CN1325455A - 肽的酶促酰胺化 - Google Patents
肽的酶促酰胺化 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1325455A CN1325455A CN99812904A CN99812904A CN1325455A CN 1325455 A CN1325455 A CN 1325455A CN 99812904 A CN99812904 A CN 99812904A CN 99812904 A CN99812904 A CN 99812904A CN 1325455 A CN1325455 A CN 1325455A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- clostripain
- medium
- water
- glp
- ala
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种方法,用于产生具有C端α-羧酰胺基团的多肽。该方法特别涉及对选定多肽底物的一种酶修饰作用,该作用可导致多肽底物裂解而形成一种带有含一个α-羧酰胺基团的C端精氨酸残基(C端“Arg-NH2”)的肽产物。该方法包括将一种含有(ⅰ)氨试剂和(ⅱ)多肽底物的水性溶液与(ⅲ)梭菌蛋白酶相接触。
Description
发明背景
通过DNA的体外操作可将外源遗传信息转移到诸如微生物宿主等多种宿主细胞内,以影响其内源蛋白和外源蛋白的有效表达。重组DNA技术则使蛋白和肽的选择性表达、扩增表达及操作成为可能。
但是,对重组产生的蛋白或肽的某些修饰无法通过改变DNA序列来实现。许多天然的蛋白和肽含有一种带有α-羧酰胺基团的C端氨基酸残基,该酰胺基团不能通过表达直接产生。而是通过基因表达产生一种前体蛋白,然后通过对该前体蛋白的体内酶修饰作用引入酰胺基团。目前有多种可将C端羧酸基团转变成α-羧酰胺基团的体外方法,但这些可使用的方法常具有多种限制因素,如反应条件、选择性、所采用的试剂类型和/或可使用的底物类型等。
此外,许多外源小蛋白和寡肽常由于宿主会在表达后将肽重新吸收而不能在大多数宿主细胞内成功地过量产生。举例来说,当所需肽的长度少于约60-80个氨基酸残基时,通常会出现终产物降解而不能积累的情况。
为解决这一问题,通常是把小肽作为含有另一种较大肽(如β-半乳糖苷酶或氯霉素乙酰转移酶)的融合蛋白的一部分来加以表达,或是作为含有所需肽的多个拷贝的重组构建体(多拷贝构建体)来加以表达。这两种情况一般都需要将最初表达的构建体裂解以产生所需的肽。最常见的是将重组构建体裂解成一种前体肽,然后对其进行翻译后修饰以产生所需的肽。如果有其它方法能够裂解肽前体,同时将α-羧酰胺基团引入裂解产物的C端氨基酸残基的话,那么将会非常有用。
发明概述
本发明涉及一种方法,用来产生具有C端α-羧酰胺基团的多肽。该方法特别涉及对含有精氨酸的选定多肽底物的一种酶修饰作用,该作用可导致多肽底物裂解而形成一种含有一个C端α-羧酰胺基团的多肽产物。该方法包括将一种含有(a)多肽底物(“第一多肽”)和(b)氨试剂的基本水性的溶液与(c)梭菌蛋白酶相接触。该多肽底物至少含有核心氨基酸序列的一个拷贝,并且通常可包含核心氨基酸序列的一个以上的拷贝(即多拷贝构建体)。该核心氨基酸序列的C端残基是一个精氨酸残基,该精氨酸残基通过α-羧基肽键(即“Arg-Xaa”肽键)与邻近氨基酸残基相结合。由于梭菌蛋白酶是一种肽链内切酶,因此Xaa氨基酸残基是指其α-羧基与另一种氨基酸残基通过肽键相结合(“Arg-Xaa-Xaa’”)或与一种羧基封端基团相结合(“Arg-Xaa-R”)的一种氨基酸残基。羧基封端基团是指可置换羧酸的酸性官能团(-C(O)OH基团的“-OH”部分)的功能性有机基团,羧基封端基团可被裂解或水解而产生一个羧酸基团(“-C(O)OH基团”)。适当羧基封端基团的实例包括含有酯基的烷氧基部分(如-C(O)OR基团的乙氧基或苄氧基部分)的基团以及含有非肽类酰胺键的-NR’部分(如-C(O)NRR’基团的NRR’部分)的基团。该-NRR’部分可不加取代(即NH2),也可用一种或两种取代基取代(即NHEt或NMe2)。当处于水性溶液中的这种多肽底物在存在梭菌蛋白酶的情况下与氨试剂接触时,该多肽底物可在所述精氨酸残基的α-羧基肽键位置裂解,并产生另一种带有含一个α-羧酰胺基团的C端精氨酸残基(“Arg-NH2”残基)的多肽(“多肽产物”)。
文中使用的术语“氨试剂”是指一种含有“溶解的游离氨”(即溶解于水性溶液的NH3)并且/或在梭菌蛋白酶可酰胺化裂解含有精氨酸的肽的条件下能够释放水性溶液中溶解的游离氨的试剂。举例来说,氨试剂可含有与溶解的游离氨相平衡的一种或多种氨盐。游离氨与不同盐的相对量一般是该领域技术人员所熟知的多种参数,如溶液的pH值、溶液中不同阴离子的相对浓度和/或特定氨盐的溶解度等。由于氨(“NH3”)在水溶液中的pKa值约为9.2,因此大多数游离氨形式的氨试剂的pH值约为9或更高。在pH值大于氨的pKa值的溶液中,通常有一半以上的氨是以溶解的游离氨或氢氧化铵(“NH4OH”)形式存在。还应了解的是,氨盐的阴离子部分通常会与特定溶液中存在的其它阴离子进行极快地交换。因此,如果pH值为10.0的水溶液中含有氯化物盐(“Cl-”)、醋酸盐(“OAc-”)和硫酸盐(“SO4 =”),则该溶液中的氨试剂除溶解的游离氨和氢氧化铵(“NH4OH”)之外,还可能包括氯化氨(“NH4Cl”)、醋酸氨(“NH4OAc”)和硫酸氨(“(NH4)SO4”)。该方法通常使用至少含有约0.5M氨试剂的基于水性的反应介质。在对酶的活性基本不产生抑制的情况下,约0.75M-1.5M的氨试剂浓度看来可实现酰胺化产物形成速率与产量之间的最佳平衡。文中提到的氨试剂浓度相当于介质中溶解的游离NH3的浓度。本方法的一项实施方案包括,在pH值不超过约8.5,优选的是基本为中性,的基于水性的第一介质中制成多肽底物溶液。通过将溶液的pH值调整到至少约9.0,典型的约为9.0-11.0,并在存在氨试剂的情况下将多肽底物与固定化形式的梭菌蛋白酶(“固定化梭菌蛋白酶”)接触,即可使多肽底物在α-羧基肽键位置发生裂解而产生具有C端Arg-NH2残基的多肽产物。底物和氨试剂与固定化梭菌蛋白酶接触的时间优选的是不少于约20分钟,更优选的是不少于约5分钟。
通常可在多肽底物和氨试剂与固定化梭菌蛋白酶接触之前不久将基于水性的第一介质与一种碱性水溶液(碱性介质)混合以提高pH值。本发明该实施方案的一种实施方法是将含有固定化梭菌蛋白酶的树脂装在层析柱中。将底物储液和碱性溶液混合,然后立即过柱,以使多肽底物最小程度地暴露于高pH值水溶液。在本发明的一项典型实施方案中,该碱性水溶液包括氨试剂。但氨试剂并非必需的,因为反应介质在其pH值被提高到至少约9.0以前也可含有某些或所有氨试剂。
一般而言,在多肽产物从与固定化酶接触的环境中移出后不久还需优选地将反应混合物的pH值调至约8.5以下,优选的是调至基本中性(即约6.5-8.0的pH值)。通常是在反应混合物脱离含有固定化梭菌蛋白酶树脂的柱之后,尽快将含有多肽产物的该混合物的pH值调至约8.5或更低。这样可以使多肽在用于梭菌蛋白酶催化酰胺化裂解的相对较高pH的水性条件下被降解的可能性。已知多肽在高pH水性条件下易于通过水解作用而受外消旋和/或降解作用的影响。
对多肽底物在存在氨试剂的情况下与固定化梭菌蛋白酶相接触的条件加以选择,以最大程度地缩短底物和产物处于高pH条件下的时间,这样通常会产生有利效果。通过将底物/产物溶液在高于约8.5的pH值下与固定化酶接触的时间限制在不超过约30分钟的方式,本发明的方法可高产量地将底物转化成酰胺化裂解产物。酰胺化裂解的优选实施方式是底物/产物溶液在8.5或更高的pH值下保持的时间不超过约20分钟,更优选的是不超过约5分钟(即使裂解反应进行2-5分钟)。
附图简述
图1显示GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)于37℃下在pH7.9的1M NH4OH、2.5mM DTT、1mM CaCl2中由梭菌蛋白酶催化的酰胺化反应中原材料与产物的相对量作为时间函数的变化图。
图2显示GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)于37℃下在pH9.0的1M NH4OH、2.5mM DTT、1mM CaCl2中由梭菌蛋白酶催化的酰胺化反应中原材料与产物的相对量作为时间函数的变化图。
图3显示GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)于37℃下在pH9.6的1M NH4OH、2.5mM DTT、1mM CaCl2中由梭菌蛋白酶催化的酰胺化反应中原材料与产物的相对量作为时间函数的变化图。
图4显示GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)于37℃下在pH10.4的1M NH4OH、2.5mM DTT、1mM CaCl2中由梭菌蛋白酶催化的酰胺化反应中原材料与产物的相对量作为时间函数的变化图。
图5显示GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)于37℃下在ph11.0的1M NH4OH、2.5mM DTT、1mM CaCl2中由梭菌蛋白酶催化的酰胺化反应中原材料与产物的相对量作为时间函数的变化图。
图6显示在利用固定化形式的酶进行由梭菌蛋白酶催化的酰胺化裂解反应中GLP-1(7-36)NH2的产量作为流速的函数的变化图。
图7显示用于利用固定化梭菌蛋白酶进行含精氨酸的肽的酶促酰胺化的装置示意图。
发明详述
本发明的方法可将含有一个精氨酸残基的肽底物酰胺化裂解,形成一种带有含一个α-羧酰胺基团的C端精氨酸残基(“C端Arg-NH2”)的肽产物。该方法包括将底物肽在存在梭菌蛋白酶的基本属于水性的溶液中与氨试剂相接触。该酶的存在形式可以是溶解形式或固定化形式。
文中使用的术语“梭菌蛋白酶”是指该酶的天然种类或其修饰形式。该修饰形式需保持梭菌蛋白酶可在Arg-Xaa肽键位置对含有精氨酸的肽进行酰胺化裂解的能力。经修饰的梭菌蛋白酶的适当实例包括,通过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加而产生的与天然梭菌蛋白酶不同的功能性突变体。修饰形式的梭菌蛋白酶的其它适当实例包括带有梭菌蛋白酶功能性片段的多肽,该片段保持有对含有精氨酸的肽进行酰胺化裂解的能力,如通过将该酶的一种或多种亚基组分的氨基端和/或羧基端若干残基去除而产生的天然梭菌蛋白酶功能活性片段。
天然梭菌蛋白酶(梭菌肽酶B)是一种来源于梭菌的细胞外巯基内切蛋白酶。该蛋白酶为异二聚体,并且与其它已知的巯基蛋白酶不同源。据报导,该酶的分子量约为30,000-80,000,等电点一般约为4.8-4.9。梭菌蛋白酶最早分离于溶组织梭菌的培养物滤出液(Mitchell et al.,J.Biol.Chem.,243(18):4683-2602(1968))。该酶的特点是对Arg-Xaa肽键(尤其是Arg-Pro键)具有高度特异性,并且具有蛋白水解活性及酰胺酶/酯酶活性。举例来说,在分离的胰岛素B链中,梭菌蛋白酶裂解Arg-Gly键比裂解Lys-Ala键快500倍,而在胰高血糖素中,裂解仅发生在Arg-Arg、Arg-Ala和Lys-Try键位置。这三种键水解的相对起始速率为1、1/7和1/300(Labouesse,Soc.Chem.Biol,42:1293(1960))。
已知可通过多种活化剂和抑制剂来调节梭菌蛋白酶的活性。梭菌蛋白酶活化剂的实例包括钙离子和诸如半胱氨酸、2-巯基乙醇及二硫苏糖醇等硫醇试剂。另外还知道甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基甲酮、过氧化氢、Co2+、Cu2+、Hg2+或Cd2+离子、EDTA或柠檬酸盐的存在可抑制梭菌蛋白酶。
梭菌蛋白酶可采用,例如,在此引入作为参考的美国专利号5,728,543中描述的方法通过微生物的发酵来加以制备。该方法是通过梭菌培养使梭菌蛋白酶在营养培养基中聚集。梭菌菌株的适当实例如溶组织梭菌DSM627。能够合成梭菌蛋白酶的梭菌突变体和变异体也可使用。
培养通常是在厌氧培养基、单一培养基或混合培养基中进行,例如可浸没于在适当情况下处在例如氮气的惰性气体环境中的不搅动的缺氧培养基或发酵器中。进行发酵的温度一般约为25-40℃,pH为5-8.5。1-3天后,培养肉汤中通常会检测到该酶的聚集。梭菌蛋白酶的合成开始于对数生长期晚期,并在稳定生长期达到最大值。酶产生后可对其进行活性测定(例如,参考Mitchell,Meth.Enzym.:47:165-170(1997))。尽管每种微生物的最佳发酵条件有所不同,但适当发酵条件或已为该领域技术人员所了解,或可通过初步测试来方便地建立。利用经典方法可将梭菌蛋白酶由培养物滤出液中分离并纯化,例如甲醇或硫酸铵沉淀法、离子交换或凝胶渗透层析法。另外还知道以重组方式产生该酶的方法(如参考Witte et al.,Microbiology,140(5),1175-1182(1994)),只要由此产生的酶能够在Arg-Xaa肽键位置进行选择性酰胺化裂解,就可以在本发明的方法中采用该方法。
在将梭菌蛋白酶用于本发明的酰胺化裂解反应之前,通常要利用诸如硫醇(含有巯基官能团(“-SH”)的复合物)等还原剂进行处理以将其活化。还原剂的适当实例包括诸如二硫苏糖醇(“DTT”)、二硫赤藓糖醇(“DTE”)、2-巯基乙醇、巯基乙酸、半胱氨酸等硫醇。用于活化梭菌蛋白酶的硫醇浓度可有很大不同,例如可约为0.05-100mM。优选而言,对用于酰胺化裂解反应的酶进行的该活化作用可在含有约0.1-5mM硫醇(如DTT)的水性溶液中进行。以该方式活化的酶和/或如下文所述通过添加钙离子源活化的酶可直接使用,也可在适当情况下,如采用层析或透析方法时,由活化缓冲液释放。
由于钙离子(Ca2+离子)也可活化梭菌蛋白酶,因此,含有用于酰胺化裂解反应的梭菌蛋白酶的水性溶液中通常还含有Ca2+离子源,如CaCl2。例如常使用含有约0.01-2mM CaCl2的梭菌蛋白酶水溶液。但如上文所述,梭菌蛋白酶在用于本发明的方法之前需通过暴露于Ca2+离子来加以活化。
在本申请中使用了氨基酸残基的标准单字母及三字母缩略语(见37 C.F.R.1.822)。缩略语“Hse”是指高丝氨酸内酯和/或高丝氨酸。这表示由溴化氰与甲硫氨酸残基反应,如在肽的溴化氰裂解反应中,产生的两种形式的氨基酸残基的混合物。高丝氨酸和高丝氨酸内酯这两种形式作为平衡产物的混合物而存在。这两种形式的相对量随pH值的不同而不同,在较高pH值下以游离酸(高丝氨酸)形式占优势。
尽管用于进行酰胺化裂解反应的水性介质主要包含的是水,但该介质中也可包含一些能与水互溶的有机溶剂。能与水互溶的有机溶剂的适当实例包括醇类(如甲醇、乙醇、1,4-丁二醇和三氟乙醇)、酮类、尿素、酰胺类(如N,N-二甲基甲酰胺(“DMF”)、N,N-二甲基乙酰胺(“DMA”)和N-甲基焦啉酮(“NMP”))、碳酸酯类(如丙烯碳酸酯)和醚类(如四氢呋喃)以及乙腈。尽管水性介质中包含的有机溶剂一般不超过约20%(v/v)(即20%体积的有机溶剂),但已发现在水性介质中存在有机溶剂可能会加强梭菌蛋白酶的蛋白水解活性而降低其酰胺化活性。因此,本发明的酰胺化裂解反应通常是在包含有不超过相对较低水平有机溶剂的水性介质中进行。一般而言,该水性反应介质中包含的有机溶剂不超过约10%(v/v),更优选的是不超过约5%(v/v)。尽管在基本不包含有机溶剂的水性介质,即包含不超过约1%(v/v)有机溶剂的溶液,中通常可观测到梭菌蛋白酶促酰胺化活性与蛋白水解活性的最佳比率,但介质中含有少量有机溶剂在许多情况下是有益的。特别适合于加入水性介质的有机溶剂的实例包括丙烯碳酸酯、乙腈和乙醇。
尽管酰胺化裂解反应的温度也可在很大范围内有所不同,但通常采用的反应温度约为4-80℃。优选的是在20-60℃的温度下进行酰胺化裂解反应,特别适合的反应温度则约为25-50℃。本发明的酰胺化裂解反应通常是在pH至少约为9.0的基于水性的介质中进行。优选的是在约9.0-11.0的pH值下进行本发明的酶催化酰胺化裂解反应,特别适合的pH值则约为9.5-10.5。
将多肽底物酰胺化裂解成具有C端Arg-NH2残基的相应多肽产物的所需时间可在很大范围内有所不同,这取决于反应的条件。举例来说,若采用单相溶液法来进行,则基本实现转化需15分钟-48小时,而从方便角度考虑,通常希望反应时间为30分钟-6小时。若采用将底物和氨试剂与固定化梭菌蛋白酶相接触的方法来进行酰胺化裂解,则可通过条件的选择使底物在约5分钟或更短时间内实现基本转化(如40%转化或更高)。正如该领域技术人员所了解的,反应速率可受多种因素的影响,其中包括底物、氨试剂和酶的浓度、反应温度、反应介质的pH值以及反应介质中有机溶剂的存在与否。通过调节这些参数中的一种或多种即可实现所需的反应速率及反应时间。
在酰胺化裂解反应中常用的相对较高的pH值条件可能会通过,例如,蛋白水解反应和/或异构化作用而导致肽的降解,其中,异构化作用可将L型氨基酸残基转化成其相应的D型异构体(“D型杂质”)。已发现含有盐类、溶剂等的反应介质以及其温度和pH值均可影响降解的速率。举例来说,若将pH值为10.5的含有1M NH4OH的GLP-1(7-36)NH2水溶液在45℃下置44小时,会有相当量的肽被降解成D型杂质。若将pH值为中性的类似溶液在44℃下置44小时,则检测到的降解作用要低得多(8%D型杂质),若将类似溶液在-20℃和4℃下置类似的时间,则基本上观测不到降解作用。
相比之下,若将GLP-1(7-36)NH2在约4-8.4的pH值下溶解于水并将该溶液在-20℃-45℃下置类似的时间,则基本上检测不到D型杂质的形成。在8.4-10.5范围内的多种pH值下检测1M氯化铵溶液中GLP-1(7-36)NH2降解情况(45℃下置25小时以上)的其它实验结果表明,该肽在pH8.4时相对稳定。而在这些条件及pH9.4下检测到相当程度的降解(9%),并且随着pH值的逐渐增高,检测到的降解速率也越来越高。这些结果表明,应最大限度地降低酰胺化肽产物暴露于相对较高pH值(如pH≥9.5)的程度,以避免底物和酰胺化产物的大量降解。
另外还在恒定pH及温度(pH10.0,45℃)下检测了氨盐(氨试剂)NH4X的不同浓度对梭菌蛋白酶催化的酰胺化裂解的影响,其中X为铵离子的平衡离子,举例来说,如氢氧根离子、氯离子、醋酸根离子或硫酸根离子。将NH4Cl/NH4OH(通过用盐酸将NH4OH水溶液的pH值调至10.0而形成)的浓度从0.5M提高至1.0M导致所需酰胺化裂解产物的形成速率及产量的提高,而能够在相对较高pH值下形成的D型杂质的量基本上不增加。此处使用的NH4OH是指氨的氢氧化物。它是通过将氨溶解于水而产生,如商品形式的氢氧化铵即是如此,它与溶解于水的NH3水合物相平衡。换句话说,氢氧化铵是NH4 +OH-与“溶解的游离NH3”相平衡的一种混合物。NH4Cl/NH4OH浓度的进一步提高(约至2M)不会导致酰胺化产物最大产量或降解产物量的任何实质性增加。但更高的NH4Cl/NH4OH浓度似乎会抑制梭菌蛋白酶的活性,因为将NH4Cl/NH4OH的浓度从1.0M提高至2.0M使得酰胺化产物达到最大值所需的时间几乎增至三倍。因此,约1.0M(如约0.75M-1.25M)的NH4Cl/NH4OH浓度看来可实现酰胺化产物形成速率与产量之间的最佳平衡,并且还基本上不抑制酶的活性。也可能会找到对pH值敏感性更低,并且在pH值大于约10.0的溶液中活性更高的梭菌蛋白酶变异体。此外,铵离子的其它平衡离子,如硫酸根离子和氯离子,也适用于酰胺化作用,并且据推断,其平衡离子并不局限于这些离子。由于溶液的平衡反应,氨试剂通常会以NH4OH、一种或多种其它氨盐(如NH4Cl和/或NH4OAc)及溶解的游离NH3的混合物形式存在。
在本发明的一项替代实施方案中,可将酰胺化裂解反应以连续方式进行,例如将含有反应物(肽底物和氨试剂)的水溶液与含有固定化梭菌蛋白酶的树脂的悬浮液或床体相接触。梭菌蛋白酶与固定支持物的结合可通过多种传统方法来实现。例如,目前已制备出通过与琼脂糖凝胶或甲基丙烯酸酯型树脂上的tresyl或醛基反应或与CNBr活化的琼脂糖反应而被固定的梭菌蛋白酶制品。以这种方式制备的树脂所连接的酶的数量可有很大不同。适于在本发明所述方法中使用的树脂通常含有约0.1-10mg/ml的固定化梭菌蛋白酶,优选的则约为1-5mg/ml。这些制品对底物的酰胺化裂解活性很高,例如在存在氨并且pH值为10的情况下可将具有GLP-1(7-35)-Arg-Ala-Phe-Ala序列的多肽裂解成含有C端GLP-1(7-35)-Arg-NH2的多肽。其产量一般都大于40%,这与单相溶液反应的观测结果相类似。含有固定化梭菌蛋白酶的树脂可装在柱中,并可作为酰胺化裂解反应的高效催化剂。
利用固定化梭菌蛋白酶进行反应通常是将溶于适当水性氨溶液的肽底物抽吸过柱。这样就无需从反应产物中去除可能带来问题的梭菌蛋白酶。与树脂结合的梭菌蛋白酶可在反应前用硫醇活化,也可在酰胺化过程中加入还原剂。通常只需在反应介质中加入硫醇(如DTT)和钙盐(如CaCl2)即可即保持酶的活化状态。利用固定化酶反应器进行酰胺化的方法还可以使肽在导致产物降解的高pH值条件下的暴露程度减至最小,尤其可以使D型杂质的形成及侧链的脱酰胺作用降至最低。举例来说,可将两股液流,一股含有处于相对较低pH(如不超过约8.5)下从而可保持稳定的肽,一股含有可提供反应所需最终pH值和化学条件的适当组分,相混合,然后立即把该反应混合物引入树脂床。底物与树脂接触的持续时间通常少于约20分钟,优选的是不超过约5分钟。此外,优选的是在产物溶液流出反应器后立即与适当酸溶液或缓冲液相混合,以使其pH值降低至约8.5或更低,酰胺化产物在该pH值下的稳定性会显著提高。
本发明的方法适用于多种含C端精氨酸残基肽的酰胺化形式的产生。预产生的靶肽可以是任何以精氨酸为末端残基的有用多肽序列,如天然序列、经修饰的天然序列、具有生物学活性的非天然序列,或其截尾形式和类似形式。该肽的分子量可约为300-20,000,一般为400-10,000。这些肽通常含有3-100个氨基酸残基,优选的则含有3-70个残基。这些肽的实例包括生长激素释放因子、这些因子的前体形式及其功能片段。可利用本发明的方法被转化成C端酰胺化肽的肽底物的适当实例包括以下多肽:
GLP(1-35)-Arg-Xaa-R(序列编号:2)
His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa-R和
GLP-1(7-35)-Arg-Xaa-R(序列编号:3)His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa-R
其中R代表一种羧基封端基团、一种氨基酸残基,或一种肽酰基(即一段通过α-羧基肽键相连接的两种或多种氨基酸的序列)。
本发明的方法可用于含有一个以上核心氨基酸序列拷贝的多肽底物的酰胺化裂解。这些多拷贝构建体的各相邻拷贝可彼此直接连接(“无隔连接”)。但更常见的是相邻的核心氨基酸序列拷贝通过一种接头序列而连接。接头序列是一种相对较短的氨基酸序列(通常不超过5-10个氨基酸残基),它可作为相邻的核心氨基酸序列拷贝之间的间隔。接头序列选用的氨基酸残基通常可提供能被酶或化学裂解剂选择性裂解的额外位点。
以下提供的实例用来对本发明进行说明,并协助普通技术人员进行相同的操作和应用。无论从任何方面考虑,这些实例都不对本发明的范围加以限制。实施例1--在pH7.9条件下由梭菌蛋白酶催化的酰胺化
将肽底物GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1;2mg)溶解于900μl 1M水性NH4OH,并利用冰醋酸将pH调至7.9。在加入梭菌蛋白酶之前将底物溶液于37℃下保温15分钟。将梭菌蛋白酶(1mg)溶解在1ml含有1mM CaCl2的25mM二硫苏糖醇中,并在室温下置15分钟。于37℃下将梭菌蛋白酶(100μl)加到含有底物溶液的试管中。将管封口,颠倒混匀,并置于37℃水浴中。
对梭菌蛋白酶催化的反应过程的监控方法是每隔一定时间(一般为每5分钟或每10分钟)取出25μl反应混合物试样。以加入梭菌蛋白酶储液后立即取出的反应混合物为0时间点。用冰醋酸将反应试样稀释10倍并利用5微米C18反相柱进行HPLC分析,洗脱采用以下缓冲液的弱线性梯度(3分钟内达到35%B,再6分钟内达到45%B,然后在12.3分钟时达100%B):A:95%(v/v)水、5%(v/v)乙腈、0.1%(v/v)三氟乙酸;B:5%(v/v)水、95%(v/v)乙腈、0.1%(v/v)三氟乙酸。
结果(图1)表明没有发生明显的酰胺化。主要的反应是在无酰胺化情况下于Arg36位置发生水解,以去除Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:6)而产生GLP-1(7-36)OH(序列编号:4),同时在Lys34位置也有轻微的水解并产生GLP-1(7-34)OH(序列编号:5)。GLP-1(7-36)OH(序列编号:4)的量在5分钟后达到约55%的最大值(以起始GLP-1(7-36)OHAla-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)为基准),然后由于在Lys34位置缓慢水解成GLP-1(7-34)OH(序列编号:5)而下降。Lys34位置的裂解表明存在有一定程度的对该次级位点的水解活性。在Lys34位置观测到相当程度的次级水解是有些出乎意料。
GLP(7-36)OH(序列编号:4)His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-OHGLP(7-34)OH(序列编号:5)His-Ala-Glu-Glp-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys实施例2--在pH9.0条件下由梭菌蛋白酶催化的酰胺化
在完成实施例1所述步骤及分析后,于pH9.0及37℃条件下用梭菌蛋白酶对溶于1M水性NH4OH的GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)进行催化酰胺化。用冰醋酸将pH调至9.0。
在pH9.0下进行反应的结果(图2)表明存在有明显的酰胺化作用,产生的GLP-1(7-36)NH2在约10分钟后达到23.6%的最大值。在反应进行10分钟时,酰胺化作用与水解作用的比率(GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OH的比值)为1.4。pH值为9.0时,在Lys34位置发生水解而产生GLP-1(7-34)OH的速度(未显示)更加缓慢,60分钟后的检测值仅为7.4%。
GLP(7-35)-Arg-NH2(序列编号:4)His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2实施例3--在pH9.6条件下由梭菌蛋白酶催化的酰胺化
在完成实施例1所述步骤及分析后,于pH9.6及37℃条件下用梭菌蛋白酶对溶于1M水性NH4OH的GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)进行催化酰胺化。用冰醋酸将pH调至9.6。
结果(图3)表明GLP-1(7-36)NH2在10-20分钟时达到最大值(38.1%)。在反应进行10分钟时,酰胺化作用与水解作用的比率为5.1。与pH值为9.0(实施例2)时相比,梭菌蛋白酶在pH9.6下的活性有轻微降低,因而导致GLP-1(7-36)NH2达到最大值的时间稍微滞后。实施例4--在pH10.4条件下由梭菌蛋白酶催化的酰胺化
在完成实施例1所述步骤及分析后,于pH10.4及37℃条件下用梭菌蛋白酶对溶于1M水性NH4OH的GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)进行催化酰胺化。用冰醋酸将pH调至10.4。在pH10.4下进行酰胺化的实验结果显示于图4。在该pH值下,GLP-1(7-36)NH2在约30分钟后达到最大值(42.3%)。在反应进行30分钟时,酰胺化作用与水解作用的比率为4.7。60分钟后的GLP-1(7-34)OH产量(未显示)为9.4%,这与pH9.0和9.6下的检测值相似。这表明在pH值为10.4时,Lys34位置发生水解的量要少于在较低pH值下的水解量。实施例5--在pH11.0条件下由梭菌蛋白酶催化的酰胺化
在完成实施例1所述步骤及分析后,于pH11.0及37℃条件下用梭菌蛋白酶对溶于1M水性NH4OH的GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)进行催化酰胺化。用冰醋酸将pH调至11.0。在pH11.0下进行酰胺化的实验结果显示于图5。在该pH值下,GLP-1(7-36)NH2(序列编号:4)在60分钟后的产量为27.6%。但是该反应的进度与其它所有较低pH下的反应相比要慢得多,并且在反应进行60分钟后仍未达到最大值。在这一相对较高的pH值下,酰胺化作用与水解作用相比具有强烈的优势,甚至在反应进行60分钟后,GLP-1(7-36)OH(序列编号:4)产量的增加速率仍低于GLP-1(7-36)NH2。在这一较高pH值下未检测到在Lys34位置水解产生GLP(7-34)OH(序列编号:5)的情况。实施例6--由梭菌蛋白酶催化的GLP-1(7-36)-Ala-Phe-Ala-Met-His-Ala-Glu酰胺化
在完成实施例1所述步骤后,于37℃下检测梭菌蛋白酶对溶于1M水性NH4OH的GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Met-His-Ala-Glu(序列编号:7)的催化酰胺化作用。其酰胺化作用是在pH10.3及10.8下进行,所产生的GLP-1(7-36)NH2的最大值分别为32.9%和12.4%。表Ⅰ显示以GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)为底物由梭菌蛋白酶催化酰胺化的各结果比较。该结果表明最佳pH范围约为9.0-11.0,优选的为9.5-10.5。
表Ⅰ
不同pH值下的酰胺化产量及选择性
实施例7--合成底物的酰胺化
产量 | 比率 | ||
pH | 底物 | GLP-1(7-36)NH2(%)a | GLP-1(7-36)NH2/GLP(7-36)OHb |
7.9 | GLP(7-36)AFAHse | 无 | nd |
9.0 | GLP(7-36)AFAHse | 3.6 | 1.4 |
9.6 | GLP(7-36)AFAHse | 38.1 | 3.1 |
10.4 | GLP(7-36)AFAHse | 42.3 | 4.7 |
11.0 | GLP(7-36)AFAHse | 27.6c | 7.0 |
10.3 | GLP(7-36)AFAHAE | 32.9 | Nd |
10.8 | GLP(7-36)AFAHAE | 12.4 | Nd |
a--最大值b--观测到最大值时的比率c--60分钟后(仍未达到最大值) |
将一般结构为Val-Lys-Gly-Arg-XXXX(“VKGRXXXX”;序列编号:8),其中“XXXX”表示三个或四个氨基酸残基的一种肽段,的合成底物与溶解于1M氯化铵,pH10.4、2mM DTT、1mM氯化钙的梭菌蛋白酶置45℃下保温。每隔一定时间取出反应混合物的少量试样,用冰醋酸淬灭,并通过毛细管电泳加以分析。表Ⅱ概括了在反应10分钟后相同浓度的梭菌蛋白酶对不同底物的裂解百分率。通过HPLC鉴定发现,在所有情况下的主要产物均为C端α-羧酰胺化的Val-Lys-Gly-Arg(“VKGR-NH2”;序列编号:9)。很明显,C端片段的性质可以有很大不同,并且它们仍具有相当大的被酰胺化裂解的能力。
表Ⅱ
实施例8--利用梭菌蛋白酶对GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse的酰胺化裂解进行实验室规模的GLP-1(7-36)NH2制备
底物(VKGR-XXXX)“XXXX” | 剩余底物百分率(反应进行10分钟后) | 序列编号 |
AFFG | 50.7 | 10 |
AFAM | 56.7 | 11 |
AFM | 73.1 | 12 |
APAG | 64.7 | 13 |
AFAHse | 67 | 14 |
AFHse | 71 | 15 |
LAFG | 82.9 | 16 |
AAGG | 81.9 | 17 |
ALAG | 78.7 | 18 |
AAPG | 82.5 | 19 |
LAAG | 85 | 20 |
AAFG | 80.8 | 21 |
QAQG | 90.6 | 22 |
HAEG | 95.4 | 23 |
以4.24mg/ml的浓度将通过重组技术制备的冻干的肽GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)溶解在利用0.15M NaOH将pH值调至10.5的1.16M NH4OH、0.25M HCl、2.5mM DTT、1mM CaCl2中,并以1∶300的酶:底物比率加入梭菌蛋白酶。在45℃下反应4.5小时,然后用10mM EDTA淬灭。利用在Amberchrome CG71上的反相条件通过层析将产物GLP-1(7-36)NH2纯化,然后冻干。
该肽产物的氨基酸组成在实验误差范围内与GLP-1(7-36)NH2的理论值相同,其吸收光谱可精确反映出酪氨酸和色氨酸的预定含量,利用MALDI-TOF质谱仪测量其分子量为3298(在实验误差范围内与预定值相同),其序列也与假定序列相同,此外,它在HPLC上的迁移率和购买的合成肽样品完全相同,与GLP-1(7-36)OH充分分离。因此,该多肽产物被确认为GLP-1(7-36)NH2。实施例9--有机溶剂对梭菌蛋白酶的蛋白水解活性的影响
于室温下在含有10%(v/v)有机溶剂的水性溶液中将10μg梭菌蛋白酶和溶解于2.5mM二硫苏糖醇、1mM氯化钙、50mM Tricine缓冲液,pH8.5的2mg N-Bz-Phe-Val-Arg-p-硝基苯胺底物溶液(1ml)共保温。通过对释放出的p-硝基苯酚阴离子的光度检测来确定初始速率。
表Ⅲ
有机溶剂对梭菌蛋白酶蛋白水解活性的影响
有机溶剂 | 相对于无有机溶剂介质的活性(%(v/v)) |
乙腈 | 180 |
丙烯碳酸酯 | 264 |
三氟乙醇 | 200 |
二甲基甲酰胺 | 123 |
二甲基乙酰胺 | 108 |
四氢呋喃 | 26 |
1,4-丁二醇 | 116 |
N-甲基吡咯烷酮(pyrolidinone) | 90 |
在含有不同量有机溶剂的情况下重复这些反应,并确定出对蛋白水解活性而言的最佳丙烯碳酸酯(10%)、N,N-二甲基甲酰胺(20%)、三氟乙醇(20%)和乙腈(20%)浓度。实施例10--利用有机溶剂对梭菌蛋白酶的酰胺化活性进行抑制
于45℃下在1ml反应体系中用20μg梭菌蛋白酶同溶解于2.5mMDTT、1mM氯化钙、2mM醋酸铵,ph10.4的GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1;2mg/ml)相互作用,以确定在含有不同有机溶剂情况下可获得的最大酰胺化水平。每隔一定时间取出反应混合物的少量试样,用冰醋酸淬灭,然后在反相HPLC柱上通过HPLC分析方法进行测定。
表Ⅳ
有机溶剂对梭菌蛋白酶促酰胺化活性的影响
溶剂 | 酰胺化程度(占被转化底物的百分率) |
水性对照(不含有机溶剂) | 44 |
20%三氟乙醇 | 9 |
10%丙烯碳酸酯 | 29 |
20%乙腈 | 18 |
表Ⅳ的结果表明,这些溶剂的存在可明显对酰胺化活性造成抑制。以1∶190的酶:底物比率在45℃的1.25M NH4OH,pH10.0、2.5mMDTT、1mM CaCl2中进行不同低浓度乙腈和乙醇的一系列反应(表Ⅴ)。低水平的乙腈或乙醇几乎不对转酰胺化产量、反应速率或GLP-1(7-36)NH2与GLP-1(7-36)OH的比率造成影响,但是却会降低D型杂质的产量。
表Ⅴ
实施例11--氨浓度对转酰胺作用的影响
溶剂 | 最大值(%) | 最大值(分钟) | %D | GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OH |
水 | 60 | 90 | 3.4 | 4.9 |
4%乙腈 | 57 | 90 | 1 | 3.9 |
2%乙腈 | 59 | 120 | 1.2 | 4.1 |
5%乙腈 | 60 | 90 | nd | 5.2 |
10%乙醇 | 58 | 150 | nd | 3.3 |
5%乙醇 | 59 | 120 | nd | 4.0 |
2.5%乙醇 | 62 | 90 | nd | 5.4 |
所用缩写:nd--不确定;%D--D型杂质百分率 |
pH值为10时,不同氨浓度(0.5、0.75、1.0、1.25、1.5及2M)对GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)的酰胺化裂解的影响采用以下反应条件来加以检测:4mg/ml GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)、2.5mM DTT、1mM CaCl2、45℃、酶与底物的比率等于1∶190。其结果显示于下表Ⅵ。1.0、1.25和1.5M这三种氨浓度的产量相似(分别为43、45和44%)。各种情况的D型杂质产量均为4.2%,并且各自的比例也基本相同。
表Ⅵ
氨浓度的影响
实施例12--铵的平衡离子对转酰胺作用的影响
NH4OH浓度(M) | 最大值a(%) | 时间b(分钟) | GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OH | D型杂质d(%) |
0.5 | 34 | 30 | 1.6∶1 | 3.4 |
0.75 | 39 | 40 | 2.5∶1 | 3.5 |
1.0 | 43 | 60 | 4.4∶1 | 4.2 |
1.25 | 45 | 100 | 5∶1 | 4.2 |
1.5 | 44 | 140 | 5.6∶1 | 4.2 |
2.0 | 41 | 165 | 7.5∶1 | 4.3 |
a--GLP-1(7-36)NH2的最大值;b--达到最大值的时间;c--达到最大值时的GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OH比率;d--达到最大值时由于产物经D型氨基酸形成而降解产生的D型杂质的百分率。 |
对氨试剂中不同平衡离子的存在对转酰胺作用的影响进行检测。对反应的pH值进行一式二份调节,即分别在含有氯化铵、醋酸铵和硫酸铵的情况下进行反应d在含有2.5mM DTT、1mM CaCl2的45℃反应介质中对GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1;1.28mg/ml)一式二份进行酰胺化裂解反应,反应介质中的酶底物比率为1∶190,并且用盐酸、醋酸或硫酸将1.25M NH4OH的pH值调至10.0。
结果显示于下表Ⅶ。各反应的产物量都几乎相同,D型杂质的量也几乎相同,因此,平衡离子的性质似乎对产生GLP-1(7-36)NH2的酰胺化作用没有影响。
表Ⅶ
铵的平衡离子的影响
实施例13--CaCl2浓度对转酰胺作用的影响
平衡离子 | GLP-1(7-36)NH2的产量a | D型杂质百分率b |
Cl- | 51% | 4.7% |
OAc- | 51% | 4.8% |
SO4 = | 42% | 4.0% |
a--150分钟后,反应均未达到最大值;b--由于产物经D型氨基酸形成而降解产生的D型杂质的百分率。 |
在含有0、0.1、1.0和10mM CaCl2的反应体系中对GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1;1和5mg/ml)的酰胺化裂解进行检测(表Ⅷ),反应体系中含有1.25M NH4OH和2.5mM DTT,并用HCl调至pH10.0,酶与底物的比率为1∶200。在不添加钙的情况下观测不到活性。因此,这种阳离子是活性所必需的,并且0.1mM以上的浓度不会影响转酰胺作用的产量。
表Ⅷ
CaCl2浓度对酰胺化裂解的影响
实施例14--酶浓度对酰胺化裂解的影响
CaCl2浓度(mM) | 底物浓度(mg/ml) | 最大值a(%) | GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OHb |
0 | 1 | NA | NA |
0.1 | 1 | 60 | 4.6∶1 |
1.0 | 1 | 59 | 4.4∶1 |
10 | 1 | 59 | 4.4∶1 |
0 | 5 | 2 | - |
2 | 5 | 47 | 4.3∶1 |
NA--无活性:a--GLP-1(7-36)NH2的最大值;b--达到最大值时的GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OH |
在酶/底物比率为1∶200、1∶400、1∶800;及1∶400的情况下对GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1;1mg/ml)的酰胺化裂解进行检测(表Ⅸ),反应是于45℃下在用HCl调至pH10.0并处于氮气环境下的1.25M NH4OH、2.5mM DTT和0.5mM CaCl2中进行,并按实施例1所述加以分析。所有情况下的GLP-1(7-36)NH2产量均为50-60%,但在酶与底物的比率较低时,达到最大值所需的时间要长得多,在比率为1∶800时所需时间达360分钟。尽管在较高底物浓度下的反应产生的产物较少并且达到最大值所需的时间较长,但其产量仍然很可观。由于在高pH值条件下的反应时间加长,所以D型杂质的量也增加,这与底物和产物在碱性pH下暴露过长时间后的预期结果相符。
表Ⅸ
酶/底物比率
实施例15--梭菌蛋白酶活性所必需的硫醇还原作用
底物浓度a(mg/ml) | 酶/底物比率 | 最大值b(%) (分钟) | D型杂质c(%) |
1 | 1∶200 | 59 90 | 3% |
1 | 1∶400 | 60 190 | 4.5% |
1 | 1∶800 | 58 360 | 6% |
5 | 1∶400 | 51 90 | nd |
a--GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(序列编号:1)。b--GLP-1(7-36)NH2的最大值及其出现时间。c--达到最大值时的D型杂质百分率(由于产物经D型氨基酸形成而降解产生)。 |
为了获得最大活性,通常需利用硫醇对梭菌蛋白酶进行处理。在硫醇,DTT,的浓度为0、0.5、1.0、2.5和5.0mM的情况下对其浓度进行检测。酰胺化反应的条件为:1mg/ml GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse、1.25M NH4OH并用HCl调至pH10.0、0.5mM CaCl2、45℃、顶部喷射氮气、酶与底物的比率为1∶400,并且如实施例1所述对反应结果进行分析。
在不添加DTT的情况下,酰胺化产物GLP-1(7-36)NH2的产量仅为20%。当在添加有0.5-5mM DTT的情况下进行反应时,所有反应产生的GLP-1(7-36)NH2均约为60%。因此,为了获得酰胺化裂解的最佳产量,必需用还原剂,如硫醇,对酶进行还原。实施例16--其它精氨酸特异性蛋白酶的酰胺化作用
将GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(0.5-2mg/ml)溶解在pH10和pH8.5的1M氢氧化铵中,并分别与6种不同的蛋白水解酶共保温,这6种蛋白水解酶中有5种与梭菌蛋白酶类似,可在精氨酸残基的羧基肽键位置将肽特异性裂解。其中包括胰蛋白酶、凝血酶、组织蛋白酶B(在pH5.5下也进行了测试)、凝血因子Xa、纤溶酶和木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶,它对精氨酰键不具有特异性。通过如实施例1所述进行的反相层析测定发现,这些蛋白酶都没有产生任何的GLP-1(7-36)NH2。酶:底物比率为1∶50-1∶100,并且在适当情况下还加入了蛋白酶特异性添加剂(如氯化钙)。在这些条件下只有梭菌蛋白酶产生了可检测的GLP-1(7-36)NH2。实施例17--梭菌蛋白酶的亲和纯化
通过亲和层析(Ullman et al.,Biol.Chem.Hoppe-Seyler,375,89-92(1994))对梭菌蛋白酶进行纯化,纯化使用的柱子是将Toyopearl TSKgel AF-Red树脂装在加有套管的内径1.2cm的柱中,柱床高度11cm。缓冲液A(25mM Hepes、5mM CaCl2,pH8)和缓冲液B(25mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH8)经过0.45μm尼龙滤膜过滤并真空抽气10分钟。
将梭菌蛋白酶(57.3mg;Worthington)以14.5mg/ml的浓度溶解于3ml含有15%缓冲液B的缓冲液A中,并加到已利用含有15%缓冲液B的缓冲液A平衡的柱中,流速为1ml/分钟。用含有15%缓冲液B的缓冲液A洗柱5分钟,然后用含有15%-100%线性梯度缓冲液B的缓冲液A洗脱40分钟。收集组分并利用梭菌蛋白酶的催化酰胺化能力鉴定出含有该酶的组分,将这些组分合并,再加入二硫苏糖醇至5mM,然后通过超滤浓缩至5mg/ml。实施例18--梭菌蛋白酶在Toyopearl AF-Formyl-650M树脂上的固定
把含有防腐剂的Toyopearl AF-Formyl-650M树脂混悬液加到带有45μm裂缝的一次性10ml柱子中,用2倍柱体积的0.1M Mes缓冲液、5mM CaCl2,pH5清洗。用等体积的0.1M Mes将上文溶解于5mMHepes,pH8的纯化梭菌蛋白酶稀释至最终pH值为5.5,再加到已排干的树脂中。然后加入氰基硼氢钠(1M加150μl),将柱加盖后在23-25℃下连续颠倒20小时,使树脂混悬液充分混合。将柱排干,保留洗脱液用于分析,并用2倍柱体积的1M Tris-HCl、5mM CaCl2、pH7.8清洗树脂。然后加入1倍柱体积的该缓冲液和50μl氰基硼氢钠,并将混合物混合1小时。然后用10倍柱体积的1M NaCl、25mM Hepes、5mM CaCl2,pH8清洗树脂,再用相同体积的不含NaCl的缓冲液清洗。通过溶液中酶损失量的测量对所得梭菌蛋白酶树脂制品进行分析,结果表明每ml树脂结合有1.8-4.4mg酶。梭菌蛋白酶树脂在使用前保存在4℃的该缓冲液中。
在其它树脂上固定化的梭菌蛋白酶同样获得了类似的结果。其实例包括醛型树脂Toyopearl Amino Link和Toyopearl Formyl 650M(Toso Haas,Inc.)以及氮杂内酯型树脂Ultra Link(Pierce)。这些树脂可以与该酶的游离氨基结合。含有固定化梭菌蛋白酶的所有这些树脂将GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse酰胺化裂解成GLP-1(7-36)NH2的产量可高达77%,一般为50-60%。实施例19--由固定化梭菌蛋白酶催化的反应
将悬于50mM Hepes、5mM CaCl2,pH8.5的固定有梭菌蛋白酶的树脂(40ml)加载到配有液流转换接头和蠕动泵并带有内径2.5cm的玻璃套管的柱中,流速35ml/分钟。用47℃的水循环流经套管。然后在47℃和pH8.5条件下用200ml 1mM DTT、1mM CaCl2清洗树脂,流速8ml/分钟。之后即可将柱用于酰胺化裂解。
对GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse的连续酰胺化裂解使用图6所示的装置。在47℃水浴中将溶解在含有1.25mM HCl的7.5%水性乙腈(溶液1)中的底物溶液(13L,浓度为0.65mg/ml)平衡,并连接至管道1的蠕动泵,该管道的出口连至T形接头1。制备2.5MNH4OH、2mM DTT、2mM CaCl2溶液13L,并用浓HCl调pH至10.0(“溶液2”),置于47℃水浴中并连接至管道2的蠕动泵,然后连接到T形接头1。与泵相连的管道3负责将室温的溶液3(1.25M HCl)输送至蠕动泵,然后经管道连接到T形接头2,该T形接头与柱体的流出物相连。T形接头2的出口用来收集反应产物。在实施过程中,泵的管线为内径0.125的聚乙烯管,管道1、2和3的泵速相同,均约为3-6ml/分钟。泵出的溶液1和溶液2在T形接头1位置汇合,混合后形成pH10的混合物,然后该所得溶液流出T形接头1并进入柱体。该溶液流经柱体后进入T形接头2,其流速约为6ml/分钟。柱的流出液在T形接头2位置与1.25M HCl溶液混合,从而使含有GLP-1(7-36)NH2的反应液的pH值降低至约8.5。在所使用的流速下,底物和产物与树脂相接触的时间约为5分钟。通过这种方式可以使底物和/或产物在pH10水性条件下的暴露时间不超过约5分钟。
在实施过程中可对流速进行调节,以产生最大量的产物或最少量的杂质,这可通过对流至T形接头2的流出物的反复取样并如实施例1所述进行HPLC分析的方法来加以评定。图7显示在上述条件下的反应结果,其中的产量和柱体流速随实验时间的不同而改变。在14ml/分钟的净流速下,GLP-1(7-36)NH2的平均产量接近50%,最大值接近64%。如果流速太快,如44ml/分钟,则产量下降至34%。流速回落至16ml/分钟,则产量也恢复到接近50%。
当产物形成不处于最佳状况时,若产物生成量低则降低流速,这样可以使底物溶液更长时间地暴露于结合有梭菌蛋白酶的树脂,若由于Lys34位置裂解而产生的GLP-1(7-34)的量增加,则显然暴露于酶的时间过长,此时可以提高流速。此外,该领域技术人员还应该了解,用于中和的HCl的浓度、底物浓度、温度、有机溶剂浓度以及可影响固定化梭菌蛋白酶速度的其它因素可有多种不同的变化来实现最佳的产物形成。实施例20--固定化的酰胺化裂解:柱参数的影响
表X显示用固定化梭菌蛋白酶在两种不同树脂上进行的一系列反应,其中列表显示了流速、GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse浓度、温度、树脂量和GLP-1(7-36)NH2产量对反应的影响,反应除使用1×15cm柱之外,其余的方法和条件与实施例19类似。其结论是,降低温度一般会导致产量降低(将前4个在23℃下反应的结果与在45℃下反应的结果相比),流速(将第1与第2、第3与第4、第6与第7个结果进行比较)以及GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse浓度的明显改变也会导致相同结果。柱反应的这些参数以及其它参数的改变会使产量发生变化。在该项研究中,产量随反应所用精确条件的不同而在4-63%之间改变,这表明可通过改变柱反应的不同参数来实现反应的最佳化。
表Ⅹ
酶反应器测试的比较
基本树脂 | GLP-1(7-36)APAHse(mg/ml) | 流速(ml/分钟) | 产量% | 温度 |
1.AminoLink | 0.1 | 1 | 56% | 23℃ |
2.AminoLink | 0.14 | 0.1 | 24% | 23℃ |
3.AminoLink | 1 | 0.1 | 4% | 23℃ |
4.AminoLink | 1 | 4 | 11% | 23℃ |
5.AminoLink | 0.14 | 0.5 | 61% | 45℃ |
6.AminoLink | 1 | 4 | 48% | 45℃ |
7.AminoLink | 1 | 3 | 57% | 45℃ |
10.AminoLink | 0.1 | 3 | 63% | 45℃ |
11.AminoLink | 0.25 | 2 | 50% | 45℃ |
12.ToyopearlFormyl | 0.25 | 2-4 | 60% | 45℃ |
13.UltraLink | 0.25 | 1 | 46% | 45℃ |
表Ⅹ续
14.ToyopearlFormyl | 0.25 | 2 | 62% | 45℃ |
15.ToyopearlFormyl | 0.5 | 2 | 57% | 45℃ |
16.ToyopearlFormyl | 1 | 2 | 53% | 45℃ |
本发明采用了多种特定的和说明性的实施方案和技术来加以描述。但应该了解的是,本发明在不脱离其主旨和范围的前提下可有多种改变和调整。
Claims (25)
1.一种方法,用于产生具有C端α-羧酰胺基团的多肽,该方法包括:
将(ⅰ)一种含有(a)氨试剂和(b)至少含有一个核心氨基酸序列拷贝的多肽底物,其中该核心氨基酸序列具有一个C端精氨酸残基,该精氨酸残基通过肽键由其α-羧基与邻近氨基酸残基的α-氨基相结合,的基本属于水性的介质与(ⅱ)梭菌蛋白酶相接触,以裂解肽键并产生具有C端Arg-NH2残基的多肽产物。
2.权利要求1的方法,其中基本属于水性的介质至少含有约占其体积的80%的水。
3.权利要求1的方法,其中基本属于水性的介质含有不超过约占其体积的10%的有机溶剂。
4.权利要求1的方法,其中基本属于水性的介质基本上不含有机溶剂。
5.权利要求1的方法,其中氨试剂所含的氨盐选自氯化铵、氢氧化铵、醋酸铵、硫酸铵及其混合物。
6.权利要求1的方法,其中基本属于水性的介质至少含有约0.5M的氨试剂。
7.权利要求1的方法,该方法包括在约4-80℃的温度下将多肽底物和氨试剂与梭菌蛋白酶相接触。
8.权利要求1的方法,其中核心氨基酸序列含有GLP-1(7-35)-Arg。
9.权利要求8的方法,其中核心氨基酸序列含有GLP-1(7-35)Arg-Ala-Phe-Ala。
10.权利要求9的方法,其中核心氨基酸序列含有GLP-1(7-35)Arg-Ala-Phe-Ala-Hse或GLP-1(7-35)Arg-Ala-Phe-Ala-Met-His-Ala-Glu。
11.权利要求11的方法,其中核心氨基酸序列含有GLP-1(7-35)-Arg-Xaa-R的一段氨基酸序列,其中Xaa为一种氨基酸残基,并且R为一种α-羧基封端基团。
12.权利要求1的方法,其中多肽底物至少含有两个核心氨基酸序列拷贝。
13.权利要求12的方法,其中核心氨基酸序列的相邻拷贝通过一种接头序列相连接。
14.权利要求1的方法,该方法包括在pH值约为9.0-11.0的基本属于水性的介质中将多肽底物和氨试剂与梭菌蛋白酶相接触。
15.权利要求1的方法,其中基本属于水性的介质进一步含有CaCl2。
16.权利要求1的方法,其中基本属于水性的介质进一步含有还原剂。
17.权利要求1的方法,其中还原剂包括硫醇。
18.权利要求17的方法,其中硫醇的选择集合包括二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、2-巯基乙醇、巯基乙酸、半胱氨酸、谷胱甘肽及其混合物。
19.权利要求1的方法,其中梭菌蛋白酶是一种固定形式的梭菌蛋白酶。
20.一种方法,用于产生具有C端α-羧酰胺基团的多肽,该方法包括:
提供一种含有多肽底物的基本属于水性的第一介质,其中的多肽底物至少含有一个核心氨基酸序列,其中该核心氨基酸序列具有一个C端精氨酸残基,该精氨酸残基通过α-羧基肽键与邻近的氨基酸残基相结合;
将基本属于水性的第一介质与含有氨试剂的碱性介质相混合,以形成pH值至少约为9.0的基本属于水性的第二介质;以及
将基本属于水性的第二介质与固定化梭菌蛋白酶相接触,以在α-羧基肽键位置裂解多肽底物并产生一种含有多肽产物的基本属于水性的产物介质,其中多肽产物具有C端Arg-NH2残基。
21.权利要求20的方法,其中基本属于水性的第二介质具有约9.0-11.0的pH值。
22.权利要求20的方法,该方法进一步包括调节基本属于水性的产物介质的pH值,以形成一种含有多肽产物并且pH值不超过约8.5的基本属于水性的第三介质。
23.权利要求22的方法,其中接触步骤包括将基本属于水性的第二介质与固定化梭菌蛋白酶接触不超过约20分钟。
24.权利要求20的方法,其中核心氨基酸序列含有GLP-l(7-35)-Arg。
25.权利要求20的方法,该方法进一步包括,用硫醇、CaCl2或其混合物对固定化梭菌蛋白酶进行活化,以形成活化的固定化梭菌蛋白酶;并且接触步骤包括将基本属于水性的第二介质与活化的固定化梭菌蛋白酶相接触。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10731198P | 1998-11-06 | 1998-11-06 | |
US60/107,311 | 1998-12-16 | ||
US09/212,663 US6461834B1 (en) | 1998-11-06 | 1998-12-16 | Clostripain catalyzed amidation of peptides |
US09/212,663 | 1998-12-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1325455A true CN1325455A (zh) | 2001-12-05 |
Family
ID=26804650
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN99812904A Pending CN1325455A (zh) | 1998-11-06 | 1999-11-05 | 肽的酶促酰胺化 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6461834B1 (zh) |
EP (1) | EP1127155A1 (zh) |
JP (1) | JP2002529101A (zh) |
KR (1) | KR20010099668A (zh) |
CN (1) | CN1325455A (zh) |
AU (1) | AU755130B2 (zh) |
CA (1) | CA2349527A1 (zh) |
CZ (1) | CZ20011523A3 (zh) |
HU (1) | HUP0104178A3 (zh) |
IS (1) | IS5932A (zh) |
MX (1) | MXPA01004526A (zh) |
NO (1) | NO20012232L (zh) |
WO (1) | WO2000028067A1 (zh) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1158304C (zh) * | 2001-05-10 | 2004-07-21 | 上海华谊生物技术有限公司 | 蛙皮抗菌肽衍生物 |
IL160917A0 (en) * | 2001-10-18 | 2004-08-31 | Bristol Myers Squibb Co | Human glucagon-like-peptide-1 mimics and their use in the treatment of diabetes and related conditions |
US7238671B2 (en) | 2001-10-18 | 2007-07-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Human glucagon-like-peptide-1 mimics and their use in the treatment of diabetes and related conditions |
EP1513945A4 (en) * | 2002-05-24 | 2008-12-24 | Restoragen Inc | PROCESS FOR UNIVERSAL ENZYMATIC PRODUCTION OF BIOACTIVE PEPTIDES |
CA2485701A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Fred W. Wagner | Method for enzymatic production of glp-1 (7-36) amide peptides |
EP1572720A4 (en) * | 2002-05-24 | 2008-12-24 | Nps Allelix Corp | PROCESS FOR THE ENZYMATIC PRODUCTION OF GLP-2 (1-34) AND GLP-2 (1-33) PEPTIDES |
RS52246B (en) * | 2003-11-21 | 2012-10-31 | Nycomed Gmbh | PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF PEPTIDE 2 LIKE GLUCAGON AND THEIR ANALOGS |
DE102004058306A1 (de) * | 2004-12-01 | 2006-07-27 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Carboxy-terminal amidierten Peptiden |
DK2154151T3 (da) * | 2005-09-19 | 2011-09-05 | Allergan Inc | Clostridiumtoksinaktiverbare clostridiumtoksiner |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4568640A (en) | 1981-05-11 | 1986-02-04 | Harvey Rubin | Method of inserting amino acid analogs into proteins |
GB8314362D0 (en) | 1983-05-24 | 1983-06-29 | Celltech Ltd | Polypeptide and protein products |
JPS6229997A (ja) | 1985-04-08 | 1987-02-07 | Sankyo Co Ltd | C末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法 |
US5416007A (en) | 1987-03-20 | 1995-05-16 | Creative Biomolecules, Inc. | Enhanced proteolytic cleavage of recombinant fusion proteins |
DK15888D0 (da) | 1988-01-14 | 1988-01-14 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Enzymatisk fremgangsmaade til fremstilling af immunmodulerende pentapeptider samt mellemprodukter til brug ved fremgangsmaaden |
GB8829432D0 (en) | 1988-12-15 | 1989-02-01 | Celltech Ltd | Enzymatic process |
US5252464A (en) | 1989-03-14 | 1993-10-12 | Carlsberg Biotechnology Ltd. A/S | Process for producing pentapeptides and intermediates for use in the synthesis |
DE3918125A1 (de) * | 1989-06-03 | 1990-12-06 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur modifizierung von proteinen und danach erhaeltliche modifizierte proteine |
JP3262329B2 (ja) | 1990-01-24 | 2002-03-04 | アイ. バックレイ,ダグラス | 糖尿病治療に有用なglp―1アナログ |
US5595887A (en) | 1990-07-16 | 1997-01-21 | Bionebraska, Inc. | Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment |
US5202239A (en) | 1990-08-07 | 1993-04-13 | Scios Nova Inc. | Expression of recombinant polypeptides with improved purification |
FI103805B1 (fi) * | 1990-09-05 | 1999-09-30 | Hoechst Ag | Menetelmä preproinsuliinien hydroloimiseksi |
EP0518088A2 (de) | 1991-05-23 | 1992-12-16 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Clostripain-katalysierten Verknüpfung von Arg-Pro und Arg-B (B=proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren) enthaltenden Peptiden |
AT396937B (de) | 1992-04-06 | 1993-12-27 | Immuno Ag | Verfahren zur aktivierung von blutgerinnungsfaktoren |
ATE225801T1 (de) | 1992-07-13 | 2002-10-15 | Bionebraska Inc | Verfahren zur modifizierung rekombinanter polypeptide |
US5332503A (en) | 1993-04-16 | 1994-07-26 | Baxter International Inc. | Process for purifying collagenase |
US6187579B1 (en) | 1993-10-28 | 2001-02-13 | Carlsberg A/S | Customized proteases |
DK144093D0 (zh) | 1993-12-23 | 1993-12-23 | Novo Nordisk As | |
AU4415796A (en) * | 1994-12-07 | 1996-06-26 | Bionebraska, Inc. | Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs |
-
1998
- 1998-12-16 US US09/212,663 patent/US6461834B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-11-05 CN CN99812904A patent/CN1325455A/zh active Pending
- 1999-11-05 KR KR1020017004269A patent/KR20010099668A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-11-05 EP EP99956920A patent/EP1127155A1/en not_active Withdrawn
- 1999-11-05 CZ CZ20011523A patent/CZ20011523A3/cs unknown
- 1999-11-05 AU AU13423/00A patent/AU755130B2/en not_active Ceased
- 1999-11-05 MX MXPA01004526A patent/MXPA01004526A/es unknown
- 1999-11-05 CA CA002349527A patent/CA2349527A1/en not_active Abandoned
- 1999-11-05 WO PCT/US1999/026060 patent/WO2000028067A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-11-05 HU HU0104178A patent/HUP0104178A3/hu unknown
- 1999-11-05 JP JP2000581233A patent/JP2002529101A/ja active Pending
-
2001
- 2001-05-02 IS IS5932A patent/IS5932A/is unknown
- 2001-05-04 NO NO20012232A patent/NO20012232L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MXPA01004526A (es) | 2002-09-18 |
CA2349527A1 (en) | 2000-05-18 |
WO2000028067A9 (en) | 2000-10-19 |
EP1127155A1 (en) | 2001-08-29 |
AU1342300A (en) | 2000-05-29 |
WO2000028067A1 (en) | 2000-05-18 |
HUP0104178A3 (en) | 2003-01-28 |
CZ20011523A3 (cs) | 2002-02-13 |
AU755130B2 (en) | 2002-12-05 |
KR20010099668A (ko) | 2001-11-09 |
HUP0104178A2 (hu) | 2002-02-28 |
JP2002529101A (ja) | 2002-09-10 |
IS5932A (is) | 2001-05-02 |
NO20012232D0 (no) | 2001-05-04 |
US6461834B1 (en) | 2002-10-08 |
NO20012232L (no) | 2001-05-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2302882C2 (ru) | Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками | |
Wong et al. | New developments in enzymatic peptide synthesis | |
CN1252836A (zh) | 修饰的羧肽酶 | |
CN1325455A (zh) | 肽的酶促酰胺化 | |
JP2011139667A (ja) | プロリンおよびβ−アラニンをN末端に有するジペプチド、及びその環化ジペプチドの酵素合成法 | |
JPS642360B2 (zh) | ||
CN1090238C (zh) | 生产酶的方法 | |
US20120107870A1 (en) | Selective enzymatic amidation of c-terminal esters or acids of peptides | |
Clapés et al. | Peptide bond formation by the industrial protease, neutrase, in organic media | |
CN1063795C (zh) | 制备胰高血糖素的方法 | |
čeřovský et al. | Enzymatic semisynthesis of dicarba analogs of calcitonin | |
IE883462L (en) | A method for the selective cleavage of fusion proteins | |
JPH04311390A (ja) | ペプチドアミダーゼおよびその用途 | |
Son et al. | Effects of β-mercaptoethanol and hydrogen peroxide on enzymatic conversion of human proinsulin to insulin | |
US6428997B1 (en) | Aminopeptidase derived from Bacillus licheniformis and process for preparation of natural type proteins | |
Krieg et al. | Enzymatic peptide synthesis by the recombinant proline-specific endopeptidase from Flavobacterium meningosepticum and its mutationally altered Cys-556 variant | |
CN1353757A (zh) | α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的微生物学生产方法 | |
CN114657196B (zh) | 一种猪胰蛋白酶原突变体及其在毕赤酵母中的表达 | |
Katoh et al. | High yield refolding of lysozyme and carbonic anhydrase at high protein concentrations | |
CN111088243B (zh) | 一种氨肽酶LapA定点突变蛋白及其应用 | |
CN1353755A (zh) | 用气单胞菌氨肽酶由多肽除去n末端丙氨酸残基的方法 | |
US7098018B2 (en) | Aminopeptidase derived from bacillus licheniformis, gene encoding the aminopeptidase, expression vector containing the gene, transformant and method for preparation thereof | |
CN114181993A (zh) | 产生基于类泛素或泛素蛋白的生化工具的方法 | |
ZA200102694B (en) | Enzymatic amidation of peptides. | |
Miyazawa et al. | Peptide synthesis using carbamoylmethyl esters as acyl donors mediated by Bacillus amyloliquefaciens protease |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |