ES2152935T5 - Metodo para suprimir la coloracion de la albumina serica humana. - Google Patents
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Abstract
Un método para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana expresada mediante ingeniería genética, que comprende el cultivo y/o la purificación en presencia de un compuesto amínico seleccionado entre metilendiamina; propilendiamina; N,N-dialquil(C1-6)alquilendiaminas(C1-6); guanidinas seleccionadas entre guanidina, aminoguanidina y fenilguanidina; benzamidinas seleccionadas entre benzamidina y p-aminobenzamidina; y aminoácidos básicos seleccionados entre lisina y arginina, en una proporción de 0,1 a 1% peso/vol con respecto al medio o a la fracción líquida que contiene la albúmina sérica humana.
Description
Método para suprimir la coloración de la
albúmina sérica humana.
La presente invención se refiere a un método
para suprimir la coloración de la albúmina sérica humana expresada
mediante ingeniería genética.
Una albúmina, en particular, la albúmina sérica
humana (de aquí en adelante también denominada HSA) es un
importante componente constituyente de la proteína en el plasma.
Esta proteína se produce en el hígado, y es responsable
principalmente del sostenimiento de la presión osmótica normal del
flujo sanguíneo. Además, funciona como un vehículo para varias
moléculas séricas.
La HSA se administra en una variedad de
situaciones clínicas. Por ejemplo, cuando se administra HSA a un
paciente que ha sufrido ataque fulminante o quemaduras, funciona
recobrando el volumen sanguíneo a su nivel original, y de este
modo, mejorando algunos síntomas relacionados con el trauma. Por
este efecto, la HSA se administra frecuentemente. También, los
pacientes que sufren de hipoproteinemia o de eritroblastosis fetal
pueden necesitar tratamientos con HSA. Como se ejemplifica, la
significación básica de la administración de HSA es notable en el
tratamiento de los síntomas que acompañan a la pérdida de fluidos de
los vasos sanguíneos, la cual causa edema, como en cirugía, choque,
quemaduras, o hipoproteinemia.
Hasta el presente, la HSA se produce
principalmente mediante fraccionamiento de sangre. Este método de
producción es antieconómico, y además, presenta el problema de que
el abastecimiento de la sangre de la cual se produce la HSA, no
está siempre asegurado. Además, ya que la HSA es originada en la
sangre, la HSA producida de esta forma está bajo un riesgo
constante de contener sustancias no deseables, tales como los virus
de la hepatitis. Desde este aspecto también, el desarrollo de un
sustituto de la sangre como el material de partida para la HSA sería
grandemente ventajoso.
Bajo las circunstancias así descritas, están
siendo establecidos métodos para una producción a gran escala de
HSA mediante ingeniería genética, seguida de alta purificación.
Semejante método permitirá una producción económica de HSA que no
contenga sustancias indeseables tales como los virus de la
hepatitis.
Mediante ingeniería genética, sin embargo, la
HSA se colorea por estar combinada con un cierto componente
colorante presente en los materiales de partida o por la
contaminación de sustancias secretadas por microorganismos durante
el cultivo de los microorganismos hospedadores y/o durante la
purificación de la HSA. Estos contaminantes no pue-
den ser separados suficientemente por los métodos convencionales de purificación de la HSA originada del plasma.
den ser separados suficientemente por los métodos convencionales de purificación de la HSA originada del plasma.
De acuerdo con esto, el objeto de la presente
invención es proporcionar un método para suprimir la coloración de
la HSA, la cual está causada por componentes del medio o secretados
por la célula, cuando se produce HSA mediante ingeniería
genética.
Los autores de la presente invención realizaron
varios estudios para conseguir el objeto descrito, y han encontrado
que llevando a cabo el cultivo y/o la purificación para la
producción de HSA mediante ingeniería genética en presencia de un
compuesto amínico particular, puede ser suprimida la coloración de
la HSA, que está causada por la combinación de o por reacción entre
la HSA producida extracelularmente por ingeniería genética y
materiales colorantes, y completaron la invención.
De acuerdo con esto, la presente invención se
refiere a un método para suprimir la coloración de la albúmina
sérica humana expresada mediante ingeniería genética, el cual
comprende llevar a cabo el cultivo y/o la purificación en presencia
de un compuesto amínico seleccionado entre metilendiamina,
propilendiamina;
N,N-dialquil(C_{1-6})-alquilendiaminas(C_{1-6});
guanidinas seleccionadas entre guanidina, aminoguanidina y
fenilguanidina; benzamidinas seleccionadas entre benzamidina y
p-aminobenzamidina; y aminoácidos básicos seleccionados entre
lisina y arginina, en una proporción de 0,1 a 1% en peso/volumen
relativo al medio o a la fracción líquida que contiene la albúmina
sérica humana.
La presente invención se refiere a un método
para suprimir la coloración de la HSA que se produce por ingeniería
genética, el cual comprende cultivar de las células (por ejemplo,
Escherichia coli, levaduras, Bacillus subtilis, koji,
células animales) capaces de expresar HSA, seguido por la expresión
extracelular (expresión secretora).
El hospedador productor de HSA que se usa en la
presente invención no está sometido a ninguna limitación particular
siempre que se prepare mediante ingeniería genética, y cualquier
hospedador ya descrito en las literaturas conocidas o que sea
desarrollado en el futuro, puede ser usado, apropiadamente con la
condición de que sea capaz de conseguir el objeto de la invención.
Ejemplos específicos de hospedadores adecuados que comparten la
capacidad de producción de HSA mediante ingeniería genética son
Escherichia coli, levaduras, Bacillus subtilis, y
células animales. Particularmente en la presente invención, es
deseable el uso como un hospedador de una levadura, específicamente
el género Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces
cerevisiae) o el género Pichia (por ejemplo Pichia
pastoris). Así mismo, pueden usarse cepas auxótrofas o cepas
sensibles a antibióticos. Además, la cepa AH22 de Saccharomyces
cerevisiae (a, his 4, leu 2, can 1) o la cepa GTS115 de
Pichia pastoris (his 4), pueden usarse
preferiblemente.
El método para la preparación de estos
hospedadores productores de HSA, el método para producir HSA
mediante cultivo de los hospedadores, y el método para la
separación y recogida de HSA de los cultivos puede ser uno conocido
o sus análogos. Por ejemplo, los métodos para la preparación del
hospedador productor de HSA (o la cepa productora de HSA) incluyen
un método en el que se usa un conocido gen de albúmina sérica humana
(Publicación de Patente Europea Números 73646, 79739 y 206733), un
método en el que se usa un nuevo gen de la albúmina sérica humana
(Publicación no Examinada de Patente Japonesa Números 29985/1987,
98486/1989), un método en el que se usa una secuencia señal
sintética (Publicación de Patente Europea Número 319641), un método
en el que se incorpora un plásmido recombinante en un cromosoma
(Publicación de Patente Europea Número 399455), un método en el que
se fusionan los hospedadores (Publicación de Patente Europea Número
409156), un método en el que se causa una mutación en un medio que
contiene metanol, un método en el que se usa el promotor variante
AOX_{2} obtenido por modificación del promotor natural AOX_{2}
mediante, por ejemplo, deleción parcial, sustitución o adición de su
secuencia de bases para aumentar la actividad como un promotor
(Solicitud de Patente Japonesa Números 63598/1991, 63559/1991), una
expresión de HSA por Bacillus subtilis (Publicación no
Examinada de Patente Japonesa Número 25133/1987), una producción de
HSA con levaduras (Publicación de Patente Europea Números 123544,
248637, y 251744) y una producción de HSA con Pichia
(Publicación de Patente Europea Número 344459).
De los métodos antes mencionados, el método en
el que se causa una mutación en un medio que contiene metanol
comprende las siguientes etapas. Esto es, se introduce en un
hospedador apropiado, preferiblemente una levadura Pichia, un
plásmido que tiene una unidad de transcripción en la que la HSA se
expresa bajo el control del promotor AOX_{1}, específicamente
dentro de una región del gen AOX_{1} de la cepa GTS115 (depósito
NRRL Número Y-15851), mediante un método
convencional, para obtener un transformante (véase Publicación de
Patente Europea Número 344459). Este transformante muestra un
crecimiento pobre en un medio que contiene metanol. A continuación,
este transformante se cultiva en un medio que contiene metanol para
causar la mutación, y solo se recogen las cepas que muestran un
crecimiento rápido. La concentración de metanol es de 0,0001 a
5%, y el medio puede ser artificial o natural. La incubación se
lleva a cabo a 15-40ºC durante 1 a 1000 horas.
Los métodos para el cultivo de un hospedador
productor de HSA, es decir, el método de producción para la HSA,
incluyen un método en el que se obtienen gran concentración de
células y rendimiento de productos al suministrar una cantidad
adecuadamente pequeña de glucosa de alta concentración, etc.
mediante un cultivo discontinuo alimentado de modo que se impida un
efecto de inhibición causado por un sustrato de alta concentración,
en las células transformadas (Solicitud de Patente Japonesa Número
219561/1989), un método en el que se aumenta la producción de HSA
mediante adición de un ácido graso en el medio (Solicitud de Patente
Japonesa Número 81719/1991), y un método de inhibición de la
coloración de la albúmina sérica humana recombinante producida por
células hospedadoras en un medio de cultivo, que comprende la
separación de contaminantes colorantes de dicha albúmina sérica
humana de los contaminantes colorantes antes mencionados unidos a la
albúmina sérica humana (Documento
EP-A-0464590).
Los métodos para la separación y recogida de la
HSA incluyen, por ejemplo, inactivación de proteasa por tratamiento
con calor (Publicación de Patente Europea Número 420007).
El medio a utilizar para el cultivo de un
hospedador transformante es un medio conocido en este campo, el cual
ha sido suplementado con un ácido graso que tiene de 10 a 26 átomos
de carbono o su sal, y el cultivo puede ser llevado a cabo por un
método convencional. El medio puede ser sintético o natural, dando
preferencia a un medio líquido. Por ejemplo, un medio sintético
puede contener varios azúcares como fuentes de carbono; urea o sal
amónica y nitratos como fuentes de nitrógeno; varias vitaminas y
nucleótido como micronutrientes; y Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co y Cu
como sales inorgánicas, y se ejemplifica en el medio líquido YNB
[0,7% de base de nitrógeno de levadura (fabricado por Difco), 2% de
glucosa]. Ejemplos de medio natural incluyen el medio líquido YPD
[1% de extracto de levadura (fabricado por Difco), 2% de
Bactopeptona (fabricada por Difco), 2% de glucosa]. El pH del medio
puede ser neutro, débilmente básico, o débilmente ácido. Cuando un
hospedador utiliza metanol, se puede usar un medio que contenga
metanol. En este caso, la concentración del metanol es de 0,01 a
5%.
La temperatura de incubación es preferiblemente
de 15 a 43ºC (de 20 a 30ºC para levaduras, y de 20 a 37ºC para
bacterias). La incubación se lleva a cabo durante 1 a 1000 horas,
bajo aireación, mediante cultivo de serie, cultivo discontinuo,
cultivo discontinuo alimentado o cultivo continuo, permitiéndose
reposo, agitación o vibración. Es preferible un precultivo previo
al cultivo principal, en el que se usa, por ejemplo, medio líquido
YNB o medio líquido YPD. El precultivo se lleva a cabo durante 10 a
100 horas a 30ºC para levaduras y 37ºC para bacterias.
Después del cultivo, se recoge la HSA del
filtrado del cultivo o de las células mediante métodos conocidos de
separación y purificación.
La etapa para suprimir la coloración de la HSA
se incorpora dentro de la etapa de cultivo, etapa de purificación
(postcultivo), y/o las etapas en línea (etapas desde el cultivo
hasta la purificación completamente automatizadas sin operación
manual), y se aplica a una solución acuosa que contiene HSA tal como
la solución de cultivo, el sobrenadante del cultivo, la fracción
cruda de la purificación o la fracción purificada.
En la presente invención, la combinación o la
reacción de la HSA expresada por el cultivo con materiales
colorantes puede ser suprimida llevando a cabo el tratamiento o
tratamientos antes mencionados, en presencia de un compuesto
específico que será mencionado más adelante. Es deseable que esta
etapa de supresión se lleve a cabo durante la etapa de cultivo en
el caso de expresión extracelular. El compuesto que se usa para la
supresión del color es un compuesto amínico como se ha indicado
anteriormente.
Las
N,N-dialquil(C_{1-6})alquilendiaminas(C_{1-6})
incluyen N,N-dimetiletilendiamina y la
N,N-dietiletilendiamina.
La supresión de la coloración en la etapa de
cultivo se lleva a cabo adecuadamente bajo las siguientes
condiciones:
- pH: 4-9 (preferiblemente pH 5-7)
- proporción de compuesto amínico a añadir:
- 0,1-1% peso/volumen relativo al medio.
Asimismo, la supresión del color en la presente
invención puede ser llevada a cabo durante la purificación de la
HSA. La purificación puede ser realizada mediante métodos conocidos
tales como fraccionamientos diversos, cromatografía de adsorción,
cromatografía de afinidad, filtración en gel, centrifugación en
gradiente de densidad, y diálisis.
La supresión de la coloración durante la etapa
de purificación puede realizarse bajo las siguientes
condiciones:
- pH: 4-9 (preferiblemente pH 5-7)
- proporción de compuesto amínico a añadir:
- 0,1-1% peso/volumen relativo a la fracción líquida que contiene HSA.
La presente invención se describe en detalle de
aquí en adelante mediante referencia a los ejemplos.
Ejemplos
1-4
La cepa revertiente de la prototrofía de la
histidina TMS33-1h4 se obtuvo de la siguiente forma
a partir de la cepa auxótrofa de histidina
TMS-33-1 de acuerdo con la
Publicación no Examinada de Patente Japonesa Número 72889/1991.
Después de que la cepa TMS-33-1 se
hiciera crecer toda una noche en un medio no selectivo, se
recogieron las células, se lavaron exhaustivamente, y se revistieron
sobre una placa selectiva (una placa de medio sin histidina). La
placa selectiva se cultivó a 30ºC, y se obtuvo la cepa
TMS-33-1h4 de las cepas revertientes
candidatas que habían crecido.
i) Medio YNB: Base de nitrógeno
Bacto-Yeast (6,7 g, fabricada por Difco), disuelta
en 100 ml de agua destilada y esterilizada por filtración, se
mezcló con 20 g de glucosa (fabricada por Nakarai Kagaku, Japón)
disuelta en agua destilada hasta hacer la cantidad total de 900 ml y
después tratada en autoclave.
ii) Medio sintético de acetato
amónico-glucosa: que tiene la composición de la
Tabla 1
Componente | Concentración (mg/l) |
Glucosa | 20.000 |
CH_{3}COONH_{4} | 5.000 |
KH_{2}PO_{4} | 10.000 |
CaCl_{2} 2H_{2}O | 100 |
KCl | 2.000 |
Componente | Concentración (mg/l) |
NaCl | 100 |
MgSO_{4} 7H_{2}O | 2.000 |
ZnSO_{4} 7H_{2}O | 100 |
CuSO_{4} 5H_{2}O | 5 |
FeCl_{3} 6H_{2}O | 100 |
Biotina | 0,1 |
Vitamina B_{1} | 10 |
Vitamina B_{6} | 1 |
Pantotenato sódico | 10 |
Inositol | 50 |
pH 6,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
iii) Cultivo
Se inoculó una cantidad adecuada de la cepa
TMS-33-1h4 en un matraz Erlenmeyer
equipado con tabiques que contenía un medio YNB, y se sometió a
cultivo en agitación a 30ºC durante 24 horas.
Se centrifugó el precultivo, y se recogieron las
células. Se suspendieron las células en 10 ml de agua esterilizada.
Se inoculó la suspensión celular (1 ml) en medio sintético de
acetato amónico-glucosa (100 ml). Se dispensó el
medio de cultivo (100 ml) en un matraz Erlenmeyer equipado con
tabiques, y se sometió a cultivo bajo agitación a 30ºC durante 70
horas a 125 rpm.
En esa ocasión, se añadieron en el cultivo
diversos compuestos amínicos respectivamente como se indica en la
Tabla 2. Para comparación, el cultivo se llevó a cabo sin compuestos
amínicos (referencia).
iv) Ejemplo de Experimento (Efecto de varios
compuestos amínicos añadidos en los medios de cultivo, sobre la
coloración de la HSA).
Después del cultivo, se tomó una muestra de cada
medio de cultivo. Se centrifugó la muestra a 15.000 rpm durante 5
minutos, y se determinó la concentración de HSA en una parte del
líquido sobrenadante obtenido.
Al sobrenadante del cultivo restante (100 ml) se
añadió Celulofina Azul (1 g, lavada exhaustivamente con solución
salina fisiológica, fabricada por Seikagaku Kogyo, Japón) en forma
de torta de filtración, y se dejó adsorber la albúmina en ésta a
temperatura ambiente durante 2 horas. La Celulofina Azul, en la cual
se había adsorbido la albúmina se transfirió a una minicolumna, se
lavó con solución salina fisiológica, y se eluyó con 3 ml de
tiocianato sódico 3 M. Se concentró el eluato en un concentrador
[Centricon 30 (30K), fabricado por Amicon], y se usó como una
muestra para medición.
Se determinó la concentración de HSA en el
líquido sobrenadante del cultivo mediante un ensayo de
hemaglutinación pasiva reversa (HAPR), en base al cual se determinó
la cantidad de HSA. La cantidad de HSA se expresó como una relación
en una base de HSA estándar (fabricada por Miles), tomando como 1 la
cantidad de HSA de ésta.
Se examinaron las muestras purificadas y
concentradas para la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm,
350 nm, o 405 nm. Se calcularon las relaciones entre la absorbancia
a la longitud de onda de 350 nm y la de la longitud de onda de 280
nm, y entre la longitud de onda de 405 nm y la longitud de onda de
280 nm, y se usaron como índices para el grado de coloración. Los
resultados se resumen en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Inhibidor de la coloración | 350 nm/280 nm | 405 nm/280 nm | Cantidad de | |
(Concentración % peso/vol.) | HSA* | |||
Referencia | 0,125 | 0,113 | 1 | |
(100) | (100) | |||
Ej. 1 | Aminoguanidina | 0,035 | 0,015 | 1 |
(0,5) | (28,0) | (13,3) | ||
Ej. 2 | Aminoguanidina | 0,028 | 0,010 | 1 |
(1,0) | (22,4) | (8,8) | ||
Ej. 3 | N,N-dietiletilendiamina | 0,011 | 0,009 | 1 |
(1,0) | (8,8) | (8,0) | ||
Ej. 4 | N,N-dimetiletilenodiamina | 0,011 | 0,008 | 1 |
(1,0) | (8,8) | (7,1) | ||
Nota: * expresada como un cociente tomando la cantidad de HSA de la Referencia como 1. |
\vskip1.000000\baselineskip
i) medio para el cultivo discontinuo: que tiene
la composición de la Tabla 3
ii) medio para el cultivo continuo: que tiene la
composición de la Tabla 4
\vskip1.000000\baselineskip
Componente | Concentración (mg/l) |
Glucosa | 1.000 |
(NH_{4})_{2} SO_{4} | 2.000 |
KH_{2}PO_{4} | 20.000 |
KCl | 4.000 |
NaCl | 400 |
MgSO_{4} 7H_{2}O | 4.000 |
CaCl_{2} 2H_{2}O | 100 |
ZnSO_{4} 7H_{2}O | 100 |
CuSO_{4} 5H_{2}O | 10 |
FeCl_{3} 6H_{2}O | 100 |
Biotina | 0,2 |
Vitamina B_{1} | 20 |
Vitamina B_{6} | 2 |
Pantotenato sódico | 20 |
Inositol | 100 |
pH 5,8 |
Componente | Concentración (mg/l) |
Glucosa | 500.000 |
MgSO_{4} 7H_{2}O | 20.000 |
ZnSO_{4} 7H_{2}O | 1.000 |
CaCl_{2} 2H_{2}O | 300 |
CuSO_{4} 5H_{2}O | 50 |
Biotina | 1 |
Vitamina B_{1} | 100 |
Vitamina B_{6} | 10 |
Pantotenato sódico | 100 |
Inositol | 500 |
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular almacenada congelada en
glicerol (1 ml, DO_{540} = 10) se inoculó en un matraz Erlenmeyer
equipado con tabiques que contenía un medio YNB, y se sometió a
cultivo bajo agitación a 30ºC durante 24 horas. Después de
recolección mediante centrifugación, las células se suspendieron en
agua esterilizada, se inocularon en 4 litros de medio de cultivo
discontinuo.
Se usó un fermentador tipo minijarra de 10
litros, y el cultivo se llevó a cabo con aireación y agitación. La
tasa de aireación se fijó en 1 vvm, y la velocidad de agitación se
controló de forma que la concentración de oxígeno disuelto no fuese
menor que 10 ppm. El pH del medio se mantuvo a 5,8 mediante adición
de amoniaco acuoso al 28%. La acción antiespumante se consiguió
mediante la adición de una pequeña cantidad de un agente
antiespumante (Adekanol, fabricado por Asahi Denka Kogyo, Japón)
según sea necesario. Se añadió un medio nutritivo (4 litros) de
acuerdo con un programa de control de manera que la tasa de
crecimiento específico llegara a ser 0,12 (h ^{-1}).
La tasa de alimentación se controló de acuerdo
con un programa. El programa fija usualmente la tasa de alimentación
de forma que la tasa de crecimiento específico sea 0,12 (h ^{-1}).
Sin embargo, cuando la concentración de oxígeno disuelto cae hasta
2 o por debajo mientras el cultivo está bajo control, la tasa de
crecimiento específico se fija en 0 para mantener constante la tasa
de alimentación.
Se añadió aminoguanidina (garantizada, fabricada
por Wako Junyaku, Japón) al medio discontinuo y al medio de
alimentación respectivamente de manera que la concentración de éstos
fuese 0,6% peso/vol.
Como referencia, se realizó el cultivo sin
aminoguanidina.
Se tomó una muestra de un medio de cultivo a un
tiempo opcional, y la muestra se diluyó apropiadamente con agua
destilada. Se midió la absorbancia a 540 nm con un espectrofotómetro
(UV 240, fabricado por Shimazu, Japón), y se determinó el peso
celular seco a partir de la curva de calibración dibujada con
anticipación.
De la misma manera que lo descrito, se
compararon la concentración de HSA y el grado de coloración. La
concentración de HSA en la muestra se expresó en mg/l. Los
resultados se recogen en la Tabla 5.
Referencia | Ejemplo 5 | |
Tiempo de cultivo (h.) | 72 | 75 |
DO_{540} | 960,0 | 972,0 |
Concentración celular | 120,0 | 121,5 |
(g-PSC/l) | ||
Concentración de HSA | 800 | 800 |
(mg/l) | ||
Grado de coloración | 0,165(100) | 0,036(21,8) |
350 nm/280 nm | ||
405 nm/280 nm | 0,132(100) | 0,022(16,7) |
El cultivo procedió fácilmente en la presencia
de 0,6% peso/vol. de aminoguanidina. La cantidad de células alcanzó
120 g-PSC/l, y la producción de HSA alcanzó 800 mg/l
durante 72-75 horas de cultivo.
En otras palabras, el cultivo convencional
(cultivo sin el tratamiento para la supresión de la coloración) pudo
ser llevado a cabo incluso en presencia de 0,6% en peso/volumen de
aminoguanidina, y la coloración de la HSA obtenida mostró,
aproximadamente, un quinto de la coloración observada usualmente (en
el cultivo sin el tratamiento para la supresión de la
coloración).
Ejemplos
6-7
La PC4130 se puede obtener mediante sustitución
de la región génica AOX_{1} de Pichia pastoris GTS115
(his 4) (NRRL Y-15851) con los fragmentos
escindidos con Not I del plásmido pPGP1 que tiene una unidad
de transcripción en la que la HSA se expresa bajo el control del
promotor AOX_{1}, mediante el método que se describe en la
Publicación de Patente Europea Número 344359. Debido a la ausencia
del gen AOX_{1}, esta cepa muestra un crecimiento pobre en un
medio que contenga metanol como fuente de carbono (cepa Mut-).
Se inoculó la PC4130 en 3 ml de medio YPD (1% de
extracto de levadura, 2% de Bactopeptona, 2% de glucosa), y 24 horas
después, éste se inoculó en 50 ml de medio YPD a una concentración
que hizo la DO_{540} inicial de 0,1. Después de una incubación a
30ºC durante 3 días, éste se inoculó en 50 ml de medio YPD a una
concentración que hizo la DO_{540} inicial de 0,1. Se repitió el
mismo subcultivo cada tres días. En cada subcultivo, se diluyeron
las células con agua esterilizada para hacer la concentración
celular 10^{7} células/placa, y se revistió con ellas una placa
al 2% en peso/volumen MeOH-YNB a.a. (0,7% de base de
nitrógeno de levadura sin aminoácido, 2% de metanol, 1,5% de agar en
polvo). Después de incubación a 30ºC durante 5 días, se observó la
presencia o ausencia de colonia. Se formaron veinte colonias en una
placa al 2% peso/volumen MeOH-YNB a.a. que había
sido revestida con células después de 12 días de subcultivo. La cepa
Mut- apenas formó colonia en esta placa, sin embargo la cepa Mut+
pudo formar una. Es decir, la formación de colonia en esta placa
indica una utilización aumentada del metanol, y también indica que
se puede obtener una cepa convertida en Mut+. Una de las colonias
formadas se diluyó apropiadamente con agua esterilizada, y se
extendió en una placa al 2% en peso/volumen MeOH-YNB
a.a. en una sola colonia que se denominó GCP101.
Se disolvió Base de nitrógeno
Bacto-Yeast (6,7 g, fabricada por Difco) en agua
hasta hacer la cantidad total de 100 ml, y se mezclaron en una
relación 1:1:18 (vol) YBN 10X, que estaba esterilizado y filtrado,
glucosa al 20% que estaba esterilizada en un autoclave, y agua
esterilizada, y se usaron.
Se añadieron varios compuestos amínicos,
respectivamente, a un medio que contiene metanol y glicerol como
fuentes de carbono (Tabla 6), y se usaron como un medio para el
cultivo principal (pH 6,0).
Componente | Concentración (1/l) |
Metanol | 40 ml |
Glicerol | 1.000 mg |
Acetato amónico | 5.000 mg |
KH_{2} PO_{4} | 10.000 mg |
CaCl_{2} 2H_{2}O | 100 mg |
KCl | 2.000 mg |
NaCl | 100 mg |
MgSO_{4} 7H_{2}O | 2.000 mg |
ZnSO_{4} 7H_{2}O | 100 mg |
CuSO_{4} 5H_{2}O | 5 mg |
FeCl_{3} 6H_{2}O | 100 mg |
Biotina | 0,1 mg |
Vitamina B_{1} | 10 mg |
Vitamina B_{6} | 1 mg |
Ácido pantoténico de sodio | 10 mg |
Inositol | 50 mg |
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó un ml de un vial de glicerol al 20%
congelado y almacenado en 100 ml de caldo YNB, y se sometió el caldo
a cultivo en agitación a 30ºC durante 24 horas, en un matraz
Erlenmeyer de 300 ml equipado con tabi-
ques.
ques.
Después, se sometieron a recolección centrífuga
100 ml del precultivo, se suspendió en 10 ml de agua esterilizada.
Se inoculó la suspensión celular (0,5 ml) en 50 ml del cultivo
principal. El medio de cultivo (50 ml) se dispensó en cada uno de
los frascos Erlenmeyer equipados con tabiques, y se sometieron a
cultivo en agitación a 30ºC durante 120 horas a 125 rpm.
Se examinó el efecto de varios compuestos
amínicos en la coloración de la HSA mediante un método similar al de
los Ejemplos 1-4. Los resultados se resumen en la
Tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Inhibidor de la coloración | 350 nm/280 nm | 405 nm/280 nm | Cantidad | |
(Concentración % peso/vol) | de HSA* | |||
Referencia | 0,098 | 0,088 | 1 | |
(100) | (100) | |||
Ej. 6 | Aminoguanidina | 0,016 | 0,010 | 1 |
(0,6) | (16,3) | (11,4) | ||
Ej. 7 | N,N-dietiletilendiamina | 0,014 | 0,009 | 1 |
(0,6) | (14,3) | (10,2) | ||
Nota: * Expresada como un cociente tomando la cantidad de HSA en la Referencia como 1. |
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, la
coloración de la HSA expresada mediante ingeniería genética puede
ser suprimida desde un medio hasta un décimo de la de sin el
tratamiento para la supresión de la coloración. Además, la HSA
puede ser recuperada en altos rendimientos, y el tratamiento de la
invención no afecta a las propiedades inherentes de la HSA.
Puesto que el método de la presente invención
comprende la adición de un agente para suprimir la coloración de la
HSA durante el cultivo y/o la purificación, el método puede ser
llevado a cabo fácilmente y eficientemente.
Consecuentemente, la HSA tratada por el método
de la presente invención puede ser usada como un fármaco
clínicamente útil, como lo es la HSA originada del plasma.
Claims (5)
1. Un método para suprimir la coloración de la
albúmina sérica humana expresada mediante ingeniería genética, que
comprende el cultivo y/o la purificación en presencia de un
compuesto amínico seleccionado entre metilendiamina;
propilendiamina;
N,N-dialquil(C_{1-6})alquilendiaminas(C_{1-6});
guanidinas seleccionadas entre guanidina, aminoguanidina y
fenilguanidina; benzamidinas seleccionadas entre benzamidina y
p-aminobenzamidina; y aminoácidos básicos seleccionados entre
lisina y arginina, en una proporción de 0,1 a 1% peso/vol con
respecto al medio o a la fracción líquida que contiene la albúmina
sérica humana.
2. El método para suprimir la coloración de la
albúmina sérica humana de acuerdo con la reivindicación 1, en el que
las
N,N-dialquil(C_{1-6})alquilendiaminas(C_{1-6})
se seleccionan entre N,N-dimetiletilendiamina y
N,N-dietiletilendiamina.
3. El método para suprimir la coloración de la
albúmina sérica humana de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que el cultivo comprende cultivar, en un medio al que se ha añadido
un compuesto amínico como se define en la reivindicación 1, un
organismo hospedador productor de albúmina sérica humana preparado
por ingeniería genética.
4. El método para suprimir la coloración de la
albúmina sérica humana de acuerdo con la reivindicación 3, en el que
el organismo hospedador productor de albúmina sérica humana es una
levadura.
5. El método para suprimir la coloración de la
albúmina sérica humana de acuerdo con la reivindicación 4, en el que
la levadura se selecciona del género Saccharomyces y el
género Pichia.
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