HU204094B - Process for producing foreing protein in streptomyces - Google Patents
Process for producing foreing protein in streptomyces Download PDFInfo
- Publication number
- HU204094B HU204094B HU882276A HU227688A HU204094B HU 204094 B HU204094 B HU 204094B HU 882276 A HU882276 A HU 882276A HU 227688 A HU227688 A HU 227688A HU 204094 B HU204094 B HU 204094B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plasmid
- protein
- gene
- fusion protein
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás idegen fehérje Streptomyces-hen történő előállítására.
A 0 161629 számú európai közrebocsátási iratból és a 85/3672 számú dél-afrikai szabadalmi leírásból ismert, hogy az α-amiláz-inhibotor szignálpeptidet (előpeptidet), a tendamisztátotkódolőDNS-tfelhasználhatjuk abból a célból, hogy Steptomyces-sejtekpolipeptidet, előnyösen tendamísztátotválasszanakki. A megfelelő DNS tulajdonképpen minden tendamisztátot termelő törzsből kinyerhető, előnyösen azonban a 3 331 860 számú német szövetségi köztársaság-beli közrebocsátási irat 3. példája szerint előállítottDNS-t alkalma 77nk.
Az 1070/88 számú magyar szabadalmi bejelentés (1746 072) fúziós fehérjék Streptomycesból történő kiválasztását ismerteti olymódon, hogya kívántfehérjét kódoló szekvenciát az adott esetben módosított tendamisztát génbe építik be és a rekombináns gént Streptomyces-sejtben fejezik ki. Az eljárás során a tendamisztát struktúrgént hordozóként alkalmazzák egy másik génhez, miáltal olyan fúziós fehérjét kapnák, amelyben egy másikfehérje aminosav-szekvenciája helyezkedik d a tendamisztát aminosav-szekvenciáján belül. Ha afúziós fehérjekémiai vagy enzimatikus hasításával felszabadítják a másik fehérjét, a tendamisztát két részszekvenciáját kapják. Az ismertetett megoldás tendamisztát-szánnazékokra is kiterjed, ahola származék jelentősen megrövidített aminosavláncot jelent. Ezek a származékok a reverzibiütás elve alapján specifikus receptorokkal kompetitív gátlómechanizmus útján reagálnak.
Azt találtuk, hogy idegen fehérjék Streptomycesbenúgyis előállíthatok, hogyafúziós fehérjéhez olyan gént állítunk elő, amelyben az adott fehérjére vonatkozó struktúrgén (kódoló szálának) 3-végéhez — adott esetbenmódosított—tendamisztát gén kapcsolódik. A tendamisztátgénmódosítása alatt elsősorban a 3 ’-végmegrövidítését értjük.
A tendamisztátot kódoló DNS-t a 0161629 számú európai közrebocsátási irat (az ottani jelölés szerint cDNS szekvencia, valamint 1. táblázat) ismerteti. Ennek szerkezetében több restrikciós enzim vágóhelye található, amelyek a kódolt aminosav sorrend módosítására használhatók. BstEH számára vágóhelyként alkalmas a 31 és 32 triplett területe, a Stul számára a 43 és 44 triplett területe, a SauITTA számára az 52 és 53 triplett területe. Megfelelő Iinker beépítésével ezekre a helyekre egy vagy több további aminosav építhető be, DNS részletek kiiktathatók ezen vágóhelyek között, vagy stop-kodon beépítésével rövidített aminosav szekvenciákkódolhatók. Ezenkívül helyspecifikus mutálással tetszés szerinti aminosavak építhetők be, cserélhetőkki, vagy iktathatókki. így olyan fehérjéket kapunk, amelyek α-amiláz-inhibitor aktivitást mutatnak vagy olyan fehérjéket, amelyeknemrendelkeznek ugyan ilyen aktivitással, azonban a megfelelő receptorokkalreagálnak.
A találmány szerinti eljáráshoz tartoznak a megfelelő génszerkezetek, ezeket a szerkezeteket tartalmazó vektorok, a vektorokkal transzformált Streptomyces sejtek, a kiválasztott fúziós fehérjék és ezek alkalmazása idegen fehérjék és tendamisztát-származékok előállítására.
Az 1-4. ábráknéhány plazmid szerkezetét ábrázol5 ják.
Az 1. ábra a pKK310 hibrid plazmid előállítását mutatja, amely olyan fúziós fehérjét kódol, amelyben a tendamisztát aminosav szekvenciájának egy részét hét aminosavból álló hídrész, majd ezt majom proin10 zulinaminosavszekvenciájakövet.
A 2. ábra a pKK310 plazmid átalakítását ismerteti apTFl kifejező plazmiddá.
A 3. ábra a pR510 plazmid előállítását ismerteti, amelyben a tendamisztát gén egy részét pUC18 poli15 Iinker követ. Az ábra mutatja továbbá a plazmidnak pTFlO kifejező plazmiddá történő átalakítását, ahol , ,mcs” (multiple cloning site) a pUC18 polilinker szakaszt jelenti.
A 4. ábra a pKK400 plazmid előállítását mutatja, 20 amely olyan fúziós fehérjét kódol, amelyben a tendamisztát összaminosavszekvenciáját egy 11 aminosavból álló hídszakasz után majom proinzulin aminosav szekvenciája követi. Az ábra mutatja továbbá a plazmidnak pGFl kifejező’ plazmiddá történő átalakítá25 sát.
Az ábráknemméretarányosak.
A találmány szerint előállított és a sejtekből kiváIasztottfőziós fehérjének azaz előnye,hogy a tenyészközegszürletéből könnyen izolálható. Az izolálás őn30 magában ismert módon végezhető, előnyösen adszorpciós vagy ioncserélő kromatográfia és/vagy gélszűrés segítségével.
Akívánt idegen fehérje (fúziós partner) felszabadítását enzimatikus vagy kémiai hasítással végezzük ön35 magában ismert módon.
A hasítás módját elsősorban a kívánt fehérje amínosav szekvenciája alapján választjuk meg. Sok esetben célszerű, ha a tendamisztát szekvencia és a kívánt fehérje aminosav szekvenciája közötti hasítóhelyre 40 egy kötőszakasz, illetve hídszakaszt építünk be. Ha a kívánt fehérje nem tartalmaz például metionint, a kötőszakasz lehet Met, amikoris a kémiai hasítás Időrvagy bróm-cián segítségével megvalósítható. Ha a kötószakasz karboxi-terminális részén ciszteint tartal45 máz, vagy a kötőszakasz Cys, ciszteinspecifikus enzimatikus hasítás vagy kémiai hasítás, például S-cianilezés valósítható meg. Ha a hídszakasz karboxiterminális szakaszán triptofán található, vagy a kötőszakasz Trp, a kémiai hasítás N-bróm-szukciniid segítségével 50 valósítható meg.
Ha a kívánt fehérje aminosav szekvenciájában nem található Asp-Pro és a fehérje savval szemben eléggé stabil, az adott hídszakaszt tartalmazó fúziós fehérje önmagában ismert módon proteolitikusan hasítható.
Ezáltal olyan fehérjét kapunk, amely N-terminális prolint, illetve C-terminális aszparaginsavat tartalmaz. ilymódon tehát módosított fehérjék is szintetizálhatok.
Az Asp-Pro kötés savval szemben labilisabb lesz, ha 60 (Asp)n-Pro, illetve Glu-(Asp)n-Pro hídszakaszt alkal2
HU 204094 Β mázunk, ahol n értéke 1-3.
Az enzimatikus hasítás szintén ismert eljárás, amelynek során javított specifitású módosított enzimek alkalmazhatók (C. S. Craik és munkatársai: Science 228, 291-297 /1985/). Ha a kívánt eukariotikus peptid proinzulin, célszerűen olyan peptid-szekvenciát választunk, amelynél a proinzulin N-terminális aminosavjához (Phe) tripszinnel lehasítható aminosav (Arg, Lys) kapcsolódik, ilyen például Ala-Ser-Met.
Ha a kívánt fehérje nem tartalmaz Ile-Glu-Gly-Arg szakaszt, a megfelelő hídszakaszt tartalmazó fúziós fehérje Xa faktorral (0 025 190 és 0 161 973 számú európai közrebocsátási irat) hasítható.
Ahasítási termék izolálását a fehérje tulajdonságai figyelembevételével végezzük. Atendamisztát és származékai izolálása vonatkozásában a 3 331 860 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratban idézett irodalomra hivatkozunk.
A találmány szerinti eljárás közelebbről az alábbi példákkal világítható meg. A példák számozása azonos az ábrák számozásával. Az ábrákban a plazmidok és a génfragmensek rajza nem méretarányos, a méretaránytól elsősorban a polilinker szekvenciánál térünk el.
Apéldákban említett műveletek egy részét T. Maniatis, E. F. Frisch és J. Sambrook .Molecular Clonin, a Laboratory Manual” c. könyvében (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) részletesen és reprodukálhatóan leírták. Tekintettel arra, hogy a következő példákban e műveletek többszörösen szerepelnek, az alábbiakban hivatkozási listát közlünk, amelyben hivatkozási szám mellett az adott művelet és a fent említett könyv egy-egy oldalszáma szerepel; a példa vonatkozó részében csak a hivatkozási számot adjuk meg, amelyhez a lista alapján a pontos irodalmi helynehézségnélkül hozzárendelhető.
1. DNS vágása, plazmid nyitása: 104. oldaltól kezdve, valamint az enzimet előállító cég prospektusa
2. DNS túlnyúló végek feltöltése: 113. oldal
3. DNS-fragmensek izolálása.
A DNS-fragmensek szétválasztása gél-elektroforézis útján, agaróz-gél segítségével (150-172. oldal), vagy—rövid, az 1 kb-nál kisebb fragmensek esetén— poliakrilamid-gél segítségével (173-181. oldal) történik.
4. Ligálás: 146. oldal.
5. DNS fragmens plazmidba történő bevitele: 390. oldal
6. E. coli sejtek transzformálása: 249-251. oldal
7. Restrikciós elemzés: 104. oldal.
A hivatkozási számokat szögletes zárójelben [] tüntetjük fel, hogy a rajzokra való hivatkozásoktól megkülönböztethetőklegyenek.
1. példa
Kiindulási anyagként a 3 536182 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratban, illetve a 0 218 204 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett pKAI650 plazmidot alkalmazzuk. Ez a plazmid a 3 331 80 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratban ismertetett pKAIl plazmidból a 650bp HincH-Sstl-fragmens izolálásával és az enzimmel felnyitott pUC19 plazmidba (Pharmacia) történő klónozásával állítható elő. Ebből a plazmidból (az enzimmel végzett hasítással [1J, a túlnyúló vég feltöltésével [2] és ligálással [4]) eltávolítjuk az egyetlen Hindin hasítóhelyet, és így pKA1650a (1) plazmidot kapunk. Az (1) plazmidból nyert és CsClgradiens centrifugálással tisztított 2 DNS-t 2 órán keresztül 50 μ,Ι reakcióelegyben az előállító által megadott adatok szerint Stul segítségével teljesen elemésztünk és az enzimet fenol-extrakcióval eltávolítjuk. A linearizált DNS-t etanollal kicsapjuk, és ismét oldjuk és ligáló elegybe visszük, amelyhez további reakciópartnerként 0,1 μg kémiailag szintetizált, 5*-végén foszforilezett, kétszálú (2) oligonukleotidot adunk.
Hindin
5’CCCAAGCTTGGG3’ (2)
3’GGGTTCGAACCC5’
A ligálóelegyet E. coli JM 109 törzsbe (ATCC 53323) transzformáljuk [6], majd azokat a kiónokat izoláljuk, amelyek a (3) pKK3a rekombináns plazmidot hordozzák Az izolált plazmid DNS-t Hindin enzim hasítási hely jellemzi, és így restrikciós analízissel [7], kimutatható. A (3) pKAI650A és olyan nukleotid szekvenciával rendelkezik, amely lehetővé teszi az aminosav szekvencia négy aminosawal történő meghosszabbítását.
43(44)
Glu Gly Pro Ser Leu Gly Leu
5’BAAGGCCCAAGCTTGGGCGTG3’
3’ CTT CC G GGT TCG AAC CC G GAC 5’
Hindin
További kiindulási anyagként a (4) pYE24 plazmidot alkalmazzuk. Ez a plazmid előállítható, ha a pUC8 vektort (Pharmacia, 27-4916-01) EcoRI és HindHImal nyitjuk [1] és a kapott linearizált plazmidba ligáljuk [5] a majom proinzulin gént (2. táblázat, Wetekam és munkatársai: Gene 19,179-183 /1982/). 2 μg (4) pYE24 plazmidot EcoRI és Hindin restrikciós enzimmel reagáltatunk [1], a majom proinzulint géntelektroelucióval izoláljuk és tisztítás és etanolos kicsapással végzett betöményítés után szintetikus (5) DNS linkerrel ligáljuk [4].
5’AGCTTGATGGCG3’ (5)
3’ AC TACCGCTTAA5’ (HindHI) (EcoRI) (Az összezáródás elkerülhető azzal, hogy a linkért nem foszforilezzük.)
A (6) ligáit terméket beépítjük a Hindffl-mal felnyitott (3) pKK3a plazmidba, miáltal (7) pKK31 plazmidot kapunk. Ezzel az eljárással a tendamisztát gén 43. Gly aminosavjához tartozó kódhoz kapcsolva a következő hídszakaszt kapjuk:
43B1
Gly Pro Ser LeuMet Alá Asn Ser Phe
HU 204094 Β
GGCCCAAGCTTGATGGCGAATTCTTTT CCGGGTTCGAACTACCGCTTAAGAAAA HindlH EcoRI
A,31”, a2.táblázathozhasonlóan, amajomproin.zulinB-láncának kezdetét jelöli.
A (7) plazmádban a proinzulin szekvencia a tendamfeztát gélen belül található. A plazmidnak a találmány szerinti plazmiddá történő átalakításához a (7) plazmidot Sphl és Sáli segítségével emésztjük [1] és izoláljuk [3] a (8) fragmenst. ApUC19 vektort (Pharmacia, 27-4951-01) Sphl és Sáli segítségével felnyitjuk [1] és a linearizált plazmidot a (8) fragmenssel ligáljuk [5]. Az így kapott (9) pKK310 plazmid olyan fúziós fehérjét kódol, amelyben a lerövidített tendamisztát szekvenciát és a fent említett linkért csak a proinzulinszekvenciakőveti.
A teljes eljárást az 1. ábra mutatja be.
2. példa
A (9) pKK310 plazmid kifejező plazmiddá történő átalakításához a (9) plazmidot Sstl és SphI-gyel reagáltatjuk [1], és izoláljuka (10) fragmest [3].
Akereskedehni forgalomban lévő (11) pU702kifejező vektort (Iohn Innes Foundation, Norwich, NagyBritannia) Sphl és Sstl segítségével felnyitjuk [1] és a (12) linearizált plazmidot a (10) fragmenssel ligáljuk [5J. AStreptomycesIividans TK24 törzsbe (Tohnlhnes Foundation) történő transzformálás után a HvántHónokat tiosztrepton rezisztencia alapján válogatjuk H. A tiosztrepton rezisztens Hónból származó plazmid DNS-t izoláljuk és restrikciós analízissel [7] vizsgáljuk. A megfelelően elhelyezkedett gént tartalmazó plazmidapTFl (13) jeletlötpja.Azilyenrekombináns plazmidot tartalmazó Hónok tenyészközegben 16 kD móltömegű fehérjét választanak H. Ez a fehérje inzulin antitestekkel „Immunbiot pozitív reakciót mutat (lásd az5. példát).
A(13) pIFl előállítását a2. ábramutatja.
3. példa
A (3) pKK3a plazmidot és a pUC18 vektort (Pharmacia, 27-4949-01)HindnisegítségévelfeInyitjuk[l] és összekapcsoljuk [4]. A ligálóelegyetE. coE JM109 törzsbe transzformáljuk [6j, amelya sikeres Hónozást izopropil-β—tio-galaktopiranozid (IPTG) és 5-bróm4-Hór-3-indolil-6-D-galaktopiranozid (X-Gal)) jelenlétében színtelen telepek képzésévelmutatja. Akeletkező (14) pRSI rekombináns plazmidot önmagában ismert módon izoláljuk. 1 a-gplazmidotSstTrestrikciós enzimmel emésztve [1], ismétligálva [4] és a megfelelőt Hválasztva a polilinker szekvenciáig (mcs) terjedő pUC18 szakaszt és a maradék tendamisztát gént töröljük. így (15) pRSlO plazmidot kapunk.
A (15) plazmid polilinker szakaszánakköszönhetően tetszőleges struktúrgénnel Hónozható, amelynek során olyan, plazmidot kapunk, amely a megfelelő fúziós fehérjét rövidített tendamisztát szekvenciával kódolja.
A (15) pRSlO plazmidot Sphl és Sstl segítségével emésztjük és a rövidebb fragmenst izoláljuk. így a kapott fragmens a 2. példában analóg módon pU702 kifejezővektorba ligálható. így (I6)pTF10kifejező vektort kapunk, amely polilinker szakaszának köszönhetően sokoldalúan felhasználható.
A (16) pTFlO előállítását a 3. ábra mutatja.
4. példa
A (4) pYE24 plazmidto EcoRI segítségével felnyitjuk [1] és az alábbilinkerrelreagáltatvapYE241 plaz10 midot kapunk.
5’AATTCAAGCTTG 3’
3’ GTTCGAACTTAA5’ (EcoRI) HindlH (EcoRI)
A plazmidot HindlH segítségével hasítjuk [1] és 15 HindlH segítségével hasított (3) pKK3a-val ligáivá [5] az 1. példával analóg módon kapjuk a pKK32 plazmidot. Ez olyan fúziós fehérjétkódol, amelyben a tendamisztát szekvenciát az alábbi hídszakaszon keresztül proinzulin szekvencia követi:
GlyProSerLeuAsnPheAlaArg
GGCCCAAGCITGAATTCTGCAAGATTT
CCGGGTTCGAACTTAAGACGTTCTAAA
Az 1. példában leüt módon a pKK32-t Sphl és Sstl segítségével hasítjuk és a mintegy 650 bp nagyságú 25 fragmenst az adott enzimekkel felnyitott pUC19 vektorba (Pharmacia, 27-4951-01) Hónozzuk. A kapott pKK320 plazmid a fenti hídszakaszig azonos a (9) pKK310 plazmiddal (amelyből a línkerrel bevitt szekvencia kivan iktatva).
A2.példávalanalógmódonazSsű-SphIragmensta pKK320-bóI pH702-be Hónozzuk, miáltal pTF2 kifejező plazmidot kapunk. Slividans TK24 törzs táptalajából olyan 16 kD nagyságú fúziós fehérjét választunk H, amely inzulin antitestekkel reagál (lásd az 5. pél35 dát).
Mivel a pTF2 előállítása nagyon hasonlít a (13) pTFT előállításához (1. és 2. ábra), a külön ábrázolástól eltekintünk.
5. példa
A (9) pKK310plazmidotEcoRIsegítségévelrésdegesen emésztjűkúgy, hogy akét EcoRIhasítóhely közül csak az egyik nyíljon fel. A szükséges paramétereket próbakísérlettel állapítjukmeg.
A túllógó véget Klenow-polimerázzal feltöltjük [2], majd a plazmidot ismét ligáljuk és az eredményt restrikciós analízissel [7] ellenőrizzük. A kívánt plazmid, amelyben a proinzulin gén végén álló EcoRI hasítóhely Hiktatódott, a pKK310a (17) jelet kapja. Ez a plazmidcsakegyEcoRIhasítóhelyettartalmazarövidített tendamisztát gén és a proinzulin gén közötti linket szakaszban,
Teljes tendamisztát szekvenciát tartalmazó fúziós fehérjét kódoló plazmid előállításához a tendamisztá55 tót kódoló DNS szekvenciába (1. táblázat) a 68/69 aminosavak kódjának szakaszába egy KpnI hasítóhelyet építünk be. Ehhez az (1) pKAI650a plazmidból izoIáltDNS-t Sstlés Sphlsegítségével emésztjük [1] és a 650 bp nagyságú fragmenst az M13mpl8 fágnak 60 (Pharmacia) szintén a fenti enzimekkel emésztett RF4
HU 204094 Β
DNS-ébe átldónozzuk [5] és az ismert módon előállítjuk az egyszálú DNS-t. 1 pg egyszálú DNS-n 0,1 pg alábbi mutagén „primerrel” helyspecifikus mutációt (”site directed mutagenesis”) hajtunk végre (M. J. Zoller és J. Smith: Nuleic Acid Rés. 10, 6487-6500 /1982/).
5’CGACGTACCGGGCGT3’
A mutált gént tartalmazó izolált M13 kiónokból, amelyek a bevitt Kpnlhasítóhely alapján kiválogathatok, izoláljuk az RF-DNS-t és a báziscserét (G helyett C az Arg 68 kód 3-as pozíciójának) szekvenálással bizonyítjuk A nukleotid csere tehát nem változtatja meg az aminosav szekvenciáját, de beviszi a kívánt új hasítási helyet a tendamisztát struktúrgénbe.
67 68 69 70
His Ala Arg Tyr Leu
CACGCCCGCTACCTC
GTC CGG GCC ATC GAG KpnI
A mutált szekvenciát Ssű-Sphl emésztés [1] után az M13mpl8-RF-DNS-ből a pUC19 plazmidba átklónozzuk [5], miáltal (18) pKAI 651 plazmidot kapunk
Kontrollként a (18) plazmidból SstI és Sphl segítségével a 2. példában leírt módon kihasított 650 bp nagyságú szakaszt a pD702plazmidba építjük be [5], miáltal pAX651 plazmidot kapunk A plazmidot Streptomyces lividans ΤΚ24 törzsbe transzformálva ugyanolyan kifejezési arányt kapunk tendamisztátra, mint a pAX650 plazmidnál a változatlan tendamisztát génre (3 536 182 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat, 3. ábra).
A tendamisztát teljes aminosav szekvenciáját tartalmazó fúziós fehérjéhez szükséges, találmány szerinti plazmid előállításához a (18) pKA1651 plazmidot Spal és KpnI segítségével emésztjük [1] és a kis fragmenst (19) linkerrel
70 71 72 73 74 (Tyr) Leu Ala Arg Cys Leu Phe Asn Ala Met Ala Thr Gly 3’
5’ CTC GCT CGC TGC CTT TTC AAT GCG ATG GCC ACC GGG
3’ C ATG GAG CGA GCG ACG GAA AAG TTA GG TAC CGG TGG CCC TTA A 5’ (KpnI) (EcoRI) és Sphl és EcoRI segítségével felnyitott (117) pKK310a plazmiddal ligáljuk [5].
A ligálóeleggyel E. coli JM 109 törzset (ATCC 53323) transzformálunk [6], a plazmid DNS-t izoláljuk és a megfelelő fúziót DNS szekvenálással igazoljuk A megfelelő szekvenciát tartalmazó plazmid a pKK400 (20) jelet kapja.
A(19)linkernemcsakatendamisztátmaradékaminosavjait kódolja, hanem egy „Spacer” részt is, amely a tendamisztátot és a proinzulin gént egymástól elválasztja és összesen a 2. táblázat szerinti gén 5' végével a következő tizenegy aminosav kódját tartalmazza:
Phe-Asn-Ala-Met-Ala-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg.
A fúziós fehérje tehát ebben a „Spacer”-hen egyebek között metionin és arginin aminosavakat is tartalmaz, amelyek lehetővé teszik a halogén-ciános, illetve tripszines hasítást.
A (20) pKK400 plazmidból SstI és Sphl segítségével végzett hasítással [1] mintegy 1090 bp nagyságú szakaszt izolálunk, és a DNS-t az azonos enzimekkel felnyitott (12) pU702 plazmiddal ligáljuk [5]. így a (21) pGFl plazmidot kapjuk A ligálóelegyet S. lividans TK24 törzsbe transzformáljuk és a tendamisztát aktivitást mutató tiosztrepton-rezisztens traszformánsokból izoláljuk a plazmid DNS-t. Valamennyi pozitív klón tartalmazza a pGFl plazmidból SstI és Sphl segítségével kihasított 1090 bp nagyságú szakaszt.
A (21) pGFl plazmid előállítását a 4. ábra mutatja.
A tendamisztát aktivitást lemeztesztek segítségével végezzük, amitaO 161629 számú európai közrebocsátási irat 3. példája és a 3 536182 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat 2. példája ismertet.
ApGHplazmiddalkódoltfúziósfehérje kifejezését önmagában ismert módon végezzük A transzformált
S. lividans TK24 törzset négy napon keresztül rázólombikban 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a tenyészoldatból a micéliumot centrifugálással leválasztjuk a fúziós fehérje a tiszta oldatból az alábbi módon mutatható ki:
10-100 pl oldatot 20-200 pl 15 tömeg%-os triklórecetsawal elegyítünk a kiváló fehérjét centrifugálással dúsítjuk, mossuk és SDS-tartalmú próhapufferben (U. Laemmli: natúré 227,680-685 /1970/) felvesszük. 2 percen keresztül 90 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, majd elektroforetikus úton 10-17 tömeg%-os SDSpoliakrilamidgélen szétválasztjuk ílymódon 19 kD móltömegű fehérjét kapunk, amelynek móltömege megfelel a tendamisztátból és proinzulinból álló fúziós fehérje várt móltömegének A fúziós fehérje mind a tendamisztát elleni, mind az inzulin elleni antitestekkel reagál.
1. táblázat
Tendamisztát DNS szekvenciája (kódolószál) és aminosav szekvenciája
10
5’ -GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCC TCC TGC GTG NH2-Asp Thr Thr ValSer GluPro AlaPro Ser Cys Val
20
ACG CTC TAC CAG AGC TGG CGG TAC TCA CAG GCC GAC Thr Leu Tyr Gin Ser Trp Arg Tyr Ser Gin Ala Asp
HU 204094 Β
1. táblázat folytatása
TendamísztátDNS szekvenciája (kódolószál) és aminosavszekvenciája
30 35
AACGGCTGTGCCGAGACGGTGACCGTGAAGGTCGTC
Asn Gly Cys Alá Glii Thr ValThr ValLys ValVal
45
TACGACGACGACACCGAAGGCCTGTGCTACGCCGTC
Tyr Glu Asp Asp Thr Glu GlyLeu Gys Tyr Alá Val
55 50
GCACCG GGC CAG ATC ACC ACC GTC GGC GAC GGCTAC
AlaPro Gly GlnHe Thr Thr Val Gly Asp Gly Tyr
70
ATCGGCTCGCACGGCCACGCGCGCTACCTGGCTCTC
He GlySerHxs Gly His Alá Arg Tyr Leu Alá Arg
TGCCIT1AG-3’
CysLeuStp
2. táblázat
5’AATTCTGCAAGA 3’ GACGTTCT (Asn) Ser Alá Arg (EcoRI9
B1
TIT GTG AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA GTG GAA GCT CTG AAACACTTGGTCGTGGACACGCCGAGGGTGGATCACCTTCGAGAG Phe Val Asn GlnHis Leu Cys Gly Ser EBs Leu Val Glu AlaLeu
TACCTGGTGTGCGGGGAGCGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACC ATGGACCACACGCCCCTCGCTCCGAAGAAGATGTGTGGGTTCTGG TyrLeu Val Cys Gly Glu ArgGlyPhePhe Tyr ThrPro Lys Thr
Cl
CGCCGGGAGGCAGAGGACCCTCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGC GCGGCCCTCCGTCTCCTGGGAGTCCACCCCGTCCACCTCGACCCG Gly Gly Pro Gly Alá Gly Ser Leu GlnPro Leu Gla Leu Glu Gly
Al
TCC CTGCAGAAGCGC GGC ATC GTGGAGCAGTGC TGC ACC AGC ATC AGGGACGTCTTCGCGCCGTAGCACCTCGTCACGACGTGGTCCTAG Ser Leu GInLys Arg Gly He Val Glu Gin Gys Gys Thr Ser He
TGCTCCCTCTACGAGCTGGAGAACTAGTGCAACTAATAGTCGACC ACGAGGGAGGTCGTCGACCTCTTGATGACGTTGATTATCAGCTGG Cys SerLeu Tyr GlnLeu Glu Asn Tyr Cys Asn
Sáli
TGCAGCCA 3’
ACGTCGGTTCGA 5’
PstI (HindlH)__
B1 Cl és Al amajomproinzulinB-, C-és A-szálánakkezdetét jelöli.
Claims (5)
- S2ABADALMTIGÉNYPONT1. Eljárás fúziós fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a kírant fehérje struktúrgénjét C-tenninálisan — adott esetben módosított — tendamisztát génhez kapcsoljuk, expressziós vektorba illesztjük,Streptomycesgazdasejtbenkifejezzük és akiválasztott fúziósfehéijétafelülűszóbólizoláljuk·
- 2. Az 1. igénypontszerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy C-terminálisan rövidített tendamisztát gént alkalmazunk.
- 3. Eljráás az 1. igénypont szerinti eljárás fúziós fehérjét kódolo génszerkezet előállítására, azzal jellemezve, hogy az — adott esetben módosított—tendamisztát génhez C-terminálisan egy másik fehérje struktúigénjét kapcsoljuk; majd expressziós vektorba illesztjük.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 55 hogy C-terminálisan lerövidített tendamisztát gént kapcsolunk.
- 5. Eljárás fehérje előállítására, genetikusán kódolható aminosavakból, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. vagy 2. igénypontszerintelőállítottfúziósfehérjé60 bőlatendamisztátrésztlehasxtjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873714866 DE3714866A1 (de) | 1987-05-05 | 1987-05-05 | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT46941A HUT46941A (en) | 1988-12-28 |
| HU204094B true HU204094B (en) | 1991-11-28 |
Family
ID=6326841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU882276A HU204094B (en) | 1987-05-05 | 1988-05-04 | Process for producing foreing protein in streptomyces |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0289936B1 (hu) |
| JP (1) | JP2671260B2 (hu) |
| KR (1) | KR970001235B1 (hu) |
| CN (1) | CN1029989C (hu) |
| AR (1) | AR241658A1 (hu) |
| AT (1) | ATE94905T1 (hu) |
| AU (1) | AU612144B2 (hu) |
| CA (1) | CA1338338C (hu) |
| DE (2) | DE3714866A1 (hu) |
| DK (1) | DK175525B1 (hu) |
| ES (1) | ES2045004T3 (hu) |
| FI (1) | FI97549C (hu) |
| HU (1) | HU204094B (hu) |
| IE (1) | IE62522B1 (hu) |
| IL (1) | IL86277A0 (hu) |
| NO (1) | NO178036C (hu) |
| NZ (1) | NZ224464A (hu) |
| PT (1) | PT87400B (hu) |
| ZA (1) | ZA883168B (hu) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4012818A1 (de) * | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| US5426036A (en) * | 1987-05-05 | 1995-06-20 | Hoechst Aktiengesellschaft | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes |
| EP0367163B1 (de) * | 1988-11-03 | 1996-01-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
| DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| DE3936876A1 (de) * | 1989-11-06 | 1991-05-23 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3331860A1 (de) * | 1983-09-03 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von tendamistat |
| DE3418274A1 (de) * | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
| EP0196056B1 (en) * | 1985-03-28 | 1991-05-22 | Chiron Corporation | Improved expression using fused genes providing for protein product |
| DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
| EP0367163B1 (de) * | 1988-11-03 | 1996-01-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
-
1987
- 1987-05-05 DE DE19873714866 patent/DE3714866A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-04-28 ES ES88106786T patent/ES2045004T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 EP EP88106786A patent/EP0289936B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 DE DE88106786T patent/DE3884261D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 AT AT88106786T patent/ATE94905T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-05-03 FI FI882059A patent/FI97549C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-05-03 AR AR88310742A patent/AR241658A1/es active
- 1988-05-03 KR KR1019880005131A patent/KR970001235B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-05-03 NZ NZ224464A patent/NZ224464A/xx unknown
- 1988-05-04 CN CN88102568A patent/CN1029989C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-04 PT PT87400A patent/PT87400B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 DK DK198802416A patent/DK175525B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 IL IL86277A patent/IL86277A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 AU AU15559/88A patent/AU612144B2/en not_active Expired
- 1988-05-04 CA CA000565869A patent/CA1338338C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-04 HU HU882276A patent/HU204094B/hu unknown
- 1988-05-04 NO NO881942A patent/NO178036C/no unknown
- 1988-05-04 IE IE133888A patent/IE62522B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 ZA ZA883168A patent/ZA883168B/xx unknown
- 1988-05-06 JP JP63110295A patent/JP2671260B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kaster et al. | Analysis of a bacterial hygromycin B resistance gene by transcriptional and translational fusions and by DNA sequencing | |
| JP3358818B2 (ja) | 細菌細胞における異種遺伝子の染色体発現 | |
| AU659240B2 (en) | Recombinant core-streptavidin | |
| HUT76674A (en) | Enhanced secretion of polypeptides | |
| NZ238095A (en) | Dna coding for signal peptide, vectors and preparation of desired proteins using the signal peptide | |
| Scholtissek et al. | A plasmid vector system for the expression of a triprotein consisting of β-galactosidase, a collagenase recognition site and a foreign gene product | |
| CA2291883C (en) | Trigger factor expression plasmids | |
| CA2159079C (en) | Methods and dna expression systems for over-expression of proteins in host cells | |
| WO1997023639A1 (fr) | Procede de production de proteines fusionnees biologiquement actives | |
| HU204094B (en) | Process for producing foreing protein in streptomyces | |
| WO1993003758A1 (en) | Production of homogeneous neurotrophic factor | |
| HU210358B (en) | Process for producing of a genetic structure, an expression vector and fused proteins | |
| JP2612264B2 (ja) | Ｄｎａ配列体 | |
| US7223742B2 (en) | Enhanced solubility of recombinant proteins | |
| JP3148455B2 (ja) | 変異型ピルビン酸脱水素酵素複合体のｅ１蛋白質 遺伝子及び変異型ピルビン酸脱水素酵素複合体のｅ１蛋白質 | |
| US5426036A (en) | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes | |
| US6632638B1 (en) | Enhanced solubility of recombinant proteins using Uracil DNA glycosylase inhibitor | |
| HU209596B (en) | Process for producing of insuline pro-product in streptomyceten | |
| Wang et al. | senS, a novel regulatory gene with complex structure and partial homology to sigma factors of Bacillus subtilis | |
| DE19512937A1 (de) | Neuer Inhibitor des Erythrina caffra Typs und dessen Verwendung zur Reinigung von Serinproteasen | |
| JP2003000283A (ja) | 発現ベクターの構築方法及びそれを介した天然型外来ポリペプチドの製造方法 |