ₁アミノ酸残基を持つペプチド基質をアミド 転移するための方法であって、 Ｓ₁サブサイト中に、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸による少なくとも１ つの置換を含む修飾されたカルボキシペプチダーゼＹの存在下に、ペプチド基質 を求核試薬と反応させることからなる方法。 ２．修飾されたカルボキシペプチダーゼが、アミノ酸残基Ｌ１７８、Ｗ３１２ 、Ｎ２４１またはＬ２４５のところに少なくとも１つの置換を含む請求項１に記 載の方法。 ３．Ｌ１７８、Ｗ３１２、Ｎ２４１またはＬ２４５の少なくとも１つがアスパ ラギン酸またはグルタミン酸によって置換されている請求項２に記載の方法。 ４．求核試薬がアミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドからなる請求項１に記 載の方法。 ５．求核試薬がLeu-ＯＨ、Leu-ＯＲまたはLeu-ＮＲＲ'からなる請求項４に記 載の方法。 ６．修飾されたカルボキシペプチダーゼが、Ｓ₁'、Ｓ₂またはＳ₃サブサイト中 に少なくとも１つの置換されたアミノ酸残基をさらに含む請求項１に記載の方法 。 ７．修飾されたカルボキシペプチダーゼが、Ｓ₁'サブサイト中に、Ｎ５１Ｑ、 Ｔ６０Ｗ、Ｔ６０Ｙ、Ｔ６０Ａ、Ｍ３９８Ｌ、Ｍ３９８Ｇ、Ｍ３９８Ａ、Ｍ３９ ８Ｖ、Ｍ３９８Ｉ、Ｍ３９８Ｆ、Ｍ３９８Ｙ、Ｍ３９８Ｃ、Ｍ３９８ＮおよびＭ ３９８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの置換をさらに含む請求項１ に記載の方法。 ８．修飾されたカルボキシペプチダーゼが、Ｓ₁'サブサイト中に２またはそれ 以上のアミノ酸置換をさらに含む請求項７に記載の方法。 ９．Ｓ₁'サブサイト中の２またはそれ以上の置換が、Ｔ６０位における少なく とも１つの置換およびＭ３９８位における少なくとも１つの置換を含む請求項８ に記載の方法。 １０．Ｔ６０位における置換が、Ｔ６０Ｆ、Ｔ６０Ｌ、Ｔ６０ＹまたはＴ６０ Ｄである請求項９に記載の方法。 １１．Ｍ３９８位における置換が、Ｍ３９８Ｆ、Ｍ３９８ＬまたはＭ３９８Ｙ である請求項９に記載の方法。 １２．修飾されたカルボキシペプチダーゼが、Ｓ₂サブサイト中に少なくとも １つのアミノ酸置換をさらに含む請求項１に記載の方法。 １３．Ｓ₂サブサイト中の置換が、Ｅ２９６、Ｓ２９７またはＮ３０３位の少 なくとも１つにおけるものである請求項１２に記載の方法。 １４．Ｓ₂サブサイト中の置換が、Ｅ２９６Ｆ、Ｓ２９７Ａ、Ｎ３０３Ａまた はＮ３０３Ｆである請求項１２に記載の方法。 １５．ペプチド基質がＰ₂にAla残基を含む請求項１２に記載の方法。 １６．修飾されたカルボキシペプチダーゼＹが、正に荷電した側鎖を有するペ プチド基質のＰ₃残基と相互作用しうるアミノ酸残基の少なくとも１つの二次置 換をさらに含む請求項１に記載の方法。 １７．修飾されたカルボキシペプチダーゼが、ペプチド基質のＰ₃残基と相互 作用しうるアミノ酸残基の少なくとも１つの二次置換であって、負に荷電した側 鎖を有するアミノ酸を導入する二次置換を含む請求項１に記載の方法。 １８．二次置換が、Ｎ２４１、Ｎ２４２、Ｌ２４５またはＡ２４６位の少なく とも１つにおけるものである請求項１６に記載の方法。 １９．ｐＨ約６.３から６.７で反応を行う請求項１に記載の方法。 ２０．負に荷電した側鎖を有する置換されたアミノ酸を、Ｎ２４１またはＬ２ ４５位の少なくとも１つに含む修飾されたカルボキシペプチダーゼＹ。 ２１．Ｓ₁'、Ｓ₂またはＳ₃サブサイト中に少なくとも１つの置換されたアミノ 酸残基をさらに含む請求項２０に記載の修飾されたカルボキシペプチダーゼ。 ２２．Ｌ１７８またはＷ３１２位の少なくとも１つに置換されたアミノ酸残基 をさらに含む請求項２０に記載の修飾されたカルボキシペプチダーゼ。 ２３．Ｌ１７８ＳおよびＭ３９８Ｌ置換をさらに含む請求項２０に記載の修飾 されたカルボキシペプチダーゼ。