MXPA01004526A - Amidacion enzimatica de peptidos. - Google Patents

Abstract

La invencion provee un metodo para producir un polipeptido que tiene un grupo alfa- carboxiamida C-terminal. Se refiere en particular a una modificacion enzimatica de polipeptidos de substrato seleccionados, que da por resultado la division del polipeptido de substrato para formar un peptido producto con un residuo arginina C-terminal, que tiene un grupo alfa-carboxiamida ("Arg-NH2" C-terminal). El metodo incluye poner en contacto una solucion de base acuosa que incluye (i) reactivo amoniaco y (ii) el polipeptido de substrato, con (iii) clostripaina.

Description

AMIDACIÓN ENZIMÁTICA DE PÉPT1DOS ANTECEDENTES DE LA I NVENCIÓN La manipulación de ADN in vitro permite la transferenci de información genética ajena en una célula anfitriona, para efectua la expresión eficiente de proteínas endógenas y ajenas, en una gra variedad de células anfitrionas, tales como anfitriones microbianos Las técnicas de ADN recorhbinante han hecho posible la selección , l amplificación y la manipulación de la expresión de proteínas péptidos. Sin embargo, no se puede lograr algunas modificacione en una proteína o péptido recombinantemente producidos, alterand la secuencia de AD N . Muchas proteínas y péptidos que ocurre naturalmente contienen un residuo aminoácido C-terminal que tien un grupo alfa-carboxiamida; pero el grupo amida no es producid directamente por medio de expresión. Más bien se produce un proteíria precursora, mediante la expresión genética, y se introduc la amida in vivo mediante modificación enzimática de lá proteín precursora. Existe una variedad de métodos in vitro para converti un grupo ácido alfa-carboxílico C-terminal a un grupo alfa carboxiamida; sin embargo, los métodos disponibles en gener tienen limitaciones, por lo que respecta a muchos factores, tale como las condiciones de la reacción, la selectividad, el tipo d reactivo o reactivos empleado(s) y/o los ti pos de substratos qu pueden ser usados. Además, muchas proteínas y oligopéptidos pequeños ajenos, no pueden ser sobreproducidos satisfactoriamente en l mayoría de los anfitriones celulares, puesto que los anfitrione pueden reasimilar el péptido después de la expresión. Por ejempl cuando el tamaño del péptido deseado no tiene una longitud mayo que aproximadamente 60 a 80 unidades de aminoácido, ocurr habitualmente degradación en lugar de acumulación del product final. En respuesta a este problema, se ha expresado lo péptidos pequeños típicamente como parte de proteínas de fusió que incluyen un segundo péptido más grande (por ejemplo, beta galactosidasa o cloranfenicol-acetil-transferasa) o como un construcción recombinante que incluye copias múltiples del péptid deseado (una construcción de copias múltiples). En cualquier cas la construcción inicialmente expresada por lo general necesita s dividida para producir el péptido o los péptidos deseados. Mu frecuentemente, se divide la construcción recombinante par producir uno o más péptidos precursor(es), que pueden s sometidos después a modificación posterior a la translación, par producir el/los péptido(s) deseado(s). Sería extremadament ventajoso tener uno o más métodos adicionales, que permitiera llevar a cabo la división de un precursor péptido simultáneament con la introducción de un grupo alfa-carboxiamida en el residuo d aminoácido C-terminal del producto dividido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refíere a un método para producir polipéptido que tiene un grupo alfa-carboxiamida C-terminal. relaciona en particular con una modificación enzimática polipéptidos de substrato, que contienen arginina, seleccionado que dan por resultado la división del polipéptido de substrato pa formar un polipéptido producto que tiene un grupo alfa-carboxiami C-terminal. El método incluye poner en contacto una soluci sustancialmente acuosa, que incluye: (a) el polipéptido de substra ("el primer polipéptido") y (b) reactivo amoniaco, con (c) clostripaín El polipéptido de substrato incluye por lo menos una copia de u secuencia central de aminoácido, e incluye típicamente más de u copia de la secuencia central de aminoácido (es decir, u construcción de copias múltiples) . El residuo C-terminal de secuencia central de aminoácido es un residuo arginina, que es unido al residuo de aminoácido adyacente, por medio de una uni de péptido alfa-carboxílico (es decir, una ligadura "Arg-Xa peptídica). Puesto que la clostripaína es una endopeptidasa, residuo aminoácido Xaa representa un residuo de aminoácido q tiene su grupo alfa-carboxílico unido a otro residuo de aminoácido, través de una ligadura peptídica ("Arg-Xaa-Xaa' ") o bien a un gru bloqueador de carboxilo ("Arg-Xaa-R"). Los grupos bloqueadores carboxilo son grupos funcionales orgánicos que reemplazan funcionalidad ácido del ácido carboxílico (la porción "-OH" del gru -C(O)OH), y son capaces de ser d ivididos o hidrolizados par regenerar un grupo ácido carboxílico ("grupo -C(O)OH"). Lo ejemplos de grupos bloqueadores de carboxilo incluyen los grupo que incluyen la porción alcoxi de un grupo éster (por ejemplo, l porción etoxi o benciloxi de un grupo .-C(O)OR) y la porción -N RR de una ligadura amida no peptídica (por ejemplo, la porción NRR' d un grupo -C(O)NRR'). La porción NRR' puede estar no sustituida ( sea NH2) o puede estar sustituida con uno o dos sustituyentes (po ejemplo, NHEt o Nme2). Cuando un polipéptido de substrato en un solución de base acuosa, es puesto en contacto con el reactiv amoniaco en presencia de clostripaína, se divide el polipéptido d substrato en la ligadura peptídica alfa-carboxilo del residuo arginina y se produce un segundo polipéptido ("el polipéptido producto") qu tiene un residuo arginina C-terminal que contiene un grupo alfa carboxiamida ("residuo Arg-NH2"). Como se emplea en la presente, el término "reactiv amoniaco" se refiere a un reactivo que incluye "amoniaco libr disuelto" (o sea, NH3 disuelto en la solución acuosa) y/o es capaz d liberar amoniaco disuelto libre en una solución acuosa, baj condiciones en las que la clostripaína dividirá de manera amidant un péptido que contiene arginina. Por ejemplo, el reactivo amoniac puede incluir una o más sales de amoniaco en equilibrio co amoniaco libre disuelto. Las cantidades relativas de amoniaco libr " y las diversas sales generalmente serán una función de diverso parámetros, bien conocidos por los expertos en la materia, tale como: el pH de la solución, las concentraciones relativas d diferentes aniones presentes en la solución y/o la solubilidad d sales individuales particulares de amoniaco. Puesto que el pKa de amoniaco ("NH3") es aproximadamente 9.2 en solución acuosa, un porción sustancial del reactivo amoniaco generalmente estar presente como amoniaco libre, a valores de pH aproximados de 9 más. En soluciones con un pH superior al pKa del amoniaco, más d la mitad del amoniaco generalmente estará presente ya sea com amoniaco libre disuelto o como hidróxido de amonio ("N H4OH") También se entenderá que la porción anión de una sal de amoniac generalmente sufrirá un cambio muy rápido con otros anione presentes en una solución dada. Así pues, si una solución acuosa pH 10.0 incluye una o más sales cloruro ("CI"*), una o más sale acetato ("Oac"") y una o más sales sulfato ("SO ""), el reactiv amoniaco en esta solución probablemente incluirá cloruro de amoni ("NH4CI"), acetato de amonio ("NH4OAc") y sulfato de amoni ("(NH4)2OH"), así como amoniaco libre disuelto e hidróxido de amoni ("NH4OH"). El método de la presente emplea típicamente el medio d reacción de base acuosa, que incluye por lo menos aproximadament 0.5 M de reactivo amoniaco. Parece que una concentración d reactivo amoniaco de aproximadamente 0.75M a 1 .5M alcanza u equilibrio entre el punto óptimo de la velocidad y el rendimiento de l formación de producto amidado, al mismo tiempo que evita l inhibición sustancial de la actividad enzimática. Como se emple aquí, se basa el reactivo amoniaco en los equivalentes de NH3 libr disuelto que están presentes en el medio. Una modalidad del método de la presente incluye formar una solución del polipéptido de substrato en un primer medio de base acuosa, que tiene un pH no mayor que aproximadamente 8.5, y, de preferencia, que tiene un pH sustancialmente neutro. Se puede dividir el polipéptido de substrato en la ligadura peptídica alfa-carboxilo, para producir el polipéptido producto que tiene un residuo Arg-NH2 C-terminai, ajustando el pH de la solución a por lo menos aproximadamente 9.0 y, típicamente, entre alrededor de 9.0 y alrededor de 1 1 .0; y poniendo en contacto el polipéptido con una forma inmovilizada de clostripaína ("clostripaína inmovilizada") en presencia de reactivo amoniaco. De preferencia se pone en contacto el substrato y el reactivo amoniaco con la clostripaína inmovilizada durante no más de unos veinte minutos y, más preferible, durante no más de unos cinco minutos. Típicamente se mezcla el primer medio de base acuosa con una solución acuosa básica ("medio alcalino") para elevar el pH poco antes de que se pongan en contacto el polipéptido de substrato , y el reactivo amoniaco, con la clostripaína inmovilizada. Una manera de poner en práctica esta modalidad de la invención es' empacar resina q ue contiene clostripaína inmovilizada, en una columna de cromatografía. Se mezcla la solución maestra de substrato y soluciones básicas , justo antes de introducirlas a la columna, reduciendo de esa manera la exposición del polipéptido de substrato al elevado pH de la solución acuosa. En una modalidad típica de la invención , la solución acuosa básica incluye el reactivo amoniaco.

Sin embargo, esto no es necesario, ya que algo o la totalidad de reactivo amoniaco también puede estar presente en el medio d reacción, antes de elevar el pH del medio de reacción a por lo meno alrededor de 9.0. En general también se prefiere ajustar el pH de la mezcl de reacción a un valor inferior a alrededor de 8.5 y, de preferencia, un pH sustancialmente neutro (por ejemplo, un pH aproximado de 6. a 8.0) poco después que se retire el polipéptido producto de contact con la enzima inmovilizada. Es típico que el pH de la mezcla d reacción que contiene el polipéptido producto se ajuste a alrededo de 8.5 o menos, tan pronto como la mezcla salga de la columna qu contiene el lecho de resina con clostripaína inmovilizada. Est disminuye las probabilidades de que el polipéptido producto s degrade bajo las condiciones acuosas a pH relativamente alto empleadas para la división amidante, catalizada con clostripaína. S sabe que los polipéptidos son susceptibles a la racemización y/o a l degradación por hidrólisis bajo condiciones acuosas a pH elevado. Es típicamente ventajoso seleccionar las condiciones baj las que se pone en contacto el polipéptido de substrato con l clostripaína inmovilizada, en presencia del reactivo amoniaco, a fi de reducir al mínimo el tiempo durante el que el substrato y e prod ucto están sujetos a condiciones de elevado pH . Se pued poner en práctica el método de la presente de una manera qu permite una conversión de alto rendimiento de substrato a product de división amidante, al mismo tiempo que se limita el tiempo que l solución de substrato/producto está en contacto con la enzim inmovilizada a un pH superior a alrededor de 8.5, a no más d alrededor de 30 minutos. Se prefiere llevar a cabo la divisió amidante de tal manea que la solución de substrato/producto esté un pH aproximado de 8.5 o más durante un tiempo no mayor qu aproximadamente 20 minutos y, más preferible, durante no más d alrededor de 5 minutos (por ejemplo, se lleva a cabo la reacción d división en alrededor de 2 a 5 minutos).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DI BUJ OS La figura 1 muestra una gráfica de las cantidade relativas de material de partida y de los productos, como una funció del tiempo para la amidación catalizada con clostripaína, de GLP 1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) a 37°C en 1 M de NH4OH , 2. mM de DTT, 1 mM de CaCI2, a pH 7.9. La figura 2 muestra una gráfica de las cantidade relativas de material de partida y de los productos, como una funció del tiempo para la amidación catalizada con clostripaína," de GLP 1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1 ) a 37°C en 1 M de NH4OH , 2. mM de DTT, 1 mM de CaCI2, a pH 9.0. La figura 3 muestra una gráfica de las cantidade relativas de material de partida y de los productos, como una funció del tiempo para la amidación catalizada con clostripaína, de GLP 1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1 ) a 37°C en 1 M de NH4OH 2.5 mM de DTT, 1 mM de CaCI2, a pH 9.6. La figura 4 muestra una gráfica de las cantidad relativas de material de partida y de los productos, como función d tiempo para la amidación catalizada con clostripaína, de GLP-1 ( 36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1 ) a 37°C en 1 M de NH4OH, 2.5 m de DTT, 1 mM de CaCI2, a pH 10.4. La figura 5 muestra una gráfica de las cantidad relativas de material de partida y de los productos, como una funció del tiempo, para la amidación catalizada con clostripaína, de GL 1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1 ) a 37°C en 1 M de NH4OH, 2. mM de DTT, 1 mM de CaCI2 a pH 1 1 .0. La figura 6 muestra una gráfica del rendimiento de GL 1 (7-36)NH2, como función de la velocidad de flujo en una divisió amidante catalizada con clostripaína, usando una forma inmovilizad de la enzima. La figura 7 muestra una representación esquemática d un aparato para llevar a cabo una amidación enzimática de u péptido que contiene Arg , usando clostripaína inmovilizada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El método de la presente permite la división amidante d un péptido de substrato que contiene un residuo arginina, pa formar un péptido producto que tiene un residuo arginina C-termina que' tiene un grupo alfa-carboxiamida ("Arg-NH2 C-terminal"). método inciuye poner eñ contacto el péptido de substrato co reactivo amoniaco en una solución sustancialmente acuosa, e presencia de clostripaíña. La enzima puede estar presente en form soluble o inmovilizada. Como se emplea aquí, el término "clostripaína" se refier tanto a las variedades naturales de la enzima como a sus versione modificadas. Las versiones modificadas retienen la capacida funcional de la clostripaína para dividir los péptidos que contiene arginina, de manera amidante, en la ligadura peptídica Arg-Xaa. Lo ejemplos de clostripaínas modificadas adecuadamente incluyen lo mutantes funcionales que difieren de una clostripaína natural por l sustitución, omisión y/o adición de uno o más residuos d aminoácido. Otros ejemplos de versiones adecuadament modificadas de clostripaína incluyen polipéptidos que representan u fragmento funcional de una clostripaína, que retiene la capacidad d dividir de manera amidante un péptido que contiene arginina, po ejemplo, un fragmento funcionalmente activo de una clostripaín natural, generado eliminando varios residuos de aminoácido d extremo amino y/o carboxilo de una o más de las subunidade constituyentes de la enzima. La clostripaína natural (clostridopeptidasa B) es una tiol endoproteasa extracelular, procedente de Clostridia. Esta proteas es un heterodímero y no es homologa con otras tiol-proteasa conocidas. Se informa que esta enzima tiene un peso molecul aproximado de 30,000 a 80,000 y típicamente tiene un punt isoeléctrico (pl) ap roximado de 4.8 a 4.9. La clostripaína fue aislad por primera vez de un filtrado de cultivo de Clostridium histolyticu (Mitchell y coautores, J. Biol. Chem. , 243(1 8): 4683-2602 (1968)) Se distingue la enzima por una elevada especificidad para la _ ligad uras peptídicas Xaa (especialmente las ligad uras Arg-Pro) tiene actividad tanto proteolítica cuanto de amidasa/esterasa. Po ejemplo, en la cadena B aislada de insulina , la clostripaína divide rompe la ligadura Arg-Gly 500 veces más rápido q ue la ligadura Lys Ala; y en el glucagón, la división ocurre únicamente en las unione Arg-Arg , Arg-Ala y Lys-Try. Las velocidades iniciales relativas d hidrólisis, de estas tres uniones son 1 , 1 /7 y 1 /300 (Labouesse, So Chem. Biol. , 42: 1 293 ( 1 960)) . Se sabe q ue la actividad de clostripaína es mod ulada p una variedad de activadores e inhibidores. Los ejemplos d activadores de clostripaína incluyen iones y mercaptanos, com cisteína, 2-mercaptoetanoI y ditiotreitol. También se sabe que l clostripaína es inhibida en presencia de tosil-L-lisin clorometilcetona, peróxido de hidrógeno, iones Co , Cu , Hg .2 + Cd2+, E DTA o citrato. Se puede preparar la clostripaína mediante fermentació usando microorganismos, por ejemplo, usando el método descrito e la patente estadounidense 5,728,543, cuya descripción qued incorporada aquí mediante esta referencia. En este proceso, s cultiva Clostridia hasta q ue se acumula la clostripaína en el medi nutriente. Son ejemplos adecuados las cepas de Clostridia : tal e como Clostridium histolyticum DSM 627. Los mutantes y variante de Clostridia también son adecuados, siempre y cuando lo microorganismos sean capaces de sintetizar clostripaína. Se lleva a cabo el cultivo anaeróbicamente, de maner individual o en cultivo mixto, por ejemplo, sumergido en un cultiv sin agitar, en ausencia de oxígeno, o en fermentadores, cuando se apropiado, bajo atmósfera de un gas inerte, tal como nitrógeno. E general se lleva a cabo la fermentación a una escala de temperatur de alrededor de 25°C a 40°C y a un pH entre 5 y 8.5. En general e caldo de cultivo muestra una acumulación detectable de enzim después de 1 a 3 días. La síntesis de clostripaína se inicia en l fase de desarrollo logarítmico tardío, y alcanza su máximo en la fas de desarrollo estacionario. La producción de la enzima puede se seg uida mediante expedientes de análisis de actividad (véase, po ejemplo, Mitchell. Meth. Enzym. , 47: 165-1 70 (1997)). Si bien la condiciones de fermentación óptima difieren para cad microorganismo, las condiciones adecuadas son conocidas ya por la personas expertas en la materia, o bien pueden ser establecida fácilmente en pruebas preliminares. Se puede aislar la clostripaín del filtrado de cultivo y se puede purificar mediante proceso clásicos, por ejemplo, mediante precipitación con metanol o sulfat de amonio; cambio de iones o cromatografía de permeación en gel Las formas de ?a enzima producidas recombinantemente también so conocidas (véase, por ejemplo, Witte y coautores, Microbiology 140(5), 1 175- 1 182 (1994)) y pueden ser empleadas en los método de la presente, siempre y cuando las enzimas sean capaces de dividir de manera amidante selectiva, las ligaduras peptídicas Arg-Xaa. Se activa típicamente la clostripaína antes de ser empleada en" la reacción de división amidante de la presente, mediante tratamiento con un agente reductor, tal como un mercaptano (un compuesto q ue incluya un grupo tiol funcional ("-SH")). Los ejemplos de agentes reductores adecuados incluyen: mercaptanos, como ditiotreitol ("DTT"), ditioeritritol "DTE"), 2-mercaptoetanol, ácido tioglicólico, cisteína y similares. La concentración de mercaptano usada para activar la clostripaína puede variar en una escala amplia, por ejemplo, aproximadamente entre 0.05 mM y 1 00 mM. Es preferible que la activación de la enzima, de la presente, para la reacción de división amidante se lleve a cabo en una solución acuosa, que incluye aproximadamente 0.1 a 5 mM de mercaptano (por ejemplo, DTT). La enzima activada de esta manera y/o por medio de la adición de una fuente de iones calcio, como se describe más adelante, puede ser usada directamente o, cuando sea apropiado, puede ser liberada del regulador de activación , tal como cromatografía o diálisis. Puesto que la clostripaína también es activada por iones calcio (iones Ca2+), las soluciones acuosas que contienen la clostripaína empleada en la reacción de división amidante contiene típicamente una fuente de iones Ca2+, tal como CaCI2. Por ejemplo, generalmente se emplea la clostripaína como una solución acuos que incluye alrededor de 0.01 a 2 mM de CaCI2. Sin embargo, com se indicó anteriormente, se puede activar la clostripaín exponiéndola a iones Ca2+ antes de usarla en el método de l presente. En esta aplicación, se usa las abreviaturas comunes corrientes de una sola letra y de tres letras para los residuos d aminoácido (véase 37 C.F.R. 1.822). La abreviatura "Hse" se refier / a homoserina-lactona y/u homoserina. Esto representa una mezcl de dos formas de un residuo de aminoácido que puede ser producid mediante la reacción de bromuro de cianógeno con un residu metionina, por ejemplo, en la división de péptidos con bromuro d cianógeno. Las dos formas, homoserina y su lactona, existen com una mezcla de productos de equilibrio. Las cantidades relativas d las dos formas variarán como una función del pH, siendo favorecid la forma de ácido libre (homoserina) a un pH mayor. Si bien el medio acuoso usado para llevar a cabo l reacción de división amidante está compuesto predominantemente d agua, el medio puede incluir algún solvente orgánico miscible co agua. Los ejemplos de solventes orgánicos miscibles con agu adecuados, ¡ncluyen los alcoholes (como metanol, etanol , 1 , butanodiol y trifluoroetanol); las cetonas, urea, amidas (como N , dimetilformamida ("DMF"), N,N-dimetilacetamida ("DMA") y metilpirrolidona ("NMP")); carbonatos (como carbonato de propilen y éteres (como tetrahidrofurano) y acetonitrilo. Aun cuando el medi acuoso en general no contiene más de alrededor de 20% (e volumen/volumen) de solventé orgánico (o sea, 20% en volumen solvente orgánico), se ha observado que la presencia de solv orgánico en el medio acuoso tiende a aumentar la activi próteolítica de la clostripaína, al mismo tiempo que disminuye actividad amidante. En consecuencia, la reacción de divi amidante de la presente es efectuada típicamente en un m acuoso que incluye no más que un nivel relativamente bajo solvente orgánico. Típicamente, el medio acuoso de reacción incl no más de alrededor de 10% (en volumen/volumen) y, más preferi no más de alrededor de 5% (en volumen/volumen) de solv orgánico. Aun cuando se observa típicamente la razón más favor de actividad amidante a actividad proteolítica de la clostripaína, medios acuosos que están sustancialmente libres de solv orgánico, es decir, que la solución no contiene más de alrededor 1% (en volumen/volumen) de solvente orgánico, en muchos ca puede ser ventajoso incluir una pequeña cantidad de solv orgánico en el medio. Los ejemplos de solventes orgáni adecuados que pueden ser incluidos en el medio acuoso inclu carbonato de propileno, acetonitrilo y etanoi. Aunque la temperatura de la reacción de divi amidante puede variar asimismo dentro de una amplia escala, emplea típicamente una temperatura de reacción aproximada entre 4°C y 80°C. Se prefiere llevar a cabo la reacción de divi amidante a una temperatura entre 20°C y 60°C, y es particularm adecuada una temperatura de reacción aproximada de 25°C a 5 La reacción de división amidante de la presente se lleva a cabo típicamente en un medio de base acuosa, que tiene un pH de por lo menos alrededor de 9.0. Es preferible que la reacción de división amidante, catalizada enzimáticamente, de la presente, se lleve a cabo a entre 9.0 y 1 1 .0, y es particularmente adecuada una escala de' pH de alrededor de 9.5 a 10.5. El tiempo necesario para la división amidante del polipéptido de substrato al polipéptido producto correspondiente, que tiene un residuo Arg-NH2 C-terminal, puede variar dentro de amplios límites, dependiendo de las condiciones de reacción. Por ejemplo, cuando se lleva a cabo usando el método de solución en una sola fase, se puede obtener una conversión sustancial entre 15 minutos 48 horas, mientras que se prefiere generalmente un tiempo de reacción de entre 30 minutos y 6 horas, por razones d conveniencia. Cuando se lleva a cabo la división amidante, poniendo en contacto el substrato y el reactivo amoniaco con clostripaína inmovilizada, se puede seleccionar las condiciones para permitir l conversión sustancial (por ejemplo, 40% o más de conversión) del substrato en aproximadamente 5 minutos o menos. Como es sabid por los expertos en la materia, la velocidad de la reacción puede se influenciada por una variedad de factores, que incluyen la concentraciones del substrato, del reactivo amoniaco y de la enzima; la temperatura de reacción, el pH del medio de reacción, y l presencia o ausencia de solvente orgánico en el medio de reacción. Se puede ajustar uno o más de esos parámetros para obtener l velocidad de reacción deseada y el tiempo de reacción deseado. Las condiciones de pH relativamente altas, empleada típicamente en la reacción de división amidante, pueden tender conducir a la degradación del péptido, por ejemplo, por medio d reacciones de división hidrolítica y/o por isomerización; esta últim puede transformar los residuos de L-aminoácido a sus D-isómero correspondientes ("D-contaminantes"). Se ha encontrado que l velocidad de degradación está influenciada por el medio de reacció que incluye sales, solventes y similares, así como por la temperatur y el pH del medio de reacción. Por ejemplo, cuando se dejó reposa una solución acuosa a pH 10.5 de GLP-1 (7-35)NH2 que contiene 1 de NH4OH, a 45°C durante 44 horas, se degradó una cantida sustancial del péptido a los D-contaminantes. Se detectó un degradación sustancialmente menor (8% de D-contaminantes) cuand se dejó reposar una solución similar a 44°C durante 44 horas a p neutro, y no se observó esencialmente ninguna degradación cuand se dejó reposar soluciones similares, durante un periodo de tiemp similar, a -20°C y 4°C. En contraste, cuando se dejó reposar soluciones de GLP 1 (7-36)NH2 disuelto a valores de pH entre alrededor de 4 y 8.4, e agua, a temperaturas que van desde -20°C hasta 45°C, durante u periodo de tiempo similar, no se detectó esencialmente formació alguna de D-contaminantes. Otros experimentos, que examinaron l degradación de soluciones de GLP-1 (7-36)NH2 en 1 M de cloruro d amonio, a diversos pH que van desde 8.4 hasta 10.5 (durante 2 horas a 45°C) demostraron que el péptido era relativamente estable a pH 8.4. Se midió una degradación sustancial (9%) a pH 9.4, bajo esas condiciones, y se detectó regímenes cada vez mayores de degradación al usar valores de pH cada vez más altos. Estos resultados sugieren que la exposición el producto péptido amidado a pH relativamente alto (por ejemplo, pH >. 9.5) debe reducirse al mínimo para evitar la degradación sustancial del substrato y el producto amidado. El efecto de variar la concentración de las sales de amoniaco (reactivo amoniaco) NH4X, donde X es el ion contrario para el ion amonio, tal como, por ejemplo, hidróxido, cloruro, acetato o sulfato, sobre la división amidante catalizada con clostripaína, también se examinó a pH y temperatura constantes (pH 10.0, 45°C). El aumentar la concentración de N H4CI/N H4OH (formada ajustando el pH de una solución acuosa de NH4OH a 10.0 con ácido clorhídrico) de 0.5M a 1 .0M , condujo a un aumento en la velocidad de formación y el rendimiento del producto de división amidante deseado, sin aumentar sustancialmente la cantidad de D-contaminantes que se forman a pH relativamente alto. Se usa NH4OH aquí para "indicar ia sal hidróxido del amoniaco. Ésta es producida, por ejemplo, en la forma comercial de hidróxido de amonio, disolviendo amoniaco en agua, y existe en equilibrio con el hidrato de NH3, disuelta en agua. En otras palabras, el hidróxido de amonio es una mezcla de NH4+OH", en equilibrio con N H3 disuelto libre. Otros incrementos en la concentración de N H4CI/N H4OH (hasta alrededor de 2M ) no produjeron ningún aumento sustancial en el rendimiento máximo d producto amidado ni en la cantidad de productos de degradació Sin embargo, cuanto más alta fue la concentración de NH4CI/NH4O parece que se inhibía la actividad de la enzima, hasta que se triplic casi el tiempo necesario para alcanzar el rendimiento máximo d producto amidado, aumentando la concentración de NH CI/N H4OH d 1.0M a 2.0M. Así pues, parece que una concentración de NH4C N H4OH de alrededor de 1 .0M (por ejemplo, aproximadamente d 0.75M a 1.25M) alcanza un equilibrio entre el óptimo de la velocida y el rendimiento de la formación de prod ucto amidado, al mism tiempo que evita la inhibición sustancial de la actividad enzimátic Puede ser posible encontrar variantes de clostripaína que sea menos sensibles al pH y más activos en soluciones que tengan un p por encima de alrededor de 10. Adicionalmente, son adecuado otros ¡ones contrarios del ion amonio, por ejemplo, sulfato, clorur para la amidación; y por inferencia, los iones contrarios no está limitados a estos iones. Típicamente, debido a reacciones d equilibrio de la solución, el reactivo amoniaco existirá como un mezcla de N H OH , una o más sales adicionales de amoniaco (p ejemplo, NH4CI y/o NH4Oac) y NH3 libre, disuelto. En una modalidad alternativa de la invención se pued efectuar la reacción de división amidante en un modo continuo, t como poniendo en contacto una solución acuosa, que incluye lo reactivos (péptido de substrato y reactivo amoniaco) con un suspensión o un lecho de resina, que contiene clostripaín inmovilizada. Se puede acopiar la clostripaína a un soporte de inmovilización por medio de una variedad de métodos convencionales. Por ejemplo, se ha preparado preparaciones de clostripaína, inmovilizada mediante reacción con grupos tresilo o aldehido sobre geles de agarosa o resinas a base de metacrilato, o con agarosa activada con CN Br. Las resinas preparadas de esta manera pueden tener cantidades ampliamente variables de enzima fijada. Las resinas típicas, adecuadas para uso en el método de la presente contienen aproximadamente 0.1 a 10 mg/ml y, de preferencia, aproximadamente 1 a alrededor de 5 mg/ml d clostripaína inmovilizada. Estas preparaciones fueron muy activas en substratos de división amidante, tales como polipéptidos de división, que incluyen la secuencia GLP-1 (7-35)-Arg-Ala-Phe-Ala, un polipéptido que tiene una GLP-1 (7-35)-Arg-NH2 C-terminal , en presencia de amoniaco a pH 10. Los rendimientos son típicament de más de 40%, similares a los observados con las reacciones en solución monofásica. Las resinas que contienen la clostripaín inmovilizada pueden ser empacadas en columnas, y pueden actua como catalizadores muy eficientes para la reacción de" divisió amidante. Generalmente se lleva a cabo la reacción que utiliz clostripaína inmovilizada, bombeando el substrato péptido en l solución acuosa apropiada de amoniaco, a través de la columna. Esto obvia la necesidad de retirar la clostripaína, potencialment problemática , del producto de reacción . Se puede activar l clostripaína unida a resina por medio de mercaptanos, antes de la reacción, o bien ei agente reductor puede estar presente durante la amidación. Típicamente se mantiene la enzima en estado activado, incluyendo simplemente un mercaptano (tal como DTT) y una sal de calcio (como CaCI2) en el medio de reacción. La amidación a base de reactor con enzima inmovilizada, también permite obtener un método para reducir al mínimo la exposición del péptido a condiciones de alto pH, que pueden conducir a la degradación del producto, específicamente para reducir al mínimo la formación del D-contaminante y la desamidación de la cadena lateral. Por ejemplo, dos corrientes de flujo, una que contiene el péptido a un pH relativamente bajo, al que es estable (por ejemplo, no mayor que pH aproximado de 8.5), y una de constitución apropiada para proveer el pH final y las condiciones químicas finales para la reacción, pueden ser mezcladas justo antes de introducir la mezcla de reacción en el lecho de resina. El tiempo durante el que está en contacto el substrato con la resina típicamente es inferior a alrededor de 20 minutos y, de preferencia, no es mayor que alrededor de 5 minutos. Además, inmediatamente al salir del reactor, la solución producto se mezcla de preferencia con un ácido apropiado o una solución reguiadora apropiada, para bajar ei pH a alrededor de 8.5 o menos, donde la estabilidad del producto amidado es notablemente mayor. El método de la presente es útil para prod ucir formas amidadas de una variedad de péptidos que contienen un residuo argini na C-terminal. El péptido de destino q ue se va a producir puede ser cualquier secuencia de polipéptido terminada en Arg , útil tal como una secuencia natural, una secuencia natural modificada una secuencia no natural que tenga actividad biológica, sus forma truncadas y versiones similares. Los péptidos pueden tener un pes molecular de 300 a alrededor de 20,000 y, en general, de 400 10,000. Dichos péptidos incluyen típicamente de 3 a 100 residuo aminoácido, de preferencia de 3 a 70 residuos. Los ejemplos d esos péptidos incluyen: factores liberadores de hormona d crecimiento, proformas de dichos factores, y frag mentos funcionale de ellos. Los ejemplos adecuados de péptidos de substrato qu pueden ser transformados a ios péptidos C-terminalmente amidados utilizando el método de la presente invención, incluyen los siguiente polipéptidos: GLP(1 -35)-Arg-Xaa-R (SEQ I D NO: 2): His-Asp-GIu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-l le-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa-R GLP-1 (7-35)-Arg-Xaa-R (SEQ I D NO: 3): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lyz-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lyz-Gly-Arg-Xaa-R donde R representa un grupo bloqueador de carboxilo, un residu aminoácido o un grupo peptidilo (o sea, una secuencia de dos o má aminoácidos unidos por medio de ligaduras peptídicas alfa carboxi!o) . Se puede usar el método de la presente invención par dividir de manera amidante los polipéptidos d e substrato, qu incluyen más de una copia de la secuencia central de aminoácidos. Dichas construcciones de copias múltiples pueden tener copia adyacentes conectadas directamente entre sí ("enlazadas de maner contigua"). Sin embargo, muy frecuentemente las copias adyacente de la secuencia central de aminoácido están conectadas por medi de una secuencia enlazadora. Una secuencia enlazadora es un secuencia relativamente corta de aminoácidos (típicamente no má de 5 a 10 residuos de aminoácido) que sirve como un separado entre copias adyacentes de la secuencia central de aminoácido. Lo residuos de aminoácido de la secuencia enlazadora generalment están seleccionados para dar sitios adicionales que puedan se abiertos o divididos selectivamente, mediante reactivos de divisió enzimáticos o químicos. Se presenta los siguientes ejemplos para ilustrar l presente invención y para ayudar a ios expertos normales a hacerla usarla. Los ejemplos no están destinados, de ninguna manera, limitar en modo alguno el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 AMIDACIÓN CATALIZADA CON CLOSTRIPAÍNA. A pH 7.9 Se disolvió 2 mg del péptido de substrato GLP-1 (7-36)Ala Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) en 900 µl de 1M de NH4OH acuoso, y s ajustó el pH a 7.9, utilizando ácido acético glacial. Luego se incub la solución de substrato a 37°C durante 15 minutos, antes de añadi la clostripaína. Se disolvió 1 mg de clostripaína en 1 ml de 25 m de ditiotreitol que contenía 1 mM de CaCI2, y se dejó reposar a l temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió 100 µl d clostripaína a un tubo de ensayo que contenía la solución d substrato, a 37°C. Se cerró el tubo, se mezcló por inversión y s mantuvo en un baño a 37°C. Se vigiló el curso de la reacción catalizada co clostripaína, retirando alícuotas de 25 µl de la mezcla de reacción intervalos de tiempo (generalmente cada 5 o 10 minutos). Se retir el punto de tiempo cero de la mezcla de reacción, inmediatament después de la adición de la solución maestra de clostripaína. S diluyó 10 veces las alícuotas de reacción con ácido acético glacial, se las analizó mediante H PLC, usando una columna de fase inversa C1 8 de 5 mieras, con un gradiente lineal ligero (hasta 35% de B en minutos, hasta 45% de B en 6 minutos adicionales, luego hasta 100 de B en 12.3 minutos) de los siguientes reguladores: A: 95% (e volumen/volumen) de agua, 5% (en volumen/volumen) de acetonitril 0.1 %o (en volumen/volumen) de ácido trifluoroacético; B: 5% (e volumen/volumen) de agua, 95% (en volumen/volumen) d acetonitrilo, 0.1 % (en volumen/volumen) de ácido trifluoroacético. Los resultados (figura 1 ) indican ninguna amidació importante. La hidrólisis en Arg36 para retirar Ala-Phe-Ala-Hse (SE ID NO: 6) sin amidación para producir GLP- 1 (7-36)OH (SEQ ID NO 4) fue la reacción primaria, con un grado ligero de hidrólisis en Lys3 para producir G LP- 1 (7-34)OH (SEQ I D NO: 5). La cantidad de G LP 1 (7-36)OH (SEQ ID NO: 4) alcanzó un máximo aproximado de 55 (con base en la GLP-1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hse) (SEQ I D NO: 1 ) d partida) después de 5 minutos y luego declinó debido a una divisió hidrolítica más lenta en Lys34 para producir GLP-1 (7-34)OH (SEQ I NO : 5). La división en Lys34 indica que está presente cierta cantida de actividad hidrolítica hacia ese sitio secundario. La cantida importante de división hidrolítica secundaria, observada en Lys3 fu un tanto inesperada. GLP(7-36)OH (SEQ I D NO: 4): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-OH GLP(7-34)OH (SEQ I D NO: 5): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-AIa-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys EJ EMPLO 2 AMIDACIÓN CATALIZADA CON CLOSTRI PAÍNA. A P H 9.0 Se llevó a cabo la amidación de GLP-1 (7-36)Ala*-Phe-Al Hse (SEQ ID NO: 1 ) en 1 M de NH4OH acuoso, a pH 9.0 y 37° siguiendo el procedimiento y el análisis descritos en el ejemplo Se ajustó el pH a 9.0 con ácido acético glacial. Los resultados de la reacción efectuada a pH 9.0 (figu 2) indican una cantidad importante de amidación, que produce u rendimiento máximo de 23.6% de GLP- 1 (7-36)NH2 después d aproximadamente 10 minutos. La razón de amidación a hidrólisis (l razón de GLP-1 (7-36)NH2 / GLP-1 (7-36)OH) a un tiempo de reacció de 10 minutos fue 1.4. A pH 9.0, la hidrólisis en Lys3 para produci GLP-1 (7-34)OH (no mostrado) fue más lenta y después de 60 minuto se observó sólo 7.4%. GLP-1 (7-35)-Arg-NH2 (SEQ I D NO: 4) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-yr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2 EJ EMPLO 3 AMIDACIÓN CATALIZADA CON CLOSTRIPAÍNA. A pH 9.6 Se llevó a cabo la amidación catalizada con clostripaína de GLP-1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1 ) en 1 M de NH4O acuoso a pH 9.6 y 37°C, siguiendo el procedimiento y el análisi descritos en el ejemplo 1 . Se ajustó el pH a 9.6 , usando ácid acético glacial. Los resultados (figura 3) muestran un rendimiento máxim de GLP-1 (7-36)NH2 (38.1 %) entre 10 y 20 minutos. La razón d amidación a hidrólisis, a los diez minutos, fue 5.1. La actividad d clostripaína es ligeramente inferior a pH 9.6 en comparación con 9. (ejemplo 2), lo que da por resultado un rendimiento máximo de GLP-1 (7-36)N H2 que ocurre en un tiempo ligeramente posterior.

EJ EMPLO 4 AMIDACIÓN CATALIZADA CON CLOSTRIPAÍNA A pH 10.4 Se llevó a cabo la amidación catalizada con clostripaín de GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO. 1) en 1M de NH4O acuoso a pH 10.4 y 37°C, siguiendo el procedimiento y el análisi descritos en el ejemplo 1. Se ajustó el pH a 10.4 con ácido acétic glacial. Los resultados de la amidación intentada a pH 10.4 está mostrados en la figura 4. A este pH se produjo el rendimient máximo de GLP-1(7-36)NH2 (42.3%) después de alrededor de 3 minutos. La razón de amidación a hidrólisis, al tiempo de reacció de 30 minutos, fue de 4.7. El rendimiento de GLP-1(7-34)O después de 60 minutos (no mostrado) fue 9.4%, similar a la cantida observada a pH 9.0 y 9.6. Esto demuestra que a pH 10.4 la cantida de división hidrolítica en Lys34 es menor que la obtenida a menore valores de pH.

EJEMPLO 5 AMIDACIÓN CATALIZADA CON CLOSTRIPAÍNA A pH 11.0 Se llevó a cabo la amidación catalizada con clostripaín de GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) en 1M de NH4O acuoso a pH 11.0 y 37°C, siguiendo el procedimiento descrito en ejemplo 1. Se ajustó el pH a 11.0 con ácido acético glacial. Lo resultados de la amidación intentada a pH 11.0 están mostrados e la figura 5. A ese pH se obtuvo, después de 60 minutos, u rendimiento de 27.6% de GLP-1 (7-36)NH2 (SEQ ID NO: 4). La razó de amidación a hidrólisis, en el tiempo de reacción de 60 minuto fue 7.0. Sin embargo, la reacción progresó mucho más lentament que a cualquiera de los valores inferiores de pH, y no habí alcanzado aún el rendimiento máximo después de 60 minutos. L amidación es favorecida fuertemente sobre la división hidrolítica este pH relativamente alto, ya que todavía después de 60 minutos s estaba incrementando el rendimiento de GLP-1 (7-36)OH (SEQ ID N 4) a una velocidad más lenta que el rendimiento de G LP-1 (7-36)NH No se observó hidrólisis en Lys34 para producir GLP(7-34)OH (SE ID NO: 5) a ese pH mayor.

EJEMPLO 6 AMIDACIÓN CATALIZADA CON CLOSTRIPAÍNA DE GLP-K7-361- Ala-Phe-A a-Met-His-Ala-Glu Se examinó la amidación catalizada con ciostripaína d GLP-1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Met-His-Ala-Glu (SEQ I D NO: 7) en 1 M d NH OH acuoso y 37°C, siguiendo el procedimiento descrito en ejemplo 1 . Se llevó a cabo la amidación a pH 10.3 y 10.8 y produj rendimientos máximos de 32.9% y 12.4% de GLP-1 (7-36)NH respectivamente. El cuadro I muestra una comparación de esto resultados con los de la amidación catalizada con clostripaína co GLP-1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1 ) como substrato. Lo resultados sugieren una escala óptima de pH entre alrededor de 9. y 11.0 y, de preferencia, entre pH 9.5 y 10.5.

CUADRO I RENDIMIENTO Y SELECTIVIDAD DE AMIDACIÓN. COMO FUNCIÓN DEL pH a.- Rendimiento máximo b.- Razón en el momento de rendimiento máximo, observado. c- Después de 60 minutos (no se alcanzó el rendimiento máximo).

EJEMPLO 7 AM1DACIÓN DE SUBSTRATOS SINTÉTICOS Se incubó substratos sintéticos de la estructura genérica Val-Lys-Gly-Arg-XXXX ("VKGRXXXX", SEQ ID NO. 8)), donde "XXXX" representa un fragmento peptídico de tres o cuatro residuos de aminoácido, con clostripaína en 1 M de cloruro de amonio, pH 10.4, 2 mM de DTT, 1 mM de cloruro de calcio, a 45°C. Se tomó alícuotas de las mezclas de reacción a diversos intervalos de tiempo, se inactivo con ácido acético glacial y se analizó mediante electroforesis capilar. El cuadro II resume la división porcentual del substrato después de 10 minutos, a concentraciones idénticas de clostripaína, para los diversos substratos. El principal producto, en todos los casos, identificado mediante análisis de HPLC fue la alfa- carboxiamida C-terminal de Val-Lys-Gly-Arg ("VKGR-NH2°; SEQ ID NO: 9). Claramente puede variar ampliamente la naturaleza del fragmento C-terminal, y todavía tener capacidad considerable para ser objeto de la división amidante.

CUADRO II EJ EMPLO 8 PREPARACIÓN A ESCALA DE LABORATORIO DE GLP-1 (7-36)NH^ M EDIANTE DIVISIÓN AMI DANTE DE GLP-1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hse PO R M EDIO DE CLOSTRI PAÍNA Se disolvió el péptido liofilizado GLP-1 (7-36)Ala-Phe-Ala- Hse (SEQ ID NO: 1 ), preparado mediante tecnología recombinante, a 4.24 mg/ml en 1 .16 M de NH4OH, 0.25 M de HCl, 2.5 mM de DTT, 1 mM de caCI2, ajustado a pH 10.5 con 0.15 M de NaOH, y se añadió clostripaína a una razón de enzima:substrato de 1 :300. Se dejó la reacción para operar durante 4.5 horas a 45°C antes de inactivar con 10 mM de EDTA. Se purificó ei producto GLP-1 (7-36)NH2 (SEQ ID NO: 4) mediante cromatografía, usando condiciones de fase inversa en Amberchrome CG71 y se liofilizó. El péptido prod ucto tuvo una composición de aminoácido idéntica, dentro del error experimental , a la composición teórica de GLP-1 (7-36)NH2, tuvo un espectro de absorción que reflejó con precisión el contenido esperado de tirosina y triptofano, y tuvo un masa atómica de 3298, medida mediante espectrometría de mas MALDI-TOF (idéntica, dentro del error experimental, a la esperada) tuvo una secuencia idéntica a la teórica, y migró de manera idéntic a una muestra comercial sintética del péptido por HPLC, bie separada de GLP-1 (7-36)OH. Por lo tanto, el polipéptido product fue identificado con GLP-1 (7-36)NH2.

CUADRO 3 EFECTO DEL SOLVENTE ORGÁNICO SOBRE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DE CLOSTRIPAÍNA Activida d relativa al medio Solvente orqánico q ue carece de solvente orgá- meo í% en volumen/volumen) Acetonitrilo 1 80 Carbonato de propileno 264 Trifluoroetanol 200 Dimetilformamida 123 Dimetilacetamida 108 Tetrahidrofurano 26 1 ,4-butanodiol 1 16 N-metilpirrolidinona 90 Se repitieron estas reacciones en presencia d cantidades variables de solvente orgánico y se determinó la concentraciones óptimas para la actividad proteolítica para carbonato de propileno (10%), la N,N-dimetilformamida (20%), trifluoroetanol (20%) y el acetonitrilo (20%).

EJ EMPLO 10 INHI BICIÓN DE LA ACTIVI DAD DE AMIDACIÓN DE CLOSTRI PAÍN A POR MEDIO DE SOLVENTE ORGÁNICO Se determinó el nivel máximo de amidación alcanzado e presencia de diversos solventes orgánicos, con GLP-1 (7-36)Ala-Ph Ala-Hse (SEQ ID NO: 1 , 2 mg/ml) en 2.5 mM de DTT, 1 mM de clorur de calcio, 2M de acetato de amonio, pH 10.4, a 45°C, con 20 µg d clostripaína, en una reacción de 1 ml. Se sacó alícuotas de l mezcla de reacción a intervalos de tiempo regulares, se las inactiv con ácido acético y se analizó mediante análisis de HPLC, en un columna de HPLC de fase inversa.

CUADRO IV EFECTO DEL SOLVENTE ORGÁNICO SOBRE LA ACTIVI DAD DE AMIDACIÓN CON CLOSTRI PAÍNA Grado de amidación (% Solvente de substrato convertido) Control acuoso (sin solvente orgánico) 44 20% de trifluoroetanol 9 10%o de carbonato de propileno 29 20% de acetonitrilo 1 8 Los resultados del cuadro IV muestran que fue evidente una depresión en la actividad de amidación en presencia de esos solventes. Se llevó a cabo una serie de reacciones a 1.25M de NH4OH, pH 10.0, 2.5 mM de DTT, 1 mM de CaCI , 45°C, a una razón de enzima a substrato (en peso/peso) de 1:190, a diversas concentraciones bajas de acetonitrilo y etanol (cuadro V). Los niveles bajos de acetonitrilo o etanol tuvieron poco efecto sobre los rendimientos de transamidación, las velocidades de las reacciones, o la razón de GLP-1 (7-36)NH2 a GLP-1 (7-36)OH; pero sí disminuyeron la cantidad de D-contaminantes producidos.

CUADRO V Abreviaturas usadas: R. M. = rendimiento máximo, ND = no determinado; % de D = porcentaje de D-contaminantes.

EJEMPLO 11 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE AMONIACO SOBRE LA TRANSAMIDACIÓN Se examinó el efecto de las variaciones en las concentraciones de amoniaco (0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5 y 2 M) a pH 10, sobre la división amidante de GLP-1 (7-36)Ala-Phe-Aia-Hse (SEQ ID NO: 1), en las siguientes condiciones de reacción: 4 mg/ml de GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO. 1), 2.5 mM de DTT, 1 mM de CaCI2, 45°C, razón de enzima a substrato = 1:190. Los resultados están mostrados en el siguiente cuadro VI. Tres concentraciones de amoniaco, 1.0, 1.25 y 1.5 M, dieron rendimientos similares (43, 45 y 44%, respectivamente). Todos produjeron la misma cantidad de D-contaminantes, 4.2%, y las proporciones de cada uno fueron aproximadamente iguales. a:- R.M. = rendimiento máximo de GLP-1 (7-36)NH2. b:- Tiempo al que se obtiene el rendimiento máximo. c:- Razón de GLP-1 (7-36)NH2 / GLP-1 (7-36)OH, en el momento requerido para lograr el rendimiento máximo. d:- % de D-contaminantes, debidos a la degradación del product por medio de la formación de D-aminoácido, en el momento d rendimiento máximo.

EJEMPLO 12 EFECTO DEL ANIÓN CONTRARIO AL AMONIO SOBRE LA TRANSAMIDACIÓN Se examinó el efecto de las variaciones en ei anió contrario, presente en el reactivo amoniaco, sobre la transamidación Se ajustó el pH de las reacciones, por duplicado; es decir, se oper en presencia de cloruro de amonio, acetato de amonio y sulfato d amonio, respectivamente. Se llevó a cabo por duplicado reaccione de división amidante de1 .28 mg/ml de GLP-1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hs (SEQ ID NO: 1 ), en un medio de reacción que consiste de 2.5 mM d DTT, 1 mM de CaCI2, 45°C y una razón de enzima:substrato d 1 : 190, con 1.25 M de NH4OH; se ajustó a pH 10.0 con ácid clorhídrico, ácido acético o ácido sulfúrico. Los resultados están mostrados en el siguiente cuadr Vil. Los rendimientos de producto para todas las reacciones fuero casi idénticos, al igual que la cantidad de D-contaminantes y, po tanto, parece que la naturaleza del ion contrario tiene poco efect sobre la amidación para producir GLP-1 (7-36)N H2.

CUADRO Vil EFECTO DEL ION CONTRARIO AL ION AMONIO Ion contrario Rendimiento de GLP-1(7-36)NH,a % de D-contaminantes cr 51% 4.7% OAc" 51% 4.8% SO4" 42% 4.0% a:- Después de 150 minutos, ninguna de las reacciones hab alcanzado un rendimiento máximo. b:- % de D-contaminantes, debidos a la degradación del produc por medio de la formación de D-aminoácido (a los 150 minutos).

EJEMPLO 13 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE CaC SOBRE LA TRANSAMIDACIÓN Se examinó la división amidante de 1 y 5 mg/ml de GL 1(7-36)AIa-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) en reacciones que conten 0, 0.1, 1.0 y 10 mM de CaCI2 (cuadro VIII), en presencia de 1.25 de NH4OH, ajustadas a pH 10.0 con HCl, 2.5 mM de DTT, razón enzima a substrato = 1:200. No se observó actividad en ausencia d calcio añadido. Así pues, este catión es necesario para la activid y las concentraciones de más de 0.1 M no afectan el rendimien de la transamidación.

CUADRO VIII EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE CaCU SOBRE LA DIVISIÓN AMÍDANTE Concentración de ? Concentración de Rendimiento GLP-1(7-36)NH2 CaCI, (mM).- Substrato (ma/ml máximo (%) GLP-1(7-36)OHD 0 1 NA NA 0.1 1 60 4.6:1 1.0 1 59 4.4:1 10 1 59 4.4:1 0 5 2 -- 2 5 47 4.3:1 NA = Ninguna actividad a:- rendimiento máximo de GLP-1 (7-36)NH2 b:- GLP-1(7-36)NH2 /GLP-1 (7-36)OH cuando se obtuvo rendimiento máximo.

EJEMPLO 14 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA SOBRE LA DIVISIÓN AMIDANTE Se examinó la división amidante de 1 mg/ml de GLP-1(7 36)AIa-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) a razones de enzima/substrat de 1:200, 1:400, 1:800 y 1:400, a 1.25 M de NH4OH, ajustadas a p 10.0 con HCl, 2.5 mM de DTT, 0.5 mM de CaCI2, a 45°C, baj nitrógeno (cuadro IX), y se analizó como en el ejemplo 1. Lo rendimientos de GLP-1(7-36)NH2 estuvieron entre 50% y 60% e todos los casos, pero a menores razones de enzima a substrato, e tiempo para alcanzar el rendimiento máximo fue considerablement más prolongado, alcanzando 360 minutos, a una razón de 1:800. la máxima concentración de substrato, el rendimiento todavía fu apreciable aunque ia reacción produjo menos producto, y se alcanz el rendimiento máximo en un tiempo mayor. Conforme aumentan lo tiempos de reacción bajo condiciones de elevado pH, aumenta l cantidad de D-contaminantes, como era de esperar, puesto que e substrato y el producto están expuestos al pH alcalino durant tiempos prolongados.

CUADRO IX RAZÓN ENZIMA/SUBSTRATO Concentración de Razón enzima/ Rendimiento máximo D-contamisubstrato8 (ma/ml) substrato (minutos) nantes0 í%) 1 1:200 59 90 3% 1 1:400 60 190 4.5% 1 1:800 58 360 6% 5 1:400 51 90 ND a:- GLP-1("7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) b:- Rendimiento máximo de GLP-1 (7-36)NH2 y tiempo en que ocurre, c:- % de D-contaminantes en el momento del rendimiento máxim (debido a la degradación del producto por la formación de D aminoácidos). EJEMPLO 15 REDUCCIÓN DE MERCAPTANO NECESARIA PARA LA ACTIVIDAD DE CLOSTRIPAÍNA ' Para obtener la máxima actividad, se trata típicamente l clostripaína con mercaptano. Se examinó la concentración de mercaptano DTT a concentraciones de 0, 0.5, 1.0, 2.5 y 5.0 mM. La condiciones para la reacción amidante fueron: 1 mg/ml de GLP-1 (7 36)Ala-Phe-Ala-Hse, 1.25 M de NH4OH, ajustado a pH 10.0 con HCl 0.5 mM de CaCI2, 45°C, espacio superior burbujeado con N2(g) razón de enzima a substrato = 1 :400, y se analizó la reacción com en el ejemplo 1 . En ausencia de DTT añadido se obtuvo únicamente u rendimiento de 20% del producto de amidación GLP-1 (7-36)NH2 Cuando se operó en presencia de 0.5 a 5 mM , todas las reaccione produjeron aproximadamente 60% de GLP-1 (7-36)NH2. Así pues para obtener los rendimientos óptimos de división amidante, e necesaria la reducción de la enzima con un agente reductor, tal com un mercaptano.

EJ EMPLO 16 AMIDACIÓN MEDIANTE OTRAS PROTEASAS ESPECÍFICAS PARA Arq Se disolvió entre 0.5 y 2 mg/ml de GLP-1 (7-36)Ala-Phe Ala-Hse en 1 M de hidróxido de amonio, a pH 10 y 8.5, y se incub individualmente con seis diferentes enzimas proteolíticas, cinco d las cuales tienen una especificidad para romper o dividir los péptido en la unión peptídica carboxilo de residuos arginina, similares a la de la clostripaína. Estas incluyeron: tripsina, trombina, catepsina (también probada a pH 5.5), factor de coagulación Xa, plasmina papaína. La papaína es una tiol-proteasa, aun cuando no e específica para uniones arginilo. Ninguna de esas proteasas produj algún GLP-1 (7-36)NH2, cuando se analizó mediante cromatografía e fase inversa, tal como se describió en el ejemplo 1. Las razone enzima:substrato estuvieron entre 1:50 y 1:100, y se añadió aditivo específicos para proteasa, cuando fue apropiado (por ejemplo cloruro de calcio). Bajo estas condiciones solamente la clostripaín produjo GLP-1(7-36)NH2 mensurable.

EJEMPLO 17 PURIFICACIÓN POR AFINIDAD DE CLOSTRIPAÍNA Se purificó clostripaína mediante cromatografía po afinidad (Ullman y coautores, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 375, 89-9 (1994)), usando una columna de resina Toyopearl TSKgel Af-Red empacada en una columna ID de 1.2 cm, con camisa, a una altura d lecho de 11 cm. Se filtró regulador A (25 mM de Hepes, 5 mM d CaCI2, pH 8) y regulador B (25 mM de Hepes, 5 mM de CaCl2, 1 M d NaCI, pH 8), a través de un filtro de nylon de 0.45 µm, y s desgasificó mediante vacío durante diez minutos. Se disolvió 57.3 mg de Clostripaína (Worthington) a 14. mg/ml en 3 ml de 15% de regulador B en regulador A, y se aplicó a l columna, que había sido equilibrada previamente con 15% d regulador B en regulador A, a 1 ml/minuto. Se eluyó la columna co 15% de regulador B en regulador A durante cinco minutos; luego co un gradiente lineal de 15% a 100% de reguiador B en regulador durante cuarenta minutos. Se recogió fracciones y las que contenía clostripaína, según se identificó por su capacidad para catalizar l amidación, fueron reunidas y constituyeron aproximadamente 5 m de ditiotreitol y se las concentró a 5 mg/ml, mediante ultrafiltración.

EJEMPLO 18 INMOVILIZACIÓN DE CLOSTRIPAÍNA SOBRE RESINA TOYOPEAR AF-FORMYL-650M Se añadió resina Toyopearl AF-Formyl-650 suministrada como una suspensión que contenía conservador, a un columna desechable de 10 ml , con un frito de 45 um, y se enjuag con 2 volúmenes de columna de 0.1 M de regulador Mes, 5 mM d CaCl2, pH 5. Se diluyó clostripaína, procedente de la purificació anterior, en 5 mM de Hepes, pH 8, a un volumen igual de 0.1 M d Mes , hasta un pH final de 5, 5 y se añadió a la resina escurrid Luego se añadió 150 µl de 1 M de cianoborohidruro de sodio, y s mezcló la suspensión de resina, mediante inversión continua de l columna tapada, durante 20 horas, a 23-25°C. Se escurrió l columna, reservando el eluado para análisis, y se lavó la resina co 2 volúmenes de columna de 1 M de Trls-HCI , 5 mM de CaCI2, pH 7.8 Luego se añadió un volumen de columna de este regulador, junto co 50 µl de cianoborohidruro de sodio, y se mezcló la mezcla durant una hora. Se lavó entonces la resina con 10 volúmenes de column de 1 M de NaCI, 25 mM de Hepes, 5 mM de CaCI2, pH 8; luego con l misma cantidad de regulador que no contenía NaCl. El análisis de l preparación de clostripaína-resina resultante, midiendo la pérdida d enzima de la solución, mostró que entre 1 .8 y 4.4 mg de enzim estaba acoplada, por ml de resina. Se almacenó la clostripaína resina en este regulador a 4°C, hasta que se usó. De manera similar, la clostripaína inmovilizada sobr otras resinas produjo resultados similares. Los ejemplos incluyen Toyopearl Amino Link, y Toyopearl Formyl 650M (Toso Haas, Inc.) que son resinas a base de aldehido, y Ultra Link (Pierce), una resin a base de azlactona. Estas resinas se unen a los grupos amin libres en la enzima. Todas estas resinas, que contenían clostripaín inmovilizada, produjeron división amidante de GLP-1 (7-36)Ala-Phe Ala-Hse a G LP-1 (7-36)N H2, en rendimientos hasta de 77% generalmente en la escala de 50 a 60%.

EJEMPLO 19 REACCIO N ES CATALIZADAS CON C LOSTRI PAÍNA I N MOVI LIZADA Se cargó 40 ml de clóstripaína-resina inmovilizada, en 5 mM de Hepes, 5 mM de CaCI2, a pH 8.5, a 35 ml/minuto, en un columna con camisa de vidrio, con diámetro interno de 2.5 cm equipada con adaptador de flujo y una bomba peristáltica. Se hiz circular agua a 47°C a través de la camisa. Se lavó la resina co 200 mi de 1 mM de DTT y 1 mM de CaCI2 a 47°C, a 8 ml/minuto, a p 8.5. Después de la preparación de columna que se acaba d describir, la columna se encuentra lista para la división amidante. Se usó el aparato diagramado en la figura 6 para l división amidante continua de GLP-1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hse. S equilibró la solución de substrato (13 L a 0.65 mg/ml en 7.5% d acetonitrilo acuoso que contenía 1 .25 mM de HCl ("solución 1 ") , en baño de agua a 47°C, y se conectó a la bomba peristáltica mediant la tubería 1 , con la salida de esta línea conectada a la junta 1 en Se formó una solución de 1 3 L de 2.5 M de N H4OH, 2 mM de DTT y mM de CaCI2, ajustada a pH 10.0 con HCl concentrado ("solución 2" se colocó en un baño de agua a 47°C y se conectó a la bomb peristáltica a través de la tubería 2, que se conectó * entonce también a la junta 1 en T. La tercera tubería de la bomba, la tuberí 3, suministra la solución 3 (1.25 M de HCl) a temperatura ambient a través de la bomba, a la junta 2 en T, que está conectada efluente de la columna. La salida de la junta 2 en T es recogid como el producto de la reacción. En la práctica, las líneas d bombeo de la bomba tienen un diámetro interno de 3.17 mm, so tubos de Tygon, y el régimen de bombeo de las tuberías 1 , 2 y 3 so idénticos, aproximadamente a 3 a 6 ml/minuto. Cuando se bombea l solución 1 y la solución 2, se encuentran éstas en la junta 1 en T pasan a la columna. Esta solución pasa a través de la columna entra en la junta 2 en T, a un régimen de flujo aproximado de ml/minuto. En la junta 2 en T, el efluente de la columna es mezclad con solución 1.25M de HCl, que sirve para disminuir el pH de l solución de reacción que contiene GLP-1 (7-36)NH2 aproximadamente a 8.5. Al régimen de flujo usado, el tiemp durante el que el substrato y el producto están en contacto con l resina es aproximadamente 5 minutos. De esa manera, el tiemp durante el cual el substrato y/o el producto están expuestos a la condiciones acuosas a pH 10 no es mayor que aproximadamente minutos. En la práctica, se ajusta el régimen de flujo para obtene la formación máxima de producto y el mínimo de contaminantes seg ún se determina mediante muestreo repetitivo del efluente, en l junta 2 en T, y el análisis de HPLC que se describió en el ejemplo 1 La figura 7 muestra los resultados de esta reacción, * bajo la condiciones arriba descritas; donde están registrados el rendimient y el régimen de flujo de la columna, como función del tiempo para e experimento. El rendimiento promedio es cercano a 50% para l formación de GLP-1 (7-36)NH2, con un máximo cercano al 64% a u régimen de flujo neto de 14 ml/minuto. Cuando el flujo fu demasiado rápido, como a 44 ml/minuto, el rendimiento cayó a 34% Al regresar al flujo de 16 ml/minuto, se volvió a llevar el rendimient a aproximadamente 50%. Cuando no es óptima la formación del producto, s disminuye el flujo si ia formación de producto es baja, lo que permit una exposición más prolongada de la solución de substrato a l clostripaína unida a resina; o se aumenta el flujo , si hay exposició excesiva a la enzima, como es evidente por el aumento en la cantidades de GLP-1 (7-34), debidas a la división en Lys34. Tambié entenderá cualquiera que sea experto en la materia , que la alteraciones en la concentración de HCl neutralizante, l concentración del substrato, la temperatura, la concentración de solvente orgánico y otros factores q ue afectan el régimen d clostripaína inmovilizada, son variables que pueden ser ajustada para elevar al punto óptimo la formación de producto.

EJ EMPLO 20 DIVISIÓN AMI DADA E INMOVILIZADA: EFECTO DE LOS PARÁMETROS DE LA COLU MNA U na serie de reacciones con clostripaína inmovilizad sobre dos resinas diferentes está mostrada en el cuadro X, dond están tabulados los efectos del régimen de flujo, la concentración d GLP-1 (7-36)Ala-Phe-Ala-Hse, la temperatura, la cantidad de resina el rendimiento de GLP- 1 (3-36)N H2, para rea cciones efectuadas d manera análoga a la del ejemplo 1 9, bajo condiciones similares, per con una columna de 1 x 15 cm. Las conclusiones son que, en general, al bajar la temperatura, disminuye el rendimiento (compárese las cuatro primeras anotaciones a 23°C con las de 45°C), al igual un cambio significativo en los regímenes de flujo (compárese las anotaciones 1 y 2, 3 y 4, 6 y 7) y las concentraciones de GLP-1/8-36)Ala-Phe-Ala-Hse. Las variaciones de estos y otros parámetros de la reacción en columna, pueden alterar el rendimiento. En este estudio, los rendimientos variaron de 4 a 63%, dependiendo de las condiciones precisas usadas para la reacción, lo que demuestra que se puede elevar al punto óptimo ias reacciones, alterando ios diversos parámetros de la reacción de columna.

CUADRO X COMPARACIÓN DE LOS ENSAYOS EN REACTOR DE ENZIMA Se ha descrito la invención con referencia a diversa modalidades y técnicas específicas e ilustrativas. Sin embargo, s debe entender q ue se pueden hacer muchas variaciones modificaciones, permaneciendo siempre dentro del espíritu y alcanc de la invención .

Claims (1)

1. REIVI NDICACION ES 1.- Un método para producir un polipéptido que tiene u grupo alfa-carboxiamida C-terminal, caracterizado porqu comprende: poner en contacto: (i) un medio de base acuosa que incluye: (a reactivo amoniaco y (b) un poiipéptido de substrato que comprend por lo menos una secuencia central de aminoácido; donde l secuencia central de aminoácido tiene un residuo Arg C-terminal unido por medio de su grupo alfa-carboxilo a un grupo alfa-amino d un residuo de aminoácido adyacente, por medio de una unión d péptido; con (ii) clostripaína, para dividir o abrir la ligadura d péptido para producir el polipéptido producto, que tiene un residu Arg-NH2 C-terminal . 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque el medio de base acuosa incluye por l menos alrededor de 80% en volumen de agua. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque el medio de base acuosa incluye n más de alrededor de 10% en volumen de solvente orgánico. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque el medio de base acuosa est sustancialmente libre de solvente orgánico. 5.- El método de conformidad con ia reivindicación 1 caracterizado además porque el reactivo amoniaco comprende sal d amoniaco, seleccionada de: cloruro de amonio, hidróxido de amoni acetato de amonio, sulfato de amonio y mezclas de ellos. 6. - El método de conformidad con la reivindicación caracterizado además porq ue el medio de base acuosa compren por lo menos alrededor de 0.5M de reactivo amoniaco. 7.- El método de conformidad con la reivindicación caracterizado además porque comprende poner en contacto polipéptido de substrato y el reactivo amoniaco con la clostri paína , una temperatura aproximada de 4°C a 80°C. 8.- El método de conformidad con la reivindicación caracterizado además porque la secuencia central de aminoáci comprende G LP-1 (7-35)-Arg . 9.- El método de conformidad con la reivindicación caracterizado además porque la secuencia central de aminoáci comprende G LP- 1 (7-36)Arg-Ala-Phe-Ala. 1 0.- El método de conformidad con la reivindicación caracterizado además porq ue la secuencia central de aminoáci comprende GLP-1 (7-35)Arg-Ala-Phe-Ala-Hse, o GLP-1 (7-35)Arg-Al Phe-Ala-Mete-H is-Ala-GI u . 1 1 .- El método de conformidad con la reivi ndicación 1 caracterizado además porq ue ia secuencia central de aminoáci comprende una secuencia de aminoácido GLP- 1 (7-35)Arg-Xaa-donde Xaa es un resid uo de aminoácido y R es u n g rupo bloq uead de alfa-carboxi io. 1 2. - El método de conformidad con la reivindicación caracterizado además porque el polipéptido de substrato incluye po lo menos dos copias de la secuencia central de aminoácido. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque las copias adyacentes de la secuencia central de aminoácido están conectadas mediante una secuencia enlazadora. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende poner en contacto el polipéptido de substrato y el reactivo amoniaco con la clostripaína, en un medio de base acuosa que tiene un pH aproximado de 9.0 a 11.0. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el medio de base acuosa comprende adicionalmente CaCI2. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el medio de base acuosa comprende adicionalmente agente reductor. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el agente reductor comprend " mercaptano. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque se selecciona el mercaptano del grupo que consiste de: ditiotreitol, ditioeritritol, 2-mercaptoetanol, ácid tioglicólico, cisteína, glutationa, y sus mezclas. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la clostripaína es una form inmovilizada de clostripaína. 20.- Un método para producir un polipéptido que tiene u grupo alfa-carboxiamida C-terminal , caracterizado porqu comprende: proveer un primer medio de base acuosa, que incluye u polipéptido de substrato que comprende por lo menos una secuenci central de aminoácido; donde la secuencia central de aminoácid tiene un residuo Arg C-terminal unido a un residuo de aminoácid adyacente, a través de una ligadura peptídica de alfa-carboxilo; mezclar el primer medio de base acuosa con un medio alcalin que incluye reactivo amoniaco, para formar un segundo medio d base acuosa, que tiene un pH de por lo menos alrededor de 9.0; y poner en contacto el segundo medio de base acuosa con l clostripaína inmovilizada, para abrir o dividir el polipéptido d substrato, en la ligadura peptídica de alfa-carboxilo, y producir u producto de medio de base acuosa que incluye el polipéptid producto que tiene el residuo Arg-N H2 C-terminal. 21 .- El método de conformidad con la reivindicación 20 caracterizado además porque el segundo medio de base acuosa tien un pH aproximado de 9.0 a 1 1 .0. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 20 caracterizado además porque comprende adicionalmente ajustar e pH del producto de medio de base acuosa, para formar un terce medio de base acuosa que incluye el polipéptido p rod ucto, y qu tiene un pH no superior a aproximadamente 8.5. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado además porque el paso de poner en contact comprende poner en contacto el segundo medio de base acuosa co la clostripaína inmovilizada durante no más de alrededor de veint minutos. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado además porque la secuencia central de aminoácid comprende GLP-1 (7-35)-Arg. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado además porque comprende activar la clostripaín inmovilizada con mercaptano, CaCI2 o una mezcla de ellos, par formar clostripaína inmovilizada activada; y el paso de poner e contacto comprende poner en contacto el segundo medio de bas acuosa con la clostripaína inmovilizada, activada.