CZ20011523A3

CZ20011523A3 - Enzymatická amidace peptidů

Info

Publication number: CZ20011523A3
Application number: CZ20011523A
Authority: CZ
Inventors: Dan Dormady; Jay S. Stout; Daniel J. Strydom; Barton Holmquist; Fred W. Wagner
Original assignee: Bionebraska, Inc.
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 1999-11-05
Publication date: 2002-02-13
Also published as: MXPA01004526A; KR20010099668A; AU755130B2; CN1325455A; JP2002529101A; HUP0104178A2; WO2000028067A9; NO20012232L; IS5932A; EP1127155A1; NO20012232D0; CA2349527A1; AU1342300A; US6461834B1; HUP0104178A3; WO2000028067A1

Description

Dosavadní stav techniky

Manipulace s DNA in vitro umožňují transfer cizorodých genetických informací do hostitelské buňky k účinnému ovlivnění exprese endogenních a cizorodých proteinů u širokého množství hostitelských buněk, např. mikrobiálních hostitelů. Rekombinantní DNA techniky zpřístupnily selektivitu, rozšíření a manipulaci exprese proteinů a peptidů.

Nicméně některé modifikace na rekombinantně vytvořených proteinech nebo peptidech nemohou být uskutečněny provedením změny sekvence DNA. Mnoho v přírodě se vyskytujících proteinů a peptidů obsahuje C-koncový aminokyselinový zbytek, který má α-karboxamidovou skupinu, ale amidová skupina není přímo vytvořena expresí. Místo toho je produkován genetickou expresí prekurzor proteinu a amid je zaveden in vivo enzymatickou modifikací prekurzoru proteinu. Pro konvertování α-karboxylové kyseliny C-koncového zbytku na α-karboxamidovou skupinu existují různé in vitro způsoby, nicméně dostupné způsoby mají obecně určitá omezení z mnoha různých faktorů, např. reakční podmínky, selektivita, typ používaných činidel a/nebo typy substrátů, které mohou být používány.

Navíc mnoho malých cizorodých proteinů a oligopeptidů nemůže být často úspěšně produkováno ve velkém množství ve většině buněčných hostitelů, poněvadž hostitel může peptid po expresi opět asimilovat. Například tam, kde délka požadovaného peptidů není více jak 60 až 80 aminokyselinových jednotek, se obvykle vyskytuje degradace spíše než akumulace konečného produktu.

V reakci na tento problém byly malé peptidy typicky exprimovány buď jako část fúzních proteinů, která zahrnují druhý větší peptid (např. β-galaktosidasu nebo chloramfenikolacetyltransferasu), anebo jako rekombinantní konstrukt, který zahrnuje mnohonásobné kopie požadovaného peptidů (vícekopiový konstrukt). Obecně v každém případě k vytvoření požadovaných peptidů musí být původní exprimovaný konstrukt štěpen. Velmi často je rekombinantní konstrukt štěpen za vzniku prekurzorových peptidů(u), které pak mohou být podrobeny posttranslační úpravě k přípravě požadovaných peptidů(u). Mohlo by být velice výhodné mít další způsob(y), které by umožňovaly štěpení • · · · prekurzoru peptidu, jež by se provádělo současně se zavedením α-karboxamidové skupiny do C-koncového aminokyselinového zbytku produktu štěpení.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu přípravy polypeptidu majícího C-koncovou α-karboxamidovou skupinu. Konkrétně se vynález týká enzymatické modifikace vybraných polypeptidových substrátů obsahujících arginin, která má za následek štěpení polypeptidového substrátu za vzniku polypeptidového produktu majícího C-koncovou akarboxamidovou skupinu. Způsob zahrnuje krok, ve kterém dochází ke kontaktu v podstatě vodného roztoku, který obsahuje (a) polypeptidový substrát („první polypeptid“) a (b) amoniakální činidlo s (c) klostripainem. Polypeptidový substrát zahrnuje alespoň jednu kopii jaderné aminokyselinové sekvence a typicky zahrnuje více než jednu kopii jaderné aminokyselinové sekvence (tzn. vícekopiový konstrukt). C-koncový zbytek jaderné aminokyselinové sekvence je argininový zbytek, který je vázán na přilehlý aminokyselinový zbytek přes α-karboxyl peptidovou vazbu (tzn. peptidová vazba „ArgXaa“). Poněvadž klostripain je endopeptidasa, reprezentuje Xaa aminokyselinový zbytek, který má svoji α-karboxylovou kyselinu vázanou buď na další aminokyselinový zbytek přes peptidovou vazbu („Arg-Xaa-Xaa“) anebo na karboxyl chránící skupinu („Arg-XaaR“). Karboxyl chránící skupiny jsou organické funkční skupiny, které nahrazují kyselou funkční skupinu karboxylové skupiny („-OH“ část -C(O)OH skupiny) a jsou schopné být štěpeny nebo hydrolyzovány k obnovení karboxylové skupiny (,,-C(O)OH skupiny“). Příklady vhodných karboxyl chránících skupin zahrnují alkoxy část esterové skupiny (např. ethoxy nebo benzyloxy část -C(O)OR skupiny) a -NRR' část nepeptidické amidové vazby (např. NRR' část -C(O)NRR' skupiny). -NRR' část může být nesubstituovaná (např. -NH2) nebo může být substituována jedním nebo dvěma substituenty (např. NHEt nebo NMe₂). Pokud je takový polypeptidový substrát ve vodném roztoku kontaktován amoniakálním činidlem za přítomnosti klostripainu, je polypeptidový substrát štěpen v akarboxylové vazbě peptidu argininového zbytku a vzniká druhý polypeptid („polypeptidový produkt“) mající C-koncový argininový zbytek obsahující α-karboxamidovou skupinu(„Arg-NH2“ zbytek).

Termín „amoniakální činidlo“, jak je zde používán, označuje činidlo, které obsahuje „rozpuštěný volný amoniak“ (tzn. NH3 rozpuštěný ve vodném roztoku) a/nebo je • · · · • ♦ ♦ · ······· · · • « · · · ··· ····· * · 4 44 · · · schopné uvolňovat volný rozpuštěný amoniak ve vodném roztoku za podmínek, kde klostripain bude amidačně štěpil peptid obsahující arginin. Například amoniakální činidlo může zahrnovat jednu nebo více solí amoniaku v rovnováze s rozpuštěným volným amoniakem. Relativní množství volného amoniaku a různých solí budou obecně funkcí různých parametrů, které jsou dobře známé odborné veřejnosti, např. pH roztoku, relativních koncentrací různých aniontů přítomných v roztoku a/nebo rozpustnosti jednotlivých specifických solí amoniaku. Poněvadž pK_a amoniaku („NH3“) ve vodném roztoku je okolo 9,2, bude obecně podstatná část amoniakálního činidla přítomna jako volný amoniak při pH okolo 9 nebo výše. V roztocích s pH nad pK_a amoniaku bude více než polovina amoniaku obecně přítomna buď jako rozpuštěný volný amoniak nebo jako hydroxid amonný („NH4OH“). Je také jasné, že aniontová část soli amoniaku obecně podléhá velmi rychlé vzájemné výměně sjinými anionty přítomnými vdaném roztoku. Tudíž, pokud při pH = 10 obsahuje vodný roztok chloridové soli (nebo chloridovou sůl) („Cf„), acetátové soli nebo sůl (,,OAc'„) a sulfátové soli nebo sůl („SO4',,), bude amoniakální činidlo v tomto roztoku pravděpodobně obsahovat chlorid amonný („NH4CI“), octan amonný („NH4OAC“) a sulfát amonný („(NTL^SC^“), jakož i rozpuštěný volný amoniak a hydroxid amonný („NH₄OH“). Zde uvedený způsob typicky používá vodné reakční prostředí, které obsahuje alespoň okolo 0,5M amoniakálního činidla. Ukazuje se, že koncentrace amoniakálního činidla asi 0,75M až asi 1,5M posunuje rovnováhu mezi optimálním průběhem a výtěžkem amidačního produktu, zatímco se dá vyhnout výrazné inhibici enzymové aktivity. Jak již bylo uvedeno výše, koncentrace amoniakálního činidla je závislá na ekvivalentech rozpuštěného volného NH₃, které jsou přítomny v médiu.

V rámci jednoho provedení předloženého způsobu je zahrnuto vytvoření roztoku polypeptidového substrátu v prvním vodném prostředí majícím pH nejvýše 8,5, výhodně majícím výrazně neutrální pH. Polypeptidový substrát může být štěpen v α-karboxylové vazbě peptidu za vzniku polypeptidového produ%u majícího C-koncový Arg-NTk zbytek upravením pH roztoku na alespoň 9,0, typicky mezi 9,0 a 11,0, a obsahující polypeptidový substrát s imobilizovanou formou klostripainu („imobilizovaný klostripain“) za přítomnosti amoniakálního činidla. Substrát a amoniakální činidlo jsou výhodně kontaktovány s imobilizovaným klostripainem po dobu nepřevyšující 20 minut, výhodně ne více jak 5 minut.

• · ·· ···»··· · · • · ··· ··· •··· i ·· « ·· ···

Typicky je první vodné prostředí smícháno s bazickým vodným roztokem („alkalické prostředí“) k zvýšení pH těsně před uvedením do kontaktu polypeptidového substrátu a amoniakálního činidla s imobilizovaným klostripainem. Jeden způsob, jak uskutečnit toto provedení vynálezu, je plnění pryskyřice obsahující imobiíizovaný klostripain do chromatografické kolony. Zásobní roztok substrátu a bazické roztoky jsou smíchány těsně před zavedením na sloupec, čímž se minimalizuje vystavení polypeptidového substrátu vysokému pH vodného roztoku. V typickém provedení vynálezu obsahuje bazický vodný roztok amoniakální činidlo. To však není nutné, protože část nebo veškeré amoniakální činidlo může být také přítomno v reakčním prostředí před zvýšením pH reakčního prostředí na alespoň 9,0.

Obecně je také výhodné upravit pH reakční směsi na hodnotu nižší než asi 8,5, výhodně na v podstatě neutrální pH (např. pH okolo 6,5 až 8,0) krátce po přerušení kontaktu polypeptidového produktu s imobilizovaným enzymem. Typicky se pH reakční směsi upravuje na hodnotu asi 8,5 nebo méně, jakmile směs vychází z kolony obsahující pryskyřičnou vrstvu s imobilizovaným klostripainem, což snižuje možnosti polypeptidového produktu být degradován za podmínek vodného prostředí s relativně vysokým pH podmínek používaných pro amidační štěpení katalyzované klostripainem. Je známo, že polypeptidy podléhají racemizaci a/nebo degradaci hydrolýzou za vysokých hodnot pH.

Je často výhodné volit takové podmínky, za kterých je polypeptidový substrát kontaktován s imobilizovaným klostripainem za přítomnosti amoniakálního činidla, aby se minimalizoval čas, po který je substrát a produkt vystaven vysokým hodnotám pH. Předložený způsob může být prováděn postupem, který umožňuje ve vysokém výtěžku přeměnu substrátu na produkt amidačmho štěpení za současného omezení doby, po kterou je roztok substrát/produkt vystaven kontaktu s imobilizovaným enzymem při pH větším než asi 8,5, na ne více než asi 30 minut. Výhodně je amidační štěpení prováděno takovým způsobem, že roztok substrát/produkt je na pH 8,5 nebo vyšším ne déle než asi 20 minut, výhodněji ne déle než asi 5 minut (např. štěpící reakce je provedena za asi 2 až 5 minut).

···*·· · « · · · «· · · · ♦ ··· • · ·«·· ·· • · ·· ······· ·

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje graf relativních množství výchozí látky a produktů jako funkci času pro klostripainem katalyzovanou amidaci GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) při teplotě 37°C v 1M NH4OH, 2,5 mM DTT, 1 mM CaC12 při pH 7,9.

Obrázek 2 ukazuje graf relativních množství výchozí látky a produktů jako funkci času pro klostripainem katalyzovanou amidaci GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) při teplotě 37°C v 1M NH4OH, 2,5 mM DTT, 1 mM CaC12 při pH 9,0.

Obrázek 3 ukazuje graf relativních množství výchozí látky a produktů jako funkci času pro klostripainem katalyzovanou amidaci GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) při teplotě 37°C v 1M NH4OH, 2,5 mM DTT, 1 mM CaC12 při pH 9,6.

Obrázek 4 ukazuje graf relativních množství výchozí látky a produktů jako funkci času pro klostripainem katalyzovanou amidaci GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) při teplotě 37°C v 1M NH₄0H, 2,5 mM DTT, 1 mM CaC12 při pH 10,4.

Obrázek 5 ukazuje graf relativních množství výchozí látky a produktů jako funkci času pro klostripainem katalyzovanou amidaci GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) při teplotě 37°C v 1M NH4OH, 2,5 mM DTT, 1 mM CaC12 při pH 11,0.

Obrázek 6 ukazuje graf výtěžku GLP-1 (7-36)NH2 jako funkci rychlosti průtoku při klostripainem katalyzovaném amidačním štěpení za použití imobilizované formy enzymu.

Obrázek 7 ukazuje schéma aparatury pro provedení enzymatické amidace peptidu obsahujícího Arg za použití imobilizovaného klostripainu.

Podrobnější popis vynálezu

Předložený způsob umožňuje amidační štěpení peptidového substrátu obsahujícího argininový zbytek za vzniku peptidového produ%u, který má C-koncový argininový zbytek s α-karboxamidovou skupinou („C-koncový Arg-NH₂“). Způsob zahrnuje krok, ve kterém dochází ke kontaktu peptidového substrátu amoniakálním činidlem ve vp_tv/f£>£'^_' vodném roztoku za přítomnosti klostripainu. Enzym může být přítomen buď v rozpustné nebo imobilizované formě.

Termín „klostripain“, jak je používán zde, se vztahuje jak na původní druhy enzymu, tak i na jeho modifikované verze. Modifikované verze zachovávají funkční schopnost klostripainu kamidačnímu štěpení peptidů obsahujících arginin v peptidové «· · · · · ··· • ···· · · • · ·· ······· · vazbě Arg-Xaa. Příklady vhodně modifikovaných klostripainů zahrnují funkční mutanty, které jsou odlišné od původních klostripainů substitucí, vynecháním a/nebo přidáním jednoho nebo více aminokyselinových zbytků. Jiné příklady vhodně modifikovaných verzí klostripainů zahrnují polypeptidy reprezentující funkční fragmenty klostripainů, které si zachovávají schopnost amidačního štěpení peptidu obsahující arginin, např. funkčně aktivní fragmenty nativního klostripainů generované odstraněním určitého počtu aminokyselinových zbytků z aminokyselinového konce a/nebo karboxylového konce z jedné nebo více podjednotek složky enzymu.

Nativní klostripain (klostridopeptidasa B) je extracelulámí thiolová endoproteasa zKlostridie. Tato proteasa je heterodimer a není homologická s jinými známými thiolovými proteasami. O tomto enzymu je publikováno, že má molekulovou hmotnost asi 30000 až 80000, izoelektrický bod (pí) asi 4,8 až 4,9. Klostripain byl poprvé izolován z filtrátu kultury Clostridium histolyticum (Mitchem et al., J. Biol. Chem., 243 (18): 4683 2602 (1968)). Enzym je rozeznáván podle vysoké specificity pro Arg-Xaa peptidové vazby (zejména Arg-Pro vazby) a má jak proteolytickou, tak i amidasovou/esterasovou aktivitu. Například v izolovaném B řetězci insulinu štěpí klostripain Arg-Gly vazbu 500 krát rychleji než Lys-Ala vazbu a v glukagonu se štěpí pouze vazby Arg-Arg, Arg-Ala a LysTry. Relativní počáteční rychlosti hydrolýzy těchto tří vazeb jsou 1, 1/7 a 1/300 (Labouesse, Soc. Chem. Biol, 42: 1293 (1960)).

Ví se, že aktivita klostripainů je modulována různými aktivátory a inhibitory. Příklady aktivátorů klostripainů zahrnují vápenaté ionty a merkaptany, např. cystein, 2-merkaptoethanol a dithiothreitol. Je také známo, že klostripain je inhibován za přítomnosti chlormethylketonu tosyl-L-lysinu, peroxidu vodíku, Co²⁺, Cu²⁺, Hg²⁺ nebo Cd²⁺ iontů, EDTA nebo citrátu.

Klostripain může být připraven fermentací za použití mikroorganizmů, např. způsobem popsaným v patentu US číslo 5 728 543, popis je zde uveden pouze jako odkaz. V tomto postupu jsou Clostridia kultivovány do té doby, dokud se klostripain neakumuluje v živném médiu. Vhodné příklady jsou kmeny Clostridia, např. Clostridium histolyticum DSM 627. Vhodné jsou také mutanty a varianty Clostridia, pokud jsou tyto mikroorganizmy schopné syntetizovat klostripain.

Kultivace je typicky prováděna anaerobně, samostatně nebo ve smíšené kultuře, např. submerzně v nemíchané kultuře za přítomnosti kyslíku nebo ve fermentačních ·· · · · · · « · • · ···· ·· tancích, a pokud je to účelné, za inertní atmosféry, např. dusíku. Fermentace je obecně prováděna při teplotním rozpětí asi 25°C až 40°C a při pH mezi 5 a 8,5. Kultivační půda ukazuje obecně detegovatelnou akumulaci enzymu po 1 až 3 dnech. Syntéza klostripainu začíná v pozdní exponenciální fázi růstu a dosahuje svého maxima ve stacionární růstové fázi. Produkce enzymu může být sledována stanovením aktivity (viz např. Mitchell, Meth. Enzym.·. 47: 165 - 170 (1997)). Ačkoliv jsou optimální podmínky fermentace u každého mikroorganizmu různé, jsou vhodné podmínky buď již odborné veřejnosti známy anebo mohou být snadno stanoveny předběžnými testy. Klostripain může být izolován z filtrátu kultury a čištěn klasickými postupy, např. methanolem nebo precipitací síranem amonným, iontoměničovou nebo gelovou chromatografií. Jsou také známy rekombinantně produkované formy enzymu (viz např. Witte et al., Microbiology, 140(5), 1175 - 1182 (1994)) a mohou být používány v předloženém způsobu do té míry, do které jsou enzymy schopné selektivního amidačního štěpení v Arg-Xaa peptidových vazbách.

V předloženém způsobu amidačního štěpení je klostripain před použitím typicky aktivován reakcí s redukčním činidlem, např. merkaptanem (sloučenina, která obsahuje thiolovou funkční skupinu („-SH“). Příklady vhodných redukčních činidel zahrnují merkaptany, např. dithiothreitol („DTT“), dithioerythritol („DTE“), 2-merkaptoethanol, thioglykolovou kyselinu, cystein, apod. Koncentrace používaného merkaptanu k aktivaci klostripainu může být různá, např. mezi asi 0,05 mM a asi 100 mM. Výhodně je aktivace enzymu pro amidační štěpení prováděna ve vodném roztoku, který obsahuje asi 0,1 až asi 5 mM merkaptanu (např. DTT). Enzym, který je aktivován tímto způsobem a/nebo přidáním zdroje vápenatých iontů, jak je popsáno níže, může být používán buď přímo anebo, kde je to vhodné, bez aktivačního pufru, např. chromatografií nebo dialýzou.

Poněvadž klostripain je také aktivován ionty vápníku (Ca²⁺ ionty), vodné roztoky obsahující klostripain používané při amidačním štěpení typicky obsahují zdroj iontů Ca²⁺, např. CaCl₂. Například klostripain se obecně používá jako vodný roztok, který obsahuje asi 0,01 až asi 2 mM CaCl₂. Nicméně, jak je uvedeno výše, klostripain může být před použitím v předloženém způsobu aktivován působením iontů Ca .

V této přihlášce vynálezu jsou používány standardní jednopísmenné nebo třípísmenné zkratky (viz 37 C.F.R. 1,822). Zkratka „Hse“ se vztahuje na homoserinlakton a/nebo homoserin, což označuje směs dvou forem aminokyselinového zbytku, který může být vznikat reakcí bromkyanu s methioninovým zbytkem, např. při štěpení peptidů ·· · ··· ··· • * · · · · ·· bromkyanem. Obě formy, homoserin a jeho lakton, existují jako směs rovnovážných produktů. Relativní množství dvou forem bude různé v závislosti na pH, přičemž forma volné kyseliny (homoserin) je favorizována při vyšším pH.

Přestože vodné prostředí používané k provádění amidační štěpící reakce je převážně složeno z vody, může dále obsahovat určité množství ve vodě mísitelného organického rozpouštědla. Příklady vhodných ve vodě mísitelných organických rozpouštědel zahrnují alkoholy (např. methanol, ethanol, 1,4-butandiol a trifluorethanol), ketony, močovinu, amidy (např. 7V,7V-dimethylformamid („DMF“), A/V-dimethylacetamid („DMA“) a N-methylpyrolidinon („NMP“), uhličitany (např. propylenkarbonát) a ethery (např. tetrahydrofuran) a acetonitril. I když vodné prostředí obecně neobsahuje více než asi 20 % (v/v) organického rozpouštědla (tzn. 20 % obj. organického rozpouštědla), bylo pozorováno, že přítomnost organického rozpouštědla ve vodném prostředí má tendenci zvyšovat proteolytickou aktivitu klostripainu, kdežto jeho amidační aktivita se snižuje. Amidační štěpící reakce podle vynálezu se proto typicky provádí ve vodném prostředí, které neobsahuje více než relativně nízkou hladinu organického rozpouštědla. Vodné prostředí neobsahuje typicky více než asi 10 % (v/v), výhodně ne více než asi 5 % (v/v) organického rozpouštědla. I když nejpříznivější poměr amidační aktivity k proteolytické aktivitě klostripainu je typicky pozorován ve vodném prostředí, které je v podstatě bez organického rozpouštědla, tzn. roztok neobsahuje více než asi 1 % (v/v) organického rozpouštědla, v mnoha případech může být výhodně zahrnout malé množství organického rozpouštědla do prostředí. Příklady obzvláště vhodných organických rozpouštědel, která mohou být zahrnuta ve vodném prostředí, zahrnují propylenkarbonát, acetonitril a ethanol.

Ačkoliv teplota reakce, při které dochází k amidačnímu štěpení, se podobně může pohybovat v širokých mezích, je typicky používáno teploty v rozmezí od asi 4 °C do asi 80 °C. Výhodně se amidační štěpení provádí při teplotě mezi 20 °C a 60 °C, reakční teplota od asi 25 °C do asi 50 °C je obzvláště výhodná. Amidační štěpící reakce podle vynálezu se typicky provádí v prostředí na vodné bázi majícím pH alespoň asi 9,0. Výhodně se enzymaticky katalyzovaná amidační štěpící reakce podle vynálezu provádí mezi pH asi 9,0 a asi 11,0 a rozpětí pH mezi asi 9,5 a 10,5 je velmi výhodné.

Doba potřebná pro amidační štěpení polypeptidového substrátu na odpovídající polypeptidový produkt mající C-koncový Arg-NH2 zbytek se může pohybovat v širokých mezích v závislosti na reakčních podmínkách. Například provádí-li s použitím metody jednofázového roztoku, pak může být dosažena podstatná konverze v rozpětí 15 minut až 48 hodin, zatímco pro pohodlnost se preferuje reakční čas mezi 30 minutami a 6 hodinami. Pokud je amidační štěpení prováděno kontaktováním substrátu a amoniakálního činidla s imobilizovaným klostripainem, je možno zvolit podmínky tak, aby bylo podstatné konverze (např. 40 % nebo vyšší) substrátu dosaženo za 5 min nebo méně. Jak je známo odborné veřejnosti, reakční rychlost může být ovlivňována různými faktory zahrnujícími koncentraci substrátu, amoniakálního činidla a enzymu, reakční teplotu, pH reakčního prostředí a přítomnost nebo absenci organického rozpouštědla vreakčním prostředí. K dosažení požadované reakční rychlosti a doby reakce mohou být upraveny jeden nebo více takových parametrů.

Relativně vysoké pH typicky používané při amidačním štěpení může vést k tendenci degradovat peptid, např. hydrolytickým štěpením a/nebo izomerizací, která může transformovat L-aminokyselinové zbytky na jejich odpovídající D-izomery („Dkontaminanty“). Bylo zjištěno, že rychlost degradace je ovlivněna reakčním prostředím včetně solí, rozpouštědel apod., jakož i teplotou a pH reakčního prostředí. Například pokud se vodný roztok GLP-1(7-36)NH2 při pH 10,5, obsahující 1M NH4OH, nechá stát při teplotě 45 °C po dobu 44 hodin, je podstatné množství peptidů degradováno na D-kontaminanty. Výrazně menší degradace (8 % D-kontaminantů) byla detegována, pokud se podobný roztok nechal stát při teplotě 44 °C po dobu 44 hodin při neutrálním pH a nebyla pozorována žádná podstatná degradace s podobným roztokem, který se nechal stát po zhruba stejnou dobu při teplotě -20 °C a 4 °C.

Naproti tomu při ponechání roztoků GLP-1(7-36)NH₂, rozpuštěných při pH asi 4 až

8,4 ve vodě, stát při teplotách v rozpětí -20 °C až 45 °C a po stejnou dobu nebyla pozorována v podstatě žádná tvorba D-kontaminantů. Další experimenty zkoumající degradaci GLP-1(7-36)NH2 v 1M roztoku chloridu amonného při různých hodnotách pH v rozmezí od 8,4 až 10,5 (v průběhu 25 hodin při teplotě 45 °C) demonstrovaly, že peptid je při pH 8,4 relativně stabilní. Za těchto podmínek byla měřena výrazná degradace (9 %) při pH 9,4 a se zvyšujícím se pH se zvyšovala také míra degradace. Tyto výsledky naznačily, že k omezení výrazné degradace substrátu a amidovaného produktu je třeba minimalizovat vystavení amidovaného peptidového produktu relativně vysokému pH (např. pH > 9,5).

Byl také pozorován účinek proměnlivé koncentrace solí amoniaku (amoniakální činidlo), NH4X, kde X je opačný iont k amonnému iontu, např. hydroxid, chlorid, acetát • · • · ··· ··· ····« · · · ·· ··· nebo sulfát, na klostripainem katalyzované amidační štěpení při konstantním pH a teplotě (pH = 10,0, 45 °C). Zvyšováním NH4CI/NH4OH koncentrace (vytvořené upravením pH vodného NH4OH roztoku na 10,0 kyselinou chlorovodíkovou) z 0,5 M na 1,0 M vedlo ke zvýšení tvorby a výtěžku požadovaného produktu amidačního štěpení bez výrazně vzrůstajícího množství D-kontaminantů, které se tvoří při relativně vysokém pH. Vzorec NH4OH se zde používá k označení hydroxidu amoniaku. Ten vzniká, např. jako obchodní druh hydroxidu amonného, rozpuštěním amoniaku ve vodě a existuje v rovnováze s hydrátem NH₃ rozpuštěným ve vodě. Jinými slovy, hydroxid amonný je směs NH₄ ⁺OH’ v rovnováze s „volným rozpuštěným NH₃“. Další zvyšování koncentrace NH4CI/NH4OH (na asi 2 M) neposkytlo jakékoliv jiné výrazné zvýšení max. výtěžku produktu amidace nebo množství degradačních produktů. Nicméně při vyšších koncentracích NH4CI/NH4OH zřejmě docházelo k inhibici aktivity enzymu, jelikož čas potřebný k dosažení maximálního výtěžku amidovaného produktu byl téměř trojnásobný při zvýšení koncentrace NH4CI/NH4OH z 1,0 M na 2,0 M. Z toho vyplývá, že koncentrace NH4CI/NH4OH okolo 1,0 M (např. od asi 0,75 M do asi 1,25 M) posunuje rovnováhu mezi optimální rychlostí a výtěžkem amidovaného produktu bez současné podstatné inhibice aktivity enzymu. Je asi možné nalézt druhy klostripainu, které jsou méně citlivé k pH a více aktivní v roztocích majících pH nad asi 10. Kromě toho jsou pro amidací vhodné i jiné protiionty amonného iontu, např. sulfátový, chloridový, a lze soudit, že protiionty nejsou omezeny ani na tyto ionty. Typicky, v důsledku rovnovážných reakcí v roztocích, bude amoniakální činidlo existovat jako směs NH4OH, jedné nebo více solí amoniaku (např. NH4CI a/nebo NH4OAC) a volného rozpuštěného NH₃.

V alternativním provedení podle vynálezu může být amidační štěpení prováděno za kontinuálního režimu, např. uvedením vodného roztoku obsahujícího reaktanty (peptidový substrát a amoniakální činidlo) v kontakt se suspenzí nebo vrstvou pryskyřice obsahující imobilizovaný klostripain. Klostripain může být navázán na imobilizační nosič různými standardními způsoby. Například byly připraveny preparáty klostripainu, imobilizovaného reakcí s tresylovými nebo aldehydickými skupinami na agarosových gelech nebo pryskyřicích na bázi methakrylátu, nebo s agarosou aktivovanou CNBr. Pryskyřice připravené tímto způsobem mohou vykazovat velmi kolísavé množství navázaného enzymu. Typické pryskyřice vhodné pro použití v předloženém způsobu obsahují asi 0,1 až asi 10 mg/ml, výhodně asi 1 až asi 5 mg/ml, imobilizovaného • · ··«« ··· • · ·· ······· · · • · ··· ··· ···« ·· · *· · · · klostripainu. Tyto přípravky byly velmi účinné při amidačním štěpení substrátů, např. polypeptidů, které obsahovaly sekvenci GLP-l(7-35)-Arg-Ala-Phe-Ala, na polypeptid mající C-koncový GLP-l(7-35)-Arg-NH2, za přítomnosti amoniaku při pH 10. Výtěžky jsou typicky > 40 %, podobné již zjištěným při reakcích s jedno fázovým roztokem. Pryskyřice obsahující imobiíizovaný klostripain mohou být plněny do kolon a mohou působit jako velmi účinné katalyzátory pro reakce amidačního štěpení.

Reakce používající imobiíizovaný klostripain je obecně prováděna procházením peptidového substrátu v příslušném vodném roztoku amoniaku kolonou, čímž odpadá potřeba odstranit potenciálně obtížný klostripain od reakčního produktu. Klostripain vázaný na pryskyřici může být aktivován před reakcí merkaptany nebo během amidace může být přítomno redukční činidlo. Typicky je enzym udržován v aktivovaném stavu zahrnutím merkaptanu (např. DTT) a vápenaté soli (např. CaCh) do reakčního prostředí. Amidace imobilizováného enzymu na bázi reaktoru také poskytuje způsob minimalizování vystavení peptidu vysokému pH, které může vést k degradaci produktu, zvláště pak k minimalizaci vzniku D-kontaminantu a deamidace postranního řetězce. Například je možno dva proudy, jeden obsahující peptid při relativně nízkém pH, při kterém je stabilní (např. ne více než pH asi 8,5) a druhý s vhodným složením k dosažení konečného pH a chemických podmínek pro reakci, smíchat těsně před zavedením reakční směsi na vrstvu pryskyřice. Čas, během kterého je substrát vystaven kontaktu s pryskyřicí, je typicky méně než asi 20 minut, výhodně ne více než asi 5 minut. Kromě toho se bezprostředně po opuštění reaktoru může roztok produktu výhodně smísit s roztokem vhodné kyseliny nebo pufru pro snížení pH na asi 8,5 nebo méně, kde je stabilita amidovaného produktu výrazně vyšší.

Předložený způsob je použitelný pro přípravu amidovaných forem různých peptidů, které obsahují C-koncový argininový zbytek. Cílový peptid, který má být připraven, může být jakákoliv použitelná polypeptidová sekvence s Arg jako koncovým zbytkem, např. nativní sekvence, modifikovaná nativní sekvence, nenativní sekvence mající biologickou aktivitu, její zkrácené formy a podobné verze. Peptidy mohou mít molekulovou hmotnost 300 až asi 20000, obvykle 400 až 10000. Takové peptidy typicky zahrnují 3 až 100 aminokyselinových zbytků, výhodně 3 až 70 zbytků. Příklady takových peptidů zahrnují uvolňovací faktory růstového hormonu, prekurzorové formy takových faktorů a jejich funkční fragmenty. Vhodné příklady peptidových substrátů, které mohou být ·· · · · · «9 9 9 · ·· 9 ··· 9 · 9 • · · · ······· « transformovány na C-koncové amidované peptidy použitím předloženého způsobu zahrnují následující polypeptidy:

GLP(l-35)-Arg-Xaa-R (SEQ ID NO:2):

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa-R a

GLP-l(7-35)-Arg-Xaa-R (SEQ ID NO: 3): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-LysGlu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa-R, kde substituent R reprezentuje karboxylovou chránící skupinu, aminokyselinový zbytek nebo peptidylovou skupinu (tzn. sekvenci dvou nebo více aminokyselin vázaných přes α-karboxylovou vazbu peptidů).

Předložený způsob může být používán kamidačnímu štěpení polypeptidových substrátů, které obsahují více než jednu kopii jaderné aminokyselinové sekvence. Takový vícekopiový konstrukt může mít sousedící kopie přímo navzájem na sebe napojené („souvisle navázané“). Nicméně velmi často jsou sousedící kopie jaderné aminokyselinové sekvence spojena přes spojovací sekvenci. Spojovací sekvence je relativně krátká sekvence aminokyselin (typicky ne více jak 5 až 10 aminokyselinových zbytků), která slouží jako „spacer“ mezi sousedícími kopiemi jaderné aminokyselinové sekvence. Aminokyselinové zbytky spojovací sekvence jsou obecně voleny tak, aby poskytovaly další místa, která mohou být selektivně štěpena enzymatickými nebo chemickými činidly.

Následující příklady jsou zde uvedeny pro ilustraci a pro snadnější orientaci při jejich používání. Příklady nemají nikterak omezovat rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - klostripainem katalyzovaná amidace pří pH 7,9

Peptidový substrát, GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO:1; 2 mg) se rozpustí v 900 μΐ 1 M vodného NH4OH a pH se upraví na 7,9 použitím ledové kyseliny octové. Substrátový roztok se pak před přidáním klostripainu inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 15 minut. Klostripain (1 mg) se rozpustí v 1 ml 25 mM dithiothreitolu obsahujícího * · ♦ · mM CaCh a nechá stát při pokojové teplotě po dobu 15 minut. Klostripainový roztok (100 μΐ) se přidá do testovací nádoby obsahující substrátový roztok při teplotě 37°C. Nádoba se uzavře, míchá převrácením a udržuje při teplotě lázně 37°C.

Průběh reakce katalyzované klostripainem se monitoruje odebráním 25 μΐ alikvótů z reakční směsi v časových intervalech (obecně každých 5 nebo 10 minut). V čase nula se odebere z reakční směsi těsně po přidání zásobního roztoku klostripainu. Reakční alikvóty se zředí desetkrát ledovou kyselinou octovou a analyzují HPLC použitím 5 mikronového C18 sloupce s reverzní fází, který se eluuje mobilní fází se slabým lineárním gradientem (na 35% B v 3. minutě, na 45% B v dalších 6 minutách, pak na 100% B ve 12,3 minutách) následujícími pufry: A: 95 % (v/v) vody, 5 % (v/v) acetonitrilu, 0,1 % (v/v) trifluoroctové kyseliny; B: 5 % (v/v) vody, 95 % (v/v) acetonitrilu, 0,1 % (v/v) trifluoroctové kyseliny.

Výsledky (obrázek 1) neukazují žádnou významnou amidaci. Primární reakce je hydrolýza v poloze Arg36 k odstranění Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 6) bez amidace za vzniku GLP-1(7-36)OH (SEQ ID NO: 4) je se slabým stupněm hydrolýzy v poloze Lys34 za vzniku GLP-1(7-34)OH (SEQ ID NO: 5). Množství GLP-1(7-36)OH (SEQ ID NO. 4) dosahuje maxima 55 % (v závislosti na výchozím GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse) (SEQ ID NO: 1) po 5 minutách, pak pokles v důsledku nižšího hydrolytického štěpení v poloze Lys34 za vzniku GLP-1(7-34)OH (SEQ ID NO: 5). Štěpení v poloze Lys34 naznačuje, že určité množství hydrolytické aktivity jde tímto směrem. Signifikantní množství sekundárního hydrolytického štěpení pozorované v poloze Lys34 je poněkud neočekávané.

GLP (7-36) OH (SEQ ID NO: 4): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Lu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-LysGlu-Phe-Ile-Ala-Trp-Lu-Val-Lys-Gly-Arg-OH

GLP (7 34) OH (SEQ ID NO: 5) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Lu-Glu-Gly-Gln Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Lu-Val-Lys.

Příklad 2 - amidace katalyzovaná klostripainem při pH = 9,0

Klostripainem katalyzovaná amidace GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) v 1 M vodném NH4OH při pH 9,0 a teplotě 37 °C se provádí podle způsobu a analýzy uvedené v příkladu 1. Hodnota pH se upraví na 9,0 ledovou kyselinou octovou.

Výsledky reakce prováděné při pH 9,0 (obrázek 2,0) znázorňují signifikantní množství amidace vytvářející maximální výtěžek 23,6 % GLP-1(7-36)NH2 po asi 10 minutách. Poměr amidace k hydrolýze (poměr GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OH) v 10. minutě (reakční čas) je 1,4. Při pH = 9,0 je hydrolýza v poloze Lys34 za vzniku GLP-1(734)OH (není uvedeno) nižší a po 60 minutách je pozorováno pouze 7,4 %.

GLP-l(7-35)-Arg-NH₂(SEQ ID NO: 4): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-val-Ser-Ser-Tyr-Lu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-LysGlu-Phe-Ile-Ala-Trp-Lu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂.

Příklad 3 - klostripainem katalyzovaná amidace při pH = 9,6

Klostripainem katalyzovaná amidace GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) v 1 M vodném NH4OH při pH 9,6 a teplotě 37 °C se provádí podle způsobu a analýzou popsanou v příkladu 1. Hodnota pH se upraví na 9,6 použitím ledové kyseliny octové.

Výsledky (obrázek 3) ukazují maximální výtěžek GLP-1(7-36)NH₂ (38,1 %) mezi

10. a 20. minutou. Poměr amidace k hydrolýze v 10. minutě je 5,1.

Aktivita klostripainu je trochu nižší při pH 9,6 v porovnání s 9,0 (příklad 2), což má za následek dosažení výtěžku GLP-1(7-36)NH₂ trochu později.

Příklad 4 - klostripainem katalyzovaná amidace při pH 10,4

Klostripainem katalyzovaná amidace GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) v 1 M vodném NH4OH při pH 10,4 a teplotě 37 °C se provádí podle způsobu a analýzou popsanou v příkladu 1. Hodnota pH se upraví na 10,4 ledovou kyselinou octovou. Výsledky pokusné amidace při pH 10,4 jsou uvedeny na obrázku 4. Při tomto pH se vytvoří maximální výtěžek GLP-1(7-36)NH₂ (42,3 %) po asi 30 minutách. Poměr amidace k hydrolýze ve 30. minutě (reakční čas) je 4,7. Výtěžek GLP-1(7-34)OH po 60 minutách (není uveden) je 9,4 %, podobné kjiž pozorovanému množství při pH 9,0 a 9,6, což • 4 • · · · · · ··· • · ·*·· ·· • · · · ······· · • · · · · ·· · ·« « demonstruje, že při pH 10,4 je množství hydrolytického štěpení v poloze Lys34 menší než při nižších hodnotách pH.

Příklad 5 - klostripainem katalyzovaná amidace při pH 11,0

Klostripainem katalyzovaná amidace GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) v 1 M vodném NH4OH při pH 11,0 a teplotě 37°C se provádí podle způsobu popsané^» v příkladu 1. Hodnota pH se upraví na 11,0 ledovou kyselinou octovou.

Výsledky pokusné amidace při pH 11,0 jsou uvedeny na obrázku 5. Při tomto pH se po 60 minutách obdrží 27,6 % výtěžek GLP-1(7-36)NH₂ (SEQ ID NO: 4). Poměr amidace ku hydrolýze v 60< minutě (reakční čas) je 7,0. Nicméně reakce probíhá mnohem pomaleji než při jakémkoliv nižším pH a po 60 minutách nedosáhne ani maximálního výtěžku. Při tomto relativně vysokém pH je amidace je silně zvýhodněná oproti hydrolytickému štěpení, ikdyž po 60 minutách se výtěžek GLP-1(7-36)OH (SEQ ID NO: 4) zvyšuje pomaleji než výtěžek GLP-1(7-36)NH₂. Při tomto vyšším pH nebyla zjištěna žádná hydrolýza v poloze Lys34 za vzniku GLP (7-34)OH (SEQ ID NO: 5).

Příklad 6 - klostripainem katalyzovaná amidace GLP-l(7-36)-Ala-Phe-Ala-Met-HisAla-Glu.

Klostripainem katalyzovaná amidace GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Met-His-Ala-Glu (SEQ ID NO: 7) je pozorována v 1 M vodném NH4OH a teplotě 37°C podle způsobu popsaném v příkladu 1. Amidace se provádí při pH 10,3 a 10,8 za vytvoření maximálního výtěžku 32,9 % a 12,4 % GLP-1(7-36)NH₂. Tabulka I ukazuje srovnání těchto výsledků s výsledky, které se obdrží z klostripainem katalyzované amidace GLP-l(7-36)Ala-PheAla-Hse (SEQ ID NO: 1) jako substrátem. Výsledky naznačují optimální rozpětí pH mezi 9,0 a 11,0, výhodně mezi 9,5 10,5.

Tabulka I

Výtěžek a selektivita amidace jako funkce pH

pH

Substrát

Výtěžek GLP-l(7-36)NH₂(%)^a

Poměr GLP-1(7-3 6)NH₂/GLP(7-3 6)OH^b

•9 ···· • · · 9 · · « 9 9·· · · » 9 9« « 9 · 9 • · · · ··««·· · ·

7,9	GLP(7-36)AFAHse	žádný	nd
9,0	GLP(7-36)AFAHse	3,6	1,4
9,6	GLP(7-36)AFAHse	38,1	3,1
10,4	GLP(7-36)AFAHse	42,3	4,7
n,o	GLP(7-36)AFAHse	27,6^C	7,0
10,3	GLP(7-36)AFAHAE	32,9	nd
10,8	GLP(7-36)AFAHAE	12,4	nd

- maximální výtěžek ^b - poměru v čase pozorovaného maximálního výtěžku ^c - po 60 minutách (maximální výtěžek nebyl dosažen) nd - nestanoveno

Příklad 7 - amidace syntetických substrátů

Syntetické substráty generické struktury Val-Lys-Gly-Arg-XXXX (VKGRXXXX ; SEQ ID NO: 8)), kde XXXX reprezentuje peptidylový fragment mající tři nebo čtyři aminokyselinové zbytky, se inkubují klostripainem v 1 M chloridu amonném, pH 10,4,2 mm DTT, 1 mM chloridu vápenatém při teplotě 45°C. Alikvóty reakční směsi se sbírají v různých časových intervalech, zháší ledovou kyselinou octovou a analyzují kapilární elektroforézou. Tabulka II uvádí procentuální podíl štěpení substrátu po 10 minutách při stejných koncentracích klostripainu pro různé substráty ve všech případech je majoritní produkt analyzovaný HPLC C-koncový α-karboxamid Val-LysGly-Arg (VKGR-NH₂ ; SEQ ID NO: 9). Charakter C-koncového fragmentu může být velice různý, nicméně jeho kapacitu k amidačníp štěpení to nikterak výrazně nesnižuje.

Tabulka Π

Substrát (VKGR-XXXX) „XXXX“	Procent, mn. zbývajícího substrátu (po 10 min. reakce)	SEQ ID NO
AFFG	50,7	10
AFAM	56,7	11

Mí* • 9

AFM	73,1	12
APAG	64,7	13
AFAHse	67	14
AFHse	71	15
LAFG	82,9	16
AAGG	81,9	17
ALAG	78,7	18
AAPG	82,5	19
LAAG	85	20
AAFG	80,8	21
QAQG	90,6	22
HAEG	95,4	23

Příklad 8 - příprava GLP-l(7-3 )NH2 amidačním štěpením GLP-l(7-36)AIa-Phe-AlaHse klostripainem prováděná v laboratorním měřítku

Lyofilizovaný peptid GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1), připravený rekombinantní technologií, se rozpustí v 4,24 mg/ml v 1,16 Μ NH4OH, 0,25 M HC1, 2,5 mM DTT, 1 mM CaCl₂ upraveném na pH 10,5 s 0,15 M NaOH a přidá se klostripain v poměru enzym:substrát 1:300. Před zastavením 10 mM EDTA se nechá reakce běžet po dobu 4,5 hodin při teplotě 45°C. Produkt GLP-1(7-36)NH₂ (SEQ ID NO: 4) se čistí chromatografií použitím reverzní fáze na Amberchrome CG71 a lyofilizuje.

Peptidový produkt měl aminokyselinové složení stejné v rámci experimentální chyby s teoretickým složením GLP-1(7-36)NH₂, absorpční spektrum, které odráží přesně očekávaný obsah tyrosinu a tryptofanu, atomovou hmotnost 3298 měřenou hmotnostním spektrometrem MALDI-TOF (v rámci experimentální chyby identickou s očekávanou hodnotou), stejnou sekvenci s teoretickým standardem a stejný pohyb při HPLC jako syntetický komerční vzorek peptidu, byl dobře separovatelný od GLP-1(7-36)OH. Z těchto důvodů se polypeptidový produkt identifikoval jako GLP-1(7-36)NH₂.

• · · · • ·

Příklad 9 - účinek organického rozpouštědla na proteolytickou aktivitu klostripainu

Substrátový roztok (1 ml) 2 mg jV-Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilidu v 2,5 mM dithiothreitolu, lmM chlorid vápenatý, 50mM Tricin pufr o pH 8,5 se inkubuje při pokojové teplotě s 10 pg klostripainu ve vodném roztoku obsahujícím 10% (v/v) organické rozpouštědla. Počáteční hodnoty se stanoví fotometrickou detekcí uvolněného p-nitrofenolátového aniontu.

Tabulka III r

Účinek organického rozpouštědla na proteolytickou aktivitu klostripainu

Organické rozpouštědlo	Aktivita vztažená na střední nepřítomn. organického rozpouštědla (%(v/v))
Acetonitril	180
Propylenkarbonát	264
Trifluorethanol	200
Dimethylformamid	123
Dimethylacetamid	108
Tetrahydrofuran	26
1,4-Butandiol	116
TV-Methylpyrolidinon	90

Tyto reakce se opakují za přítomnosti různých množství organického rozpouštědla a optimální koncentrace pro proteolytickou aktivitu se stanoví pro propylenkarbonát (10 %), V, V-dimethylfbrmamid (20 %), trifluorethanol (20 %) a acetonitril (20 %).

Příklad 10 - inhibice aktivity klostripainové amidace organickým rozpouštědlem

Maximální dosažená úroveň amidace za přítomnosti různých organických rozpouštědel se stanoví s GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1; 2 mg/ml) v 2, 5 mM DTT, 1 mM chloridu vápenatém, 2 M octanu amonném, pH 10,4, při teplotě 45°C s pg klostripainu v 1 ml reakční směsi. Alikvóty reakční směsi se odstraní v pravidelných • · · · • · časových intervalech, poté se provede zhášení kyselinou octovou a analýza pomocí HPLC s reverzní fází.

Tabulka IV

Účinek organického rozpouštědla na aktivitu klostripainové amidace

Rozpouštědlo	Rozsah amidace (% konvertovaného substrátu
vodný roztok (bez org. rozpouštědla)	44
20% Trifluorethanol	9
10% Propylenkarbonát	29
20% Acetonitril	18

Výsledky v tabulce IV ukazují, že za přítomnosti těchto rozpouštědel je potlačení aktivity pro amidaci evidentní. Série reakcí se provádí v 1,25 Μ NH4OH, pH 10,0, 2,5 mM DTT, 1 mM CaCb, teplotě 45°C, při poměru enzym/substrát (w/w) 1:190 při různých nízkých koncentracích acetonitrilu a ethanolu (tabulka V). Nírké hladiny acetonitrilu nebo ethanolu mají malý účinek na výtěžky transamidace, rychlost reakcí nebo poměr GLP-1(7-36)NH2 ku GLP-1(7-36)OH, ale snižují množství vznikajících D-kontaminantů.

Tabulka V

Rozpouštědlo	Max.výtěžek (%)	Max.výtěžek (min)	%D	GLP-1(7-3 6)NH₂/GLP- 1(7-36)OH
Voda	60	90	3,4	4,9
4 % Acetonitril	57	90	1	3,9
2 % Acetonitril	59	120	1,2	4,1
5 % Acetonitril	60	90	nd	5,2
10 % Ethanol	58	150	nd	3,3
5 % Ethanol	59	120	nd	4,0
2,5 % Ethanol	62	90	nd	5,4
Použité zkratky: nd - nestanoveno; % D - procento D-kontaminantů

······ ·*Β ·· • · · ··· ··· • · ···· ·· • · » · ······· · ····· ·« · ·· ·»»

Příklad 11 - účinek koncentrace amoniaku na transamidaci

Účinek rozdílných koncentrací amoniaku (0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5 a 2 M) při pH 10 na amidační štěpení of GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1) se stanoví podle následujících reakěních podmínek: 4mg/ml GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1), 2,5 mM DTT, 1 mM CaCl₂, teplota 45°C, poměr enzym/substrát 1:190. Výsledky jsou uvedeny v tabulce VI níže. Tři koncentrace amoniaku 1,0, 1,25 a 1,5 M poskytnou podobné výtěžky (43, 45 a 44 %). Všechny mají stejné množství D-kontaminantů, 4,2 % a poměrné díly jsou u každého zhruba stejné.

Tabulka VI

Účinek koncentrace amoniaku

Koncentrace ΝΗ,ΟΗ (M)	Maximální výtěžek³ (%)	Čas^b (min)	GLP-1(7-36)NH₂/ ΟΕΡ-1(7-36)ΟΗ°	D-kontaminanty^d
0,5	34	30	1,6:1	3,4
0,75	39	40	2,5:1	3,5
1,0	43	60	4,4:1	4,2
1,25	45	100	5:1	4,2
1,5	44	140	5,6:1	4,2
2,0	41	165	7,5:1	4,3

^a- Maximální výtěžek GLP-(7-36)NH₂;

^b- Čas, kdy se obdrží max. výtěžek;

^c- Poměr GLP-1(7-36)NH₂/GLP-1(7-36)OH v čase potřebném k dosažení max. výtěžku;

^d- % D-kontaminantů v důsledku degradace produktu za vzniku D-aminokyselin v čase maximálního výtěžku).

Příklad 12 - účinky amonných protiiontů na transamidaci

Byly zkoumány účinky změn protiiontů za přítomnosti amoniakálního činidla na transamidaci. Hodnota pH se dvakrát upravila, tzn. reakce se nechaly běžet za přítomnosti chloridu amonného, acetátu amonného a síranu amonného. Amidační štěpení GLP-1(736)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1; 1,28 mg/ml) vreakčním prostředí obsahujícím 2,5

mM DTT, 1 mM CaCl₂, za teploty 45°C a poměru enzyme/substrát 1:190 s 1,25 Μ NH4OH upraveném na pH 10,0 kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou octovou nebo kyselinou sírovou, se nechalo běžet dvakrát.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce VII níže. Výtěžky produktu ve všech reakcí byly skoro podobné, stejně tak jako množství D-kontaminantů a tudíž bylo vidět, že charakter protiiontu má malý vliv na amidaci za vzniku GLP-1(7-36)NH₂.

Tabulka VII

Účinek amonného protiiontu

Protiiont	Výtěžek GLP-(7-36)NH₂ ^a	% D-kontaminantů^b
cr	51%	4,7%
OAc'	51%	4,8%
SOí	42%	4,0%

- po 150 minutách, žádná z reakcí nedosáhla maximálního výtěžku ^b - % D-kontaminantů v důsledku degradace produktu přes vznik D-aminokyseliny (v 150 min.

Příklad 13 - účinek koncentrace CaCI₂ na transamidaci

Amidační štěpení GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1; 1 a 5 mg/ml) se zkoumalo v reakcích obsahujících 0, 0,1, 1,0 a 10 mM CaCl₂ (tabulka VIII) za přítomnosti 1,25 Μ NH4OH, upraveném pH na 10,0 kyselinou chlorovodíkovou, 2,5 mM DTT, poměru enzym/substrát 1:200. Za přítomnosti CaCl₂ nebyla pozorována žádná aktivita. To znamená, že tento kationt, který je vyžadován pro aktivitu a koncentrace vyšší než 0,1 mM, neovlivňuje výtěžek transamidace.

Tabulka VIII

Účinek koncentrace CaCl₂ na amidační štěpení

Koncentrace CaCl₂(mM)	Konc. Substrátu (mg/ml)	Maximální výtěžek³(%)	GLP-1(7-36)NH₂/ GLP-l(7-36)OH^b
0	1	NA	NA
0,1	1	60	4,6:1

1,0	1	59	4,4:1
10	1	59	4,4:1
0	5	2	-
2	5	47	4,3:1

NA - žádná aktivita;

^a - maximální výtěžek GLP-1(7-36)NH₂;

^b - GLP-1(7-36)NH₂/GLP-1(7-36)OH, v čase dosaženého maximálního výtěžku.

Příklad 14 - účinek koncentrace enzymu na amidační štěpení

Amidační štěpení GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1; 1 mg/ml) při poměru enzyme/substrát 1:200, 1:400, 1:800 a 1:400 se zkoumalo při 1,25 Μ NH4OH, upraveném pH na 10,0 kyselinou chlorovodíkovou, 2,5 mM DTT, 0,5 mM CaCh, při teplotě 45°C, pod atmosférou dusíku (tabulka IX) a analyzovalo podle způsobu z příkladu 1. Výtěžky GLP-1(7-36)NH2 jsou ve všech případech mezi 50 a 60 %, ale při menších poměrech enzym/substrát je čas potřebný k dosažení maximálního výtěžku podstatně delší (až 360 min při poměru 1:800). Při vyšších koncentracích substrátu byl výtěžek pořád slušný, ačkoliv při reakci vzniká méně produktu a max. výtěžek s dosáhne v delším čase. Se zvyšujícími se reakčními časy při vyšších pH se také zvyšuje množství Dkontaminantů, cože je očekováno, poněvadž substrát a produkt jsou vystaveny alkalickému prostředí (pH) po delší dobu.

Tabulka IX

Poměr enzym/substrát

Konc. substrátu³ (mg/ml)	Poměr enzym/substrát	Maximální výtěžek³	D-kontaminantů (%)
(%)	(min)
1	1:200	59	90	3%
1	1:400	60	190	4,5%
1	1:800	58	360	6%
5	1:400	51	90	nd

GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO: 1). maximální výtěžek GLP-1(7-36)NH₂ a čas výskytu.

• · ^c - % D-kontaminantů v čase maximálního výtěžku (v důsledku degradace produktu přes tvorba

D-aminokyseliny).

nd - nestanoveno

Příklad 15 -merkaptanová redukce vyžadovaná pro aktivitu klostripainu

K dosažení maximální aktivity se klostripain nechá typicky reagovat s merkaptanem. Koncentrace merkaptanu (DTT) se stanoví při koncentracích 0, 0,5, 1,0,

2,5 a 5,0 mM. Podmínky pro amidační reakci jsou: 1 mg/ml GLP-l(7-36) Ala-Phe-AlaHse, 1,25 Μ NH4OH, upraveném na pH 10,0 kyselinou chlorovodíkovou, 0,5 mM CaCl₂, teplota 45°C, propláchne N₂ (g), poměr enzym/substrát = 1:400 a průběh a výsledky reakce se stanoví podle způsobu z příkladu 1.

Bez přítomnosti přidaného DTT se obdrží pouze 20% výtěžku produktu amidace GLP-1(7-36)NH₂. Pokud se reakce nechá běžet za přítomnosti 0,5 až 5 mM, pak ve všech reakcích se obdrží asi 60% GLP-1(7-36)NH₂. To znamená, že k získání optimálních výtěžků amidačního štěpení je třeba redukce enzymu redukčním činidlem, např. merkaptanem.

Příklad 16 - amidace jinými proteasami specifickými pro Arg

GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (mezí 0,5 a 2 mg/ml) se rozpustí v 1 M hydroxidu amonném při pH 10 a 8,5 a jednotlivě inkubuje s šesti různými proteolytickými enzymy, z nichž pět má specifitu ke štěpení peptidů v poloze karboxylu peptidové vazby argininového zbytku, podobně jako klostripain. Těchto pět zahrnuje trypsin, thrombin, kathepsin B (také testovaný při pH 5,5), koagulační faktor Xa, plasmin a papain. Papain je thiolová proteasa, ačkoliv není specifická k arginylovým vazbám. Žádná z těchto proteas vzhledem k provedenému stanovení pomocí chromatografíe s reverzní fází podle způsobu z příkladu 1 neprodukuje GLP-1(7-36)NH₂. Poměry enzym:substrát jsou 1:50 až 1:100 a tam, kde je to vhodné, se přidají aditiva pro specifické proteasy (např. chlorid vápenatý). Za těchto podmínek pouze klostripain vytváří měřitelný GLP-1(7-36)NH₂.

« ·

Příklad 17 - purifikace klostripainu afmitní technikou

Klostripain se čistí afmitní chromatografií (Ullman et al., Biol. Chem., HoppeSeyler, 375, 89-92 (1994)) použitím sloupce Toyopearl TSKgel AF-Red resin plněný v povlečeném 1,2 cm ID sloupci o výšce vrstvy 11 cm. Pufř A (25 mM Hepes, 5 mM CaCh, pH 8) a pufř B (25 mM Hepes, 5 mM CaCh, 1 M NaCl, pH 8) se filtrují přes 0,45 μπι nylonový filtr a odplyňují ve vakuu po dobu deseti minut.

Klostripain (57,3 mg; Worthington) se rozpustí v 14,5 mg/ml v 3 ml 15 % pufru B v pufru A a nanese na sloupec, který byl předem uveden v rovnováhu 15% pufrem B v pufru A při 1 ml/minutu. Sloupec se eluuje 15 % pufrem B v pufru A po dobu pěti minut, pak lineárním gradientem 15 % až 100 % pufru B v pufru A v průběhu čtyřiceti minut. Frakce se spojí a ty, které obsahují klostripain, identifikované jejich schopností katalyzovat amidaci, se spojí a nechá se na ně působit 5mM dithiothreitol a koncentrují ultrafiltrací na 5 mg/ml.

Příklad 18 - imobilizace klostripainu na pryskyřici Toyopearl AF-Formyl-650M

Pryskyřice Toyopearl AF-Formyl-650M, dodávaná jako kašovitá směs obsahující konzervační prostředek, se přidá do 10 ml disponibilního sloupce s 45 pm fritou a promývá 2 sloupcovými objemy 0,1 M Mes pufru, 5 mM CaCh, pH 5. Klostripain z výše popsané purifikace v 5 mM Hepesu, pH 8, se zředí na ekvivalentní objem 0,lM Mes s konečnou hodnotou pH = 5,5 a přidá na odvodněnou pryskyřici. Pak se přidá kyanoborohydrid sodný (150 μΐ, 1M) a kašovitá směs pryskyřice je míchána kontinuální inverzí pokrytého sloupce po dobu 20 hodin při teplotě 23 - 25°C. Sloupec se poté zbaví vody, ponechá se eluent pro analýzu a pryskyřice se promyje dvěma sloupcovými objemy 1M Tris-HCl, 5 mM CaCh, pH 7,8. Poté se přidá sloupcový objem tohoto pufru společně s 50 μΐ kyanoborohydridu sodného a směs se míchá po dobu 1 hodiny. Pryskyřice se pak promyje deseti sloupcovými objemy 1M NaCl, 25 mM Hepes, 5 mM CaCh, pH 8, pak stejným množstvím pufru neobsahujícího žádný NaCl. Analýzou přípravy výsledné klostripainové pryskyřice měřením ztráty enzymu z roztoku se zjistí, že 1,8 až 4,4 mg enzymu se navázalo na ml pryskyřice. Do doby použití se klostripainová pryskyřice uchovává v tomto pufru při teplotě 4°C.

·· ♦ · · ·*·· • · · · · ···

Λ · ·· ········ a · · · ·· · • · · v · ·· · · ··

Stejné výsledky se dosáhnou také s klostripainem imobilizovaným na jiných pryskyřicích. Příklady zahrnují Toyopearl Amino Link a Toyopearl Formyl 650M (Toso Haas, lne.), což jsou pryskyřice na bázi aldehydů a Ultra Link (Pierce), pryskyřice na bázi azlaktonu. Tyto pryskyřice se vážou na volné amino skupiny v enzymu. Všechny tyto pryskyřice obsahující imobilizovaný klostripain provádí amidační štěpení GLP-1(736)Ala-Phe-Ala-Hse na GLP-1(736)NH₂ s výtěžky až 77%, obecně v rozpětí 50 až 60%.

Příklad 19 - reakce katalyzované imobilizovaným klostripainem

Pryskyřice s imobilizovaným klostripainem (40 ml) v 50 mM Hepes, 5 mM CaCl₂při pH 8,5 se plnila rychlostí 35 ml/min do 2,5 cm ID sloupce opláštěného sklem, který je vybaven adaptérem pro regulaci toku a peristaltickou pumpou. Voda o teplotě 47°C se nechá cirkulovat pláštěm. Pryskyřice se pak promyje 200 ml lmM DTT a 1 mM CaCl₂ o teplotě 47°C při toku 8 ml/min a pH 8,5. Po této popsané přípravě je sloupec hotov pro amidační štěpení.

Pro kontinuální amidační štěpení GLP-l(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse se použije aparatura znázorněná na obrázku 6.

Roztok substrátu (13 1 v 0,65 mg/ml) v 7,5 % vodném acetonitrilu obsahujícím 1,25 mM HC1 (roztok 1) se uvede v rovnováhu ve vodné lázni o teplotě 47°C a spojí s peristaltickou pumpou k trubici 1 s výstupem tohoto spojení v T-spoji. Připraví se roztok 13 1 2,5 Μ NH4OH, 2 mM DTT a 2 mM CaCl₂, upravený na pH 10,0 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou („roztok 2“), který se umístní do vodné lázně o teplotě 47°C a spojí s peristaltickou pumpou k trubici 2 s výstupem tohoto spojení také v T-spoji. Třetí trubicí vycházející z pumpy, trubice 3, proudí roztok 3 (1,25M HC1) za pokojové teploty přes pumpu do T-spoje 2, který je spojen s efluentem sloupce. Výstup z T-spoje 2 představuje produkt reakce. Obvykle jsou čerpací potrubí 0,125 inID Tygon trubice a čerpací rychlosti v trubicích 1, 2 a 3 jsou stejné, zhruba 3 až 6 ml/min. Roztoky 1 a 2 se spojují v T-spoji 1, smíchávají se za vzniku směsi o pH = 10 a výsledný roztok opouští T-spoj 1 a vstupuje do sloupce. Tento roztok prochází sloupcem a vstupuje do T-spoje 2 za průtokové rychlosti asi 6 ml/min. V T-spoji 2 se efluent vycházející ze sloupce míchá s 1,25M roztokem HC1, která snižuje hodnotu pH reakčního roztoku obsahujícího GLP-1(736)NH₂ na asi 8,5. Při používané průtokové rychlosti je doba, po kterou jsou substrát a • · produkt v kontaktu s pryskyřicí, asi 5 minut. Tímto způsobem nepřesáhne doba, po kterou jsou substrát a/nebo produkt vystaveny vodnému prostředí pH=10, 5 minut.

Obvykle je rychlost proudění upravena k dosažení maximálního výtěžku produktu a minimálního vzniku kontaminantů podle opakovaných stanovení odběrů vzorků efluentu T-spoje 2 a analýzou HPLC podle způsobu z příkladu 1. Obrázek 7 ukazuje výsledky této reakce za výše uvedených podmínek, kde výtěžek a rychlost průtoku v sloupci jsou zaznamenávány jako funkce času na experiment. Průměrný výtěžek je skoro 50% pro tvorbu GLP-1(7-36)NH2 s maximem blízko 64% při výsledné rychlosti průtoku 14 ml/min. Pokud byla rychlost průtoku příliš vysoká, 44 ml/min, výtěžek se snížil na 34%. Vrácení rychlosti průtoku na 16 ml/min způsobilo, že výtěžek se opět přiblížil až na 50%.

Pokud tvoření produktu není optimální, pak jestliže tvoření produktu je nízké dejme tomu pro delší dobu vystavení substrátového roztoku klostripainu navázaného na pryskyřici je rychlost průtoku snížena nebo jestliže nadměrné vystavení enzymu je zřejmé zvýšenými množstvími GLP-1(7-34) v důsledku štěpení v poloze Lys34 je rychlost průtoku zvýšena. Také je odborné veřejnosti zřejmé, že je možné provést různé změny při neutralizaci koncentrace HC1, koncentrace substrátu, teploty, koncentrace organického rozpouštědla a jiných faktorů, které ovlivňují míru imobilizovaného klostripainu, takovým způsobem, aby se optimalizovalo tvoření produktu.

Příklad 20 . imobilizované amidační štěpení: účinek sloupcových parametrů

V tabulce X je ukázána série reakcí s imobilizovaným klostripainem na dvou různých pryskyřicích, kde jsou tabelovány účinky rychlosti průtoku, koncentrace GLP-1(736)Ala-Phe-Ala-Hse, teploty, množství pryskyřice a výtěžek GLP-1(3-36)NH₂ pro reakce prováděné způsobem analogickým k příkladu 19 a za podobných podmínek, ale s použitím 1 x 15 cm sloupce. Závěry jsou takové, že obecně pokles teploty vede ke snížení výtěžku (srovnej první čtyři při teplotě 23°C s dalšími při teplotě 45°C) stejně tak jako signifikantní změny průtokových rychlostí (srovnej vstupy 1 a 2,3 a 4,6 a 7) a koncentrací GLP-1(736)Ala-Phe-Ala-Hse. Změny těchto a dalších parametrů sloupcové reakce mohou různým způsobem ovlivnit výtěžek. V tomto pozorování se výtěžky různily od 4 do 63% v závislosti na přesných podmínkách používaných pro reakci a ukazují, že reakce mohou být optimalizovány v závislosti na změně různých sloupcových parametrů • * • · ···· ·· • · · · · • · · · • · ♦ · · • · · · • » · · 9 · ·

Tabulka X

Srovnání různých podmínek enzymové reakce

Druh pryskyřice	GLP-1(7- 36)APAHse (mg/ml)	Rychlos průtoku (ml/min)	Výtěžek (%)	Teplota
1.	AminoLink	0,1	1	56%	23°C
2.	AminoLink	0,14	0,1	24%	23°C
3.	AminoLink	1	0,1	4%	23°C
4.	AminoLink	1	4	11%	23°C
5.	AminoLink	0,14	0,5	61%	45°C
6.	AminoLink	1	4	48%	45°C
7.	AminoLink	1	3	57%	45°C
10.	AminoLink	0,1	3	63%	45°C
11.	AminoLink	0,25	2	50%	45°C
12.	Toyopearl Formy 1	0,25	2-4	60%	45°C
13.	UltraLink	0,25	1	46%	45°C
14.	Toyopearl Formy 1	0,25	2	62%	45°C
15.	Toyopearl Formyl	0,5	2	57%	45°C
16.	Toyopearl Formyl	1	2	53%	45°C

Vynález byl popsán s odkazy na různé specifické a názorné provedení a techniky.

Nicméně mělo by být jasné, že při zachování charakteru a rozsahu vynálezu může být vytvořen velký počet změn a modifikací.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy polypeptidu majícího C-koncovou α-karboxamidovou skupinu, vyznačující se tím, že se uvádí do styku (i) prostředí na vodné bázi, zahrnující (a) amoniakální činidlo a (b) polypeptidový substrát zahrnující alespoň jednu jadernou aminokyselinové sekvenci, kde jaderná aminokyselinová sekvence má C-koncový Arg-zbytek navázaný přes jeho α-karboxylovou skupinu na a-aminoskupinu sousedního aminokyselinového zbytku peptidovou vazbou, s (ii) klostripainem za štěpení peptidové vazby a vzniku polypeptidového produktu majícího C-koncový Arg-NH2 zbytek.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že prostředí na vodné bázi zahrnuje alespoň 80 obj. % vody.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že prostředí na vodné bázi nezahrnuje více než 10 obj. % organického rozpouštědla.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že prostředí na vodné bázi jev podstatě prosté organického rozpouštědla.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že amoniakální činidlo zahrnuje amonné soli vybrané ze skupiny sestávající z chloridu amonného, hydroxidu amonného, octanu amonného, sulfátu amonného a jejich směsí.

• · · · · · • · · · · · · • ·· ······· · • · · · · « • · · · ·
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že prostředí na vodné bázi zahrnuje alespoň 0,5 M amoniakálního činidla.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se uvádí do styku polypeptidový substrát a amoniakální činidlo s klostripainem při teplotě asi 4 °C až asi 80 °C.
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jaderná aminokyselinová sekvence zahrnuje GLP-l(7-35)-Arg.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že jaderná aminokyselinová sekvence zahrnuje GLP-1(7-35)-Arg-Ala-Phe-Ala.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že jaderná aminokyselinová sekvence zahrnuje GLP-l(7-35)-Arg-Ala-Phe-Ala-Hse nebo GLP-l(7-35)-Arg-AlaPhe-Ala-Met-His-Ala-Glu.
11. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že jaderná aminokyselinová sekvence zahrnuje aminokyselinovou sekvenci GLP-1(7-3 5)-ArgXaa-R, kde Xaa je aminokyselinový zbytek a substituent R je α-karboxyl chránící skupina.
12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že polypetidový substrát zahrnuje alespoň dvě kopie jaderné aminokyselinové sekvence.

• · • · ···· · · • · · · · · ·· • · ·· «······ · • * · · · · · ····· ·· · ·*
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že sousední kopie jaderné aminokyselinové sekvence jsou napojeny spojovací sekvencí.
14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že se uvádí do styku polypeptidový substrát a amoniakální činidlo s klostripainem v prostředí na vodné bázi majícím hodnotu pH asi 9,0 až asi 11,0.
15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že prostředí na vodné bázi dále zahrnuje CaCh.
16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že prostředí na vodné bázi dále zahrnuje redukční činidlo.
17. Způsob podle nároku 1, v y z n a č uj í c í se t í m , že redukční činidlo zahrnuje merkaptan.
18. Způsob podle nároku 17, v y z n a č u j í c í se t í m , že merkaptan je vybrán ze skupiny sestávající z dithiothreitolu, dithioerythritolu, 2-merkaptoethanolu, thioglykolové kyseliny, cysteinu, glutathionu a jejich směsí.
19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že klostripain je imobilizovaná forma klostripainu.
20. Způsob přípravy polypeptidu majícího C-koncovou α-karboxamidovou skupinu, vyznačující se tím, že se připraví první prostředí na vodné bázi zahrnující polypeptidový substrát zahrnující alespoň jednu jadernou aminokyselinovou sekvenci, kde jaderná aminokyselinová sekvence má C-koncový Arg zbytek vázaný na sousední aminokyselinový zbytek přes α-karboxylovou vazbu peptidu;

první prostředí na vodné bázi se smíchá se zásaditým prostředím zahrnujícím amoniakální činidlo za vzniku druhého prostředí na vodné bázi majícího hodnotu pH alespoň asi 9,0; a druhé prostředí na vodné bázi se uvede do styku s mobilizovaným klostripainem za štěpení polypeptidového substrátu v poloze α-karboxylové vazby peptidu a vzniku produktu v prostředí na vodné bázi, který zahrnuje polypeptidový produkt mající C-koncový Arg-NH₂ zbytek.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t í m , že druhé prostředí na vodné bázi má hodnotu pH asi 9,0 až asi 11,0.
22. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t í m , že se dále upraví hodnota pH produktového prostředí na vodné bázi za vzniku třetího prostředí na vodné bázi zahrnujícího polypeptidový produkt a mající hodnotu pH ne více než asi 8,5.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že uvedení do styku zahrnuje uvedení do styku druhého prostředí na vodné bázi s mobilizovaným klostripainem po dobu nepřesahující asi 20 minut.
24. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že jaderná aminokyselinová sekvence zahrnuje GLP-l(7-35)-Arg.
25. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t í m , že se dále mobilizovaný klostripain aktivuje merkaptanem, CaCl₂ nebo jejich směsí za vzniku aktivovaného • · ···· ·· · ·· ·· · ··· · ·· • · · · · · ·· • · ♦ · «······· • · · · · «· ····· · · ··♦ · imobilizováného klostripainu, a uvedení do styku zahrnuje uvedení do styku druhého prostředí na vodné bázi s aktivovaným imobilizovaným klostripainem.