DK175551B1 - Isoleret polypeptid med hæmatopoietiske biologiske egenskaber som naturligt forekommende hpG-CSF, DNA-sekvens kodende for denne, plasmider indeholdende sekvensen, hermed transformerede/transficerede..... - Google Patents

Description

DK 175551 B1

Opfindelsen angår et isoleret polypeptid med de hæmatopoietiske biologiske egenskaber for naturligt forekommende pluripotent granulocyt kolonistimulerende 5 faktor (hpG-CSF), hvor polypeptidet har den i tabel VII angivne aminosyresekvens 1-174. I sammenhæng hermed angår opfindelsen en DNA-sekvens, der ved eksprimering i en prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle koder for et polypeptid, de besidder i det mindste en del af de 10 primære struktur og de hæmatopoietiske egenskaber for naturligt forekomende pluripotent granulocyt kolonistimulerende faktor; et biologisk funktionelt plasmid eller viral DNA-vektor; en prokaryotisk eller eukaryotisk ^ værtscelle; en fremgangsmåde til fremstilling af isolerede polypeptider med de hæmatologiske egenskaber for naturligt forekommende pluripotent granulocyt koloni-stimulerende faktor (pG-CSF), hvor polypeptidet har den i tabel VII angivne aminosyresekvens 1-174; et farma-2o ceutisk præparat og anvendelse af et sådant polypeptid til fremstilling af et lægemiddel.

Det bloddannende (hæmatopoietiske) system hos mennesker nydanner en række hvide blodlegemer (deriblandt neutrofile, makrophager og basofile/mastceller), 25 røde blodlegemer (erythrocyter) og størkningsfremmende 'celler (megakaryocyter/blodplader). Man har anslået, at' det hæmatopoietiske system hos en gennemsnitlig mandsperson producerer ca. 4,5 x 1011 granulocyter og erythrocyter hvert år, hvilket svarer til en fornyelse af

I DK 175551 B1 I

I I

I hele kroppens vægt. Dexter et al., BioEssays, 2, 154 - I

I 15Θ (1985). I

I Man mener, at små mængder af visse hæmatopoieti- I

I ske vækstfaktorer er årsag til, at et lille antal "stam- I

I 5 faderceller" deler sig i en række blodcellelinier, at I

I disse udbreder sig i så høj grad og til sidst uddiffe- I

I rentieres til fuldt udviklede celler i blodet. Da de I

I hæmatopoietiske vækstfaktorer er til stede i umådelig I

I ringe mængde, har bestemmelser og identificering af I

I 10 disse faktorer hvilet på en række forsøg, som op til nu I

I kun skelner mellem de forskellige faktorer baseret på I

I deres stimulerende virkning på cellekulturer under kun- I

I stige omstændigheder. Som et resultat af dette har man I

I frembragt et stort antal navne til betegnelse af et I

I 15 langt mindre antal faktorer. Som et eksempel på den I

I herskende forvirring kan man nævne, at betegnelserne I

I IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF og PSF er forskellige I

I navne, som man nu tror alle betegner samme hæmatopoieti- I

I ske vækstfaktor hos mus. Metcalf, Science, 229, 16-22 I

I 20 (1985). Se også Burgess et al., J. Biol. Chem. 252, I

I 1988 (1977), Das, et al., Blood, 58, 600 (1980), Ihle, I

I et al., J. Immunol,129, 2431 (1982), Nicola, et al., J. I

I Biol. Chem., 258, 9017 (1983), Metcalf, et al., Int. J. I

I Cancer, 30, 773 (1982), og Burgess, et al., Int. J. I

I 25 cancer, 26, 647 (1980), angående forskellige vækstregu- I

I lerende glycoproteiner hos mus. I

I Anvendelse af rekombinant genteknik har bragt en I

I vis orden i dette kaos. For eksempel kender man nu til I

I aminosyre og DNA-sekvenserne for human erythropoietin, I

I 30 som stimulerer produktionen af erythrocyter. (Se Lin, I

I PCT ansøgning nr. 85/02510, offentliggjort 20. juni I

I 1985). Man har også benyttet rekombinante fremgangsmå- I

I der til isolering af cDNA for en human granulocyt- I

DK 175551 B1 3 macrophag kolonistimulerende faktor. Se Lee, et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360-4364 (1985) og Wong, et al.. Science, 228, 810-814 (1985). Se også Yo-kota, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1070 5 (1984), Fung, et al., Nature, 307, 233 (1984), og Gough, et al., Nature, 309, 763 (1984) angående kloning af gener fra mus, såvel som Kawasaki, et al., Science, 230, 291 (1985) angående human M-CSF.

Man har vist, at der findes en human hæmatopoie-10 tisk vækstfaktor, kaldet human pluripotent koloni-stimulerende faktor (hpCSF) eller pluripoietin i dyrkningsmediet fra en human blærecarcinomcellelinie, kaldet 5637 og deponeret under restriktive omstændigheder hos American Type Culture Collection, Rockville, Mary-15 land som A.T.C.C. nr. HTB-9. Man har angivet, at phCSF, . oprenset fra denne cellelinie, vil stimulere udbredelse og differentiering af pluripotente stamfaderceller og derved medføre produktion af alle de vigtige blodcelletyper i forsøg, hvor man benytter udgangsceller fra men-20 neskelig knoglemarv. Walte et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. Ved rensning af phCSF benyttede man: (NH4)2S04 udfældning; anionbytterchromatografi (DEAE cellulose, DE 52); gelfiltrering (AcA54 søjle); og C18 omvendt fase høj kapacitet væskechromatografi* Man angav, at et prot-25 ein, der blev identificeret som phCSF og blev elueret i den anden af to aktivitetstoppe i Cl8 reversfase HPLC-chromatografi, skulle besidde en molekylvægt (MW) på 18.000, bestemt ved hjælp af natriumdodecylsulphat (SDS)-polyacrylamid gelelektrophorese (PAGE) under an-30 vendelse af farvning med sølv. Tidligere angav man, at hpCSF skulle have et isoelektrisk punkt på 5,5 [Welte, et al., J. Cell. Biochem., Supp. 9A, 116 (1985)] og en høj differentierende aktivitet for den myelomonocytiske

I DK 175551 B1 I

I 4 I

I leukæmicellelinie WEHI-3B D+ fra mus [welte, et al., I

I UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Gale, I

I et al., eds., New Series, 28 (1985)]. Tidligere studier I

I tyder på, at den faktor man identificerer som phCSF be- I

I 5 sidder overvejende granolycyt kolonistimulerende akti- I

I vitet i de første syv dage i et humant CFU-GM forsøg. I

I Man har endvidere fra den humane blærecarcinom- I

I cellelinie 5637 isoleret en anden faktor, betegnet human I

I CSF-β, som man beskriver som en konkurrent til 125I-mær- I

I 10 ket granulocyt kolonistimulerende faktor (G-CSF) fra mus I

I med hensyn til binding til WEHI-3B D+ celler i en dosis- I

I respons vekselvirkning, der er identisk ved, hvad man I

I finder ved ikke-mærket G-CSF fra mus [Nicola, et al., I

I Nature, 314, 625-628 (1985)]. Man har tidligere med- I

I 15 delt, at denne sammenhæng mellem dosis og respons skulle I

I være unik for ikke-mærket G-CSF fra mus, og ikke være I

I til stede hos sådanne faktorer som M-CSF, GM-CSF eller I

I multi-CSF [Nicola, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), I

I 81, 3765-3769 (1984)]. Blandt CSF'er indtager CSF-β og I

I 20 G-CSF den særstilling, at de begge i høj grad er i stand I

I til at inducere differentiering i WEHI-3B D+ celler. I

I Nicola, et al.. Immunology Today, 5, 76-80 (1984). Ved I

I høje koncentrationer stimulerer G-CSF blandede granulo- I

I cyt/makrophag kolonidannende celler (Nicola, et al., I

I 25 (1984) se ovenfor), hvilket stemmer med tidligere resul- I

I tater, der tyder på, at der forekommer granulocytiske I

I monocytiske og blandede granulocytiske/monocytiske og I

I eosinophile kolonier (CFU-GEMMM) efter 14 dages inkube- I

I ring af humane knoglemarvskulturer med phCSF. Man har I

I 30 også beskrevet CSF-β som stimulerende for dannelse af I

I neutrofile granulocytkolonier i forsøg, hvor man benyt- I

I ter knoglemarvsceller fra mus, en egenskab, som man har I

I benyttet til identificering af en faktor som en G-CSF. I

5 DK 175551 B1 På basis af disse ligheder har man identificeret human CSF-β med G-CSF (granulocyt kolonistimulerende faktor).

Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985).

Det lader til, i betragtning af deres fælles 5 egenskaber, at human CSF-β Ifølge Nlcola, et al., se ovenfor, og hpCSF ifølge Welte, et al., se ovenfor, er den samme faktor, som man passende kan betegne som en human pluripotent granulocyt-koloni-stimulerende faktor (hpG-CSF). Det ville være meget ønskeligt at kunne ka-10 rakterisere og rekombinantproducere hpG-CSF på baggrund af den meddelte evne hos G-CSF fra mus til fuldstændig at undertrykke in vitro population af WEHI-3B D+ leukæmiceller ved "fuldstændig normale koncentrationer", og i betragtning af, at man har rapporteret, at urensede 15 præparationer af G-CSF fra mus ved indsprøjtning kan undertrykke eksisterende transplanterede myeloid-leukæmier hos mus. Metcalf, Science, 229, 16-22 (1985). Se også Sachs, Scientific American, 284(1), 40-47 (1986).

Hvis hpG-CSF skulle vise sig at være terapeutisk 20 betydningsfuld, og det bliver nødvendigt at kunne fremstille det i kommercielle mængder, vil isolering fra cellekulturen næppe kunne tilvejebringe den nødvendige mængde materiale. For eksempel bør man lægge mærke, til, at der synes at være restriktioner mod kommerciel udnyt-25 telse af celler fra Human Tumor Bank, såsom blærecarci-nom-cellelinie 5637 fra mennesker (A.T.C.C. HTB9), som man har angivet som kilde for naturlige hpCSF-præpara-ter; Welte, et al., (1985), se ovenfor).

Det ovenfor definerede isolerede polypeptid iføl-30 ge opfindelsen er ejendommeligt ved at være ikke naturligt forekommende og være et produkt af prokaryotisk eller eukaryotisk ekspression af en exogen DNA-sekvens.

Sådanne sekvenser kan omfatte: inkorporerede "fore- !

I DK 175551 B1 I

I 6 I

I trukne" kodoner til eksprimering ved udvalgte ikke-pat- I

I tedyrs værtsceller, tilvejebringelse af gennemskærings- I

I steder for endo-nuclease restriktionsenzymer; og tilve- I

I jebringelse af yderligere DNA-sekvenser anbragt før, I

I 5 indeni eller efter omtalte sekvens, som gør konstruktio- I

I nen af vektorer, der kan eksprimeres uden videre, lette- I

I re. Mere detaljeret er DNA-sekvensen ifølge opfindelsen I

I ejendommelig ved at kode for et polypeptid med en amino- I

I syresekvens valgt blandt den i Tabel VII angivne poly- I

I 10 peptidsekvens og en hvilken som helst allelisk variant, I

I et derivat, en sletningsanalog, substitutionsanalog el- I

I ler additionsanalog deraf. I

I Sådanne DNA-sekvenser ifølge opfindelsen omfatter I

I sekvenser, der er nyttige til at sikre eksprimering i I

I 15 prokaryotiske eller eukaryotiske værtsceller af polypep- I

I tidprodukter med i det mindste en del af den primære I

I strukturelle konformation og en eller flere af de biolo- I

I giske egenskaber for naturligt forekommende pluripotent I

I granulocyt kolonistimulerende faktor. DNA-sekvenserne I

I 20 ifølge opfindelsen kan mere detailleret omfatte: I

I (a) DNA-sekvenserne, der vises i Tabel VII; (b) en I

I genomisk DNA-sekvens, der koder for alleliske varianter, I

I derivater og analoger af hpG-CSF. Disse DNA-sekvenser I

I kan inkorporere kodoner, der gør translation af messen- I

I 25 ger rjja i mikrobeværter lettere. Sådanne fremstillede I

I sekvenser kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge I

I Alton, et al., offentliggjort PCT ansøgning WO 83/04053. > I

I I sammenhæng med de isolerede polypeptider og de I

I for sådanne polypeptider ifølge opfindelsen er det bio- I

I 30 logisk funktionelle plasmid eller den virale DNA-vektor I

I ifølge opfindelsen ejendommelig ved at inkludere en I

I DNA-sekvens ifølge opfindelsen; og en prokaryotisk eller I

I eukaryotisk værtscelle ifølge opfindelsen er ejendomme- I

7 DK 175551 B1 lig ved, at der er transformeret eller transficeret med en DNA-sekvens ifølge opfindelsen på en sådan måde, at værten kan eksprimere det pågældende polypeptidprodukt, fortrinsvis ved at være transformeret eller transficeret 5 med en DNA-vektor ifølge opfindelsen.

De isolerede polypeptidprodukter ifølge opfindelsen er produkter af eksprimering i prokaryotiske eller eukaryotiske værter (f.eks. bakterier, gær eller dyrkede celler fra planter, insekter og pattedyr) af exogene 10 DNA-sekvenser, opnået ved genomisk eller cDNA-kloning eller ved syntese af gener. Produktet fra typiske gærceller (f.eks. Saccaromyces cerevisiae) eller prokaryotiske værtsceller [f.eks. Escherichia coli (E. coli)] er fri for association med noget som helst pattedyrspro-15 tein. Produktet af mikrobeeksprimering i vertebratcel-ler (f.eks. pattedyr bortset fra mennesker og fugle) er fri for associering med nogen som helst former for humane proteiner. Afhængig af den anvendte vært vil poly-peptiderne ifølge opfindelsen kunne være glycosylerede 20 med pattedyrs- eller andre eukaryotiske carbohydrater eller kan være ikke-glycosylerede. Polypeptider ifølge opfindelsen kan også indeholde en start methionin amino-syrerest (ved stillingen -1).

De opfinderiske farmaceutiske præparater er ejen-25 dommelige ved at omfatte effektive mængder af polypep-tidprodukter ifølge opfindelsen eller fremstillet ifølge opfindelsen sammen med passende fortyndingsmidler, adju-vanser og/eller bærere, som er sædvanlige i hpG-CSF-terapi. Endelig anvendes det omhandlede polypeptid iføl-30 ge opfindelsen til fremstilling af et lægemiddel til hæ-matopoietisk terapi på et pattedyr.

Polypeptidprodukter ifølge opfindelsen kan mærkes, idet de associeres med en påviselig markørsubstans

I DK 175551 B1 I

I I

I (f.eks. radiomarkeres med 125l), hvorved der tilveje- I

I bringes reagenser, der er nyttige ved bestemmelse af I

I tilstedeværelse og mængde af human hpG-CSF i vævsprøver I

I og i væskeformige prøver, såsom blod eller urin. DNA- I

I 5 produkter ifølge opfindelsen kan også mærkes med påvise- I

I lige markører, såsom radiomarkører og ikke-isotop mar- I

I kører såsom biotin), og anvendes i DNA-hybridiserings- I

I processer, så man kan lokalisere positionen for human I

I hpG-CSF-genet og/eller positionen af en hvilken som I

I 10 helst beslægtet genfamilie i et kromosomkort. De kan I

I og<5a anvendes til identifikation af uregelmæssigheder I

I vedrørende humant hpG-CSF-gen på DNA-niveauet og benyt- I

I tes som genmarkører til identifikation af nabostillede I

I 15 gener og deres uregelmæssigheder. I

I Polypeptidprodukter ifølge opfindelsen kan alene I

I eller kombineret med andre hæmatopoietiske faktorer el- I

I ler medikamenter være nyttige ved behandling af hæmato- I

I poietiske afvigelser, såsom aplastisk anæmi. De kan og- I

I 20 så være nyttige ved behandling af hæmapoietiske mangler I

I forårsaget af chemoterapi eller af stråleterapi. Chan- I

I een for, at en knoglemarvstransplantation lykkes, kan f. I

I eks. forstærkes, hvis man tilfører hpG-CSF. Behandling I

I med heling af brandsår og behandling af bakteriel for- I

I 25 årsaget betændelse kan også forstærkes ved tilføring af I

I hpG-CSF. Derudover kan hpG-CSF være nyttig ved behand- I

I ling af leukæmi, idet det er publiceret, at den er i I

I stand til at differentiere leukæmiceller. Welte, et I

I al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82,,1526-1530 (1985) I

I 30 og Sachs, se ovenfor. I

I Fagmanden vil, ved at læse følgende detaillerede I

I beskrivelse, som illustrerer udførelsen af opfindelsen, I

I i de for tiden foretrukne udførelsesformer, kunne se I

I adskillige aspekter og fordele ved opfindelsen. I

DK 175551 B1 9

Tegningen viser ét delvis restriktionsendonude-ase kort over hpG-CSF-genet forsynet med pile til belysning af strategien for sekvensering, som benyttes til opnåelse af den genomiske sekvens.

5 Ifølge opfindelsen har man isoleret og karakteri seret DNA-sekvenser, der koder for hele polypeptidse-kvensen i hpG-CSF eller dele deraf.

De følgende Eksempler skal illustrere opfindelsen og er især rettet på procedurer, der udføres inden iden-tifikation af hpG-CSF cDNA og genomiske kloner, procé-durer, der fører til en sådan identifikation og til sekvensering, udvikling af ekspressionssystemer, baseret på cDNA, genomiske og fremstillede gener og bekræftelse af eksprimering af hpG-CSF og lignende produkter i så-15 danne systemer.

Mere detailleret angår Eksempel 1 aminosyrese-kventering af hpG-CSF. Eksempel 2 angår fremstilling af et cDNA bibliotek til gennemsøgning for kolonihydridise-ring. Eksempel 3 angår fremstilling af hybridiserings-20 sonder. Eksempel 4 angår gennemsøgning for hybridise-ring, identifikation af positive kloner, DNS-sekvense-ring af en positiv cDNA klon og tilvejebringelse af information om den primære strukturelle konformation (ami-25 nosyresekvens) af polypeptidet. Eksempel 5 angår identificering og sekvensering af en genomisk klon, der koder for hpG-CSF. Eksempel 6 angår konstruktion af et fremstillet gen, der koder for hpG-CSF, hvori man anvender kodoner, der hører til E. coli.

30 Eksempel 7 angår fremgangsmåder til konstruktion af en E. coli transformationsvektor, der indeholder DNA, der koder for hpG-CSF, anvendelse af denne vektor til prokaryotisk eksprimering af hpG-CSF og analyse af egenskaberne af de rekombinante produkter ifølge opfindels-

I DK 175551 B1 I

I 10 I

I en. Eksempel 8 angår fremgangsmåder til fremstilling af I

I analoge af. hpG-CSF, hvori cysteinrester er erstattede I

I med andre passende aminosyrerester ved hjælp af mutagen- I

ese udført på DNA, der koder for hpG-CSF. Eksempel 9 I

I 5 angår fremgangsmåder til konstruktion af en vektor, der I

I indeholder DNA, der koder for en analog til hpG-CSF, I

I afledt fra en positiv cDNA klon, anvendelse af vektoren I

I til transfektion af COS-1 celler og dyrkning af de I

I transficerede celler. Eksempel 10 angår fysiske og bio- I

I 10 logiske egenskaber af opfinderiske og beslægtede rekom- I

I binante polypeptidprodukter. I

I Eksempel 1 I

I (A) Sekvensering udført ved litteraturbekendte frem- I

I 15 gangsmåder. I

I/ En prøve (3-4 pg, 85-90% ren SDS, sølvfarvning- I

I PAGE) af hpG-CSF blev opnået fra Sloan Kettering Insti- I

I tute, New York, New York, den var isoleret og renset I

I 20 ifølge welte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, I

I 1526-1530 (1985). I

I Den N-terminale aminosyresekvens i denne prøve af I

I hpG-CSF blev bestemt i et første forsøg ved mikrose- I

I kvensanalyse under anvendelse af en AB407A gasfase se- I

I 25 kvensoopdeler (Applied Biosystems, Foster City, Califor- I

I nia) til opnåelse af sekvensen, der vises i Tabel I ne- I

I denfor. I Tabellerne I-IV benyttes enkeltbogstavsko- I

I der, "X" betyder en rest, som ikke kunne bestemmes helt I

I sikkert, og rester angivet i parentes angiver mulighe- I

I 30 der. I

DK 175551 B1 11

TABEL I

1 5 10 15

K-P-L-G-P-A-S-K-L-K-Q- {G ,V, S) -G-L-X-X-X

5

Ved alle dele af det forsøg, hvis resultater gives i Tabel I, var der et højt niveau for baggrundsstøj til stede, et tegn på, at prøven indeholdt mange konta-minerende ingredienser, sandsynligvis kemiske rester 10 stammende fra rensningen. Sekvensen er kun givet af referencegrunde .

I forsøg nr. 2 benyttede man en anden prøve (5-6 yg, ca. 95% ren) fra Sloan Kettering som ved forsøg nr.

1, og man udførte sekvenseringen som ved forsøg nr. 1.

15 Denne prøve stammede fra det samme materiale, som blev benyttet til opnåelse af fig. 4 i Welte, et al., Proc.

Natl. Adac. Sci. (USA), 82, 1526-1530 (1985). Resultaterne gives i Tabel II.

20 TABEL II

15 10 15 20 T-P-L-G-P-A-S- (S) -L-P-Q- <S > -M- <L > -X-K- (R) -X-X- (R) - (L) -X- 1 2 3 4 5 6

Selvom man ved forsøg nr. 2 identificerede flere 2 rester, opnåede man ikke en tilstrækkelig lang sikkert 3 identificeret sekvens, hvorfra man kunne konstruere et 4 fornuftigt antal sonder til brug ved eftersøgning af 5 hpG-CSF DNA. Man beregnede, at man i det mindste skulle 6 bruge 1536 sonder, hvis an ved hjælp af sekvensen i Tabel II skulle isolere cDNA. Igen var kontaminering af prøven sandsynligvis årsag til dette.

Derefter fremskaffedes en tredie prøve (3-5 yg, ca. 40% ren) fra Sloan Kettering som ovenfor. Man op-

I DK 175551 B1 I

I 12 I

I delte denne prøve ved SDS-PAGE og underkastede den elek- I

I troblot i et forsøg på yderligere rensning. Sekvensana- I

I lyse af denne prøve gav ingen data. I

I 5 (B) Sekvensopdeling ved reviderede fremgangsmåder I

I Til opnåelse af en tilstrækkelig mængde rent ma- I

I teriale, hvorpå man kunne udføre en tilstrækkelig nøj ag-

I tig aminosyresekvensanalyse, tilvejebragte man celler I

I 10 fra blærecarcinomcellelinie 5737 (underklon 1A6), som de I

I fremstilles hos Sloan-Kettering, fra Dr. E. Platzer. I

I Cellerne blev først dyrket i Iscove's medium (GIBCO,

I Grand Island, New York) i småflasker til de flød sammen. I

I Derefter forsynede man dyrkningsmedierne med trypsin og I

I 15 podede dem i rulleflasker (1½ småflasker/flaske), der I

I hver indeholdt 25 ml forudbehandlet Iscove's medium un- I

I der 5% C02· Cellerne blev dyrket natten over ved 37eC I

I og 0,3 rpm. I

I Cytodex-l småkugler (Pharmacia, Uppsala, Sverige) I

I 20 blev vasket og steriliseret ved følgende fremgangsmåde. I

I Man anbragte 8 g småkugler i en flaske og tilsatte 400 I

I ml PBS. Man holdt småkuglerne i suspension, idet man I

I rystede blidt i tre timer. Man lod småkuglerne bund- I

I fælde, hældte PBS fra, rensede småkuglerne i PBS og til- I

I 25 satte ny PBS. Småkuglerne blev autoklaveret i 15 minut- I

I ter. Før anvendelse vaskede man småkuglerne i Iscove's I

I medium plus 10% kalvefosterserum (FCS), før man tilsatte I frisk medium plus 10% FCS til opnåelse af behandlede

I småkugler. I

I 30 Man fjernede dyrkningsmedium, bortset fra 30 ml I

I fra hver rulleflaske og tilsatte 30 ml frisk medium plus I

I 10% FCS og 40 ml behandlede småkugler til flaskerne. I

I Flaskerne blev gennemboblet med 5% C02, og man sugede I

13 DK 175551 B1 alle bobler bort. Man anbragte flaskerne 1 rulleanordninger ved 3 rpm tø time før man nedsatte hastigheden til 0,3 rpm. Efter tre timers forløb forsynede man yderligere en lille flaske med trypsin, og indholdet blev til-5 sat til alle rulleflaskerne, der indeholdt småkugler.

Når sammenflydningen havde nået 40-50%, vaskede man kulturen i rulleflaskerne med 50 ml PBS og rullede videre i 10 minutter, før man fjernede PBS. Cellerne blev dyrket i 48 timer i medium Ά [iscove's medium med 10 indhold af 0,2% PCS, 10”8M hydrocortison, 2 mM glutamin, 100 enheder/ml penicillin og 100 pg/ml streptomycin]. Derefter indhøstede man supernatanten fra kulturen, idet man centrifugerede ved 3000 rpm i 15 minutter og lagrede ved -70°C. Man tilsatte igen til kulturerne medium A 15 med indhold af 10% PCS og dyrkede i 48 timer. Dyrkningsmediet blev kasseret, hvorefter man vaskede celler-ne med PDS som ovenfor og dyrkede i 48 timer i medium A.

Man indhøstede igen supernatanten og behandlede den som tidligere beskrevet.

20 Man indkoncentrerede ca. 30 1 medium, der inde holdt 1A6 celler til ca. 2 1 på en Millipore Pellicon enhed, forsynet med to kassetter med afskæringer ved molekylvægt 10.000, idet man filtrerede 200 ml pr. minut og tilbageholdt ca. 1000 ml pr. minut. Koncentratet 25 blev diafiltreret mod ca. 10 1 50 mM Tris (pH 7,8) med samme apparat og samme hastigheder. Det diafiltrerede koncentrat blev med en hastighed på 40 ml pr. minut påsat en én liter DE cellulosesøjle, bragt i ligevægt med 50 mM Tris (pH 7,8). Efter påsætning vaskede man søjlen 30 med samme hastighed med en liter 50 mM Tris (pH 7,8) og derefter med to liter 50 mM Tris (pH 7,8) tilsat 50 mM NaCl. Søjlen blev derefter i rækkefølge elueret med seks 1 liter portioner 50 mM Tris (pH 7,5), der inde-

I DK 175551 B1 I

I 14 I

I holdt følgende koncentrationer af NaCl: 75 mM; 100 mM; I

I 125 mH; 150 mM; 200 mM; og 300 mM. Man indsamlede frak- I

I tioner (50 ml) og sammenbragte de aktive fraktioner, I

I som blev indkoncentreret til 65 ml på en "Amicon ultra- I

I 5 filtration stirred cell unit" forsynet med en YM5 mem- I

I bran. Dette koncentrat blev påsat en 2 liter AcA54 gel- I

I filtreringssøjle, bragt i ligevægt med PBS. Gennemløbet I

I var 80 ml/time, og man indsamlede fraktioner på 10 ml. I

I Aktive fraktioner blev sammenbragt og direkte påsat en I

I IQ C4 "high performance liquid chromatography" (HPLC) I

I søjle. I

I Prøver, hvis rumfang var 125-850 ml, og som inde- I

I holdt 1-8 mg protein, hvoraf 10% var hpG-CSF, blev påsat I

I søjlen med en gennemstrømningshastighed på 1-4 ml/min. I

I 15 Efter påsætning og en første vask med 0,1 M ammoniumace- I

I tat (pH 6,0-7,0) i 80% 2-propanol med en gennemstrøm- I

I ningshastighed på lml/minut. Man indsamlede 1 ml frak- I

I tioner og undersøgte for proteinindhold ved 220 nm, 260 I

I nm og 280 nm. I

I 20 Ved denne rensning blev fraktioner, der indholdt I

I hpG-CSF klart adskilt (som fraktionerne 72 og 73 ud af I

I 80) fra andre fraktioner, der indeholdt protein. Man I

I isolerede hpG-CSF (150-300 yg) af en renhed på ca. 85 ± I

I 5% og med et udbytte på ca. 50%. Fra dette rensede ma- I

I 25 teriale benyttede man 9 yg i forsøg nr. 4, en aminosy- I

I resekvensanalyse, hvor man påsatte proteinprøven til en I

I TFA-aktiveret glasfiberskive uden polybren. Man udførte I

I sekvensanalysen med en AB 470A sekvensopdeler ved frem- I

I gangsmåden ifølge Hewick, et al., J. Biol. Chem., 256, I

I 30 7990-7997 (1981) og Lai (Anal. Chim. Acta, 163, 243-248 I

I (1984). Resultaterne af forsøg nr. 4 vises i Tabel I

I III. I

15 DK 175551 B1

TABEL III

1 5 10

Thr- Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu -Pro-5 15 20

Gin- Ser - Phe - Leu - Leu - Lys -(Lys)- Leu -(Glu)-Glu- 25 30 10 Val- Arg - Lys - Ile -(Gin)- Gly - Val - Gly - Ala -Ala-

Leu -X - X - I forsøg nr. 4 opnåede man efter 31 gennemløb 15 (svarende til rest 31 i Tabel III) ingen yderligere signifikant oplysning om sekvensens forløb. Til opnåelse af en længere tydelig sekvens i et femte forsøg reducerede man 14 yg hpG-CSF oprenset fra behandlet dyrkningsmedium med 10 ]il β-mercaptoethanol i en time ved 45°C, 20 hvorefter man tørrede grundigt under vakuum. Proteinresten blev genopløst i 5% myresyre og påsat en polybren-behandlet glasfiberskive. Sekvensopdelingsanalysen blev udført som ved forsøg nr. 4 ovenfor. Resultaterne fra forsøg nr. 5 gives i Tabel IV:

I DK 175551 B1 I

I 16 I

I TABEL IV I

II 5 10 I

I Thr- Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu- Pro- I

I I

I 15 20 I

I Gin- Ser - Phe - Leu - Leu - Lys - Cys - Leu - Glu- Gin- I

I 25 30 I

I Val- Arg - Lys - Ile - Gin - Gly - Asp - Gly - Ala- Ala- I

I 35 40 I

I Leu- Gin - Phe - Lys - Leu - Gly - Ala - Thr - Tyr- Lys- I

I 15 45 I

I Val- Phe - Ser - Thr -(Arg)-(Phe)-(Met)- X- I

I Aminosyresekvensen i Tabel IV var tilstrækkelig I

I lang (44 rester) og nøjagtigt bestemt, at man derfra I

I 20 kunne konstruere sonder til opnåelse af hpG-CSP cDNA som I

I beskrevet nedenfor. I

I Eksempel 2 I

I Blandt standardfremgangsmåder til isolering af I

I 25 relevante cDNA sekvenser findes en fremstilling af plas- I

midbaserede cDNA "biblioteker", afledt fra revers tran- I

skription af mRNA, der findes i donorceller udvalgt på I

I basis af deres eksprimering af et udvalgt gen. Når man I

kender væsentlige dele af aminosyresekvensen af et be- I

I 00 stemt polypeptid, kan man benytte mærkede, enkeltstren- I

I gede DNA sondesekvenser, der duplikerer en sekvens, som I

I man antager findes i det relevante cDNA ved en DNA/DNA I

I hybridiseringsprocedure, som man udfører på klonede ko- I

17 DK 175551 B1 pier af cDNA, som er blevet denatureret, så det forekommer på enkeltstrengsform. Weissman, et al., US patent nr. 4 394 443; Wallace, et al., Nucleic Acids Res., 6, 3543-3557 (1979), og Reyes, et al., Proc. Natl. Acad.

5 Sci. (USA), 79, 3270-3274 (1982), og Jaye, et al.,

Nucleic Acids Res., 11, 2325-2335 (1983). Se også US patent nr. 4 358 535, Falkow, et al., angående DNA/DNA hybridiseringsprocedure ved diagnose; og Davis, et al., "A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial 10 Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980) siderne 55-58 og 174-176 angående teknikken for koloni og plaquehybridisering.

Man ekstraherede al RNA fra ca. 1 g celler fra en blærecarcinomcellelinie 5637 (1A6) under anvendelse af 15 guanidiniumthiocyanat til kvantitativ isolering af ubeskadiget RNA. [Chirgwin, et al., Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)].

Den sterile vandige RNA opløsning indeholdt al RNA fra IA6 cellerne. For tilvejebringelse af messenger 20 rna alene ud fra opløsningen af total RNA lod man denne opløsning passere en søjle, der indeholdt oligodesoxy-thymidylat [oligo(dT)] (Collaborative Research, Inc., Waltham, Massachusetts). Poly-adenylerede (poly-A+) endestykker, der er karakteristiske for messenger RNA, 25 bindes til søjlen, hvorimod ribosom RNA elueres. Som et resultat af denne fremgangsmåde kunne man isolere ca. 90 yg poly-adenyleret messenger RNA (poly-A+ mRNA). Det isolerede poly-A+ messenger RNA blev forbehandlet med methylkviksølvhydroxid (Alpha Ventron, Danvers, Massa-30 chusetts) ved en slutkoncentration på 4 mM i fem minutter ved stuetemperatur før anvendelse i en cDNA reaktion. Behandlingen med methylkviksølvhydroxid denaturerer vekselvirkninger med messenger RNA, både internt

I DK 175551 B1 I

I I

I og med kontaminerende molekyler, som blokerer transla- I

I tion. Payvar, et al., J. Biol. Chem., 258, 7636-7642 I

I (1979). I

I Ifølge Okayama-fremgangsmåden [Okayama, et al,, I

I 5 Molecular & Cellular Biology, 2, 161-170 (1982)] frem- I

I stillede man en cDNA bank, idet man benyttede mRNA, op- I

I nået fra IA6 celler. Man transformerede cDNA, idet man I

I inkuberede i en værtsmikroorganisme E. coli K-12 stamme I

I HB101 til forøgelse af mængden. I

I 10 I

I Eksempel 3 I

I Hybridiseringssonder, konstrueret på basis af den I

I terminale aminosyresekvens for hpG-CSP ifølge Tabel IV, I

I bestod af et sæt af 24 oligonucleotider, hver med en I

I 15 længde på 23 baser og med et indhold på tre inosinre- I

I ster. Sondeoligonucleotiderne blev fremstillet ved I

I fremgangsmåden Ifølge Caruthers, et al., Genetic I

I Engineering, 4, 1-18 (1982) og mærket med y-32P ATP, id- I

I et de blev kinaseret med polynucleotidkinase. Sondeoli- I

I 20 gonucleotiderne, der svarede til messenger RNA for re- I

I sterne 23-30 i sekvensen i Tabel IV, illustreres i Tabel I

I V: I

I TABEL V I

I 25 I

I hpG-CSF sonder I

I 5’ GC IGC ICC *TC ICC TTG GAT TTT3’ I

I 30 Antagelsen af neutralitet for I-baserne var base- I

I ret på offentliggjorte arbejder af Takahashi, et al., I

I Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1931-1935 (1985) og I

I Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem., 260, 2605-2608 (1985). I

19 DK 175551 B1

Inosin kan imidlertid have en destabiliserende effekt, hvis det baseparres med G eller T. Hos Takahashi, et al., synes inosiner at besidde en neutral effekt, fordi de som gruppe i gennemsnit opnår næsten neutralitet 5 (f.eks. hvis tre med fordel parrer med C, og to ikke med fordel parrer med T).

Til afprøvning af virkningen af baseparring mellem I og G konstruerede man kontroleksperimenter ved hjælp af en N-myc gensekvens og klon. Sekvensen, der 10 var udplukket fra N-myc genet, havde samme total indhold af G og C ved de første to stillinger i hvert kodon, som var bestemt for hpG-rCSF sonderne. N-myc prøvesonderne var af samme længde, indeholdt I i samme relative stillinger og havde potentielt samme gennemsnitværdi for Tm 15 (62-66°C, idet de tre eller fire inosinrester, der fandtes, ikke blev talt med) som hpG-CSF sonderne.

Man konstruerede to grupper N-myc prøvesonder ved fremgangsmåden ifølge Caruthers, et al., se ovenfor.

Sæt I, som illustreret i Tabel VI, inkluderede: 1, en 20 23 mer med fuldstændig tilpasning; 2, i hvilken tre tredie-positions C'er var erstattet med I'er under dannelse af det værst mulige tilfælde ved tilsætning af I; og 3, i hvilken fire tredie-positions C er var erstattet med I'er. Den anden gruppe testsonder var konstrueret, 25 så den repræsenterede en mere tilfældig fordeling af inosinbasepar, hvorved man kunne opnå en baseparrende virkning, der i gennemsnit var neutral. Sæt II, som illustreret i Tabel VI, inkluderede; 4, med indhold af to I'er, der vil danne basepar med C og I med G; og 5, 30 identisk med 4, idet der er tilsat et yderligere I:G basepar.

I DK 175551 B1 I

I 20 I

I TABEL VI I

I 1. 5' CAC AAC TAT GCC GCC CCC TCC CC3' I

I 5 2. 5' CAC AAC TAT GCI GCC CCI YCI CC3' I

I 3. 5* CAI AAC TAT GCI GCC CCI TCI CC3' I

I 4. 5' AAC GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3' I

I 10 I

I 5. 5' AAI GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3' I

I Fem replikafiltre, der indeholdt N-myc DNA se- I

I kvenser og sekvenser fra DNA fra kyllingevæksthormon I

I 15 (gom en negativ kontrol), blev ophedet i to timer ved I

I 80°C i en vakuumovn før hybridiseringen. Alle filtre I

I blev hybridiseret som beskrevet i Eksempel 4 for hpG-CSF I

I sonderne, med undtagelse af at hybridiseringsperioden I

I kun var seks timer. Filtre blev vasket tre gange ved I

I 20 stuetemperatur og en gang ved 45°C, 10 minutter hver I

I gang. Filtrene blev kontrolleret med en Geigertæller. I

I Filteret, der repræsenterede en N-myc sonde 3, I

gav et meget svagt signal i forhold til de andre fire I

filtre med sonder og blev ikke vasket yderligere. Efter I

I 25 ti minutters vask ved 50°C gav Geigertælleren følgende I

I procentiske signal, idet sonde 1 sættes til 100%; sonde I

I 2 20%; sonde 3 (45°C), 2%; sonde 4 92%; og sonde 5 75%. I

I Efter vask ved 55eC var procentværdierne: sonde 2 16%; I

I sonde 4 100%; og sonde 5 80%. En sluttelig vask ved I

30 60°C gav følgende procentværdier: Sonde 2 1,6%; sonde 4 I

I 90%, og sonde 5 70%. I

I Således observerer man under tilstedeværelse af I

I tre I'er, som i sonderne 2 og 4 en op til 60-gange så I

21 DK 175551 B1 stor forskel i signal, når man nærmer sig den teoretiske værdi for Tm (I ikke inkluderet i beregningen) [baseret på det værste tilfælde for baseparring med I (sonde 2) og et relativt neutralt tilfælde med baseparring med I 5 (sonde 4)].

De standardiseringsoplysninger, som man indvandt ved N-myc prøvehybridiseringerne, blev udnyttet, når man skulle vaske og kontrollere hpG-CFS hybridiseringen som nedenfor til at vurdere, i hvor høj grad man kunne have 10 tillid til resultaterne, når man benyttede en mindre ' stringent vaskeprocedure.

Eksempel 4

Ved fremgangsmåden ifølge Hanahan, et al., J.

15 Mol. Biol. 166, 557-580 (1983) udspredte man bakterier, der indeholdt rekombinanter med cDNA indsætningsstykker, som fremstillet i Eksempel 2 på 24 nitrocellulosefiltre (Millipore, Bedford, Massachusetts), anbragt på agarplader. Man inkuberede derefter pladerne til opnåelse af 20 ca. 150 000 kolonier, som blev replikaplattede på 24 andre nitrocellulosefiltre. Man inkuberede replikafiltrene, indtil man opnåede adskilte kolonier. Bakterierne på filtrene blev lyserede på Whatman 3 MM papir, der var næsten mættet med natriumhydroxid (0,5 M) i ti minutter 25 og derefter plettet med Tris (1M) i to minutter, hvorefter man plettede med Tris (0,5 M) med indhold af NaCl (1,5 M) i ti minutter. Når filtrene var næsten tørre, lod man dem opvarme i to timer ved 80°C i en vakuumovn, før de skulle hybridiseres med nucleinsyre. [wahl, et 30 al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76, 3683-3687 (1979)] ; og Maniatis, et al., Cell, 81, 163-182 (1976).

Man forhybridiserede filtrene i to timer ved 65eC i 750 ml 10 x Denhardt, 0,2% SDS og 6 x SSC. Man

I DK 175551 B1 I

I 22 I

I rensede filtrene i 6 x SSC og anbragte dem fire sammen, I

I hvorefter man hybridiserede 14 timer i 6 x SSC og 10 x I

I Denhardt. Der var ca. 15 ml opløsning i hybridiserings- I

I beholderen med indhold af 50 x 106 cpm af 32P-mærket I

I 5 sonde (oligonucleotider). I

I Efter hybridisering vaskede man filtrene tre I

I gange i 6 x SSC (1 liter/vask) ved stuetemperatur, 10 I

I minutter hver gang. Man vaskede filtrene to gange ved I

I 45*C i 15 minutter, en gang ved 50°C i 15 minutter og en I

I 10 gang ved 55eC i 15 minutter, idet man benyttede l liter I

I 6X SSC hver gang. Man autoradiograferede filtrene ved I

I -70'c i to timer under benyttelse af en forstærkende I

I skærm og Kodak XAR-2 film. På denne autoradiograf var I

I der 40-50 positive signaler, deriblandt fem meget kraf- I

I 15 tige signaler. I

I Arealet, der indeholdt de stærkeste fem signaler I

I og yderligere fem positive signaler, blev skrabet fra I

I udgangspladerne og igen udplattet for en anden gennem- I

søgning ved hjælp af samme sondeblanding og samme betin- I

I 20 gelser. Vaskningen afveg, idet man vaskede ved høj tem- I

I peratur to gange ved 55°C i 15 minutter, og en gang ved I

I 60eC i 15 minutter. På baggrund af studiet af N-myc I

I sonden i Eksempel 3 satte man slut vasketemperaturen I

I i den anden gennemsøgning i vejret, idet det kombinerede I

I 25 smeltepunkt for de 24 23-mere var $0-68°C, som i N-myc I

sonderne. Umiddelbart efter den anden vask ved 55°C lod I

I man filtrene autoradiografere i fugtig tilstand. En I

sammenligning af denne autoradiografi med en anden auto- I

I radiografi, optaget samme tidspunkt efter slutvasken ved I

30 6o°C, viste at kun to af de ti afprøvede kloner ikke led I

et kraftigt tab i signalstyrke, når man forøgede tempe- I

I raturen fra 55-60eC. Man kunne senere vise, at disse to I

I kloner var af næsten identisk længde og besad næsten I

23 DK 175551 B1 samme mønster for restriktionsendonucleaser. Man udvalgte en klon, betegnet Ppo2, til sekvensopdeling.

Man udførte sekvensopdelingen af den rekombinante hpG-CSF cDNA klon Ppo2, opnået ved den ovennævnte frem-5 gangsmåde ved didesoxymetoden ifølge Sanger, et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74, 5463-5467 (1977). M-13 strengen med enkeltstrenget DNA blev benyttet som kloningsvektor og leverede enkeltstrenget DNA skabeloner til de dobbeltstrengede cDNA kloner. Sanger, et al.

10 fremgangsmåden gav den sekvens, der vises i Tabel VII sammen med den tilsvarende aminosyresekvens og en komplementær streng i den region, der koder for polypep-tid.

,1»

I DK 175551 B1 I

I 24 I

I O Eh C COO 3ϋϋ ΟΟϋ W O O W < PH I

W O O M < Eh M C £H klUO NC Eh JCCJO I

AOO OOO UUU AOO Eh Eh C Eh < E* I

I >iUU 0)0 0 OUO «O O 300 0,0 0 I

M O O M M Eh C WOO >lOO UH< 0) < S I

O O O m m C Eh A O O O Eh C kJ O O COO I

I 3 OO <1 0)0 O 0)00 UOO OIOO 300 I

S «> Eh C NC Eh m C E* 0)0 0 4S Eh C 0) EH <

jf iJ O O kJ C Eh SOO W C E« A H «2 *A ί* C

I δ ooo croo moo woo 3eh c woo I

Γ. WOO WOO NO O 0)00 0) EH 3 42 0 0 I

zL A O O C C Eh U Eh C W C Eh kJ O O Eh C £

I S HWOO MOO 300 300 NOO OOO I

I g +4200 m Eh C 4) Eh C ft) H < HUU WOO I

I § EHHiEH >00 hJOO kJOO OOO A O O I

I S <000 cceh moo 000 woo ©nehc I

I g HOW © M C Eh O NC Eh OwOO O 0) O O OMOO I

I O -H<OOfMOOO HTJ*iEHVOAOOC0W*iEHHOOO

I R 3 < Eh 300 WOO m Eh C m Eh C 300 I

I g h2eh H<£h NC E* MOO -H < Eh C) p 2 I

I g OOO OOO Eh Eh < COO SOO .J Eh C

I S COO 3<EH WOO 0,0 0 300 3 00 I

S rn ·-* < fH ft) EH < 42 0 0 WOO ® Ε-» C m C Eh

> O OOO kJEH< Eh < Eh Eh Eh C JUO OOO

I S moo moo moo ooo c c eh ooo I

I , g to EH C NO O MOO WOO m 2 Eh woo I

Μ o >00 O Eh 41 COO AOO OOO AOO I

I w R W < EH moo m£H< OOO WOO wOO I

I m g 42 Ο O NC Eh NO Ο M Eh < OOO OOO I

I ® . g Eh C Eh iJ < Eh O Eh C H C Eh W < Eh CO Eh C I

I < 52 0,0 0 300 300 NOO 300 OOO I

g WOO OEH«i O Eh < MOO O EH < M Eh 3 ** g Eh Eh < kJOO kJOO OOO kJEH< m C Eh

I $2 300 300 moo 300 moo no ο I

I Mg O EH < ft) Eh C NC Eh ft) Eh C >ιϋ O MOO I

Mg kJOO kJOO kJ C E· kJOO OEh< ooo

I όΗ (0 < Eh μ 0) ο O 300 h Eh 4 NO O 3 C E· I

C 3 MOOC 42 Eh C M < Eh 0)0 0 MOO m 3 Eh

Mg COOm A Eh 3 OOO OT E· C OOO OOO

I y! W Eh < SI w u O COO mOO m C E* 300 I

3 0)00 0)00 MCE· μ<Εη μΟΟ ΦΕη·4;

I 3 w C eh MCE* OOO SOO COO kJOO

I P omoo COO 300 NC EH 300 HQOO I

Γ Μ·Η<ΕΗ m C E· ft) Eh C MOO ft) Eh C moo I

I g ISOO OOO kJOO OOO kJOO coo

I 3 ao o ooo moo coo coo coo I

**· WOO OWOO OMOO o ft) EH c Ο m c Eh ο μ < Eh I

I EhEh< mAOO n<WO miJOO r^OOO <λ Ο Ο Ο I

I . 300 300 mCEn 300 300 300 I

m Μ Φ Eh C ft) Eh C MOO ft> Eh C 0) Eh 4 ft) Eh C

I m MkJOO kJOO COO kJOO kJOO iJ o o

I woo NO o MOO moo 300 I

I moo moo mine moo v e· c

I W Eh 4 OOO >00 COO kJOO

I WOO OiEh c 300 COO NO Ο I

moo W C Eh ft) Eh C m C Eh mOO I

w c eh coo kJoo ooo ooo I

I moo NO O 300 woo coo I

I MOO MOO MCEh 0)00 m C Eh I COO OOO OOO UCEh ooo 25 DK 175551 B1 >,tfti C U U kOO O O O o o o HUU π tf Ei >itf Ei f O tf tf O tf

OOO OOO Ei f tf tf O O tf U O

aoo α» o o huu f tf p o o o ajtitf js η «i tuop Ei < < o o o .JUO 0.|h< CO £i tf Ei O t· tf tf t· a tf t· «β e« tf πϋϋ tf tf p t; o o nUO « f tf t· O Ei tf Ei E« ooo tfOO >00 O O O tf tf o

3 C tt κ f tf 300 f tf O tf O O

H tf ti «00 r-l < f tf o p t« ta < C) o U »Eitf OOO O tf Ei O O o uoo to υ o apu u tf o o ti ei IV f <4S HUO tu ti tf U O O tf O tf

Stft· tfOO JOO f O t· E-t < E-i ©COO°®OOotUUU 4! o o < u o rsrHtfti *· £ f tf »©£titf U tf ti O O tf

« HUUO HOiEi< O O ti tf O O

COO (QUO KOO O 4: tf t· O 4! m ri 4! ti rtuo <UOU O O O O ti o 5 OOO tfOO W 4! H t! tf El O tf Ei n DlOU ooo C oo O tf ti 4: tf ti «2 KOO κ O O ri c El O <2 El o o o

Z ti f 4! 0.00 OOO O f O O O O

QJOO u O O 3 0 0 O t! 4! O El O

H rH t· 4! 0> f tf Q>f< tf El P El O tf H s tf El JOO 2 tf t· O El o

^ κ O O (Q O O tfl t« tf O El O tf O O

£00 rtoo -H 4; El O tf El O O O

j f tf Ei 4:oO 0300 O O Ei O O ti

Μ KOO >it< KOO < ti El El El El O

£ O O rt O O (UOO AOU O tf O O O

OQ f tf f OOO 03 Ei < O t· < O O O 0 4!

iQ O O COO (O O O vOOO O O O O O

rt O O ntfEI n O O r* κ O O «£ t< O O O

^ 4300 OOO tfOO HftUU tf O Ei tf O

V ti tf KOO Ή t· tf COO Ei O tf O O

£ El tf £ O O (O Ei tf Π tf Ei f O O O f

O. El tf t* tf El >00 OOO H El O O O

0.00 OOO 300 (OOO tf t· O O O

OJ tf f KOO 0) El tf rtoo Ei O t· t· O

tfOU P. O O J O O tf O O O O O O tf

(QUO COO rlOO 3 Ei tf El Ei O O O

ΠΟΟ n tf El tO El tf tU Ei tf O O El t· f

tfOO OOO >00 JUO t· f O O O

O ri O O 0300 o >iO O O« OO tf O El tf O

rt (0 El tf m Cl El tf I/IHOO r* tf f Ei t* O O £i

rl>OU HJOO rt O O O rlfflOO t» O O t« O

„ 0.0 0 (OOO PitfEi OOO tj El tj tf p 0) tf El ri O O rtoo KOO tf O O Ei Ei

tfOO tfOO OOO tf O O H O O O O

300 Oftf (O tf Ei =* «C tj tf 03 tf tf O

0) Ei tf KOO rtOO Φ Ei tf tf O u tf Ei O

JUO Λ O O tf O O J O O Ei tf CO tf t· O

COO (OOO OO O rt Ei tf Ei O tf tf O

ri tf H rtoo KOO IQ El tf El O tf El tf

OOO tfOO tfOO >00 tf O O Ei O

3 00 UOO O'O O OOO El O tf El El tU Ei tf at t< tf KOO KOO o o o tf o JUO £ tf El tfOO tfOO El tf El El El «

I DK 175551 B1 I

I 26 ' " I

I H 4 H 4 O O I

Η P 4 O 4 4 I

o h 4 4 o o

I 000400 I

η h o o 4 h I

o o 4 o o o I

I -· o o o o o o I

o o o o o h η η o η o h

I O E* H O O O I

H O O 4 O O

4 o o o h o I

I o o o η o h I

O O O Η O H

O Η Η Η O H I

I 0 4 0 0 0 4 I

Η O ϋ O H O I

— η o o h o 4 I

I <o o h o 4 o o I

æ H o o o 4 o I

*J O O H 4 O H I

I o 4 U 4 O 4 O I

«w O O O O O O

o o o o o o I

I 4 O O Η O H I

· Η O O < H O O I

H 4 O O Η H O

I > 4 4 O H O 4 I

400000

j Eh 4 H 4 O O

I u h o o o o o I

I H o O 4 H 4 I

ffl 4 H 4 4 O O I

I 4 Η O O H O O I

4 4 4 H O O

Η 4 O O O H O I

I Η O O H O O I

Η O O Η H 4 I

Η O O O Η H I

I 04HHHH I

H U O Η Η H

O Η O Η Η H

I O O 4 Η O Η I

O O O Η Η O I

H O 4 O O H

I 400 000 I

4 Eh o Η H 4 I

404000 I

I O H 4 Η Η H I

I 400400 . I

4444 HH

I 000 000 I

4 HOO O 4 I

O O H O 4 O I

I 400000 I

00OHO4 I

000000

I O 4 O O 4 H I

HOOHOO I

OOOHHO I

i I

27 DK 175551 B1 < o < Eh < u o < eh o o o

Eh E-i o o eη o o o

Eh u o h o o OM E-·

0 3 O

xi < W < u o < ^

Eh U U ^ ~ o < o °

* < fr- o S

2 o υ o 1 u e· < o “ o < υ e- * £ < o eh Λ o o o 13 H < O Eh .

> 0.00 {i

O < < S

J < u < § o Eh 2 Λ ' M < Eh Eh O 7 « S ^ $ 7 7Γ « 5 s S ss .*· s s g s i O o O % o o o < Λ '2 O EH o 5 < o EH ** 5 O O EH >· 2 O O O næ

Eh O < m U

O Eh o X M

* » * S M

< Eh O Λ >

8 S 5 g S

, O O EH 7 e> O O O Λ

Eh Eh £h S Ih O O Eh C? «S*

O < O

O < <

o o O

O o EH

I DK 175551 B1 I

I 28 I

I De følgende karakteristika for sekvensen i Tabel I

I VII bør bemærkes. I 5'enden af sekvensen vises baser, I

I der svarer til, hvad man finder i en poly G cDNA sammen- I

I binder. Derefter findes ca. fem baser (betegnet "N"),

I 5 hvis sekvens ikke kunne bestemmes nøjagtigt ved Sanger, I

I et al. fremgangsmåden på grund af den lange G sekvens, .1 I der kommer umiddelbart forud. Sekvensen, der følger,

I udviser en serie af 12 kodoner, der koder for en del af I

I en antagen ledersekvens for polypeptidet. På basis af I

I korrespondens med den terminale aminosyresekvens i na- I

I turligt isoleret hpCSF, beskrevet i Eksempel 1, er den I

I første threoninrest i den antagne "færdige" form for

I hpG-CSF betegnet med +1. Derefter ses det, at færdig I

I hpG-CSF omfatter 174 aminosyrerester, som vist. Efter I

I 15 "stop" kodonet (OP kodonet, TGA) forekommer omtrent 856

I baser, der tilhører en ikke translateret 3' sekvens og I

I en række A’er i poly A "halen". Unikke HgiAi og Apal I restriktionsendonucleasesteder, så vel som to Stul ste- I der (diskuteret nedenfor i forbindelse med konstruktion

I 20 af et procaryotisk og eucaryotisk eksprimeringssystem) I

I vises også i Tabel VII. Da der ikke findes asparaginre- I

I ster i polypeptidet, er der tilsyneladende ingen posi-

I tioner, hvor man kan N-glycosylere. De understregede I

I seks baser nær ved enden af den 3' ikke-translaterede

I 25 sekvens repræsenterer et muligt polyadenyleringssted. I

I Man bør bemærke, at begge de to yderligere cDNA

I kloner, identificeret ved hybridiseringsfremgangsmåden I

I beskrevet ovenfor ud af total 450 000 kloner, ikke in- I

I kluderede DNA, der kodede for hele leader-sekvensen fra ' I

I 30 transkriptions-initieringsstedet og fremad. Alle tre I

I hpG-CSF kloner terminerede faktisk 5' regionen på nøj ag- I

I tigt samme sted, et tegn på at den sekundære struktur i I

I det transkriberede mRNA i alvorlig grad hindrer dannel- I

29 DK 175551 B1 sen af cdna hinsides dette sted. I praksis ville derfor en cDNA eksprimeringsscreening, som beskrevet hos Okayama, et al.. Mol. and Cell. Biol., 3, 280-289 (1983) og som blev benyttet til at Isolere GM-CSF hos Wong, et 5 al., Science, 228, 810-814 (1985) uden videre ikke være benyttet til isolering af hpCSF DNA, da sådanne isoleringssystemer almindeligvis er afhængig af tilstedeværelsen af transkriberet cDNA i fuld længde i de kloner, der bliver undersøgt.

10 Den ovenfor nævnte sekvens er ikke direkte i stand til at sikre direkte eksprimering af hpG-CSF i en mikrobevært. Til opnåelse af en sådan eksprimering skal hpG-CSF koderegionen forsynes med et initial ATG kodon og sekvensen skal anbringes i en transformationsvektor i 15 en position, hvor det kontrolleres af en passende promo-tor/regulator DNA sekvens.

Eksempel 5 I dette Eksempel benyttede man cDNA, der kodede 20 for hpG-CSF som isoleret i det foregående Eksempel til at gennemsøge en genomisk klon. Et phag λ menneskefosterlever genomisk bibliotek [fremstillet ved fremgangsmåden ifølge Lawn, et al.. Cell, 15, 1157-1174 (1978) og opnået fra T. Maniatis] blev gennemsøgt ved hjælp af en 25 haktranslateret sonde, bestående af to hpG-CSF fragmenter, isoleret ved fordøjelse med HgiAI og Stul (HgiAI til Stul, 649 basepar; Stul til Stul, 639 basepar).

Ialt ca. 500 000 phager blev udplattet på 12 (15 cm) petriskåle, og de dannede pletter blev udtaget derfra og 30 sondehybridiseret ved hjælp af Benton/Davison fremgangsmåden [Benton, et al., Science, 196, 180 (1977)]. Man observerede ialt 12 positive kloner. Tre kloner (1-3), der gav det stærkeste signal ved autoradiografi i en

I DK 175551 B1 I

I 30 I

I anden gennemsøgning, blev dyrket i 1 liter kulturer og I

I afbildet ved fordøjelse med restriktionsenzymer og Sou- I

I them blot under anvendelse af en radiomærket 24-mer I

I oligonucleotid (kinaseret med y-32p ATP) I

I 5 5 *CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG31. Afbildingsresultaterne vi- I

I ste, at isolaterne 1 og 3 var identiske, og 2 indeholdt I

I 2000 yderligere baser 5'stillet til hpG-CSF genet. Der- I

I for benyttede man klon 2 til yderligere karakterisering. I

I Man fordøjede DNA fra klon 2 med RI til frigivelse af et I

I 10 8500 bp fragment med indhold af hpG-CSF, dette blev der- I

I efter underklonet i pBR322 og yderligere underkastet af- I

I bildning ved hjælp af fordøjelse med restriktionendonuc- I

I leaser, Southern Blot, Ml3 underkloning og sekvensopdel- I

I ing. Den opnåede sekvens vises i Tabel VIII. I

31 DK 175551 B1 O O O O o o o o o o o o o o η «Ν «*i « in io r* U U U Η X 4 H J u U O U O O U U 3 p U 4 U O u U H « p e« υ u o o. u P j cj

P O 4 O u U O CO

u o 4 ε* οι o - u h 4 4 O U 4 «4 u o o U p U U CO U «O 3 p u P §« u h 4 u h « g«

POÉ-IH O O Η I iJ U

P Q P U u U 4 <0 o

O O P U C. O O HU

Ο Η H O E« 4 O O

4 υ P o <o o p < U U H < HU Q u Η O H U 4 P P u UOUU op u o 4 4 O U w U O o o u 4 h eu u o l·* O El u U >1 < o o O H 4 U H o O E-t 5 S i i: 3 g S g 4 o υ η h o < o

0 0 0 4 4 0 U O

4 O U 4 o JJ O 4 U

O O H E« « » H o u

O O Η O I X 4 P U

O E* P o u p o 4 U U 4 U P 4 O H 4 u u o p

4 U 4 U 4 p P

M O 4 4 U o P U

Γ1 4 CJ 4 O 4 U U

□ u40o u o e«

0 4 4 0 U O U

> 4 4 U E-> O* 4 E*

O U H O 4 O P

4 E-t E« U U O P

υ η h e* u o 4

U O 4 O o 4 O

ω P E« 4 4 U O O

w P O U H O O 4

mUH4H 4 p U

“ E< E« U U U P 4 .OOUU U 4 4 «« 4 E« H O U U p

4 U H 4 O O O

E-IU044 4 O O

O 4 P E« U H 4

U U 4 U O O M

U E« O 4 H U O

U H 4 H U U O

U O U E- U O E-i

U E< H 4 O H O

SH 4 e 4 U O

HUE« O U 4

U U O O O O O

4 U 4 4 - U U E-·

U O U 4 U U U

4 4 0 0 U O U

0 0 4 0 O 4 O

O H 4 O 4 O O

4 O 4 H U 4 O

4 O U U 4 O 4

4 O E« U 4 O O

U U O H 4 O 4

O O U 4 4 H O

0 4 4 4 U 4 U

O U O 4 U O U

O E-t O H U O U

4 4 0 4 U 4 U

O H O U O U E-«

4 U 4 O O U P

O H 4 H O U P

O O U Η H O O

4 O O H U O 4

4 0 0 4 O §* U

4 0 0 4 4 6* U

U 4 O 4 O U U

U U O U 4 H 4

U U O U H O U

Η H 4 4 U Η P

4 E-t O U U O O

4 U H 4 U 4 4 O O E-t O U O 4 4 U H O U H 4 P O O E« O O E-t

P O 4 E« O 40 P

E-* E-t O U O co H O 4

UOOH 4 H <U H O

OUOO 4 1X4 O

O E-t 4 H 4 30 O

4 U 4 E-> Η «Η O

U O O 4 4 JO E-t 4 O O U E«oao 4 0440 O fs >, 4 4

O U O E« Η I J 4 O

O 4 O U 4 J-t O O

OUOU E-t » Et O

I DK 175551 B1 I

I 32 I

I o o o o I

o o o o o os O O O r-t fM ri

CO A H p4 Η Η I

I Q I

>U(9UHuau

O C <£ U U O O n O

y «« u u t· S

I yU«UU<OU

3y<UOUwU

>h< f < o u a u

I ου υυπυαυ I

? < o y o u <-· f

U t· O O O U >i O

»o < u < u η ϋ * o o o o « o o u t· o u < u s o · a u U H U U 0) p u<tio<owti

3U U<OU0>O

at· u u < o to ti uuuuo<au 3 0 U U t· O -w <

OJttUCUUWU I

I ουο3Ρ«>.< au <. o u < ^ u

£t«<U UUOO

ft t· O U U U O 3 U

>- U u fri U U man au o u o u u u -j W < < U U U 3 o

t, CU O U O U Φ H

I m * < U S < < O U

I °} uu e 3 3 u ·~ι o I

-t-* OOU UUUU ro t· I H 14 U tr u u < > o

I 0 A U UUUU 3U

4-1 3 0 UUUOVt·

I ·— a H O H < U U U

J U U U «£ U 30 w, U < o 3 u ή < I μ „ϊ U y « o t· u u I E »i t; < u < u 3 u I E -H pOO<r-l< .

r1 au ti ti o o u u I > w< ou«<ou

<0 U UCUUUU

I Ί u u u f <t ft u U <U t< U Eh u « u I O E* O 4 4 U "< 4

H u U O O U 4 SI U

I ft u 4 u < u au I ta >i y o 4 u 4 >, u n Ή O E-I El t* < U f

^ UU O f 4 4 3 O

<> au 4 4 U O a t·

„ Φ t· O t· O U »4 U

E-I UU t! is U U O O u I o u u < «< o » >. *< uUu13UUU4U4

ftUmaif CUU MU

^ O U U O H O >1 < +.COaOUOOE*ti

t* 4 :* 4 u 4 4 W.U

I -lflUU<6-iUOjCU

I i u s u 4 o u t< 4

I <Ur-l-iUUtl<eU

I 3<UU<ti«C-4U

I -H4 eou4U40 υυ«-Η<υυ<ΌαΕ-ι

CU UU U U U ri >1 U

I <-«4 3U4 0UUt· I oua>ti<ti<o I I-IUUUUUU 4

10 El O (0 o U O O U

I >O nrHU f O O U

I »-<<uut'tu I x:yiQ<tiuuu I E-I < r-ι u U U U f I OtU<UUUU < '

I up>.UtiU*<U

I Eiti^O*C<iUU

I 3 u y u u u < t· I aE-iD.E-irfU<f I uym<iuuu

I <0<<UUUt*U

I r-ι u >, U U ti U E-I

I <UrHUUU<<

I ufUUUU<U

I a u c o o H u u ' I co<>h<<uu< I ocnuuuu<< u I rH--i<auuuo t· I i m u rn t- e c <; u I 0tUM<UUU<

I ^UaU4U<U

I t»ti>,rf<2uuti

I 3UU<UUUU

I aHcroufUti

I JUuOE-iOUU

I 3u<<cuc< I aE-ir-iuutiUu 33 DK 175551 B1 O O O O o

O O O o O

in vo r- oo H H r-t H r-l «2 c< 4 o o uo U H < O Η ϋ O 3 4 SOU Η α H H «-*3

nu H > o 4 UU

Se» U a U H Η x» u tn < m < o ™ α h u au 4 o Η H * 4

O α f> 3 0 O O

S · J H 01 ft H < au j u u u 4 >) o co u 4 3 uh h < o u o >> u o u o u O H O 3 o o u 4 O O (UH u u O cm a 4 lJU U u

O r- p—< U n 4 O H

4 4 O £ O 4 H

o O H 4 y H

4 < au 4 u o u a 4 u o y < <o y 4 4 u 3 0 4 u 3 Η a H u 4 O U J H o u o f* n U O ft O O £ U O 4

Jj O Η H 4 H O

O U O U u H

S 4 ft nu H U

® o u au h 4

t-> o O © >t H 4 U

n 4 u o rH u u u O O Ur-too O 4 m Η H 3 0 O 4 — 4 H <D H H u

4 U »J H U U

H f ft 3 0 p U

H U U h 4 H o

Γ1 O 4 O O O O

ti 0 4 O O U O

> 4 f· nU H 4 4 U au O 4

ft U nu O O

J 4 U 0» U 4 4

O U tn H 3 U

M O U 0) U U ft

4 4 HH U U

to 3 U H 4 O 4

w 3 O >i O O U

^ O 4 η O H U

«. O U O O O U

, 4 O 3 4 O O

H U O h 4 O U

H 4 O O < 4 O U 3 0 U 3

Η Η 0» Η O H

O U J U O 4 4 h au o 3

O 4 HU Η H

Η H 4 0 H O

O O O C O O H

h 3 O U 0\ H 4 Η H

a H 4 OU Η H

h) U O 3 0 u 4 oeu H aiH u u

P- H 4 U tJU O H

O U U 3 U 4 U

3 0 O β» H O U

0) H O |J U Η H

►JO O >1 o O H

au o p—i o o c o h HU O O O CM H 4 4 40 H COHOU u CO U h 4 co o H 4 O O U h 4 4

OU 4 nu OU U

nu 3 >4 ao U

a o U HH np U

ID 4 U 3 U HH U

ου h an au u

nu H JU HH O

au o au h 4 < au O £ H nu u

>1 O 4 aH £ U H

UH U 3 H H 4 O

nu U an nu H

a o H JO £ o u tn 4 U >.U H 4 o

nu H HU au H

a o O O O HU 4

ID 4 H o nu 40 U

30 4 coao an U

an u tn 4 £ η H

►j u u aH an o

oou U H 4 au H

vo n U U au «4 U

au u 3 u 4o u aH H aH au u pH u u J U hu o

I DK 175551 B1 I

I 34 I

I O O O O O O O O I

O O O O O O O O

I n

r-tM(M(NrN<NIM(S

I "i 4 Ei P P P £i P t< I

I s u 4 p p 4 f 4 p I ·- u e p P 4 p p h φ υ 4 P p p p 4 p I (At· 5 υ u < u < < <o p huu uuhu

I ri P P fri P 4 Ej P P

I <p ti(J<p<U4 I <-· P < Ei u G υ ti p

itj ti ti P p p p P P

I > p p 4 p P P p p 3 G h u u o υ η G m

I »ti U ti Ei ο υ η G

I h3 O t* Η P '4 P H <

I ri P 4 P P P P P P

I li Éi · ti O ti O P Ei P

I >p P4ppGp4 O >, U Ei O *t ti o u o

I m «-* p 4 fri p P P Ei P

I ri O P Ei U Ei ti < U P

I >4 p ti < p u f υ

I ri P Ei P Ei P 4 4 P

I p G < f p < u < p I 10 < P 4 4 P O P fr*

I rip P P ti fr< P G P

I _ 4 P P P P 4 P G P

I 7? 0>P Éifri 4fr'4PP

I t, Ί u < P Ei P P ti p I <0 4P PPp4PPp I « σ>ρ u p P o p p p

I iJ ti P P fri 4 4 P P P

I ti 4 P O Éi Ei P < Ei < I 0 c P Ei P P Ei P ti P ; I «Μ ri 4 p p 4 ti h 4 4 :

I w PP P fri 4 P P 4 P

I <up ppppppp

I £ ti PEiPPPPP

I p» ti < p < < G < p I ti (Q Ei 4 fr· fri P P P fri I ti ri u p p 4 p p p p

I M 4 P P ti < P f P P

I > Vi fri P P 4 P P ti P .

I 0) P < P Ei P < P G

I mtiotppppppti I j (OP OEipP<tipp

I riPtrOP<<PPPP

I M <Pr»MPPEiPPtiP

I w ootprio.pp<pppti I _ i? n ti cp pp pp pp I ffl ri Di Ei ri< P4Ei<Pti I _ (OPPPPEiPPPti I 4 ri u (QP<PP PPEi I <PriPPPPEi£iti , I ti OP 4PP<<Ei< ti

I . tiP SHPPPPPP

I eup®H«£ptiPPti

I -UPJP^PPtiPP

I a)EiomuofiPP<p I X<t^ri< <PtiPPti

I (0PriXPP<PPPP

I riPOtPPPPEiPEi I <Pt.P<PEiPEip I > Éi <PPEiPti Pti I ri Ό. 34 4 0 0 4 0 0 I pp®ti3ppp<p I CO >40000 004

I ri<riEiPPPP<P

I PP(0tipEi<PPP

I ti P > p < <p Ei P P

I jCPPPPPtitiP< I ti<tip<ppp pp I OP<PPPEitititi I tiPtiP<tiPPP< I AO >14400 400 I OC0frifri4 0 0 0 4 4 I η h < tip Ei ti P P P 4 -

I ri P P »PtiPP<<P

I 3PWtitiEi<PPP

I ȣirip<pptfpp H

I PP IT] ti Ei P |i < << P

I lOP>P4 Ei<<4ti

I riP3PPPPHPP

I <Pri<tiPPEi<< I 0tippp<ptipp I ti P 3P P 4 ti 4 P ti I 0iP<UtiP4Ptititi I (0PPP4444PEi

I ri P ΟΦΡ 4 4 P 4 P P

I 4P vo JC ti ti P P ti P P

I -tjPri0ititi4PtiPti I ®ti tiPEiPPEip 4

I X<ft)P4EiEiPPP

I >i4P4tiP<ti44

I ri p CPP4 4PPP

I PPrH4tiPPPEiP

I 3 P pppppppp H

I »ti 3PEi<titititi I PP ®Ei4EiP<PEi I 34 PPtiP, . ti 4 P ' ti I ri4mEititiP<Gti 35 DK 175551 B1 o o o o o OOOOt" oo σι o o r* γν cn m o

E* ta H H

P tf ta u 3 o tf

U 3 tf H

u ti ta u ta tf o u ta i p <

tf E·* tf U

u tf ta ta H O < < p o u ta

H tf U H

tf U 13 U

υ e* o h H H tf tf

tf U Ο H

3 < tf S

ta 3 ta h ta o o < < Eh O 6« ta υ h tf g tf ta u < 3 G < u h S o < ta tf ta . o t* 3 < 4j tf e« p e ti υ < h h S o o o u ® tf tf ta o f* ta u p u ta ^ O E« Η H tf

O ta O O E* O

*w < e« o < u

^ ta U tf U H

o < o e« υ H p u o H tf .

h S υ o < u tj ta. h ta u ta 5 H ' U H tf E« >> tf u u ta u ta υ ta η h _ o u o u tf ►3 t3 H 13 H 3

g O t3 u CJ

Μ Η H tf U CJ

o ta O η e« CQ tf tf U H tf w ta cj o ta u tf ta p ta tf tf ta tf e« 3 ta _ ta U u u tf

Εη Η E« tJ fr> U

tf u ta υ ta ta tf e* ta p o ta h tf h u ta ta 3 υ u h tf u ta υ υ tf tf e« u ta 3 3 t* o tf ta ta υ tf υ ta ta o u υ «< ta ta e« h ta tf eh h ta ta u h u tf tf ta h h ta o tf tf u h ta u u y h tf tf tf tf u ta u ta o h ta tf ta u η ta ta E4 h o tf ta cj α o u ta o u h u ta ta υ υ l·* h e* tf u ta u ta o e< ta ta ta H H tf Η tf ta tj ta ta u eh u ta tf ta o fr· tf 3 ta tf ta ta h tf u u ta u υ υ tf ta ta ο η u ta ta ta υ h e-· ta ta ta ta uh ta tf tf η u tf 3 o ta ta h ta o ta u h ta h tf tf E-t < u ta ta e* 3 u ta tf ei 3 ta tf u u ta h ta ta

E-t Η E·· ta H

u ta h ta ta tf E·· ta ta e* ta ta h u u

I DK 175551 Bl I

I 36 I

I Bt restriktionsendonucleoasekort (ca. 3,4 kb) for I

I genomisk DNA, der indeholder hpG-CSF genet, vises i de- I

I tailler i fig. 1. Restriktionsendonucleaserne i fig. 1 I

I er: Ncol, N; PstI, P; BamHI, B; Apal, A; Xhol, X; og I

I 5 Kpn, K. Pilene under kortet viser den sekvenserings- I

I strategi, man benytter for at opnå den genomiske se- I

I kvens. De indrammede regioner er sådanne, som man fin- I

I der i cdna klonen og den punkterede åbne indramning re- I

I præsenterer en sekvens, der ikke findes i cDNA klonen, I

I 10 men er identificeret med blot med mRNA sonde. Man ud- I

I førte identifikationen af de kodende sekvenser, der fo- I

I reslås til exon én ved Northern blot analyse. En 24 mer I

I oligonucleotid sonde, 5'CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3', der I

I spændte over de antagne sammensplejsningsforbindelser I

I 15 for exonerne 1 og 2, blev hybridiseret med hpG-CSF mRNA I

I i Northern blot format. Det resulterende blot viser en I

I mRNA af samme størrelse (ca. 1650 bp), som man ser med I

I en exon 2 oligonucleotidsonde. Dette resultat og evnen I

I til at dirigere eksprimering af hpG-CSF ud fra pSVGM- I

I 20 Ppol vektoren (Eksempel 9) med Met initieringskodon, I

I vist i Tabel VIII, definerer de kodende sekvenser, der I

I findes i exon 1. Exonerne 2-5 defineres ved de kodende I

I sekvenser, som man opnår i cDNA klonen (Ppo2) fra hpG- I

I CSF genet (Tabel vil). I

I 25 I

I Eksempel 6

I Eksemplet angår præparering af et fremstillet I

I gen, der koder for hpG-CSF og omfatter kodoner til E. I

I coli. I - I

I 30 I korthed anvendte man samme fremgangsmåde, som I

I vises i PCT publikation W083/04053, Alton, et al. Gener- I

I ne blev konstrueret, idet man først samlede komponent I

I oligonucleotider til multiple duplexer, som derefter 37 DK 175551 B1 blev samlet 1 tre adskilte sektioner. Disse sektioner blev konstrueret, så de let kunne mangfoldiggøres, og efter fjernelse fra mangfoldiggørelsessystemet kunne samles 1 rækkefølge eller ved en ligering af mange frag-5 menter til en passende ekspri-meringsvektor.

Kontruktionen af sektionerne I, II og III illustreres i tabellerne IX-XIV. Ved konstruktionen af sektion I, som illustreret i Tabellerne IX og X, samlede man oligonucleotiderne 1-14 til 7 duplexer (l og 8; 2 og 10 g. 3 0g io; 4 og 11; 5 og 12; 6 og 13; og 7 og 14).

Man sammenbandt derefter de syv duplexer under dannelse af sektion I som vist i Tabel X. Man bør notere i forbindelse med Tabel X, at sektion I indeholder opstrøms en Xbal klæbende ende og nedstrøms en BamHI klæbende 15 ende, der er nyttig til sammenbinding med mangfoldiggørelses- og eksprimeringsvektorer og til ligering til sektion II.

I DK 175551 B1 I

I 38 I

I TABEL XX I

I 5 I

I EChpG-CSFDNA SECTION I I

I CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAA 1 I

I TAATGACTCCATTAGGTCCTGCTTCTTCT 2 I

I 10 CTGCCGCAAAGCTTTCTGCTGAAATGTCTGG 3 I

I AACAGGTTCGTAAAATCCAGGGTGACGGT 4 I

I GCTGCACTGCAAGAAAAACTGTGCGCTA 5 I

I CTTACAAACTGTGCCATCCGGAAGAGC 6 I

I TGGTACTGCTGGGTCATTCTCTTGG 7 I

I 15 CATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT 8 I

I GCAGAGAAGAAGCAGGACCTAATGGAGT 9 I

I TGTTCCAGACATTTCAGCAGAAAGCTTTGCG 10 I

I CAGCACCGTCACCCTGGATTTTACGAACC 11

I TAAGTAGCGCACAGTTTTTCTTGCAGTG 12 I

I 20 ACCAGCTCTTCCGGATGGCACAGTTTG 13 I

I GATCCCAAGAGAATGACCCAGCAGT 14 I

39 DK 175551 B1 O CJ O O O O o u o « u U rsi t tf coou t tf H O O HEh< α o o o o o t tf t tf tf t ο o ου t tf t tf u υ o o t tf o o ου O O tf t Et< te o o o o

o t tf o t tf o O O

moo HOU r- tf t o o Huo hoo HC<M O O Hl tft O O tf t h| tf ti ni O O -»lo O O O H|

f tf O O tf>|U O

«Νίου t < o o o o tf t o o tf t! tf t t tf o Eh tf O tf E-ι o tf t

O tf E-I iflUO

tft H E-ι tf h O O

CJ O O CJ O O

CJ O O O t! tf

Eh tf Eh tf O CJ

x O O E-I tf t tf

tf E-ι O CJ CJ O

o cj o cj tf e a t tf tft tft ω ©tft ouo otfE-1

η tf E-ι cn tf t m cj O

m t> tf tft Htft* tf e-ι υ υ t tf tf tf El O CJ t! tf

tf t En tf U O

ti E-ι tf U O tf E-i ^ tft Eh tf Eh tf tf e-i ου υ o

E-ι tf En tf O U

HH t I

σου o tf eh ουο o o as z <N o υ oo tf eh Η»ου o tf e O tf Eh tft« H ti tf H t <0 μ . o υ ου ου o en

Eh OUOOl titf Eh tf OO

υ tf Eh υο υ o ου W Hitf f ηίουοΙ tf EH EH tf W υο . t tf ΗI tf Eh CN Eh tf υο uo mitf f η υο tf tf Eh f tf tf Eh Eh tf

Z

Q O tf Eh o t tf O tf Eh O U O

Cm H tf £h r-£h tf η O O CJ\ t tf C/l tf Eh U O h tf Eh H Eh tf υ tfEn ου tfEn tfti I tfEHH tft OO OCjHfl

O O <0 tft OO Em tf ΗI

α tf Si tft Eh tf MOO

•C t x u o uo oo O O OO tft oo w υ o o o t tf

I DK 175551 B1 I

I 40 I

I Som illustreret som i Tabellerne XI og XII i for- I

I bindelse med konstruktion af sektion II samlede man oli- I

I gonucleotiderne 15-20 i 8 duplexer (15 og 23; 16 og 24; I

I 17 og 25; 18 og 26; 19 og 27; 20 og 28; 21 og 29; I

I 5 og 22 og 30). Derefter sammenbandt man disse 8 duplexer I

I til opnåelse af sektion II, som vist i Tabel XII. Som I

I yderligere vist i Tabel XII besidder sektion II opstrøms I

I en BamHI klæbende ende og nedstrøms en EcoRI klæbende I

I ende, der er nyttig til ligering til en mangfoldiggørel- I

I 10 sesvektor og til ligering til sektion I. Tæt ved ned- I

I strømsenden omfatter sektion II også et nedstrøms SstI I

I sted, der er nyttig ved eventuel sammenbinding af sek- I

I tionerne II og III. I

I 15 TABEL XI I

I EChpG-CSFDNA SECTION II I

I 20 GATCCCGTGGGCTCCGCTGTCTTCT 15 I

I TGTCCATCTCAAGCTCTTCAGCTGGC 16 I

I TGGTTGTCTGTCTCAACTGCATTCTGGT 17 I

I CTGTTCCTGTATCAGGGTCTTCTG 18 I

I CAAGCTCTGGAAGGTATCTCTCCGGA 19 I

I 25 ACTGGGTCCGACTCTGGACACTCTGCA 20 I

I GCTAGATGTAGCTGACTTTGCTACTACT 21 I

I ATTTGGCAACAGATGGAAGAGCTCAAAG 22 I

I GACAAGAAGACAGCGGAGCCCACGG 23 I

I ACCAGCCAGCTGAAGAGCTTGAGATG 24 I

I 30 ACAGACCAGAATGCAGTTGAGACAGACA 25 I

I CTTGCAGAAGACCCTGATACAGGA 26 I

I CAGTTCCGGAGAGATACCTTCCAGAG 27 I

I TAGCTGCAGAGTGTCCAGAGTCGGACC .28 I

I AAATAGTAGTAGCAAAGTCAGCTACATC 29 I

I AATTCTTTGAGCTCTTCCATCTGTTGCC 30 I

41 DK 175551 B1 o U O β<Ε< ' VOH< Nh< ® Eh < o u hou —t u o

H < O CJ M O O

Η 3 σ\ «£ Eh cm| Eh < «Λ (9 0 h|3eh Eh3cn| eau oa hm eh < p a cn|u p a o ti < < h o a a o o a opu O Eh < O £h <

in E-I < HUO Γ" U O

uo hou hou O O < Eh < i* < Eh 3 Eh Eh < u o ^ o o o a ^ voiE-· < cn| o a eh < h|Eh 3 Eh < < Eh o o a o o a E-I < Eh < - < f

M

ouo ote OB C K

•«r o a ouo «> u o o

< H H Eh < HOU O

3 H 0U*0 < Eh < W

UO COOUCM uo 3 H Eh < h|o U O y eh H UO <fH Eh < £h

X EH < UO UO OU

< H Eh< Eh < < H

UO < Eh UO 3 Eh

M

OUO OEh< o < E-I O c EH

W n Eh <5 OOU iftUO Η U O m

_ OU Eh < H < £h M Eh < JJ

ffl Eh 3 Up OU U O 01

Eh< UO OU® OU CO

< UO Eh tf Eh<«n| ««Eh,

Eh Λ Eh 3 O U O ,Ο O O

Eh Eh 3 OU <s|tH < Eh n| U O Eh < U O w|3 Eh

M Eh< UO <Eh OU

*-H

oou o Eh < o O U oou Z <NEh< ® O U htUO O Eh <

O U O OU HUO N < EH

m OUr»| Eh< Eh 3 OU

Eh iftlU O en U o OU <Eh U H U O Eh 2 O U Up ca eh 3 eh3 oy co uo <εη«λ eh 3 3 Eh OU r^lUOCN up uo

3 O U h |o U < EH O U

z

0 oou O Eh 3 O < EH OOU

b H EH 3 r* U O που «Λ §H < CO OU < Eh HOU H Eh 3 U UO 3 Eh UO ^ 3 1 UO UO UO 3 Eh O O M Eh 3 Eh 3 Eh 3

a EhSUO UO UO

C. 3 El H4 Eh< 3 Eh U O IQ OU UO Eh< a « Εη < eh 3 u o

I DK 175551 B1 I

I 42 I

I Endelig konstruerede man sektion III som vist i I

I Tabellerne XIII og XIV. Med henblik på denne konstmk- I

I tion samlede man oligonucleotiderne 31-42 i 6 duplexer I

I (31 og 37; 32 og 38; 33 og 39; 34 og 40; 35 og 41; I

I 5 og 36 og 42). Man sammenligerede derefter de 6 duplexer I

I under dannelse af sektion III, som vist i Tabel XIV.

I Som også vist i Tabel XIV omfatter sektion III opstrøms I

I en BamHI klæbende ende og nedstrøms en EcoRI klæbende

I ende, nyttig til ligering i en mangfoldiggørelsesvektor I

I 10 og, i hvert fald når det drejer sig om EcoRI, i en ek- I

I sprimeringsvektor. Derudover besidder sektion II et op- I

I strøms Sstl sted, nyttig ved eventuel ligering af sek- I

I tionerne il og III. I

I 15 TABEL XIII I

I ECHGpG-CSFDNA sektion III I

I GATCCAAAGAGCTCGGTATGGCACCAG 31 I

I 20 CTCTGCAACCGACTCAAGGTGCTATGCCG 32 I

I GCATTCGCTTCTGCATTCCAGCGTCGTGC 33 I

I AGGAGGTGTACTGGTTGCTTCTCATCTG 34 I

I CAATCTTTCCTGGAAGTATCTTACCGTGT 35 I

I TCTGCGTCATCTGGCTCAGCCGTAATAG 36 I

I 25 AGAGCTGGTGCCATACCGAGCTCTTTG 37 I

I ATGCCGGCATAGCACCTTGAGTCGGTTGC 38 I

I TCCTGCACGACGCTGGAATGCAGAAGCGA 39 I

I ATTGCAGATGAGAAGCAACCAGTACACC 40 I

I CAGAACACGGTAAGATACTTCCAGGAAAG 41 I

I 30 I AATTCTATTACGGCTGAGCCAGATGACG 42 43 DK 175551 B1 0<h o fri 4 ouu nuo

O O rH E-) < M

O O 4 fr· 06 O O 4 l·* o OO oo 4 o

O O O O 4 W

fr· 4 fri 4 Eh 4 fr* o o eh

fr« 4 fr! 4 O O

O O O O 4 fr< O 4 fri inuu HUU fr· 4 EH 4 rH fri <J Ol M 4 fri O O O O «1 4 fr· OO® η*|Εη 4 fri 4

NW fr n[ COIEH 4 o O

n|4 fr* O O O O

O O O O O O

fr· 4 fri 4 O OPHl O O fri 4 4 fr« *r\

o 4 fri o O O o O O

VOO ooo Ό Eh 4

O O rH fri 4 HUO

O O O O O O

> 4 Eh 4 Eh O O

W 4 fr» Eh 4 vo Eh 4 X O O O O η|θΟ O O fr· 4 Eh 4 fr« 4 O O 4 fr«

1-4 O O O O O O

W OI fri 4 o 4 fr· o EH 4

η|θ O «Λ O O in o O

CQ O O O O rH O O

^ 4 fr· 4 Eh O O

4 O O O O fr· 4

O O O O O O

Eh 4 fr· Eh 4 fr· 4 O O O O frH 4

M o O O O O O

M O O En 4 H 4

M

O fri 4 OOO OOO

z «Μ 4 fr· »OO H»00

O fri 4 M O O HOO

m O O n| 4 Eh 4 fr« EH rH lo O UCSØil fr· 4 O nlo O nioonl Eh 4

W Eh 4 Μ n fr» 4 O O

W OOJ-» Ih 4 fr· 4 O O « 4 fr· 4 fr· 4 4 fr· W O O fr· 4 55

O OOO OOO OOO

bi rH 4 H r- fri 4 n < fr W 4 fr· O O rH 4 fr· 0 4Eh Eh 4 OOrHj 1 O O Eh 4 O O "»1 O O m o O rnlfri 4

O» Eh 33 O O n|o O

-c 4 ε υ o o o O O «0 fri 4 Eh 4 W CQI fri|4 fri 4

I DK 175551 B1 I

I A4 I

I Xbal-BamHI fragmentet, dannt af sektion I, liger- I

I es i en M13mpll phag vektor, åbnet med Xbal og BamHI. I

I Man genåbner derefter vektoren ved fordøjelse med BamHI I

I og EcoRI, hvorefter man ligerer med BamHI-EcoRI frag- I

I 5 mentet, dannet af sektion II. På dette trin er sektio- I

I nerne I og II blevet sammenbundet i den rigtige oriente- I

I ring. Derefter åbner man en anden M13mpll vektor ved I

I hjælp af fordøjelse med BamHI og EcoRI og ligerer den I

I derefter med BamHI-EcoRI fragmentet, dannet af sektion I

I 10 m. I

I Man lader vektoren, der indeholder sektionerne I I

I og II, fordøje med Xbal og Sstl. Ligeledes lader man I

I vektoren, der indeholder sektion III, fordøje med Sstl I

I og EcoRI. De mindste af de to fragmenter, der i begge I

I 15 tilfælde dannes ved fordøjelsen, ligeres i et plasmid I

I pCPM1156, som tidligere er åbnet med Xbal og EcoRI. Re- I

I aktionsproduktet er et eksprimeringsplasmid, der inde- I

I holder en kontinuert DNA sekvens, som vist i Tabel XV, I

I og som koder for hele hpG-CSF polypeptidet med en amino- I

I 20 terminal methioninkodon (ATG) til initiering af trans- I

I lation i E. coli. I

45 DK 175551 B1 30 H (0 30 3 H 30 ttH <9 H >,<

V H OH 0) Η Φ H 0» E-« (0 4 HU HO

JO 04 JO JO JO 40 4 0 O O

uH H > H < <9 H 3H 34 04 <0 4 Φ O UH <0 Η Η O β» EH Φ H U O hu UH OO >0 40 JO JO Pi O 40 uh oa 30 C4 >iH CO <0 4 0Ή ® O 4« Φ Η h 4 HU rH< HU uo UH 04 JO OO OO OO 40 40

<0H H >i 30 UH CO 30 O OH

HO O <H H4 «Ο ή 4 Φ Η Φ H uo 40 OO OO UH OO JO S< 40

OH OC 34 04 uH uH >iH C O

U O 4H rH 4 u o >i4 Æ O H O H <

Pi O OO OO Pi O HH H 4 OO OO

>ιΗ ΟΦ OO OH 30 aO 3 0 ΦΟ

rH o H rH u O >ιΟ Φ H (04 Φ H ÆH

OO 4M P| O OH JO 40 H O Pi H

34 4 a (0 H UH ΦΟ 30 30 <9 4

® H 4>i -h< φ O ÆH Φ Η H 4 HO

JH 4 J UO UH Pit· JO OO 40

0 4 Η O Φ O UH 30 uH 34 UH

u O O U >υ ΦΟ Φ H ÆO H 4 ΦΟ

Pi O 04 OH UH JO H4 OO UH

>HUH HH 30 30 ><H OO -U O <9 H

b< + Æ O H <0 Φ Η Φ H HO UO Φ H HO

H 4 0> JO JO OO Pi O S 4 40 •jhjjo o o C o <n 4 o o O ouH o>iH oco o ω o

I Φ H CN 4 H nr >i4 SO U o 00 Φ U OHO (NH4 '»ÆH

w S 4 OO J 4 Pi O UH HOO HOO H Pi η CQ 4 43 uo <0 H OH 30 C4 <9 4

H 4 H >i4 HO h 4 Φ Η H 4 HO

4 4 OO HH <90 UO JO OO 40

ti 4 os uh ao 3 0 3 4 ao O O

^ 4 Η Φ ÆO uo Φ Η H 4 U O U O

H OJ H 4 HH HO OO HH PiO

4 HO <9 H OO C4 OO ΦΗ jj O

4 O >i HO uo H 4 uo Hr* Φ H

H HO 40 Pi O OO Pi O S! 4

O 4«n «Ο ΦΟ UH UH UH <9 H

O 4 >i >iO HH ΦΟ ΦΟ ÆO HO

4 4 J OH M 4 UH UH H4 40

O 0 3 3 0 NO 3 0 ΦΟ uH >.H

O Η Φ Φ H HO Φ H HH ÆO HO

4 OJ JO OO JO m 4 H 4 OO

4 0 3 <0 4 3 Η m H ><H <9 H C4 O Η Φ >ι4 Φ H NO Η O Η O H 4

O OJ J 4 JO OH OO 40 OO

4 Η Φ 3 4 uH >iE< 34 Φ H UH

4 HÆ H 4 ΦΟ HO h4 ÆH ÆO

4 H Pi OO UH OO OO Pi Η H4

4ouc4<oh<oh30 ao OO

4 O Φ H 4 -H 4 HO Φ H 04 UO

4 4 U OO UO 40 JO 40 Pi O

O 4 C 3 0 NH 30 <9 H <9H C 4 4 4 H uh HO Φ H HO HO H 4

H OO JO OO JO 40 40 OO

O OOO o <9 4 030 OCO O C 4 OH4 030 H o u m rH o <τ»ΦΗ r~ h 4 h 4 h <9 Η πφη

O Pi 40 JO OO OO H > O HJO

I DK 175551 B1 I

I 46 I

I Ofx I

I w o

I 4 u I

I 3(9 I

I Φ Ex

I I

I Hfi I

I «Ex

I >o I

I I

kl O

I <u I

I u u i >.< I ** h

I ki b I

I <u u I 05 E-t

I ^ ·* < I

I £ >o

I s ίί I

I o uo lu

I W 3 O I

I «Η

I % au I

O dl o vo jC Ex

I J Η ft H

I pq h EH

I « MEh

I <53 I

£< OU £x

I 3 0 Ex I

I Φ < I j o <!

I WHO I

I ·Η < < I 33 U fx

I w e-< < I

I φ u < W Ex Ex

I <β H «0(9 I

I -HU f- u u

<(9 HPiO

I iH Ex G o I

I m Eh i-ι < H

I > o o u

I 30 *Ex I

® E· H O

I »j o < o I

I Hi 30 I

<B Ex φ Ex

> O J U

I O >iEx O O Ex I

ΙΛ iH U -H <

I Ή O O H EC U

47 DK 175551 B1

Selv om man kan anvende en hvilken som helst passende vektor til at eksprimere dette DNA, kan man uden videre konstruere eksprimeringsplasmidet pCFM1156 ud fra et plasmid pCFM836, hvis konstruktion er beskrevet i EPO 5 publiceret patentansøgning nr. 136 490. Man gennemskærer først pCFM836 med Ndel og afrunder enderne med Poll, således at begge de eksisterende Ndel steder ødelægges. Derefter lader man vektoren fordøje med Clal og SacII, så man fjerner en eksisterende polysammenbinder før lig-10 ering til en substitut polysammenbinder, som illustreret i Tabel XVI. Man kan konstruerer denne substitut polysammenbinder ved fremgangsmåden ifølge Alton, et al., se ovenfor. Kontrol af eksprimeringen i eksprimeringsplasmidet pCFMH56 foregår ved hjælp af en lambda PL promo-15 tor, som selv måske er under kontrol af et Cl857 repressor gen (såsom hvad der tilvejebringes i E. coli stamme Ki2AHtrp).

I DK 175551 B1 I

I A8 I

I Ή

Eh tf « CEI Ol I o o o I o o w

I

I b < o o p- o u o o

Eh tf

I Eh tf rH

3^ 31

Eh rH CM

o o s υι I O U 18

Eh tf σι W|

Eh tf co

OU σ\ U

oo * oo r- I t4 u o rH υ o > U O <U| Eh tf » I k tf Eh qJ <Eh cm I tf ej Si o o οι I Eh tf (JO £

I Eh tf » tf Eh X

I O O rH tf Eh

W O U rH E-* tf M

I «. Eh tf OJ O O £0

05 tf Eh cl tf Eh E

Eh tf *rt| tf Eh <fl|

tf tf £h ffil Eh tf OQI

O O - tf Eh

Eh tf Eh t n >h tf Eh in tf Eh co tf Eh P' 31 Eh tf Xi j Eh tf

Eh »Cfll tf Eh . -

Eh rH, OU rH

O O «Η O O O

οα ό ol ao λ I tf eh ζ|υ o a x oo z oo οασι αοΗ tf EH CN r^> Eh tf 031 tf Eh in tf Eh > I o a - o a tfl

I <Ehih«.oO

Eh tf <0 H tf Eh O

a o -O ci o u r» I EH tf xloJ a o I Eh tf XI Eh tf » tf Eh cm Ο O ή

OUrHrHtfEHrH

I Eh tf a EH tf rH

I EH tf »-Hl EH tf Ό

I Ej tf H W aO C

I tf Eh ID SI O O «Η

I OUrH tfEHS

I a o alco tf eh

Eh tf tn o O ro

I tf Eh rH o U VO

I rH rH I

to 49 DK 175551 B1

Eksempel 7

Dette Eksempel angår E. coli eksprimering af et hpG-CSF polypeptid ved hjælp af en DNA sekvens, der koder for [Met-1] hpCSP. Den anvendte sekvens var delvis 5 syntetisk og delvis afledt fra cDNA. Den syntetiske sekvens benyttede kodoner egnet til E. coli.

Man fordøjede plasmidet Ppo2, der indeholdt hpG-CSF genet vist i Tabel vil, med HgiAI og Stul under tilvejebringelse af et ca. 645 basepar fragment, der inde-10 holdt genet for færdig hpCSF (som vist i Tabel VII) med syv af ledersekvensens kodoner i 5' enden og ca. 100 basepar i den ikke kodende 3’-ende. Fordøjelse med HgiAI tilvejebringer en 5' 4-base klæbende ende, der er identisk med, hvad man får med PstI, og fordøjelse med Stul 15 giver en lige ende. Dette medfører, at man uden videre kan indsætte fragmentet i Ml 3 mp8 (Rf) gennemskåret med PstI, og med det ligeende-rdannende restriktionsenzym Hindi. Efter mangedobling i Ml3 lod man hpG-CSF DNA udskære ved fordøjelse med Apal og BamHl, som henholds-20 vis skærer ved Apal stedet, der indeholder kodonerne for resterne +3 til +5 i hpCSF og ved et BamHl. sted "ned-strøms" i forhold til Hindi stedet i Ml3 mp8 restriktionssammenbinderen. For at man kunne opnå E. coli eksprimering af hpG-CSF polypeptidet, fremstillede man et 25 syntetisk fragment, som vist i Tabel XVII nedenfor.

I DK 175551 B1 I

I 50 I

I TABEL XVII I

I 5' - C TAG AAA AAA CCA AGG AGG TAA TAA ΑΤΑ I

5 3 * - TTT TTT GGT TCC TCC ATT ATT TAT I

I Xbal I

I -l+i I

I Met Thr Pro Leu I

ATG ACA CCT CTG GGC C - 5' I

TAC TGT GGA GAC -3* I

I . Apal I

I Som man kan se ved analyse af Tabel XVII, omfatt- I

er sammenbinderen en Apal klæbende ende, kodoner, der I

I koder for de første tre rester i aminoenden af hpG-CSF I

15 (og som "genopretter" kodonerne, der koder for Thr1, I

I Pro2 og Leu3, og som blev udslettet ved Apal fordøjelse I

I af Ml3 DNA, beskrevet ovenfor, og under anvendelse af I

I kodoner, der fortrinsvis eksprimeres i E. coli), et I

translationsinitierende ATG, en sekvens på 24 basepar, I

I 20 der tilvejebringer et ribosombindingssted og en Xbal I

I klæbende ende. I

Eksprimeringsvektoren, som man anvender til E. I

coli eksprimering, var den, der beskrives som pCFM536 i I

I epo patentansøgning nr. 136 490, Morris, offentliggjort I

I 25 10. april 1985. (Se også A.T.C.C. 39934, E. coli JM103 I

I med indhold af pCFM536). Kort fortalt fordøjede man I

I plasmid pCFM536 med Xbal og BamHI. Man ligerede deref- I

I - ter hpG-CSF fragmentet (Apal/BamHl) og sammenbinderen I

(Xbal/ Apal), beskrevet ovenfor, under dannelse af et I

I 30 plasmid, der blev betegnet p536Ppo2. I

Man transformerede plasmid p536Ppo2 i en phag I

I modstandsdygtig variant af E. coli AM7 stammen, som tid- I

I ligere var blevet transformeret med plasmidet pMWl I

51 DK 175551 B1 (A.T.C.C. nr. 39933), der indeholdt et Cl857 gen. Man kontrollerede transformationen ved hjælp af markergenet for antibiotisk modstand (amp), som bæres af stamfader-plasmidet pCFM536. Cellekulturer i I*B urt (ampicillin 5 50 pg 1 ml) blev opretholdt ved 28eC, og efter vækst af celler i kulturen til Α600 = 0,5, inducerede man hpCSF eksprimering, idet man forhøjede temperaturen af kulturen til 42°C i tre timer. Den sluttelige O.D. af kulturen var Ag00 = 1,2.

10 Man bestemte niveauet for eksprimering af hpG-CSF

af de transformerede celler på en SDS-polyacrylamidgel, farvet med blå coomassifarve til at være 3-5% af total cellulær protein.

Man indhøstede celler ved centrifugering ved 3500 15 g i 10 minutter på en JS-4,2 rotor. Man knuste celler i vand 25% (w/v), fdet man lod opslæmningen passere tre gange gennem en French trykcelle ved 10.000 psi. Den sønderdelte cellesuspension blev centrifugeret ved 10.000 gi 15 minutter i en JA-20 rotor. Bundfaldet 20 blev igen suspenderet i vand og solubiliseret med et indhold på ca. 5 mg/ml total protein i 1% laurinsyre, 50 mM Tris, pH 8,7. Det solubiliserede materiale fra bundfaldet blev centrifugeret ved 15.000 g i ti minutter, og man satte CuSo4 op til en koncentration på 20 mM til su-25 pernatanten. Efter en time påsatte man denne prøve en C4 HPLC søjle til rensning ifølge fremgangsmåden i Eksempel 1 (B) med korrektioner for rumfang og koncentration.

Man udviklede en anden rensningsfremgangsmåde med 30 henblik på større mængder af hpG-CSF formuleret i en puffer, der indeholdt ikke-organisk materiale. Dette materiale er egnet til in vivo studier. Man udsuspenderede 150 g cellepasta i ca. 600 ml 1 mM DTT og lod det

I DK 175551 B1 I

I 52 I

I fire gange passere gennem en Manton Gualin homogenisa- I

I tor ved ca. 7000 psi. Den knuste cellesuspension blev I

I centrifugeret ved 10.000 g i 30 minutter, og man udsu- I

I spenderede bundfaldet i 400 ml desoxycholat (DOC), 5 mM

I 5 EDTA, 5 mM DTT, og 50 mM Tris, pH 9. Denne suspension I

I blev sammenblandet i 30 minutter ved stuetemperatur og I

I centrifugeret ved 10.000 g i 30 minutter. Man udsuspen-

I derede igen bundfaldet i ca. 400 ml vand og centrifuge- I

I rede ved 10.000 g i 30 minutter. Bundfaldet blev solu- I

I 10 biliseret i 100 ml 2% sarkosyl og 50 mM ved pH Θ. Man I

I tilsatte CuS04 op til 20 ym og holdt blandingen under I omrøring 16 timer ved stuetemperatur, hvorefter man een-

I trifugerede ved 20.000 g i 30 minutter. Til supernatan- I

I tan tilsatte man 300 ml acetone. Denne blanding blev I

I 15 anbragt på is i 20 minutter og derefter centrifugeret I

I ved 5000 g i 30 minutter. Bundfaldet blev opløst i 250

I ml 6 M guanidin og 40 mM natriumacetat ved pH 4 og påsat I

I en 1200 ml G-25 søjle, bragt i ligevægt og drevet med 20 I

I mM natriumacetat ved pH 5,4. Fraktioner med indhold af I

I 20 hpG-CSF (ca. 400 ml) blev sammenbragt og påsat en 15 ml I

I CM-cellulosesøjle, bragt i ligevægt med 20 mM natrium- I

I acetat ved pH 5,4. Efter påsætningen vaskede man søjlen

I med 60 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 25 mM I

I natriumchlorid og derefter eluerede man søjlen med 200 I

I 25 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 37 mM natrium-

I chlorid. 150 ml af dette gennemløb blev indkoncentreret I

I til 10 ml og påsat en 300 ml G-75 søjle, bragt i lige-

I vægt og drevet med 20 mM natriumacetat og 100 mM natri- I

I umchlorid ved pH 5,4. Fraktioner med relevant indhold

I 30 (35 ml) blev sammenbragt og filtersteriliseret. Slut- I

I koncentrationen af phG-CSF var 1,5 mg/ml, det var mere I end 95% rent som bestemt ved analyse på en gel og inde-

I holdt mindre end 0,5 ng pyrogen pr. 0,5 mg hpG-CSF. I

53 DK 175551 B1

Indholdet af pyrogen blev bestemt under anvendelse af et Limulus Amebocyte Lysate (LAL) prøveudstyr (M. A. Bio-products, Walkersville, Maryland).

5 Eksempel 8

Eksemplet angår anvendelse af rekombinante fremgangsmåder til fremstilling af analoge til hpG-CSF, hvori de cysteinrester, der findes ved positionerne 17, 36, 42, 64 og 74, enkeltvis blev erstattet med en pas- 10 sende aminosyrerest.

Man udførte positionsdirigerede mutageneseproce-durer efter Souza,et al., PCT ansøgning nr. W085/00817, offentliggjort 28. februar 1985, på DNA fra plasmid p536Ppo2, der koder for [Met-1], beskrevet nedenfor un- 15 der anvendelse af syntetiske oligonnucleotider med en længde på 20-23 baser, som vist i Tabel XVIII nedenfor.

Med oligonucleotid nr. 1 kunne man danne et gen, der kodede for [Ser17]hpG-CSF, med oligonucleotid nr. 2 kunne man få dannet [Ser36]hpG-CSF osv.

20

TABEL XVIII

Oligonucleotid :.....Sekvens__ 25 1. 5 ' -CTG CTC AAG TCC TTA GAG CAA GT-3' 2. 5'-GAG AAG CTG TCT GCC ACC TACA-3* 3. S’-TAC AAG CTG TCC CAC CCC GAG-3’ \ 4. 5 *-TGA GCA GCT CCC CCA GCC AG-3’ 5. 5’-CTG GCA GGC TCC TTG AGC CAA-3* 30

Man udførte de positionsdirigerende Cys til Ser mutagenese restriktioner under anvendelse af Ml3 mplO, der indeholdt et Xbal-BamHl hpG-CSF fragment isoleret fra p536Ppo2 som skabelon. Man behandlede DNA fra hver

I DK 175551 B1 I

I 54 I

I M13mplO klon, der indeholdt en Cys-Ser substitution med I

I Xbal og BamHI. Det resulterende fragment blev klonet i I

I eksprimeringsvektoren pCFM746, og man isolerede ekspri- I

I meringsprodukter som i Eksempel 7, I

I 5 Man kan konstruere plasmid pCFM746 ved at spalte I

I et plasmid pCFM736 (konstruktionen af dette plasmid ud I

I fra deponeret og offentlig tilgængeligt materiale be- I

I skrives i PCT ansøgning nr. W085/00829, Morris, offent- I

I liggjort 28. februar 1985) med Clal og BamHI til fjer- I

i n I

A nelse af en eksisterende polysammenbinder og substitu- I

I tion af følgende polysammenbinder. I

I TABEL XIX I

I 5 ^ I

I 5'cgatttgattctagaattcgttaacggtaccatggaa I

I 3 TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGCCATGGTACCTT I

I 20 GCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAAC3' I

I CGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAG5' I

Sau3a I 1

Ved en rensningsfremgangsmåde for Cys til Ser I

I 25 analoge ifølge opfindelsen udsuspenderede man ca. 10-15 I

I g cellepasta i 40 ml 1 mM DTT og lod det tre gange pas- I

I sere en French trykcelle ved 10.000 psi. Den opbrudte I

cellesuspension blev centrifugeret ved 1000 g i 30 mi- I

I nutter. Man udsuspenderede bundfaldet i 1% DOC, 5 mM I

I 30 EDTA, 5 mM DTT, 50 mM Tris, pH 9 og sammenblandede 30 I

I minutter ved stuetemperatur. Man centrifugerede bian- I

I dingen ved 10.000 i 30 minutter, udsuspenderede i 40 ml I

I h20 og centrifugerede igen ved 10.000 g i 30 minutter. I

55 DK 175551 B1

Man opløste bundfaldet 1 10 ml 2% Sarkosyl, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8. Efter sammenblanding 1 en time klarede man blandingen ved centrifugering ved 20.000 g 1 30 minutter, hvorefter man påsatte den en 300 ml G-75 søj-5 le, bragt i ligevægt med og drevet med 1% Sarkosyl, 50 mM Tris,. pH 8. Fraktioner med Indhold af den analoge forbindelse blev sammenbragt, og man lod dem oxydere med luft ved at stå med luftadgang i det mindste én dag. Slutkoncentrationerne var 0,5 - 5 mg/ml.

10

Eksempel 9 I dette Eksempel benyttede man et pattedyrscelle-eksprimeringssystem til at fastslå, om et aktivt poly-peptidprodukt ud fra phG-CSF DNA kunne eksprimeres i og !5 udskilles af pattedyrsceller (COS-1, A.T.C.C. CRL-1650). Systemet blev konstrueret, så det kunne tilvejebringe udskillelse af et polypeptid analogt til phGCSF ved eks-primering og udskillelse af en delvis syntetisk, delvis cDNA-afledt konstruktion, der kodede for [Ala1] hpG-CSF, 20 hvor der foran var anbragt et leader polypeptid med en sekvens af aminosyrerester, som henføres til human G--CSF ifølge Wong, et al., Sciense, 228, 810-815 (1985) og Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360-4364 (1985).

25 Eksprimeringsvektoren, som man anvendte til fore løbige studier af eksprimering af polypeptidpro.dukter ifølge opfindelsen, var en "shuttle"-vektor, der inkorporerede både pBR322 og SV40 DNA, og som var blevet konstrueret til autonom replikation både i E. coli og i 30 pattedyrsceller, idet eksprimeringen i pattedyrsceller af indsat exogen DNA var under kontrol af en viral pro-mot or/regulator DNA sekvens. Denne vektor, betegnet pSVDM-19 i E. coli Hn 101, blev deponeret 23. august

I DK 175551 B1 I

I 56 I

I 1985 hos American Type Culture Collection, 12301 Par- I

I klawn DRive, Rockville, Maryland, med nr. A.T.C.C. I

I 53241. I

I ved konstruktion af ekspressionsvektoren udførte . I

I 5 man følgende specifikke manipulationer. Man syntetise- I

I rede en DNA sekvens, der kodede for leader, som nævnt i I

I Tabel 20 nedenfor. I

I TABEL XX I

I 10 I

I -17 I

I Hindlll Met Trp I

I 5 * - A GCT TCC AAC ACC ATG TGG I

I 3* - AGG TTG TGG TAC ACC I

I -10 I

I Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val I

I CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG I

I 2Q GAC GTC TCG GAC GAC GAG AAC CCG TGA CAC I

I -1 41 I

I Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Leu I

I GCC TGC AGC ATC TCT GCA CCC CTG GGC G .-3' I

I CGG ACG TCG TAG AGA CGT GGG GAC -5' I

H *· y I Apal I 1

30 Som det ses af Tabel XX, omfatter sekvensen Hin- I

I dill og Apal klæbende ender og kodoner for de 17 amino- I

I syrerester, som man mener tilhører "leaderen" for human I

I GM-CSF. Derefter følger kodoner for en alaninrest, en I

57 DK 175551 B1 prolinrest og en leucinrest. Prolin- og leucinresterne duplikerer de aminosyrer, der findes ved positionerne +2 og +3 i hpG-CSF, hvorimod alaninresten duplikerer den første aminosyrerest (+1) i GM-CSF snarere end den før-5 ste i hpG-CSF.

Man havde konstrueret ombytningen af threonin med alanin, idet det derved ville være lettere for den aktuelle værtscelle at fjerne GM-CSF leaderpeptidet ved cellemekanismer, normalt forbundet med udskillelse af 10 GM-CSF.

Man fordøjede plasmid pSVDM-19 med Kpnl og udfyldte til lige ender med Klenow enzym. Derefter gennemskår man DNA med Hindlll. Det resulterende store fragment blev kombineret og ligeret med Hindlll/Pvull *5 fragmentet, der er vist i Tabel VII (isoleret fra plasmid Ppo2 som det næststørste fragment efter en Hindlll fordøjelse og en delvis fordøjelse med Pvull) under dannelse af plasmid psv-ppol. Derefter ligerede man det fremstillede GM-CSF leadersekvensfragment i Tabel VIII 20 i psv-Ppol (efter at det var kløvet med Hindlll og Apal) til opnåelse af plasmid pSVGM-Ppol.

Man transformerede calciumphosphatprecipitater (1-5 yg) af plasmid pSVGM-Pol DNA i duplikat 60 mm plader af OOS-1 celler, i det væsentlige som beskrevet 25 ifølge Wigler, et al., Cell, 14, 725-731 (1978). Som kontrol transformerede man også plasmid pSVDM-19 i COS-1 celler. Man indhøstede supernatanten over vævskulturen fem dage efter transficering og analyseredes for hpG-CSF aktivitet. Udbyttet af [Ala^hpG-CSF fra kultursuperna-30 tanten var af størrelsesordenen 1-2,5 yg/ml.

Efter den positive eksprimering af plasmidet pSVGM-Ppol, der koder for [Ala1]hpG-CSF i COS-1 celler, konstruerede man en anden vektor, som omfattede den hum-

I DK 175551 B1 I

I 58 I

I ane GM-CSF leadersekvens, men havde en kodon for en I

I threoninrest (naturlig forekommende i position li I

I hpG-CSF), der erstattede kodonet for alanin ved denne I

I stilling. I korthed syntetiserede man et oligonucleotid I

I 5 (5'CAGCATCTCTACACCTCTGGG) til positionsrettet mutagenese I

I (SDM). Man ligerede Hindlll - BamHl hpG-CSF fragmentet I

I i pSVGM-Ppol i Ml3mpl0 med henblik på SDM. Det nysyn** I

I tetiserede hpG-CSF gen, der indeholdt en Thr kodon i po- I

I sition 1, blev isoleret ved spaltning med Hindlll og I

I 10 EcoRI. Derefter klonede man fragmentet i pSVDM-19, I

I forberedt ved kløvning med de samme to restriktions- I

I endonucleaser. Den resulterende vektor pSVGM-Ppo(Thr) I

I blev transformeret i COS celler, og udbyttet af hpG-CSF I

I målt i supernatanten fra kulturen lå i området 1-5 I

I 15 yg/ml. I

I Endelig anvendte man den genomiske sekvens, hvis I

I isolering beskrives i Eksempel 5, til at danne en eks- I

I pressionsvektor til eksprimering hpG-CSF i pattedyrscel- I

I ler. Mere detailleret lod man pSVDM-19 fordøje med Kpnl

I 20 og Hindlll og benyttede det store fragment i en firedob- I

I belt legering med en syntetisk sammenbinder med Hindlll I

I og Ncol klæbende ender, som vist i Tabel XXI. Et Ncol - I

I BamHl fragment, der indeholdt exon 1 isoleret fra pBR322 I

I (8500 hpG-CSF), en genomisk subklon, og et BamHl - Kpbl I

I 25 fragment med indhold af exonerne 2-5, isoleret fra plas- I

I mid pBR322 (8599 hpG-CSF genomisk subklon). Den resul- I

I terende ekspressionsvektor til pattedyrsceller, I

I pSV/ghG-CSF producerede 1-2,5 yg/ml hpG-CSF fra trans- I

I formerede COS celler. I

DK 175551 B1 59

TABEL XXI

Hindlll 5'AGCTTCCAACAC

5 AGGTTGTGGTAC5'

Ncol

Eksempel 10

Eksemplet angår fysiske og biologiske egenskaber 1,0 af opfInderlske og hermed beslagtede rekombinante poly-peptldprodukter.

1. Molekylvagt

Rekombinante hpG-CSF produkter fra E. coli eks-15 primering som i Eksempel 7 havde en tilsyneladende molekylvagt på 18,8 kD, bestemt ved hjalp af reducerende SDS-PAGE (som man ville vente ud fra de angivne aminosyrer i Tabel vil), hvorimod naturlige isolater renset som 1 Eksempel 1 har en tilsyneladende molekylvagt på 20 19,6 kD. En teori om tilstedevarelse af N-glycaner, associeret med de naturlige isolater, kan afvises, da der mangler asparaginrester 1 primærsekvensen for hpG-CSF i Tabel VII, og som følge heraf konstruerede men en fremgangsmåde til at bestemme, om O-glycaner var ansvarlige 25 for forskelle i molekylvægt mellem de naturlige isolater og de ikke-glycosylerede rekombinante produkter. Man behandlede ca. 5 yg af naturligt isolat med neuraminidase (Calbiochem, LaJolla, Californien), man udtog en prøve på 0,5 yg og inkuberede resten med 4 mU O-glycana-30 se (endo-x-n-acetylgalactoseaminidase, Genzyme, Boston, Massachusetts) ved 37°C. Man udtog lige store portioner efter fc, 2 og 4 timers inkuberuring. Disse prøver blev underkastet SDS-PAGE side om side med det rekombinante

I DK 175551 B1 I

I 60 I

I materiale, afledt fra E. coli. Efter behandling med I

I neuraminidase ændredes den tilsyneladende molekylvægt af I

I isolatet fra 19,6 kD tril 19,2 kD, hvad der kunne skyl- I

I des, at en "sailic acid" rest blev fjernet. Efter to I

I 5 timers behandling med O-glycanase ændredes molekylvægten I

I til 18,8 kD - denne værdi er identisk med den tilsynela- I

I dende molekylvægt af materialet, afledt fra E. coli. På I

I grund af carbohydratstrukturens følsomhed overfor neura- I

I minidaser og O-glycanase, kan man foreslå følgende I

I 10 struktur for carbohydratkomponenten: N-acetyl-neuramin-

I syre-α(2-6)(galactose β(1-3) N-acetylgalactose-amin-R, I

I ; hvori R er serin eller threonin. I

I 2. Optagelse af 3H-Thymldln I

I 15 Man undersøgte induktion af vækst ved celledeling I

I for humane knoglemarvsceller, baseret på voksende inkor- I

I porering af 3H-thymidin. Man underkastede human knogle- I

I marv fra sunde donorer en opdeling med hensyn til den- I

I sitet ved hjælp af Picoll-Hypague (1,077 g/ml, Pharma- I

I 20 cie) og udsuspenderede celler med lav densitet i I

I Iscove's medium (GIBCO), der indeholdt 10% kalvefoster- I

I serum og glutamin pen-strep. Derefter inkuberede man I

I 2xl04 humane knoglemarvsceller med enten kontrolmedium I

I eller det rekombinante E. coli materiale fra Eksempel 7 I

I 25 i plader med 96 fordybninger med flad bund ved 37°C, med I

I 5% C02 i luften i to dage. Man foretog dobbeltanalyser I

I og lod koncentrationen variere med en faktor 10.000. I

I Kulturerne blev derefter holdt under pulsering i fire I

I timer med 0,5 μ Ci/fordybning 3H-thymidin (New England I

I 30 Nuclear, Boston, Massachusetts). Man målte optagelsen - I

I af 3H-thymidin som beskrevet hos Ventua, et al., Blood, I

I 61, 781 (1983). Ved dette forsøg kan humane hpG-CSF I

I isolater inducere inkorporering af 3H-thymidin i humane I

61 DK 175551 B1 knoglemarvsceller 1 et ca. 4-10 gange højere niveau end ved anvendelse af kontrolsupernatanter. hpG-CSF materialet, afledt fra E. coli, ifølge Eksempel 6, havde lignende egenskaber.

5 Man udførte et andet studie over vækst ved celle deling af humane knoglemarvsceller, idet man anvendte et dyrkningsmedium fra transficerede COS-1 celler ifølge Eksempel 9, og opnåede samme resultater, hvad der var et tegn på, at det kodede polypeptidprodukt faktisk som ak-10 tivt materiale blev udskilt i dyrkningsmediet.

3. Inducerinq af differentiering 1 WEHI-3B D*

Evnen hos rekombinant materiale afledt fra E. coli, til at inducere differentiering i den myelomonocy-15 tiske leukæmicellelinie WEHI-3B D+ fra mus, blev undersøgt i et halvfast agarmedium, som beskrevet i Metcalf,

Int. J. Cancer, 25, 255 (1980). Man inkuberede det re-kombinante hpG-CSF produkt og et kontrolmedium med ca.

60 WEHI-3B D+ celler/fordybning ved 37eC med 5% C02 i 20 luften i syv dage. Man inkuberede prøverne i plader med 24 fordybninger med flad bund og lod koncentrationen variere med en faktor 2000. Kolonierne blev opdelt som ikke-differéntierede, delvis differentierede eller fuldstændig differentierede, og man talte celler i kolo-25 nierne under mikroskop. Man fandt, at det rekombinante materiale fra E. coli inducerede differentiering.

4. Analyser for CFU-GM, BFU-E oq CFU-GEMM Man fandt, at naturlige isolater af pluripotent 30 human G-CSF (hpG-CSF) og det rekombinante pluripotente human G-CSF (rhpG-CSF) kunne få menneskelige knoglemarvsceller til at undergå celledeling og differentieres. Disse aktiviteter blev målt ved CFU-GM [Broxmeyer,

I DK 175551 B1 I

I 62 I

I et al., Exp. Hematol., 5, 87, (1971)] BFU-E og CFU-GEMM I

I assays [Lu, et al., Blood, 61, 250 (1983)] under anven- I

I delse af ikke-sammenhængende knoglemarvsceller med lav I

I densitet fra sunde frivillige mennesker. En sammenlig- I

I 5 ning af CFU-GM, BFU-E og CFU-GEMM biologiske aktiviteter I

I under anvendelse af enten 500 enheder hpG-CSF eller I

I rhpG-CSF vises i Tabel XXII nedenfor. I

I Alle koloniforsøgene blev udført med lkke-sammen- I

I hængende knoglemarvsceller med lav densitet. Man under- I

I 10 kastede humane knoglemarvsceller en densitetopdeling med I

I Ficoll-Hypaque (densitet 1,077 g/cm3; Pharmacia). Man I

I udsuspenderede cellerne med lav densitet i Iscove's mo- I

I dificerede Dulbecco's medium, der indeholdt kalvefoster- I

I serum og anbragte dem på Falcon vævskulturskåle (nr. I

I 15 3003, Becton Dickenson, Cockeysville, MD.) i 1½ time I

I ved 37eC. I

I TABEL XXII I

I 20 _CFU-GM BFU-E CFR-GEMM I

Kontrolmedium 0±0 26 ±1 0 ± 0 I

Naturligt hpG-CSF 83 ± 5,4 83 ± 6,7 4 ± 0 I

rhpG-CSF 87 ± 5 81 ± 0,1 6 ± 2 I

25 I

Kontrolmediet bestod af Iscove’s modificeret Dul- I

becco medium plus 10% FCS, 0,2 mM hæmin og 1 enhed re- I

kombinant erythropoietin. I

Ved et CFU-GM assay udplattede man de pågældende I

celler i et antal på 1 x 105 i l ml 0,3% agar dyrknings- I

medium, der omfattede supplementeret McCoy's 5A medium I

og 10% varmeinaktiveret kalvefosterserum. Man gennem- I

søgte kulturerne for kolonier (mere end 40 celler pr.

63 DK 175551 B1 sammenklumpning) og undersøgte morphologlen den syvende kulturdag. Antallet af kolonier vises som middelværdi ± standardafvigelse, bestemt ud fra firedobbelte for-5 søg.

Ved BFU-E og CFU-GEMM assays satte man celler (1 x 105) til en 1 ml blanding af Iscove's modificeret Dul-becco medium (Gibco), 0,8% methylcellulose, 30% kalve-fosterserum, 0,05 nM 2-mercaptoethanol, 0,2 mM hemin 10 og 1 enhed rekombinant erythropoietin. Man inkuberede skålene i en fugtig atmosfære, der indeholdt 5% C02 og 5% 02. Man opnåede et lavt oxygentryk ved hjælp af en oxyreducer fra Herning Bioinstruments (Syracuse, N.Y.).

Man talte kolonier efter 14 dages inkubering. Antallet 15 af kolonier vises som middelværdi ± standardafvigelse, bestemt ved dobbeltforsøg.

Man fandt, at alle kolonier, der blev dannet i CFU-GM assayet, var positive overfor chloracetatesterase og negative overfor ikke specifik esterase (a-naphthyl-20 acetatesterase), i overensstemmelse med, at kolonierne er af granulocyttype. Man fandt, at både naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF havde en specifik aktivitet på ca. l x 10® U/mg rent protein, når det blev undersøgt ved voksende fortynding i et CFU-GM assay. BFU-E og CFU-GEMM 25 data i Tabel XXII er repræsentative for tre adskilte eksperimenter, og resultaterne ligner data, man tidligere har opgivet for naturlig hpG-CSF. Det er vigtigt at bemærke sig, at rhpG-CSF er overordentlig ren og fri for andre mulige vækstfaktorer fra pattedyr på grund af sin 30 frembringelse i E. coli. rhpG-CSF er således i stand til at understøtte dannelse af blandede kolonier (CFU-GEMM), og BFU-E når det tilsættes under tilstedeværelse af rekombinant erythropoietin.

I DK 175551 B1 I

I 64 I

I 5. Forsøg med cellebinding I

I Det er tidligere blevet meddelt, at WEHI-3B(D+) I

celler og humane leukæmiceller fra frisk diagnosticeret I

I leukæmi vil binde 125l-mærket G-CSF fra mus, og at der I

I 5 kan foregå konkurrence om denne binding ved tilsætning I

I af ikke-mærket G-CSF eller human CSF-β. Man afprøvede I

I evnen hos naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF til at konkurrere I

I om binding af 125I-hpG-CSF til leukæmiceller fra menne- I

I sker og mus. Man ioderede høj renset naturlig hpG-CSF I

I 10 (>95% ren, I yg) [Trejedor, et al., Anal. Biochem., 127, I

I 143 (1982)], og man skilte det fra reaktanterne ved I

I hjælp af gelfiltrering og ionbytterchromatografi. Den I

I specifikke aktivitet af det naturlige 125I-hpG-CSF var I

I omtrent yCi/yg protein. Man afprøvede WEHI-3B(D+) I

15 fra mus og to præparationer af periferale myeloide leu- I

kæmiceller fra menneskeblod (ANLL, én klassificeret som I

M4, en anden som M5B) for deres evne til at binde I

l25I-hpG-CSF. I

Museleukæmicellerne og de frisk indsamlede humane I

20 periferal myeloide leukæmiceller fra blod blev vasket I

I tre gange med PBS/1% BSA. Man inkuberede WEHI-3B(D+) I

I celler (5 x 106) eller friske leukæmiceller (3 x 10^) i I

I dobbeltforsøg i PBS/1% BSA (100 μΐ) under fravær eller I nærvær af forskellige koncentrationer (rumfang: 10 μΐ) I 25 ikke mærket hpG-CSF, rhpG-CSF eller GM-CSF og under til- I stedeværelse af 125I-hpG-CSF (ca. 100.000 cpm eller 1 I ng) ved 0eC, i 90 minutter. (Totalrumfang; 120 yl). Man I udsuspenderede cellerne igen og anbragte dem som et lag I over 200 μΐ iskold FCS i 350 μΐ plastcentrifugerør og I 30 centrifugerede dem (1000 g, 1 min.). Man indsamlede I bundfaldet ved at skære enden af røret af og talte bund- faldet og supernatanten hver for sig i en gammatæller I (Packard). 1 i 65 DK 175551 B1

Man bestemte specifik binding (cpm) som totalbinding under fravær af en konkurrent (gennemsnit af to forsøg) minus bindungen (cpm) under tilstedeværelse af et 100 dobbelt overskud af ikke-mærket hpG-CSF (ikke 5 specifik binding). Den ikke-specifikke binding var maksimal 2503 cpm for WEHI-3B(D+) celler, 1072 cpm for ANLL (M4) celler og 1125 cpm for ANLL (M5B) celler. Det første og det andet eksperiment blev udført på adskilte dage med samme præparation af 1^5I-hpG-CSF, og forsøgene 10 udviser indre konsistens med henseende til procentværdien af inhibition, opnået for 2000 enheder hpG-CSF. Data angives i Tabel XXIII nedenfor.

I DK 175551 B1 I

I 66 I

H

Λ I Ή

£ I O O

C

« -W

in I s #>

I j I

I 1-3

§(S VO O

E CS» r* 0< ή <n o æ I Ή I £ I m

^ C CD

-H

I s

I — dP

I H J I

I H J

I HZ CO 't O

S< rH n O

EN <N

I W - m

I Λ ^ I

lu I

Ια I

I < I

I & s I

I £ ιο^·σ\οΝΐη o co o I + c m vo © co φ I Q -.Η r-t

I n «»p I

I I

I H

I X co m n h o m o o co r-i U o oo m n co η .h rs *h I SE Ό Ό vo o i-ι η σ' vo m

I CU

I U Η N H W CN Γ0

I "" o o o o o o o ooo I

I H o o o o o o o o I E OONCON o o I · · · ♦

I D OCaOCN rsj (N

I w o «-» I ^ 1

4J *· H

I c u u I 4> cn w u o> m I U ft O 10 -HU·· I U i—1 r-t I u N ι-t i u I s c u o i cuoca I .* · © 3 o« o · © 3 o« u .

I C © 0i +> ,C 0« æ cn Æ 1 I o x c ta r * c « s I bCHHC u u m z o 67 DK 175551 B1

Som angivet i Tabel XXIII udviste 125I-hpG-CSF binding til WEHI-3B(D+) leukæmicellerne. Bindingen blev dosisafhsngigt inhiberet af umærket naturligt hpG-CSF eller rhpG-CSF, men ikke af GM-CSF. Derudover observe-5 rede man binding af naturligt hpG-CSF til humane myelo-monocytiske leukæmiceller (ANLL, M4). Bindingen til disse celler har en parallel i væskeformige kulturers respons til naturlig hpG-CSF, idet de differentierer til fuldt udviklet macrophager, bedømt ud fra morphologien.

10 Den manglende binding af naturlig 125l-hpG-CSF til mono-cytiske leukæmiceller fra en anden patient (ANLL, M5B) kan skyldes, at visse leukæmiceller kan differentiere på en anden måde eller mangle receptorer for hpG-CSF. Evnen af rhpG-CSF til at konkurrere med naturlig hpG-CSF om 15 binding til naturlig 125I-hpG-CSF er et tegn på# at receptorerne genkender begge former i lige høj grad.

Disse forsøg, der demonstrerer bindingen af naturlig 125i—mærket hpG-CSF til leukæmiceller, har en parallel i evnen hos naturlig hpG-CSF til at inducere 20 granulocytisk og monocytisk differentiering af knoglemarvsceller med lav densitet, opnået fra en patient med akut promyelocytisk leukæmi (M3) og en anden patient med akut myeloblastisk leukæmi (M2). Celler fra de to patienter blev dyrket i fire dage enten i dyrkningsmedium 25 alene eller under tilstedeværelse af 1 x 105 enheder rhpG-CSF. Celler fra M3 kontrolmediet inkuberet alene her var stadig af promyelocyt-type; hvorimod celler, dyrket under tilstedeværelse af rhpG-CSF udviste fuldt udviklede celler af den myeloide type, deriblandt en 30 metamyelocyt, en kæmpe båndform og segmenteret meutro-philis og monocyt. For denne patient var opdelingen af 100 celler i kontrolgruppen 100% promyelocyter, og af rhpG-CSF behandlede celler 22% blastceller plus promye-

I DK 175551 B1 I

I 68 I

I locyter, 7% myelocyter, 35% metamyelocyter, 20% bånd- I

I former plus segmenterede neutrofile, 14% monocyter og 2% I

I macrophager. En interessant kendsgerning er, at en af I

I de polymorphonucleære granulocyter stadig indeholdt et I

I 5 dominerende auerlegeme, et tegn på, at i det mindste I

I denne celle repræsenterede en differentieret celle, der I

I hørte til leukæmiklonen. Celler fra den anden patient I

I med myeloblastisk leukæmi (M2) blev også dyrket fire I

I dage under fravær eller tilstedeværelse af rhpG-CSP. I

I 10 Ved gennemsyn af M2 celler, der var dyrket i mediet I

I alene, kunne man iagttage store "blastagtige" celler, af I

I hvilke nogle besad kerner. Visse af M2 cellerne diffe- I

I rentierede, når de blev behandlet med rhpG-CSF, til I

I fuldt udviklede segmenterede neutrophile med rest af au- I

I 15 erlegemer i centret af neutrophilen, et tegn på at der I

I var foregået differentiering i en celle, der tilhørte I

I leukæmiklonen. En opdeling af 100 celler, der var un- I

I dersøgt morphologisk, viste, at cellerne fra kontrol- I

I gruppen bestod af 100% blastceller. De celler, der var I

20 behandlet med rhpG-CSP, bestod af 43% blastceller, 1% I

myelocyter, 15% metamyelocyter, 28% båndformer plus I

segmenterede neutrophile, 2% promonocyter og 11% mono- I

cyter. Man undersøgte også leukæmicellerne med henblik I

på differentiering ved fire andre koncentrationer af I

25 rhpG-CSF (5 x 103, 1 x 104, 2,5 x 104 og 5 x 104 U/ml, I

data ikke vist). Selv ved de lavest afprøvede koncen- I

trationer af rhpG-CSF (5 x 103 U/ml) var der tydelig I

differentiering (cellerne differentierede længere end I

til myelocyter) af M3 (50%) og M2 (37%) leukæmicel- I

30 lerne. I

DK 175551 B1 69 6. Immunassay

Til fremstilling af polyklone antistoffer til brug i immunassay anvendte man som antigen pluripotent G-CSF, oprenset fra human blærecarcinom cellelinie 5637 5 (ia6), som fremstillet i Eksempel 1 (B). På basis af sølvnitratfarvning af polyacrylamidgeler vurderede man materialet til at være 85% rent. Man immuniserede seks uger gamle Balb/C mus med mange subkutane injektioner af antigenet. Antigenet blev udsuspenderet i PBs og emul-10 geret med lige så store rumfang af Freund's komplette adjuvans.

Dosis var 5-7 pg antigen pr, mus pr. injektion.

18 dage senere forstærkede man immuniseringen ved den samme mængde antigen emulgeret med et lige så stort rum-15 fang af Freund's ikke-komplette adjuvans. 4 dage senere udtog man museserum til afprøvning for indhold af det antistof, der var specifikt overfor human pluripotent G-CSF.

Man overtrak Dynatech immulon II Removawell 20 strips i holdere (Dynateck Lab., Inc., Alexandria, Virginia) med hpG-CSF 5 pg/ml i 50 mM carbonat-bicarbonat-puffer, pH 9,2. Fordybninger i plader blev overtrukket med 0,25 pg i et rumfang på 50 pi. Man inkuberede de antigendækkede plader to timer ved stuetemperatur natten 25 over ved 4°C. Man fradekanterede opløsningen og inkuberede pladerne 30 minutter med PBS med indhold af 5% BSA for at blokere den reaktive overflade. Man fradekanterede denne opløsning og tilsatte enten fortyndet pre-immunserum eller serum til afprøvning til fordybningerne 30 og inkuberede to timer ved stuetemperatur. Sera blev fortyndet med PBS, pH 7,0, med indhold af 1% BSA. Man fradekanterede serumopløsningen og vaskede pladerne tre gange med Wash Solution (KPL, Gaithersburg, Maryland). Tilsatte ca. 200.000 cpm ioderet kanin-antimus IgG (NEN,

I 1 DK 175551 B1 I

I 70 I

I Boston, Massachusetts) i 50 ul PBS, pH 7,0, med indhold I

I af 1% BSA til hver fordybning. Efter inkubering 1½ I

I time ved stuetemperatur fradekanterede man denne opløs- I

I ning og vaskede pladerne fem gange med Wash solution. I

I 5 Man fjernede fordybningerne fra holderen og talte dem i I

I en Beckman 5500 gamma tæller. Højaktiv museserum viste I

I mere end 12 gange større reaktivitet end det tilsvarende I

I prs-immune serum ved en fortynding på 1:100. I

I Man bestemte de immunologiske egenskaber af E. I

I 10 coli-afledt hpG-CSF ved reaktivitet over for højaktiv I

I museserum, der var specifikt overfor pattedyrscelle af- I

I ledt hpG-CSF. Man overtrak Xmmulon II Removawells med I

I 0,25 ug 90% ren E. coli afledt protein i et rumfang på I

I 50 μΐ og analyserede museserummet som beskrevet oven- I

I 15 for. I

I Højaktive musesera udviste en 24 gange højere re- I

I aktivitet overfor materiale fra E. coli end de tilsva- I

I rende præ-immune sera ved en fortynding på 1:100. I

I 20 7. Bloassays for serinanaloge I

I Man undersøgte [Ser17]hpG-CSF, [Ser36]hpG-CSF, I

I [Ser42]hpG-CSF, [Ser64]hpG-CSF og [Ser74]hpG-CSF produk- I

I ter, fremstillet ifølge Eksempel 9 for hpG-CSF aktivitet I

I ved optagelse af 3H-thymidin, CFU-GM og WEHI 3B D+ I

I 25 assays. I alle assays besad [Ser17] analogen en aktivi- I

I tet, der kunne sammenlignes med aktiviteten i det rekom- I

I binante molekyle med den naturlige struktur. De andre I

analoge besad ca. 100 gange mindre aktivitet ved forsø- I

I get med optag af 3H-thymidin, en 250 gange mindre akti- I

I 30 vitet i CFU-GM essayet, og en 500 gange mindre aktivitet I

I i WEHI-3B D+ assayet. Disse data støtter den teori, at I

I cysteinrester er nødvendige i stillingerne 36, 42, 64 og I

I 74 til opnåelse af fuld biologisk aktivitet. I

I I

71 DK 175551 B1 8. In vivo bloassay

Man forbandt Alzet osmotiske pumper (Aiset Corp.,

Palo Alto, CA; Model 2001) til permanente katetere i den højre halsåre og implanterede dem under huden på syv sy-5 riske guldhamstre. Fire af pumperne indeholdt en puffer [ 20 mM natriumacetat (pH 5,4) og 37 mM natriumchlorid] og 1,5 mg/ml E. coli-afledt hpG-CSF, hvorimod 3 kun indeholdt puffer. Pumpehastigheden var angivet til at være 1 μΐ/time i op til syv dage. Tre dage efter an-10 bringeisen af pumperne var middelantallet af granulocy-ter hos de fire behandlede hamstere seks gange højere end hos de tre kontrolhamstere (puffer), og samtidig med det forøgede antal af granulocyter var der en firedobling i antallet af totale lymfocyter. Antallet af 15 erythrocyter blev ikke ændret ved behandlingen. Disse resultater er et tegn på, at det rekombinante materiale producerer en specifik forstærkning af produktionen af og/eller frigivelse af granulocyter hos et pattedyr.

De her beskrevne DNA-sekvenser, som koder for 20 hpG-CSF-agtige polypeptider, kan være nyttige i henseende til den information, den leverer om aminosyresekven-sen fra pattedyrsproteinet, som tidligere har været utilgængeligt, trods analyseforsøg på isolater af naturlige forekommende produkter. DNA sekvenserne må også 25 anses for at være værdifulde som produkter, der kan anvendes ved mikrobiel syntese i stor skala af hpG-CSF ved et antal rekombinante fremgangsmåder. Disse DNA-sekvenser kan være egnet materiale til anvendelse som mærkede sonder ved isolering af hpG-CSF og beslægtet protein, 30 der kodes for af human genomisk DNA, såvel som cDNA og genomiske DNA sekvenser fra andre pattedyrsarter. DNA sekvenserne kan også være nyttige ved forskellige andre fremgangsmåder for proteinsyntese (f.eks. i insektcel-

I DK 175551 B1 I

I 72 I

I ler) eller 1 genetisk terapi på mennesker og andre pat- I

I tedyr. Man venter, at DNA sekvenser ifølge opfindelsen I

I er nyttige ved udvikling af transgene pattedyrs-specier, I

I som kan tjene som eukaryotiske "værter" ved produktion I

I ^ af hpG-CSF og hpG-CSF produkter i store mængder. Se i I

I denne forbindelse Palmiter, et al., Science, 222 (4625), .1

I 809-814 (1983). I

I Med relevans til hpG-CSF derivater og analoger I

I ifølge opfindelsen kan nævnes rapporter om den immunolo- I

I 10 giske aktivitet af syntetiske peptider, som i det væ- I

I sentlige duplikerer aminosyresekvenser, der findes i I

I naturligt forekommende proteiner, glycoproteiner I

I og nucleoproteiner. Mere detailleret har man vist, at

I relativt lavmolekylære polypeptider indgår i immunreak- I

I 15 tioner, som med henseende til varighed og udbredelse li- I

I gner immunreaktionerne af fysiologisk signifikante prot- I

I einer som virale antigener, polypeptidhormoner og lig- I

I nende. Blandt immunreaktionerne på sådanne polypeptider I

I er inkluderet provokation af dannelse af specifikke an-

I 20 tistoffer i immunologisk aktive dyr. Se f.eks. Lerner, I

I et al.. Cell, 23, 309-310 (1981); Ross, et al.. Nature, I

I 294, 654-656 (1981); Walter, et al., Proc. Natl. Acad. I

I Sci. (USA), 77, 5197-520.0 (1980); Lerner, et al., Proc. I

I Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 3403-3407 (1981); Walter, I

I 25 et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 4882-4886 I

I (1981); Wong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), I

I 78, 7412-7416 (1981); Green, et al., Cell, 28, 477-487 I

I (1982); Nigg, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, I

I 5322-5326 (1982); Baron, et al., Cell, 28, 395-404 I

I 30 (1982); Dreesman, et al., Nature, 295, 185-160 (1982); I

I og Lerner, et al., Scientific American, 248, nr. 2, I

I 66-74 (1983). Se også Kaiser, et al., Science, 223, I

I 249-255 (1984) hvad. angår biologiske og immunologiske I

73 DK 175551 B1 aktiviteter af syntetiske peptider, som med tilnærmelse deler den sekundære struktur med peptidhormoner, men muligvis ikke har primær strukturel konformation tilfælles med dem.

Claims (17)

1. Isoleret polypeptid med de hæmatopoietiske I I biologiske egenskaber for naturligt forekommende pluri- I I potent granulocyt kolonistimulerende faktor (hpG-CSF), I I 5 hvor polypeptidet har den i Tabel VII angivne aminosy- I I resekvens 1-174, kendetegnet ved at være ik- I I ke naturligt forekommende og være et produkt af proka- I I ryotisk eller eukaryotisk ekspression af en exogen DNA- I I sekvens. I I 10 2. Polypeptidanalog ifølge krav 1, k e n d e - I I tegnet ved, at den exogene DNA-sekvens er en I I cDNA-sekvens. I

3. Polypeptidanalog ifølge krav 1, kende- I I tegnet ved, at den exogene DNA-sekvens er en ge- fl I 15 nomisk sekvens. I

4. Polypeptidanalog ifølge krav 1,kende- I I tegnet ved, at den exogene DNA-sekvens bæres af I I et autonomt replikerende DNA-plasmid eller viral vek- I I tor. I I 20 5. Polypeptid ifølge krav 1, kendeteg- I I net ved at være kovalent associeret med en påviselig I I markørsubstans, især en radioaktiv markør. I

6. DNA-sekvens, der ved eksprimering i en proka- I I ryotisk eller eukaryotisk værtscelle koder for et poly- I I 25 peptidprodukt, der besidder i det mindste en del af den . I I primære struktur og de hæmatopoietiske biologiske egen- I I skaber for naturligt forekommende pluripotent granulo- · I I cyt kolonistimulerende faktor, hvor DNA-sekvenden er I I kendetegnet ved at kode for et polypeptid I I 30 med den i Tabel VII angivne aminosyresekvens 1-1748. I 7. cDNA-sekvens ifølge krav 6. I

8. Genomisk DNA-sekvens ifølge krav 6. I

9. DNA-sekvens ifølge krav 6,kendeteg- I 75 DK 175551 B1 net ved, at den er kovalent associeret med en påviselig markørsubstans, især en radioaktiv markør.

10. Enkeltstrenget DNA-sekvens ifølge krav 9.

11. Biologisk funktionelt plasmid eller viral . 5 DNA-vektor, kendetegnet ved, at det inklude rer en DNA-sekvens ifølge krav 6.

12. Prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle, kendetegnet ved, at den er transformeret el-: ler transficeret med en DNA-sekvens ifølge krav 6 på en 10 sådan måde, at værtscellen kan eksprimere det pågældende polypeptidprodukt.

13. Prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle, kendetegnet ved, at den er stabilt transformeret eller transficeret med en DNA-vektor ifølge krav 15 11.

14. Værtscelle ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at værten er E. coli.

15. Værtscelle ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at værten er en pattedyrscelle.

16. Fremgangsmåde til fremstilling af isolerede polypeptider med de hæmatopoietiske egenskaber for naturligt forekommende human granulocyt kolonistimulerende faktor, hvor polypeptidet har den i Tabel VII angivne aminosyresekvens 1-174, kendetegnet ved, 25 at man under egnede næringsbetingelser dyrker prokaryo-tiske eller især eukaryotiske værtsceller, der er transformeret eller transficeret med en DNA-sekvens ifølge krav 6 på en sådan måde, at de kan eksprimere det nævnte polypeptid, og at man isolerer det ønskede 30 polypeptidprodukt fra ekspressionen af DNA-sekvensen. 1 Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter en effektiv mængde af poly- DK 175551 B1 I

76 I peptidet ifølge krav 1 og/eller fremstillet ifølge krav I 16, og et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel, I adjuvans eller bærer.

18. Farmaceutisk præparat ifølge krav 17, yder- I 5 ligere kendetegnet ved at være frit for as- sociation med noget som helst humant protein. I

19. Anvendelse af polypeptidet ifølge krav l til I fremstilling af et lægemiddel til tilvejebringelse af hæmatopoietisk terapi på et pattedyr. I

10 I