CN1029989C - 在链霉菌中制备异种蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
可用tendamistat基因构建融合基因,可借助该融合基因在链霉菌宿主细胞中表达并分泌融合蛋白。可修饰tendamistat部分,特别是缩短其C-末端。
Description
公开号为0,161,629的欧洲专利申请(EP-A)和南非专利85/3672公开了使用编码α-淀粉酶抑制剂tendamistat之信号肽(前肽)的DNA,而使链霉菌细胞分泌一种多肽,具体地说就是tendamistat的方法。原则上,合适的DNA可从每种能够产生tendamistat的菌株中得到,但最好选用依德国专利公开3,331,860中实施例3之方法所得到DNA。
业已发现,也可通过构建融合蛋白基因而在链霉菌中制得异种蛋白,其中表达所需蛋白的结构基因与tendamistat基因(编码链)的3′末端相偶联,而该基因是已经过适当地修饰的。对tendamistat基因的修饰特别可包括C-末端的缩短。
在EP-A0,161,629中描述了编码tendamistat的DNA(即表1所示的DNA序列C)。该结构基因含有几个限制性内切酶的切点,这些酶可用来修饰被编码的氨基酸顺序。适宜的切点有处在三联体31和32区域内的BstⅡ切点、三联体43和44区域内的StuⅠ切点,以及三联体52和53区域内的Sau3A切点。有可能通过掺入合适的连接子而使一个或多个其它氨基酸插入到这些切点中,以除去这些切点之间的DNA片段,或通过掺入终止密码子来编码缩短了的氨基酸顺序。此外,有可能通过位点特异性诱变以插入、取代或除去任何所需氨基酸。用这种方法可得到具有α-淀粉酶抑制作用的蛋白,以及无此活性但仍可与相应受体反应的蛋白。
本发明还涉及合适的基因结构、含有这些基因结构的载体、用这些载体转化的链霉菌细胞、分泌的融合蛋白以及它们在制备异种蛋白和tendamistat衍生物上的应用。下面将详述本发明的优选实施方案并在权利要求书中加以限定。
图1至图4描述了本发明之某些质粒的构建。
图1表明编码融合蛋白的杂交质粒pKK310的制备,其中在tendamistat氨基酸顺序部分后面接有一包含7个氨基酸的桥接部分,其后是猴胰岛素原的氨基酸顺序。
图2表明起始于质粒pKK310的表达质粒pTF1的构建。
图3表明质粒pRS10-其中在tendamistat基因部分后面接有来自pUC18的多连接子-的构建,及其在表达质粒pTF10内的重建。“mcs”表示pUC18的多连接子区域(多克隆位点)。
图4表明编码融合蛋白的质粒pKK400的构建,其中在全部tendamistat氨基酸顺序后面接有一包含7个氨基酸的桥接部分,其后是猴胰岛素原的氨基酸顺序,同时显示了pKK400重建为表达质粒pGF1的构建图。
这些图都不是按真实比例绘制的。
根据本发明得到的融合蛋白(它们是从细胞中排出的)的优点在于易于从培养滤液中分离出来。可用本身已知的方法,如通过吸附或离子交换层析和/或凝胶过滤进行分离。
可用本身已知的方法,通过酶促裂解或化学裂
解释放出所需异种蛋白(参与融合者)。
就此而论,裂解的类型主要取决于所需蛋白的氨基酸顺序。在许多情况下,最好将桥接或连接部分插在tendamistat序列和所需蛋白之氨基酸序列之间的切点中。例如,如果所需蛋白不含有蛋氨酸,则连接部分可表示蛋氨酸,于是可用氯化氰或溴化氰进行化学裂解。如果连接部分的羧基末端是半胱氨酸,成连接部分代表半胱氨酸,则可能进行半胱氨酸特异性酶促裂解或化学裂解,例如在特异性S-氰化反应之后进行化学裂解。如果桥接部分具有羧基末端色氨酸,或连接部分代表色氨酸,则可用N-溴代琥珀酰亚胺进行化学裂解。
在其氨基酸序列中不含Asp-Pro并且对酸足够稳定的所需蛋白,可作为具有该桥连部分的融合蛋白用本身已知的方法进行蛋白水解。水解后可产生含N-末端脯氨酸和C-末端天冬氨酸的蛋白质。因此,用这种方法有可能合成经修饰的蛋白质。
如果该桥接部分表示(Asp)n-Pro或为Glu-(Asp)n-Pro,n代表1~3,则可形成对酸不太稳定的Asp-Pro键。
也已公开了酶促裂解的实例,也可使用具有改善了特异性的修饰酶(参见C.S.Craik et al.,Science 228(1985)291-297)。如果所需的真核生物肽是胰岛素原,则所选用的肽序列最好是其中能被胰蛋白酶除去的氨基酸(Arg,Lys)是结合到胰岛素原的N-末端氨基酸(Phe)上的,例如Ala-Ser-Met-Thr-Arg,这样就有可能使用胰蛋白酶进行精氨酸特异性裂解。
如果所需蛋白不含有氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg,则可用Xa因子裂解具有相应桥接部分的融合蛋白(EP-A0,025,190和0,161,973)。
裂解产物的分离取决于这些蛋白质的性质。就tendamistat及其衍生物的分离而论,可参见德国专利公开3,331,860中所引用的文献。
用下列实例将更详细地阐述本发明。除特别指出者外,其中的百分比均指重量百分比。其中涉及的图号与实施例号相同。
实施例1
所用的起始材料为在德国专利公开3,536,182和EP-A0,218,204中所述的质粒pKAI650。可通过分离650bp HincⅡ/SstⅠ片段并克隆到已用这些酶切开的质粒pUC19中,由德国专利公开,3,331,860所述的质粒pKAI1制得该质粒。去除该质粒中唯一的HindⅢ切点(用该酶切割,填充突出的末端并连接)以产生质粒pKAI650a(1)。
在50μl反应混合物中,按制造商推荐的方法用Stul将2μg经氯化铯梯度离心纯化的DNA(1)完全水解2小时并用苯酚提取以除去酶。用乙醇沉淀线性DNA,再溶解并引入到连接混合物中,向其中加入0.1μ已在5′-末端磷酸化了的化学合成的双链寡核苷酸(2)反应物
HindⅢ
5′ CCC AAG CTT GGG 3′ (2)
3′ GGG TTC GAA CCC 5′
将该连接混合物转化到E.Coli JM109中,然后分离那些包含重组质粒pKK3a(3)的克隆。分离出的质粒DNA具有限制性内切酶HindⅢ的切点,可通过限制性分析来鉴定。pKK3a(3)比pKAI650(1)多12个碱基对,其所具有的核苷酸序列可使氨基酸序列延伸4个氨基酸,如下所示
42 43 (44)
Glu Gly Pro Ser Leu Gly Leu
5′ GAA GGC CCA AGC TTG GGC CTG 3′
3′ CTT CCG GGT TCG AAC CCG GAC 5′
HindⅢ
所用的其它起始材料是质粒pYE24(4)。该质粒可通过下述方法得到:用EcoRⅠ和HindⅢ切开载体pUC8,并将猴胰岛素原基因连接到该线性质粒中(表2;参见Wetekam et al.,Gene 19(1982)179-183)。
使2μg质粒pYE24(4)与限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ反应,经电洗脱分离出猴胰岛素原基因,在经乙醇沉淀以纯化并浓缩后,使该基因与合成的DNA连接子(5)连接,
5′ AGC TTG ATG GCG 3′
3′ AC TAC CGC TTA A 5′(5)
(HindⅢ) (EcoRⅠ)
将连接产物(6)插入到已用HindⅢ切开的质粒pKK3a(3)中,产生质粒pKK31(7)。这样便得到下列位于tendamistat基因第43位氨基酸Gly之
密码子下游的桥接部分
43 B1
Gly Pro Ser Leu Met Ala Asn Ser Phe
GGC CCA AGC TTG ATG GCG AAT
TCT TTT
CCG GGT TCG AAC TAC CGC TTA A
GA AAA
- -
HindⅢ EocRⅠ
这里和表2中的“B1”为猴胰岛素原B链的起始点。
在质粒(7)中,猴胰岛素原序列定位于tendamistat基因内。为了将该质粒重新构建成本发明的质粒,可用SphⅠ和SalⅠ裂解(7),并分离出片段(8)。用SphⅠ和SalⅠ切开载体pUC19,并使此线性质粒与片段(8)连接。所得到的质粒pKK310(9)可编码其中缩短了tendamistat序列的融合蛋白,而且上述连接子只接有胰岛素原序列。
全部构建如图1所示。
实施例2
为了在表述质粒中重新构建质粒pKK310(9),使(9)与SstⅠ和SphⅠ反应,并分离出片段(10)。
将市场上可买到的表达载体pIJ702(11)(可从John Innes Foundation,Norwich,England得到)用SphⅠ和SstⅠ切开,并使线性质粒(12)与片段(10)连接。在转化变铅青链霉菌TK24菌株(John Innes Foundation)以后,通过对硫链丝菌肽抗性的选择鉴定所需克隆。分离硫链丝菌肽抗性克隆的质粒DNA并通过限制性分析检验之。将具有预期基因定位的质粒定名为pTF1(13)。含有该重组质粒的克隆向培养基内分泌一种分子量为16千道尔顿的蛋白质。这种蛋白质与胰岛素抗体呈阳性“免疫吸印”反应(参见实施例5)。
pTF1(13)的构建如图2所示。
实施例3
一方面是质粒pKK3a(3),而另一方面是载体puC18各自均用HindⅢ切开并使之连在一起。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109菌株,在异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)存在条件下,根据有无色菌落的形成而证明克隆是成功的。用已知的方法分离所得重组质粒pRS1(14)。用限制性内切酶SstⅠ消化1μg质粒,然后再连接而导致除多连接子序列(mcs)和tendamistat基因之剩余留片段外的pUC18部分的缺失。得到质粒pRS10(15)。
由于质粒(15)存在多连接子部分,使得该质粒适合于克隆任何所需的结构基因,结果产生编码具有缩短了tendamistat序列的相应融合蛋白的质粒。
当用SphⅠ和SstⅠ消化pRS10(15),并分离出较小的片段时,则可用与实施例2类似的方法将后者连接到表达载体PIJ720中。用这种方法可得到表达载体pTF10(16),同样凭借其多连接子部分,可进行多种构建。
pTF10(16)的构建如图3所示。
实施例4
用EcoRⅠ切开质粒pYE24(4),插入连接子
5′ AAT TCA AGC TTG 3′
3′ GT ACG AAC TTA A 5′
(EcoRⅠ)HindⅢ(EcoRⅠ)
得到质粒pYE241。依照实施例1的相似方法用HindⅢ切割,并连接到已用HindⅢ切断的pKK3a(3)中,得到质粒pKK32,后者编码融合蛋白,该融合蛋白中tendamistat序列通过下列桥接部分连接到胰岛素原序列上:
43
Gly Pro Ser Leu Asn Phe Ala Arg
GGC CCA AGC TTG AAT TCT GCA AGA
TTT
CCG GGT TCG AAC TTA AGA CGT TCT A
AA
依照与实施例1类似的方法,用SphⅠ和SstⅠ切割pKK32,并将长约650bp的片段克隆到已用这些酶切开的pUC19中。得到的质粒pKK320除上述桥接部分(其中强调了由连接子引导的序列)外相当于质粒pKK310(9)。
用与实施例2相似的方法,将具有pKK320重组基因的SstⅠ-SphⅠ片段克隆到pIJ702中,得到表达质粒pTF2。在变铅青链霉菌TK24中表达
并分泌分子量为16千道尔顿的融合蛋白,并使该蛋白与胰岛素抗体反应(参见实施例5)。
由于pTF2的构建与pTF1(13)的构建类似(见图1和图2),所以未在附图中描述。
实施例5
用EcoRⅠ部分消化pKK310(9)这样只将两个EcoRⅠ切点之一切开。用Klenow聚合酶填充突出末端之后,再连接该质粒,并通过限制性分析检验结果。所需质粒(其中定位在胰岛素原基因未端的EcoRⅠ切点已被除去)被定名为pKK310(a)(17)。这样,pKK310(a)(17)在缩短的tendamistat基因和胰岛素原基因之间的连接子区域内便只含有唯一的EcoRⅠ限制性切点。
为了构建可编码具有完整tendamistat序列之融合蛋白的质粒,在氨基酸68/69的密码子区域内,将KpnⅠ的唯一切点引入到编码tendamistat的DNA序列中(表1)。这就需要用SstⅠ和SphⅠ酶切由pKAI650(a)(1)分离的DNA,并将长度为650bp的片段克隆到同样用这两种酶切断的噬菌体M13mp 18RF DNA中,并用已知方法制备单链DNA。在位点定向诱变过程中使用了1μg这种单链DNA(ssDNA)以及0.1μg诱变“引物”:5′C GAG GTA CCG GGC GT3′(见M.J.Zoller and J.Smith,Nucleic Acid Res.10(1982)6487-6500)。
从分离出的含有突变基因的M13克隆中分离RFDNA,可通过另外的KpnⅠ切点来选择该DNA,并且通过序列测定来进一步证实碱基交换(在Arg68密码子的第3位上C与G交换)。可见,核苷酸交换并没有改变氨基酸顺序,但将所需的唯一新切点引入了tendamistat结构基因中。
66 67 68 69 70
His Ala Arg Tyr Leu
CAC GCC CGC TAC CTC
GTG CGG GCG ATG GAG
KpnⅠ
在用SstⅠ-SphⅠ酶切后,将来自M13pm18RF DNA的突变序列克隆到质粒pUC19中,得到质粒pKAI651(18)。
为了检查,按照实施例2中所述方法将长650bp的来自(18)的SstⅠ-SphⅠ插入子掺入到质粒pIJ702中,得到质粒pAX651。在将该质粒转化到变铅青链霉菌TK24中以后,可得到的tendamistat的表达率与具有未经修饰的tendamistat基因的质粒pAX650的表达率相同(见德国专利公开3,536,182,图2)。
为了制备本发明用于表达具有tendamistat完整氨基酸序列之融合蛋白的质粒,可用SphⅠ和KpnⅠ酶切断质粒p KA I651(18),并将小片段与连接子(19)
69 70 71 72 73 74
(Tyr)Leu Ala Arg Cys Leu Phe Asn Ala Met Ala Thr Gly 3′
5′ CTC GCT CGC TGC CTT TTC AAT GCG ATG GCC ACC GGG
3′C ATG GAG CGA GCG ACG GAA AAG TTA CGC TAC CGG TGG CCC TTA A 5′
(KpnⅠ) (19) (EcoRⅠ)
和已用SphⅠ和EcoRⅠ切开的质粒pKK310a(17)连接。
用连接混合物转化大肠杆菌JM109,分离出质粒DNA,并通过DNA序列测定证实正确的融合。将具有正确序列的质粒定名为pKK400(20)。
连接子(19)不仅编码tendamistat的其余氨基酸,而且编码可使tendamistat和胰岛素原基因彼此分开的间隔部分,并且总的包括如表2所示之基因的5′末端,即下列11个氨基酸的密码子:
Phe-Asn-Ala-Met-Ala-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg因此,融合蛋白在该间隔区中含有可用卤化氰或胰蛋白酶裂解的蛋氨酸和精氨酸。
用SstⅠ和SphⅠ双重酶切而从质粒pKK400(20)中分离出长约1090bp的插入子,将该DNA连接到已用同样酶切开的质粒pIJ702(12)中,得到质粒pGF1(21)。将该连接混合物转化到变铅青链霉菌TK24中,并从具有tendamistat活性的硫链丝菌肽抗性转化体中分离出质粒DNA。所有阳性克隆均含有长度为1090bp的pGF1 SstⅠ-SphⅠ插入子。
pGF1(21)的构建如图4所示。
用EP-A10,161,629之实施例3中和德国专利公开3,536,182之实施例2中所述的平板培养检测法测定tendamistat活性。
可用已知方法表达由pGF1编码的融合蛋
白。于28℃下在摇瓶中将变铅青链霉菌的转化菌株培养4天,并经离心由培养液中除去菌丝体,可按下述方法检测澄清溶液中的融合蛋白:
将10~100μl溶液与20-200μl15%强度的三氯乙酸混合,离心浓缩沉淀的蛋白,洗涤并用含SDS的样品缓冲液(见U.Laemmli,Nature227(1970)680-685)配制。于90℃下保温2分钟后,在10-17%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离该样品。得到分子量为19千道尔顿的蛋白质,也就是说其分子量处子tendamistat和胰岛素原所组成的融合蛋白之预期的分子量范围内。该融合蛋白可与抗tendamistat抗体和抗胰岛素抗体反应。
表1
tendamistat的DNA序列(编码链)和氨基酸序列
6 10
5′-GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCC TCC TGC GTG
NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Ala Pro Ser CysVal
15 20
ACG TCT TAC CGA AGC TGG CGG TAC TCA CAG GCC GAC
Thr Leu Tyr Gln Ser Trp Arg Tyr Ser Gln Ala Asp
25 30 35
AAC GGC TGT GCC GAG ACG GTG ACC GTG AAG GTC GTC
Asn Gly Cys Ala Glu Thr Val Thr Val Lys Val Val
40 45
TAC GAG GAC GAC ACC GAA GGC CTG TGC TAC GCC GTC
Tyr Glu Asp Asp Thr Glu Gly Leu Cys Tyr Ala Val
50 55 60
GCA CCG GGC CAG ATC ACC ACC GTC GGC GAC GGC TAC
Ala Pro Gly Gln Ile Thr Thr Val Gly Asp Gly Tyr
65 70
ATC GGC TCG CAC GGC CAC GCG CGC TAC CTG GCT CGC
Ile Gly Ser His Gly His Ala Arg Tyr Leu Ala Arg
TGC CTT TAG-3′
Cys Leu(终止密码子)
表2
5′AAT TCT GCA AGA
3′ GA CGT TCT
(Asn) Ser Ala Arg
(EcoRⅠ)
B1
TTT GTG AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA GTGTG GAA GCT CTC
AAA CAC TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG GAT CAT CAC CTT CGA GAG
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC
ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCT CCG AAG AAG ATG TGT GGG TTC TGG
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Por Lys Thr
C1
CGC CGG GAG GCA GAG GAC CCT CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC
GCG GCC CTC CGT CTC CTG GGA GTC CAC CCC GTC CAC CCG
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly
GGG GGC CCT GGC GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCG CTG GAG GGG
CCC CCG GGA CCG CGT CCG TCG GAC GTC GGG AAC CGC GAC CTC CCC
Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Alla Leu Glu Gly
A1
TTC CTG CAG AAG CGC GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGC ACC AGC ATC
AGG GAC GTC TTC GCG CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACG TGG TCG TAG
Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile
TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TAC TGC AAC TAA TAG TCG ACC
ACG AGG GAG ATG GTC GAC CTC TTG ATG ACG TTC ATT ATC AGC TGG
Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
SalⅠ
TGC AGC CA 3′
ACG TCG GTT CGA 5′
PstⅠ (HindⅢ)
B1,C1和A1分别代表猴胰岛素原B、C和A链的起始点
Claims (5)
1、一种制备融合蛋白的方法,该方法包括将胰岛素原基因的编码链通过桥接部分偶联到tendamistat基因编码链的3′末端,其中桥接部分含有至少为:
Met,Trp,Asp-Pro,(Asp)n-Pro,Glu-(Asp)n-Pro,Arg,Lys,Ala-Ser-Met-Thr-Arg,Pro-Ser-Leu-Met-Ala-Asn-Ser,Pro-Ser-Leu-Asn-Phe-Ala-Arg,Phe-Asn-Ala-Met-Ala-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg或Ile-Glu-Gly-Arg编码的核酸且n表示1-3,使该基因结构在链霉菌宿主细胞中表达,并从上清液中分离出所分泌的融合蛋白。
2、根据权利要求1所述的方法,其中的偶联发生在截短的tendamistat基因的3′末端,该截短的基因至少含有所述tendamistat的前31个氨基酸。
3、根据权利要求2所述的方法,其中截短的tendamistat基因至少含有所述tendamistat的前43个氨基酸。
4、根据权利要求2所述的方法,其中截短的tendamistat基因至少含有所述tendamistat的前52个氨基酸。
5、一种制备tendamistat或权利要求2,3或4所述的截短的tendamistat和胰岛素原的方法,该方法包括裂解可用权利要求1-4所述的方法制得的融合蛋白。
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