BG63065B2 - Аналози на плурипотентен гранулоцитен колония-стимулиращ фактор - Google Patents

Description

Настоящото изобретение принадлежи най-общо към хематопоетичните растежни фактори и към полинуклеотиди, кодиращи такива фактори. Настоящата заявка по-точно принадлежи към плурипотентни гранулоцитни колониястимулиращи фактори на бозайници, по-точно плурипотентен гранулоцитен колония-стимулиращ фактор на човек (hpGCSF), негови фрагмени и полипептидни аналози и към кодиращи го полинуклеотиди.

Човешката кръвотворна система ( хематопоетична ) замества голямо разнообразие бели кръвни клетки (включително неутрофили, макрофаги и базофили/ мастоцити), червени кръвни клетки (еритроцити) и клетки, образуващи съсиреци (мегакариоцити/тромбоцити). Определя се, че хематопоетичната система на средностатистическия човек продуцира в границите на 4,5x10¹¹ гранулоцити и еритроцити всяка година, което е еквивалентно на годишно заместване на цялото телесно тегло. Dexter et al; BioEssays, 2, 154-158 (1985).

Счита се,че малки количества от някои хематопоетични растежни фактори отговарят за диференцирането на малко количество родителски “стволови клетки” в голям брой клетъчни линии, за огромната пролиферация на тези линии и за последната диференциация на зрели кръвни клетки от тези линии. Тъй като хематопоетичните растежни фактори присъстват в изключително малки количества, откриването и идентифицирането на тези фактори се основава на определен кръг изследвания, който все още само разграничава различните фактори на основата на ефектите на стимулиране върху куптурални клетки при изкуствени условия. В резултат на това, голям брой имена са измислени за обозначаване на много по-малък брой фактори. Като пример за получаваните грешки, термините IL-3, ВРА, multi-CSF, HCGF, MCGF u PSF всички са акроними₅за които се счита понастоящем, че се прилагат за единичен миши хематопоетичен растежен фактор. Metcalf, Science, 229, 16-22 (1985). Виж също Burgess, et al. J.Biol. Chem., 252, 1998-2003 (1977), Das, et al. Blood, 58, 630641 (1981) Ihle, et al., J.Immunol., 129, 2431 (1982), Nicola, etal., J.Biol. Chem 258, 9017 (1983), Metcalf et al., lot. J. Cancer, 30, 773 (1982), u Burgess et al. Int. J. Cancer, 26, 647 (1980), отнасящ се до различни миши растежни регулаторни гликопротеини.

Заявката за рекомбинантни генетични техники е внесла известен ред в този хаос. Например, получени са аминокиселинните и ДНК последователности на човешки еритропоетин, който стимулира продуцирането на еритроцити, (виж Lin, РСТ published Application No 85/02610, публикувана на 20.06.1985.) Рекомбинантни методи са били прилагани за изолиране на сДНК за човешки гранулоцит-макрофаг колониястимулиращ фактор. Виж Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (САЩ), 82, 4360-4364 (1985) u Wong, et al., Science, 228, 810814 (1985). Виж също Yokota, et al. proc. Natl. Acad. Sci. (САЩ), 81, 1070 (1984), Fung, et al., Nature, 307, 233 (1984) u Gough, et al, Natura, 309, 763 (1984) отнасящи се до клониране на миши гени, както и Kawasaki, et al., Science, 230, 291 (1985) отнасящи се до човешки M-CSF.

За човешки хематопоетичен растежен фактор, наречен човешки плурипотентен гранулоцитен колония-стимулиращ фактор (hpCSF) или плурипоетин е показано, че присъства в културалната среда на човешка клетъчна линия на карцином на пикочния мехур? означена като 5637 и депозирана при рестриктивни условия в American Type Culture Collection, Rockville, Md. Като A.T.C.C. номер на депозиране HTB-9. За hpCSF, пречистен от тази клетъчна линия,е докладвано, че стимулира пролиферацията и диференциацията на плурипотентни родителски клетки, което води до продуциране на всички големи типове клетки на кръвта при изследвания^ използващи човешки родителски клетки от костен мозък. Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (САЩ), 82, 1526-1530 (1985). Пречистването на hpCSF използва: (NH^SCM утаяване; анионообменна хроматография (DEAE целулоза, DE52); Гел филтрация (АсА54 колона); и С18 обратнофазова високо ефективна течна хроматография (ВЕТХ). Протеин, идентифициран като hpCSF, който се елуира при втория от два пика на активност при С18 обратнофазова ВЕХТ фракции, е докладван,че има молекулно тегло (MW) от 18,000,както е определено от натриев додецил сулфат (SDS) полиакриламидна гел електрофореза (PAGE), използваща оцветяване със сребро. По-рано е докладвано за hpCSF, че притежава изоелектрична точка от 5,5 [Welte et aL, J. Cell. Biochem., Supp 9A, 116 (1985)] u висока диференцираща активност за миша миеломоноцитна левкемична клетъчна линия WEHI-3B D⁺ [Welte, et al., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Gate, et al., ads., New Series, 28 (1985)]. Предварителните изследвания показват, че факторът, идентифициран като hpCSF^ има предимно гранулоцитна колония-стимулираща активност по време на първите седем дни при изследване на човешки CFU-GM.

Друг фактор, означен като човешки CSF-β, също е бил изолиран от човешка клетъчна линия 5637 от рак на пикочния мехур и е описан като влизащ в съревнование с миши ¹²⁵1-белязан гранулуцитен колония-стимулиращ фактор (GCSF) за свързване на WEHI-3B D⁺ клетки в доза-отговор отношение, идентично на това на небелязан миши G-CSF [Nicola, et al., Nature, 314, 625-628 (1985)]. Преди това е докладвано, че това доза-отговор отношение е единствено за небелязан миши G-CSF и не се притежава от такива фактори като M-CSF, GM-CSF, multi-CSF [Nicola, et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (USA), 81,3765-3769 (1984)]. CSF-β u G-CSF също са единствени сред CSF-ите по това,че споделят висока степен на способност да индуцират диференциация на WEHIЗВ D⁺ клетки Nicola, et al., Immunology Today , 5, 76-80 (1984). При високи концентрации G-CSF стимулира смесени гранулцит/макрофаг колония-стимулиращи клетки. [Nicola, et al., (1984) по-горе], което отговаря на предварителните резултати ? сочещи появата на гранулоцитни, моноцитни, смесени гранулоцитни/моноцитни и еозинофилни колонии (CSFU-GEMM) след 14 дни инкубиране на култури от човешки костен мозък с hpCSF. CSF-β също се описва като стимулиращ образуването на неутрофилни гранулоцитни колонии при изследвания, които използуват клетки от миши костен мозък, свойство,което е критерий за идентифициране на фактор като G-CSF. На основата на тези прилики човешки CSF-β се идентифицира като G-CSF (гранулоцитен колониястимулиращ фактор). Nicola et. al., Nature, 314, 625-628 (1985).

На основата на тяхните общи свойства става ясно, че човешки CSF-β от Nicola et al., по-горе, и hpCSF от Welte, et al., по-горе, са един и същ фактор, който може правилно да се посочи като човешки плурипотентен гранулоцитен колониястимулиращ фактор (hpG-CSF). Охарактеризирането и рекомбинантното продуциране на hpG-CSF е изключително желано с оглед на съобщената способност на миши G-CSF напълно да подтиска in vitro WEHI-3B D⁺ левкемична клетъчна популация при “почти нормални концентрации” и съобщената способност на свежи, инжектирани препарати от миши G-CSF да подтискат установените трансплантирани миелоидни левкемии при мишка. Metcalf, Science, 229, 16-22 (1985). Виж също Sachs, Scientific American, 284(1), 40-47 (1986).

В обхвата, в който hpG-CSF може да докаже,че е терапевтично значим и следователно има необходимост да бъде достъпен в количества за търговската мрежа, изолирането от клетъчни култури не е възможно да осигури адекватен изходен материал. Забележително е например, че изглежда съществуват ограничения срещу търговското използване на клетки от Човешка Туморна Банка, като човешка клетъчна линия от карцином на пикочен мехур 5637 (А.Т.С.С. НТВ9), която е докладвана във Welte et. al., (1985) по-горе, като естествен източник на hpCSF изолати.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Съгласно настоящото изобретение се предоставят ДНК последователности , кодиращи цял или част от hpG-CSF. Такива последователности могат да включват: инкорпориране на кодони “предпочитани” за експресия от избрани безгръбначни гостоприемници; предвиждането на сайтове за разцепване от рестрикционни ендонуклеазни ензими; и осигуряването на допълнителни първоначални, терминални или междинни ДНК последователности, което улеснява конструирането на бързо експресирани вектори. Настоящото изобретение предоставя също така ДНК последователности, кодиращи за микробна експресия на полипептидни аналози или производни на hpG-CSF, които се различават от естествено съществуващите в природата форми по идентичност или месторазположение на един или повече аминокиселинни остатъци (т.е. делеционни аналозисъдържащи по-малко от всички други остатъци определени за hpGCSF; заместени аналози, като [Ser¹⁷] hpG-CSF, при които един или повече определени остатъци се заместват с други остатъци; и аналози с прибавяне, при които един или повече аминокиселинни остатъци се прибавят към краен или среден участък на полипептида) и който споделя едно или повече свойства на естествено съществуващите в природата форми.

Новите ДНК последователности на изобретението включват последователности^ полезни за осигуряване на експресията в прокариотни или еукариотни клетки гостоприемници на полипептидни продукти^притежаващи поне част от първоначалната структурна конформация и едно или повече от биологичните свойства на естествено съществуващ в природата плурипотентен гранулоцитен колониястимулиращ фактор. Установено е, че ДНК последователностите на изобретението специфично включват : а) ДНК последователността _t посочена на фигура 2 и фигура 3 или тяхните комплементарни вериги; б) ДНК последователност която хибридизира (при условия на хибридизация, както са илюстрирани в настоящето или по-строги условия) към ДНК последователностите от фигура 2 или към тяхни фрагменти; ДНК последователност, която, поради разпадане на генетичния код, би хибридизирала към ДНК последователноста от фугура 2. Характерно, към точка б) се включват геномни ДНК последователности,кодиращи форми на алелни варианти на hpG-CSF и/или кодиращи плурипотентен гранулоцитен колония-стимулиращ фактор от други видове гръбначни. Характерно, към точка в) се включват произведени ДНК последователности, кодиращи hpG-CSF, фрагменти на hpG-CSF и аналози на hpG-CSF, чиито ДНК последователности могат да включват кодони, улесняващи транслацията * на информационна РНК в микробиални гостоприемници. ^Λ Такива произведени последователности лесно могат да се конструират съгласно методите на Alton, et al., PCT публикувана заявка WO 83/04053. '

В настоя/щото изобретение също се включват този клас полипептиди, кодирани от участъци на ДНК комплемент към top веригата на човешки сДНК или геномни ДНК последователности от фигура 2 или фигура 3 от настоящото, т.е. “комплементарни инвертирани протеини”,както е описано от Tramontano, et al., Nucleic Acids Res., 12,5049-5059 (1984).

Настоящото изобретение предоставя пречистени и изолирани полипептидни продукти, притежаващи част или цялата от първичната структурна конформация (т.е. непрекъсната последователност на аминокиселинни остатъци) и едно или повече от биологичните свойства (например, имунологични свойства и in vitro биологична активност) и физични свойства (например молекулно тегло) на естествено съществуващите в природата hpG-CSF включително техни алелни варианти. Тези полипептиди също така се характеризират с това, че са продукт на химични процедури на синтез или на прокариотна или еукариотна експресия в гостоприемник (например от бактерии, дрожди, висши растения, насекоми и клетъчни култури от гръбначни) на екзогенни ДНК последователности,получени чрез геномно или сДНК клониране или чрез генен синтез. Продуктите на типични дрожди (например, Saccharomyces cerevisiae) или прокариотни [Escherichia coli (Е. сой)] клетки гостоприемници не са в асоциация с които и да са протеини от бозайници. Продуктите от микробиална експресия в клетки на гръбначни (например, бозайници (не хора) и птици) не са асоциирани с човешки протеини. Според използвания гостоприемник полипептидите на изобретението могат да са гликолизирани с въглехидрати от бозайници или други еукариотни въглехидрати или могат да не са гликозилирани. Полипептидите на изобретението също така могат да включват един първоначален метионинов аминокиселинен остатък (в позиция -1).

Изобретението включва също така фармацевтични състави , съдържащи ефективно количество полипептидни продукти от изобретението заедно с подходящ разтворител, адюванти и /или носители_;полезни в hpG-CSF терапията.

Полипептидните продукти на изобретението могат да бъдат “белязани” чрез асоциирани с откриваеми маркерни вещества ( например, изотопно белязани с ¹²⁵i)_y за да се предоставят реагенти, полезни при откриването на човешки hpG-CSF в твърди тъкани и течни проби, като кръв или урина.

ДНК продуктите на изобретението могат също да се бележат с откриваеми маркери (като радиомаркери (изотопни) и неизотопни макери, като биотин) и да се използуват при процесите на ДНК хибридизиране, за да се локализира позицията на гена на човешкия hpG-CSF и/или позицията на което и да е свързано генно семейство в хромозомната карта. Те могат, също така, да се използуват за идентифициране на човешки hpG-CSF генни нарушения на ДНК ниво и да се използуват като генни маркери за идентифициране на съседните гени и тяхния ред.

Полипептидните продукти на настоящото изобретение могат да са полезни самостоятелно или в комбинация с други хематопоетични фактори или лекарствени средства при лечението на хематопоетични нарушения като апластична * анемия. Те могат също така, да са полезни за лечение на хематопоетичен дефицит? получен в следствие на хемотерапия или на радиационна терапия. Успехът на трансплантирането на костен мозък например, може да се засили чрез прилагане на hpG-CSF. Оздравителният процес при лечение на рани от изгаряне и лечението на бактериална инфекция също може да се възползува от прилагането на hpG-CSF. Допълнително, hpG-CSF може също да е полезен при лечението на левкемия^ основаваща се на съобщена способност за диференциране на левкемийните клетки. Welte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1526-1530 (1985) u Sachs, no-rope.

Многобройни аспекти и предимства на изобретението ще станат явни за специалистите в областа след разглеждане на следващото подробно описание, което предоставя илюстративен материал за практическото приложение на изобретението в предпочетения понастоящем вариант за изпълнение на изобретението.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1 е частична рестрикционна ендонуклеазна карта на hpG-CSF гена, придружена от стрелки, обозначаващи използуваната стратегия за секвениране, за получаване на геномната последователност.

Фигури 2 до 10 представляват ДНК последователности, съгласно изобретението.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съгласно настоящото изобретение са изолирани и охарактеризирани ДНК последователностите, кодиращи част или цялата полепептидна последователност на hpG-CSF.

Следващите примери са предоставени за илюстриране на изобретението и по-специално са насочени към процедурите, провеждани преди идентифицирането на сДНК на hpG-CSF и на геномните клонове, към процедури,водещи до такова идентифициране и до секвенирането, развитието на експресионните системи, основаващи се на сДНК, геномни и произведени гени и проверката на експресията на hpG-CSF и аналозите му при такива системи.

По-специално, пример 1 се отнася до аминокиселинна последователност на hpG-CSF. Пример 2 се отнася до изготвянето на сДНК библиотека за скрининг за хибридизация на колонии,. Пример 3 се отнася до конструирането на хибридизационни проби. Пример 4 се отнася до информация за хибридизационен скрининг, идентифициране на положителни проби, НК секвениране на положителен сДНК клон и генериране на полипептидна първична структурна конформция (аминокиселинна последовтелност). Пример 5 се отнася до идентифициране и секвениране на геномен клон, кодиращ hpG-CSF. Пример 6 се отнася до конструирането на производствен ген,кодиращ hpG-CSF, при което се използуват за предпочитане кодони на Е. coli.

Пример 7 се отнася до процедури за конструиране на Е. coli трансформационен вектор, включващ hpG-CSF, кодиращ ДНК, ползата от вектора при експресия на hpG-CSF в прокариоти, и до анализ на свойствата на рекомбинантните продукти на изобретението. Пример 8 се отнася до процедури за генериране на аналози на hpG-CSF, при което цистеинови остатъци се заместват от други подходящи аминокиселинни остатъци чрез средствата на мутагенеза, осъществен върху ДНК кодираща hpG-CSF. Пример 9 се отнася до процедури за конструиране на вектор/ включващ hpG-CSF аналог-кодиращ ДНК_тпроизлизаща от положителен сДНК клон, използуването на вектора за трансфектиране на COS-1 клетки, и култивирането на трансфектираните клетки. Пример 10 се отнася до физичните и биологични свойства или до рекомбинантните полипептидни продукти на изобретението.

ПРИМЕР 1, (А) Секвениране на материал, предоставен от методи в литературата

Проба (3-4 цд, 85-90% чист SDS, оцветена със сребро PAGE) на hpG-CSF се получава от Sloan Kettering Institute,

New York, N.Y., както е изолиран и пречистен съгласно Welte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1526-1530 (1985).

N-крайната аминокиселинна последователност на тази проба на hpG-CSF се определя в изпълнение # 1 чрез микросеквенционен анализ при използване на АВ407А газо -фазов секвенатор (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) за доставяне на информация за последователности, посочена в Таблица 1 по-долу. В таблици 1 - 4 се използва еднобуквеният код, “X” означава остатък? който не е определен недвусмислено и остатъците в скоби са определени само алтернативно или временно.

Таблица 1 ,

5 10 15

K-P-L-G-P-A-S-K-L-K-Q - (G,V,S) -G-L-X-X-X

При всеки цикъл на изпълнението присъства висок фон^ за което резултатите са представени в таблица 1, означавайки, че резултатите от пробата имат много замърсяващи съставки, вероятно под формата на химични остатъци от пречистването. Последователността се запазва само за използване за сравнение.

При изпълнение # 2 втора проба (5-6 р.д, ~ 95% чистота) се получава от Sloan Kettering както в изпълнение # 1 и процедурата за секвениране се изпълнява както в изпълнение # 1. Тази проба се изпълнява от същата партида материал, използван за генериране на фигура 4 от Welte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1526-1530 (1985). Резултатите са посочени в таблица 2.

Таблица 2 1 5 10 15 20

T-P-L-G-P-A-S-(S)-L-P-Qx^(s)- M_(M) ^(L) -X-K-(R)-X-X-(R)-(L)-X

Въпреки че са идентифицирани повече остатъци, изпълнение # 2 не доставя достатъчно дълга, недвусмислена последователност, от която биха могли да се конструират разумен брой проби за търсене на hpG-CSF ДНК. Бе пресметнато, че биха били необходими най-малко 1536 проби, за да се направи опит да се изолира сДНК на основата на последователността от таблица 2. Отново се предполага, че проблемът се състои в онечиствания в пробата.

В съответствие, трета проба (3-5 цд, ~ 40% чистота) се получава от Sloan Kettering както по-горе. Този препарат се подлага на електроблокинг след разделяне чрез SDS-PAGE в опит за последващо пречистване. Секвенционният анализ на тази проба не дава никакви данни.

(В) Секвениране на материали, доставени от подобрени методи

С цел да се получи достатъчно количество чист матетриал за осъществяване на подходящ окончателен анализ на аминокиселинната последователност, клетки от клетъчна линия от карцином на пикочния мехур 5637 (субклон 1А6)_?продуцирани от Sloan Kettering,са получени от Dr. Е. Platzer. Първоначално клетките се култивират в Iscove’s среда (GIBCO, Grand Island, N.Y.) в колби до сливане. Когато се слеят, кутурите се обработват с трипсин и се посяват във ролерни бутилки (1½ колби/бутилка), всяка съдържаща 25 ml предварително кондиционирана Iscove’s среда под 5% СО₂. Клетките се култивират цяла нощ при 37°С, при 0,3 гргп (оборота в минута).

Cytodex-1 перли (Pharmacia, Uppsala, Sweden) се промиват и стерилизират при използване на следните процедури. Осем грама перли се поставят в бутилка и се прибавят 400 ml PBS. След като се оставят перлите да се утаят, PBS се извежда, перлите се промиват в PBS и се прибавя свеж PBS. Перлите се автоклавират 15 минути. Преди използване перлите се промиват в Iscove’s среда плюс 10% зародишен телешки серум (FCS) преди прибавяне на свежа среда плюс 10% FCS за получаване на обработени перли.

След отстраняване от всяка ролерна бутилка на всичко освен 30 ml от средата, към бутилките се прибавят 30 ml свежа среда плюс 10% FCS и 40 ml третирани перли. Бутилките се насищат с 5% СО₂ и всички мехурчета се отстраняват чрез изтегляне. Бутилките се поставят във ролерни рамки при 3 грт в продължение на Уа час_/Г като скоростта се намалява на 0,3 грт. След три часа една допълнителна колба се обработва с трипсин и се добавя към всяка въртяща се бутилка₇съдържаща перли.

При 40% до 50% сливане на културите, ролерните бутилки се промиват с 50 ml PBS и се въртят 10 минути преди да се отстрани PBS. Клетките се култивират 48 часа в среда А [Iscove’s среда,съсдържаща 0,2% FCS, 10’⁸ М хидрокортизон, 2 тМ глутамин, 100 единици/ml пеницилин и 100 pg/ml стрептомицин] . След това супернатантата на културата се събира чрез центрофугиране при 3000 грт за 15 минути и се съхранява при -70°С. Културите се допълват със свежа среда А, съдържаща 10% FCS и се култивират 48 часа. След отстраняването на средата клетките се промиват с PBS_?Kaiao по-горе,и се култивират 48 часа в среда А. Супернатантата отново се събира и се третира,както е описано по-горе.

Приблизително 30 литра Среда,кондиционирана с 1А6 клеткисе концентрират до приблизително 2 литра върху Millipore Pellicon единица^снабдена с 2 касети,притежаващи 10000 M.W. прекъсване при скорост на филтриране от приблизително 200 ml/min и при скорост на задържане от приблизително 1000 ml/min. Концентратът се диафилтрира с приблизително 10 литра 50 mM Tris (pH 7,8) при използуване на същия апарат и при същата скорост на потока. Диафилтрираният концентрат се зарежда на колона, уравновесена с 50 гпМ Tris (pH 7,8) с 1 литър DE целулоза при 40 ml/min. След зареждането колоната се промива при същата скорост с1 литър 50 mM Tris (pH 7,8), а след това-с 2 литра 50 mM Tris (pH 7,8) с 50 mM NaCI. След това колоната се елуира на порции със шест еднснпитрови разтвори на 50 ml Tris (pH 7,5), съдържащи следните концентрации на NaCI : 75mM; 100 тМ; 125 тМ; 50 тМ; 200 mM; и 300 тМ. Събират се фракции (50 ml), като активните фракции се обединяват и се концентрират до 65 ml върху Amicon ултрафилтрационна клетъчна единица с разбъркване, снабдена с YM5 мембрана. Този концентрат се зарежда върху 2-литрова АсА54 гелфилтрационна колона уравновесена в PBS. Колоната се пуска при 80 ml/час и се събират Ю-ml фракции. Активните фракции се обединяват и се зареждат директно върху С4 колона за Високо Ефективна Течна Хроматография (ВЕТХ).

\Ί

Проби с обем в границите от 125 ml до 850 ml и съдържщи 1-8 mg протеин, приблизително 10% от който е hpG-CSF, се зареждат върху колоната при скорост на потока от 1 ml до 4 ml на минута. След зареждането и едно първоначално промиване с 0,1 М амониев ацетат (pH 6,0-7,0) в 80% 2-пропанол при скорост на потока от 1 ml/min, едномилилитрови фракции се събират и се следят за протеини при 220 nm и 280 nm.

Като резултат от пречистването фракциите,съдържащи hpG-CSF? ясно се разделят (при фракции 72 и 73 от 80) от останалите фракции, съдържащи протеини. hpG-CSF се изолира (150 - ЗООрд) с чистота от приблизително 85±5% и с добив от приблизително 50%. От този пречистен материал 9 pg се използуват при изпълнение # 4, един аминокиселинен анализ, при който протеиновата проба се полага върху активиран с TFA диск от фибростъкло без полибрен. Секвенционният анализ се провежда с AB 470А секвенатор, съгласно методите на Hewick, et al.,J. Biol. Chem., 256, 79907997 (1981) and Lai, Anal. Chim. Acta, 163, 243-248 (1984). Резултатите от изпълнение #4 са изведени в таблица 3.

Таблица 3,

510

Thr - Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu - Pro 1520

Gin - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys - (Lys) - Leu - (Glu) - Glu 2530

Vai-Arg-Lys- lie - (Gin) - Gly - Vai - Gly - Ala - AlaLeu-X - X При изпълнение #4, след 31-вия цикъл (съответстващ на остатък 31 в таблица 3) повече не се получава някаква значима информация. С цел да се получи по-дълга недвусмислена последователност, при изпълнение #5, 14 p.g hpGCSF, пречистен от кондиционираната среда, се редуцирате 10 μ! β-меркаптоетанол в продължение на 1 час при 45°С, след което се изсушават под вакуум. Протеиновият остатък след това се разтваря в 5% мравчена киселина преди да се приложи върху поАибрениран диск от фибростъкло. Секвенционният анализ се провежда както при изпълнение #4, по-горе. Резултатите от изпълнение #5 са показани на таблица 4.

Таблица 4,

510

Thr - Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu - Pro 1520

Gin - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys - Cys - Leu - Giu - Gin 2530

Vai - Arg - Lys - lie - Gin - Gly - Asp - Gly - Ala - Ala 3540

Leu - Gin - Phe - Lys - Leu - Gly - Ala - Thr - Tyr - Lys 45

Vai - Phe - Ser - Thr - (Arg) - (Phe) - (Met) - X

Аминокиселинната последователност, посочена в таблица 4, е достатъчно дълга (44 остатъка) и недвусмислена, за да се конструират проби за получаване на сДНК на hpGCSF, както е описано по-горе.

ПРИМЕР 2.

Сред стандартните процедури за изолиране на сДНК последователности, представляващи интерес, е изготвянето на произлизаща от плазмид сДНК “библиотека” получена чрез обратна транскрипция на иРНК изобилстваща в донорни клетки, подбрани въз основа на тяхната експресия на гена мишена. Когато значителни участъци от аминокиселинната последователност са известни, белязани, едноверижни последователности на ДНК проба? дублиращи последователност, за която се предполага, че присъства в сДНК “мишена”, може да се използва в ДНК/ДНК процедури на хибридизация,осъществени върху кпонирани копия на сДНК, които са били денатурирани до едноверижна форма. Weissman, et al., U.S.Pat. No. 4,394,443; Wallace, et al., Nucleic Acids Res., 6, 3543-3557 (1979), u Reyes, et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA), 79, 3270-3274 (1982), u Jaye, et al., Nucleic Acids Res., 11, 2325-2335 (1983). Виж също, U.S. Pat. No. 4,358,535 Ha Falkow, et al., във връзка c ДНК/ДНК процедури на хибридизация при поставянето на диагноза; u Davis, et al., “A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Narbor, N.Y. (1980) at pp. 55-58 I 174-176, отнасящо се до хибридизационни техники на колонии и плаки.

Общата РНК се екстрахира от приблизително един грам клетки от клетъчна линия от карцином на пикочния мехур 5637 (1А6) при използване на гуанидин тиоцианатната процедура за количествено изолиране на интактна РНК. [Chigwin, et al., Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)].

Стерилният воден разтвор на РНК съдържа обща РНК от IA6 клетките. За получаване единствено на информационната РНК от разтворената обща РНК, разтворът се пропуска през колона?съдържаща олигодезокситимидилирани [олиго(бТ)] (Collaborative Reseach, Inc., Waltham, Mass. PolyAdenylated (poly-A⁺) опашки, характерни за прилепването на информационната ДНК към колоната, докато рибозомалната РНК се елуира. В резултат на тази процедура се изолират приблизително 90 pg полиаденилирана информационна РНК (poly-A⁺ иРНК). Изолираната poly-A⁺ информационна РНК предварително се обработва с метилживачен хидроксид (Alpha Ventron, Danvers, Mass.) при крайна концентрация от 4 тМ за 5 минути при стайна температура преди използване в сДНК реакция. Третирането с метилживачен хидроксид денатурира взаимодействието на информационната РНК, и с двете,както със себе си, така и със замърсяващите молекули, които инхибират транслацията. Payvar, et al., J.Biol.Chem., 258, 7636-7642(1979).

Съгласно Okayama procedure [Okayama, et al., Molecular & Cellular Biology, 2, 161-170 (1982)], се изготвя сДНК банка при използване на иРНК, получена от IA6 клетки. сДНК се трансформират след това чрез инкубиране в микроорганизъм гостоприемник Е. coli К-12 щам HBW1 за амплифициране.

ПРИМЕР 3.

Хибридизационни проби, проектирани на основата на hpG-CSF амино терминална последователност от таблица 4, се състоят от комплект от 24 олигонуклеотида, всеки с дължина от 23 бази и съдържащ три инозинови остатъка. Олигонуклеотидите на пробите се произвеждат съгласно процедурата на Caruthes, et al., Genetic Engineering, 4, 1-17 (1982) и се бележат с γ-³²Ρ ATP чрез обработване с полинуклеутидна киназа. Олигунуклеотидите на пробите, съответстващи на информационната РНК за остатъци 23 - 30 от последователността от таблица 4 са илюстрирани в таблица 5.

_______________________________Таблица 5 hpG-CSF Проби

5’ 3’

A Т G Т

GO IGC ICC TC ICC TG AT TT

G C A C

T

Определянето на неутралност към I’s се основава на публикуваната работа на Takahashi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82,1931-1935 (1985) u Ohtsuka, et al., J.Biol. Chem., 260, 2605-2608 (1985). Въпреки това инозинът може да има дестабилизиращо действие, ако образува базова двойка с G или Т. В Takahashi, et al., инозините могат да се явят като притежаващи неутрален ефект, тъй като се усредня ват като група с близка неутралност (например, три образуващи двойки за предпочитане със С и две непредпочитани за образуване на двойки с Т).

За тестване на ефекта от притежаване на I’s базова двойка с G’s се проектират контролни експерименти при изоползване на N-myc генна последователност и клон. Последователностите,взети от N-myc гена_?имат същото общо съдържание на G и С при първите две позиции на всеки кодон, както бе предписано от hpG-CSF пробите. Следователно Nтус тестовите проби са със същата дължина, съдържат I’s в относително същата позиция и притежават потенциално същата средна Тт (62-66°С, без да се взимат предвид 3 или 4 инозинови остатъци) както hpG-CSF пробите.

Два комплекта N-myc тестови проби се конструират съгласно процедурата на Caruthers et al., по-горе. Комплект I, както е илюстриран в таблица 6, включва: 1. 23-мер с перфектно съвпадане; 2. в който три трети позиции C’s са заместени с I’s, като се генерира възможно най-лошият случай за прибавяне на I’s; и 3. в който четири трети позиции C’s са заместени с I’s. Вторият комплект тестови проби се проектира да представлява по-случайно разпределение на инозиновите базови двойки, което трябва да даде един общ неутрален ефект на свързване на базовите двойки. Комплект 2,както е илюстрирано в таблица б^ключва : 4. съдържащ две l’s/ойто ще образува базова двойка с C’s и една с G; и 5., идентичен на 4,с прибавяне на още една I: G базова двойка.

Таблица 6>

N - тус тестови проби

1. 5 сас	ААС	TAT	GCC	GCC	GCC	TCC	co3’
2. 5’САС	ААС	TAT	GCI	GCC	CCI	TCI	cc3'
3. 5'cai	ААС	TAT	GCI	GCC	CCI	TCI	cc3'
4. 5 ААС	GAG	CTG	TGI	GGC	AGI	CCI	GC 3
5. 5 AAI	GAG	CTG	TGI	GGC	AG I	CCI	GC 3

Пет репликационни филтъра,съдържащи N - тус ДНК последователности и ДНК последователности от пилешки растежен хормон (като отрицателна контрола),се изпичат на вакуумна фурна в продължение на 2 часа при 80°С преди хобридизацията. Всички филтри се хибридизират? както е описано в пример 4 за hpG-CSF пробите^ с изключение на това, че периодьтна хибридизация е само 6 часа. Филтрите се промиват три пъти да стайна температура, след това веднъж при 45°С за 10 минути всеки. Филтрите се следят с Гайгеров брояч.

Филтърът, представляващ N-myc проба 3_?дава много тих сигнал по отношение на останалите 4 филтъра с проби и повече не се промива. След 10 минути промиване на 50°С Гайгеровият брояч дава следния процентен сигнал, като проба 1 се нормализира до 100% ; проба 2,20%; проба 3 (45°С), 2%; проба 4, 92%; и проба 5, 75%. След промиване при 55°С процентите стават : проба 2, 16%; проба 4, 100%; и проба 5, 80%. Крайно промиване при 60°С дава следните проценти : проба 2,1,6%; проба 4, 90%; и проба 5, 70%.

Следователно, в присъс твието на 3 I’s, както в проби 2 и 4, се наблюдава до 60 пъти разлика в сигнала спрямо теоритичната Tm (I’s не се включва в сметките), се доближава [на основата на най-лошия случай I на образуване на базови двойки (проба 2) и относително неутрален I случай на образуване на базови двойки (проба 4)].

Получената стандартизирана информация чрез N-myc тест хибридизации се използва при промиването и онагледяването на hpG-CSF хибридизацията, както е посочено по-долу за проверка на степента на доверие,при която резултатите под строгото промиване могат да бъдат приети.

ПРИМЕР 4,

Съгласно процедурата на Hanahn, et al., J.Mol. Biol., 166, 557-580 (1983) бактерии,съдържащи рекомбинанти със сДНК инсерти, както са получени в пример 2,се разпръскват върху 24 нитроцелулозни филтри (Millipore, Betford, Mass.\ положени върху агарови блюда. След това блюдата се инкубират до установяване на приблизително 150000 колонии, които репликативно се посяват на други 24 нитроцелулозни филтъра . Репликите се инкубират до появата на отделни колонии. Бактериите върху филтрите се лизират върху листове Watman 3 ММ хартия., слабо наситена с натриев хидроксид (0,5М) за 10 минути, след което се накапват с Tris (1 М) за 2 минути, следван от накапване с Tris (0,5 М) съдържащ NaCI (1,5 М) за 10 минути. Когато филтрите са почти сухи, те се изпичат в продължение на 2 часа при 80°С във вакуумна фурна преди хибридизацията на нуклеиновата киселина. [Wahl, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76, 3683-3687 (1979)]; u Maniatis, et al., Cell, 81, 163-182 (1976).

Филтрите предварително се хибридизират 2 часа при 65°С във 750 ml 10х Denhardt’s, 0,2% SDS и 6х SSC. Филтрите се промиват в 6xSSC, след което четири се поставят в торбичка и се хибридизират 14 часа в 6xSSC и 10х Denhardt’s. Има приблизително по 15 ml разтвор на торбичка,съдържаща 50x10⁶ срт проби (олигонуклеутиди) белязани с ³²Р.

След хибридизирането филтрите се промиват три пъти в 6xSSC (1 литър/промиване) при стайна температура за 10 минути всеки. След това филтрите се промиват два пъти при 45°С за 15 минути всеки, веднъж при 50°С за 15 минути и веднъж при 55°С за 15 минути при използване на 1-литрови обеми от 6xSSC. Филтрите се авторадиографират 2 часа при -70°С при използване на усилващ екран и Kodak XAR-2 филм. На този авторадиограф има 40-50 открити позитивни сигнала, включително 5 много силни сигнала. Полетата, включващи петте най-силни сигнала и допълнителни пет позитивни, се остъргват от главните блюда и отново се посяват за вторично скриниране при използване на същата смес за проби, при същите условия. Процедурата по промиването се различава по това, че промиванията при висока температура се състоят от две при 55°С за 15 минути всяко, след което едно при 60°С за 15 минути. На базата на изследването на N-myc проба от пример 3 последната температура на промиване при второто скриниране се повишава, тъй като температурата на топене на агрегата на 24-те 23-мери е 60-68°С, подобна на тази на Nтус пробите. Едва след второто промиване при55°С филтрите се овлажняват и се прави авторадиография. Сравняването на тази авторадиография с втората авторадиография, проведена за подобен период от време след последното промиване при 60°С показва, че само 10 клона от тестваните не страдат от значителна загуба на сигнал при промиване от 55-60°С. За тези два клона по-късно бе доказано, че са с почти идентична дължина и модели на рестрикционна ендонуклеаза. За скрининга се подбира един клон,назован Рро2.

Секвенирането на рекомбинантния сДНК клон на hpGCSF, Рро2, получен по горните процедури,се извършва чрез дидезокси метода на Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 74, 5463-5467 (1977). Едноверижният ДНК фаг M-13 се използва като вектор за клониране за доставяне на едноверижни ДНК матрици от двоиноверижни сДНК клонове. Методът на Sanger, et al., извежда последователността,както е показана на фигура 2,придружена от нейната аминокиселинна транслация и комплементарна верига в кодиращата област на полипептида. За отбелязване са следните характеристики от фигура 2. При 5’ края на последователноста. са отбелязани базисъответстващи на тези от поли G сДНК линкера. След това се срещат около 5 бази (означени с “N”), чиято последователност не може точно и недвусмислено да се определи по метода на Sanger, et al., поради предшестващите многобройни G. След това последователността показва серии от 12 кодона, кодиращи участък от предполагаема лидерна последователност за полипептида. На основата на съответствието на аминотерминалната последователност на естествени изолати на hpCSF, описана в пример 1, първоначалният треонинов остатък на предполагаемата “зряла” форма на hpG-CSF се означава с +1. След това се оказва, че зрелият hpG-CSF включва 174 остатъка, както е означено. След “stop” кодона (ОР кодона, TGA) има приблизително 856 бази от една нетранслирана 3’ последователност и многобройни A’s от поли А “опашката”. Уникални HgiAi, и Apal сайтове за разпознаване на рестрикционни ендонуклеази, така както и два Stul сайта (описани по-долу с оглед конструирането на прокариотна и еукариотна системи) също са посочени във фигура 2. В следствие на липсата на аспергинови остатъци в полипептида няма явни сайтове за N-гликозилиране. Подчертаните 6 бази близо до края на 3’ нетранслираната последователност представляват потенциален сайт за полиаденилиране.

За отбелязване е, че всеки от два допълнителни сДНК клона, идентифицирани чрез процедурите на хибридизация, описани по-горе, от общо 450 000 клона не успяват да включат ДНК,кодираща цялата лидерна последователност от сайта за иницииране на транскрипцията напред. Всъщност всичките три hpG-CSF клона, завършващи в 5’ областта точно при същия сайт, посочващ, че вторичната структура на иРНК строго транскрибира задните сДНК образувания отвъд този сайт. Следователно, от практична гледна точка, скрининпзгна сДНК експресията, както е описан от Okayama et al., Mol. and Cell. Biol., 3, 280-289 (1983) и използван всъщност за изолиране на GM-CSF във Wong, et al., Science, 228, 810-814 (1985) не може направо да се приложи за изолиране на hpCSF ДНК, тъй като такива системи за изолиране обикновенно се базират на присъствието на сДНК транскрипт в пълна дължина в изследваните клонове.

Горната последователност не е точно чувствителна на подсигуряване на директна еспресия на hpG-CSF в микробиален гостоприемник. За подсигуряване на такава експресия, кодиращата област на hpG-CSF,трябва да бъде снабдена с ATG кодон за иницииране и последователността трябва да бъде инсерирана във вектор за трансформиране в сайт под контрола на подходяща промоторна/регулаторна ДНК последователност.

ПРИМЕР 5.

В този пример сДНК, кодираща hpG-CSF, както е изолирана в предходния пример,се използва за скриниране на геномен клон. Геномна библиотека на ламбда фага на човешки зародишен черен дроб [изготвена съгласно процедурата на Lawn, et al., Cell. 15, 1157-1174 (1978) и получен от Т. Maniatis] се скринира при използване на nickтранслирана проба, състояща се от два hpG-CSF сДНК фрагмента, изолирана чрез смилане с HgiAl u Stul (HgiAl до Stul, 649 bp; Stul до Stul, 639 bp). Общо около 500 000 фага се посяват върху 12 (15 cm) петриеви блюда и плаките се отделят и хибридизират с пробата при използване на процедурата на Benton/Davison [Benton et al., Science, 196, 180 (1977)]. Наблюдават се общо 12 позитивни клона. Три клона (1-3), даващи най-силните сигнали при авторадиография при второ скриниране.се култивират в 1-но литрови култури и се картират чрез смилане с рестрикционен ензим и Southern blotting при използване на белязан с изотоп 24-мер олигонуклеотид (обработен с киназа с γ-³²Ρ ATP) 5OTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3’. Резултатите от картирането показват, че изолати 1 и 3 са идентични, а 2 съдържа 2000 допълнителни бази 5’ към hpG-CSF гена. Поради това клон 2 се използва за последващо охарактеризиране. ДНК от клон 2 се смила с R1 за освобождаване на фрагмент от 850 Ьр, съдържащ hpG-CSF, който след това се субклонира в pBR322 с последващо картиране чрез смилане с рестрикционни ендонуклеази, Southern blotting М13 субклониране и секвениране. Получената последователност е посочената на фигура 3.

Подробно е показана на фигура 1 рестрикционна ендонуклеазна карта (приблизително 3,4 КЬ) на геномна ДНК, съдържаща hpG-CSF гена. Рестрикционните ендонуклеази, показани на фигура 1, са: Ncol, N; Pstl, Р; BanHI, В; Apal, A;

Xhol, X ; u Kpn, K. Стрелките под картата показват стратегията на секв£ниране^ използвана за получаване на * геномна последователност. Областите^оградени в правоъгълници,са откритите в сДНК клона, като правоъгълниците с пунктир представляват последователност, неприсъстваща в сДНК клона, но идентифицирана чрез изследване на иРНК петна. Идентифицирането на кодиращи последователности, предложени за екзон 1,се провежда чрез Northern blot анализ. 24-мерна олигонуклеотидна проба 5’CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3’, заемаща предсказаните места на свързване за екзони 1 и 2_; се хибридизира с hpG-CSF и РНК в Northern blot формат. Полученото петно показва иРНК със същия размер (~1650 Ьр),като установения с екзон 2 олигонуклеутидна проба. Тези данни, комбинирани със способността на pSVGM-Ppol вектора да провежда експресията на hpG-CSF (пример 9) при използване на Met кодон за иницииране, посочен на фигура 3, дефинира кодиращите последователности, включени в екзон 1. Екзони 2 -5 се дефинират чрез кодиращите последователности, получени в сДНК клона (Рро2) на hpG-CSF гена (фигура 3).

ПРИМЕР 6.

Този пример се отнася до приготвянето на произведен ген,кодиращ hpG-CSF, и включващ предпочитани кодони на Е. coli.

Накратко използваният протокол най-общо е като описаният в РСТ публикация No W083/04053 в съпритежание на Alton, et al., който е включен в настоящото за справка. Гените се проектират за първоначално събиране на съставните олигонуклеотиди в многобройни дуплекси, които на свой ред се събират в три отделни секции. Тези секции се проектират за бързо амплифициране и след отстраняване от системата за амплифициране, могат да се сглобят по секвенции или чрез многобройно лигиране на фрагменти в подходящ експресионен вектор.

Конструирането на секции I, II u III е илюстрирано в таблици 7 до 9 и фигури 4 до 6. При конструирането на секция I, както е илюстрирано в таблица 7 и на фигура 4, олигонуклеотиди 1-14 се сглобяват в 7 дуплекса (1 и 8; 2 и 9; 3 и 10; 4 и 11; 5 и 12; 6 и 13; и 7 и 14). Седемте дуплекса след това се лигират, за да образуват секция I, както е показано на фигура 4. Може да се отбележи също на фигура 4, че секция I включва в посока upstream един Xbal леплив край, а в посока downstream BamHI леплив край, използвани за лигиране към амплификационни и експресионни вектори и за лигиране към секция II.

Таблица 7.

EchpG-CSFDNA - СЕКЦИЯ I

CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAA1

TAATGACTCCATTAGGTCCTGCTTCTTCT2

CTGCCGCAAAGCTTTCTGCTGCTGAAATGTCTGG 3

AACAGGTTCGTAAAATCCAGGGTGACGGT4 (продължение)

GCTGCACTGCAAGAAAAACTGTGCGCTA5

CTTACAAACTGTGCCATCCGGAAGAGC6

TGGTACTGCTGGGTCATTCTCTTGG7

CATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT8

GCAGAGAAGAAGCAGGACCTAATGGAGT9

TGTTCCAGACATTTCAGCAGAAAGCTTTGCG10

CAGCACCGTCACCCTGGATTTTACGAACC11

TAAGTAGCGCACAGTTTTTCTTGCAGTG12

ACCAGCTCTTCCGGATGGCACAGTTTG13

GATCCCAAGAGAATGACCCAGAAGT14

Както е показано на таблица 8 и фигура 5, при конструирането на секция II, олигонуклеотиди 15-30 се сглобяват в осем дуплекса (15 и 23; 16 и 24; 17 и 25; 18 и 26; 19 и 27; 20 и 28; 21 и 29 и 22 и 30). Тези осем дуплекса след това се лигират?за да образуват секция ll_?както е показано на фигура 5. Както е показано след това на фигура Секция II включва в посока upstream един BamHI леплив край и в посока downstream EcoRI леплив край, използвани за лигиране към амплификационен вектор и за лигиране към секция I. Близо до нейния downstream край секция II включва също така downstream Sstl сайт, използван при евентуално лигиране на секция II и III.

Таблица 8.

EchpG-CSFDNA - СЕКЦИЯ II

GATCCCGTGGGCTCCGCTGTCTTCT15

TGTCCATCTCAAGCTCTTCAGCTGGC16

TGGTTGTCTGTCTCAACTGCATTCTGGT17

CTGTTCCTGTATATCAGGGTCTTCTG18

CAAGCTCTGGAAGGTATCTCTCCGGA19

ACTGGGTCCGACTCTGGACACTCTGCA20

GCTAGATGTAGCTGACTTTGCTACTACT21

ATTTGGCAACAGATGGAAGAGCTCAAAG22

GACAAGAAGACAGCGGAGCCCACGG23

ACCAGCCAGCTGAAGAGCTTGAGATG24 (продължение)

ACAGACCAGAATGCAGTTGAGACAGACA25

CTTGCAGAAGACCCTGATACAGGA26

CAGTTCCGGAGAGATACCTTCCAGAG27

TAGCTGCAGAGTGTCCAGAGTCGGACC28

AAATAGTAGTAGCAAAGTCAGCTACATC29

AATTCTTTGAGCTCTTCCATCTGTTGCC30

Последно, секция III се конструира,както е показано на таблица 9 и фигура 6. За тази конструкция олигонуклеотиди 31-42 се сглобяват в 6 дублета (31 и 37; 32 и 38; 33 и 39; 34 и 40; 35 и 41; и 36 и 42). Шестте дублета след това се лигират,за да образуват секция III, както е показано на фигура 6. Както е показано след това на фигура 6, секция III включва в посока upstream един BamHI леплив край, а в посока downstream EcoRI леплив край, използвани за лигиране към амплификационен вектор, и поне в случая на EcoRI края, в експресионен вектор. В допълнение секция II има в посока upstream Sstl сайт, използван при евентуално лигиране на секция II и III.

Таблица 9,

EchpG-CSFDNA СЕКЦИЯ III

GATCCAAAGAGCTCGGTATGGCACCAG31

CTCTGCAACCGACTCAAGGTGCTATGCCG32

GCATTCGCTTCTGCATTCCAGCGTCGTGC33

AGGAGGTGTACTGGTTGCTTCTCATCTG34

CAATCTTTCCTGGAAGTATCTTACCGTGT35

TCTGCGTCATCTGGCTCAGCCGTAATAG36

AGAGCTGGTGCCATACCGAGCTCTTTG37

ATGCCGGCATAGCACCTTGAGTCGGTTGC38

TCCTGCACGACGCTGGAATGCAGAAGCGA39

ATTGCAGATGAGAAGCAACCAGTACACC40

CAGAACACGGTAAGATACTTCCAGGAAAG41

AATTCTATTACGGCTGAGCCAGATGACG42

Xbal към BamHI фрагмент, образуван в секция I, се лигира в М13тр11 фагов вектор_?отворен cXbal и BamHI. След това векторът отново се отваря чрез смилане BamHI и EcoRI, следвано от лигиране с BamHI към EcoRI фрагмент в секция II. На този етап секции I u II са свързани в правилна ориентация. След това друг М13тр11 вектор се отваря чрез BamHI към EcoRI смилане, след което се лигира с BamHI към EcoRI фрагмента, образуван в секция III.

Векторът,съдържащ секции I и II,се смила с Xbal u Sstl. Подобно, векторът, съдържащ секция III, се смила със Sstl и EcoRI. И двата по-малки от двата фрагмента, получени от всяко смилане, се лигират в плазмид pCFM1156, който предварително е отворен с Xbal и EcoRI. Продуктът на тази реакция е експресионен плазмид, съдържащ непрекъсната ДНК последователност, както е показано на фигура 7, кодиращ hpG-CSF полипептид с амино терминален метионинов кодон (ATG) за иницииране на транслацията в Е. coll.

Въпреки че може да се използва който и да е подходящ вектор за екпресиране на тази ДНК, експресионният плазмид pCFM1156 лесно може да се конструира от плазмид pCFM836, чиято конструкция е описана в публикувана заявка за Европейски Патент No 136,490. pCFM836 първо се срязва с Ndel^a после се прави с тъпи краища с Poll, като по този начин се разрушават двата съществуващи Ndel сайта. След това векторът се смила с Clal и Sacll за отстраняване на съществуващия полилинкер преди лигирането към заместващ полилинкер, както е показано на фигура 8. Този заместващ полилинкер може да се конструира съгласно Alton, et al., погоре. Контролът на експресията в експресионния pCFM1156 плазмид се осъществява посредством ламда P_L промотор, който от своя страна може да бъде под контрола на С₎₈57 репресорен ген (какъвто е доставен в Е. coli щам ΚΊ 2AHtrp).

ПРИМЕР 7,

Този пример се отнася до експресия на hpG-CSF полипептид в Е. coli посредством ДНК последователност, кодираща [Met'¹] hpCSF. Използваната последователност частично е синтетична и частично произлиза от сДНК. Синтетичната последователност използва предпочитаните кодони за Е. coli.

Плазмид Рро2, съдържащ hpG-CSF гена, показан на фигура 2,се смила с HgiAl и Stul_?KaTo се предоставя фрагмент от приблизително 645 базови двойки,включващ гена на зрелия hpCSF (както е показано на фигура 2) със седем остатъчни кодони на лидерната последователност в 5’ края и приблизително 100 базови двойки от 3’ некодиращата област. Смилане с HgiAl води до 4-бази леплив край при 5’, идентичен на този от Pstl, a Stul води до тъпи краища. Това позволява бързо инсериране на фрагмента в М13 mp8 (Rf),срязан с Pstl и с рестрикционния ензим Hindi,образуващ тъпи краища. След амплифициране в М13, hpG-CSF ДНК се изрязва чрез смилане с Apal u BamHI, които съответно срязват при Apal сайта, разполагайки кодоните за остатъци +3 до +5 на hpCSF и при BamHI сайта в посока “downstream” на Hindi сайта в М13 тр8 рестрикционния полилинкер. С цел да се позволи експресирането на hpG-CSF полипептида в Е. coli,се изготвя синтетичен фрагмент, както е показано на таблица 10 по-допу.

Таблица 10,

5’- CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATA

3’ - ТТТ ТТТ GGT ТСС ТСС АТТ АТТ ТАТ

Xbal

-1 +1

Met Thr Pro Leu

ATG АСА CCT CTG GGC C-5’

TAC TGT GGA GAC - 3’

Apal

Както може да бъде определено от анализа на таблица 10, линкерът включва Apal леплив край, кодони, характеризиращи първоначалните три остатъка от амино края на hpG-CSF (“възстановяващ” Thr¹, Pro², Leu₃ характеризиращи кодони,делетирани след смилане с Apal на М13 ДНК,описано по-горе, и при използване на кодони, за предпочитане експресирани в Е. coli), иницииращ транслацията на ATG, последователност от 24 базови двойки, предоставяща сайт за свързване на рибозоми, и Xball леплив край.

Експресионният вектор, използван за експресиране в Е. coli_?e този, описан като pCFM536 в заявка за Европейски Патент No 136,490 от Morris, публикувана на 10.04.1985. (Виж също А.Т.С.С. 39934, Е. coli JM103,съдържащ pCFM536). Накратко, плазмид pCFM536 се смила с Xbal u BamHI. hpG-CSF фрагментът (Apal/BamHI) и линкер (ХЬа1/Ара1)_?описан по-горе, след това се лигира към негова да образува плазмид^означен като р536Рро2.

Плазмид р536Рро2 се трансформира във вариант на Е. coli щам АМ7, устойчив на фаги, който предварително е трансформиран с плазмид pMW1 (А.Т.С.С. No 39933) включващ CI⁸⁵⁷ ген. Трансформирането се проверява на основата на маркерен ген (amp) за устойчивост на антибиотици, пренесен от родителски плазмид pCFM536. Култури на клетки в LB бульон (ампицилин 50 pg 1 ml) се поддържа при 28°С и след прорастването на клетките в културата до А600=0,5, hpCSF експресията се индуцира чрез повишаване температурата на култивиране до 42°С в продължение на 3 часа. Крайната O.D. на културата е А600=1,2.

Определено е върху SDS-полиакриламиден гал,оцветен с coomassie blue багрило, че степента на експресиране на hpG-CSF от трансформираните клетки е 3-5% от общия клетъчен протеин.

Клетките се събират чрез центрофугиране при 3500 g в продължение на 10 минути в JS-4.2 ротор. Клетки при 25% (тегло/обем) във вода се разрушават чрез трикратно преминаване през French Pressure Cell при 10 000 p.s.i. Суспенсията от разрушени клетки се центрофугира при 10 000 g в продължение на 15 минути на JA-20 ротор. Плътната утайка се суспендира повторно във вода и се разтваря до приблизително 5 mg/ml общ протеин в 1% лауринова киселина, 50 mM Tris, pH 8,7. Разтворената плътна утайка се центрофугира при 15 000 g в продължение на 10 минути и към супернатантата се прибавя CuSO₄ до 20 тМ. След 1 час тази проба се пропуска на С4 ВЕТХ колона за пречистване съгласно процедурите от пример 1 (Б) с нагласяване на обема и концентрацията.

Разработва се втора процедура на пречистване за получаване на по-големи количества hpG-CSF в неорганичен съдържащ буфер. Този материал е подходящ за in vivo изследвания. 150 грама клетъчна паста отново се суспендира в приблизително 600 ml 1 mM DTT и 4 пъти се пропуска през Manton Gualin Homogenizer при приблизително 7 000 PSI. Суспенсията от разрушени клетки се центрофугира при 10 000 g за 30 минути и плътната утайка отново се суспендира в 400 ml 1% дезоксихолат (DOC), 5 mM EDTA, 5 mM DTT и 50 тМ Tris, pH 9. Тази суспенсия се разбърква при стайна температура в продължение на 30 минути и се центрофугира при 10 000 g в продължение на 30 минути. Плътната утайка отново се суспендира в приблизително 400 ml вода и се центрофугира при 10 000 g в продължение на 30 минути. Плътната утайка се разтваря в 100 ml 2% Sarkosyl и 50 mM Tris при pH 8. Прибавя се CuSO₄ до 20 μΜ и сместта се разбърква 16 часа при стайна температура^след което се центрофугира при 20 000 g в продължение на 30 минути. Към супернатантата се прибавят 300 ml ацетон. Сместа се слага върху лед в продължение на 20 минути? след което се центрофугира при 5 000 g в продължение на 30 минути. Плътната утайка се разтваря в 250 ml 6М гуанидин и 40 mM натриев ацетат при pH 4, и се слага върху 1,200 ml G-25 уравновесена колона и се пропуска в 20 mM натриев ацетат при pH 5,4. Пикът на hpG-CSF (около 400 ml) се обединява и се зарежда върху 15 ml-ова колона СМ-целулоза^ уравновесена в 20 тМ натриев ацетат при pH 5,4. След

4] зареждане колоната се промива с 60 ml 20 mM натриев ацетат при pH 5,4 и с 25 тМ натриев хлорид, след което колоната се елуира с 200 ml 20 mM натриев ацетат при pH 5,4 и с 37 тМ натриев хлорид. 150 ml от този елуент се концентрират до 10 ml и се прилагат към 300 ml G-75 уравновесена колона и се пропускат в 20 тМ натриев ацетат и 100 тМ натриев хлорид при pH 5,4. Пиковите фракции, съдържащи 35 ml , се обединяват и се стерилизират през филтър. Крайната концентрация на hpG-CSF, която е 1,5 mg/ml,e с над

95% чистота, както е определено чрез анализ върху гел,и съдържа по-малко от 0,5 ng пироген на 0,5 mg hpG-CSF. Нивото на пироген се определя при използване на тестов комплект Limulus Amebocite Lysate (LAL) (M.A. Bioproducts, Walkersville, Md).

ПРИМЕР 8.

Настоящият пример се отнася до използване на рекомбинантни методи за генериране на аналози на hpG-CSF_; при което цистеиновите остатъци,присъстващи в позиции 17, 36, 42, 64, и 74 подотдел но са заместени с подходящ аминокиселинен остатък.

Провеждат се процедури за сайт насочен мутагенез съгласно Souza, et al., РСТ заявка No W085/00817, публикувана на 28.02.1985, върху [Met-'¹] _?кодираща ДНК на плазмид р536Рро2, описан по-долу, при използване на синтетични олигонуклеотиди с размер от 20 до 23 бази, както е посочено в таблица 11 по-долу. Олигонуклеотид No 1 позволява образуването на ген/кодиращ [Ser¹⁷] hpG-CSF;

олигонуклеотид No 2 позволява образуването на [Ser³⁶] hpGCSF, и т.н.

Таблица 11, Олигонуклеотид Последователност.

1. 5’-CTG СТС AAG ТСС ТТА GAG CAA GT-3’

2. 5’ -GAG AAG CTG ТСТ GCC ACC TACA - 3’

3. 5’ -TAC AAG CTG ТСС CAC CCC GAG - 3’

4. 5’ -TGA GCA GCT CCC CCA GCC AG-3’

5. 5’ -CTG GCA GGC TCC TTG AGC CAA-3’

Рестрикциите на сайтичасоченият мутагенез от Cys до Ser се провеждат при използване на М13 трЮ, съдържащ Xbal-BamHI hpG-CSF фрагмент, изолиран от р536Рро2 като матрица. ДНК от всеки М13тр10 клон, съдържащ Cys-Ser заместване.се третира с Xbal u BamHI. Полученият фрагмент се клонира в експресионен вектор pCFM746 и продуктите на експресията се изолират^както в пример 7.

Плазмид pCFM746 може да бъде конструиран чрез разцепване на плазмид pCFM736 (конструирането на който от депозирани и достъпни за обществото материали е описано в Morris, РСТ заявка No W085/00829, публикувана на

28.02.1985) c Clal u BamHI за отстраняване на съществуващ полилинкер и чрез заместването на следния полилинкер.

Таблица 12,

Clal ⁵' CGATTTGATTCTAGAATTCGTTAACGGTACCATGGAA ³' TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGCCATGGTACCTT

GCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAAC³ CGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAG⁵

Sau3a

При процеса на пречистване на аналози на Cys до Ser, съгласно настоящото изобретение, приблизително 10-15 g клетъчна паста се ресуспендират в 40 ml 1 mM DTT и три пъти се прокарват през French Pressure Cell при 10 000 psi. Суспензията от разрушени клетки се центрофугира при 1000 g за 30 минути. Плътната утайка се суспендира отново в 1% DOC, 5 mM EDTA, 5 тМ DTT, 50 тМ Tris, pH 9 и се разбърква 30 минути при стайна температура. Сместта се центрофугира при 10 000 g за 30 минути, отново се суспендира в 40 ml Н₂О и отново се центрофугира при 10000 g за 30 минути. Плътната утайка се разтваря в 10 ml 2% Sarkosyl, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH8. След разбъркване в продължение на един час сместта се избистря чрез центрофугиране при 20 000 9 в продължение на 30 минути, след което се прилага на 300 mlова G-75 уравновесена колона и се пропуска в 1% Sarkosyl, 50 тМ Tris, pH 8. Фракциите, съдържащи аналога, се обединяват и се оставят да се окислят чрез излагането им на въздух поне за 1 ден. Крайните концентрации варират от 0,5 - 5 mg/ml.

ПРИМЕР 9.

В този пример експресионна система от клетки на бозайници се разделяла да се удостовери дали един активен полипептиден продукт на hpG-CSF ДНК би могъл да бъде експресиран в, и секретиран от клетки на бозайници (COS-1, А.Т.С.С. CRL-1650). Тази система е проектирана да осигури секретиране на полипептиден аналог на hpG-CSF чрез експресионен и секреторен процесинг на частично синтетична, частично получена от сДНК кодираща структура [Ala¹] hpGCSF, предхождана от лидерен полипептид , притежаващ последователността от остатъци на приписана на човек GMCSF във Wong, et al., Science, 228, 810-815 (1985) и Lee et al., ., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360 - 4364 (1985).

Експресионният вектор, използван за предварителни изследвания на полипептидните продукти на експресията от изобретението,е вектор “совалка) включващ и двете pBR322 и SV40 ДНК, които са били проектирани, за да позволят автономна репликация в Е. coli, както и в клетки от бозайници, с експресия в клетките на бозайници на инсерирана екзогенна ДНК под контрола на вирусна промоторна/регулаторна ДНК последователност. Този вектор, означен като pSVDM-19, се пренася от Е. coli: 101, депозиран на 23.08.1985 в American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md., и входящ номер No А.Т.С.С. 53241.

Специфичните манипулации, включени в конструкцията на експресионния вектор,са,както следва. Лидерна-кодираща

ДНК последователност се синтезира, както е посочено в таблица 13 по-долу.

Таблица 13,

Hindlll Met Trp

5’ - A GCT TCC AAC ATG TGG

3’ -AGG TGG TGG TAG ACC

Leu	Gin	Ser	Leu	Leu	Leu	Leu	Gly	Thr	Vai
CTG	CAG	AGC	CTG	CTG	CTC	TTG	GGC	ACT	GTG
GAC	GTC	TCG	GAC	GAC	GAG	AAC	CCG	TGA	CAC
				-1	+ 1
Ala	Cys	Ser	lie	Ser	Ala	Pro	Leu
GCC	TGC	AGC	ATC	TCT	GCA	CCC	CTG	GGC	G-3’
CGG	ACG	TCG	TAG	AGA	CGT GGG	GAC	-5’

Apal

Както е посочено в таблица 13, последователността включва Hindlll u Apal лепливи краища и кодони за 17 аминокиселинни остатъци, приписвани на “лидера” от човешки GM-CSF. Следват кодони,характеризиращи аланинов остатък, пролинов остатък и левцинов остатък. Пролиновите и левциновите остатъци дублират аминокиселините, присъстващи в позиции +2 и +3 на hpG-CSF, докато аланиновият остатък е предимно дублиращ на първоначалния амино терминален (+1) остатък на GM-CSF, отколкото на hpGCSF. Заместването на треонин от аланин е проектирансуза да улесни правилния “processing off’ в клетката гостоприемник на GM-CSF лидер чрез клетъчни механизми, обикновенно включени в GM-CSF секреторния процесинг.

Плазмид pSVDM-19 се смила с Kpnl и сайтът се прави с тъп край с ензим на Klenow. След това ДНК се скъсва с Hindlll. Полученият голям фрагмент се комбинира и лигира с Hindlll/Rvull фрагмент, показан на фигура 2 (изолиран от плазмид Рро2, като вторият най-голям фрагмент, получен от смилане с Hindlll и частично смилане с РуиН)_лза да образува плазмид pSV-Ppol. Произведеният фрагмент на GM-CSF лидерна последователност от фигура 3 след това се лигира в pSV-Ppol (след скъсването с Hindlll и Apal)_? за да се получи плазмид pSVGM-Ppol.

ДНК от плазмид pSVGM-Ppol, утаена с калциев фосфат (1-5 цд);се трансформира с повторение в 60 mm-ови блюда с COS-1 клетки по същество, както е описано от Wigler, et al., Cell, 14, 725-731 (1978). Като контрола плазмид pSVDM-19 също се трансформира в COS-1 клетки. Супернатанти от тъканна култура се събират 5 дни след трансфекцията и се изследват за hpG-CSF активност. Добивът на [Ala¹] hpG-CSF от супернатантата на културата е в рамките от 1 до 2,5 gg/ml.

След успешното експресиране на [Ala¹] hpG-CSF продукта, кодиран от плазмид pSVGM-Ppol в COS-1 клетки, се конструира друг вектор, който включва човешка GM-CSF лидерна последователност, но притежаваща кодон за треонинов остатък (естествено намиращ се позиция 1 на hpGCSF) _? който замества кодона за аланин в тази позиция.

Накратко, синтезира се олигонуклеотид (5’ CAGCATCTCTACACCTCTGGG) за сайт насочен мутагенез (SDM). Hindlll до BamHI hpG-CSF фрагмента в pSVGM-Ppol се лигира в М13 трЮ за SDM. Новосинтезираният hpG-CSF ген, съдържащ Thr кодон в позиция 1,се изолира чрез разцепване с Hindlll u EcoRI. След това фрагментът се клонира в pSVDM19, изготвен чрез разцепване със същите две рестрикционни ендонуклеази. Полученият вектор pSVGM-Ppo(Thr) се трансформира в COS клетки и добивът на hpG-CSF, измерен в супернатантата на културите, е в границите от 1 до 5 цд/т1.

Накрая геномната последователност, чието изолиране е описано в пример 5, се използва за образуване на експресионен вектор за експресия на hpG-CSF в клетки на бозайници. По-специално. pSVDM-19 се смила с Kpnl u Hindlll и най-големият фрагмент се използва в четирипосочно лигиране със синтетичен линкер с Hindlll u Ncol лепливи краища, както е показано на таблица 14. Ncol-BamHI фрагмент, съдържащ екзон 1, изолиран от pBR322 (8500 hpG-CSF), геномен субклон, hpG-CSF и BamHI-Kpnl фрагмент,съдържащ екзони 2-5, изолирани от плазмид pBR322 (8500 hpG-CSF, геномен субклон). Полученият експресионен вектор за бозайници, pSV/ghG-CSF продуцира 1 до 2,5 gg/ml hpG-CSF от трансформирани COS клетки.

Таблица 14, Hindlll ⁵'agcttccaacac AGGTTGTGGTAC⁵ Ncol

ПРИМЕР 10,

Този пример се отнася до физичните и биологични свойства на рекомбинантни полипептидни продукти на настоящото изобретение.

1. Молекулно тегло

Рекомбинантни hpG-CSF продукти от експресия в Е. colli, както в пример 7, имат явно молекулно тегло от 18,8 kD при определяне с редуцираща SDS-PAGE₇ както би било предсказано от изведения аминокиселинен анализ от фигура 2, където естествени изолати, като описаните в пример 1,имат явно молекулно тегло от 19,6 kD. Присъс твието на N-гликани, асоциирани с естествени изолати действително може да бъде изключено на основата на липса на аспергинови остатъци в първичната последователност на hpG-CSF от фигура 2 и следователно се отделя процедура за определяне дали 0гликани са отговорни за разликата в молекулното тегло между естествени изолати и негликозилираните рекомбинантни продукти. Приблизително 5 цд материал от естествен изолат се обработват с невраминидаза (Calbiochem, LaJolla, Calif.), Отстранява се проба от 0,5 цд и останалият материал се инк^бира с 4 mil О-гликаназа (ендо-х-п-ацетилгалактозаминидаза, Genzyme, Boston, Mass.) при 37°С. Аликвотни части се отстраняват след 1/2, 2 и 4 часа от инкубирането. Тези проби се подлагат на SDS-PAGE една до друга с рекомбинантен продукт, произлизащ от Е. colli. След обработването с невраминидаза явното молекулно тегло на изолата се измества от 19,6 kD на 19,2 kD, което подсказва отстраняването на остатък на сиалова киселина. Два часа след обработването с О-гликаназа явното молекулно тегло се измества от 18,8 kD - идентично с явното молекулно тегло на материал, произлизащ от Е. colli. Чувствителността на карбохидратната структура към невраминидаза и О-гликаназа подсказва следната структура за карбохидратния компонент. N-ацетилневраминова киселина-а(2-6)галактоза β (1-3) М-ацетилгалактозамин-R, където R е серин или треонин.

2. ³Н-тимидин ориентиране

Индуцирането на пролиферация на клетки от костен мозък на човек се изследва на основата на повишено включване на ³Н-тимидин. Човешки костен мозък от здрави донори се подлага на плътностно срязване с Ficoll-Hypaque (1.077 g/ml Pharmacia) и клетките с ниска плътност се суспендират в Iscove’s среда (GIBCO), съдържаща 10% зародишен говежди серум и глутамин pen-strep. След това 2x10⁴ клетки от костен мозък на човек се инкубират или с контролна среда?или с материал от рекомбинантна Е. colli от пример 7 в 96-ямкови блюда с плоско дъно при 37°С в 5% СО₂ на въздух в продължение на два дни. Пробите се изследват в повторение и концентрацията варира над 10 000 пъти. След това в културите се прокарват в продължение на 4 часа с 0,5 μ Ci/ямка ³Н-тимидин (New England Nuclear, Boston, Mass.). ³Н-тимидин ориентирането се измерва? както е описано в Ventua, et al., Blood, 61, 781 (1983). В това изследване човешки hpG-CSF изолати могат да се индуцират с включване на ³Н-тимидин в клетки от костен мозък на човек, при приблизителни нива 4-10 пъти по-високи от контролните супернатанти. hpG-CSF продукт, произлизащ от Е. colli от пример 6,притежава подобни свойства.

Провежда се второ изследване на пролиферацията на клетки от костен мозък на човек при използване на културална среда на трансфектирани COS-1 клетки, както е приготвена в пример 9, и дава подобни резултати, което показва, че кодираните полипептидни продукти действително се секретират в културалната среда като активни продукти.

3. WEHI - ЗВ D+ индуциране на диференциация Способността на рекомбинантни продукти, произлизащи от Е. colli, да продуцират диференциация на миша миеломоноцитна левкемична клетъчна линия WEHI - ЗВ D-i- се изследва в полутвърда агарова среда,както е описано в Metcalf, Int. J. Cancer, 25, 225 (1980). Рекомбинантният hpG-CSF продукт и контроли на среда се инкубират с ~60 WEHI - ЗВ D+ клетки/ямка при 37°С в 5% СО₂ на въздух в продължение на 7 дни. Пробите се инкубират в 24-ямкови блюда с плоско дъно и концентрациите варират над 2 000 пъти. Колониите се класифицират като недиференцирани , частично диференцирани или напълно диференцирани и преброяването на клетъчните колони се извършва под микроскоп. Открито бе, че рекомбинантният продукт от Е. colli индуцира диференциране.

4. CFU-GM, BFU-E и CFU-GEMM изследвания

Открито бе, че естествени изолати от плурипотентен човешки G-CSF (hpG-CSF) и рекомбинантен плурипотентен човешки G-CSF (rhpG-CSF) причиняват пролиферация и диференциация на клетки от костен мозък на човек. Тези действия се измерват при CFU-GM [Broxmayer, et al., Exp. Hematol., 5, 87, (1971)] BFU-E и CFU-GEMM изследвания [Lu, et al., Blood, 61, 250 (1983)] при използване на ниска плътност, не^прилепващи клетки от костен мозък на здрав човек доброволец. Сравнение на CFU-GM, BFU-E и CFU-GEMM биологичните активности чрез използване на 500 единици hpG-CSF или rhpG-CSF е показано на таблица 15 по-долу.

Всички изследвания на колониите са проведени с неприлепващи клетки от костен мозък с ниска плътност. Клетки от костен мозък на човек се подлагат на плътностно срязване с Ficoll-Hypaque (плтзност, 1,077 g/cm³; Pharmacia). След това клетките с ниска плътност отново се суспендират в Iscove’s модифицирана Dulbecco’s среда, съдържаща зародишен телешки серумни се поставят за адхезия върху Falcon блюда с тъканна кутура (No 3003, Becton Dickenson, Cockeysville, Md.) за 1½ часа пей 37°С.

Таблица 15,

	CFU-GM	BFU-E	CFU-GEMM
Среда	0±0	26+1	0±0
Неутрален hpG-CSF	83+5.4	83+6.7	4+0
rhpG-CSF	87+5	81±0.1	6+2

Контролната среда се състои от Iscove’s модифицирана Dulbecco’s среда плюс 10% FCS, 0,2 тМ хемин и една единица ракомбинантен еритропоетин.

За CFU-GM изследването клетките мишени се посяват при 1x10⁵ в 1 ml 0,3% агарова културална среда, която включва допълнена McCoy’s 5А среда и 10% топлинно инактивиран зародишен телешки серум. Културите се преброяват за колонии (над 40 клетки на агрегат) и морфологично се определят на 7-мия ден от култивирането .Броят на колониите е показан като средно от ±SEM, както е определено от четирикратен брой на блюдата.

За BFU-E u CFU-GEMM изследването, клетки (1х10⁵) се прибавят към 1 ml смес на Iscove’s модифицирана Dulbecco’s среда (Gibco), 0,8% метилцелулоза, 30% зародишен телешки серум, 0,05 пМ 2-меркаптоетанол 0,2 тМ хемин и една единица рекомбинантен еритропоетин. Блюдата се инкубират във влажна атмосфера на 5% СО₂ и 5% О₂. Ниско кислородно налягане се получава при използване на оксиредюсер от Fleming Bioinstruments (Syracuse, N.Y.). Колониите се преброяват след 14 дни инкубиране. Броят на колониите е показан като тяхната средна стойност ± SEM, както е определено от дублираните блюда.

За всички колонии, образувани при CFU-GM изследването, бе открито, че са хлорацетат естераза позитивни и негативни към неспецифична естераза (алфа-нафтил ацетат естераза), което съответства с колониите гранулоцитни по тип. И за двата естествени hpG-CSF и rhpG-CSF е открито, че притежават специфична активност на приблизително 1x10⁸ U/mg чист протеин, при изследвания със серийно разреждане при CFU-GM изследването. BFU-E и CFU-GEMM данните от таблица 15 са представителни за три отделни експеримента и са подобни на данните,посочени преди това за естествен hpGCSF. Важно е да се отбележите rhpG-CSF е изключително чист и лишен от други потенциални растежни фактори на бозайници, благодарение на продуцирането му в Е. coli. Следователно rhpG-CSF е способен да поддържа образуването на смесени колони (CFU-GEMM) и BFU-E,KoraTO се прибавя в присъствие на рекомбинантен еритропоетин.

5. Изследване за клетъчно свързване

Докладвано е преди това, че WEHI-3B (D⁺) клетки и човешки левкемийни клетки от новодиагностицирани левкемии свързват ¹²⁵1-белязан миши G-CSF, и че това свързване може да е компетитивно чрез прибавяне на небелязан GCSF или човешки CSF-A. Тества се способноста на естествения hpG-CSF и rhpG-CSF да се съревновават при свързването на ¹²⁵l-hpG-CSF към човешки или миши левкемични клетки. Високопречистен естествен hpG-CSF (>95% чистота; един pg) се йодира [Tejedor, et al., Anal. Biochem., 127, 143 (1982)], отделя се от реагиращите вещества чрез гел филтрация и йонообменна хроматография. Специфичната активност на естествения ¹²⁵l-hpG-CSF е приблизително 100 pCi/pg протеин. Миши WEHI-3B (D⁺) и два препарата на миелоидни левкемични клетки от периферна кръв на човек (ANLL, едните класифицирани като М4, другите като М5В) се тестват за тяхната способност да свързват ¹²⁵l-hpG-CSF.

Мишите и прясно получените миелоидни левкемични клетки от периферна кръв на човек трикратно се промиват с PBS/1% BSA. WEHI-3B(D⁺) клетки (5x10⁶) или свежи левкемични клетки (3x10⁶) се инкубират в повторения в PBS/1% BSA (100 pl) при отсъствие или присъствие на различни концентрации (обем: 10 pl) небелязан hpG-CSF, rhpG-CSF или GM-CSF и в присъствие на ¹²⁵l-hpG-CSF (приблизително 100 000 срт или 1 ng) при 0°С за 90 минути (общ обем: 120 pl). След това клетките отново се суспендират и се разстилат на слой над 200 pl ледено студен FCS в 350 pl пластмасови центрофужни епруветки и се центрофугират (1000 g; 1 минута). Плътната утайка се събира чрез изрязване на дъното на епруветката и плътната утайка и супернатантата се изброяват псютделно в гама брояч (Packard).

Специфичното свързване (срт) се определя като общо свързване при отсъствие на компетитор (средно от повторенията) минус свързването (срт) в присъствието на стократен излишък небелязан hpG-CSF (неспецифично свързване). Неспецифичното свързване максимално е 2503 срт за WEHI-3B (D⁺) клетки, 1072 срт за ANLL (М4) клетки и 1125 срт за ANLL (М5В) клетки. Експерименти 1 и 2 се провеждат в различни дни при използване на същите препарати ¹²⁵l-hpG-CSF и се изобразява вътрешната същност в процентно инхибиране регистрирано за 2000 единици hpG-CSF. Получените данни са посочени на фигура 9.

Както е показано на фигура 9, ¹²⁵l-hpG-CSF показва свързване към WEHI-3B (D⁺) левкемични клетки. Свързването се инхибира по зависещ от дозата начин от небелязан естествен hpG-CSF или rhpG-CSF, но не и от GM-CSF. Освен това се наблюдава свързване на естествения hpG-CSF към човешки миеломоноцитни левкемични клетки (ANLL. М4). Свързването към тези клетки е паралелно по отговор на естествен hpG-CSF в течни култури чрез диференцииране в зрели макрофаги, както се съди по морфологията. Отсъствието на свързване на естествения ¹²⁵l-hpG-CSF към моноцитни левкемични клетки от друг пациент (ANLL. М5) подсказва, че някои левкемии могат диференциално да експресират или да им липсват рецептори за hpG-CSF. Способността на rhpG-CSF да се съревновава за свързването на естествения ¹²⁵l-hpG-CSF, подобно на естествения hpG-CSF, подсказва че рецепторите еднакво добре разпознават и двете форми.

Тези изследвания, демонстриращи свързването на естествения ¹²⁵1-белязан hpG-CSF към левкемични клетки, са паралелни в култура по способността на естествения hpG-CSF да индуцира диференциране на гранулоцити и моноцити на клетки от костен мозък с ниска плътност, получени от един пациент с остра промиелоцитна левкемия (M3) и втори пациент с остра миелобластна левкемия (M2). Клетки от всеки пациент се култивират 4 дни само в среда или в присъствието на 1х10⁵ единици rhpG-CSF. Клетки от M3 контролни култури, инкубирани само в среда, все още са промиелоцитен тип; докато клеткидултивирани в присъствие на rhpG-CSF, показват зрели клетки от миелоиден тип, включително метамиелоцити, гигантоивична форма и сегментирани неутрофили и моноцити. Действителното диференциално броене за този пациент, върху 100 клетки, изчислени спрямо контролата, 100% промиелоцити, и за клетки,третирани с rhpG-CSF, 22% бласти плюс промиелоцити, 7% миелоцити, 35% метамиелоцити, 20% ивични форми плюс сегментирани неутрофили, 14% моноцити и 2% макрофаги. Трябва да се отбележи фактгьче един от полиморфонуклеарните гранулоцити все още съдържа забележителен auer rod, което подсказва че поне тази клетка представя диференциална клетъчна принадлежност към левкемичният клон. Клетки от втория пациент с миелобластъна левкемия (M2) също се култивират четири дни в присъствие или отсъствие на rhpG-CSF. Визуалният анализ на M2 клетки, култивирани само в среда, показва “бластоподобни” клетки, някои от които притежаващи ядрени телца. Някои от M2 клетките при третиране с rhpG-CSF се диференцират до зрели сегментирани неутрофили, показващи остатъчни auer rods в центъра на неутрофилите, което подсказва диференциране, протичащо в клетка, принадлежаща на левкемичен клон. Действителното диференциране на сто клетки, оценени морфологично, показва, че контролните клетки се състоят от 100% бласти. Клетки, третирани с rhpG-CSF, се състоят от 43% бласти, 1% миелоцити, 15% метамиелоцити, 28% ивични форми плюс сегментирани неутрофили, 2% промоноцити и 11% моноцити. Левкемичните клетки се проверяват за диференцииране при четири други концентрации на rhpG-CSF (5х10³, 1x10⁴, 2,5х10⁴ и 5x10⁴ U/ml, данните не са показани). Даже и при най-ниските тествани концентрации (5x10³ U/ml) на rhpG-CSF има значително дифенци ране (клетките се диференцират отвъд миелоцитите)на M3 (50%) и M2 (37%) левкемичните клетки.

6. Имуно изследване

За получаване на поликлонални антитела за имунно изследване използваният антиген е плурипотентен G-CSF, пречистен от карциномна клетъчна линия 5637 (1А6) от пикочен мехур на човек, както се получава в пример 1 (В). Преценява се^че този продукт е 85% чист на основата на оцветяване на полиакриламидни телове със сребърен нитрат. Balb/C мишки на възраст 6 седмици се имунизират подкожно с антиген. Антигенът се суспендира отново в PBS и се емулгира с равни обеми пълен адювант на Freund. Дозата е от 5 до 7 pg антиген на мишка на инжектиране. 18 дни по-късно се прилагат спомагащи имунизации със същото количество антиген емулгиран с равен обем непълен адювант на Freund.

След 4 дни се взима серум от мишки за тестване на специфично антитяло за човешки плурипотентен G-CSF.

Dynatech Immulon II Removawell ивици в рамки (Dynatech Lab., Inc., Alexandria, Va.) се покриват c hpG-CSF 5 цд/ml в 50 mM карбонат-бикарбонатен буфер, pH 9,2. Ямките се покриват с 0,25 цд в обем от 50 Ш. Блюдата с покритие от антиген се инкубират два часа при стайна температура и цяла нощ при 4°С. Разтворът се декантира и блюдата се инкубират 30 минути с PBS/Съдържащ 5% BSA за блокиране на реактивната повърхност. Този разтвор се декантира и разредени пре^имунни или тестови серуми се прибавят към ямките и се инкубират 2 часа при стайна температура. Серумите се разреждат с PBS, pH 7,0, съдържащ 1% BSA. Серумният разтвор се декантира и блюдата се промиват трикратно с Wash Solution (KPL, Gaithersburg, Md.). Към всяка ямка се прибавят приблизително 200 000 срт йодиран заешки анти-миши IgG (NEN, Boston, Mass.) в 50 μΙ PBS, pH 7,0, съдържащ 1% BSA. След 1½ часа инкубиране при стайна температура разтворът се декантира и блюдата се промиват пет пъти с промивен разтвор. Ямките се изваждат от рамките и се преброяват на Beckman 5500 гама брояч. Високотитърните миши серуми показват по-вече от 12 пъти по-висока реактивоспособност, отколкото съответните преимунни серуми при разреждане 1.100.

Имунологичните свойства на hpG-CSF, произлизащ от Е. coli ,се определят чрез реактивоспособноста на високотитърни миши серуми, специфични към hpG-CSF, получен от клетки на бозайници. 0,25 цд протеин с 90% чистота,получен от Е. coli,ce покрива с Immulon II Removawells в обем 50 μΙ и мишият серум се изследва, както е описано по-горе.

Високотитърните миши серуми показват повече от 24 пъти по-висока реактивоспособност към продукт, получен от Е. coli, отколкото съответните пре^имунни серуми при разреждане 1:100.

7. Биоизследвания на аналог на серин [Ser¹⁷]hpG-CSF, [Ser³⁶]hpG-CSF, [Ser⁴²]hpG-CSF, [Ser⁶⁴]hpG-CSF u [Ser⁷⁴]hpG-CSF продукти, получени съгласно пример 9,се изследват за hpG-CSF активност при изследвания за ³Н-тимидин ориентиране, CFU-GM u WEHI-3B D⁺ анализи. Във всяко изследване [Ser¹⁷] аналогът е с активност,сравнима с тази на рекомбинантни молекули, притежаващи нативната структура. Останалите аналози притежават около 100 пъти пониска активност при изследването за ³Н-тимидин ориентиране, 250 пъти по-ниска активност при изследването за CFU-GM и 500 пъти по-ниска активност при изследването за WEHI-3B D⁺. Тези данни поддържат предположението, че цистеините в позиции 36, 42, 64 и 74 може да са необходими за пълна биологична активност.

8. In vivo биоизследване

Alzet® осмотични помпи (Alzet Corp., Palo Alto, Calif; Model 2001) се свързват към постоянни катетри на дясната югуларна вена и се имплантират подкожно на седем мъжки Syrian golden хамстери. Четири от помпите съдържат буфер [20 тМ натриев ацетат (pH 5,4) и 37 тМ натриев хлорид] и 1,5 mg/ml hpG-CSF, получен от Е. coli, докато три от помпите съдържат само буфер. Обявената скорост на осмотичните помпи е 1 микролитър/час до 7 дни. На третия ден след имплантирането на помпите средният брой гранулоцити на четирите третирани хамстера е 6 пъти повисок от този на трите (буфер) контролни и повишениягброй гранулоцити дава отражение на четирикратно увеличение на общите лимфоцити. Броят на еритроцитите не се променя след третиране. Тези резултати показват, че рекомбинантният продукт води до специфично засилване на продуцирането и/или освобождаване на гранулоцити в бозайници.

В допълнение към естествено съществуващите в природата алелни форми на hpG-CSF, настоящето изобретение също включва други hpG-CSF продукти като полипептидни аналози на hpG-CSF и фрагменти на hpG-CSF. Следвайки методите на горепосочената публикувана заявка на Alton, et al., (W083/04053), специалистът в областта лесно може да проектира и микробиална експресия първична конформация, да произведе гени, кодиращи на полипептиди, притежаващи които се различават от тук посочените по същността или месторазположението на един или два остатъка (например, заместване, крайно или междинно прибавяне или делеция). Алтернативно, модификации на сДНК и на геномни гени лесно може да се осъществи с добре известни техники за сайт>насочен мутагенез и да се използват за генериране на аналози и производни. Такива продукти биха споделяли най-малко едно от билогичните свойства на hpG-CSF, но могат и да се различават по други. Например, планувани продукти, съгласно изобретението, включват такива, които са съкратени например чрез делеции; или такива/оито са по-стабилни към хидролиза (и следователно могат да имат по-подчертан или по дълготраен ефект, отколкото естествено съществуващите в природата); или които са били променени да делетират един или по-вече от потенциалните сайтове за о-гликозилиране (което може да доведе до по-високи активности на продукти, продуцирани в дрожди); или които могат да притежават един или повече цистеинови остатъка,делетирани или заместени от аланинови или серинови остатъци, например, и потенциално по-лесно могат да бъдат изолирани в активна форма от микробиални системи; или които притежават един или повече тирозинови остатъци «заместени от фенилаланин,и могат да се свържат повече или по-малко лесно към рецептори на hpGCSF на клетки мишени. Включват се също така, полипептидни фрагменти^ дублиращи само част от непрекъсната аминокиселинна последователност или вторични конформации в hpG-CSF, които фрагменти могат да притежават една активност (например, за свързване на. рецептор), а не и други (например активност за стимулиране растежа на колонии). Трябва да се отбележи, че не е необходимо активността за някой или повече продукти от изобретението да притежава терапевтична полза [виж, Weiland, et al., Blut, 44, 173-175 (1982)] или полза в друг контекст, като например изследвания за hpG-CSF антагонизъм. Компетитивните антагонисти могат да бъдат доста полезни, например при случай на свръхпродуциране на hpG-CSF.

Съгласно друг вариант на настоящото изобретение описаната ДНК последователност, която кодира hpG-CSF полипептиди, е ценна за информацията? която се предоставя по отношение на аминокиселинната последователност на протеина от бозайници, която до сега не бе достъпна, въпреки аналитичния подход на изолиране на естествено саществуващи в природата продукти. ДНК последователностите също са очевидно ценни като продукти, полезни за извършване на микробиален синтез на hpG-CSF в голям мащаб чрез голямо разнообразие от рекомбинантни техники. От друга страна? ДНК последователностите? предоставени от настоящото изобретение се използват за генериране на нови и полезни вирусни и кръгови плазмидни ДНК вектори, нови и полезни трансформирани и трнсфектирани микробиални прокариотни и еукариотни клетки гостоприемници (включително бактериални и дрождеви клетки и клетки от бозайници, растящи в култура), и нови и полезни методи за прорастване в култура на такива микробиални клетки гостоприемници, способни да експресират hpG-CSF и свързаните с него продукти. ДНК последователностите от настоящото изобретение са също така особено подходящи продукти за използване като белязани проби при изолиране на hpG-CSF и свързаните протеини, кодиращи геномна ДНК на човек, както и сДНК и геномни ДНК последователности от други видове бозайници. ДНК последователностите също могат да се използват при различни алтернативни методи за синтез на протеини (например, в клетки на насекоми) или в генната терапия на хора и други бозайници. Очаква се ДНК последователностите от настоящото изобретение да се използват в развитието на трансгенни видове бозайници, които могат да послужат като еукариотни “гостоприемници” за количествено получаване на hpG-CSF и hpG-CSF проду^и.

Виж най-общо Palmiter, et (1983).

За приложимостта al., на полипептидни аналози от hpG-CSF фрагменти и изобретението съществуват доклади за имунологична активност на синтетични пептиди, които по същество дуолират съществуващите аминокиселинни последователности естествено съществуващите нуклеопротеини.

в природата протеини,

По-специално за полипептидите гликопротеини относително ниско молекулно тегло е показано, че участват имунни реакции, които са подобни по времетраене и обхват на имунните реакции на физиологично значими протеини, като вирусни антигени, полипептидни хормони и други подобни.

Сред имунните реакции на такива полипептиди се включва провокирането на образуване на специфични антитела в имунологично активни животни. Ви;х например, Lernr, et al., 23, 309-310 (1981); Ross, et al., Nature 294, 654-656 (1981); Walter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77, 5197-5200 (1980); Lerner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 73, 3403-3407 (1981); Walter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 4882-4886 (1981); Wong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 7412-7416 (1981); Green, et al., Cell, 28, 477-487 (1982); Nigg. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, 5322-5326 (1982); Baron, et al., Cell, 28, 395-404 (1982); Dreesman, et al., Nature, 295, 185-160 (1982); u Lerner, Scientific American, 248, No.2, 66-74 (1983). Виж също Kaiser, et al., Science, 223, 249-255 91984) отнасящи се до биологичните и имунологични активности на синтетичните пептиди, които приблизително споделят вторичните структури на пептидни хормони, но не споделят тяхната първична конформация.

Тъй като настоящото изобретение е описано по отношение на предпочитаните варианти на изпълнение, трябва да се разбира, че специалистите в областа биха използвали вариации и модификации. Следователно се подразбира, че прилежащите претенции включват всички такива еквивалентни вариации, които се включват в обхвата на изобретението съгласно патентните претенции.

Claims (1)

1. Изолиран полипептиден аналог на човешки плурипотентен гранулоцитен колония-стимулращ фактор (hpG-CSF), притежаващ аминокиселинна последователност избрана от група,състоя ща се от:

+1 ' +10

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro +20 Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin +30 Vai Arg Lys lie Gin Gly Asp Gly Ala Ala +40 Leu Gin Giu Lys leu Cys Ala Thr Tyr Lys +50 Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Vai Leu Leu +60 Gly His Ser Leu Gly He Pro Trp Ala Pro +70 Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin +80 Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser +90 Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin +100 Ala Leu Glu Gly lie Ser Pro Glu Leu Gly + 110 Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai