KR0122430B1 - 합성 올리고펩티드를 이용한 아미노펩티다제의 검출방법 - Google Patents

합성 올리고펩티드를 이용한 아미노펩티다제의 검출방법

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Abstract

본 발명은 화학적으로 합성한 올리고펩티드를 이용하여 아미노펩티다제를 검출하는 방법, 보다 구체적으로는 재조합 메티오닐 단백질의 N-말단 아미노산 서열과 유사한 펩티드를 화학적으로 합성하고 이를 아미노펩티다제와 반응시킨 후 반응액을 고압 액체크로마토그라피로 분석함을 특징으로 하는 아미노펩티다제의 활성을 검출하는 방법을 제공한다.

Description

합성 올리고펩티드를 이용한 아미노펩티다제의 검출방법
제1도는 합성된 올리고펩티드의 아미노산 조성 분석 결과를 나타낸 것이고,
제2도는 올리고펩티드의 비브리오 아미노펩티다제의 반응 전 시료를 역상 고압 액체크로마토그래피한 결과를 214nm에서 기록한 것이고,
제3도는 올리고 펩티드와 비브리오 아미노펩티다제를 16시간 반응시킨 후 역상 고압 액체크로마토그라피한 결과를 214nm에서 기록한 것이고,
제4도는 제3도에 7분대에서 새로이 나타난 피크의 N-말단 아미노산 서열 분석을 시행한 결과를 나타낸 것이고,
제5도는 올리고펩티드에 대한 비브리오 아미노펩티다제의 초기 반응속도를 측정한 것을 나타낸 것이고,
제6도는 올리고펩티드에 대한 비브리오 아미노펩티다제의 Km 값을 결정한 것을 나타낸 것이다.
본 발명은 화학적으로 합성한 올리고펩티드를 이용하여 아미노펩티다제를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 재조합 메티오닐 단백질의 N-말단 아미노산 서열과 유사한 펩티드를 화학적으로 합성하고 이를 아미노펩티다제와 반응시킨 후 반응액을 고압 액체크로마토그라피로 분석함을 특징으로 하는 아미노펩티다제의 활성을 검출하는 방법에 관한 것이다.
아미노펩티다제 [EC. 3,4,11,10]는 여러 종류의 동물세포 및 미생물에서 다양한 형태로 발견되며, 대체적으로 활성 유지를 위해 칼슘 또는 아연 이온 등을 필요로 하는 메탈로프로테아제(metallo-protease)이다. 이러한 아미노펩티다제들은 엑소펩티다제(exopeptidase)에 속하는 것으로 기질 단백질의 N-말단으로부터 순차적으로 아미노산을 유리시키는 성질을 가지고 있다. 이들 효소는 일반적으로 50 내지 70℃의 온도에서도 활성을 보유하는 공통점이 있는 반면, 기질 단백질의 N-말단에 위치하는 아미노산의 종류 및 서열에 따라 서로 다른 기질 특이성을 나타낸다.
이와 같은 특성을 이용하여 유전공학적으로 제조되어 효모나 박테리아 등에서 발현되는 재조합 단백질의 N-말단 메티오닐기를 제거하는 과정에 아미노펩티다제를 유용하게 사용할 수 있으므로, N-말단 메티오닐기만을 선택적으로 제거하며 비활성도가 높은 아미노펩티다제 및 이를 효과적으로 검출하는 방법에 대한 요구가 증대되고 있다.
현재까지 아미노펩티다제를 검출하기 위하여, 통상적으로 사용되는 방법은 아미노산-아미드(amide)[S. R. Hinmelhoch E. A. Peterson, Biochemistry 7, 2085(1986)], 아미노산-베타-나프틸아미드(β-naphthylamide)[J. A. Goldbarg A. M. Rutenburg, Cancer 11, 283(1958)] 및 아미노산-파라-니트로아닐리드(ρ-nitro-anilide)[H. Tuppy, W. Wiesbauer E. Wintersberger, Z. Physiol. Chem. 329, 278(1962)] 등을 기질로 이용하는 방법과 2 내지 4개의 아미노산으로 구성된 비특이적 서열의 펩티드를 기질로 이용하는 방법이 있다.
이러한 아미노펩티다제의 검출방법 중 아미노-베타-나프틸-아미드와 아미노산-파라-니트로아닐리드를 기질로 사용하는 방법은 흡광의 변화를 측정하므로서 효소 활성을 신속하고 간편하게 검출할 수 있다는 장점으로 인하여 현재까지 보편적으로 이용되고 있다. 그러나 효소 반응이 일어나는 효소 활성부위는 결합부위와 촉매부위로 구성되며, 이러한 활성부위의 구조적 차별성에 기인하여 효소의 기질특이성이 나타난다는 것은 공지의 사실이다. 따라서 기질로 사용되는 아미노산-베타-나프틸 아미드와 아미노산-파라-니트로 아닐리드는 구조적 한계성으로 아미노펩티다제의 다양한 기질 특이성과 활성도에 있어 실제적인 기질 단백질과 현격한 차이를 나타낼 수 있으므로 이들을 기질로 사용할 경우 유용한 아미노펩티다제의 검출에 중대한 오류를 야기시킬 수 있다.
실제로 재조합 메티오닐 인간 성장호르몬(methionyl humangrowth hormone)의 N-말단 메티오닐기를 선택적으로 제거하는 과정에 유용하게 이용되고 있는 비브리오 프로티오리티커스 아미노펩티다제는 메티오닐-파라니트로아닐리드에 대하여 거의 반응하지 않으며 메티오닐아미드에 대한 kcat/Km은 2.2mM-1sec-1로서 매우 낮은 값을 나타내고 있다[F. W. Wagner, S. H. Wilkes J. M. Prescott, J. Biol. Chem. 247, 1208(1971)]
이러한 문제점들을 보완하기 위하여, 루이신-파라니트로 아닐리드 등을 이용한 1차 검출과정을 거친 후 최종적으로 순수하게 정제된 아미노펩티다제를 실제적인 기질단백질과 반응시키고 아미노산 서열 또는 아미노산 조성 분석을 이용하여 기질 단백질의 N-말단 아미노산의 제거 정도를 측정하는 방법을 통상적으로 이용하고 있다.
실질적인 기질 단백질을 이용할 경우 아미노산 서열 및 조성 분석은 명확한 결과를 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있으나, 아미노펩티다제와 기질 단백질 및 트리스 또는 인산염 등이 포함된 반응 용액에서 기질 단백질만을 순수하게 정제하여야 하며 분석과정에 상당한 시간과 비용이 소요된다는 단점을 가지고 있다.
또한 미생물 배양액에는 통상적으로 아미노펩티다제와 물리화학적 특성이 유사하여 통상적인 크로마토그라피 과정을 통하여 제거하기 어려운 여러 종류의 엔도프로테아제들이 존제한다.
최종적으로 정제된 아미노펩티다제 용액 중에 미량 존재하는 엔도프로테아제들에 의하여 반응액 중의 재조합 단백질의 펩티드 결합이 부분 절단될 수 있으며 부분 절단된 단백질들은 새로운 N-말단을 제공하여 아미노산 서열과 조성 분석에 영향을 미칠 수 있게 된다.
루이신과 글리신을 주로 포함하는 2 내지 4개의 아미노산으로 구성된 비특이적 서열의 펩티드를 기질로 이용하여 아미노 펩티다제를 이용하는 방법도 전술한 아미노산-파라-니토로아닐리드 또는 아미노산-베타-나프틸아미드를 이용한 방법에서와 동일하게 기질특이성을 반영하는 검출결과를 기대할 수 없다는 문제점을 가지고 있다. 또한, 닌히드린(ninhydrin)을 이용하여 유리된 아미노산을 정량하는 경우 반응액내 단백질 및 기타 불순물에 의하여 오차가 유발될 수 있으며 유리된 아미노산을 고전압 전기영동(high voltage electrophoresis) 등의 방법으로 분리하는 과정을 필요로 하게 되어 상당한 시간과 노력이 소모될 수 있다.
이제 본 발명자들은 아미노펩티다제의 기질 특이성을 최대로 반영하여 효소 활성을 정확하고 간편하게 검출할 수 있는 방법에 대하여 연구를 거듭한 결과, 특정 재조합 메티오닐단백질의 N-말단부와 유사한 서열을 갖는 올리고펩티드를 합성하여 아미노펩티다제의 기질로 이용하였을때 아미노펩티다제와의 반응에 따라 역상 고압 액체 크로마토그라피에서 N-말단 메티오닐기가 제거된 펩티드와 메티오닐펩티드가 서로 분리되어 용출되는 것을 관찰할 수 있었으며, 용출시간이 서로 다른 펩티드의 피크 계산을 통하여 아미노펩티다제의 활성도를 용이하게 측정할 수 있음을 확인하고, 올리고펩티드에 대한 아미노펩티다제의 Km값, Vmax, kcat, kcat/Km 등의 상수값을 결정하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명에서는 재조합 메티오닐 단백질의 N-말단서열과 유사한 올리고펩티드를 합성하고 이를 아미노펩티다제의 기질로 이용하므로서 재조합 메티오닐 단백질의 N-말단 메티오닐기를 선택적으로 제거하여 천연형과 동일한 재조합 단백질을 제조하는 과정에 이용할 수 있는 아미노펩티다제를 미생물 등의 생물체로부터 용이하게 검출하는 방법을 제공한다.
이에 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
재조합 메티오닐단백질의 N-말단과 유사한 서열을 갖고 4 내지 10개의 아미노산으로 구성된 올리고펩티드를 화학적 합성, 예컨대 문헌(User's manul, Applied Biosystem, U.S.A.]에 기재된 방법으로 합성한다.
합성 올리고펩티드는 재조합 메티오닐 단백질의 N-말단 서열에서 N-말단 메티오닐기를 포함하며 아미노펩티다제의 작용을 받을 것으로 예측되는 부분을 포함하고, 통상적으로 사용가능한 반응액, 예를들면 0.1M 트리스-HCl(pH 8.0) 완충 용액내에서 용해될 수 있으며 아미노펩티다제와의 반응에 따라 N-말단메티오닐기가 제거되었을때 펩티드의 소수성이 현저하게 감소하는 아미노산 서열, 예컨대 Gly, Asp, Glu, Thr, Ser 등의 아미노산이 포함되도록 고안하는 것이 바람직하다.
0.1M 트리스-HCl(pH 8.0) 완충 용액에 합성 올리고펩티드와 아미노펩티다제를 넣고 37℃에서 일정시간 동안 반응시키고 70% 아세트산을 넣어 반응을 정지시킨 후 고압액체크로마토그라피를 통해 반응 생성물을 분석한다. 반응물의 분석방법으로는 모든 크로마토그라피 방법을 사용할 수 있으나, 소수성의 차이를 이용하는 역상 고압 액체 크로마토그라피를 이용하는 것이 바람직하다.
올리고펩티드의 농도를 변화시키면서 각각의 농도에 대한 아미노펩티다제의 초기 반응속도를 역상 고압 액체크로마토그라피로 구하고, 이를 이용하여 아미노펩티다제의 올리고펩티드에 대한 Km 값, Vmax, kcat 및 kcat/Km 등을 결정하므로서 합성 올리고펩티드가 아미노펩티다제의 효율적 기질로 작용하는지를 확인하고 아미노펩티다제의 기질특이성, 기질에 대한 친화도 및 비활성도 등을 확인하여 재조합 단백질의 N-말단 메티오닐기의 제거 목적으로 사용할 수 있는 아미노펩티다제를 용이하게 검출할 수 있게 되었다.
본 발명에 따른 아미노펩티다제의 검출 기질로는 메티오닐 인간 성장호르몬과 유사한 N-말단 서열을 갖는 올리고펩티드를 예를들어 설명하지만 본 발명은 모든 재조합 메티오닐 단백질의 N-말단부와 50% 이상 유사한 서열을 갖는 합성된 올리고펩티드를 이용하여 아미노펩티다제들을 검출하고 기질 특이성 및 상업적 이용 가능성을 확인하는 과정에 거의 제약없이 이용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 어떠한 의미에 있어서도 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 실시예에서 사용되는 아미노펩티다제는 대한민국 특허 출원 제92-25651호에 개시된 방법으로 정제된 것이 사용하고, 합성 올리고펩티드에 대한 기질 특이성 확인 및 활성도 측정은 역상 고압액체크로마토그라피를 이용한다.
[실시예 1]
올리고펩티드의 제조
메티오닐 인간 성장호르몬의 N-말단 서열중 효소의 작용을 받지 않을 것으로 예측되는 일부분을 변화시켜 펩티드의 용해도를 향상시키며 메티오닌이 제거되었을때 펩티드의 소수성이 현격하게 감소될 수 있도록, 다음과 같은 아미노산 서열을 가지는 올리고 펩티드를 합성하였다.
메티오닐 인간 성장 호르몬 : Met-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-올리고펩티드 : Met-Phe-Pro-Thr-Glu-Pro-Ser 올리고펩티드의 합성은 고체상 펩티드 합성기(Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer, 미합중국) 내에서 자동화된 고체상 펩티드 합성(solid-phase peptide synthesis) 반응에 의해 0.1mM의 규모로 실시하였다. 반응의 결과 생성된 펩티드-레진(peptide-resin) 복합체를 TFMSA(trifluoromethane sulfonic acid)를 이용한 절단방법(Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems. pp 43-45)에 따라 처리하여 펩티드를 획득하였다. 고압 역상 액체크로마토그라피를 통하여 절단 과정에서 혼입된 불순물들을 제거하여 펩티드만을 순수하게 정제한 후 건조시켰다. 펩티드의 용해도를 고려한 용매 선택과정을 거쳐 100% DMSO[dimethyl-sulfoxide; 미국 시그마(sigma)사에서 구입]에 용해시켜 아미노펩티다제의 기질로 사용하였다.
제조한 펩티드는 아미노산 분석기[Applied Biosystems사(미국)의 Amino acid analysis system 420A 모델]를 이용한 아미노산 조성 분석을 통하여 합성이 정확하게 이루어졌음을 확인하였다. 분석결과는 제1도 및 표 1에 나타내었다.
비브리오 프로티오리티커스(Vibrio protiolyticus ATCC 15338)로부터 아미노펩티다제를 삼상분할법(대한민국 특허출원 제92-25651호)을 이용하여 순수하게 정제하여 효소원으로 사용하였다.
아미노펩티다제의 효소 활성도는 필더러(Pfleiderer)의 방법[Meth. Enzymol., 19, pp. 514-521(1970)]에 따라 측정하였다.
효소 활성도 1 단위는 0.1M 트리스-HCl(pH 8.0), 2% DMSO에 용해된 2mM 루이신 파라-니트로아닐리드(leucine ρ-nitroanilide; 미국 시그마사에서 구입)를 가질로 한 반응용액에 아미노펩티다제를 가하여 1ml이 되도록 하고 37℃에서 1분간 반응시켰을때 405nm에서의 흡광도를 1단위 변화시키는 효소의 양으로 정의하였다.
[실시예 2]
비브리오 아미노펩티다제의 의한 올리고펩티드의 N-말단 메티오닐기의 제거확인
비브리오 아미노펩티다제를 올리고펩티드와 반응시켰을때 N-말단 메티오닐기가 제거되는지 확인하기 위하여, 0.1M 염화나트륨이 포함된 0.1M 트리스-HCl(pH 8.5) 완충용액에 아미노펩티다제 1 단위와 DMSO에 용해된 올리고펩티드 25㎍을 넣고 최종 부피가 200㎕가 되도록 하고 37℃에서 방치하였다.
상기 반응용액에 70% 아세트산 용액을 먼저 가한 후 아미노펩티다제를 가하여 반응이 일어나지 않도록 한 것을 반응의 대조구로 준비하여 동일하게 방치하였다.
16 시간 경과한 후 반응액 50㎕를 취하고 50㎕의 70% 아세트산 용액으로 반응을 정지시켰다. 이 시료와 대조구를 각각 약 14,000×g에서 7분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 후 분석시료로 이용하였다.
준비된 시료를 0.05% TFA(trifluoroacetic acid)가 포함된 16% 아세토니트릴 용액으로 미리 평형시킨 C-18μ-본다파크(Bondapak) 컬럼(3.9×300mm; Waters사, 미국)에 주입하고 20분간 16%에서 24%로 아세토니트릴 용액 선형구배로 펩티드를 용출시켰으며 258nm와 214nm에서 각각 흡광의 변화를 기록하였다.
크로마토그람의 분석 결과, 용출시간이 14 내지 15분대인 올리고펩티드의 피크는 아미노펩티다제와의 반응에 따라 그 면적과 높이가 감소하였으며 7 내지 8분대에 새로운 피크가 나타난 것을 관찰하였다(제2,3도). 아미노산 서열 분석 결과, 새로운 피크는 메티오닐기가 제거된 펩티드임이 확인되었다(제4도).
[실시예 3]
올리고펩티드에 대한 비브리오 아미노펩티다제의 Km 값과 최대 속도 결정
제조한 올리고펩티드에 대한 비브리오 아미노펩티다제의 Km 값을 결정하기 위하여 다음과 같이 기질인 올리고펩티드의 농도를 변화시킨 반응액을 준비하였다.
반응액은 0.1M의 염화나트륨이 포함된 0.1M 트리스-HCl(pH 8.0) 완충액에 0.05단위의 아미노펩티다제와 올리고펩티드를 부가하여 최종부피가 50㎕가 되도록 하였다.
반응액내 올리고펩티드의 최종 농도는 각각 0.125, 0.250, 0.050, 0.875, 1.250, 1.625mM이었으며 37℃에서 동일 농도의 시료를 각각 1, 2, 5분동안 반응시키고 10㎕의 70% 아세트산 용액을 넣어 반응을 정지시켰다. 반응물을 0.22㎛의 필터에 여과한 후 이중 50㎕를 자동 시료 주입기를 이용하여 0.05% TFA가 포함된 16% 아세토니트릴 용액으로 미리 평형시킨 C-18 μ-본다파크 칼럼(3.9×300mm; Waters사, 미국)에 주입하고 20분간 16%에서 24%로 아세토니트릴 용액 선형구배로 펩티드를 용출시켰으며 258nm와 214nm에서 각각 흡광의 변화를 기록하였다.
크로마토그람에 나타난 메티오닐기가 제거된 펩티드와 제거되지 않은 펩티드의 피크들을 확인하고 두피크의 면적 및 높이를 계산하였다.
올리고펩티드가 메티오닐기가 제거된 펩티드로 전환되는 반응에 있어 기질인 올리고펩티드의 농도별로 초기 반응 속도를 결정하기 위하여 메티오닐기가 제거된 펩티드의 농도를 아래의 식을 이용하여 계산하고 이를 제5도에서와 같이 반응 시간에 따른 직선을 구하였다.
A1 : 올리고펩트디의 피크 면적
A2 : 메티오닐기가 제거된 펩티드의 피크 면적
H1 : 올리고펩티드의 피크높이
H2 : 메티오닐기가 제거된 펩티드의 피크 높이
[MP] : 올리고펩티드의 초기농도
[P] : 메티오닐기가 제거된 펩티드의 농도
올리고펩티드의 각 농도별로 직선의 기울기를 계산하여 이를 비브리오 아미노펩티다제의 초기 반응 속도로 정의하고, 올리고펩티드의 농도에 대하여 반응 속도를 표현하였을때 전형적인 포화 곡선(sigmoidal saturation curve)이 나타났으며, 이를 제6도에서와 같이 라인위버-버크 방정식(Lineweaver-Burk plot)에 따라 올리고펩티드에 대한 비브리오 아미노펩티다제의 Km 값과 최대 속도를 결정하였다. 결정된 Km 값과 최대 속도를 이용하여 kcat, kcat/Km 등의 상수값을 결정하였으며(제6도) 그 결과는 메티오닌아미드, 루이신파라니트로아닐리드 및 루이신 베타나프틸아미드에 대한 값[F. W. Wagner, S. H. Wilkes J. M. Prescott, I. Biol. Chem. 247, 1208(1971)]과 비교하여 표 2에 나타냈다.
실험 결과 기질에 대한 친화도의 척도인 Km 값에 있어 올리고펩티드는 루이신 베타 나프틸아미드와 유사하였으며 단위시간당 효소의 활성부위가 촉매되어 전환되는 반응물의 수를 나타내는 kcat 값에 있어서는 올리고펩티드가 다른 기질보다 15 내지 30배 높은 값을 나타내어 비브리오 아미노펩티다제에 의하여 매우 빠른 속도로 이용되는 것을 확인하였다. 또한 효소의 촉매 효율 척도로 이용되는 kcat/Km에 있어서도 가장 일반적으로 이용되고 있는 기질인 루이신 파라 니토로아닐리드와 유사한 범위값(10+3mM-1sec-1)을 나타냈다.
이러한 결과로부터 본 발명의 아미노펩티다제 검출 방법이 공지의 검출방법보다 기질특이적이며 보다 정확하고 용이함을 알 수 있으며 이를 이용하여 재조합 단백질의 N-말단 메티오닐기의 제거에 유용한 아미노펩티다제를 검출하고 실제적인 최적 반응 조건의 탐색을 용이하게 수행할 수 있게 되었다.

Claims (4)

  1. 특정 재조합 메티오닐 단백질의 제거에 유용한 아미노펩티다제를 검출하기 위해, 상기 재조합 메티오닐 단백질의 N-말단 아미노산 서열과 유사한 N-말단 아미노산 서열을 갖는 합성 올리고 펩티드를 기질로 사용하여 아미노펩티다제의 활성을 측정함을 포함하는, 아미노펩티다제의 검출방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 합성 올리고 펩티드는 그의 N-말단 메티오닐기가 제거될 경우 소수성이 현저하게 감소되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 합성 올리고 펩티드가 4 내지 10개의 아미노산으로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 활성의 측정이 역상 고압 액체 크로마토그라피를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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