ES2152935T5

ES2152935T5 - Metodo para suprimir la coloracion de la albumina serica humana.

Info

Publication number: ES2152935T5
Application number: ES93104123T
Authority: ES
Inventors: Akinori c/o The Green Cross Corp. Sumi; Wataru c/o The Green Cross Corp. Ohtani; Naoto c/o The Green Cross Corp. Furuhata; Kazuya c/o The Green Cross Corp. Takeshima; Kaeko c/o The Green Cross Corp. Kamide; Takao c/o The Green Cross Corp. Ohmura; Kazumasa C/O The Green Cross Corp. Yokoyama
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 1992-03-16
Filing date: 1993-03-13
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2013-03-13
Also published as: TW255914B; US5369020A; DE69329841D1; CA2091636A1; CA2091636C; EP0591605A3; KR0168689B1; JPH05260986A; KR930019817A; JPH07102147B2; DE69329841T2; DE69329841T3; EP0591605A2; DK0591605T3; ES2152935T3; EP0591605B2; EP0591605B1

Abstract

Un método para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana expresada mediante ingeniería genética, que comprende el cultivo y/o la purificación en presencia de un compuesto amínico seleccionado entre metilendiamina; propilendiamina; N,N-dialquil(C1-6)alquilendiaminas(C1-6); guanidinas seleccionadas entre guanidina, aminoguanidina y fenilguanidina; benzamidinas seleccionadas entre benzamidina y p-aminobenzamidina; y aminoácidos básicos seleccionados entre lisina y arginina, en una proporción de 0,1 a 1% peso/vol con respecto al medio o a la fracción líquida que contiene la albúmina sérica humana.

Description

Método para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana.

La presente invención se refiere a un método para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana expresada mediante ingeniería genética.

Antecedentes de la invención

Una albúmina, en particular, la albúmina sérica humana (de aquí en adelante también denominada HSA) es un importante componente constituyente de la proteína en el plasma. Esta proteína se produce en el hígado, y es responsable principalmente del sostenimiento de la presión osmótica normal del flujo sanguíneo. Además, funciona como un vehículo para varias moléculas séricas.

La HSA se administra en una variedad de situaciones clínicas. Por ejemplo, cuando se administra HSA a un paciente que ha sufrido ataque fulminante o quemaduras, funciona recobrando el volumen sanguíneo a su nivel original, y de este modo, mejorando algunos síntomas relacionados con el trauma. Por este efecto, la HSA se administra frecuentemente. También, los pacientes que sufren de hipoproteinemia o de eritroblastosis fetal pueden necesitar tratamientos con HSA. Como se ejemplifica, la significación básica de la administración de HSA es notable en el tratamiento de los síntomas que acompañan a la pérdida de fluidos de los vasos sanguíneos, la cual causa edema, como en cirugía, choque, quemaduras, o hipoproteinemia.

Hasta el presente, la HSA se produce principalmente mediante fraccionamiento de sangre. Este método de producción es antieconómico, y además, presenta el problema de que el abastecimiento de la sangre de la cual se produce la HSA, no está siempre asegurado. Además, ya que la HSA es originada en la sangre, la HSA producida de esta forma está bajo un riesgo constante de contener sustancias no deseables, tales como los virus de la hepatitis. Desde este aspecto también, el desarrollo de un sustituto de la sangre como el material de partida para la HSA sería grandemente ventajoso.

Bajo las circunstancias así descritas, están siendo establecidos métodos para una producción a gran escala de HSA mediante ingeniería genética, seguida de alta purificación. Semejante método permitirá una producción económica de HSA que no contenga sustancias indeseables tales como los virus de la hepatitis.

Mediante ingeniería genética, sin embargo, la HSA se colorea por estar combinada con un cierto componente colorante presente en los materiales de partida o por la contaminación de sustancias secretadas por microorganismos durante el cultivo de los microorganismos hospedadores y/o durante la purificación de la HSA. Estos contaminantes no pue-
den ser separados suficientemente por los métodos convencionales de purificación de la HSA originada del plasma.

Sumario de la invención

De acuerdo con esto, el objeto de la presente invención es proporcionar un método para suprimir la coloración de la HSA, la cual está causada por componentes del medio o secretados por la célula, cuando se produce HSA mediante ingeniería genética.

Los autores de la presente invención realizaron varios estudios para conseguir el objeto descrito, y han encontrado que llevando a cabo el cultivo y/o la purificación para la producción de HSA mediante ingeniería genética en presencia de un compuesto amínico particular, puede ser suprimida la coloración de la HSA, que está causada por la combinación de o por reacción entre la HSA producida extracelularmente por ingeniería genética y materiales colorantes, y completaron la invención.

De acuerdo con esto, la presente invención se refiere a un método para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana expresada mediante ingeniería genética, el cual comprende llevar a cabo el cultivo y/o la purificación en presencia de un compuesto amínico seleccionado entre metilendiamina, propilendiamina; N,N-dialquil(C_{1-6})-alquilendiaminas(C_{1-6}); guanidinas seleccionadas entre guanidina, aminoguanidina y fenilguanidina; benzamidinas seleccionadas entre benzamidina y p-aminobenzamidina; y aminoácidos básicos seleccionados entre lisina y arginina, en una proporción de 0,1 a 1% en peso/volumen relativo al medio o a la fracción líquida que contiene la albúmina sérica humana.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para suprimir la coloración de la HSA que se produce por ingeniería genética, el cual comprende cultivar de las células (por ejemplo, Escherichia coli, levaduras, Bacillus subtilis, koji, células animales) capaces de expresar HSA, seguido por la expresión extracelular (expresión secretora).

1. Preparación del hospedador productor de HSA mediante ingeniería genética

El hospedador productor de HSA que se usa en la presente invención no está sometido a ninguna limitación particular siempre que se prepare mediante ingeniería genética, y cualquier hospedador ya descrito en las literaturas conocidas o que sea desarrollado en el futuro, puede ser usado, apropiadamente con la condición de que sea capaz de conseguir el objeto de la invención. Ejemplos específicos de hospedadores adecuados que comparten la capacidad de producción de HSA mediante ingeniería genética son Escherichia coli, levaduras, Bacillus subtilis, y células animales. Particularmente en la presente invención, es deseable el uso como un hospedador de una levadura, específicamente el género Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae) o el género Pichia (por ejemplo Pichia pastoris). Así mismo, pueden usarse cepas auxótrofas o cepas sensibles a antibióticos. Además, la cepa AH22 de Saccharomyces cerevisiae (a, his 4, leu 2, can 1) o la cepa GTS115 de Pichia pastoris (his 4), pueden usarse preferiblemente.

El método para la preparación de estos hospedadores productores de HSA, el método para producir HSA mediante cultivo de los hospedadores, y el método para la separación y recogida de HSA de los cultivos puede ser uno conocido o sus análogos. Por ejemplo, los métodos para la preparación del hospedador productor de HSA (o la cepa productora de HSA) incluyen un método en el que se usa un conocido gen de albúmina sérica humana (Publicación de Patente Europea Números 73646, 79739 y 206733), un método en el que se usa un nuevo gen de la albúmina sérica humana (Publicación no Examinada de Patente Japonesa Números 29985/1987, 98486/1989), un método en el que se usa una secuencia señal sintética (Publicación de Patente Europea Número 319641), un método en el que se incorpora un plásmido recombinante en un cromosoma (Publicación de Patente Europea Número 399455), un método en el que se fusionan los hospedadores (Publicación de Patente Europea Número 409156), un método en el que se causa una mutación en un medio que contiene metanol, un método en el que se usa el promotor variante AOX_{2} obtenido por modificación del promotor natural AOX_{2} mediante, por ejemplo, deleción parcial, sustitución o adición de su secuencia de bases para aumentar la actividad como un promotor (Solicitud de Patente Japonesa Números 63598/1991, 63559/1991), una expresión de HSA por Bacillus subtilis (Publicación no Examinada de Patente Japonesa Número 25133/1987), una producción de HSA con levaduras (Publicación de Patente Europea Números 123544, 248637, y 251744) y una producción de HSA con Pichia (Publicación de Patente Europea Número 344459).

De los métodos antes mencionados, el método en el que se causa una mutación en un medio que contiene metanol comprende las siguientes etapas. Esto es, se introduce en un hospedador apropiado, preferiblemente una levadura Pichia, un plásmido que tiene una unidad de transcripción en la que la HSA se expresa bajo el control del promotor AOX_{1}, específicamente dentro de una región del gen AOX_{1} de la cepa GTS115 (depósito NRRL Número Y-15851), mediante un método convencional, para obtener un transformante (véase Publicación de Patente Europea Número 344459). Este transformante muestra un crecimiento pobre en un medio que contiene metanol. A continuación, este transformante se cultiva en un medio que contiene metanol para causar la mutación, y solo se recogen las cepas que muestran un crecimiento rápido. La concentración de metanol es de 0,0001 a 5%, y el medio puede ser artificial o natural. La incubación se lleva a cabo a 15-40ºC durante 1 a 1000 horas.

Los métodos para el cultivo de un hospedador productor de HSA, es decir, el método de producción para la HSA, incluyen un método en el que se obtienen gran concentración de células y rendimiento de productos al suministrar una cantidad adecuadamente pequeña de glucosa de alta concentración, etc. mediante un cultivo discontinuo alimentado de modo que se impida un efecto de inhibición causado por un sustrato de alta concentración, en las células transformadas (Solicitud de Patente Japonesa Número 219561/1989), un método en el que se aumenta la producción de HSA mediante adición de un ácido graso en el medio (Solicitud de Patente Japonesa Número 81719/1991), y un método de inhibición de la coloración de la albúmina sérica humana recombinante producida por células hospedadoras en un medio de cultivo, que comprende la separación de contaminantes colorantes de dicha albúmina sérica humana de los contaminantes colorantes antes mencionados unidos a la albúmina sérica humana (Documento EP-A-0464590).

Los métodos para la separación y recogida de la HSA incluyen, por ejemplo, inactivación de proteasa por tratamiento con calor (Publicación de Patente Europea Número 420007).

El medio a utilizar para el cultivo de un hospedador transformante es un medio conocido en este campo, el cual ha sido suplementado con un ácido graso que tiene de 10 a 26 átomos de carbono o su sal, y el cultivo puede ser llevado a cabo por un método convencional. El medio puede ser sintético o natural, dando preferencia a un medio líquido. Por ejemplo, un medio sintético puede contener varios azúcares como fuentes de carbono; urea o sal amónica y nitratos como fuentes de nitrógeno; varias vitaminas y nucleótido como micronutrientes; y Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co y Cu como sales inorgánicas, y se ejemplifica en el medio líquido YNB [0,7% de base de nitrógeno de levadura (fabricado por Difco), 2% de glucosa]. Ejemplos de medio natural incluyen el medio líquido YPD [1% de extracto de levadura (fabricado por Difco), 2% de Bactopeptona (fabricada por Difco), 2% de glucosa]. El pH del medio puede ser neutro, débilmente básico, o débilmente ácido. Cuando un hospedador utiliza metanol, se puede usar un medio que contenga metanol. En este caso, la concentración del metanol es de 0,01 a 5%.

La temperatura de incubación es preferiblemente de 15 a 43ºC (de 20 a 30ºC para levaduras, y de 20 a 37ºC para bacterias). La incubación se lleva a cabo durante 1 a 1000 horas, bajo aireación, mediante cultivo de serie, cultivo discontinuo, cultivo discontinuo alimentado o cultivo continuo, permitiéndose reposo, agitación o vibración. Es preferible un precultivo previo al cultivo principal, en el que se usa, por ejemplo, medio líquido YNB o medio líquido YPD. El precultivo se lleva a cabo durante 10 a 100 horas a 30ºC para levaduras y 37ºC para bacterias.

Después del cultivo, se recoge la HSA del filtrado del cultivo o de las células mediante métodos conocidos de separación y purificación.

2. Etapa para suprimir la combinación o la reacción de la HSA con materiales colorantes

La etapa para suprimir la coloración de la HSA se incorpora dentro de la etapa de cultivo, etapa de purificación (postcultivo), y/o las etapas en línea (etapas desde el cultivo hasta la purificación completamente automatizadas sin operación manual), y se aplica a una solución acuosa que contiene HSA tal como la solución de cultivo, el sobrenadante del cultivo, la fracción cruda de la purificación o la fracción purificada.

En la presente invención, la combinación o la reacción de la HSA expresada por el cultivo con materiales colorantes puede ser suprimida llevando a cabo el tratamiento o tratamientos antes mencionados, en presencia de un compuesto específico que será mencionado más adelante. Es deseable que esta etapa de supresión se lleve a cabo durante la etapa de cultivo en el caso de expresión extracelular. El compuesto que se usa para la supresión del color es un compuesto amínico como se ha indicado anteriormente.

Las N,N-dialquil(C_{1-6})alquilendiaminas(C_{1-6}) incluyen N,N-dimetiletilendiamina y la N,N-dietiletilendiamina.

La supresión de la coloración en la etapa de cultivo se lleva a cabo adecuadamente bajo las siguientes condiciones:

: pH: 4-9 (preferiblemente pH 5-7)

: proporción de compuesto amínico a añadir:

: 0,1-1% peso/volumen relativo al medio.

Asimismo, la supresión del color en la presente invención puede ser llevada a cabo durante la purificación de la HSA. La purificación puede ser realizada mediante métodos conocidos tales como fraccionamientos diversos, cromatografía de adsorción, cromatografía de afinidad, filtración en gel, centrifugación en gradiente de densidad, y diálisis.

La supresión de la coloración durante la etapa de purificación puede realizarse bajo las siguientes condiciones:

: pH: 4-9 (preferiblemente pH 5-7)

: proporción de compuesto amínico a añadir:

: 0,1-1% peso/volumen relativo a la fracción líquida que contiene HSA.

La presente invención se describe en detalle de aquí en adelante mediante referencia a los ejemplos.

Ejemplos 1-4

1. Cepa usada: Saccharomyces cerevisiae cepa TMS33-1h4

La cepa revertiente de la prototrofía de la histidina TMS33-1h4 se obtuvo de la siguiente forma a partir de la cepa auxótrofa de histidina TMS-33-1 de acuerdo con la Publicación no Examinada de Patente Japonesa Número 72889/1991. Después de que la cepa TMS-33-1 se hiciera crecer toda una noche en un medio no selectivo, se recogieron las células, se lavaron exhaustivamente, y se revistieron sobre una placa selectiva (una placa de medio sin histidina). La placa selectiva se cultivó a 30ºC, y se obtuvo la cepa TMS-33-1h4 de las cepas revertientes candidatas que habían crecido.

2. Medio

i) Medio YNB: Base de nitrógeno Bacto-Yeast (6,7 g, fabricada por Difco), disuelta en 100 ml de agua destilada y esterilizada por filtración, se mezcló con 20 g de glucosa (fabricada por Nakarai Kagaku, Japón) disuelta en agua destilada hasta hacer la cantidad total de 900 ml y después tratada en autoclave.

ii) Medio sintético de acetato amónico-glucosa: que tiene la composición de la Tabla 1

TABLA 1

Componente	Concentración (mg/l)
Glucosa	20.000
CH_{3}COONH_{4}	5.000
KH_{2}PO_{4}	10.000
CaCl_{2} 2H_{2}O	100
KCl	2.000

TABLA 1 (continuación)

Componente	Concentración (mg/l)
NaCl	100
MgSO_{4} 7H_{2}O	2.000
ZnSO_{4} 7H_{2}O	100
CuSO_{4} 5H_{2}O	5
FeCl_{3} 6H_{2}O	100
Biotina	0,1
Vitamina B_{1}	10
Vitamina B_{6}	1
Pantotenato sódico	10
Inositol	50
	pH 6,0

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iii) Cultivo

Precultivo

Se inoculó una cantidad adecuada de la cepa TMS-33-1h4 en un matraz Erlenmeyer equipado con tabiques que contenía un medio YNB, y se sometió a cultivo en agitación a 30ºC durante 24 horas.

Cultivo principal

Se centrifugó el precultivo, y se recogieron las células. Se suspendieron las células en 10 ml de agua esterilizada. Se inoculó la suspensión celular (1 ml) en medio sintético de acetato amónico-glucosa (100 ml). Se dispensó el medio de cultivo (100 ml) en un matraz Erlenmeyer equipado con tabiques, y se sometió a cultivo bajo agitación a 30ºC durante 70 horas a 125 rpm.

En esa ocasión, se añadieron en el cultivo diversos compuestos amínicos respectivamente como se indica en la Tabla 2. Para comparación, el cultivo se llevó a cabo sin compuestos amínicos (referencia).

iv) Ejemplo de Experimento (Efecto de varios compuestos amínicos añadidos en los medios de cultivo, sobre la coloración de la HSA).

Purificación del líquido sobrenadante del cultivo y concentración

Después del cultivo, se tomó una muestra de cada medio de cultivo. Se centrifugó la muestra a 15.000 rpm durante 5 minutos, y se determinó la concentración de HSA en una parte del líquido sobrenadante obtenido.

Al sobrenadante del cultivo restante (100 ml) se añadió Celulofina Azul (1 g, lavada exhaustivamente con solución salina fisiológica, fabricada por Seikagaku Kogyo, Japón) en forma de torta de filtración, y se dejó adsorber la albúmina en ésta a temperatura ambiente durante 2 horas. La Celulofina Azul, en la cual se había adsorbido la albúmina se transfirió a una minicolumna, se lavó con solución salina fisiológica, y se eluyó con 3 ml de tiocianato sódico 3 M. Se concentró el eluato en un concentrador [Centricon 30 (30K), fabricado por Amicon], y se usó como una muestra para medición.

Medición de HSA

Se determinó la concentración de HSA en el líquido sobrenadante del cultivo mediante un ensayo de hemaglutinación pasiva reversa (HAPR), en base al cual se determinó la cantidad de HSA. La cantidad de HSA se expresó como una relación en una base de HSA estándar (fabricada por Miles), tomando como 1 la cantidad de HSA de ésta.

Grado de coloración

Se examinaron las muestras purificadas y concentradas para la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm, 350 nm, o 405 nm. Se calcularon las relaciones entre la absorbancia a la longitud de onda de 350 nm y la de la longitud de onda de 280 nm, y entre la longitud de onda de 405 nm y la longitud de onda de 280 nm, y se usaron como índices para el grado de coloración. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2

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	Inhibidor de la coloración	350 nm/280 nm	405 nm/280 nm	Cantidad de
	(Concentración % peso/vol.)			HSA*
Referencia		0,125	0,113	1
		(100)	(100)
Ej. 1	Aminoguanidina	0,035	0,015	1
	(0,5)	(28,0)	(13,3)
Ej. 2	Aminoguanidina	0,028	0,010	1
	(1,0)	(22,4)	(8,8)
Ej. 3	N,N-dietiletilendiamina	0,011	0,009	1
	(1,0)	(8,8)	(8,0)
Ej. 4	N,N-dimetiletilenodiamina	0,011	0,008	1
	(1,0)	(8,8)	(7,1)
Nota: * expresada como un cociente tomando la cantidad de HSA de la Referencia como 1.

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Ejemplo 5 1. Cepa usada: Las mismas cepas usadas en los Ejemplos 1-4 2. Medio

i) medio para el cultivo discontinuo: que tiene la composición de la Tabla 3

ii) medio para el cultivo continuo: que tiene la composición de la Tabla 4

TABLA 3

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Componente	Concentración (mg/l)
Glucosa	1.000
(NH_{4})_{2} SO_{4}	2.000
KH_{2}PO_{4}	20.000
KCl	4.000
NaCl	400
MgSO_{4} 7H_{2}O	4.000
CaCl_{2} 2H_{2}O	100
ZnSO_{4} 7H_{2}O	100
CuSO_{4} 5H_{2}O	10
FeCl_{3} 6H_{2}O	100
Biotina	0,2
Vitamina B_{1}	20
Vitamina B_{6}	2
Pantotenato sódico	20
Inositol	100
	pH 5,8

TABLA 4

Componente	Concentración (mg/l)
Glucosa	500.000
MgSO_{4} 7H_{2}O	20.000
ZnSO_{4} 7H_{2}O	1.000
CaCl_{2} 2H_{2}O	300
CuSO_{4} 5H_{2}O	50
Biotina	1
Vitamina B_{1}	100
Vitamina B_{6}	10
Pantotenato sódico	100
Inositol	500

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3. Cultivo Precultivo

La línea celular almacenada congelada en glicerol (1 ml, DO_{540} = 10) se inoculó en un matraz Erlenmeyer equipado con tabiques que contenía un medio YNB, y se sometió a cultivo bajo agitación a 30ºC durante 24 horas. Después de recolección mediante centrifugación, las células se suspendieron en agua esterilizada, se inocularon en 4 litros de medio de cultivo discontinuo.

Cultivo principal

Se usó un fermentador tipo minijarra de 10 litros, y el cultivo se llevó a cabo con aireación y agitación. La tasa de aireación se fijó en 1 vvm, y la velocidad de agitación se controló de forma que la concentración de oxígeno disuelto no fuese menor que 10 ppm. El pH del medio se mantuvo a 5,8 mediante adición de amoniaco acuoso al 28%. La acción antiespumante se consiguió mediante la adición de una pequeña cantidad de un agente antiespumante (Adekanol, fabricado por Asahi Denka Kogyo, Japón) según sea necesario. Se añadió un medio nutritivo (4 litros) de acuerdo con un programa de control de manera que la tasa de crecimiento específico llegara a ser 0,12 (h ^{-1}).

Programa de control de cultivo

La tasa de alimentación se controló de acuerdo con un programa. El programa fija usualmente la tasa de alimentación de forma que la tasa de crecimiento específico sea 0,12 (h ^{-1}). Sin embargo, cuando la concentración de oxígeno disuelto cae hasta 2 o por debajo mientras el cultivo está bajo control, la tasa de crecimiento específico se fija en 0 para mantener constante la tasa de alimentación.

Compuesto amínico

Se añadió aminoguanidina (garantizada, fabricada por Wako Junyaku, Japón) al medio discontinuo y al medio de alimentación respectivamente de manera que la concentración de éstos fuese 0,6% peso/vol.

Como referencia, se realizó el cultivo sin aminoguanidina.

4. Ejemplo de experimento - Producción de HSA en presencia de un compuesto amínico, y su efecto en la coloración i) Determinación de la concentración celular

Se tomó una muestra de un medio de cultivo a un tiempo opcional, y la muestra se diluyó apropiadamente con agua destilada. Se midió la absorbancia a 540 nm con un espectrofotómetro (UV 240, fabricado por Shimazu, Japón), y se determinó el peso celular seco a partir de la curva de calibración dibujada con anticipación.

De la misma manera que lo descrito, se compararon la concentración de HSA y el grado de coloración. La concentración de HSA en la muestra se expresó en mg/l. Los resultados se recogen en la Tabla 5.

TABLA 5

	Referencia	Ejemplo 5
Tiempo de cultivo (h.)	72	75
DO_{540}	960,0	972,0
Concentración celular	120,0	121,5
(g-PSC/l)
Concentración de HSA	800	800
(mg/l)
Grado de coloración	0,165(100)	0,036(21,8)
350 nm/280 nm
405 nm/280 nm	0,132(100)	0,022(16,7)

El cultivo procedió fácilmente en la presencia de 0,6% peso/vol. de aminoguanidina. La cantidad de células alcanzó 120 g-PSC/l, y la producción de HSA alcanzó 800 mg/l durante 72-75 horas de cultivo.

En otras palabras, el cultivo convencional (cultivo sin el tratamiento para la supresión de la coloración) pudo ser llevado a cabo incluso en presencia de 0,6% en peso/volumen de aminoguanidina, y la coloración de la HSA obtenida mostró, aproximadamente, un quinto de la coloración observada usualmente (en el cultivo sin el tratamiento para la supresión de la coloración).

Ejemplos 6-7

1. Cepa a usar: Pichia pastoris GCP101

La PC4130 se puede obtener mediante sustitución de la región génica AOX_{1} de Pichia pastoris GTS115 (his 4) (NRRL Y-15851) con los fragmentos escindidos con Not I del plásmido pPGP1 que tiene una unidad de transcripción en la que la HSA se expresa bajo el control del promotor AOX_{1}, mediante el método que se describe en la Publicación de Patente Europea Número 344359. Debido a la ausencia del gen AOX_{1}, esta cepa muestra un crecimiento pobre en un medio que contenga metanol como fuente de carbono (cepa Mut-).

Se inoculó la PC4130 en 3 ml de medio YPD (1% de extracto de levadura, 2% de Bactopeptona, 2% de glucosa), y 24 horas después, éste se inoculó en 50 ml de medio YPD a una concentración que hizo la DO_{540} inicial de 0,1. Después de una incubación a 30ºC durante 3 días, éste se inoculó en 50 ml de medio YPD a una concentración que hizo la DO_{540} inicial de 0,1. Se repitió el mismo subcultivo cada tres días. En cada subcultivo, se diluyeron las células con agua esterilizada para hacer la concentración celular 10^{7} células/placa, y se revistió con ellas una placa al 2% en peso/volumen MeOH-YNB a.a. (0,7% de base de nitrógeno de levadura sin aminoácido, 2% de metanol, 1,5% de agar en polvo). Después de incubación a 30ºC durante 5 días, se observó la presencia o ausencia de colonia. Se formaron veinte colonias en una placa al 2% peso/volumen MeOH-YNB a.a. que había sido revestida con células después de 12 días de subcultivo. La cepa Mut- apenas formó colonia en esta placa, sin embargo la cepa Mut+ pudo formar una. Es decir, la formación de colonia en esta placa indica una utilización aumentada del metanol, y también indica que se puede obtener una cepa convertida en Mut+. Una de las colonias formadas se diluyó apropiadamente con agua esterilizada, y se extendió en una placa al 2% en peso/volumen MeOH-YNB a.a. en una sola colonia que se denominó GCP101.

2. Medio i) Medio para el precultivo

Se disolvió Base de nitrógeno Bacto-Yeast (6,7 g, fabricada por Difco) en agua hasta hacer la cantidad total de 100 ml, y se mezclaron en una relación 1:1:18 (vol) YBN 10X, que estaba esterilizado y filtrado, glucosa al 20% que estaba esterilizada en un autoclave, y agua esterilizada, y se usaron.

ii) Medio para el cultivo principal

Se añadieron varios compuestos amínicos, respectivamente, a un medio que contiene metanol y glicerol como fuentes de carbono (Tabla 6), y se usaron como un medio para el cultivo principal (pH 6,0).

TABLA 6

Componente	Concentración (1/l)
Metanol	40 ml
Glicerol	1.000 mg
Acetato amónico	5.000 mg
KH_{2} PO_{4}	10.000 mg
CaCl_{2} 2H_{2}O	100 mg
KCl	2.000 mg
NaCl	100 mg
MgSO_{4} 7H_{2}O	2.000 mg
ZnSO_{4} 7H_{2}O	100 mg
CuSO_{4} 5H_{2}O	5 mg
FeCl_{3} 6H_{2}O	100 mg
Biotina	0,1 mg
Vitamina B_{1}	10 mg
Vitamina B_{6}	1 mg
Ácido pantoténico de sodio	10 mg
Inositol	50 mg

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3. Método de cultivo i) Precultivo

Se inoculó un ml de un vial de glicerol al 20% congelado y almacenado en 100 ml de caldo YNB, y se sometió el caldo a cultivo en agitación a 30ºC durante 24 horas, en un matraz Erlenmeyer de 300 ml equipado con tabi-
ques.

ii) Cultivo principal

Después, se sometieron a recolección centrífuga 100 ml del precultivo, se suspendió en 10 ml de agua esterilizada. Se inoculó la suspensión celular (0,5 ml) en 50 ml del cultivo principal. El medio de cultivo (50 ml) se dispensó en cada uno de los frascos Erlenmeyer equipados con tabiques, y se sometieron a cultivo en agitación a 30ºC durante 120 horas a 125 rpm.

Se examinó el efecto de varios compuestos amínicos en la coloración de la HSA mediante un método similar al de los Ejemplos 1-4. Los resultados se resumen en la Tabla 7.

TABLA 7

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	Inhibidor de la coloración	350 nm/280 nm	405 nm/280 nm	Cantidad
	(Concentración % peso/vol)			de HSA*
Referencia		0,098	0,088	1
		(100)	(100)
Ej. 6	Aminoguanidina	0,016	0,010	1
	(0,6)	(16,3)	(11,4)
Ej. 7	N,N-dietiletilendiamina	0,014	0,009	1
	(0,6)	(14,3)	(10,2)
Nota: * Expresada como un cociente tomando la cantidad de HSA en la Referencia como 1.

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De acuerdo con la presente invención, la coloración de la HSA expresada mediante ingeniería genética puede ser suprimida desde un medio hasta un décimo de la de sin el tratamiento para la supresión de la coloración. Además, la HSA puede ser recuperada en altos rendimientos, y el tratamiento de la invención no afecta a las propiedades inherentes de la HSA.

Puesto que el método de la presente invención comprende la adición de un agente para suprimir la coloración de la HSA durante el cultivo y/o la purificación, el método puede ser llevado a cabo fácilmente y eficientemente.

Consecuentemente, la HSA tratada por el método de la presente invención puede ser usada como un fármaco clínicamente útil, como lo es la HSA originada del plasma.

Claims

1. Un método para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana expresada mediante ingeniería genética, que comprende el cultivo y/o la purificación en presencia de un compuesto amínico seleccionado entre metilendiamina; propilendiamina; N,N-dialquil(C_{1-6})alquilendiaminas(C_{1-6}); guanidinas seleccionadas entre guanidina, aminoguanidina y fenilguanidina; benzamidinas seleccionadas entre benzamidina y p-aminobenzamidina; y aminoácidos básicos seleccionados entre lisina y arginina, en una proporción de 0,1 a 1% peso/vol con respecto al medio o a la fracción líquida que contiene la albúmina sérica humana.

2. El método para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las N,N-dialquil(C_{1-6})alquilendiaminas(C_{1-6}) se seleccionan entre N,N-dimetiletilendiamina y N,N-dietiletilendiamina.

3. El método para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cultivo comprende cultivar, en un medio al que se ha añadido un compuesto amínico como se define en la reivindicación 1, un organismo hospedador productor de albúmina sérica humana preparado por ingeniería genética.

4. El método para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el organismo hospedador productor de albúmina sérica humana es una levadura.

5. El método para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la levadura se selecciona del género Saccharomyces y el género Pichia.